CN106135003A - 一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药材加工技术领域，特别是一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法。包括如下步骤：黄芪种子筛选、黄芪种子浸泡、黄芪种子消毒、清洗接种培养、黄芪愈伤组织诱导培养和增殖培养。综上所述本发明成果是在大量实验研究和不断探索优化的基础上取得的，理想的诱导和增殖培养基，黄芪愈伤诱导率达100%，愈伤组织生长旺盛，增殖速度快，经15d的培养，愈伤组织的鲜重增加至培养前的3.27倍左右。细胞增殖速度快，培养周期短，1个月内可轻松培养2代，产出比高，且操作简单，重复性好，具有工厂化生产和自动化控制等优点，便于生物学和医药学领域对黄芪次生代谢产物的开发和利用研究。
Description
技术领域
本发明涉及中药材加工技术领域，特别是一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法。
背景技术
中药黄芪是我国传统的常用药用植物，具有补气固表、利尿、排脓、敛疮生肌之功效，而蒙古黄芪又是黄芪中的极品。近年来，随着保健药日益畅销，黄芪的用药量越来越大，但由于长期大量、无节制采挖，未注意对自然资源的保护，野生黄芪资源几近枯竭，大面积成规模的野生黄芪资源已十分少见。蒙古黄芪中的有效成分可以通过提取获得，但原料、季节、地域等条件会限制黄酮的提取量，而用植物组织培养技术生产次生代谢物则可以不受地区、季节限制，节省土地和植物资源，降低成本，提高生产效率。因此，利用组织培养技术生产黄芪次生代谢产物在生物学和医药学领域具有重要的研究和应用价值，但采用常规组培技术进行黄芪愈伤组织培养过程中极易出现褐化现象（褐化是指在外植体诱导和分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象），褐化使外植体、组织细胞、培养基发生褐变，而且对许多酶有抑制作用，影响培养材料的生长与分化，常常造成大量培养材料褐变死亡，导致科研和生产应用的失败。因此，褐化能否得到有效控制是黄芪组织培养成功与否的关键所在。
发明内容
本发明解决现有技术的不足，提供一种愈伤组织生长旺盛、增殖速度快、培养周期短、操作简单、重复性好的有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，包括如下步骤：
A、黄芪种子筛选
选取籽粒饱满、无病虫斑和损伤的黄芪种子，使用自来水冲洗30min；
B、黄芪种子浸泡
烧杯内加入蒸馏水放在60℃水浴中浸种，1h之后倒出水，加入质量浓度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃条件下浸泡2h；
C、黄芪种子消毒
首先加入体积浓度75%的乙醇溶液消毒30-50s后倒出乙醇溶液，其次采用质量浓度2%的NaClO溶液消毒10-30min，后倒出NaClO溶液，最后加入质量浓度0.1%氯化汞溶液消毒2-5min后倒出氯化汞溶液，期间不断轻轻摇晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液与种子充分接触；
D、清洗接种培养
使用无菌水冲洗种子表面去除消毒液，反复冲洗3～5次，冲洗完成后用滤纸吸干种子表面水分，接种到1/2MS培养基中并放入纸箱内，纸箱外套黑色塑料袋放置于培养室中，培养温度23±2℃，待种子萌发后转至光照条件下培养，光照强度1000～2000lux；
E、黄芪愈伤组织诱导培养和增殖培养
选取步骤D中培养苗龄7天的无菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚轴为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基上培养10～20d，愈伤组织诱导培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.0～3.5 mg/L、萘乙酸NAA 质量浓度0.1～0.5 mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～10g/L，愈伤组织诱导培养基pH值调节为 5.8～6.2进行诱导培养；接着进行愈伤组织快速增殖培养10～15d，增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度1.5～3.0mg/ L、萘乙酸 NAA质量浓度0.8～2.0mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～8g/L，黄芪愈伤组织快速增殖培养基pH值调节为 5.8～6.2。
所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一种或几种，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.6～0.8 g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.1～0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0～6.0g/L。
所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc或聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.8 g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度6.0g/L。
所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内混合加入抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗坏血酸Vc质量浓度0.2 g/L、聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0g/L。
所述步骤E中愈伤组织诱导培养基和增殖培养基的琼脂质量浓度6.0g/L，pH值调节为6.2。
所述步骤A将种子放到烧杯内，用纱布蒙住烧杯口，使用自来水下冲洗30min，冲洗种子在烧杯内上下旋转。
所述步骤C中首先加入体积浓度75%的乙醇溶液消毒40s后倒出乙醇溶液，其次加入质量浓度2%的NaClO溶液消毒20min后倒出NaClO溶液，最后加入质量浓度0.1%氯化汞溶液消毒3min后倒出氯化汞溶液，期间不断轻轻摇晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液与种子充分接触。
所述步骤D中使用无菌水冲洗种子表面去除消毒液，反复冲洗5次每次2min，冲洗完成后用滤纸吸干种子表面水分，接种到1/2MS培养基中并放入纸箱内，纸箱外套黑色塑料袋放置于培养室中，培养温度23±2℃，待种子萌发后转至光照条件下培养，光照强度1000lux；
所述步骤E选取步骤D中培养苗龄7天的无菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚轴为外植体并接种在愈伤组织诱导培养基上培养10～20d，愈伤组织诱导培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.5 mg/L、萘乙酸NAA 质量浓度0.3 mg/L、蔗糖质量浓度30g/L、琼脂质量浓度6g/L，愈伤组织诱导培养基pH值调节为 6.2进行诱导培养；接着进行愈伤组织快速增殖培养10～15d，增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.0mg/L、萘乙酸 NAA质量浓度1.2mg/L、蔗糖质量浓度30g/L、琼脂质量浓度6g/L，黄芪愈伤组织快速增殖培养基pH值调节为 6.2。
本发明的有益效果：
1、黄芪种子筛选
选取饱满、种皮有光泽、无有病虫斑和损伤的黄芪种子，黄芪种子优选蒙古种子，在自来水下冲洗30min，60℃水浴中浸种1h，35℃条件下质量浓度2.5%NaHCO3浸泡2h，体积浓度75%的乙醇消毒40s，质量浓度2%的NaClO消毒20min，质量浓度0.1%的氯化汞消毒3min，无菌水清洗5次，每次2min。消毒完成后用无菌滤纸吸干种子表明水分，接种到1/2MS培养基上，黑暗培养到萌发后转至光照条件下培养。采用该方法对种子消毒杀菌，有利于快速打破种子休眠时间，发芽率达到75%以上，真菌和细菌污染率小于2%。
2、黄芪愈伤组织诱导培养基和增殖培养基筛选
以7d苗龄的无菌苗为研究材料，取0.5～1.0 cm的下胚轴建立外植体，接种在愈伤组织诱导培养基上，通过对基本培养基、植物外源激素浓度及配比的多次实验，筛选出黄芪愈伤组织诱导适宜的培养基为MS、6-BA 2.5 mg/L、NAA 0.3 mg/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L，pH6.2，下胚轴愈伤组织诱导率为70.6％，但褐化率高达90%以上，多数外植体随着培养天数的增加逐渐褐化死亡。
增殖培养是组织培养中决定繁殖速度快慢、繁殖系数高低的关键阶段，是由植物激素的的种类和浓度决定的，本方法中优化筛选出黄芪愈伤组织快速增殖培养基为MS、6-BA2.0mg/ L、 NAA1.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L，pH 6.2，愈伤组织增殖速度较快，增殖倍数1.84，褐化率较高，70%以上的愈伤组织随着培养时间的延长逐渐褐化死亡。
3、不同褐变抑制剂和吸附剂对黄芪愈伤组织褐化的抑制效果
在筛选的最佳诱导培养基的基础上，在培养基中添加一定量的抗氧化剂和吸附剂都能不同程度的降低外植体褐化率，单独添加抗氧化剂柠檬酸0.8 g/L、抗坏血酸Vc0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP6.0g/L，褐化率较对照分别降低20%、30%和22.9%。配合使用不同种类和浓度的抗氧化剂和吸附剂进行实验，结果显示以0.2 g/L抗坏血酸Vc和4.0g/L聚乙烯吡咯烷酮 PVP配合使用效果最好，褐化率较对照降低58.6%。
4、固体支持物和培养条件对愈伤组织褐化的影响
培养基中的固体支持物琼脂用量的多少和培养条件对黄芪愈伤组织褐化的影响较大。本研究通过适当提高琼脂用量和pH值能显著降低褐化现象，琼脂用量为6.0g/L，pH 6.2，弱光照条件下1000lux，愈伤组织褐化率较对照降低33.5%，有利于细胞的分裂和生长。
5、有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法
在培养基中添加一定量的抗氧化剂和吸附剂都能不同程度的降低外植体褐化率，但却不能完全抑制褐化现象的发生，但将多种方法和措施综合运用，可使黄芪愈伤组织褐化现象得到有效抑制，取得了黄芪组织细胞离体培养的成功。
黄芪下胚轴愈伤组织诱导，最佳培养基配方为MS、6-BA 2.5 mg/L、NAA 0.3 mg/L、Vc 0.2 g/L、4.0g/L PVP＋蔗糖30g/L＋琼脂6.0g/L，pH 6.2，培养条件光照1000lux，温度22±3℃，相对湿度70%-80%。在此条件下培养10-20d，下胚轴愈伤组织诱导率达到100%，呈淡绿色或白色雪花状，结构疏松，无褐化现象发生。
在黄芪愈伤组织增殖阶段，最佳培养基配方为 MS、6-BA2.0mg/L、 NAA1.2mg/L、白砂糖30g/L、琼脂6.0g/L，pH 6.2，培养条件同上。因在诱导阶段愈伤组织褐化现象得到了有效抑制，在增殖阶段去除Vc和PVP不会引起褐化发生，且去除非培养基成分有利于细胞的分裂和快速生长。采用白砂糖代替蔗糖，对黄芪愈伤组织增殖效率不会造成影响，且降低了生产成本。在此条件下愈伤组织细胞生长旺盛，增殖快，继代周期10-15d，增值倍数3.27，愈伤组织颜色呈乳白色或淡黄绿色，有光泽，结构疏松易分散，无褐化现象出现。
综上所述本发明成果是在大量实验研究和不断探索优化的基础上取得的，理想的诱导和增殖培养基，黄芪愈伤诱导率达100%，愈伤组织生长旺盛，增殖速度快，经15d的培养，愈伤组织的鲜重增加至培养前的3.27倍左右。细胞增殖速度快，培养周期短，1个月内可轻松培养2代，产出比高，且操作简单，重复性好，具有工厂化生产和自动化控制等优点，便于生物学和医药学领域对黄芪次生代谢产物的开发和利用研究。
本方法以蒙古黄芪无菌苗为研究材料，在优化筛选基本培养基的基础上，重点研究了不同种类和浓度的褐变抑制剂、吸附剂、固体支持物和培养条件对黄芪愈伤组织褐化的影响，优化建立了一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，取得了黄芪组织细胞离体培养的圆满成功，为今后开展黄芪次生代谢产物研究和利用开辟了新途径。
具体实施方式
一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，包括如下步骤：
A、黄芪种子筛选
选取籽粒饱满、无病虫斑和损伤的黄芪种子，使用自来水冲洗30min；
B、黄芪种子浸泡
烧杯内加入蒸馏水放在60℃水浴中浸种，1h之后倒出水，加入质量浓度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃条件下浸泡2h；
C、黄芪种子消毒
首先加入体积浓度75%的乙醇溶液消毒30-50s后倒出乙醇溶液，其次采用质量浓度2%的NaClO溶液消毒10-30min，后倒出NaClO溶液，最后加入质量浓度0.1%氯化汞溶液消毒2-5min后倒出氯化汞溶液，期间不断轻轻摇晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液与种子充分接触；
D、清洗接种培养
使用无菌水冲洗种子表面去除消毒液，反复冲洗3～5次，冲洗完成后用滤纸吸干种子表面水分，接种到1/2MS培养基中并放入纸箱内，纸箱外套黑色塑料袋放置于培养室中，培养温度23±2℃，待种子萌发后转至光照条件下培养，光照强度1000～2000lux；
E、黄芪愈伤组织诱导培养和增殖培养
选取步骤D中培养苗龄7天的无菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚轴为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基上培养10～20d，愈伤组织诱导培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.0～3.5 mg/L、萘乙酸NAA 质量浓度0.1～0.5 mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～10g/L，愈伤组织诱导培养基pH值调节为 5.8～6.2进行诱导培养；接着进行愈伤组织快速增殖培养10～15d，增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度1.5～3.0mg/ L、萘乙酸 NAA质量浓度0.8～2.0mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～8g/L，黄芪愈伤组织快速增殖培养基pH值调节为 5.8～6.2。
所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一种或几种，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.6～0.8 g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.1～0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0～6.0g/L。
所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc或聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.8 g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度6.0g/L。
所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内混合加入抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗坏血酸Vc质量浓度0.2 g/L、聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0g/L。
所述步骤E中愈伤组织诱导培养基和增殖培养基的琼脂质量浓度6.0g/L，pH值调节为6.2。
所述步骤A将种子放到烧杯内，用纱布蒙住烧杯口，使用自来水下冲洗30min，冲洗种子在烧杯内上下旋转。
所述步骤C中首先加入体积浓度75%的乙醇溶液消毒40s后倒出乙醇溶液，其次加入质量浓度2%的NaClO溶液消毒20min后倒出NaClO溶液，最后加入质量浓度0.1%氯化汞溶液消毒3min后倒出氯化汞溶液，期间不断轻轻摇晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液与种子充分接触。
所述步骤D中使用无菌水冲洗种子表面去除消毒液，反复冲洗5次每次2min，冲洗完成后用滤纸吸干种子表面水分，接种到1/2MS培养基中并放入纸箱内，纸箱外套黑色塑料袋放置于培养室中，培养温度23±2℃，待种子萌发后转至光照条件下培养，光照强度1000lux；
所述步骤E选取步骤D中培养苗龄7天的无菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚轴为外植体并接种在愈伤组织诱导培养基上培养10～20d，愈伤组织诱导培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.5 mg/L、萘乙酸NAA 质量浓度0.3 mg/L、蔗糖质量浓度30g/L、琼脂质量浓度6g/L，愈伤组织诱导培养基pH值调节为 6.2进行诱导培养；接着进行愈伤组织快速增殖培养10～15d，增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.0mg/L、萘乙酸 NAA质量浓度1.2mg/L、蔗糖质量浓度30g/L、琼脂质量浓度6g/L，黄芪愈伤组织快速增殖培养基pH值调节为 6.2。
实施例1
一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，包括如下步骤：
A、黄芪种子筛选
选取子粒饱满、无病虫斑和损伤的黄芪种子，用纱布蒙住烧杯口，使用自来水下冲洗30min，冲洗种子在烧杯内上下旋转。
B、黄芪种子浸泡
烧杯内加入蒸馏水放在60℃水浴中浸种1h之后倒出水，加入质量浓度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃条件下浸泡2h；
C、黄芪种子消毒
首先加入体积浓度75%的乙醇溶液消毒30s后倒出乙醇溶液，其次加入质量浓度2%的NaClO溶液消毒10min后倒出NaClO溶液，最后加入质量浓度0.1%氯化汞溶液消毒2min后倒出氯化汞溶液，期间不断轻轻摇晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液与种子充分接触；
D、清洗接种培养
使用无菌水冲洗种子表面去除消毒液，反复冲洗3次每次2min，冲洗完成后用滤纸吸干种子表面水分，接种到1/2MS培养基中并放入纸箱内，纸箱外套黑色塑料袋放置于培养室中，培养温度23±2℃，待种子萌发后转至光照条件下培养，光照强度2000lux；
E、黄芪愈伤组织诱导培养和增殖培养
选取步骤D中培养苗龄7天的无菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚轴为外植体并接种在愈伤组织诱导培养基上培养10～20d，愈伤组织诱导培养基为MS培养基、6 苄基嘌呤6BA质量浓度2.0 mg/L、萘乙酸NAA 质量浓度0.1mg/L、蔗糖质量浓度15g/L、琼脂质量浓度4g/L，愈伤组织诱导培养基pH值调节为 5.8进行诱导培养；接着进行愈伤组织快速增殖培养10～15d，增殖培养基为MS培养基、6 苄基嘌呤6BA质量浓度1.5mg/ L、萘乙酸 NAA质量浓度0.8mg/L、蔗糖质量浓度15g/L、琼脂质量浓度4g/L，黄芪愈伤组织快速增殖培养基pH值调节为 5.8。所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一种或几种，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.6 g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.1 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0g/L。
实施例2
一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，包括如下步骤：
A、黄芪种子筛选
选取子粒饱满、无病虫斑和损伤的黄芪种子，用纱布蒙住烧杯口，使用自来水下冲洗30min，冲洗种子在烧杯内上下旋转。
B、黄芪种子浸泡
烧杯内加入蒸馏水放在60℃水浴中浸种1h之后倒出水，加入质量浓度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃条件下浸泡2h；
C、黄芪种子消毒
首先加入体积浓度75%的乙醇溶液消毒50s后倒出乙醇溶液，其次加入质量浓度2%的NaClO溶液消毒30min后倒出NaClO溶液，最后加入质量浓度0.1%氯化汞溶液消毒5min后倒出氯化汞溶液，期间不断轻轻摇晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液与种子充分接触；
D、清洗接种培养
使用无菌水冲洗种子表面去除消毒液，反复冲洗5次2min，冲洗完成后用滤纸吸干种子表面水分，接种到1/2MS培养基中并放入纸箱内，纸箱外套黑色塑料袋放置于培养室中，培养温度23±2℃，待种子萌发后转至光照条件下培养，光照强度1000lux；
E、黄芪愈伤组织诱导培养和增殖培养
选取步骤D中培养苗龄7天的无菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚轴为外植体并接种在愈伤组织诱导培养基上培养10～20d，愈伤组织诱导培养基为MS培养基、6 苄基嘌呤6BA质量浓度3.5 mg/L、萘乙酸NAA 质量浓度0.5 mg/L、蔗糖质量浓度45g/L、琼脂质量浓度10g/L，愈伤组织诱导培养基pH值调节为 6.2进行诱导培养；接着进行愈伤组织快速增殖培养10～15d，增殖培养基为MS培养基、6 苄基嘌呤6BA质量浓度3.0mg/ L、萘乙酸 NAA质量浓度2.0mg/L、蔗糖质量浓度45g/L、琼脂质量浓度8g/L，黄芪愈伤组织快速增殖培养基pH值调节为 6.2。
所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc或聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.8 g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度6.0g/L。
实施例3
一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，包括如下步骤：
A、黄芪种子筛选
选取子粒饱满、无病虫斑和损伤的黄芪种子，用纱布蒙住烧杯口，使用自来水下冲洗30min，冲洗种子在烧杯内上下旋转；
B、黄芪种子浸泡
烧杯内加入蒸馏水放在60℃水浴中浸种1h之后倒出水，加入质量浓度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃条件下浸泡2h；
C、黄芪种子消毒
首先加入体积浓度75%的乙醇溶液消毒40s后倒出乙醇溶液，其次加入质量浓度2%的NaClO溶液消毒20min后倒出NaClO溶液，最后加入质量浓度0.1%氯化汞溶液消毒3min后倒出氯化汞溶液，期间不断轻轻摇晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液与种子充分接触；
D、清洗接种培养
使用无菌水冲洗种子表面去除消毒液，反复冲洗5次每次2min，冲洗完成后用滤纸吸干种子表面水分，接种到1/2MS培养基中并放入纸箱内，纸箱外套黑色塑料袋放置于培养室中，培养温度23±2℃，待种子萌发后转至光照条件下培养，光照强度1000lux；
E、黄芪愈伤组织诱导培养和增殖培养
所述步骤E选取步骤D中培养苗龄7天的无菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚轴为外植体并接种在愈伤组织诱导培养基上培养10～20d，愈伤组织诱导培养基为MS培养基、6 苄基嘌呤6BA质量浓度2.5 mg/L、萘乙酸NAA 质量浓度0.3 mg/L、蔗糖质量浓度30g/L、琼脂质量浓度6g/L，愈伤组织诱导培养基pH值调节为 6.2进行诱导培养；接着进行愈伤组织快速增殖培养10～15d，增殖培养基为MS培养基、6 苄基嘌呤6BA质量浓度2.0mg/ L、萘乙酸 NAA质量浓度1.2mg/L、蔗糖质量浓度30g/L、琼脂质量浓度6g/L，黄芪愈伤组织快速增殖培养基pH值调节为 6.2。
所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内混合加入抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗坏血酸Vc质量浓度0.2 g/L、聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0g/L。
Claims (9)
1.一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，其特征在于包括如下步骤：
A、黄芪种子筛选
选取籽粒饱满、无病虫斑和损伤的黄芪种子，使用自来水冲洗30min；
B、黄芪种子浸泡
烧杯内加入蒸馏水放在60℃水浴中浸种，1h之后倒出水，加入质量浓度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃条件下浸泡2h；
C、黄芪种子消毒
首先加入体积浓度75%的乙醇溶液消毒30-50s后倒出乙醇溶液，其次采用质量浓度2%的NaClO溶液消毒10-30min，后倒出NaClO溶液，最后加入质量浓度0.1%氯化汞溶液消毒2-5min后倒出氯化汞溶液，期间不断轻轻摇晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液与种子充分接触；
D、清洗接种培养
使用无菌水冲洗种子表面去除消毒液，反复冲洗3～5次，冲洗完成后用滤纸吸干种子表面水分，接种到1/2MS培养基中并放入纸箱内，纸箱外套黑色塑料袋放置于培养室中，培养温度23±2℃，待种子萌发后转至光照条件下培养，光照强度1000～2000lux；
E、黄芪愈伤组织诱导培养和增殖培养
选取步骤D中培养苗龄7天的无菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚轴为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基上培养10～20d，愈伤组织诱导培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.0～3.5 mg/L、萘乙酸NAA 质量浓度0.1～0.5 mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～10g/L，愈伤组织诱导培养基pH值调节为 5.8～6.2进行诱导培养；接着进行愈伤组织快速增殖培养10～15d，增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度1.5～3.0mg/ L、萘乙酸 NAA质量浓度0.8～2.0mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～8g/L，黄芪愈伤组织快速增殖培养基pH值调节为 5.8～6.2。
2.根据权利要求1所述的一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，其特征在于所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一种或几种，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.6～0.8 g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.1～0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0～6.0g/L。
3.根据权利要求2所述的一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，其特征在于所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc或聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.8 g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度6.0g/L。
4.根据权利要求2所述的一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，其特征在于所述步骤E中愈伤组织诱导培养基内混合加入抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗坏血酸Vc质量浓度0.2 g/L、聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0g/L。
5.根据权利要求1所述的一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，其特征在于所述步骤E中愈伤组织诱导培养基和增殖培养基的琼脂质量浓度6.0g/L，pH值调节为6.2。
6.根据权利要求1所述的一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，其特征在于所述步骤A将种子放到烧杯内，用纱布蒙住烧杯口，使用自来水下冲洗30min，冲洗种子在烧杯内上下旋转。
7.根据权利要求1所述的一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，其特征在于所述步骤C中首先加入体积浓度75%的乙醇溶液消毒40s后倒出乙醇溶液，其次加入质量浓度2%的NaClO溶液消毒20min后倒出NaClO溶液，最后加入质量浓度0.1%氯化汞溶液消毒3min后倒出氯化汞溶液，期间不断轻轻摇晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液与种子充分接触。
8.根据权利要求1所述的一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，其特征在于所述步骤D中使用无菌水冲洗种子表面去除消毒液，反复冲洗5次每次2min，冲洗完成后用滤纸吸干种子表面水分，接种到1/2MS培养基中并放入纸箱内，纸箱外套黑色塑料袋放置于培养室中，培养温度23±2℃，待种子萌发后转至光照条件下培养，光照强度1000lux。
9.根据权利要求1所述的一种有效抑制黄芪愈伤组织褐化的方法，其特征在于所述步骤E选取步骤D中培养苗龄7天的无菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚轴为外植体并接种在愈伤组织诱导培养基上培养10～20d，愈伤组织诱导培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.5 mg/L、萘乙酸NAA 质量浓度0.3 mg/L、蔗糖质量浓度30g/L、琼脂质量浓度6g/L，愈伤组织诱导培养基pH值调节为 6.2进行诱导培养；接着进行愈伤组织快速增殖培养10～15d，增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.0mg/L、萘乙酸 NAA质量浓度1.2mg/L、蔗糖质量浓度30g/L、琼脂质量浓度6g/L，黄芪愈伤组织快速增殖培养基pH值调节为 6.2。
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