CN102630562A - 九华黄精的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种九华黄精的组培快繁方法，以黄精根状茎为外植体，经过不定芽的诱导阶段，丛芽增殖阶段，生根阶段和炼苗移栽阶段，调配和优选各培养阶段的培养基配方和培养条件，形成了每年扩繁速度为106倍的组培技术，实现了九华黄精的组织培养和快速稳定繁殖，可以有效解决九华黄精的优质种苗供应问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有药用价值的黄精属植物的组培快繁方法，特别是九华黄精的组培快繁方法。
背景技术
九华黄精是百合科黄精属多年生宿根性草本药用植物，其根茎是传统中药，在九华山地区普遍生长。近代研究表明，黄精含有烟酸、醒类、豁液质、二氨基丁酸、多种皂苷和黄精多糖等成分，作为中药使用具有补脾润肺、益气养阴、强壮筋骨等作用。近年来，黄精已被广泛应用于治疗冠心病、高血压、糖尿病、肺结核、再生障碍性贫血等疾病，取得了较好的疗效。
随着黄精的药用价值和保健价值越来越被人们所认识，黄精原料的需求量也越来越大，从而导致对野生黄精的大量掠夺性采集加剧，使自然资源迅速枯竭。因此，保证黄精原料来源、实行产业化种植的重要性越来越明显。而由于黄精生产上多采用分根繁殖，其繁殖系数低，种根茎用量大，不便栽植管理与推广，故黄精种苗问题成了人工大面积种植的瓶颈。
利用植物组织培养技术建立黄精快速繁殖体系是生产优质黄精种苗的有效途径。其关键技术之一在于黄精根茎上不定芽的增殖数量和质量，不同激素组合及其浓度对此影响很大。尽管国内已有黄精组织培养研究的报道，但黄精种苗繁殖率低，无法进行工业化生产的问题仍然没有得到有效解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种九华黄精的组培快繁方法，该方法克服了九华黄精根状茎繁殖率低、生长年限长的缺陷，达到了繁殖系数高，速度快、技术稳定、可在短时间内提供大量优质黄精种苗的目的。
为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案为：
一种九华黄精的组培快繁方法，包括下列培养阶段：
1)不定芽的诱导阶段：取幼嫩黄精根状茎，先进行消毒获得无菌材料，再将其接种于诱导培养基上，培养28-32天，培养温度为25±1℃，光照时间为10-12h/天，光照强度为1600lx，获得丛芽，所述的诱导培养基组成为：MS基本培养基+3.0-5.0mg/L6-BA+0.3-0.5mg/L 2，4-D+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖，其pH5.5-6.0；
2)丛芽增殖阶段：将步骤1)所得丛芽切成保留一个顶芽或侧芽的茎段，分别接种于增殖培养基上，培养38-42天，培养温度为25±1℃，光照时间为10-12h/天，光照强度为1600lx，所述的增殖培养基的组成为：MS基本培养基+0.5-0.7mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L IAA+0.1-0.2mg/L NAA+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖，pH5.5-6.0；
3)试管苗培养生根阶段：将所得的单个健壮不定芽从基部剪下，接种于生根培养基上，培养22-26天，培养温度为25±1℃，光照时间为10-12h/天，光照强度为1600lx，培养出生根试管苗，所述的生根培养基组成为：1/2MS基本培养+0.5-0.7mg/L NAA+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖，pH5.5-6.0；
4)炼苗移栽阶段：当试管苗生根后，将培养试管苗的培养瓶塞打开后，置于4000lx左右的光照下炼苗3-4d，取出生根试管苗，洗净培养基，移栽到混和土中，并盖上有机玻璃盖子，移栽后7d内要保持没有直射光照射、温度在20℃以上、湿度在90％以上的环境条件，7d后去盖，即可得到优质黄精种苗，所述的混和土由蛭石、黑土和珍珠岩按比例混合而成，三者的混合比例为蛭石∶黑土∶珍珠岩＝(10-14)∶(1.5-2.5)∶1的混和土。
所述的九华黄精组培快繁方法，其特征是：步骤1)中获得无菌材料的具体操作为：
1)取幼嫩黄精根状茎，洗掉泥土，用刀切取带芽根茎于洗洁精水溶液中浸泡5-6min，然后用自来水冲洗干净；
2)再用75％乙醇擦洗黄精根状茎表面，再次用自来水冲洗；
3)再在超净工作台中：先用75％乙醇浸泡0.5min，再用灭菌水冲洗；再用升汞浸泡10min，灭菌水冲洗；最后用无菌滤纸吸干水份，用刀切去伤口坏死部分，接种在诱导培养基上。
所述的九华黄精组培快繁方法，其特征是：所述的诱导、增殖、生根阶段的培养温度均为25℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600lx。
所述的九华黄精组培快繁方法，其特征是：步骤4)所述的混合土中添加有铁矿尾矿，混合土各组分的重量比例为：蛭石∶黑土∶珍珠岩∶铁矿尾矿＝(10-14)∶(1.5-2.5)∶1∶(2-3)。
铁矿尾矿的化学成分分析为： (％)
本发明的有益性体现在：提供了九华黄精的植物组织培养和快速繁殖技术，每个不定芽一年能繁殖出一百万株无性后代，不仅可以为黄精的商品化生产提供了一套可行的生产技术路线，而且高效分化的不定芽又为该植物转基因研究提供了理想的材料。
具体实施方式
一、九华黄精无菌材料的获得及不定芽的诱导：
实施例1
1.植物材料
九华黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)，百合科黄精属，取自安徽省九华山。
2.不定芽的诱导
取幼嫩黄精根状茎，洗掉泥土。用刀切取带芽根茎于洗洁精水溶液中浸泡5min，自来水冲洗干净。用75％乙醇擦洗表面，自来水冲洗干净。以下在超净工作台中完成：75％乙醇浸泡0.5min，灭菌水冲洗；升汞浸泡10min，灭菌水冲洗；用无菌滤纸吸干水份，用刀切去伤口坏死部分，接种在诱导培养基上。培养基组成为：MS基本培养基+1.0-6.0mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L NAA+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH为5.8。激素组成及含量见表见表1。
3.结果
由表1结果可知，在含2，4-D的培养基中能在增殖的同时分化出不定芽，其中以4.0mg/L 6-BA和0.4mg/L 2，4-D组合的分化芽数最多。
表1
二、不定芽的增殖培养
实施例2
1.材料
实施例1所诱导的九华黄精不定芽。
2.不定芽的增殖培养
将实施例1中所得丛芽切成具有一个顶芽或侧芽的茎段，分别接种于丛芽增殖培养基上。置于培养温度为25±1℃，光照时间为12小时/天，光照强度为1600Lx的环境下培养40天。培养基组成为：MS基本培养基+0.6mg/L6-BA+0.2-0.4mg/L IAA+0-0.8mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8。激素组成及含量见表见表2。
由表2可见，以浓度为0.2mg/L的NAA与浓度为0.2mg/L的IAA配合使用效果最好。观察还表明，把在这一培养基上诱导分化的不定芽从基部剪下，接种到相同的培养基上进行分化继代培养，40d为一个分化培养周期，其分化率、平均分化不定芽数及分化不定芽长势保持不变。如此周而复始循环，一年一个外植体可产生一百万株后代。
表2
三、茎芽的生根诱导
实施例3
1.材料
实施例2中所得的分化丛芽。
2.生根培养
将实施例3中所得的分化培养的单个健壮不定芽从基部剪下，接种于生根培养基上，置于培养温度为25±1℃，光照时间为12小时/天，光照强度为1600Lx的环境下培养25天。培养基组成为：1/2MS基本培养基+0.2-1.0mg/L NAA+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH为5.8。
由表3结果可知，本发明生根培养基优选组成为：1/2MS+0.6mg/L NAA。并且在这一培养基上所培养的生根试管苗茎粗壮、叶色浓绿，生长旺盛，培养到20d时几乎所有的培养苗都会生长出数量不等的根。
表3
四、炼苗和移栽
实施例4
1.材料
实施例3中所得的生根苗。
2.炼苗和移栽
将试管苗的培养瓶塞打开后，置于4000lx左右的光照下炼苗3-4d，取出生根试管苗，洗净培养基，移栽到蛭石∶黑土∶珍珠岩∶铁矿尾矿＝12∶2∶1∶3的混和土中，盖有机玻璃盖子。移栽后7d内要保持没有直射光、温度在20℃以上、湿度在90％以上的环境条件，7d后去盖。移栽后7d成活并开始正常生长。30d观察统计表明，以混合土为移栽基质移栽的试管苗成活率为90％，且移栽苗生长旺盛。
铁矿尾矿的化学成分分析为： (％)
Claims (4)
1.一种九华黄精的组培快繁方法，其特征是包括下列培养阶段：
1）不定芽的诱导阶段：取幼嫩黄精根状茎，先进行消毒获得无菌材料，再将其接种于诱导培养基上，培养28-32天，培养温度为25+1℃，光照时间为10-12h/天，光照强度为1600lx，获得丛芽，所述的诱导培养基组成为：MS基本培养基+3.0-5.0mg/L6-BA +0.3-0.5mg/L 2，4-D+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖，其pH 5.5-6.0；
2）丛芽增殖阶段：将步骤1）所得丛芽切成保留一个顶芽或侧芽的茎段，分别接种于增殖培养基上，培养38-42天，培养温度为25+1℃，光照时间为10-12h/天，光照强度为1600lx，所述的增殖培养基的组成为：MS基本培养基+0.5-0.7mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L IAA+0.1-0.2mg/L NAA+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖，pH 5.5-6.0；
3）试管苗培养生根阶段：将所得的单个健壮不定芽从基部剪下，接种于生根培养基上，培养22-26天，培养温度为25+1℃，光照时间为10-12h/天，光照强度为1600lx，培养出生根试管苗，所述的生根培养基组成为：1/2MS基本培养+0.5-0.7mg/L NAA+6-8g/L琼脂+28-32g/L蔗糖，pH 5.5-6.0；
4）炼苗移栽阶段：当试管苗生根后，将培养试管苗的培养瓶塞打开后，置于4000lx左右的光照下炼苗3-4d，取出生根试管苗，洗净培养基，移栽到混和土中，并盖上有机玻璃盖子，移栽后7d内要保持没有直射光照射、温度在20℃以上、湿度在90%以上的环境条件，7d后去盖，即可得到优质黄精种苗，所述的混和土由蛭石、黑土和珍珠岩按比例混合而成，三者的混合比例为蛭石：黑土：珍珠岩=（10-14）：（1.5-2.5）：1的混和土。
2.根据权利要求1所述的九华黄精组培快繁方法，其特征是：步骤1）中获得无菌材料的具体操作为：
1）取幼嫩黄精根状茎，洗掉泥土，用刀切取带芽根茎于洗洁精水溶液中浸泡5-6min，然后用自来水冲洗干净；
2）再用75%乙醇擦洗黄精根状茎表面，再次用自来水冲洗 ；
3）再在超净工作台中：先用75%乙醇浸泡0.5 min，再用灭菌水冲洗；再用升汞浸泡10min，灭菌水冲洗；最后用无菌滤纸吸干水份，用刀切去伤口坏死部分，接种在诱导培养基上。
3.根据权利要求1所述的九华黄精组培快繁方法，其特征是：所述的诱导、增殖、生根阶段的培养温度均为25℃，光照时间为12h/天，光照强度为1600lx。
4.根据权利要求1所述的九华黄精组培快繁方法，其特征是：步骤4）所述的混合土中添加有铁矿尾矿，混合土各组分的重量比例为：蛭石：黑土：珍珠岩：铁矿尾矿=（10-14）：（1.5-2.5）：1：（2-3）。
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