CN114557281A - 一种利用大叶种茶树幼胚组织培养茶苗的茶树繁育方法 - Google Patents

一种利用大叶种茶树幼胚组织培养茶苗的茶树繁育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用大叶种茶树幼胚组织培养茶苗的茶树繁育方法，涉及生物技术领域。该繁育方法包括以下步骤：(1)采集云南大叶种茶树的幼果，剥去果皮，取出种子；(2)所述种子剥去种皮，取出幼胚，之后依次接种于愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中进行培养，得到大叶种茶树幼苗；所述愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中均添加半胱氨酸和甘露醇。本发明通过在愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中添加半胱氨酸和甘露醇降低大叶种茶树幼胚组织培养过程中愈伤组织的褐化率，其中半胱氨酸作为褐变抑制剂，甘露醇作为渗透压调节剂，半胱氨酸和甘露醇联合作用，有效降低了愈伤组织的褐化率。

Description

一种利用大叶种茶树幼胚组织培养茶苗的茶树繁育方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种利用大叶种茶树幼胚组织培养茶苗的茶树繁育方法。
背景技术
茶树(Camellia sinensis)是世界上最重要的生产非酒精类饮料的木本植物之一。它生长周期长，自然结实率和杂交结实率都较低，使得常规茶树育种需要20-25年。由于无性繁殖能保持良种的特征特性，后代性状一致性高，有利于茶园管理，近年来备受人们关注，但是目前传统的无性繁殖方法在茶树的生根效果和成活率方面均不理想。
植物组织培养是指利用植物体离体的各种器官、组织或细胞(如根、茎、叶、花、果实、种子、胚、胚珠、子房、花药、花粉及贮藏器官的薄壁组织、维管束组织等)，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等条件下，获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其它生物产品的一项技术。与传统育种方法相比，植物组织培养有着快速高效、可控性强、利于自动化生产、不受外界环境条件影响等优点，并已应用于植物育种，在增加植物育种变异性、改良植物种性、培育新品种、缩短育种周期、提高育种效率等方面发挥了独特的优势，产生了巨大的经济效益和社会效益。目前，许多研究者对茶树组织培养进行了研究，以茶树营养器官和生殖器官作外植体培养均有成功报道。但云南大叶种茶树因其品种因素，茶多酚含量较高，一般在35％左右，外植体切段易氧化褐死，至今组织培养获得成功的报道并不多见。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用大叶种茶树幼胚组织培养茶苗的茶树繁育方法，以解决上述现有技术存在的问题，使组织培养过程的褐变率降低，提高组织培养成活率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种利用大叶种茶树幼胚组织培养茶苗的茶树繁育方法，包括以下步骤：
(1)采集云南大叶种茶树的幼果，剥去果皮，取出种子；
(2)所述种子剥去种皮，取出幼胚，之后依次接种于愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中进行培养，得到大叶种茶树幼苗；
所述愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中均添加半胱氨酸和甘露醇。
进一步地，所述半胱氨酸在所述愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中的添加量均为100g/L，所述甘露醇在所述愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中的添加量均为6g/L。
进一步地，所述愈伤组织培养基为：MS+0.6mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+100g/L半胱氨酸+6g/L甘露醇+6.5g/L琼脂。
进一步地，所述增殖培养基为：MS+1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+100g/L半胱氨酸+6g/L甘露醇+6.5g/L琼脂。
进一步地，所述生根培养基为：MS+1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+100g/L半胱氨酸+6g/L甘露醇+7.0g/L琼脂。
进一步地，愈伤组织培养、增殖培养和生根培养的光照强度均为1600lx。
进一步地，所述愈伤组织培养、增殖培养和生根培养的温度均为26℃。光照时间为10h/d。
进一步地，所述愈伤组织培养和增殖培养的光照时间为10h/d，所述生根培养的光照时间为12h/d。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过在愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中添加半胱氨酸和甘露醇降低大叶种茶树幼胚组织培养过程中愈伤组织的褐化率，其中半胱氨酸作为褐变抑制剂，甘露醇作为渗透压调节剂，半胱氨酸和甘露醇联合作用，有效降低了愈伤组织的褐化率。
半胱氨酸和甘露醇的加入对丛芽的生成有一定的影响。为了降低因半胱氨酸和甘露醇的加入对丛芽造成的影响，我们对光照强度进行了优化，优化实验表明但光照强度设定为1600lx时，丛芽的生成量得到了有效提升。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)种子获得
采集授粉后30天的云南大叶种茶树幼果，依次用75％的乙醇和无菌水清洗后，剥去果皮，取出种子，放入0.1wt％的升汞中浸泡8ming，然后用无菌水冲洗3遍，得到消毒后的种子。
(2)组织培养
在无菌条件下，将步骤(1)得到的消毒后的种子，剥去种皮，取出幼胚，接种在愈伤组织培养基上，在温度为26℃，光照强度为1600lx，光照时间为10h/d的条件下，培养30天；之后转入增殖培养基中，在温度为26℃，光照强度为1600lx，光照时间为10h/d的条件下培养45天；最后转接到生根培养基中，在温度为26℃，光照强度为1600lx，光照时间为12h/d的条件下培养45天，即可得到云南大叶种茶树幼苗。
愈伤组织培养基：MS+0.6mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+100g/L半胱氨酸+6g/L甘露醇+6.5g/L琼脂。
增殖培养基：MS+1.0mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+100g/L半胱氨酸+6g/L甘露醇+6.5g/L琼脂。
生根培养基：MS+1.0mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+100g/L半胱氨酸+6g/L甘露醇+7.0g/L琼脂。
(3)将步骤(2)得到的云南大叶种茶树幼苗，炼苗，移栽，统计成活率。
本实施例组织培养80个幼胚，历经愈伤组织培养、增殖培养和生根培养后，再经炼苗，移栽，其中，2个幼胚，培养过程中出现轻微褐化，在后期培养过程中被淘汰；其余78个幼胚，培养过程中无褐化现象，幼苗移栽后全部成活。
实验例1
将组织培养中的培养基修改为：愈伤组织培养基：MS+0.6mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂；增殖培养基：MS+1.0mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂；生根培养基：MS+1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。按照表1所示，在上述培养基中分别加入0g/L、1g/L、3g/L、6g/L、9g/L或15g/L甘露醇，其余操作同实施例1，分别对20个云南大叶种茶树的幼胚进行组织培养，统计愈伤组织培养中的褐化情况，结果见表1。根据表1可以看出，在愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中添加甘露醇，有利于降低愈伤组织的褐化率，当甘露醇的添加浓度为6g/L时，褐化率最低。
表1
Figure BDA0003591966520000041
实验例2
将组织培养中的培养基修改为：愈伤组织培养基：MS+0.6mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂；增殖培养基：MS+1.0mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂；生根培养基：MS+1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂。按照表2所示，在上述培养基中分别加入0g/L、10g/L、50g/L、100g/L、150g/L或200g/L半胱氨酸，其余操作同实施例1，分别对20个云南大叶种茶树的幼胚进行组织培养，统计愈伤组织培养中的褐化情况，结果见表2。根据表2可以看出，在愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中添加半胱氨酸，有利于降低愈伤组织的褐化率，当半胱氨酸的添加浓度为100g/L时，褐化率最低。
表2
Figure BDA0003591966520000051
实验例3
本发明在愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中添加半胱氨酸和甘露醇，有利于降低愈伤组织的褐化率，然而，半胱氨酸和甘露醇的加入对丛芽的生成有一定的影响。为了进一步提升丛生芽的生成量，我们对光照强度进行了优化。将组织培养过程中的光照强度分别调整为1000lx、1300lx、1600lx、1900lx和2500lx，其余操作同实施例1，分别对20个云南大叶种茶树的幼胚进行组织培养，统计丛芽的平均生成数量，结果见表3。结果表明，光照强度对诱导云南大叶种茶树幼胚外植体产生不定根和不定芽具有重要作用，通过优化光照强度可以解决因添加半胱氨酸和甘露醇导致的丛芽生成量降低的问题，将光照强度调整为1600lx，有利于提高丛芽的生成量。
表3
Figure BDA0003591966520000052
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种利用大叶种茶树幼胚组织培养茶苗的茶树繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集云南大叶种茶树的幼果，剥去果皮，取出种子；
(2)所述种子剥去种皮，取出幼胚，之后依次接种于愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中进行培养，得到大叶种茶树幼苗；
所述愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中均添加半胱氨酸和甘露醇。
2.根据权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，所述半胱氨酸在所述愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中的添加量均为100g/L，所述甘露醇在所述愈伤组织培养基、增殖培养基和生根培养基中的添加量均为6g/L。
3.根据权利要求2所述的繁育方法，其特征在于，所述愈伤组织培养基为：MS+0.6mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+100g/L半胱氨酸+6g/L甘露醇+6.5g/L琼脂。
4.根据权利要求2所述的繁育方法，其特征在于，所述增殖培养基为：MS+1.0mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+100g/L半胱氨酸+6g/L甘露醇+6.5g/L琼脂。
5.根据权利要求2所述的繁育方法，其特征在于，所述生根培养基为：MS+1.0mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+100g/L半胱氨酸+6g/L甘露醇+7.0g/L琼脂。
6.根据权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，愈伤组织培养、增殖培养和生根培养的光照强度均为1600lx。
7.根据权利要求6所述的繁育方法，其特征在于，所述愈伤组织培养、增殖培养和生根培养的温度均为26℃。光照时间为10h/d。
8.根据权利要求6所述的繁育方法，其特征在于，所述愈伤组织培养和增殖培养的光照时间为10h/d，所述生根培养的光照时间为12h/d。
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