CN106718880A - 一种滇黄精的组培快繁方法 - Google Patents

一种滇黄精的组培快繁方法 Download PDF

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CN106718880A CN201611045404.8A CN201611045404A CN106718880A CN 106718880 A CN106718880 A CN 106718880A CN 201611045404 A CN201611045404 A CN 201611045404A CN 106718880 A CN106718880 A CN 106718880A
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Abstract

本发明公开了一种滇黄精的组培快繁方法，包括外殖体的选择与处理、诱导培养、继代培养、增殖培养、生根培养和炼苗移栽，其中诱导培养基为：MS +1.0～3.0mg/L6‑BA+0.5～1.0mg/L2,4‑D+1.0～2.0mg/L赤霉素+5.0～10.0g/L琼脂+20.0～30.0g/L蔗糖；增生根培养基为：1/2MS +0.2～1.0mg/LNAA +0.2～0.6mg/LIBA+0.2～0.5%活性炭+5～20%香蕉 +6.0～8.0g/L琼脂+20.0～25.0g/L蔗糖。本发明不仅有效的缩短了种苗培育的时间和成本，提高快繁的速度，而且有效的提高了黄精的繁殖系数，能较好的保持黄精的遗传稳定性，其移栽后的成活率可达到98%以上，创造较好的社会效益和经济效益。

Description

一种滇黄精的组培快繁方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种滇黄精的组培快繁方法。
背景技术
黄精为百合科多年生草本植物黄精、滇黄精或多花黄精的根茎，具有润肺滋阴、补中益气、益肾增精的作用。近代研究表明，黄精含有烟酸、醒类、豁液质、淀粉、二氨基丁酸、黄精多糖及低聚糖等成分，有麻醉及降低动物血压的作用，对肾上腺素引起的血糖过高有抑制作用，对改善肾功能也有较好功效。黄精还是一味抗菌良药，对伤寒杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌及皮肤癣菌等均有一定抑制作用。近年来，黄精已广泛用于冠心病、高血压、糖尿病、肺结核、再生障碍贫血、以及预防放疗、化疗引起的副作用等。由此可见，黄精的市场应用前景广阔，然而随着市场需求量的不断增加和野生资源的不断减少，黄精的人工栽培已成为市场供求的主体。目前，黄精的繁殖方式主要有性（种子）繁殖和无性（根茎）繁殖两种方式。由于黄精种子难收集，种子发芽率低，而且种子繁殖时间长。不利于黄精的人工大面积种植，所以在当前黄精的人工栽培中，繁殖主要依靠根茎的无性繁殖，该方法繁殖系数低、根茎的用量大，既不经济，又限制了黄精的产量潜力，不便于栽培管理推广。因此，研制开发一种成本低、繁殖系数高、繁殖速度快、技术稳定、可在短时间内提供大量优质黄精种苗的滇黄精的组培快繁方法是客观需要的。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种成本低、繁殖系数高、繁殖速度快、技术稳定、可在短时间内提供大量优质黄精种苗的滇黄精的组培快繁方法。
本发明的目的是这样实现的，一种滇黄精的组培快繁方法，包括以下几个步骤：
①外殖体的选择与处理:选取成熟、新鲜、无病虫害的滇黄精根茎，用刀切取带芽的根茎置于洗洁精水溶液中浸泡，浸泡1～3min后将其用流水清洗干净，然后用体积分数为70～75%的酒精浸泡1～2min，用无菌水反复冲洗2～3次，最后放入质量分数为0.1～0.3%的氯化汞中反复浸泡灭菌3～5次，每次浸泡的时间为3～5min，每次浸泡后须用无菌水冲洗2～3次,冲洗干净后再用无菌滤纸将无菌水吸干，用刀切去伤口坏死的部分即可进行接种；
②诱导培养：将步骤①中消毒处理后的根茎接种于诱导培养基上进行诱导培养，在培养温度为23～28℃，光照强度为2000～2500Lux，光照时间为12～16h/天的条件下培养，培养20～30天后根茎部分膨大，根茎的切口处诱导出淡黄色致密的愈伤组织，所述诱导培养基为：MS基本培养基+1.0～3.0mg/L6-BA+0.5～1.0mg/L2,4-D+1.0～2.0mg/L赤霉素+5.0～10.0g/L琼脂+20.0～30.0g/L蔗糖；
③继代培养：先将步骤②中诱导出的愈伤组织转接于继代培养基中进行继代培养，在培养温度为23～28℃，光照强度为2000～2500Lux，光照时间为12～16h/天的条件下培养，培养20～30天分化出新的幼芽；所述继代培养基为：MS培养基+3.0～4.5mg/L6-BA+2.0～3.0mg/L62BA +3.0～5.0mg/L玉米素+0.2～1.0mg/LNAA+1.0～3.0g/L琼脂+5.0～10.0g/L蔗糖；
④增殖培养：将步骤③中继代培养成功的带有幼芽的根茎切成0.4～0.8cm3的小块，然后接种于增殖培养基中，在培养温度为23～28℃，光照强度为2000～2500Lux，光照时间为12～16h/天的条件下培养20～30天后获得分化苗；所述增殖培养基为：MS培养基+2.0～4.0mg/L6-BA+0.5～1.5mg/L2,4D+0.5～1.0 mg/L GA3 +6.0～8.0g/L琼脂+20.0～25.0g/L蔗糖；
⑤生根培养：待步骤④中增殖培养得到的分化苗长至2～4cm时，先将分化苗转接到生根培养基上诱导生根，在培养温度为23～28℃，光照强度为2000～2500Lux，光照时间为12～16h/天的条件下培养20～30天后可观察到分化苗长出3～6条根须，根须长度为2～4cm，然后将分化苗移至自然光下培养，培养10天后即可进行组培苗的移栽，所生根培养基为：1/2MS培养基 +0.2～1.0mg/LNAA +0.2～0.6mg/LIBA+0.2～0.5%活性炭+5～20%香蕉 +6.0～8.0g/L琼脂+20.0～25.0g/L蔗糖；
⑥炼苗移栽：将步骤⑤中培养得到的组培苗从生根培养基中取出，洗净根部的培养基后，将组培苗移栽至苗床的育苗基质中，移栽初期需搭建小拱棚，覆盖透明塑料布，适当遮荫，保持环境温度20～25℃，空气湿度70～80%，每隔7天喷施1次营养液，15天后除去塑料布，逐渐通风，增加光照，转入常规管理，30～40天即可进行大田移栽。
本发明利用植物组培方法建立了滇黄精的快速繁殖体系，通过将黄精的根茎反复多次短时灭菌清洗，减少了污染，降低了灭菌剂对外殖体的损伤，经消毒处理后的外殖体经过组培培育，及可产生大量的种苗，从块茎到生根苗只需要6～8个月的时间。本发明在繁殖的过程中通过对各种的培养基、用量和培养条件的优化，不仅不仅有效的缩短了种苗培育的时间和成本，提高快繁的速度，而且有效的提高了黄精的繁殖系数，能较好的保持黄精的遗传稳定性，利用本方法的繁殖体系，其黄精幼芽的发芽率可达到99%以上，增殖培养后的成苗率达到96%以上，生根培养后生根率为99%以上，移栽后的成活率可达到98%以上，一个不定芽的根茎一次就可以繁殖出百万株的无性后代，该方法既可以为黄精的商品化生提供一套可行的生产技术路线，能为植物转基因的研究提供了理想的材料，又能创造较好的社会效益和经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1：
本实施例的具体步骤如下：
①外殖体的选择与处理:选取成熟、新鲜、无病虫害的滇黄精根茎，用刀切取带芽的根茎置于洗洁精水溶液中浸泡，浸泡1min后将其用流水清洗干净，然后用体积分数为70%的酒精浸泡1～2min，用无菌水反复冲洗2次，最后放入质量分数为0.1%的氯化汞中反复浸泡灭菌3次，每次浸泡的时间为5min，每次浸泡后须用无菌水冲洗2～3次, 所述氯化汞中含有质量分数为0.02%的土温20，冲洗干净后再用无菌滤纸将无菌水吸干，用刀切去伤口坏死的部分即可进行接种；
②诱导培养：将步骤①中消毒处理后的根茎接种于诱导培养基上进行诱导培养，在培养温度为23℃，光照强度为2500Lux，光照时间为12h/天的条件下培养，培养25天后根茎部分膨大，根茎的切口处诱导出淡黄色致密的愈伤组织，所述诱导培养基为：MS基本培养基+3.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+1.0mg/LKT+0.1mg/LNAA +1mg/L赤霉素+5g/L琼脂+20g/L蔗糖；
③继代培养：先将步骤②中诱导出的愈伤组织转接于继代培养基中进行继代培养，在培养温度为28℃，光照强度为2000ux，光照时间为16h/天的条件下培养，培养30天分化出新的幼芽；所述继代培养基为：MS培养基+4.5mg/L6-BA+2mg/L62BA +3mg/L玉米素+0.2mg/LNAA+1.0g/L琼脂+10g/L蔗糖；
④增殖培养：将步骤③中继代培养成功的带有幼芽的根茎切成0.4cm3的小块，然后接种于增殖培养基中，在培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/天的条件下培养20天后获得分化苗；所述增殖培养基为：MS培养基+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4D+1.0mg/L GA3 +6.0g/L琼脂+20g/L蔗糖；
⑤生根培养：待步骤④中增殖培养得到的分化苗长至2～4cm时，先将分化苗转接到生根培养基上诱导生根，在培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为16h/天的条件下培养30天后可观察到分化苗长出3～6条根须，根须长度为2～4cm，然后将分化苗移至自然光下培养，培养10天后即可进行组培苗的移栽，所生根培养基为：1/2MS培养基 +0.2mg/LNAA +0.2mg/LIBA+0.3mg/LCA+0.2%活性炭+5%香蕉 +6.0g/L琼脂+20g/L蔗糖；
⑥炼苗移栽：将步骤⑤中培养得到的组培苗从生根培养基中取出，洗净根部的培养基后，将组培苗移栽至苗床的育苗基质中，所述育苗基质为：树皮20份、锯末10份、蛭石30份、黑土10份、珍珠岩5份、草木灰0.2份，移栽初期需搭建小拱棚，覆盖透明塑料布，适当遮荫，保持环境温度20～25℃，空气湿度70～80%，每隔7天喷施1次营养液，15天后除去塑料布，逐渐通风，增加光照，转入常规管理， 40天即可进行大田移栽。
本实施例1的繁殖系数高、繁殖速度快、繁殖的周期短，培育得到种苗质量好、长势强，利用本实施例1的培育方法，其幼芽的发芽率可达到99.35%，增殖培养后的成苗率达到97.4%，生根培养后生根率为99.8%，生根苗移栽后的成活率达到97.8%，一个地下根茎经灭均诱导成功后，55天后能切成5块带芽的组织块，经过20天的增殖培养可得到30块以上的带芽块，在经过4～5代的增殖培养即可得到百万株种苗。
实施例2
本实施例的具体步骤如下：
①外殖体的选择与处理:选取成熟、新鲜、无病虫害的滇黄精根茎，用刀切取带芽的根茎置于洗洁精水溶液中浸泡，浸泡2min后将其用流水清洗干净，然后用体积分数为72.5%的酒精浸泡2min，用无菌水反复冲洗3次，最后放入质量分数为0.2%的氯化汞中反复浸泡灭菌4次，每次浸泡的时间为4min，每次浸泡后须用无菌水冲洗2～3次,冲洗干净后再用无菌滤纸将无菌水吸干，用刀切去伤口坏死的部分即可进行接种，所述氯化汞中含有质量分数为0.06%的土温20；
②诱导培养：将步骤①中消毒处理后的根茎接种于诱导培养基上进行诱导培养，在培养温度为25℃，光照强度为2200Lux，光照时间为14h/天的条件下培养，培养25天后根茎部分膨大，根茎的切口处诱导出淡黄色致密的愈伤组织，所述诱导培养基为：MS基本培养基+2mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+1.5mg/L赤霉素+8g/L琼脂+25g/L蔗糖；
③继代培养：先将步骤②中诱导出的愈伤组织转接于继代培养基中进行继代培养，在培养温度为25℃，光照强度为2200Lux，光照时间为14h/天的条件下培养，培养25天分化出新的幼芽；所述继代培养基为：MS培养基+4.0mg/L6-BA+2.5mg/L62BA +3.0mg/L玉米素+0.2mg/LNAA+3.0g/L琼脂+8.0g/L蔗糖；
④增殖培养：将步骤③中继代培养成功的带有幼芽的根茎切成0.6cm3的小块，然后接种于增殖培养基中，在培养温度为28℃，光照强度为2500Lux，光照时间为16h/天的条件下培养25天后获得分化苗；所述增殖培养基为：MS培养基+3.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4D+0.8mg/L GA3 +8.0g/L琼脂+22.0g/L蔗糖；
⑤生根培养：待步骤④中增殖培养得到的分化苗长至2～4cm时，先将分化苗转接到生根培养基上诱导生根，在培养温度为25℃，光照强度为2200Lux，光照时间为16h/天的条件下培养25天后可观察到分化苗长出3～6条根须，根须长度为2～4cm，然后将分化苗移至自然光下培养，培养10天后即可进行组培苗的移栽，所生根培养基为：1/2MS培养基 +0.8mg/LNAA +0.4mg/LIBA+0.3%活性炭+10%香蕉 +0.5mg/LCA +7.0g/L琼脂+22.0g/L蔗糖；
⑥炼苗移栽：将步骤⑤中培养得到的组培苗从生根培养基中取出，洗净根部的培养基后，将组培苗移栽至苗床的育苗基质中，所述育苗基质为：树皮30份、锯末25份、蛭石35份、黑土20份、珍珠岩3份、草木灰0.2份，移栽初期需搭建小拱棚，覆盖透明塑料布，适当遮荫，保持环境温度20～25℃，空气湿度70～80%，每隔7天喷施1次营养液，15天后除去塑料布，逐渐通风，增加光照，转入常规管理，30～40天即可进行大田移栽。
本实施例2的繁殖系数高、繁殖速度快、繁殖的周期短，培育得到种苗质量好、长势强，利用本实施例2的培育方法，其幼芽的发芽率可达到99.56%，增殖培养后的成苗率达到98.67%，生根培养后生根率为99.45%，生根苗移栽后的成活率达到99.2%，一个地下根茎经灭均诱导成功后，50天后能切成5块带芽的组织块，经过25天的增殖培养可得到30块以上的带芽块，在经过4～5代的增殖培养即可得到百万株种苗。
实施例3：
本实施例的具体步骤如下：
①外殖体的选择与处理:选取成熟、新鲜、无病虫害的滇黄精根茎，用刀切取带芽的根茎置于洗洁精水溶液中浸泡，浸泡3min后将其用流水清洗干净，然后用体积分数为75%的酒精浸泡2min，用无菌水反复冲洗3次，最后放入质量分数为0.3%的氯化汞中反复浸泡灭菌5次，每次浸泡的时间为3min，每次浸泡后须用无菌水冲洗2～3次,冲洗干净后再用无菌滤纸将无菌水吸干，用刀切去伤口坏死的部分即可进行接种，所述氯化汞中含有质量分数为0.1%的土温20；
②诱导培养：将步骤①中消毒处理后的根茎接种于诱导培养基上进行诱导培养，在培养温度为28℃，光照强度为2500Lux，光照时间为16h/天的条件下培养，培养30天后根茎部分膨大，根茎的切口处诱导出淡黄色致密的愈伤组织，所述诱导培养基为：MS基本培养基+3.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+2.0mg/LKT+0.2mg/LNAA +2.0mg/L赤霉素+5.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖；
③继代培养：先将步骤②中诱导出的愈伤组织转接于继代培养基中进行继代培养，在培养温度为28℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/天的条件下培养，培养30天分化出新的幼芽；所述继代培养基为：MS培养基+4.5mg/L6-BA+3.0mg/L62BA +5.0mg/L玉米素+0.2mg/LNAA+3.0g/L琼脂+10.0g/L蔗糖；
④增殖培养：将步骤③中继代培养成功的带有幼芽的根茎切成0.8cm3的小块，然后接种于增殖培养基中，在培养温度为28℃，光照强度为2500Lux，光照时间为12h/天的条件下培养30天后获得分化苗；所述增殖培养基为：MS培养基+4.0mg/L6-BA+1.5mg/L2,4D+1.0mg/L GA3 +6.0g/L琼脂+25.0g/L蔗糖；
⑤生根培养：待步骤④中增殖培养得到的分化苗长至2～4cm时，先将分化苗转接到生根培养基上诱导生根，在培养温度为28℃，光照强度为2500Lux，光照时间为12h/天的条件下培养30天后可观察到分化苗长出3～6条根须，根须长度为2～4cm，然后将分化苗移至自然光下培养，培养10天后即可进行组培苗的移栽，所生根培养基为：1/2MS培养基 +1.0mg/LNAA +0.6mg/LIBA+0.5%活性炭+20%香蕉 +8.0g/L琼脂+25.0g/L蔗糖；
⑥炼苗移栽：将步骤⑤中培养得到的组培苗从生根培养基中取出，洗净根部的培养基后，将组培苗移栽至苗床的育苗基质中，所述育苗基质为：树皮40份、锯末30份、蛭石40份、黑土20份、珍珠岩5份、草木灰0.3份，移栽初期需搭建小拱棚，覆盖透明塑料布，适当遮荫，保持环境温度20～25℃，空气湿度70～80%，每隔7天喷施1次营养液，15天后除去塑料布，逐渐通风，增加光照，转入常规管理，30～40天即可进行大田移栽。
本实施例3的繁殖系数高、繁殖速度快、繁殖的周期短，培育得到种苗质量好、长势强，利用本实施例3的培育方法，其幼芽的发芽率可达到99.21%，增殖培养后的成苗率达到99.45%，生根培养后生根率为99.95%，生根苗移栽后的成活率达到98.2%，一个地下根茎经灭均诱导成功后，60天后能切成5块带芽的组织块，经过30天的增殖培养可得到30块以上的带芽块，在经过4～5代的增殖培养即可得到百万株种苗。

Claims (5)

1.一种滇黄精的组培快繁方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
①外殖体的选择与处理:选取成熟、新鲜、无病虫害的滇黄精根茎，用刀切取带芽的根茎置于洗洁精水溶液中浸泡，浸泡1～3min后将其用流水清洗干净，然后用体积分数为70～75%的酒精浸泡1～2min，用无菌水反复冲洗2～3次，最后放入质量分数为0.1～0.3%的氯化汞中反复浸泡灭菌3～5次，每次浸泡的时间为3～5min，每次浸泡后须用无菌水冲洗2～3次,冲洗干净后再用无菌滤纸将无菌水吸干，用刀切去伤口坏死的部分即可进行接种；
②诱导培养：将步骤①中消毒处理后的根茎接种于诱导培养基上进行诱导培养，在培养温度为23～28℃，光照强度为2000～2500Lux，光照时间为12～16h/天的条件下培养，培养20～30天后根茎部分膨大，根茎的切口处诱导出淡黄色致密的愈伤组织，所述诱导培养基为：MS基本培养基+1.0～3.0mg/L6-BA+0.5～1.0mg/L2,4-D+1.0～2.0mg/L赤霉素+5.0～10.0g/L琼脂+20.0～30.0g/L蔗糖；
③继代培养：先将步骤②中诱导出的愈伤组织转接于继代培养基中进行继代培养，在培养温度为23～28℃，光照强度为2000～2500Lux，光照时间为12～16h/天的条件下培养，培养20～30天分化出新的幼芽；所述继代培养基为：MS培养基+3.0～4.5mg/L6-BA+2.0～3.0mg/L62BA +3.0～5.0mg/L玉米素+0.2～1.0mg/LNAA+1.0～3.0g/L琼脂+5.0～10.0g/L蔗糖；
④增殖培养：将步骤③中继代培养成功的带有幼芽的根茎切成0.4～0.8cm3的小块，然后接种于增殖培养基中，在培养温度为23～28℃，光照强度为2000～2500Lux，光照时间为12～16h/天的条件下培养20～30天后获得分化苗；所述增殖培养基为：MS培养基+2.0～4.0mg/L6-BA+0.5～1.5mg/L2,4D+0.5～1.0 mg/L GA3 +6.0～8.0g/L琼脂+20.0～25.0g/L蔗糖；
⑤生根培养：待步骤④中增殖培养得到的分化苗长至2～4cm时，先将分化苗转接到生根培养基上诱导生根，在培养温度为23～28℃，光照强度为2000～2500Lux，光照时间为12～16h/天的条件下培养20～30天后可观察到分化苗长出3～6条根须，根须长度为2～4cm，然后将分化苗移至自然光下培养，培养10天后即可进行组培苗的移栽，所生根培养基为：1/2MS培养基 +0.2～1.0mg/LNAA +0.2～0.6mg/LIBA+0.2～0.5%活性炭+5～20%香蕉 +6.0～8.0g/L琼脂+20.0～25.0g/L蔗糖；
⑥炼苗移栽：将步骤⑤中培养得到的组培苗从生根培养基中取出，洗净根部的培养基后，将组培苗移栽至苗床的育苗基质中，移栽初期需搭建小拱棚，覆盖透明塑料布，适当遮荫，保持环境温度20～25℃，空气湿度70～80%，每隔7天喷施1次营养液，15天后除去塑料布，逐渐通风，增加光照，转入常规管理，30～40天即可进行大田移栽。
2.根据权利要求1所述的一种滇黄精的组培快繁方法，其特征在于：在步骤②中，所述的诱导培养基中还添加有1.0～2.0mg/LKT+0.1～0.2mg/LNAA。
3.根据权利要求1所述的一种滇黄精的组培快繁方法，其特征在于：在步骤⑤中，所述生根培养基中还添加有0.3～0.5mg/LCA。
4.根据权利要求1所述的一种滇黄精的组培快繁方法，其特征在于：在步骤⑥中，所述育苗基质为：树皮20～40份、锯末10～30份、蛭石30～40份、黑土10～20份、珍珠岩2～5份、草木灰0.2～0.3份。
5.根据权利要求1所述的一种滇黄精的组培快繁方法，其特征在于：在步骤①中，所述氯化汞中含有质量分数为0.02～0.1%的土温20。
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