CN109169286B - 一种多花黄精组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物种植领域，具体涉及一种多花黄精组织培养方法。本发明提供了用于多花黄精组织培养的组合物以及组合物用于培养多花黄精的方法。本发明的方法采用多花黄精的幼嫩块茎为材料，采用植物组织培养技术，通过多花黄精块茎诱导愈伤组织，愈伤组织增殖分化，低温处理打破多花黄精芽休眠，达到快速高效的多花黄精种苗生产要求，适合多花黄精种苗的规模化生产。

Description

一种多花黄精组织培养方法
技术领域
本发明属于药物种植领域，具体涉及一种多花黄精组织培养方法。
背景技术
多花黄精Polygonatum cyrtonema是百合科Liliaceae黄精属Polygonatum植物，与同属的黄精Polygonatum sibiricum、滇黄精Polygonatum kingianum coll.et Hemsl.一起被中国药典收录为中药黄精的基源植物。多花黄精根茎具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的传统功效，用于健胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、口干食少、肺虚燥咳、精血不足、腰膝酸软等。多花黄精在抗衰老、调节免疫力、调血脂、改善记忆力、抗肿瘤、抗菌等方面有广泛的应用前景。多花黄精在重庆、四川、湖南、湖北、贵州、浙江等省份均有分布。
多花黄精的传统繁殖方式有块茎和种子繁殖两种。多花黄精的块茎繁殖需要消耗大量块茎，块茎同时又是商品，造成用种成本高。同时，块茎繁殖过程中容易造成腐烂，种植风险较高。多花黄精种子繁殖是常规繁殖方式，但是种子繁殖生长速度慢，一般第一年只有初生茎长出，第二年可以长出一片叶子，三年后才会长到十几公分，第四年以后才能移栽大田，田间管理费用较高，如除草等农事操作需要大量人工。
申请号为201711317934.8的专利公开了一种多花黄精的组培快繁方法，包括依次进行沙藏、35～40℃温水浸泡和赤霉素处理对多花黄精种子进行预处理，以打破种子休眠；将预处理的种子接种于种子丛生芽诱导培养基中，直接将种子诱导为丛生芽，所述的种子丛生芽诱导培养基的组成包括：MS培养基+6-BA1.5～2.5mg/L+GA30.5～1.5mg/L+琼脂6.5～7g/L+蔗糖30～35g/L，pH值为5.5～6.0；将丛生芽分割并进行增殖培养以扩大丛生芽数量，生根培养、炼苗移栽，得到多花黄精种苗。该方法使用多花黄精种子进行繁殖，仍存在生长速度慢的问题。
目前尚无针对多花黄精块茎的组培快繁方法。
因此开发一种多花黄精块茎的组织培养方法，提高多花黄精的繁殖效率以降低时间和管理成本。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于多花黄精块茎组织培养的组合物及其用于多花黄精组织培养的方法，以及低温处理促进组织培养获得的带芽块茎出苗的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
用于多花黄精块茎组织培养的组合物，所述组合物包含外植体处理培养基、愈伤组织诱导培养基和块茎诱导培养基；
所述外植体处理培养基在MS培养基的基础上还包含6-苄氨基腺嘌呤2.0-3.0mg/L，蔗糖20-35g/L和琼脂4-8g/L；
所述愈伤组织诱导培养基在MS培养基的基础上还包含6-苄氨基腺嘌呤1.5-3.0mg/L，蔗糖20-35g/L和琼脂4-8g/L；
所述块茎诱导培养基在1/2MS培养基的基础上还包含萘乙酸0.1-0.8mg/L，蔗糖20-35g/L和琼脂4-8g/L。
MS培养基为组织的生长提供所需的碳源、氮源、水、无机物和生长因子。
所述MS培养基包括大量元素、微量元素、铁盐和有机化合物，所述1/2MS培养基为MS培养基中大量元素减半，其他不变，MS培养基具体的配方如下：
大量元素的组分及其对应的浓度为：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、二水氯化钙440mg/L；
微量元素的组分及其对应的浓度为：碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L；
铁盐的组分及其对应的浓度为：七水硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸二钠浓度为37.3mg/L；
有机化合物的组分及其对应的浓度为：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L。
所述6-苄氨基腺嘌呤(Benzylaminopurine)，简称6-Ba，是人工合成的细胞分裂素。6-Ba具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，以及将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能。6-苄氨基腺嘌呤作为一种植物生长调节剂，具有促进促进外植体形成丛生芽的作用。
萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid)，简称NAA，是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根的作用。萘乙酸可经叶片、树枝的嫩表皮、种子进入到植物体内，随同营养流输导到作用部位。
蔗糖为细胞的分裂、扩大、增殖提供必要的能量。
其中琼脂的用量随品牌强度不同而改变。
作为优选的方案，所述外植体处理培养基还包含萘乙酸，添加量为0-0.5mg/L。
作为优选的方案，所述外植体处理培养基、愈伤组织诱导培养基和块茎诱导培养基中蔗糖添加量为23-27g/L。
作为优选的方案，所述块茎诱导培养基中萘乙酸添加量为0.2-0.5mg/L。
本发明的目的还在于提供一种上述的组合物在用于多花黄精组织培养的应用。
本发明的目的还在于提供一种低温处理促进多花黄精的芽出苗的方法，其首次将低温处理用于多花黄精的组织培养，打破多花黄精芽的休眠，对于提高繁殖效率有重要意义。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种低温处理促进多花黄精的芽出苗的方法，具体为：将组织培养获得的带芽的多花黄精组织块于1-6℃环境中无光培养30-80天，再转入光照培养。
在经过诱导后形成的多花黄精组织块一般会分化出芽和根，但是芽有休眠现象，一般只有少量的有叶片长出，而且叶片过一段时间会枯掉(也就是正常倒苗)，这时芽也会处于休眠状态，很久都不会萌发(其他品种的黄精组培没有这种现象，一般都会持续生长)。在经过本发明的低温处理的方法打破休眠后，芽会整齐、健壮的长出叶片。具体见附图1-2。
作为优选的方案，所述带芽的多花黄精组织块具体为带芽的多花黄精块茎。
作为优选的方案，所述温度优选4℃。
低温培养时间优选为50-70天。
作为优选的方案，所述光照培养的条件为：培养室温度23-27℃，光照时间10-12小时，光照强度1800～2200lx。
进一步，培养室温度为25℃。
本发明的目的还在于提供一种上述的组合物用于多花黄精的组织培养的方法，主要包括外植体处理、愈伤组织诱导、块茎诱导、低温处理、驯化移栽五个部分。包括以下步骤：
1)选择多花黄精带隐芽的幼嫩块茎作为外植体，将所述外植体进行灭菌处理后切成外植体小块，然后接种到本发明的外植体处理培养基上，光照培养直至长出嫩芽；
2)将所述嫩芽切下，接种于本发明的愈伤组织诱导培养基光照培养，所述嫩芽基部膨大形成愈伤组织；将所述愈伤组织切成小块，重新接种于所述愈伤组织诱导培养基培养形成愈伤组织，重复3-6次，以扩大培养；
3)将扩大培养后的愈伤组织切成愈伤组织小块，接种于本发明的块茎诱导培养基光照培养，形成带芽和根的多花黄精块茎；
4)将步骤3)获得的多花黄精块茎放入1-6℃环境中无光培养30-80天，再转入光照培养40-80天，形成多花黄精植株；
5)将所述多花黄精植株炼苗15天以上获得多花黄精种苗，移栽于土壤。
作为优选的方案，其特征在于，步骤1)、2)、3)、4)所述光照培养的条件为：培养室温度23-27℃，光照时间10-12小时，光照强度1800～2200lx。
进一步培养温度为25℃。
作为优选的方案，其特征在于，步骤1)所述外植体小块具体为体积为0.3cm3-1cm3的带隐芽的小块。
作为优选的方案，步骤1)所述灭菌处理包括：清水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，在超净工作台上用75％酒精浸泡后无菌水冲洗，无菌滤纸吸干表面水分，0.1％升汞溶液浸泡后无菌水冲洗，无菌滤纸吸干表面水分。
作为优选的方案，上述方法具体为：
1、外植体处理
采挖新鲜的多花黄精幼嫩块茎(带有较多隐芽)，用清水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，在超净工作台上用75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3—6次，无菌滤纸吸干表面水分，0.1％升汞溶液浸泡8—10分钟，无菌水冲洗3—6次，无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将块茎切开，每块大小比黄豆略大即可，将带有芽点的多花黄精块茎接种于外植体处理培养基上光照培养20-50天，培养室温度25℃左右，光照时间10-12小时，光照强度1800～2200lx，下同。
2、愈伤组织诱导
将上述处理中长出嫩芽的多花黄精块茎嫩芽，在无菌条件下切下，接种于愈伤组织诱导培养基光照培养30-90天。嫩芽膨大形成的愈伤组织可以在无菌条件下切成比黄豆略大的小块，重复本步骤3-6次，不断扩大培养。
3、块茎诱导
将上述嫩芽膨大形成的愈伤组织在无菌条件下切成比黄豆略大的小块，接种于块茎诱导培养基，培养10-30天，形成带芽和根的多花黄精块茎(部分会长出嫩叶)。
4、低温处理
将成苗后的多花黄精块茎放入4℃环境中低温无光培养40-80天。再转入光照培养60-80天，形成多花黄精植株。
5、驯化移栽
将成苗后的多花黄精植株在炼苗棚内炼苗15天以上，打开瓶盖，取出多花黄精种苗，清洗干净培养基，阴干表面水分后下地种植，土地应选择肥沃、酥松透气的土壤，适量胶水，防止高温暴晒即可。
本发明的有益效果在于：一、本发明提供的用于多花黄精组织培养的组合物以及组合物用于培养多花黄精的方法。本发明采用多花黄精的幼嫩块茎为材料，优化了组培培养基配方。二、首次将低温处理用于多花黄精的组织培养，通过低温处理打破芽的休眠，提高了多花黄精的出苗率，缩短了出苗时间，达到快速高效的多花黄精种苗生产要求，适合多花黄精种苗的规模化生产。
附图说明
图1为实施例5的非低温组。
图2为实施例5的低温处理组。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
试剂购自：
成都市科龙化工试剂厂：硝酸钾、硝酸铵、二水氯化钙、碘化钾、硼酸、六水氯化钴、七水硫酸亚铁、烟酸、盐酸吡哆醇、萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤。
国药集团化学试剂有限公司：七水硫酸镁、磷酸二氢钾、七水硫酸锌、四水硫酸锰、肌醇。
广东省化学试剂工程技术研究开发中心：二水钼酸钠、五水硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠、盐酸硫胺素、甘氨酸。
实施例1多花黄精组织培养培养基1
外植体处理培养基：在MS培养基的基础上添加6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L，蔗糖25g/L和琼脂6g/L；
愈伤组织诱导培养基：在MS培养基的基础上添加6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L，蔗糖25g/L和琼脂6g/L；
块茎诱导培养基：在1/2MS培养基的基础上添加萘乙酸0.5mg/L，蔗糖25g/L和琼脂6g/L。
实施例2多花黄精组织培养培养基2
外植体处理培养基：在MS培养基的基础上添加6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L，蔗糖20g/L和琼脂6g/L；
愈伤组织诱导培养基：在MS培养基的基础上添加6-苄氨基腺嘌呤3.0mg/L，蔗糖25g/L和琼脂6g/L；
块茎诱导培养基：在1/2MS培养基的基础上添加萘乙酸0.3mg/L，蔗糖25g/L和琼脂6g/L。
实施例3多花黄精组织培养培养基3
外植体处理培养基：在MS培养基的基础上添加6-苄氨基腺嘌呤3.0mg/L，蔗糖20g/L和琼脂6g/L；
愈伤组织诱导培养基：在MS培养基的基础上添加6-苄氨基腺嘌呤3.0mg/L，蔗糖25g/L和琼脂6g/L；
块茎诱导培养基：在1/2MS培养基的基础上添加萘乙酸0.2mg/L，蔗糖25g/L和琼脂6g/L。
实施例4多花黄精块茎的组织培养
以多花黄精组织培养培养基1为例。
1、外植体处理
采挖新鲜的多花黄精两年生种子苗5个，用清水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，每个分别在超净工作台上用75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，0.1％升汞溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将块茎切成比黄豆略大的小块，将带有表皮和芽点的多花黄精块茎接种于外植体处理培养基上光照培养，每瓶一个小块茎，共16瓶。培养室温度25℃左右，光照时间10-12小时，光照强度1800～2200lx，下同，培养30天。
2、愈伤组织诱导
将上述处理中长出嫩芽的多花黄精块茎嫩芽，在无菌条件下切下，接种于愈伤组织诱导培养基。光照培养了52天后，嫩芽基部膨大形成了直径1-2cm不等的愈伤组织。取愈伤组织在无菌条件下切成比黄豆略大的小块，重复本步骤，不断扩大培养。第一次转接16瓶转18瓶，每瓶接种4颗。每40-80天转接1次，每次增殖4-6倍，6个月以后达到360瓶(每瓶4个愈伤组织)。
3、块茎诱导
将上述嫩芽膨大形成的愈伤组织在无菌条件下切成比黄豆略大的小块，接种于成苗培养基。每瓶接种4颗，共计20瓶，光照培养55天，形成了带芽和根的多花黄精块茎60棵，其中17棵长了叶片。
4、低温处理
将带芽的多花黄精块茎放入4℃环境中低温无光培养55天。再转入光照培养。光照培养12天，多花黄精芽开始长出嫩叶，形成多花黄精植株，60棵全部发芽。光照培养70天后转入炼苗棚炼苗。
5、驯化移栽
将成苗后的多花黄精植株在炼苗棚内炼苗20天，打开瓶盖，取出多花黄精种苗，清洗干净培养基，去掉过弱的小苗，阴干表面水分后种于温室大棚内营养土中，每3天浇水1次，温度20-28℃，成活率100％，长势较好。
实施例5低温处理打破芽休眠
1、按照实施例4的方法进行外植体处理、愈伤组织诱导、块茎诱导的过程，获得带芽和根的多花黄精块茎。
2、将获得的带芽和根的多花黄精块茎分为两组，分别为低温处理组和非低温组。
①低温处理组：
将带芽的多花黄精块茎放入4℃环境中低温无光培养55天。再转入光照培养70天：培养室温度25℃左右，光照时间10-12小时，光照强度1800～2200lx。
见图2，低温处理的方法打破芽的休眠后，全部长出叶片，获得多花黄精植株。
②非低温组：
将带芽的多花黄精块茎在光照培养：培养室温度25℃左右，光照时间10-12小时，光照强度1800～2200lx。
见图1，长叶片的多花黄精块茎较少。
在经过块茎诱导后形成的多花黄精块茎的芽有休眠现象，一般只有少量的有叶片长出，而且叶片过一段时间会枯掉。这时芽处于休眠状态，很久都不会萌发。经过本发明的低温处理打破多花黄精芽的休眠，提高多花黄精的出苗率，达到快速高效的多花黄精种苗生产要求，适合多花黄精种苗的规模化生产。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.用于多花黄精块茎组织培养的组合物，其特征在于，所述组合物包含外植体处理培养基、愈伤组织诱导培养基和块茎诱导培养基；
所述外植体处理培养基由MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤2.0-3.0mg/L，蔗糖20-35g/L和琼脂4-8g/L组成；
所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤1.5-3.0mg/L ，蔗糖20-35g/L和琼脂4-8g/L组成；
所述块茎诱导培养基由1/2MS培养基、萘乙酸0.2-0.5mg/L，蔗糖20-35g/L和琼脂4-8g/L组成。
2.权利要求1所述的组合物在用于多花黄精块茎组织培养的应用。
3.一种权利要求1所述的组合物用于多花黄精的组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）外植体处理：选择多花黄精带隐芽的幼嫩块茎作为外植体，将所述外植体进行灭菌处理后切成外植体小块，然后接种到权利要求1所述外植体处理培养基上，光照培养直至长出嫩芽；
2）愈伤组织诱导和扩大培养：将所述嫩芽切下，接种于权利要求1所述愈伤组织诱导培养基光照培养，所述嫩芽基部膨大形成愈伤组织；将所述愈伤组织切成小块，重新接种于所述愈伤组织诱导培养基培养形成愈伤组织，重复3-6次，以扩大培养；
3)块茎诱导：将扩大培养后的愈伤组织切成愈伤组织小块，接种于权利要求1所述块茎诱导培养基光照培养，形成带芽和根的多花黄精块茎；
4）低温处理：将步骤3）获得的多花黄精块茎放入1-6℃环境中无光培养30-80天，再转入光照培养40-80天，形成多花黄精植株；
5)驯化移栽：将所述多花黄精植株炼苗15天以上获得多花黄精种苗，移栽于土壤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）、2）、3）、4）所述光照培养的条件为：培养室温度23-27℃，光照时间10-12小时，光照强度1800～2200lx。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）所述外植体小块具体为体积为0.3cm3-1cm3的带隐芽的小块。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）所述灭菌处理包括：清水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，在超净工作台上用75%酒精浸泡后无菌水冲洗，无菌滤纸吸干表面水分，0.1%升汞溶液浸泡后无菌水冲洗，无菌滤纸吸干表面水分。
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