CN108849501A - 一种黄精育苗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能够大大缩短种子育苗周期的黄精育苗方法。该黄精育苗方法包括选种、诱导培养、继代培养、分化培养、培养室培养、炼苗、移栽，并针对黄精种子特有的休眠特性，对诱导培养基进行改良设计，使其能够在诱导过程中破除黄精种子的休眠特性，使其能够快速发芽，并提高发芽率，通过炼苗处理可以大大提高黄精幼苗的成活率，同时在幼苗根部施加外源添加剂可以有效缓解干旱胁迫下黄精生长受阻、叶片萎蔫，可以显著的提高黄精的抗旱性，为选育黄精优良品种提供了技术参考，同时采用黄精种子作为外植体，克服了外植体供给的季节限制，同时该育苗方法只需三个月左右即可，能够实现黄精的快速繁殖。适合在生物技术领域推广运用。

Description

一种黄精育苗方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黄精育苗方法。
背景技术
黄精味甘，性平。归脾、肺、肾经。具有补气养阴，健脾，润肺，益肾功能。用于脾胃虚弱，体虚乏力，口干食少，肺虚燥咳，精血不足，内热消渴。现代研究，对糖尿病、高血压病、心血管疾病、结核病、慢性肝炎等症，以及在抗菌、解毒、抗疲劳、抗衰老等方面均有较好作用。其化学成分主要有黄精多糖、甾体皂苷、蒽醌类化合物、生物碱、强心苷、木脂素、维生素和多种对人体有用的氨基酸等。
黄精的育苗方式主要是黄精种子育苗和根状茎育苗两种。由于块茎繁殖属于无性繁殖，容易携带病毒、品种退化致使黄精产量和品质降低，而黄精种子有生理后熟和休眠特性、种子出苗难，现在黄精种子育苗技术不成熟且种子育苗周期长，通常需要三年左右才会发芽成苗，且发芽率较低。随着药材市场对黄精需求量增大，黄精的快速繁殖成了亟待解决的难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够大大缩短种子育苗周期的黄精育苗方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该黄精育苗方法，包括以下步骤：
A、选种：选取黄精种子，并对黄精种子进行消毒处理；
B、将清洗灭菌后的黄精种子接种到诱导培养基中在无菌环境下培养26～30d得到愈伤组织，所述诱导培养基由N6培养基、150mg/L的GA3、100mg/L的IAA、300mg/LETH、500mg/L的SNP、Vb stock、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、100mg/L的双氧水、4.5g/L的琼脂组成，所述诱导培养基的PH＝5.8；
C、将愈伤组织转入继代培养基中在无菌环境下培养5～9d，所述继代培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、100mg/L的6-BA、100mg/L的高锰酸钾、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的琼脂组成，所述继代培养基的PH＝5.8；
D、将经过步骤C处理的愈伤组织转接到分化培养基中在无菌环境下培养18～22d，所述分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、50mg/L的GA3、1g/L的硫酸铜、100mg/L的6-BA、4.5g/L的琼脂组成，所述分化培养基的PH＝5.8；
E、将经过步骤D处理的愈伤组织转接到组培瓶中，并将组培瓶放置在光照强度为1500～3000lx，温度为25～30℃的无菌环境中培养5～8d，光照时间为38～42h/d；
F、将组培瓶放置在温度为20～30℃的有菌环境中炼苗培养4～7d，在炼苗培养过程中，在幼苗根部施加外源添加剂，所述外源添加剂包括溶剂和溶质，所述溶剂为霍格兰氏营养液，所述溶质包括壳聚糖(CTS)和精胺(Spm)，所述CTS的浓度为0.5g/L-1.5g/L，所述Spm的浓度为50.58mg/L-151.74mg/L；
G、当幼苗长至2～3cm时，将其移栽。
进一步的是，在步骤A中，对黄精种子清洗灭菌的处理方式采用如下所述的方式：首先，将黄精种子放入瓶中，并在瓶中添加无水乙醇浸泡1分钟，接着黄精种子取出用蒸馏水清洗干净，然后在瓶中加入蒸馏水并将清洗干净的黄精种子放入瓶中，将瓶子置于40℃冰箱中进行泡种处理，所述泡种的时间为24-30h，泡种结束后，将黄精种子取出放入浓度为13.8mg/Ld的水杨酸溶液中浸泡30min，，后将鸭茅成熟种子取出后用双蒸水清洗3-5次，并将其置于灭菌滤纸，晾干多余水分。
进一步的是，在步骤B中，所述诱导培养中含有的Vb stock由20mg/L的Vb1、19.5mg/L的Vb6、9mg/L的烟酸组成。
进一步的是，在步骤B中，所述诱导培养的环境温度为25℃，且培养方式为暗培。
进一步的是，所述诱导培养中含有的N6培养基由KNO3、NH4SO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2O ZnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H2BO3、KI、甘氨酸、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素组成，各组分的含量如下所述：KNO3为2830mg/L，NH4SO4为463mg/L，CaCl2·2H2O为166mg/L，MgSO4·7H2O为,185mg/L，KH2PO4为400mg/L，
MnSO4·4H2O为4.4mg/L，ZnSO4·7H2O为1.6mg/L，H3BO3为0.8mg/L，KI为1.6mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，烟酸为0.5mg/L，盐酸硫胺素为1.0mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L。所述诱导培养中含有的Vb stock由9.9mg/L的Vb1、9.5mg/L的Vb6、4.5mg/L的烟酸组成。所述继代培养基、分化培养基中含有的MS培养基由KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·4H2O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇组成，各组分的含量如下所述：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L，Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L。
进一步的是，所述MS培养基包括KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·4H2O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、蔗糖，各组分的含量如下所述：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L，Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L，蔗糖30g/L。
本发明的有益效果在于：该黄精育苗方法包括选种、诱导培养、继代培养、分化培养、培养室培养、炼苗、移栽，本发明通过对黄精种子进行诱导培养、继代培养、分化培养，并针对黄精种子特有的休眠特性，对诱导培养基进行改良设计，使其能够在诱导过程中破除黄精种子的休眠特性，使其能够快速发芽，并提高发芽率，通过炼苗处理可以大大提高黄精幼苗的成活率，同时在幼苗根部施加外源添加剂可以有效缓解干旱胁迫下黄精生长受阻、叶片萎蔫，可以显著的提高黄精的抗旱性，避免由于缺水导致黄精干枯减产的情况发生，为选育黄精优良品种提供了技术参考，同时采用黄精种子作为外植体，克服了外植体供给的季节限制，同时该育苗方法只需三个月左右即可，大大缩短了育苗周期，而且发芽率和成活率就较高，能够实现黄精的快速繁殖。
具体实施方式
本发明黄精育苗方法，包括以下步骤：
A、选种：选取黄精种子，并对黄精种子进行消毒处理；
B、将清洗灭菌后的黄精种子接种到诱导培养基中在无菌环境下培养26～30d得到愈伤组织，所述诱导培养基由N6培养基、150mg/L的GA3、100mg/L的IAA、300mg/LETH、500mg/L的SNP、Vb stock、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、100mg/L的双氧水、4.5g/L的琼脂组成，所述诱导培养基的PH＝5.8；
C、将愈伤组织转入继代培养基中在无菌环境下培养5～9d，所述继代培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、100mg/L的6-BA、100mg/L的高锰酸钾、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的琼脂组成，所述继代培养基的PH＝5.8；添加活性炭不仅有效防止褐化，由于添加6-BA后激素环境变化的作用，通过添加活性炭还可以缓解愈伤继代生长对环境的敏感性，更加促进愈伤稳定生长；另外，较低浓度的2,4-D和较高浓度的6-BA组合使用，既提高愈伤的质量，又促进其分化，成为愈伤最终分化成植株极好的过渡时期；
D、将经过步骤C处理的愈伤组织转接到分化培养基中在无菌环境下培养18～22d，所述分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、50mg/L的GA3、1g/L的硫酸铜、100mg/L的6-BA、4.5g/L的琼脂组成，所述分化培养基的PH＝5.8；
E、将经过步骤D处理的愈伤组织转接到组培瓶中，并将组培瓶放置在光照强度为1500～3000lx，温度为25～30℃的无菌环境中培养5～8d，光照时间为38～42h/d；
F、将组培瓶放置在温度为20～30℃的有菌环境中炼苗培养4～7d，在炼苗培养过程中，在幼苗根部施加外源添加剂，所述外源添加剂包括溶剂和溶质，所述溶剂为霍格兰氏营养液，所述溶质包括壳聚糖(CTS)和精胺(Spm)，所述CTS的浓度为0.5g/L-1.5g/L，所述Spm的浓度为50.58mg/L-151.74mg/L；通过炼苗处理可以大大提高黄精幼苗的成活率，同时在幼苗根部施加上述抗旱组合物形成的外源添加剂可以有效缓解干旱胁迫下黄精生长受阻、叶片萎蔫，可以显著的提高黄精的抗旱性，避免由于缺水导致黄精干枯减产的情况发生；
G、当幼苗长至2～3cm时，将其移栽。
该黄精育苗方法包括选种、诱导培养、继代培养、分化培养、培养室培养、炼苗、移栽，本发明通过对黄精种子进行诱导培养、继代培养、分化培养，并针对黄精种子特有的休眠特性，对诱导培养基进行改良设计，使其能够在诱导过程中破除黄精种子的休眠特性，使其能够快速发芽，并提高发芽率，通过炼苗处理可以大大提高黄精幼苗的成活率，同时在幼苗根部施加外源添加剂可以有效缓解干旱胁迫下黄精生长受阻、叶片萎蔫，可以显著的提高黄精的抗旱性，避免由于缺水导致黄精干枯减产的情况发生，为选育黄精优良品种提供了技术参考，同时采用黄精种子作为外植体，克服了外植体供给的季节限制，同时该育苗方法只需三个月左右即可，大大缩短了育苗周期，而且发芽率和成活率就较高，能够实现黄精的快速繁殖。
在步骤A中，对黄精种子清洗灭菌的处理方式可以采用多种方式，为了使清洗效果、杀菌效果达到最佳，进一步的是，在步骤A中，对黄精种子清洗灭菌的处理方式采用如下所述的方式：首先，将黄精种子放入瓶中，并在瓶中添加无水乙醇浸泡1分钟，接着黄精种子取出用蒸馏水清洗干净，然后在瓶中加入蒸馏水并将清洗干净的黄精种子放入瓶中，将瓶子置于40℃冰箱中进行泡种处理，所述泡种的时间为24-30h，泡种结束后，将黄精种子取出放入浓度为13.8mg/Ld的水杨酸溶液中浸泡30min，，后将鸭茅成熟种子取出后用双蒸水清洗3-5次，并将其置于灭菌滤纸，晾干多余水分。通过水杨酸的浸泡还可以初步破除黄精种子的休眠特性，从而为后续的培养打下良好的基础。
进一步的是，在步骤B中，所述诱导培养中含有的Vb stock由20mg/L的Vb1、19.5mg/L的Vb6、9mg/L的烟酸组成。
为了使诱导培养效果更好，在步骤B中，所述诱导培养的环境温度为25℃，且培养方式为暗培。
进一步的是，所述诱导培养中含有的N6培养基由KNO3、NH4SO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2O ZnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H2BO3、KI、甘氨酸、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素组成，各组分的含量如下所述：KNO3为2830mg/L，NH4SO4为463mg/L，CaCl2·2H2O为166mg/L，MgSO4·7H2O为,185mg/L，KH2PO4为400mg/L，MnSO4·4H2O为4.4mg/L，ZnSO4·7H2O为1.6mg/L，H3BO3为0.8mg/L，KI为1.6mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，烟酸为0.5mg/L，盐酸硫胺素为1.0mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L。所述诱导培养中含有的Vb stock由9.9mg/L的Vb1、9.5mg/L的Vb6、4.5mg/L的烟酸组成。所述继代培养基、分化培养基中含有的MS培养基由KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·4H2O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇组成，各组分的含量如下所述：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L，Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L。
进一步的是，所述MS培养基包括KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·4H2O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、蔗糖，各组分的含量如下所述：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L，Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L，蔗糖30g/L。

Claims (6)

1.一种黄精育苗方法，其特征在于包括以下步骤：
A、选种：选取黄精种子，并对黄精种子进行消毒处理；
B、将清洗灭菌后的黄精种子接种到诱导培养基中在无菌环境下培养26～30d得到愈伤组织，所述诱导培养基由N6培养基、150mg/L的GA3、100mg/L的IAA、300mg/LETH、500mg/L的SNP、Vb stock、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、100mg/L的双氧水、4.5g/L的琼脂组成，所述诱导培养基的PH＝5.8；
C、将愈伤组织转入继代培养基中在无菌环境下培养5～9d，所述继代培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、100mg/L的6-BA、100mg/L的高锰酸钾、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的琼脂组成，所述继代培养基的PH＝5.8；
D、将经过步骤C处理的愈伤组织转接到分化培养基中在无菌环境下培养18～22d，所述分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、50mg/L的GA3、1g/L的硫酸铜、100mg/L的6-BA、4.5g/L的琼脂组成，所述分化培养基的PH＝5.8；
E、将经过步骤D处理的愈伤组织转接到组培瓶中，并将组培瓶放置在光照强度为1500～3000lx，温度为25～30℃的无菌环境中培养5～8d，光照时间为38～42h/d；
F、将组培瓶放置在温度为20～30℃的有菌环境中炼苗培养4～7d，在炼苗培养过程中，在幼苗根部施加外源添加剂，所述外源添加剂包括溶剂和溶质，所述溶剂为霍格兰氏营养液，所述溶质包括壳聚糖(CTS)和精胺(Spm)，所述CTS的浓度为0.5g/L-1.5g/L，所述Spm的浓度为50.58mg/L-151.74mg/L；
G、当幼苗长至2～3cm时，将其移栽。
2.如权利要求1所述的黄精育苗方法，其特征在于：在步骤A中，对黄精种子清洗灭菌的处理方式采用如下所述的方式：首先，将黄精种子放入瓶中，并在瓶中添加无水乙醇浸泡1分钟，接着黄精种子取出用蒸馏水清洗干净，然后在瓶中加入蒸馏水并将清洗干净的黄精种子放入瓶中，将瓶子置于40℃冰箱中进行泡种处理，所述泡种的时间为24-30h，泡种结束后，将黄精种子取出放入浓度为13.8mg/Ld的水杨酸溶液中浸泡30min，，后将鸭茅成熟种子取出后用双蒸水清洗3-5次，并将其置于灭菌滤纸，晾干多余水分。
3.如权利要求1所述的黄精育苗方法，其特征在于：在步骤B中，所述诱导培养中含有的Vb stock由20mg/L的Vb1、19.5mg/L的Vb6、9mg/L的烟酸组成。
4.如权利要求1所述的黄精育苗方法，其特征在于：在步骤B中，所述诱导培养的环境温度为25℃，且培养方式为暗培。
5.如权利要求1所述的黄精育苗方法，其特征在于：所述诱导培养中含有的N6培养基由KNO3、NH4SO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2O ZnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H2BO3、KI、甘氨酸、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素组成，各组分的含量如下所述：KNO3为2830mg/L，NH4SO4为463mg/L，CaCl2·2H2O为166mg/L，MgSO4·7H2O为,185mg/L，KH2PO4为400mg/L，MnSO4·4H2O为4.4mg/L，ZnSO4·7H2O为1.6mg/L，H3BO3为0.8mg/L，KI为1.6mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，烟酸为0.5mg/L，盐酸硫胺素为1.0mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L。所述诱导培养中含有的Vb stock由9.9mg/L的Vb1、9.5mg/L的Vb6、4.5mg/L的烟酸组成。所述继代培养基、分化培养基中含有的MS培养基由KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·4H2O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇组成，各组分的含量如下所述：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L，Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L。
6.如权利要求1所述的黄精育苗方法，其特征在于：所述MS培养基包括KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·4H2O、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、蔗糖，各组分的含量如下所述：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L，Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L，蔗糖30g/L。
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