CN106305423A - 一种鸭茅组织培养再生体系的建立方法 - Google Patents

一种鸭茅组织培养再生体系的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能够克服外植体供给的季节限制且能够大大缩短实验周期的鸭茅组织培养再生体系的建立方法。本发明采用鸭茅成熟种子作为外植体，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养26～30d得到愈伤组织，接着将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养5～9d，再将其转接到分化培养基中培养18～22d，当幼苗长至2～3cm时，将其移栽即可，通过上述方法建立了高效的鸭茅组织培养再生体系，为建立鸭茅组织高效遗传转化体系奠定基础，为选育鸭茅组织优良品种提供了技术参考，同时克服了外植体供给的季节限制，同时也大大缩短了实验周期。适合在生物技术领域推广运用。

Description

一种鸭茅组织培养再生体系的建立方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸭茅组织培养再生体系的建立方法。
背景技术
鸭茅(又名鸡脚草、果园草)的野生种分布于我国新疆、天山山脉的森林边缘地带、四川的峨眉山、二郎山、邛崃山脉、凉山及岷山山系海拔1600～3100米的森林边缘、灌丛及山坡草地；并且散见于大兴安岭东南坡地。栽种鸭茅除驯化当地野生种外多引自丹麦、美国、澳大利亚等国。目前，青海、甘肃、陕西、吉林、江苏、湖北、四川及新疆等省(区)均有栽培；鸭茅原产欧洲、北非和亚洲温带，后引入全世界温带地区。
鸭茅草质柔软，牛、马、羊、兔等均喜食。幼嫩时尚可用以喂猪。叶量丰富，叶占60％，茎约占40％。鸭茅可作用放牧或制作干草，也可收割青饲或制作青贮料。鸭茅的化学成分随其成熟度而下降。再生草叶多茎少，基本处于营养生长，其成分与第一次由割前的孕穗期相近。其钾、磷、钙、镁的含量也随成熟度而下降，铜含量在整个生长期变化不大。第一次收割的草含钾、铜、铁较多，再生草含磷、钙、镁较多。鸭茅抽穗期的维生素含量很高，尤其胡萝卜素含量，30毫克/千克、维生素E248毫克/千克。微量元素含量也丰富，铁100毫克/千克、锰136毫克/千克、铜7.0毫克/千克、锌21.0毫克/千克。鸭茅的必需氨基酸含量高，鸭茅形成大量的茎生叶和基生叶，适合于放牧、青贮或刈制干草。叶量丰富的放牧用草种，冬季保持青绿，在冬季气候温和的地方还能提供部分青料。在连续重牧条件下，不能较好地长久保持生长，但是，如果放牧不充分，形成大的株丛，就会变得粗糙而降低适口性，故适于轮牧。播种当年刈割1次，亩产鲜草1000千克，而第二、三年可刈割2～3次，亩产鲜草3000千克以上。生长在肥沃土壤条件下，亩产鲜草可达5000千克左右。此外，鸭茅较为耐荫，与果树结合，建立果园草地，在我国果品产区是有发展前途的。
鸭茅具有生长迅速、分蘖能力强、产量高、耐瘠薄等优良特性，是中国南方草地农业生产中广泛使用的草种。随着分子生物学的发展，很多涉及到基因功能验证的实验需要通过组织培养进行遗传转化。传统的组培方式多以鸭茅的幼嫩花穗，茎节或者幼苗为外植体进行愈伤的诱导，进而通过分化得到完整的植株，但这些方式也存在外植体的选取受季节的限制不能全年提供足够的外植体进行实验，同时实验也相对比较耗时。因此，我们的组培是以种子为外植体，直接诱导愈伤从而得到完整的植株。克服了外植体供给的季节限制，同时也可以大大缩短实验周期。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够克服外植体供给的季节限制且能够大大缩短实验周期的鸭茅组织培养再生体系的建立方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该鸭茅组织培养再生体系的建立方法，包括以下步骤：
A、采用鸭茅成熟种子作为外植体，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养26～30d得到愈伤组织，所述诱导培养基由N6培养基、Vb stock、30g/L的蔗糖、200mg/L的酸水解络蛋白、500mg/L的脯氨酸、7.0mg/L的2，4-D、4.5g/L的琼脂组成，所述诱导培养基的PH＝5.8；
B、将愈伤组织转入继代培养基中培养5～9d，所述继代培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的6-BA、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的琼脂组成，所述继代培养基的PH＝5.8；
C、将经过步骤B处理的愈伤组织转接到分化培养基中培养18～22d，所述分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.5mg/L的GA、1.0mg/L的6-BA、4.5g/L的琼脂组成，所述分化培养基的PH＝5.8；
D、当幼苗长至2～3cm时，将其移栽。
进一步的是，在步骤A中，对鸭茅成熟种子清洗灭菌的处理方式如下所述：首先，将鸭茅成熟种子放入瓶中，并在瓶中添加无水乙醇浸泡1分钟，接着鸭茅成熟种子取出用蒸馏水清洗干净，然后在瓶中加入蒸馏水并将清洗干净的鸭茅成熟种子放入瓶中，将瓶子置于4℃冰箱中进行泡种处理，所述泡种的时间为24h，泡种结束后，将鸭茅成熟种子取出放入70％的乙醇溶液中浸泡1min，再取出放入1％的NaClO溶液中浸泡30min，最后将鸭茅成熟种子取出后用双蒸水清洗3-5次，并将其置于灭菌滤纸，晾干多余水分。
进一步的是，在步骤A中，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养12～16d后，减去鸭茅成熟种子上发出的新芽并更换新的诱导培养基继续培养12～16d后得到愈伤组织。
进一步的是，在步骤A中，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养14d后，减去鸭茅成熟种子上发出的新芽并更换新的诱导培养基继续培养14d后得到愈伤组织。
进一步的是，所述诱导培养中含有的N6培养基由KNO3、NH4SO4、CaCl2.2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2O ZnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H2BO3、KI、甘氨酸、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素组成，各组分的含量如下所述：KNO3为2830mg/L，NH4SO4为463mg/L，CaCl2.2H2O为166mg/L，MgSO4·7H2O为,185mg/L，KH2PO4为400mg/L，MnSO4·4H2O为4.4mg/L，ZnSO4·7H2O为1.6mg/L，H3BO3为0.8mg/L，KI为1.6mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，烟酸为0.5mg/L，盐酸硫胺素为1.0mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L。
进一步的是，所述诱导培养中含有的Vb stock由9.9mg/L的Vb1、9.5mg/L的Vb6、4.5mg/L的烟酸组成。
进一步的是，所述继代培养基、分化培养基中含有的MS培养基由KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·4H2O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇组成，各组分的含量如下所述：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L，Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L。
进一步的是，在步骤A中，所述诱导培养的环境温度为25℃，且培养方式为暗培。
本发明的有益效果在于：本发明采用鸭茅成熟种子作为外植体，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养26～30d得到愈伤组织，由N6培养基、Vb stock、30g/L的蔗糖、200mg/L的酸水解络蛋白、500mg/L的脯氨酸、7.0mg/L的2，4-D、4.5g/L的琼脂组成的诱导培养基可以大大提高诱导率，接着将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养5～9d，由MS培养基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的6-BA、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的琼脂组成的继代培养基可以使愈伤组织增殖最快且质量好，再将其转接到分化培养基中培养18～22d，由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.5mg/L的GA、1.0mg/L的6-BA、4.5g/L的琼脂组成的愈伤组织分化培养基可以大大提高分化率，当幼苗长至2～3cm时，将其移栽即可，通过上述方法建立了高效的鸭茅组织培养再生体系，为建立鸭茅组织高效遗传转化体系奠定基础，为选育鸭茅组织优良品种提供了技术参考，同时克服了外植体供给的季节限制，同时也大大缩短了实验周期。
具体实施方式
本发明采用鸭茅成熟种子作为外植体，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养26～30d得到愈伤组织，由N6培养基、Vb stock、30g/L的蔗糖、200mg/L的酸水解络蛋白、500mg/L的脯氨酸、7.0mg/L的2，4-D、4.5g/L的琼脂组成的诱导培养基可以大大提高诱导率，接着将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养5～9d，由MS培养基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的6-BA、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的琼脂组成的继代培养基可以使愈伤组织增殖最快且质量好，再将其转接到分化培养基中培养18～22d，由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.5mg/L的GA、1.0mg/L的6-BA、4.5g/L的琼脂组成的愈伤组织分化培养基可以大大提高分化率，当幼苗长至2～3cm时，将其移栽即可，通过上述方法建立了高效的鸭茅组织培养再生体系，为建立鸭茅组织高效遗传转化体系奠定基础，为选育鸭茅组织优良品种提供了技术参考，同时克服了外植体供给的季节限制，同时也大大缩短了实验周期。具体的，本发明所述的鸭茅组织培养再生体系的建立方法，具体包括以下步骤：
A、采用鸭茅成熟种子作为外植体，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养26～30d得到愈伤组织，所述诱导培养基由N6培养基、Vb stock、30g/L的蔗糖、200mg/L的酸水解络蛋白、500mg/L的脯氨酸、7.0mg/L的2，4-D、4.5g/L的琼脂组成，所述诱导培养基的PH＝5.8；
B、将愈伤组织转入继代培养基中培养5～9d，所述继代培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的6-BA、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的琼脂组成，所述继代培养基的PH＝5.8；
C、将经过步骤B处理的愈伤组织转接到分化培养基中培养18～22d，所述分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.5mg/L的GA、1.0mg/L的6-BA、4.5g/L的琼脂组成，所述分化培养基的PH＝5.8；
D、当幼苗长至2～3cm时，将其移栽。
在上述鸭茅组织培养再生体系的建立方法过程中，在步骤A中，对鸭茅成熟种子清洗灭菌的处理方式可以采用多种方式，为了使清洗效果、杀菌效果达到最佳，本发明采用如下所述的方式：首先，将鸭茅成熟种子放入瓶中，并在瓶中添加无水乙醇浸泡1分钟，接着鸭茅成熟种子取出用蒸馏水清洗干净，然后在瓶中加入蒸馏水并将清洗干净的鸭茅成熟种子放入瓶中，将瓶子置于4℃冰箱中进行泡种处理，所述泡种的时间为24h，泡种结束后，将鸭茅成熟种子取出放入70％的乙醇溶液中浸泡1min，再取出放入1％的NaClO溶液中浸泡30min，最后将鸭茅成熟种子取出后用双蒸水清洗3-5次，并将其置于灭菌滤纸，晾干多余水分。
在步骤A中，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养12～16d后，减去鸭茅成熟种子上发出的新芽并更换新的诱导培养基继续培养12～16d后得到愈伤组织。将初次发出的新芽去除，由于初次发出的新芽发芽率不高，故减去采用二次长出的新芽，该方法可以得到效果最佳的新芽。通常情况下，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养14d后，减去鸭茅成熟种子上发出的新芽并更换新的诱导培养基继续培养14d后得到愈伤组织，最后得到的新芽效果最佳。
所述诱导培养中含有的N6培养基由KNO3、NH4SO4、CaCl2.2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2O ZnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H2BO3、KI、甘氨酸、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素组成，各组分的含量如下所述：KNO3为2830mg/L，NH4SO4为463mg/L，CaCl2.2H2O为166mg/L，MgSO4·7H2O为,185mg/L，KH2PO4为400mg/L，MnSO4·4H2O为4.4mg/L，ZnSO4·7H2O为1.6mg/L，H3BO3为0.8mg/L，KI为1.6mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，烟酸为0.5mg/L，盐酸硫胺素为1.0mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L。所述诱导培养中含有的Vb stock由9.9mg/L的Vb1、9.5mg/L的Vb6、4.5mg/L的烟酸组成。所述继代培养基、分化培养基中含有的MS培养基由KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2.2H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·4H2O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇组成，各组分的含量如下所述：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2.2H2O为440mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L，Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L。这种配方是专门针对鸭茅配置的，更加适宜鸭茅组织培养。
为了诱导培养的效果更好，所述诱导培养的环境温度为25℃，且培养方式为暗培。
将多个鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到上述诱导培养基中，然后在25±2℃的培养室中黑暗培养14d后，减去鸭茅成熟种子上发出的新芽并更换新的诱导培养基继续培养14d后得到愈伤组织。观察愈伤组织的质量并统计愈伤组织数计算愈伤组织诱导率，其愈伤组织诱导率高达73％，而且愈伤组织生长速度快、品质最好，呈淡黄色、致密、较大(直径>1cm)颗粒。
继代培养主要作用是使愈伤组织扩增，更有利于培养出更多的再生植株。将经过诱导培养基培养得到的愈伤组织转入上述继代培养基中，然后在培养室中黑暗培养7d，观察愈伤组织的质量并统计愈伤组织最终重量，然后计算增值效率，增殖效率为一个愈伤分化出的幼芽数目，其增值效率高达1400％，且愈伤组织呈淡黄色的致密颗粒。
将经过继代培养基处理的愈伤组织转接到上述分化培养基中培养20d，然后在培养温度25±2℃、光照强度1000lx条件下培养20d，统计绿苗分化率，其绿苗分化率高达80％。
当苗长至2～3cm时，将其移栽即可。
在本发明中min表示分钟，d表示天数，NaClO表示次氯酸钠，Vb表示维生素B，Vb1表示维生素B1，Vb6表示维生素B6，2,4-D表示2,4-二氯苯氧乙酸，6-BA表示6-苄氨基嘌呤，NAA表示萘乙酸，GA表示赤霉素。

Claims (8)

1.一种鸭茅组织培养再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：
A、采用鸭茅成熟种子作为外植体，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养26～30d得到愈伤组织，所述诱导培养基由N6培养基、Vb stock、30g/L的蔗糖、200mg/L的酸水解络蛋白、500mg/L的脯氨酸、7.0mg/L的2，4-D、4.5g/L的琼脂组成，所述诱导培养基的PH＝5.8；
B、将愈伤组织转入继代培养基中培养5～9d，所述继代培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的6-BA、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的琼脂组成，所述继代培养基的PH＝5.8；
C、将经过步骤B处理的愈伤组织转接到分化培养基中培养18～22d，所述分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.5mg/L的GA、1.0mg/L的6-BA、4.5g/L的琼脂组成，所述分化培养基的PH＝5.8；
D、当幼苗长至2～3cm时，将其移栽。
2.如权利要求1所述的鸭茅组织培养再生体系的建立方法，其特征在于：在步骤A中，对鸭茅成熟种子清洗灭菌的处理方式如下所述：首先，将鸭茅成熟种子放入瓶中，并在瓶中添加无水乙醇浸泡1分钟，接着鸭茅成熟种子取出用蒸馏水清洗干净，然后在瓶中加入蒸馏水并将清洗干净的鸭茅成熟种子放入瓶中，将瓶子置于4℃冰箱中进行泡种处理，所述泡种的时间为24h，泡种结束后，将鸭茅成熟种子取出放入70％的乙醇溶液中浸泡1min，再取出放入1％的NaClO溶液中浸泡30min，最后将鸭茅成熟种子取出后用双蒸水清洗3-5次，并将其置于灭菌滤纸，晾干多余水分。
3.如权利要求1所述的鸭茅组织培养再生体系的建立方法，其特征在于：在步骤A中，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养12～16d后，减去鸭茅成熟种子上发出的新芽并更换新的诱导培养基继续培养12～16d后得到愈伤组织。
4.如权利要求3所述的鸭茅组织培养再生体系的建立方法，其特征在于：在步骤A中，将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中培养14d后，减去鸭茅成熟种子上发出的新芽并更换新的诱导培养基继续培养14d后得到愈伤组织。
5.如权利要求1所述的鸭茅组织培养再生体系的建立方法，其特征在于：所述诱导培养中含有的N6培养基由KNO3、NH4SO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2OZnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H2BO3、KI、甘氨酸、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素组成，各组分的含量如下所述：KNO3为2830mg/L，NH4SO4为463mg/L，CaCl2·2H2O为166mg/L，MgSO4·7H2O为,185mg/L，KH2PO4为400mg/L，MnSO4·4H2O为4.4mg/L，ZnSO4·7H2O为1.6mg/L，H3BO3为0.8mg/L，KI为1.6mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，烟酸为0.5mg/L，盐酸硫胺素为1.0mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L。
6.如权利要求1所述的鸭茅组织培养再生体系的建立方法，其特征在于：所述诱导培养中含有的Vb stock由9.9mg/L的Vb1、9.5mg/L的Vb6、4.5mg/L的烟酸组成。
7.如权利要求1所述的鸭茅组织培养再生体系的建立方法，其特征在于：所述继代培养基、分化培养基中含有的MS培养基由KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·4H2O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇组成，各组分的含量如下所述：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L，Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L。
8.如权利要求1所述的鸭茅组织培养再生体系的建立方法，其特征在于：在步骤A中，所述诱导培养的环境温度为25℃，且培养方式为暗培。
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