CN107821169A - 一种滇黄精种苗的组培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种滇黄精种苗的组培方法，包括选取滇黄精地下部分带芽根茎作为外植体，灭菌后接种到MS培养基中进行培养，然后进行诱导培养、继代培养、生根培养和炼苗。本发明通过诱导培养、继代培养和生根培养几个阶段的培养的组织培养方法及各组织培养阶段选择适宜的培养基，有效缩短滇黄精育苗时间，提高滇黄精种苗质量，在短时间内获得大量优质滇黄精种苗，且该方法有效解决了滇黄精繁育对块根需求量大、种子育苗发芽率低的问题。

Description

一种滇黄精种苗的组培方法

技术领域

本发明涉及中药材栽培技术领域，具体而言，涉及一种滇黄精种苗的组培方法。

背景技术

滇黄精为百合科黄精属多年生草本植物，产中国云南、四川、贵州，分布于林下、灌丛或阴湿草坡，海拔700-3600米。滇黄精与多花黄精、鸡头黄精同被《中国药典》(2015版)确定为正品药用品种。滇黄精主要以根茎入药，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾功能。用于治疗脾胃虚弱，体倦乏力，口干食少，肺虚燥咳，精血不足，内热消渴等症，对于糖尿病很有疗效。

黄精主要含多糖、甾体皂苷、蒽醌、强心苷，具有养阴润肺；补脾益气，滋肾填精的功效。黄精在新药研发及保健品开发领域有广阔的前景，人们对黄精的需求量日益增加，野生资源日趋枯竭，已经不能满足市场需求。滇黄精种子繁殖成活率低，目前人工种植主要以分块繁殖为主，对根茎需求量大，经济效益低，难以形成大规模种植。滇黄精种苗问题成为制约滇黄精规模化种植的瓶颈。

发明内容

有鉴于此，本发明提供的一种滇黄精种苗的组培方法，更好的克服了上述现有技术存在的问题和缺陷，该方法有效提高了种苗生长速度，缩短滇黄精育苗时间，提高滇黄精种苗质量和移栽成活率，且能够在短时间内获得大量优质滇黄精种苗。

一种滇黄精种苗的组培方法，包括以下步骤：

(1)选择滇黄精地下部分带芽根茎作为外植体，将剥下最外层芽鳞片的所述外植体进行灭菌处理，然后将灭菌后的所述外植体接种到MS培养基中进行培养；

(2)将无菌的所述外植体转接到诱导培养基中进行诱导培养得到分化出不定芽的外植体；

(3)将分化出不定芽的所述外植体转接到继代培养基中进行继代培养，得到滇黄精丛生芽；

(4)将所述滇黄精丛生芽转接至生根培养基中进行生根培养，得到滇黄精生根苗；

(5)将所述滇黄精生根苗进行炼苗。

进一步地，步骤(1)中，在剥下所述最外层芽鳞片前，将带芽根茎从节间切下，去除须根后进行清洗和灭菌，再剥去外层顶芽鳞片。

进一步地，所述清洗包括：用水冲洗掉表面泥沙，用毛刷除去残留泥土，然后在饱和洗衣粉水中浸泡20～30min，再用水冲洗30～60min；所述灭菌包括：先用75％酒精浸泡20～40s，再用混有1～2滴土温80的0.2％升汞摇晃灭菌10～15min，最后用无菌水清洗3～5次。

进一步地，步骤(1)中，所述培养采用暗培养，所述培养的温度为23～27℃，所述培养的湿度为50～55％，所述培养的时间为3～5天。

进一步地，步骤(2)中，步骤(2)中，所述诱导培养基包括MS培养基、苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖和琼脂；所述苄氨基腺嘌呤的浓度为1.0～3.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.2mg/L，所述蔗糖的浓度为25～40g/L，所述琼脂的浓度为5～7g/L；

所述诱导培养包括：先暗培养7天，再在光照强度为1500～2000lx的条件下光培养40～50天，光照时间为8～10h/d；所述诱导培养的温度为23～27℃，所述诱导培养的湿度为50～55％。

进一步地，步骤(3)中，所述继代培养基包括MS培养基、苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖和琼脂；所述苄氨基腺嘌呤的浓度为3.0～5.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.2mg/L，所述蔗糖的浓度为25～40g/L，所述琼脂的浓度为5～7g/L；

所述继代培养包括：先暗培养7天，再在光照强度为1500～2000lx的条件下光培养30～45天，光照时间为8～10h/d；所述继代培养的温度为23～27℃，所述继代培养的湿度为50～55％。

进一步地，步骤(4)中，所述生根培养基包括1/2MS培养基、萘乙酸、蔗糖、琼脂和活性炭；所述萘乙酸的浓度为0.5～1.5mg/L，所述蔗糖的浓度为25～30g/L，所述琼脂的浓度为4～6g/L，所述活性炭的浓度为0.2～0.3g/L；

所述生根培养包括：先暗培养15天，再在光照强度为1500～2000lx的条件下光培养45～60天，光照时间为8～10h/d；所述生根培养的温度为23～27℃，所述生根培养的湿度为50～55％。

进一步地，所述诱导培养基、继代培养基和生根培养基的pH值为5.8～6.2。

进一步地，步骤(5)中，所述炼苗包括：将所述滇黄精生根苗在营养杯中进行培养10～15天，所述培养的温度为25～30℃，所述培养的湿度为75～90％。

进一步地，所述营养杯中的基质组分按质量百分比包括：酒精渣20～30％、蛭石25～35％、碎泥沙30～40％和鸡粪10～20％。

与现有技术相比，本发明的一种滇黄精种苗的组培方法的有益效果是：

(1)本发明通过诱导培养、继代培养和生根培养几个阶段的培养的组织培养方法及各组织培养阶段选择适宜的培养基，有效提高了种苗生长速度，缩短滇黄精育苗时间，提高滇黄精种苗质量和移栽成活率，且能够在短时间内获得大量优质滇黄精种苗。

为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合实施例的方式对本发明的技术方案做详细说明，在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。

但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

如本文所用之术语：

本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。

一种滇黄精种苗的组培方法，包括以下步骤：

(1)选择滇黄精地下部分带芽根茎作为外植体，将剥下最外层芽鳞片的所述外植体进行灭菌处理，然后将灭菌后的所述外植体接种到MS培养基中进行培养；

(2)将无菌的所述外植体转接到诱导培养基中进行诱导培养得到分化出不定芽的外植体；

(3)将分化出不定芽的所述外植体转接到继代培养基中进行继代培养，得到滇黄精丛生芽；

(4)将所述滇黄精丛生芽转接至生根培养基中进行生根培养，得到滇黄精生根苗；

(5)将所述滇黄精生根苗进行炼苗。

优选地，步骤(1)中，在剥下所述最外层芽鳞片前，将带芽根茎从节间切下，去除须根后进行清洗和灭菌，再剥去外层顶芽鳞片。

优选地，用水冲洗掉表面泥沙，用毛刷除去残留泥土，然后在饱和洗衣粉水中浸泡20～30min，再用水冲洗30～60min；所述灭菌包括：先用75％酒精浸泡20～40s如20s、25s、30s、35s或40s等，再用混有1～2滴土温80的0.2％升汞摇晃灭菌10～15min如10min、11min、12min、13min、14min或15min，最后用无菌水清洗3～5次如3次、4次或5次。

优选地，步骤(1)中，所述培养采用暗培养，所述培养的温度为23～27℃如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃，所述培养的湿度为50～55％如50％、51％、52％、53％、54％或55％，所述培养的时间为3～5天如3天、4天或5天。

优选地，步骤(2)中，步骤(2)中，所述诱导培养基包括MS培养基、苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖和琼脂。

所述苄氨基腺嘌呤的浓度为1.0～3.0mg/L如1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L或3.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.2mg/L，所述蔗糖的浓度为25～40g/L，所述琼脂的浓度为5～7g/L如5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L或7g/L。

所述诱导培养包括：先暗培养7天，再在光照强度为1500～2000lx如1500lx、1600lx、1700lx、1800lx、1900lx或2000lx的条件下进行光培养40～50天，光照时间为8～10h/d如8h/d、8.5h/d、9h/d、9.5h/d或10h/d；所述诱导培养的温度为23～27℃如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃，所述诱导培养的湿度为50～55％如50％、51％、52％、53％、54％或55％。

优选地，步骤(3)中，所述继代培养基包括MS培养基、苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖和琼脂。

所述苄氨基腺嘌呤的浓度为3.0～5.0mg/L如3.0mg/L、3.5mg/L、4.0mg/L、4.5mg/L或5.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.2mg/L，所述蔗糖的浓度为25～40g/L，所述琼脂的浓度为5～7g/L如5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L或7g/L。所述继代培养包括：先暗培养7天，再在光照强度为1500～2000lx如1500lx、1600lx、1700lx、1800lx、1900lx或2000lx的条件下光培养30～45天，光照时间为8～10h/d如8h/d、8.5h/d、9h/d、9.5h/d或10h/d；所述继代培养的温度为23～27℃如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃，所述继代培养的湿度为50～55％如50％、51％、52％、53％、54％或55％。

优选地，步骤(4)中，所述生根培养基包括1/2MS培养基、萘乙酸、蔗糖、琼脂和活性炭。

所述萘乙酸的浓度为0.5～1.5mg/L如0.5mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.2mg/L或1.5mg/L，所述蔗糖的浓度为25～30g/L，所述琼脂的浓度为4～6g/L如4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L或6g/L，所述活性炭的浓度为0.2～0.3g/L如0.2g/L、0.25g/L或0.3g/L。

所述生根培养包括：先暗培养15天，再在光照强度为1500～2000lx如1500lx、1600lx、1700lx、1800lx、1900lx或2000lx的条件下光培养45～60天，光照时间为8～10h/d如8h/d、8.5h/d、9h/d、9.5h/d或10h/d；所述生根培养的温度为23～27℃如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃，所述生根培养的湿度为50～55％如50％、51％、52％、53％、54％或55％。

上述，需要理解的是，MS培养基为组织的生长提供所需的碳源、氮源、水、无机物和生长因子。

所述MS培养基包括大量元素、微量元素和有机化合物，具体的配方如下：

大量元素的组分及其对应的浓度为：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、二水氯化钙440mg/L；

微量元素的组分及其对应的浓度为：碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸二钠浓度为37.3mg/L。

有机化合物的组分及其对应的浓度为：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2.0mg/L。

上述，可以理解的是，苄氨基腺嘌呤(Benzylaminopurine)，简称BA。可以理解的是，苄氨基腺嘌呤有味BA，是人工合成的细胞分裂素。BA具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能。苄氨基腺嘌呤作为一种植物生长调节剂，具有促进促进外植体形成丛生芽的作用。

可以理解的是，吲哚丁酸亦作为一种植物生长调节剂，具有促进促进外植体形成丛生芽的作用。

吲哚丁酸可以作为植物主根生长促进剂，常用于木本和草本植物的浸根移栽，硬枝杆插，能加速根的生长，提高植物生根的百分率，也可用于植物种子的浸种和拌种，可提高发芽率和成活率。高浓度吲哚丁酸也可促进部分组培苗的增殖。

可以理解的是，萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid)，简称NAA。萘乙酸是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等。萘乙酸可经叶片、树枝的嫩表皮、种子进入到植物体内，随同营养流输导到作用部位。通常用于小麦、水稻、棉花、茶、桑、番茄、苹果、瓜类、马铃薯、林木等，是一种良好的植物生长刺激素。

可以理解的是，蔗糖为细胞的分裂、扩大、增至提供必要的能量。

可以理解的是，香蕉泥中含有大量的糖类，并且，在香蕉泥中含有植物激素，比如细胞分裂素，生长素，乙烯和赤霉素，可为植物组织细胞分裂分化提供能源。

可以理解的是，琼脂粉是从植物里提取出来的藻胶。琼脂因为有特殊的胶凝性质，尤其有显着的稳固性、滞度和滞后性，并且易吸收水分，有特殊的稳定效应；具有增量剂、增稠剂、乳化剂、胶凝剂、稳定剂、赋形剂、助悬剂、水分保持剂等功效。琼脂粉主要作用是固化培养基，起支撑作用。

优选地，所述诱导培养基、继代培养基和生根培养基的pH值为5.8～6.2如5.8、5.9、6.0、6.1或6.2。

优选地，步骤(5)中，所述炼苗包括：将所述滇黄精生根苗转移至营养杯中培养10～15天如10天、11天、12天、13天、14天或15天；所述培养的温度为25～30℃如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，所述培养的湿度为75～90％如75％、78％、80％、85％、88％或90％。

优选地，所述营养杯中的基质组分按质量百分比包括：

酒精渣20～30％如20％、22％、25％、28％或30％等；

蛭石25～35％如25％、28％、30％、32％或35％等；

碎泥沙30～40％如30％、32％、35％、38％或40％等；

鸡粪10～20％如10％、12％、15％、18％或20％等。

为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过下述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于下述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明应依赖下述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

实施例1

(1)外植体选取：从海拔600米的百色市隆林县采集的野生滇黄精，用根茎繁殖，种植在百色田林县实验基地，栽培两年，在3月初，从实验基地挖出地下根茎，选择带芽根茎从节间切下，去除须根，用自来水冲掉表面泥沙，并用毛刷刷掉残留的泥土，再用饱和洗衣粉水浸泡20min，然后用自来水冲洗1h，再用酒精擦拭表面，用无菌刀片和镊子，从外到内小心剥去2～3层顶芽鳞片，尽量保证里面的顶芽完整无划痕。

将剥好的滇黄精带芽根茎置于无菌玻璃瓶中，在超净工作台上用75％酒精浸泡30s，再用添加了1～2滴土温80的0.2％升汞溶液消毒10min，期间摇晃玻璃瓶，使其充分灭菌，最后用无菌水洗3次，用无菌滤纸吸干水分。

(2)将上述步骤(1)得到的滇黄精带芽根茎外植体接种到MS培养基中，每瓶培养基接种一个滇黄精带芽根茎外植体，在温度为23℃和湿度为50％的培养室中暗培养2天，然后剔除表面污染细菌、真菌或者失活的外植体，得到无菌外植体。

(3)诱导培养：将上述无菌外植体转接到诱导培养基中，在温度为23℃和湿度为50％的培养室中，先暗培养7天，基部开始膨大，分化出白色颗粒状愈伤组织，顶芽由淡黄色转变为嫩绿色。再在光照强度为1500lx、光照时间为8h/d、温度为25℃和湿度为50％的培养室中，进行光培养40天，愈伤分化成淡绿色小芽。上述诱导培养基为：MS基本培养基+1.0mg/L苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L萘乙酸+25g/L蔗糖+7g/L琼脂，该诱导培养基的pH值为5.8。

(4)继代培养：将上述经过诱导培养的得到的淡绿色小芽转接到继代培养基中，在温度为23℃和湿度为50％的培养室中，先暗培养7天，基部膨大，分化出愈伤组织，再在光照强度为1000lx、光照时间为8h/d、温度为25℃和湿度为50％的培养室中，进行光培养30天，得到滇黄精丛生芽。上述继代培养基为：MS基本培养基+3.0mg/L苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L萘乙酸+25g/L蔗糖+7g/L琼脂，该继代培养基的pH值为5.8。

(5)生根培养：将上述滇黄精丛生芽转接到生根培养基中，在温度为23℃和湿度为50％的培养室中，先暗培养15天，基部开始分化出不定根，根表面有白色绒毛，小芽分化出叶片，再在光照强度为1000lx、光照时间为8h/d、温度为25℃和湿度为50％的培养室中，进行光培养50天，得到根长4～5cm，根系发达的滇黄精生根苗。上述生根培养基为：1/2MS基本培养基+萘乙酸0.5mg/L+25g/L+4g/L琼脂+0.2g/L活性炭，该生根培养基的pH值为5.8。

(6)炼苗：将所述滇黄精生根苗根部的培养基用自来水清洗干净，阴凉处晾干水分，再转移至营养杯中培养10天，保持培养的温度为25℃，湿度为75％，得到滇黄精种苗；该营养杯中的基质组分按质量百分比包括酒精渣20％，蛭石35％，碎泥沙30％，鸡粪15％。

(7)移栽：将上述经炼苗后的滇黄精种苗移栽至大田。

实施例2

(1)外植体选取：从海拔600米的百色市隆林县采集的野生滇黄精，用根茎繁殖，种植在百色田林县实验基地，栽培两年，在3月初，从实验基地挖出地下根茎，选择带芽根茎从节间切下，去除须根，用自来水冲掉表面泥沙，并用毛刷刷掉残留的泥土，再用饱和洗衣粉水浸泡20min，然后用自来水冲洗1h，再用酒精擦拭表面，用无菌刀片和镊子，从外到内小心剥去2～3层顶芽鳞片，尽量保证里面的顶芽完整无划痕。

将剥好的滇黄精带芽根茎置于无菌玻璃瓶中，在超净工作台上用75％酒精浸泡20s，再用添加了1～2滴土温80的0.2％升汞溶液消毒12min，期间摇晃玻璃瓶，使其充分灭菌，最后用无菌水洗4次，用无菌滤纸吸干水分。

(2)将上述步骤(1)得到的滇黄精带芽根茎外植体接种到MS培养基中，每瓶培养基接种一个滇黄精带芽根茎外植体，在温度为23℃和湿度为50％的培养室中暗培养2天，然后剔除表面污染细菌、真菌或者失活的外植体，得到无菌外植体。

(3)诱导培养：将上述无菌外植体转接到诱导培养基中，在温度为25℃和湿度为53％的培养室中，先暗培养7天，基部开始膨大，分化出白色颗粒状愈伤组织，顶芽由淡黄色转变为嫩绿色。再在光照强度为1200lx、光照时间为9h/d、温度为23℃和湿度为53％的培养室中，进行光培养45天，愈伤分化成淡绿色小芽。上述诱导培养基为：MS基本培养基+2.0mg/L苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L萘乙酸+35g/L蔗糖+6g/L琼脂，该诱导培养基的pH值为6.0。

(4)继代培养：将上述经过诱导培养的得到的淡绿色小芽转接到继代培养基中，在温度为25℃和湿度为53％的培养室中，先暗培养7天，基部膨大，分化出愈伤组织，再在光照强度为1200lx、光照时间为9h/d、温度为23℃和湿度为53％的培养室中，进行光培养40天，得到滇黄精丛生芽。上述继代培养基为：MS基本培养基+4.0mg/L苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，该继代培养基的pH值为6.0。

(5)生根培养：将上述滇黄精丛生芽转接到生根培养基中，在温度为25℃和湿度为53％的培养室中，先暗培养15天，基部开始分化出不定根，根表面有白色绒毛，小芽分化出叶片，再在光照强度为1200lx、光照时间为9h/d、温度为23℃和湿度为53％的培养室中，进行光培养45天，得到根长4～5cm，根系发达的滇黄精生根苗。上述生根培养基为：1/2MS基本培养基+萘乙酸1.0mg/L+35g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.3g/L活性炭0.25g/L，该生根培养基的pH值为6.0。

(6)炼苗：将所述滇黄精生根苗根部的培养基用自来水清洗干净，阴凉处晾干水分，再转移至营养杯中培养12天，保持培养的温度为28℃，湿度为80％，得到滇黄精种苗；该营养杯中的基质组分按质量百分比包括酒精渣25％，蛭石30％，碎泥沙35％，鸡粪10％。

(7)移栽：将上述经炼苗后的滇黄精种苗移栽至大田。

实施例3

(1)外植体选取：从海拔600米的百色市隆林县采集的野生滇黄精，用根茎繁殖，种植在百色田林县实验基地，栽培一年，在9月初，从实验基地挖出地下根茎，选择带芽根茎从节间切下，去除须根，用自来水冲掉表面泥沙，并用毛刷刷掉残留的泥土，再用饱和洗衣粉水浸泡20min，然后用自来水冲洗1h，再用酒精擦拭表面，用无菌刀片和镊子，从外到内小心剥去2～3层顶芽鳞片，尽量保证里面的顶芽完整无划痕。

将剥好的滇黄精带芽根茎置于无菌玻璃瓶中，在超净工作台上用75％酒精浸泡40s，再用添加了1～2滴土温80的0.2％升汞溶液消毒15min，期间摇晃玻璃瓶，使其充分灭菌，最后用无菌水洗5次，用无菌滤纸吸干水分。

(2)将上述步骤(1)得到的滇黄精带芽根茎外植体接种到MS培养基中，每瓶培养基接种一个滇黄精带芽根茎外植体，在温度为27℃和湿度为55％的培养室中暗培养3天，然后剔除表面污染细菌、真菌或者失活的外植体，得到无菌外植体。

(3)诱导培养：将上述无菌外植体转接到诱导培养基中，在温度为27℃和湿度为55％的培养室中，先暗培养7天，基部开始膨大，分化出白色颗粒状愈伤组织，顶芽由淡黄色转变为嫩绿色。再在光照强度为1000lx、光照时间为10h/d、温度为27℃和湿度为55％的培养室中，进行光培养50天，愈伤分化成淡绿色小芽。上述诱导培养基为：MS基本培养基+3.0mg/L苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L萘乙酸+40g/L蔗糖+5g/L琼脂，该诱导培养基的pH值为6.2。

(4)继代培养：将上述经过诱导培养的得到的淡绿色小芽转接到继代培养基中，在温度为27℃和湿度为55％的培养室中，先暗培养7天，基部膨大，分化出愈伤组织，再在光照强度为1500lx、光照时间为10h/d、温度为27℃和湿度为55％的培养室中，进行光培养45天，得到滇黄精丛生芽。上述继代培养基为：MS基本培养基+5.0mg/L苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L萘乙酸+40g/L蔗糖+5g/L琼脂，该继代培养基的pH值为6.2。

(5)生根培养：将上述滇黄精丛生芽转接到生根培养基中，在温度为27℃和湿度为55％的培养室中，先暗培养15天，基部开始分化出不定根，根表面有白色绒毛，小芽分化出叶片，再在光照强度为1500lx、光照时间为10h/d、温度为27℃和湿度为55％的培养室中，进行光培养60天，得到根长4～5cm，根系发达的滇黄精生根苗。上述生根培养基为：1/2MS基本培养基+萘乙酸1.5mg/L+40g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.3g/L活性炭，该生根培养基的pH值为6.2。

(6)炼苗：将所述滇黄精生根苗根部的培养基用自来水清洗干净，阴凉处晾干水分，再转移至营养杯中培养15天，保持培养的温度为30℃，湿度为90％，得到滇黄精种苗；该营养杯中的基质组分按质量百分比包括：30％酒精渣、25％蛭石、30％碎泥沙和15％鸡粪。

(7)移栽：将上述经炼苗后的滇黄精种苗移栽至大田。

对实施例1～3的外植体灭菌污染率、从生芽出芽率、继代培养增殖系数、生根率和炼苗成活率进行相关的测试，结果如下表1所示。

表1

上述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明配方及制备工艺可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种滇黄精种苗的组培方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)选择滇黄精地下部分带芽根茎作为外植体，将剥下最外层芽鳞片的所述外植体进行灭菌处理，然后将灭菌后的所述外植体接种到MS培养基中进行培养；

(2)将无菌的所述外植体转接到诱导培养基中进行诱导培养得到分化出不定芽的外植体；

(3)将分化出不定芽的所述外植体转接到继代培养基中进行继代培养，得到滇黄精丛生芽；

(4)将所述滇黄精丛生芽转接至生根培养基中进行生根培养，得到滇黄精生根苗；

(5)将所述滇黄精生根苗进行炼苗。

2.根据权利要求1所述的滇黄精种苗的组培方法，其特征在于：步骤(1)中，在剥下所述最外层芽鳞片前，将带芽根茎从节间切下，去除须根后进行清洗和灭菌，再剥去外层顶芽鳞片。

3.根据权利要求2所述的滇黄精种苗的组培方法，其特征在于：所述清洗包括：用水冲洗掉表面泥沙，用毛刷除去残留泥土，然后在饱和洗衣粉水中浸泡20～30min，再用水冲洗30～60min；所述灭菌包括：先用75％酒精浸泡20～40s，再用混有1～2滴土温80的0.2％升汞摇晃灭菌10～15min，最后用无菌水清洗3～5次。

4.根据权利要求1所述的滇黄精种苗的组培方法，其特征在于：步骤(1)中，所述培养采用暗培养，所述培养的温度为23～27℃，所述培养的湿度为50～55％，所述培养的时间为3～5天。

5.根据权利要求1所述的滇黄精种苗的组培方法，其特征在于：步骤(2)中，所述诱导培养基包括MS培养基、苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖和琼脂；所述苄氨基腺嘌呤的浓度为1.0～3.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.2mg/L，所述蔗糖的浓度为25～40g/L，所述琼脂的浓度为5～7g/L；

所述诱导培养包括：先暗培养7天，再在光照强度为1500～2000lx的条件下光培养40～50天，光照时间为8～10h/d；所述诱导培养的温度为23～27℃，所述诱导培养的湿度为50～55％。

6.根据权利要求1所述的滇黄精种苗的组培方法，其特征在于：步骤(3)中，所述继代培养基包括MS培养基、苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖和琼脂；所述苄氨基腺嘌呤的浓度为3.0～5.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.2mg/L，所述蔗糖的浓度为25～40g/L，所述琼脂的浓度为5～7g/L；

所述继代培养包括：先暗培养7天，再在光照强度为1500～2000lx的条件下光培养30～45天，光照时间为8～10h/d；所述继代培养的温度为23～27℃，所述继代培养的湿度为50～55％。

7.根据权利要求1所述的滇黄精种苗的组培方法，其特征在于：步骤(4)中，所述生根培养基包括1/2MS培养基、萘乙酸、蔗糖、琼脂和活性炭；所述萘乙酸的浓度为0.5～1.5mg/L，所述蔗糖的浓度为25～30g/L，所述琼脂的浓度为4～6g/L，所述活性炭的浓度为0.2～0.3g/L；

所述生根培养包括：先暗培养15天，再在光照强度为1500～2000lx的条件下光培养45～60天，光照时间为8～10h/d；所述生根培养的温度为23～27℃，所述生根培养的湿度为50～55％。

8.根据权利要求1所述的滇黄精种苗的组培方法，其特征在于：所述诱导培养基、继代培养基和生根培养基的pH值为5.8～6.2。

9.根据权利要求1所述的滇黄精种苗的组培方法，其特征在于：步骤(5)中，所述炼苗包括：将所述滇黄精生根苗在营养杯中进行培养10～15天，所述培养的温度为25～30℃，所述培养的湿度为75～90％。

10.根据权利要求9所述的滇黄精种苗的组培方法，其特征在于：所述营养杯中的基质组分按质量百分比包括：酒精渣20～30％、蛭石25～35％、碎泥沙30～40％和鸡粪10～20％。