CN102960243A - 一种利用中国石蒜不带基盘鳞片组培快繁的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用中国石蒜不带基盘鳞片组培快繁的方法，包括以下步骤：(1)以MS培养基为基础，添加6-BA、NAA、2，4-D等植物生长调节剂；(2)选取不带基盘的中国石蒜鳞茎或无菌培养的小鳞茎；(3)培养室温度控制在25±2℃，光照1000-1200lx；(4)诱导出愈伤组织及小鳞茎后，切割并转接于增殖培养基中继代；(5)壮苗培养；(6)生根培养；(7)幼苗消毒后移栽，保持湿润环境，待幼苗叶片伸展，即可进行正常管理。本发明利用中国石蒜不带基盘鳞片建立快繁体系，具有取材少、繁殖系数高等优点；得到的幼苗遗传基础一致、性状稳定、生长势整齐，在观赏和药用新品种栽培中具有显著的竞争优势。

Description

一种利用中国石蒜不带基盘鳞片组培快繁的方法

1.技术领域

本发明涉及一种利用中国石蒜不带基盘鳞片建立无菌培养体系快速繁殖鳞茎的方法。 

2.背景技术

中国石蒜Lycoris chinensis属石蒜科Amaryllidaceae石蒜属Lycoris植物，在国内主要分布于长江流域及西南诸省，是一类优良的球根花卉植物和药用植物。目前，已在城市绿化、鲜切花销售、药用等不同领域得到应用。自然条件下，中国石蒜主要依靠鳞茎分球和种子自播繁殖，繁殖系数很低，而且野生资源数量有限，难以满足大规模的生产应用。因此，开发中国石蒜组培快繁技术对野生种群保护与园林生产应用具有重要意义。 

组织培养技术作为植物品种快繁的主要手段已在鳞茎类植物中得到广泛应用，它可以大幅度提高鳞茎的繁殖系数，满足中国石蒜快速大规模繁育生产的需要，有效解决中国石蒜鳞茎供不应求的矛盾。 

CN102217540A公开了周坚的“一种中国石蒜的快速繁殖方法”发明专利技术，以中国石蒜的种胚为外植体，先诱导外植体产生愈伤组织，进而诱导不定芽、小鳞茎的发生，最终完成植株再生，这种方法虽然繁殖系数较高，但种子的遗传背景较复杂，繁育出的后代性状分离现象严重，限制了中国石蒜纯系品种的推广应用。 

3.发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是利用中国石蒜不带基盘鳞片建立无菌培养体系培养再生植株。 

解决上述技术问题的技术方案按如下步骤进行： 

(1)培养基的配方及配制 

诱导及扩繁培养基配方：MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L 

壮苗培养基配方：MS+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L 

生根培养培养基配方：1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L 

具体的配制方法： 

A、按照MS培养基配方，分别配置10×大量元素、100×微量元素、100×铁盐及100×有机物的母液； 

B、加入一定量的母液，再加入相应的激素及蔗糖(30g)、琼脂(5.5g)，定容，调节pH值至5.9，微波炉加热，煮沸至溶液呈透明； 

C、将配制好的培养基分装在事先准备好的培养瓶中，1L一般分装20-22瓶，然后盖上盖子并注明标签进行高压灭菌(121℃维持时间18-25min)； 

D、灭菌过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，放置24小时后使用，一般应在消毒后的两周内 用完。 

(2)材料的选择及接种 

A：选取营养充足的中国石蒜鳞茎，去除表面杂物，用洗洁剂浸泡10min，再用流水冲洗2h。将鳞茎表面的水分吸干，选取上半部不带基盘的部分，进行灭菌，灭菌过程为：75％乙醇中消毒40s-1min→无菌水清洗2次→0.1％ HgCl2溶液中灭菌8-12min(期间不断摇晃)→无菌水清洗5次。将灭好菌的材料用无菌滤纸吸干表面水分，用小剪刀将接触HgCl2的四周剪去0.5cm左右，再将其剪成长宽1cm左右的小片，即可接种到培养基中。 

B：选择无菌培养的小鳞茎转接，切除下半部基盘，去除上部叶片后，直接将其接种于培养基中，也可将其切成两半分别接种。 

(3)培养条件 

将接种好的材料放在培养架上，培养室温度控制在25±2℃，光照1000-1200lx，16h/天。 

(4)诱导培养和增殖培养 

材料接种于诱导培养基上一个月后，即可诱导出的愈伤组织及小鳞茎，然后切割并转接于增殖培养基中，一般一次继代培养可扩繁4倍以上。继代培养可连续进行，继代周期一个月左右，达到预期扩繁数量为止。 

(5)壮苗培养 

将分化出的小鳞茎去除叶片，根系，直接接种于壮苗培养基中一个月，即可达到壮苗效果。 

(6)生根培养 

继代培养得到的小鳞茎直径达到0.5cm左右时，即可进行生根培养。将生长势健壮的中国石蒜小苗(适当去除叶片减少营养消耗)转接于生根培养基上，一般半个月时间可长出一定量的健壮根系，待长出3条1cm以上的须根后，进行驯化移栽。 

(7)驯化移栽 

将幼苗根部附着的培养基用清水洗净，然后修剪去较长的根须，用稀释800-1000倍的多菌灵浸泡10-15min即可移栽于大棚苗床，保持空气湿度90％以上，并加盖遮阳网。半个月后，待幼苗叶片展开后，可除去遮阳网，进行正常栽培管理。 

本发明的有益效果：(1)利用中国石蒜不带基盘的鳞片作为外植体，建立无菌快繁体系，再生植株，为中国石蒜的快速繁育提供一种新的有效的途径。(2)由组织培养得到的中国石蒜幼苗，具有遗传基础一致、性状稳定、生长势整齐等特点，在观赏中国石蒜的栽培中有显著的竞争优势。 

4.附图说明

图1：不带基盘单鳞片诱导出愈伤组织；图2：不带基盘单鳞片诱导出小鳞茎；图3：无菌苗小鳞茎上半部诱导出愈伤组织；图4：愈伤组织诱导小鳞茎。 

5.具体实施方式

下面结合实施例作进一步详述：本发明所指明的培养过程包括四个培养阶段，各培养阶段所用培养基配方均以MS培养基为基础，添加不同种类和不同浓度的植物生长调节剂构成。通过生长调节剂的调节，调控中国石蒜再生植株的发育过程，实现中国石蒜鳞片组织的脱分化、再分化，得到再生植株。 

下面将本发明中培养过程的信息按五项实施例列于下表： 

实施例1：选取营养充足的中国石蒜鳞茎，去除外表杂物，清洁剂浸泡10分钟，流水冲洗2小时，吸于表面水分移至无菌操作台进行消毒处理；用解剖刀将鳞片切成1.0-1.5cm的片段，接种在培养基上；将接种好的材料置于培养架上培养，1个半月后，可观测到鳞片上愈伤组织及小鳞茎的分化。 

实施例2：：选取无菌苗小鳞茎不带基盘的上半部，去除叶片，接种于诱导培养基中，置于与实施例1相同的培养条件下培养，1个月后可观察到培养物基部分化出愈伤组织。 

实施例3-5：将已诱导出的愈伤组织按照0.5×0.5cm规格分成几个小块，转接于增殖培养基上；诱导出的小鳞茎则将其上部分切除，留下带基盘的底部再转接至增殖培养基上。待扩繁到一定数量之后将每个小鳞茎分出，去除叶片后，接种于壮苗培养基中1个月，促其鳞茎生长到直径0.5cm左右，即可进行生根培养，待每个小鳞茎长出3条1cm以上的健壮须根，便可进行驯化移栽。 

上表的五项实施例中，成功率均在76％以上，对于未达到下一生长阶段要求的培养物，可延长培养时 间，直至得到满意效果。 

总之本方法的关键是把握好接种材料的选择和处理、培养基的成分含量和培养条件，以及无菌实验操作三个环节，其中培养基的成分含量、培养条件和无菌实验操作较为容易掌握，但因接种材料的选择和处理方法，不易控制，故只对其用列表形式举出实施例予以说明。 

Claims (1)

1.一种利用中国石蒜不带基盘鳞片组培快繁的方法，其技术方案按如下步骤进行：

(1)培养基的配方及配制

诱导及扩繁培养基配方：MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L

壮苗培养基配方：MS+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L

生根培养培养基配方：1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L

具体的配制方法：

A、按照MS培养基配方，分别配置10×大量元素、100×微量元素、100×铁盐及100×有机物的母液；

B、加入一定量的母液，再加入相应的激素及蔗糖(30g)、琼脂(5.5g)，定容，调节pH值至5.9，微波炉加热，煮沸至溶液呈透明；

C、将配制好的培养基分装在事先准备好的培养瓶中，1L一般分装20-22瓶，然后盖上盖子并注明标签进行高压灭菌(121℃维持时间18-25min)；

D、灭菌过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，放置24小时后使用，一般应在消毒后的两周内用完。

(2)材料的选择及接种

A：选取营养充足的中国石蒜鳞茎，去除表面杂物，用洗洁剂浸泡10min，再用流水冲洗2h。将鳞茎表面的水分吸干，选取上半部不带基盘的部分，进行灭菌，灭菌过程为：75％乙醇中消毒40s-1min→无菌水清洗2次→0.1％HgCl2溶液中灭菌8-12min(期间不断摇晃)→无菌水清洗5次。将灭好菌的材料用无菌滤纸吸干表面水分，用小剪刀将接触HgCl2的四周剪去0.5cm左右，再将其剪成长宽1cm左右的小片，即可接种到培养基中。

B：选择无菌培养的小鳞茎转接，切除下半部基盘，去除上部叶片后，直接将其接种于培养基中，也可将其切成两半分别接种。

(3)培养条件

将接种好的材料放在培养架上，培养室温度控制在25±2℃，光照1000-1200lx，16h/天。

(4)诱导培养和增殖培养

材料接种于诱导培养基上一个月后，即可诱导出的愈伤及小鳞茎，然后切割并转接于增殖培养基中，一般一次继代培养可扩繁4倍以上。继代培养可连续进行，继代周期一个月左右，达到预期扩繁数量为止。

(5)壮苗培养

将分化出的小鳞茎去除叶片，根系，直接接种于壮苗培养基中一个月，即可达到壮苗效果。

(6)生根培养

继代培养得到的小鳞茎直径达到0.5cm左右时，即可进行生根培养。将生长势健壮的中国石蒜小苗(适当去除叶片减少营养消耗)转接于生根培养基上，一般半个月时间可长出一定量的健壮根系，待长出3条1cm以上的须根后，进行驯化移栽。

(7)驯化移栽

将幼苗根部附着的培养基用清水洗净，然后修剪去较长的根须，用稀释800-1000倍的多菌灵浸泡10-15min即可移栽于大棚苗床，保持空气湿度90％以上，并加盖遮阳网。半个月后，待幼苗叶片展开后，可除去遮阳网，进行正常栽培管理。

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