CN103141387A - 一种万象组织培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种万象组织培养的方法，包括如下步骤：培养基的配制、外植体的选取与消毒、愈伤诱导、不定芽诱导、不定芽增值、壮苗培养、不定芽生根诱导、组培苗驯化及移栽。基本培养基选用MS培养基，蔗糖用量为20～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，培养基pH分装前调整为5.7～5.8；愈伤诱导培养基为MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；不定芽诱导培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；不定芽增殖培养基为MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；壮苗培养基为MS+6-BA0.1～0.2mg/L+NAA0.01～0.1mg/L；生根培养基为MS+IBA0～1.0mg/L或1/2MS+IBA0～1.0mg/L。本发明的优点：建立的万象组培快繁技术体系增殖系数2～2.5，生根率100％，移栽成活率98％以上。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术、植物茎尖培养技术，主要是一种万象组织培养的方法。
背景技术
万象(Haworthia maughanii)，又名毛汉十二卷，为百合科(Liliaceae)、十二卷属（Haworthia）多年生多浆植物,原产南非，喜温暖、干燥和阳光充足的环境，耐干旱，怕积水、忌烈日曝晒，不耐寒冷。万象整株植株无茎，条状肉质叶从基部斜出，呈松散的莲座状排列，叶顶端截面透明或半透明，有些品种叶顶端截面上还有花纹。万象品种多样，株型小巧、奇特，观赏价值较高，目前主要用小盆栽培，适合阳台、窗台和书桌点缀、观赏，具有较大的市场前景。
万象的繁殖常用播种、分株、插叶、插根等方式，但是传统繁殖方式受季节、年限及栽培技术限制严重，每年繁殖数量有限，不利用万象的推广。植物组织培养技术被认为是目前最高效的植物种苗快繁技术手段，目前，国内利用植物组培技术对万象进行快速繁殖的文献报道极少，产业化生产体系尚未建立。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种万象组织培养的方法，建立良好的万象组培再生体系，为万象种苗产业化生产、新品种创制及品质遗传改良等做好技术支持。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种万象组织培养的方法，该方法包括以下几个步骤：
1)外植体的选取及处理：选取万象穗状花序作为起始材料，收集到的万象穗状花序剥去小穗基部萼片，再将整个花序切成0.5cm长短，作为组培用外植体；
2）愈伤诱导：在超净工作台上，将经过表面消毒的外植体在转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于初代培养基MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L中进行初代培养，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1；
3）不定芽诱导：将获得的增殖良好的万象愈伤材料转移至诱导培养基MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L中，进行不定芽，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1；
4）不定芽增殖：在无菌工作台上，将愈伤诱导获得的1～1.5cm高的不定芽2～3个一丛，利用无菌的解剖刀将基部轻轻造成一些伤口，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，不定芽增殖培养基为MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1；
5）壮苗培养：高生长到1.5～2cm的丛生不定芽2～3个一丛，接种到壮苗培养基MS+6-BA0.1～0.2mg/L+NAA0.01～0.1mg/L中培养，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1；
6）不定芽生根诱导：从基部将高生长到3～5cm的丛生不定芽分开成单个不定芽，接入生根培养基中进行不定根的诱导，生根培养基为MS+IBA0～0.5mg/L或1/2MS+IBA0～0.5mg/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1；
7）组培苗驯化及移栽：不定芽基部长出3～5条1～2cm的不定根后，将组培移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养1～2d，完成组培苗移栽前驯化，然后将组培苗从培养瓶取出，洗净组培苗表面琼脂，晾至表皮稍红,，栽入基质中，保湿60％-80％以上培养15d，然后在温室中正常培养。
愈伤诱导、不定芽诱导及增殖、壮苗培养、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，培养基pH分装前调整为5.7～5.8。
本发明有益的效果是：
1、通过组织培养技术进行万象种苗快繁，生产不受地区、季节、气候及母株生长年限的限制，便于工厂化育苗，可根据订单进行生产，生产时间及规模可控，为万象的推广应用提供充足的优质种苗保障。
2、繁殖系数达到2～2.5，生根率100％，移栽成活率98％以上，达到种苗工厂化育苗生产的要求，目前尚未见关于万象组织培养的文献报道。
3、组培苗后代种苗遗传背景一致，最大限度保持母本的优良性状。
4、有利于本属其他植物品种组培快繁体系建立借鉴、推广。
5、建立良好的组培快繁体系，为今后利用植物生物技术对万象进行新品种培育、遗传改良等研究工作奠定基础。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
本发明所述的万象组织培养的方法，包括步骤如下：
1、培养基及培养条件：基本培养基选用MS培养基，蔗糖用量为20～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，培养基pH分装前调整为5.7～5.8；愈伤诱导培养基为MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；不定芽诱导培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；不定芽增殖培养基为MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；壮苗培养基为MS+6-BA0.1～0.2mg/L+NAA0.01～0.1mg/L；生根培养基为MS+IBA0～1.0mg/L或1/2MS+IBA0～1.0mg/L；愈伤诱导、不定芽诱导及增殖、壮苗培养、不定芽生根培养条件为，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1。
2、外植体的处理与消毒：选取万象穗状花序作为起始材料，收集到的万象穗状花序剥去小穗基部萼片，再将整个花序切成0.5cm左右长短，作外植体，处理好的外植体用洗洁精溶液清洗30min，期间不断轻轻搅拌，然后流水冲洗经洗洁精清洗的外植体材料30～60min，在已经过消毒的超净工作台上将经流水清洗过的万象外植体转移至无菌锥形瓶中，用75%酒精浸泡30～40s，期间不断轻轻晃动锥形瓶，去除附在万象外植体表面气泡，倒出75%酒精，再用0.1%HgCl2溶液浸泡材料8～10min，或用有效氯浓度为1%NaClO溶液浸泡材料10～15min，浸泡期间不断轻轻晃动锥形瓶，去除附在万象外植体表面气泡，倒出0.1%HgCl2溶液或1%NaClO溶液，用无菌水清洗经过消毒处理的种子4～5次，处理后的外植体用无菌水浸泡、备用。
3、愈伤诱导：在超净工作台上，将经过表面消毒的万象外植体转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于愈伤诱导培养基MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L中进行愈伤诱导，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1。
4、不定芽诱导：将获得的增殖良好的万象愈伤材料转移至诱导培养基MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L中，进行不定芽，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1。
5、不定芽增殖：在无菌工作台上，将愈伤诱导获得的1～1.5cm高的不定芽2～3个一丛，利用无菌的解剖刀将基部轻轻造成一些伤口，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，不定芽增殖培养基为MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1。
6、壮苗培养：高生长到1.5～2cm左右的丛生不定芽2～3个一丛，接种到壮苗培养基MS+6-BA0.1～0.2mg/L+NAA0.01～0.1mg/L中培养，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1。
7、不定芽生根诱导：高生长到3～5cm的丛生不定芽从基部分开成单个，接入生根培养基中进行不定根的诱导,生根培养基为MS+IBA0～1.0mg/L或1/2MS+IBA0～1.0mg/L或MS+NAA0～1.0mg/L或1/2MS+NAA0～1.0mg/，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1，生根率达100％。
8、组培苗驯化及移栽：不定芽基部长出3～5条2～3cm的肉质不定根后，将生根苗移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养1～2d，将万象生根植株小心从培养瓶中取出，用自来水洗净组培苗基部的培养基,然后在通风阴凉处放置2～3天，晾干至组培苗表面稍红,将万象组培苗，栽入基质中，保湿60％-80％以上培养15d，然后在温室中正常培养,移栽成活率98%以上。
最后，应当指出，以上实例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种万象组织培养的方法，其特征在于：该方法包括以下几个步骤：
1)外植体的选取及处理：选取万象穗状花序作为起始材料，收集到的万象穗状花序剥去小穗基部萼片，再将整个花序切成0.5cm长短，作为组培用外植体；
2）愈伤诱导：在超净工作台上，将经过表面消毒的外植体在转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于初代培养基MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L中进行初代培养，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1；
3）不定芽诱导：将获得的增殖良好的万象愈伤材料转移至诱导培养基MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L中，进行不定芽，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1；
4）不定芽增殖：在无菌工作台上，将愈伤诱导获得的1～1.5cm高的不定芽2～3个一丛，利用无菌的解剖刀将基部轻轻造成一些伤口，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，不定芽增殖培养基为MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1；
5）壮苗培养：高生长到1.5～2cm的丛生不定芽2～3个一丛，接种到壮苗培养基MS+6-BA0.1～0.2mg/L+NAA0.01～0.1mg/L中培养，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1；
6）不定芽生根诱导：从基部将高生长到3～5cm的丛生不定芽分开成单个不定芽，接入生根培养基中进行不定根的诱导，生根培养基为MS+IBA0～0.5mg/L或1/2MS+IBA0～0.5mg/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为45～60μ·mol·m-2·s-1；
7）组培苗驯化及移栽：不定芽基部长出3～5条1～2cm的不定根后，将组培移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养1～2d，完成组培苗移栽前驯化，然后将组培苗从培养瓶取出，洗净组培苗表面琼脂，晾至表皮稍红,，栽入基质中，保湿60％-80％以上培养15d，然后在温室中正常培养。
2.根据权利要求1所述的万象组织培养的方法，其特征在于：愈伤诱导、不定芽诱导及增殖、壮苗培养、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，培养基pH分装前调整为5.7～5.8。
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