KR101114578B1

KR101114578B1 - 황기 캘러스 대량 생산 방법

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Publication number: KR101114578B1
Application number: KR1020090098316A
Authority: KR
Inventors: 박정해; 이진성; 전영진; 이태성; 김성규; 윤승원; 박종철
Original assignee: 주식회사 아이기스화진화장품; 제천시; 재단법인충북테크노파크
Priority date: 2009-10-15
Filing date: 2009-10-15
Publication date: 2012-02-27
Also published as: KR20110041235A

Abstract

본 발명은 황기의 캘러스를 고효율로 발생시키는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 황기 종자를 소독하여 기내배양하거나 자연 발육된 황기의 줄기 또는 잎을 2,4-디클로로페녹시아세트산이 포함된 캘러스 유도 배지에 치상하여 캘러스를 발생시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 황기 캘러스를 발생시키는데 있어 최적의 황기 부위, 최적의 배지 조성 및 최적의 소독 조건을 찾아낸 것으로 이를 이용하여 황기 캘러스를 대량 배양 할 수 있으며 다양한 황기 성분이 함유된 식, 의약품 또는 화장품 개발에 유용하게 사용할 수 있다.

황기, 캘러스

Description

황기 캘러스 대량 생산 방법{Mass production method for callus of Astragalus membranaceus L.}

본 발명은 황기의 캘러스를 고효율로 발생시키는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 황기 종자를 소독하여 기내배양하거나 자연 발육된 황기의 줄기 또는 잎을 2,4-디클로로페녹시아세트산이 포함된 캘러스 유도 배지에 치상하여 캘러스를 발생시키는 방법에 관한 것이다.

제천 황기는 우리나라 생산량 중 전체 약 30%가 생산되고 있으며, 약 70%가 제천 지역을 통하여 유통되고 있다. 또한 제천산 황기의 뿌리는 이미 초기 가공기술을 통하여 단순한 식품첨가에 사용되고 있으나 다양한 연구를 통한 산업화가 필요하다.

이러한 황기는 아토피 개선, 피부 항상성을 통한 보습, 주요 성분인 사포닌계통의 astragaloside의 항노화 효과, formonectin의 미백효과 등이 있어 고기능성 화장품 개발을 위한 최적의 소재이다.

하지만, 지금까지는 자연 상태에서 자란 성체의 뿌리만을 선택적으로 이용하고 있다.

따라서 황기를 이용하는 산업시장에 무균상태의 원료를 대량으로 제공하고, 그 배양산물을 이용하거나 기술을 응용하여 보다 효과적인 화장품원료 및 산업물질을 생산하는 기술의 필요성이 절실한 상황이다.

식물의 조직배양은 식물이 가지고 있는 전형성능을 이용하여 식물조직 이나 종자 등 식물체의 일부를 인공적으로 영양소를 첨가하여 만든 배지에서 배양하는 것으로 현재 유전공학 기술과 접목하여 교배 및 재분화, 형질 전환 등에 사용되는 고효율 기술로 자리 잡고 있다. 또한 식물 희귀성의 단점을 보완, 일반화된 조직배양기술을 이용한 대량증식, 단시간 내에 적은 비용으로 균일한 생산물을 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있다.

캘러스(callus)는 분열이 활발히 이루어지면서 기관이 형성되지 않은 조직으로 흔히 식물체에 상처가 났을 때 상처 주변에 생기는 분열조직이다. 처음 식물조직에 상처를 낸 후(일반적으로 절편을 제작) 각자의 식물 종에 적절한 생장조절제를 첨가한 영양 배지에 넣고 키우면 캘러스가 유기 된다. 그 후 부정배가 형성되고 식물이 가지고 있는 전형성능으로 인해 식물체로 분화한다. 이러한 캘러스는 흔히 식물의 줄기세포라 한다.

식물조직배양에 사용되는 생장 조절제는 크게 Cytokinin과 Auxin으로 나눌 수 있으며, 일반적으로 고농도의 Cytokinin에서는 Shoot가 발생하고, 고농도의 Auxin에서는 뿌리가 발생하며 Cytokinin 과 Auxin의 적당한 비율만이 캘러스를 유기 시킨다. 하지만 식물 종에 따라서 Auxin의 단독처리 만이 캘러스를 유기시키기 도 한다. 정리하면, 생장 조절 물질로서의 Auxin과 Cytokinin의 농도와 비율이 식물조직의 탈분화, 캘러스 증식 및 재분화 등을 지배하고 그 반응은 식물 종에 따라 현저하게 차이가 있으며 각 식물 종에 관여하는 생장조절제의 비율은 독자적으로 검토해야 한다.

식물조직배양은 이미 세포학 분야, 유전 육종학 분야, 약리학과 식물병리학 분야 등 다양한 분야에서 눈부신 발전을 이루며 성장하고 있으나 이런 학문을 화장품과 접목하는 사례는 최근에 시작되고 있다. 따라서 조직배양과 천연물을 이용한 산업화의 발전이 절실한 상황이다. 효과 효능 면에서 우수하며 친환경 소재인 식물줄기세포(callus)를 이용한 원료의 필요성이 대두 되고 있으며, 이에 앞서 효능 효과가 우수한 식물의 캘러스 유기 방법의 확립이 필요하다 생각된다.

현재까지 황기의 기내 배양을 이용한 캘러스유기 방법의 확립에 관한 보고는 없다. 또한 화장품 원료로 사용하기 위하여 캘러스를 대량 생산하는 기술들은 최근 시작되고 있으나 각자의 식물 종에 따라 현저하게 차이가 있어 각자 독자적으로 검토해야 하기 때문에 효능 효과가 우수한 황기의 캘러스 유기 방법 확립이 절실하다.

본 발명자들은 황기 대량 생산 방법에 관하여 연구하던 중 황기 성체의 조직을 절단하여 소독한 조직, 또는 황기 종자를 소독하여 기내 배양하여 절단한 조직을 캘러스 유도 배지에 치상하여 캘러스를 높은 비율로 유도하는 방법을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 황기 종자 또는 성체 황기의 잎 또는 줄기 조직을 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 황기 캘러스 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 황기 종자를 소독하는 단계; 상기 소독된 황기 종자를 기내 배양 하는 단계; 및 상기 배양된 황기의 잎 또는 줄기 조직을 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 황기 캘러스 대량 생산 방법을 제공한다.

또한 본 발명의 다른 목적은 달성하기 위하여 본 발명은 황기 줄기 또는 잎을 소독하는 단계; 상기 소독된 황기의 잎 또는 줄기 조직을 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 황기 캘러스 대량 생산 방법을 제공한다.

이하 본 발명의 과제 해결 수단에 대하여 상세히 설명하고자 한다.

본 발명의 황기(Astragalus membranaceus Bunge)는 콩과(Leguminosae)에 속하는 다년생 초본으로 산지나 고지에서 주로 자생하나 최근에는 각지에서 재배하고 있으며 그의 생약명은 Astragali Radix이며 한방에서는 그 뿌리를 약재로 사용하고 있으며, 보중익기, 탁독 등의 효능이 있고, 내상노권 및 모든 기쇠허혈증에 치료효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이에 관한 주요한 약리효능 연구로는 혈압강하작용, 강심작용, 간장보호작용, 혈당강하작용 등이 보고되고 있다.

본 발명은 (a) 황기 종자를 소독하는 단계;(b) 상기 소독된 황기 종자를 기내 배양 하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 황기의 잎 또는 줄기 조직을 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 황기 캘러스 대량 생산 방법을 제공한다.

캘러스(callus)란 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 식물조직 또는 세포덩어리를 말한다.

상기 (a) 단계에서는 황기 종자를 소독한다. 소독 방법과 시간은 종자의 발아를 심하게 저해하지 아니하는 한 공지의 어떠한 종자 소독 방법과 시간도 가능하나 바람직하게는 2중량% 하이포아염소산나트륨 수용액을 이용한 소독방법 일 수 있으며, 소독 시간은 13내지 17분이 바람직하다. 소독 시간이 너무 긴 경우 종자의 발아율이 떨어지며 너무 짧은 경우 각종 곰팡이 및 세균이 완전히 소독되지 않는 문제가 있다.

상기 (b) 단계에서는 소독된 황기 종자를 기내 배양한다. 기내 배양이란 무균조건하에서 식물체의 종자, 배, 기관, 조직, 세포 및 원형질체를 영양소가 든 배지위에서 키우는 것을 말한다. 기내 배양은 본 발명의 캘러스를 유도하기 위한 황기의 잎 또는 줄기를 정상적으로 발생시킬 수 있는 조건이면 어떤 조건도 가능하다. 기내 배양 기간은 황기의 줄기와 잎이 발생할 수 있는 기간이어야 하며 파종 후 15일 내지 25일이 바람직하다. 14일 이하의 경우 너무 어려 절편을 제작하기 힘들고 26일 이상의 경우 줄기가 너무 많이 자라 부적절하기 때문이다.

상기 (c) 단계에서는 배양된 황기의 잎 또는 줄기 조직을 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하여 캘러스를 유도한다. 상기 캘러스 유도 배지는 캘러스를 유도하는 배지면 어떤 것이나 가능하나 바람직하게는 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)이 0.5mg/L 내지 3.0mg/L의 농도로 포함된 유도배지 일 수 있다. 좀 더 바람직하게는 2,4-디클로로페녹시아세트산이 0.5mg/L 내지 3.0mg/L의 농도로 포함되며, 30g/l의 수크로오스(Sucrose)와 0.3% Gelrite가 포함된 기본 MS 배지 일 수 있다.

또한 본 발명은 (a) 황기 줄기 또는 잎을 소독하는 단계; 및 (b) 상기 소독된 황기의 잎 또는 줄기 조직을 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 황기 캘러스 대량 생산 방법을 제공한 다.

(a) 단계의 자연 재배한 황기의 줄기 또는 잎을 수득하여 소독한다. 소독 방법과 시간은 수득한 황기의 줄기 또는 잎 조직을 심하게 상하게 하지 아니하는 한 공지의 어떠한 식물조직 소독 방법과 시간도 가능하나 물에 하이포아염소산나트륨을 2중량%로 용해한 2중량% 하이포아염소산나트륨 수용액에 침지하는 소독이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 70% 에탄올에 30초 동안 침지 후 꺼내어 2중량% 하이포아염소산나트륨 수용액에 침지하는 소독방법 일 수 있으며, 2중량% 하이포아염소산나트륨 수용액을 이용한 소독 시간은 13내지 17분이 바람직하다. 소독 시간이 너무 긴 경우 조직세포가 죽어 캘러스 발생률이 떨어지며 너무 짧은 경우 각종 곰팡이 및 세균이 완전히 소독되지 않는 문제가 있다.

(b) 단계에서는 상기 소독된 잎 또는 줄기 조직을 절단하여 캘러스 유도 배지에 치상하여 캘러스를 유도한다. 상기 캘러스 유도배지에 대하여는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법에 의하면 황기로부터 캘러스를 높은 비율로 발생시킬 수 있다. 황기를 이용한 캘러스 유도 방법이나 효율적인 캘러스 유도 조건은 본 발명에 의하여 처음 제공되는 것이다.

본 발명의 일실시예에서는 황기의 캘러스 유도를 위한 적당한 소독 시간을 찾기 위하여 황기 종자를 다양한 시간 동안 2중량% 하이포아염소산나트륨 수용액에 침지 시켜 소독 한 후 발아율을 측정하였다. 그 결과 10분 또는 30분간 침지를 한 종자의 경우 발아율이 급격히 떨어지는 것을 확인하였으며 15분간 침지하여 소독한 경우 가장 발아율이 높은 것을 확인하였다(실시예 1-1참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 황기에서 캘러스를 유도하기에 가장 좋은 조직과 가장 좋은 배지 조성을 알기 위하여 뿌리, 줄기, 잎, 떡잎 등 다양한 조직을 수득하여 다양한 배지 조성에서 캘러스 유도 실험을 하였다. 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid; 2,4-D), 인돌아세트산(indole acetic acid; IAA), 벤질아데닌(banzyladenine; BA) 또는 트디아주론(Thidiazuron; TDZ)이 다양한 농도로 포함된 MS기본배지를 만들어 캘러스 발생비율 측정 시험을 하였다. 그 결과 2,4-디클로로페녹시아세트산이 단독으로 포함된 경우 가장 높은 캘러스 발생률을 보였다. 황기의 부위는 줄기를 이용하는 경우가 가장 높은 캘러스 형성률을 보였으며 잎의 경우에도 높은 캘러스 형성률을 나타내었다(실시예 1-2 및 1-3 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 캘러스 유도배지에 포함되는 2,4-디클로로페녹시아세트산의 농도에 따른 황기 캘러스 발생률을 비교 측정하였다. 그 결과 0.5mg/L 내지 3.0mg/L의 농도로 2,4-디클로로페녹시아세트산이 포함되는 경우 가장 높은 캘러스 발생률을 나타내는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 황기 종자 또는 자연 발생된 황기에서 캘러스를 고효율로 발생시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 황기 캘러스를 발생시키는데 있어 최적의 황기 부위, 최적의 배지 조성 및 최적의 소독 조건을 찾아낸 것으로 이를 이용하여 황기 캘러스를 대량 배양 할 수 있으며 다양한 황기 성분이 함유된 식, 의약품 또는 화장품 개발에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용한 황기(Astragillus membranaceus L.)종자는 충청북도 제천시 전통의학센터에서 분양받아 사용하였고, 제천시 관할 농가에서 자연 상태로 생육중인 성체를 사용하였다.

<실시예 1> : 황기를 이용한 캘러스 유도

<1-1> 종자의 표면 소독 시간에 따른 발아율 비교실험

무균발아를 위한 종자의 소독과 성체의 소독은 소독 처리시간에 따라 시간이 길어질 경우 조직이 파괴되고, 시간이 부족할 경우 표면조직의 각종 곰팡이 및 세균이 완전히 소독되지 않아 오염이 심하기 때문에 다양한 처리 시간으로 소독을 실시하였다.

본 발명에서는 경실종자인 황기 종자의 내피조직은 보존하며 표피조직의 완벽한 살균을 위한 방법으로 우선 70% 에탄올에 30초 침지한 후 꺼내어 2중량% 하이포아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite)수용액에 5, 10, 15, 30분 침지하였다. 이때 소독이 끝난 후 표피에 남아있는 소독약제의 내피세포로의 침투를 막기 위하여 멸균된 증류수로 3회 세척하였다.

멸균된 종자는 MS 배지(3% sucrose, 0.3% gelrite, pH 5.8)에 각 10개씩 파종하여 무균으로 암실에서 발아를 유도하였으며 파종 후 20일 된 유식물체를 사용하였다.

MS 배지 조성(mg/L)

성분	함량(mg/L)
CoCl₂6H₂O	0.025
CuSO₄5H₂O	0.025
FeNaEDTA	36.70
H₃BO₃	6.20
KI	0.83
MnSO₄H₂O	16.90
Na₂MoO₄2H₂O	0.25
ZnSO₄7H₂O	8.60
CaCl₂	332.02
KH₂PO₄	170.00
KNO₃	1900.00
MgSO₄	180.54
NH₄NO₃	1650.00
Glycine	2.00
Myo-Inositol	100.00
Nicotinic acid	0.50
Pyridoxine HCl	0.50
Thiamine HCl	0.10

종자 소독 시간에 따른 발아 정도(2중량% 하이포아염소산나트륨 수용액)

	5분	10분	15분	30분
발아율	0%	10%	60%	20%

표 2에서 보는 것과 같이, 기존 경실 종자들의 종자소독 시간이 30분 정도인 것에 비교하여 황기의 경우 30분 소독 시 내피 조직의 손상으로 인해 발아율이 현저히 저하됨을 볼 수 있었다. 또한 5분과 10분 정도 소독 시 표피조직이 완전히 살균되지 않아 그 오염도가 심각하였으며, 이에 발아율도 현저히 저하되었다. 즉, 황기 종자의 기내 배양을 위한 적정한 소독시간은 15분 정도가 적당함을 확인하였다. 따라서 본 발명에서는 이후 실험에 대하여 황기 종자를 2중량% 하이포아염소산나트륨 수용액에 15분간 소독하여 기내발아시켜 사용하였다.

자연 상태로 생육중인 성체는 적당한 크기로 임의 절단하여 70% 에탄올에 30초 침지 후 꺼내어 2중량% 하이포아염소산나트륨 수용액에 15분간 침지하였으며, 소독이 끝난 후 표피에 남아있는 소독약제의 내부세포로의 침투를 막기 위하여 멸균된 증류수로 3회 세척하였다.

<1-2> 절편 제작

파종 후 20일 정도 된 유식물체를 각 기관별 나누어 캘러스의 유기에 가장 효과적인 기관을 선택하고자 떡잎, 줄기, 뿌리로 나누어 5×5mm 크기로 절편을 만들어 사용하였다. 유식물체는 이미 무균상태로 발아 한 것이기에 소독의 단계는 생략 하였다.

자연 상태에서 자란 성체역시 소독한 조직을 줄기와 잎으로 나누어 5mm크기로 절편을 만들어 사용하였다. 성체의 절편 제조 시 지상부인 줄기와 잎만을 이용한 이유는 기존에 지하부의 효능과 지하부를 이용한 연구들과 상품들은 존재하지만 지상부를 이용한 연구는 전무하였기 때문이다. 또한 이는 지하부를 채취함과 동시에 식물체가 연속적으로 성장할 수 없다는 문제점이 있었으며 지하부 가공 시 남아 있는 지상부 조직의 이용을 높이기 위함이다.

<1-3> 캘러스 유기용 배지 선별 및 부위별 캘러스 유기 효율 비교

기본 MS배지에 30g/l 수크로오스(Sucrose)와 0.3% Gelrite를 첨가 하였고, 각 처리구별로 2,4-D, IAA, BA, TDZ를 단독 처리 및 각 비율에 따라 다르게 처리하였다. 각 처리구별 캘러스 유기정도를 관찰하였으며, 4주마다 계대배양 하였다. 각 기관별 처리구 중 줄기부분에서 가장 빠른 캘러스유기를 나타내었고, 생장속도도 가장 빠르다는 결과가 나타남에 따라 이후 2차 실험에서는 줄기를 이용하여 집중적으로 관찰하였다.

자세히 말하면, 생장조절제를 농도별로 처리하여 떡잎(Cotyledon), 줄기(stem), 뿌리(root)를 각각 나누어 치상한 후 캘러스유기를 관찰한 결과 표 3 및 표 4와 같은 결과를 도출하였다. 뿌리의 절편에서는 캘러스 발생률이 매우 적었으며, 처리구별 차이를 관찰할 수 없었다(결과 미도시).

유식물체의 떡잎, 줄기를 생장조절제가 동일한 비율로 첨가된 처리구에 치상하였을 경우 표 3, 4에서 보는 것과 같이 줄기의 캘러스 발생률이 현저하게 높았으며, 생장조절제의 비율에 따라서도 크게 차이를 보였다. 줄기의 경우 2,4-D의 단독 처리구에서 현저하게 높은 캘러스 발생률을 보였기에 2,4-D를 단독으로 사용하고 2,4-D의 농도를 다르게(0.5, 1.0, 2.0, 3.0mg/l)하여 이후 실험을 진행하였다.

성체의 잎과 줄기에서 역시 같은 결과를 나타내었으며 이후 실험도 동일하게 진행하였다. 잎 절편의 경우 보편적인 잎 절편의 단면 모두에서 캘러스가 유도되는 것과 달리 특이하게 절편의 중앙맥의 절단면에서 캘러스가 발생(도 1 참조)하였다. 줄기절편에서 부정아가 생성된 경우도 있었는데 0.5mg/l 2,4-D에서 가장 높았으며, 3.0mg/l 2,4-D에서 역시 부정아 형성을 보였다.

유식물체의 떡잎(Cotyledon) 및 줄기에서의 생장조절제 처리별 캘러스발생 정도(Cotyledon/줄기, %)

		2,4-D(mg/l)			IAA(mg/l)
		0	0.5	1.0	0	0.2	1.0
BA (mg/l)	0	0	19/74	18/86	0	0/23	0/23
	1.0	0	8/40	0/45	0	5/42	6/25
	2.0	0	0/48	6/32	0	10/34	4/56
TDZ (mg/l)	0	0	19/74	18/86	0	0/23	0/23
	0.5	0	0/12	5/13	0	0/26	12/25
	1.0	0	8/24	0/52	0	4/16	0/39

성체의 잎(leaf) 및 줄기(stem)에서의 생장조절제 처리별 캘러스 발생정도 (Leaf/Stem, %)

		2,4-D(mg/l)			IAA(mg/l)
		0	0.5	1.0	0	0.2	1.0
BA (mg/l)	0	0	65/89	55/74	0	0/8	5/5
	1.0	0	40/49	26/40	0	2/5	4/0
	2.0	0	32/46	16/55	0	0/3	5/6
TDZ (mg/l)	0	0	65/89	55/74	0	0/8	5/5
	0.5	0	30/12	18/20	0	9/7	0/0
	1.0	0	18/13	4/36	0	3/0	2/1

<1-4> 2,4-D 처리 비율별 줄기 유래 캘러스 증식

생장 호르몬의 처리구 중 2,4-D단독 처리구에서의 활성이 가장 높다는 결과가 나타남에 따라 2,4-D를 4가지 농도(0.5, 1.0, 2.0 ,3.0 mg/l)로 처리하였고, 4주마다 계대하였다.

그 결과 표 5에서 보는 바와 같이, 유식물체와 성체에서 모두 동일하게 2,4-D 1.0mg/l의 처리구에서 가장 활발히 캘러스가 유도되었으며 증식 속도 역시 활발하였다. 또한 dark condition(28℃)과 16시간 광주기(27℃)를 주었을 경우 dark condition에서 좀 더 활발한 증식 속도를 보였다.

줄기의 2,4-D(mg/l) 단독 처리구 농도별 캘러스 발생 정도(%)

	0.5	1.0	2.0	3.0
유식물체	68	80	64	74
성체	50	84	71	62

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 황기 종자 또는 자연 발생된 황기에서 캘 러스를 고효율로 발생시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 황기 캘러스를 발생시키는데 있어 최적의 황기 부위, 최적의 배지 조성 및 최적의 소독 조건을 찾아낸 것으로 이를 이용하여 황기 캘러스를 대량 배양 할 수 있으며 다양한 황기 성분이 함유된 식, 의약품 또는 화장품 개발에 유용하게 사용할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

도면 1은 자연 상태에서 생육중인 황기 잎 절편의 중앙맥 부근에서 캘러스 유기 사진이다(2,4-D 1.0mg/l).

도면 2는 자연 상태에서 생육중인 황기 줄기 절편의 캘러스 유기 초기 사진이다(2,4-D 1.0mg/l).

도면 3은 자연 상태에서 생육중인 황기 줄기 절편의 캘러스 유기 후 증식하고 있는 사진이다(2,4-D 1.0mg/l).

도면 4는 무균 발아한 유식물체의 줄기절편의 캘러스 유기 사진이다(2,4-D 1.0mg/l).

도면 5는 무균 발아한 유식물체의 캘러스 유기 후 증식하고 있는 사진이다(2,4-D 1.0mg/l).

Claims

(a) 황기 종자를 소독하는 단계;

(b) 상기 소독된 황기 종자를 기내 배양 하는 단계; 및

(c) 상기 배양된 황기의 잎 또는 줄기 조직을 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 황기 캘러스 대량 생산 방법.
(a) 황기 줄기 또는 잎을 소독하는 단계; 및

(b) 상기 소독된 황기의 잎 또는 줄기 조직을 절단하여 캘러스 유도배지에 치상하여 캘러스를 유도하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 황기 캘러스 대량 생산 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계의 소독은 2중량% 하이포아염소산나트륨 수용액으로 13내지 17분간 소독하는 것을 특징으로 하는 황기 캘러스 대량 생산 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 캘러스 유도배지는 2,4-디클로로페녹시아세트산을 0.5 내지 3.0mg/L의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 황기 캘러스 대량 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 기내 배양 기간은 15일에서 25일인 것을 특징으로 하는 황기 캘러스 대량 생산 방법.