KR101453903B1 - 기내 식물체로부터 채취한 생장점 배양을 통한 바이러스 무병주 생산방법 - Google Patents

기내 식물체로부터 채취한 생장점 배양을 통한 바이러스 무병주 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생장점 배양에 사용하기 위해 생장점 채취용으로 경정을 기내에서 조직배양하여 기내 식물체를 생산하는 방법, 이러한 방법에 사용되기 위한 증식 배지, 이러한 방법에 따라 생산된 기내 식물체에서 채취한 생장점을 이용한 생장점 배양을 통해 무병주를 생산하는 방법, 및 이러한 생산방법에 사용하기 위한 배지에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 계절적인 제한 없이 생장점을 채취할 수 있으며 바이러스 오염율은 낮고 생존율은 높은 식물체를 대량생산할 수 있어, 우량품종을 원활하게 보급할 수 있으므로 농가 소득증대에 기여할 수 있으며 생산품의 품질향상에 의한 국제 경쟁력 제고로 우수품종의 수출이 가능할 것으로 기대된다.

Description

기내 식물체로부터 채취한 생장점 배양을 통한 바이러스 무병주 생산방법{Production of Virus Free Plants from in Vitro Shoot Tips through in Vitro Meristem Culture}
본 발명은 생장점 배양을 통해 바이러스 무병주를 생산하는 방법 및 이러한 생산방법에 사용하기 위한 증식 및 발근배지에 관한 것이다.
식물체가 바이러스에 감염되면 수량이 감소하고(20-30%), 외형이 나빠지고 당도가 감소하고, 색체가 퇴색하는 단점이 있다. 일단 바이러스에 감염된 식물은 치유되지 않아, 바이러스를 제거하여 바이러스 무병주 식물체를 생산하는 방법이 반드시 필요하다.
바이러스 무병주 식물체를 생산하기 위한 대표적인 방법으로는 캘러스 배양, 생장점 배양, 및 기내 접목법이 있다.
먼저, 생장점 배양은 기외(ex vitro)에서 생장한 식물의 생장점 또는 그것을 포함하는 주변조직을 분리하여 기내배양(in vitro culture)을 하는 배양법을 말한다. 조직배양(tissue culture)에 속하는 방법으로, 생장점이 포함된 조직 예를 들어 경정, 뿌리, 또는 눈(bud) 등에서 생장점을 분리하여 배양한다. 따라서 생장점 배양은 통상적으로 기외 식물체로부터 생장점을 포함한 조직을 분리하는 단계, 분리한 조직을 소독하는 단계, 소독한 조직에서 생장점을 분리하는 단계, 분리된 생장점을 기내에서 배양하는 단계, 및 식물체를 증식하는 단계를 거친다. 생장점 배양법을 이용하면, 동일개체의 번식이 가능하고 따라서 상품의 균일성이 보장되어 우수품종의 대량증식이 가능하다. 그러나 생장점은 기외 식물체에서 채취되기 때문에 조직배양시 소독과정이 필수적이다. 이에, 생장점 배양 전 소독과정을 거치고 있으며, 그럼에도 불구하고 바이러스 제거가 어려운 식물체의 경우에는 생장점 배양 전 식물체를 열처리하여 바이러스 오염율을 낮추고 바이러스 무독의 범위를 확장하기도 한다. 그러나 Growth Chamber 등에서 식물체를 배양하는 과정이 포함되어야 하는 등 열처리 과정이 복잡하고, 생장점은 소독이 까다로울 뿐만 아니라 소독 후의 생존율이 낮은 문제점이 있다. 뿐만 아니라, 생장점 크기에 따라 배양의 난이도에 차이가 있어 생장점의 크기가 작으면 작을수록 바이러스 제거 가능성은 높아지나 배양이 어려워지는 난점이 있다. 또한, 바이러스 제거를 위해 생장점을 약 0.2-0.5 mm의 작은 크기로 절취하나 이렇게 작은 크기로 절취하기는 매우 어렵다.
캘러스 배양은 생장점 배양과 유사하나 생장점 배양의 경우 생장점에서 직접 식물체의 경엽(stem and leaf)을 분화시키지만, 캘러스 배양은 생장점에서 캘러스를 유기 및 증식시킨 후 이러한 캘러스에서 다시 경엽을 분화시킨다는 차이가 있다. 캘러스 배양의 경우에는 유전적 변이가 일어날 확율이 높아 우수품종의 유지가 어렵다는 난점이 있고, 많은 식물체의 경우 캘러스에서는 식물체 분화가 쉽지 않은 등의 문제가 있다.
기내접목법은 생장점 배양과 기내접목을 병행하는 방법으로 접수로 생장점 조직을 사용해 유묘의 대목(rootstock)에 접목(grafting)하는 방법을 말하는 것으로, 미세접목의 기술이 필요하고 생존율이 낮은 단점이 있다.
뿐만 아니라, 상기 생장점 배양, 캘러스 배양, 및 기내접목법 모두 기외 식물체에서 채취한 생장점을 이용하므로, 식물체 내 생육억제물질(예를 들어, ABA, penolic compound)의 농도는 낮고 생육촉진물질(예를 들어, 지베렐린, 오옥신, 사이토킨닌)의 함량이 높은 시기인 봄철에 생장점을 채취해야만 생존율이 높다는 생장점 채취시기상 한계가 있다.
그러므로 생장점 배양법에 따라 식물체를 생산하되, 종래 생장점 배양법의 단점들을 해소하고 바이러스 무병주 식물체를 생산하는 방법을 개발할 필요성이 대두되고 있다.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 계절적인 제한 없이 생장점을 채취할 수 있으며 오염율은 낮고 식물체 생존율은 높은 바이러스 무병주 식물체를 생산하는 방법 및 이러한 방법에 사용하기 위한 배지를 제공하는데 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
일 양태로 본 발명은 기외(ex vitro)에서 식물체의 경정을 절취 후 소독하는 단계, 및 상기 소독한 경정을 기내에서 조직배양하는 단계를 포함하는 생장점 배양을 위한 생장점 채취용 기내 식물체 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 생장점 배양에 의해 식물체를 생산함에 있어서, 기외 식물체에서 생장점을 채취함에 따라 생기는 여러 문제점, 즉 낮은 식물체 생존율, 높은 진균 및 세균 오염율, 생장점 절취 시기의 제한, 및 생장점 소독 과정의 어려움 등을 해소하기 위해, 생장점 배양을 위한 생장점 채취용으로 기내 조직배양에 의해 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법을 각 단계별로 설명하면,
(S1) 기외(ex vitro)에서 식물체의 경정을 절취 후 소독하는 단계
절취하는 경정의 길이는 본 기술분야에 속하는 통상의 기술자라면 절취 부위, 배양시기 및 식물체의 종류 등을 고려하여 적절히 조절할 수 있다. 사과목 또는 배목 경정의 경우 5-10 mm 길이로 절취할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 절취하는 시기는 식물체 내 생육억제물질(예를 들어, ABA, penolic compound)의 농도는 낮고 생육촉진물질(예를 들어, 지베렐린, 오옥신, 사이토킨닌)의 함량이 높은 시기인 봄철이 바람직하다.
아울러, 상기 절취된 경정을 소독한다. 상기 소독은 당업계 공지된 다양한 방법에 의해 이뤄질 수 있으며, 예를 들어 멸균수로 세척 또는 살균제로 세척하는 방법을 통해 이뤄질 수 있으며, 상기 살균제에는 전착제를 추가로 포함시킬 수 있다. 상기 살균제로는 차아염소산나트륨(NaOCl) 또는 차아염소산칼슘{Ca(ClO)2} 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
(S2) 소독한 경정을 기내에서 조직배양하는 단계
본 발명에 따른 명세서에 있어서, 용어 "조직배양"이란 조직을 배양하여 모주와 동일한 유전형질을 가진 완전한 식물체로 증식시키는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 명세서에 있어서, 용어 "기내(in vitro) 배양"이란 식물체를 멸균된 용기내에서 배양하는 것을 의미하고, "기내 식물체"란 기내 배양에 의해 배양된 식물체를 의미한다. 따라서 기내에서 식물체를 조직배양 하기 위해서는 이에 적합한 배지가 필요하다.
생장조절물질이 첨가된 MS 배지에서 조직배양하는 것이 바람직하며, 생장조절물질 중 BA 및 IBA를 첨가하는 것이 바람직하다. 상기 BA 및 IBA는 식물 성장호르몬으로 종류에 따라 식물 생장반응에 현저한 차이를 유도하는 물질이다.
배목의 경우 바람직하게 BA 1 - 5 mg/L, IBA 0.2 - 1 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 15 - 30 g/L 를 포함한 MS 배지에서 조직배양할 수 있으며, 가장 바람직하게는 BA 2 - 3 mg/L, IBA 0.5mg/L 및 수크로오스(sucrose) 30g/L 를 포함한 MS 배지에서 조직배양한다. BA 1 mg/L 미만, IBA 0.2 mg/L 미만, 또는 수크로오스 15 g/L 미만으로 첨가할 경우 증식이 둔화되는 문제점이 있고, BA 5 mg/L 초과, IBA 1 mg/L 초과, 또는 수크로오스 30 g/L 초과로 첨가할 경우 불량 신초의 출현과 같은 문제점이 있다.
아울러, 사과목의 경우 바람직하게 BA 0.5 - 2 mg/L, IBA 0.2 - 1 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 15 - 30 g/L 를 포함한 MS 배지에서 조직배양할 수 있으며, 가장 바람직하게는 BA 1 mg/L, IBA 0.5mg/L 및 수크로오스(sucrose) 30g/L 를 포함한 MS 배지에서 조직배양한다. BA 0.5 mg/L 미만, IBA 0.2 mg/L 미만, 또는 수크로오스 15 g/L 미만으로 첨가할 경우 증식이 둔화되는 문제점이 있고, BA 2 mg/L 초과, IBA 1 mg/L 초과, 또는 수크로오스 30 g/L 초과로 첨가할 경우 불량 신초의 출현과 같은 문제점이 있다.
본 발명에 따른 기내 배양시 온도, 배양시간 및 조도는 본 기술분야에 속하는 통상의 기술자라면 적절히 조절할 수 있을 것이나, 예를 들어 배목 또는 사과목의 경우 25 ± 1 ℃, 명조건(3,000lux, 16시간 일장)에서 8주 이상 기내 배양할 수 있고, 다만 이에 제한되지 않는다.
또한, 다른 양태로 상기 생산방법에 따라 생산된 기내 식물체에서 생장점을 채취하는 단계, 및 상기 채취한 생장점을 소독 과정없이 기내 배양하는 단계를 포함하는 바이러스 무병주 식물체 생산방법을 제공한다.
상기 방법을 각 단계별로 설명하면,
(S1) 상기 생산방법에 따라 생산된 기내 식물체에서 생장점을 채취하는 단계
상기 생산방법에 따라 생산된 기내 식물체는 기내배양되므로, 생장점 채취에 적절한 환경, 예를 들어 배지 내에 인위적으로 생장조절물질을 첨가하여 식물체 증식을 촉진하는 상태로 생육환경을 조절할 수 있고, 곰팡이, 세균 등으로 오염되지 않은 무균 상태를 유지시킬 수 있다. 설사, 기내 식물체 중 오염된 식물체가 포함되어 있다고 할지라도 병징 관찰을 통해 오염된 기내 식물체는 용이하게 제거 가능하며, 오염되지 않은 기내 식물체를 대상으로 본 발명을 실시할 수 있다. 또한, 생장점 채취용 기내 식물체를 확보하고 있으므로, 필요시마다 언제든 기내 식물체의 다양한 조직으로부터 생장점을 채취할 수 있고 생장점 채취 후에도 동일한 기내 식물체로부터 생장점 채취가 반복적으로 가능하다. 이에 반해, 기외 식물체로부터 생장점을 채취하는 방법에 따르면, 오염 확률이 높고, 생장점 채취해 생장한 식물체가 오염된 경우 생장점 채취 과정부터 전 과정을 다시 반복해야하여 비경제적일 뿐만 아니라, 기외 식물체에서의 생장점 채취는 1회성으로 그친다는 문제가 있어, 본 발명과 구별된다.
생장점을 채취하는 방법에는 기내 식물체로부터 직접 생장점을 분리하는 방법 또는 생장점 포함 조직을 절취 후 생장점을 분리하는 방법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게 엽원기가 2매까지 포함해 생장점을 분리하는 방법을 이용할 수 있다. 아울러, 생장점 채취시기에도 제한이 없으며, 연중 가능하다.
(S2) 상기 채취한 생장점을 소독과정 없이 기내 배양하는 단계
생장점을 기내 식물체로부터 채취하였기 때문에 별도의 소독과정 없이 생장점을 곧 바로 배양할 수 있다.
생장점 배양을 위해 당업계 공지된 다양한 방법 및 조건으로 생장점을 배양할 수 있으며, 증식과정(신초 형성과정 내지 다신초 형성과정) 및 발근과정을 거칠 수 있다.
증식 및 발근을 위해서는 배지조성이 중요한데, 생장조절물질이 첨가된 MS 배지에서 증식 및 발근시키는 것이 바람직하며, 증식에는 생장조절물질 중 BA 및 IBA를 첨가하는 것이 바람직하고, 발근에는 IBA만 첨가하는 것이 바람직하다.
생장은 배목의 경우 바람직하게 BA 1 - 5 mg/L, IBA 0.2 - 1 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 15 - 30 g/L 를 포함한 MS 배지에서 증식시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 BA 2 - 3 mg/L, IBA 0.5mg/L 및 수크로오스(sucrose) 30g/L 를 포함한 MS 배지에서 증식한다. BA 1 mg/L 미만, IBA 0.2 mg/L 미만, 또는 수크로오스 15 g/L 미만으로 첨가할 경우 증식이 둔화되는 문제점이 있고, BA 5 mg/L 초과, IBA 1 mg/L 초과, 또는 수크로오스 30 g/L 초과로 첨가할 경우 불량 신초의 출현과 같은 문제점이 있고, 특히 초과 수크로오스 첨가로 인해 역삼투 현상, 또는 투명화 발생에 의해 신초가 이상비대하거나 신장하지 못하는 문제점이 있다.
아울러, 사과목의 경우 바람직하게 BA 0.5 - 2 mg/L, IBA 0.2 - 1 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 15 - 30 g/L 를 포함한 MS 배지에서 증식시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 BA 1 mg/L, IBA 0.5mg/L 및 수크로오스(sucrose) 30g/L 를 포함한 MS 배지에서 증식한다. BA 0.5 mg/L 미만, IBA 0.2 mg/L 미만, 또는 수크로오스 15 g/L 미만으로 첨가할 경우 증식이 둔화되는 문제점이 있고, BA 2 mg/L 초과, IBA 1 mg/L 초과, 또는 수크로오스 30 g/L 초과로 첨가할 경우 불량 신초의 출현과 같은 문제점이 있고, 특히 초과 수크로오스 과다첨가로 인해 역삼투 현상, 또는 투명화 발생으로 신초가 이상비대하거나 신장하지 못하는 문제점이 있다.
아울러, 발근은 배목의 경우 바람직하게 IBA 1 - 5 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 7.5 - 30 g/L 를 포함한 1/4 -1/2 MS 배지에서 발근시킬 수 있으며, 더욱 바람직하게, IBA 2-5 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 7.5-15g/L 를 포함한 1/4MS 배지에서 발근시킬 수 있다. 가장 바람직하게, IBA 2 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 15g/L 를 포함한 1/4MS 배지에서 발근시킬 수 있다. 1/4배 미만의 염류 함유한 MS 배지, 또는 수크로오스 7.5 g/L 미만으로 첨가할 경우 발근이 둔화되는 문제점이 있고, 1/2배 초과의 염류 함유한 MS 배지 또는 수크로오스 30 g/L 초과로 첨가할 경우 발근이 불량하고 캘러스가 출현하는 문제점이 있다.
또한, 사과목의 경우 바람직하게 IBA 0.5 - 5 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 7.5 - 30 g/L 를 포함한 1/4 -1/2 MS 배지에서 발근시킬 수 있으며, 더욱 바람직하게, IBA 0.5-2 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 7.5-15g/L 를 포함한 1/4MS 배지에서 발근시킬 수 있다. 가장 바람직하게, IBA 1 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 15g/L 를 포함한 1/4MS 배지에서 발근시킬 수 있다. 1/4배 미만의 염류 함유한 MS 배지, 또는 수크로오스 7.5 g/L 미만으로 첨가할 경우 발근이 둔화되는 문제점이 있고, 1/2배 초과의 염류 함유한 MS 배지 또는 수크로오스 30 g/L 초과로 첨가할 경우 발근이 불량하고 캘러스가 출현하는 문제점이 있다.
또한, 추가로 바이러스 검정을 통해 바이러스 이병주를 제거하는 단계를 거칠 수도 있다. 바이러스 검정은 당업계 공지된 다양한 방법에 따라 수행될 수 있으며, 지표식물에 의한 검정, 혈청학적 검정, 또는 Multiplex RT-PCR 방법이 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법에 따르면, 바이러스 무병주 식물체를 생산할 수 있으며, 본 발명에 따른 명세서에 있어서, 용어 "바이러스"는 식물체에 감염되어 증식될 가능성이 있는 바이러스를 모두 포함하며 야생형은 물론 변종도 포함한다. 또한, 상기 용어 "바이러스 무병주"는 상기 바이러스와 함께, 바이로이드, 마이코플라스마 유사체, 세균, 또는 진균에 오염되지 않은 식물체를 말한다.
본 발명에 따르면, 계절적인 제한 없이 생장점을 채취할 수 있고 바이러스 오염율은 낮고 생존율은 높은 식물체를 대량생산할 수 있어, 우량품종을 원활하게 보급할 수 있으므로 농가 소득증대에 기여할 수 있으며 생산품의 품질향상에 의한 국제 경쟁력 제고로 우수품종의 수출이 가능할 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 생장점 배양을 위한 생장점 채취용 기내 식물체 생산 및 이에 사용되는 배지
먼저, 배 및 사과목 가지의 경정을 절취하여 흐르는 물로 24시간 동안 수세하여 붙어있는 흙과 이물질을 모두 제거하였다. 그 다음, 70% 에탄올에 30 ~ 60 초간 침지하여 표면소독한 후, Tween 20이 함유된 3% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 15분간 침지하여 소독하고 멸균수로 3회 세척하였다. 소독 과정을 거친 경정을 하기 표 1의 조성의 증식배지에 접종하여 25 ± 1 ℃, 명조건(3,000lux, 16시간 일장)으로 기내배양하여 증식시켰다.
과수 배지
사과 MS 배지 + BA 1.0 mg/L + IBA 0.5mg/L + 수크로오스(sucrose) 30g/L
배 MS 배지 + BA 2.0 - 3.0 mg/L + IBA 0.5mg/L + 수크로오스(sucrose) 30g/L
< 실험예 1> BA 및 IBA 농도에 따른 증식율 비교
생장점 채취용으로 기내 식물체를 제작하기 위해서는 배지의 조성, 특히 생장조절물질의 농도가 매우 중요한 요소이므로, BA 및 IBA의 농도에 따른 증식율 비교 실험을 수행하였다.
하기 표 2는 사과 대목 M9 신초의 증식에 미치는 BA의 영향을 비교한 것으로, BA 1.0 mg/L 일때 신초수 및 생체중/절편체 값에서 가장 우수한 결과를 나타내며 이보다 낮은 농도는 물론이고 높은 농도에서도 BA는 신초증식에 악영향을 미침을 확인할 수 있었다.
처 리
(mg/L)		 신초수
(개)		 신초길이
(cm)		 생체중(mg)
/절편체		 Callus
BA 0.0 1.2 5.3 212
0.5 3.3 4.7 386 -
1.0 4.4 3.6 494 -
2.0 3.1 3.4 435 -
3.0 2.7 2.7 467 +
5.0 2.4 2.4 489 ++
* 배지는 MS + sucrose 30 g/L가 첨가된 배지 사용
* Callus - : 없음, + : 적음, ++ : 보통
하기 표 3은 사과 대목 M9 신초의 증식에 미치는 IBA 및 BA의 영향을 비교한 것으로, BA 1.0 mg/L 이면서 특히 IBA의 농도가 0.5mg/L일때 신초수, 신초길이 및 생체중/절편체 값에서 가장 우수한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
처 리
(mg/L)		 신초수
(개)		 신초길이
(cm)		 생체중(mg)
/절편체		 Callus
Control 1.1 5.6 257 -
BA 0.5 + IBA 0.2 4.0 4.7 436 -
BA 0.5 + IBA 0.5 4.3 4.1 435 -
BA 0.5 + IBA 1.0 3.7 3.8 460 -
BA 1.0 + IBA 0.2 5.3 4.0 494 -
BA 1.0 + IBA 0.5 6.1 4.2 540 -
BA 1.0 + IBA 1.0 4.9 3.8 524 -
BA 2.0 + IBA 0.2 4.1 3.4 485 -
BA 2.0 + IBA 0.5 4.8 3.3 477 -
BA 2.0 + IBA 1.0 4.4 2.9 498 -
* 배지는 MS + sucrose 30 g/L가 첨가된 배지 사용
* Callus - : 없음
하기 표 4는 배대목 “배연 3호” 신초의 증식에 미치는 BA의 영향을 비교한 것으로, BA 2.0 - 3.0 mg/L 일때 신초수 및 생체중/절편체 값에서 가장 우수한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
처 리
(mg/L) 		신초수
(개)		 신초길이
(cm)		 생체중(mg)
/절편체		 Callus
BA 0.0 1.0 5.1 154 -
0.5 2.3 4.3 268 -
1.0 3.2 3.4 249 -
2.0 4.3 3.7 354 -
3.0 4.0 3.2 317 -
5.0 3.1 2.7 263 +
* 배지는 MS + sucrose 30 g/L가 첨가된 배지 사용
* Callus - : 없음, + : 적음
하기 표 5는 배대목 “배연 3호”의 증식에 미치는 IBA 및 BA의 영향을 비교한 것으로, BA 2.0 - 3.0mg/L 이면서 특히 IBA의 농도가 0.5mg/L일때 신초수, 신초길이 및 생체중/절편체 값에서 가장 우수한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
처 리
(mg/L)		 신초수
(개)		 신초길이
(cm)		 생체중(mg)
/절편체
Control 1.0 4.6 165
BA 1.0 + IBA 0.2 3.4 3.4 276
BA 1.0 + IBA 0.5 4.0 3.1 254
BA 1.0 + IBA 1.0 4.7 2.3 260
BA 2.0 + IBA 0.2 6.2 3.5 332
BA 2.0 + IBA 0.5 6.8 3.1 354
BA 2.0 + IBA 1.0 6.1 3.2 346
BA 3.0 + IBA 0.2 5.5 3.4 309
BA 3.0 + IBA 0.5 6.1 3.6 321
BA 3.0 + IBA 1.0 4.9 2.8 329
* 배지는 MS + sucrose 30 g/L가 첨가된 배지 사용
< 실시예 2> 기내 식물체로부터 채취한 생장점을 배양해 바이러스 무병주 식물체 생산
상기 실시예 1의 방법으로 생산한 기내 식물체인, 배 및 사과목에서 신초를 절취하고 상기 재료로부터 별도의 소독 과정을 거치지 않고, 곧바로 클린벤치(무균작업대)로 옮겨 수술용 칼과 핀셋을 이용해 생장점을 적출하였다. 적출한 생장점을 수크로오스 30g/L과 식물 생장조절물질(BA, IBA)이 각각 단독 혹은 혼합 첨가된 MS(Murashige and Skoog) 배지가 담긴 멸균된 시험관(지름 24 ㎜, 높이 150 ㎜)에 치상하였고 25 ± 1 ℃로 유지되는 배양실에서 명조건(3,000lux, 16시간 일장)으로 8 주 동안 배양하였다.
상기 배양 중인 배 및 사과목마다 확인인식(라벨)표를 부착한 후 검정을 위한 잎 조직 일부를 채취하며, 동일 모본에 대하여 착즙을 하여 즙액을 채취하였다. 바이러스 검정은 농업실용화재단 분석검정팀에 의뢰하여 Multiplex RT-PCR에 따라 실시하였으며, 그 결과, 이병주는 제거하고 남은 개체만 유지하였다.
< 실험예 2> 식물체의 바이러스 오염율 및 생존율 비교
종래 생장점 배양에 따른 식물체 생산방법과 상기 실시예 1 및 2에 따른 식물체 생산방법 간의 식물체 곰팡이 및 세균 오염율 및 생존율을 비교하기 위해 하기와 같은 실험을 실시하였다.
실험에 이용된 A 방법은 기외 식물체의 경정을 소독하여 생장점을 채취한 후, 실시예 2의 방법에 따라 증식시키는 것이고, 이에 대조되는 B 방법은 실시예 1의 방법에 따라 기외 식물체에서 채취한 경정을 소독한 후, 기내에서 조직배양을 하여 증식시킨 기내 식물체의 신초에서 생장점을 분리하여 소독 없이 배양을 실시예 2의 방법에 따라 증식시켰다.
상기 A 방법은 4~5월에 배 및 사과목 가지의 경정을 절취하고 흐르는 물로 24시간 동안 수세하여 붙어있는 흙과 이물질을 모두 제거하였다. 그 다음, 70% 에탄올에 30 ~ 60 초간 침지하여 표면 소독한 후, Tween 20이 함유된 3% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 15분간 침지하여 소독하고 멸균수로 3회 세척하였다. 소독 과정을 거친 경정을 클린벤치(무균작업대)로 옮겨 수술용 칼과 핀셋을 이용해 생장점을 적출하고 실시예 2의 방법에 따라 배양하였다. 상기 B 방법은 실시예 1 및 2의 방법을 그대로 이용하였다.
하기 표 6에 배양 8주 후, 사과 M9 대목과 배대목 “배연3호”의 생장점 방법에 따른 생장점 생존율 및 식물체 생육 결과를 기재하였다.
A 방법에 따라 배양한 식물체의 경우 B 방법에 따라 배양한 식물체에 비해, 하기 표 6에서 보는 바와 같이 생존율은 낮고, 바이러스, 곰팡이 및 세균 오염율은 높음을 알 수 있었다.
A 방법에 따르면 생장점 배양 바로 전에 소독과정을 거치므로 소독액이 생장점에 침착될 가능성이 높고, 본 방법에 따른 생장점은 기외 식물체에서 분리한 것이므로 기외 식물체 내에 축적된 생육억제물질이 유출되어, 식물체의 고사율이 높은 것으로 생각되었다. 이에 반해, B 방법에 따르면 경정배양 전에 소독과정을 거칠 뿐 기내 식물체에서 생장점을 분리할 때에는 소독과정을 거치지 않음으로써 소독액이 생장점에 침착될 가능성이 없으며, 주변환경을 무균 상태로 조절 가능해 높은 생존율을 나타냈다. 하기 표 6에서 보는 바와 같이, B 방법은 A 방법에 비해 그 생존율이 사과의 경우 무려 약 50% 정도 높았고, 배의 경우에도 40% 정도 높은 등 현격한 차이가 있었다.
또한, 표 6에 따르면, B 방법은 높은 생존율 뿐만 아니라 생존한 식물체들을 비교하여도 A 방법에 따른 식물체에 비해 신초수 및 신초의 길이 모두에서 우수한 결과를 나타냈는바, 식물체 대량증식 면에서도 현저한 효과가 있음을 알 수 있었다.
또한, A 방법에 따르면 생장점의 소독과정에서 100% 곰팡이 및 세균 제거가 어려워 오염율이 높았으며, 생장점의 크기가 작으면 작을수록 바이러스 제거 가능성은 높아지나 배양이 어려워지는 난점이 있었다. 이에 반해, B 방법에 따르면 경정배양 전에 소독과정을 거칠 뿐 기내 식물체에서 생장점을 분리할 때에는 소독과정을 거치지 않음으로써 소독액이 생장점에 침착될 가능성이 없고, 기내 식물체를 이용하므로 주변 환경조절이 가능해 무균상태 유지가 가능하여 곰팡이 및 세균 오염율이 낮았다. 하기 표 6에서 보는 바와 같이, B 방법으로 배양된 사과 및 배에서의 오염율이 0%인바, 20% 정도 오염율을 보이는 A 방법에 비해 현저한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, A 방법에 따르면 기외 식물체에서 생장점을 채취하는데, 기외 식물체의 경우 식물체 내 생육억제물질(예를 들어, ABA, penolic compound)의 농도는 낮고 생육촉진물질(예를 들어, 지베렐린)의 함량이 높은 시기인 봄철에만 생장점을 채취할 수 있다는 시기상의 제한이 있었다. 이에 반해, B 방법에 따르면 적절히 조절된 환경에서 배양된 기내 식물체에서 생장점을 채취하므로 생장점 채취상 시기의 제한이 없었다.
생장점 배양 작물 생존율
(%)		 오염율
(%)		 신초수
(개)		 신초길이
(cm)
A방법
(외부 식물체 이용)		 사과 45.8 25.0 4.4 2.7
배 55.3 22.5 3.6 2.2
B방법
(조직배양식물체 이용)		 사과 92.5 0 4.7 2.6
배 95.0 0 3.4 2.4
< 실시예 3> 바이러스 무병주 식물체의 대량증식 및 이에 사용되는 배지
상기 실시예 2에 따른 바이러스 무병주 식물체를 상기 표 1의 조성의 증식배지가 담긴 배양병(지름 81 ㎜, 높이 132 ㎜)으로 옮겨 25 ± 1 ℃, 명조건(3,000lux, 16시간 일장)에서 8 주 동안 증식시키고, 4 - 5주 간격으로 계대배양을 하였다. 이어서, 토양 순화 전 뿌리를 형성시키기 위해 하기 표 7의 발근배지로 옮겨 또다시 25 ± 1 ℃, 명조건(3,000 lux, 16시간 일장)으로 계대배양하였다. 이 단계에서 공기구멍(air hole)이 있는 배양병 마개를 사용하였고, 공기구멍을 Millipore tape로 막아 멸균상태를 유지하며 외부공기가 순화되도록 하였다.
과수 배지
사과 1/4MS 배지 + IBA 1.0 mg/L + 수크로오스(sucrose) 15g/L
배 1/4MS 배지 + IBA 2.0 mg/L + 수크로오스(sucrose) 15 g/L
그 결과, 1-2 개월 후부터 뿌리가 유도되고 완전한 식물체가 형성되었으며, 이러한 배지조건에서 사과 및 배목 모두 바이러스 무병주를 대량증식할 수 있음을 확인할 수 있었다.
< 실험예 3> MS 배지 염류 농도 및 수크로오스 농도에 따른 발근율 비교
기내발근은 어렵기 때문에 바이러스 무병주 식물체를 대량증식하기 위해서는 발근율이 중요한 요소이므로, MS 배지 염류 농도, 수크로오스, BA, 및 IBA 농도에 따른 발근율 비교 실험을 수행하였다.
하기 표 8은 사과 대목 M9 신초의 발근율을 비교한 것으로, MS 배지의 염류농도가 1/2배 이하이면서 수크로오스 농도는 15 g/L, 7.5 g/L일 때 발근상태가 우수함을 알 수 있었고, 15 g/L 수크로오스를 포함한 1/4 MS 배지에서 가장 우수한 발근율을 보였다. 모든 경우에 IBA 1.0 mg/L를 첨가하였다.
수크로오스 농도 MS 염류 농도: 1배 MS 염류 농도:1/2배 MS 염류 농도:1/4배
30 g/L - - +
15 g/L - ++ +++
7.5 g/L + ++ ++
* 발근상태
-: 아주불량, + : 불량, ++ : 보통, +++ : 양호
하기 표 9는 배양 6주 후 사과 대목 M9 신초의 발근에 미치는 IBA의 영향을 비교한 것으로, IBA 1.0mg/L 일 때 발근율 및 뿌리수에서 가장 우수한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
처 리
(mg/L) 		발근율
(%)		 신초수
(개)		 뿌리수
(개)		 뿌리길이
(cm)		 생체중(mg)
/절편체
IBA 0.0 0 1.0 0 0 137
0.5 46.7 1.1 2.4 4.7 231
1.0 57.8 1.2 7.3 5.6 249
2.0 43.5 1.0 4.2 6.4 253
3.0 37.3 1.0 3.4 4.3 267
5.0 23.4 1.2 1.8 4.7 289
* 배지는 1/2 MS + sucrose 30 g/L가 첨가된 배지 사용
하기 표 10은 배양 6주 후 사과 대목 M9 신초의 발근에 미치는 수크로오스의 영향을 비교한 것으로, 수크로오스 15.0 g/L 일 때 발근율, 뿌리수, 및 뿌리길이에서 가장 우수한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
Sucrose
(g/L)		 발근율
(%)		 신초수
(개)		 뿌리수
(개)		 뿌리길이
(cm)		 생체중(mg)
/절편체
7.5 58.7 1.0 6.4 5.7 265
15.0 72.3 1.1 7.6 7.6 245
30.0 33.5 1.1 6.2 7.3 232
* 배지는 1/2 MS + IBA 1.0 mg/L가 첨가된 배지 사용
하기 표 11은 배양 6주 후 사과 대목 M9 신초의 발근에 미치는 MS배지 염류농도의 영향을 비교한 것으로, 1/4 배지에서 발근할 때 뿌리수가 가장 많은 등 가장 우수한 발근율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
MS 염류 발근율
(%)		 신초수
(개)		 뿌리수
(개)		 뿌리길이
(cm)		 생체중(mg)
/절편체
1 x 63.6 1.0 5.4 4.9 278
1/2 x 67.7 1.0 6.3 5.4 263
1/4 x 85.2 1.0 5.6 5.7 224
* 배지는 Sucrose 15 g/L + IBA 1.0 mg/L가 첨가된 배지 사용
또한, 하기 표 12는 배 대목 "배연 3호" 신초의 발근율을 비교한 것으로, MS 배지의 염류농도가 1/2배 이하이면서 수크로오스 농도는 15 g/L, 7.5 g/L일 때 발근상태가 우수함을 알 수 있었고, 특히, 15 g/L 수크로오스를 포함한 1/4 MS 배지에서 가장 우수한 발근율을 보였다. 모든 경우에 IBA 2.0 mg/L를 첨가하였다.
수크로오스 농도 MS 염류 농도
1배		 MS 염류 농도
1/2배		 MS 염류 농도
1/4배
30 g/L - - +
15 g/L - ++ +++
7.5 g/L + ++ ++
* 발근상태
-: 아주불량, + : 불량, ++ : 보통, +++ : 양호
하기 표 13은 배양 6주 후 배 대목 "배연 3호" 신초의 발근에 미치는 IBA 농도의 영향을 비교한 것으로, 2.0 mg/L에서 발근할 때 뿌리수가 가장 많고 뿌리길이도 가장 긴 등 가장 우수한 발근율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
처 리
(mg/L) 		발근율
(%)		 신초수
(개)		 뿌리수
(개)		 뿌리길이
(cm)		 생체중(mg)
/절편체
IBA 0.0 0 1.0 0 0 89
0.5 7.3 1.2 0.7 4.9 245
1.0 15.8 1.0 1.8 5.2 269
2.0 53.6 1.0 3.4 5.6 293
3.0 45.0 1.0 2.2 3.5 284
5.0 36.7 1.1 1.9 3.4 207
* 배지는 1/2 MS + sucrose 30 g/L가 첨가된 배지 사용
하기 표 14는 배양 6주 후 배 대목 "배연 3호" 신초의 발근에 미치는 수크로오스 농도의 영향을 비교한 것으로, 15 g/L에서 발근할 때 뿌리수가 가장 많고 뿌리길이도 가장 긴 등 가장 우수한 발근율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
Sucrose
(g/L)		 발근율
(%)		 신초수
(개)		 뿌리수
(개)		 뿌리길이
(cm)		 생체중(mg)
/절편체
7.5 65.3 1.0 3.6 5.5 246
15.0 75.6 1.0 4.7 6.3 294
30.0 50.1 1.0 3.2 6.1 224
* 배지는 1/2 MS + IBA 2.0 mg/L가 첨가된 배지 사용
하기 표 15는 배양 6주 후 배 대목 "배연 3호" 신초의 발근에 미치는 MS배지 염류농도의 영향을 비교한 것으로, 1/4 배지에서 발근할 때 뿌리수가 가장 많은 등 가장 우수한 발근율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
MS 염류 발근율
(%)		 신초수
(개)		 뿌리수
(개)		 뿌리길이
(cm)		 생체중(mg)
/절편체
1 x 60.7 1.0 3.4 5.8 267
1/2 x 73.4 1.0 5.6 5.3 236
1/4 x 87.6 1.0 5.2 5.8 207
* 배지는 Sucrose 15 g/L + IBA 2.0 mg/L가 첨가된 배지 사용

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 기외(ex vitro)에서 식물체의 경정을 절취 후 소독하는 단계, 상기 소독한 경정을 기내에서 조직배양하여 생장점 배양을 위한 생장점 채취용 기내 식물체를 생산하는 단계, 생산된 기내 식물체에서 계절적인 제한 없이 생장점을 수득하는 단계, 및 상기 수득한 생장점을 소독 과정없이 기내 배양하는 단계를 포함하여,
    곰팡이 또는 세균에 오염되지 않은 것을 특징으로 하는 바이러스 무병주 식물체의 생산방법.
  6. 제5항에 있어서, 바이러스 검정을 통해 바이러스 이병주를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 생산방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 식물체는 사과 또는 배목인 것을 특징으로 하는 생산방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 식물체가 사과목인 경우 사과목인 경우 BA 0.5 - 2 mg/L, IBA 0.2 - 1 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 15 - 30g/L 를 포함한 MS 배지에서 배양하여 증식시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 식물체가 사과목인 경우 IBA 0.5 - 5 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 7.5 - 30 g/L 를 포함한 1/4 -1/2 MS 배지에서 발근시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 식물체가 배목인 경우 BA 1 - 5 mg/L, IBA 0.2 - 1 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 15 - 30g/L 를 포함한 MS 배지에서 배양하여 증식시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  11. 제5항에 있어서, 상기 식물체가 배목인 경우 IBA 1 - 5 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 7.5 - 30 g/L 를 포함한 1/4 -1/2 MS 배지에서 발근시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  12. 제5항에 있어서, 상기 생장점 채취용 기내 식물체를 생산하기 위하여, 상기 식물체가 사과목인 경우 BA 0.5 - 2 mg/L, IBA 0.2 - 1 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 15 - 30g/L 를 포함한 MS 배지에서 조직배양하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  13. 제5항에 있어서, 상기 생장점 채취용 기내 식물체를 생산하기 위하여, 상기 식물체가 배목인 경우 벤질아데닌(BA) 1 - 5 mg/L, 인돌-2-부티릭산(IBA) 0.2 - 1 mg/L 및 수크로오스(sucrose) 15 - 30g/L 를 포함한 MS 배지에서 조직배양하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  14. 제5항에 있어서, 상기 경정의 길이는 5-10 mm인 것을 특징으로 하는 생산방법.
  15. 삭제
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