CN105766584B - 一种获取砀山酥梨外植体及提高组培苗成活率的方法 - Google Patents

一种获取砀山酥梨外植体及提高组培苗成活率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种砀山酥梨外植体及提高组培苗成活率的方法，选择田间生长健壮、芽体饱满无病虫害的一年生中庸枝，通过人工培养获得5㎝‑10㎝的“新稍”，将其作为组培的外植体，然后再将该外植体经消毒及预处理、诱导培养、增殖分化培养、接穗培养和嫁接等步骤获得砀山酥梨种苗。本发明方法简单，充分利用冬季修剪去除的将丢弃的枝条。通过本发明人工方式获得大量“新稍”，提供组培所需足够的外植体，可进行砀山酥梨工厂化快速繁殖脱毒的优良种苗；且本发明组培方法成活率达96％。

Description

一种获取砀山酥梨外植体及提高组培苗成活率的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种梨组织培养的外植体获取及提高组培苗成活率的组培方法，具体说是在10月-翌年2月获取砀山酥梨外植体及提高砀山酥梨组培苗成活率的方法。
背景技术
砀山酥梨原产安徽省砀山县，至今有2000多年的历史。砀山酥梨耐盐碱、耐瘠薄、耐贮藏、酥脆多汁等等综合性状优良，至今无其他品种替代。目前，仅砀山酥梨这一个品种的栽培面积仍占全国梨生产总面积20％以上，但在长期的无性繁殖过程中，感染并积累了多种病毒，严重影响梨果的产量和质量；随着分子生物学领域技术迅猛发展，利用基因工程进行种质改良研究也进一步深入。无论是种苗脱毒纯化或利用基因工程进行种质改良研究等，都需要进行大量的砀山酥梨组织培养，而外植体的选择是组织培养的第一步，选材的部位、时期等都会影响到外植体的成活率。梨的组织培养分为茎尖培养、茎段培养、胚培养、花药培养和叶片培养，考虑到成活率、取材是否容易以及生产成本等诸多因素，目前在梨的组织培养中应用比较广泛的是采取旺盛生长的新梢作为外植体，取其茎尖作接种材料培养，由于此期外植体的酚类物质积累较少，多酚氧化酶活性弱，外植体不容易褐化，成活率最高。
砀山酥梨是落叶果树，具有符合自身特性的品种物候期，其新梢旺盛生长期一般在4月上旬至5月上旬，到6月中旬基本停止生长，进入10月份以后，砀山酥梨叶柄开始形成离层而开始脱落，已经没有新萌发的新稍。因此，在生产上或实验室所需组培，一般只能在每年的4月上旬至5月上旬能获得大量优良外植体，满足当季组培需要。而砀山酥梨在组培时增殖倍数较低，一般不超过3倍，并且最多继代培养6代，否则影响其生长势和成活率。也因此，无论利用基因工程进行种质改良研究或砀山酥梨规模化种苗繁殖等，不能周年提供足够的组培苗严然已成为产业发展的瓶颈。
本项目组经10余年反复试验研究，终于获得一种方法，能在10月-翌年2月份获得大量的组培外植体，获得当期充足的组培苗，并能充分利用冬季修剪去除的将丢弃的枝条，操作简单，并且能提高砀山酥梨组培苗成活率。
发明内容
本发明的目的是提供一种在10月-翌年2月通过人工培养获取砀山酥梨外植体的方法以及基于该外植体提高砀山酥梨组培苗成活率的组培方法。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
在10-12月份获得砀山酥梨组培外值体的方法，其特点在于，
S1、在10-12月份，选择田间生长健壮、芽体饱满无病虫害的一年生中庸枝，若还存有少部分叶片未脱落的，人工将其上面的叶片剪去，留叶柄；用清水冲洗干净,将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝～2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入温度5℃～7℃环境条件中处理7d～10d，每隔2d换水1次，每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，最后将枝条再冲洗一遍，再用湿沙布包裹待处理；
S2、在翌年元月-2月份，结合冬季梨树修剪，将剪除废弃的枝条拾回，剪成小于60㎝的段，最佳是选取一年生中庸枝，用清水冲洗干净,再用湿沙布包裹待处理。
S3、将S1、S2用湿沙布包裹待处理的枝条置温度－3℃～0℃环境中暗处理45d，取出，再将枝条基部下端呈45℃剪去2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入人工气候箱，人工气候箱设置的培养条件为:昼/夜气温为25℃/16℃，光照强度3000LX，昼/夜时间分配为16h/8h，空气相对湿度80％，隔2d换水1次,每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，直至“新梢”生长5㎝-10㎝时，采集“新梢”作为组培外植体。
本发明同时提供一种在10月-翌年2月提高砀山酥梨组培苗成活率的方法，包括外植体获得与消毒及预处理、诱导培养、生根培养、炼苗和移栽，其特点在于，
所述外植体获得是指：
S1、在10-12月份，选择田间生长健壮、芽体饱满无病虫害的一年生中庸枝，若还存有少部分叶片未脱落的，人工将其上面的叶片剪去，留叶柄；用清水冲洗干净,将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝～2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入温度5℃～7℃环境条件中处理7d～10d，每隔2d换水1次，每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，最后将枝条再冲洗一遍，再用湿沙布包裹待处理；
S2、在翌年元月-2月份，结合冬季梨树修剪，将剪除废弃的枝条拾回，剪成小于60㎝的段，最佳是选取一年生中庸枝，用清水冲洗干净,再用湿沙布包裹待处理；
S3、将S1、S2用湿沙布包裹待处理的枝条置温度－3℃～0℃环境中暗处理45d，取出，再将枝条基部下端呈45℃剪去2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入人工气候箱，人工气候箱设置的培养条件为:昼/夜气温为25℃/16℃，光照强度3000LX，昼/夜时间分配为16h/8h，空气相对湿度80％，隔2d换水1次,每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，直至“新梢”生长5㎝-10㎝时，采集“新梢”作为组培外植体。
作为优选，所述外植体的消毒是指：所述外植体的消毒是指：将外植体用洗衣粉浸泡30min后再用流水冲洗1h，然后先放入6％Vc(W/V)溶液中浸泡15min，并不断振荡，再置于超净工作台上，用75％(V/V)的酒精溶液消毒25s，再用无菌水冲洗3次后用0.1％(V/V)的HgCl2溶液浸泡5～7min，所述的HgCl2溶液每500mL添加有200μL吐温-80，最后用无菌水冲洗3次，进行外植体预处理；所述外植体预处理是指用经灭菌处理过的剪刀将外植体剪成2cm～3cm的小段，每段带有一个腋芽或者顶芽，之后用无菌滤纸吸干附着在表面的水分，等待接入诱导培养基。
作为优选，所述诱导培养是指，将预处理后的外植体形态学下端向下接入诱导培养基上，于25±1℃、光照1500Lx～2500Lx；光照时间为12h～16h/d的条件下培养25d～30d，得到分化出叶片的试管苗；所述诱导培养基配方为MS+1.5～2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.2～0.6％AC+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8～6.0。
作为优选，所述继代增殖分化培养是指将诱导培养得到的分化出芽丛的试管苗在继代培养基中培养，促使腋芽和不定芽的萌生，形成大量芽丛，通过将芽丛分割而达到扩繁的目的，所述继代增殖分化培养基为：MS+1.0～1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA++80mg/L PG。继代增殖分化培养每代最佳间隔时间为28d～35d，最多继代培养6代，否则影响其生长势和成活率。
作为优选，所述接穗培养是指将分化出芽丛的试管苗分割，再逐个芽接入接穗培养基中，于25±1℃、光照1500Lx～2500Lx；光照时间为12h～16h/d的条件下培养30d～35d，使试管苗具有5～7片叶时即可进行嫁接，所述接穗培养基为1/4MS+80mg/L PG+0.5～1.0mg/L IBA+0.3mg/L NAA+0.3mg/L K2H2PO4+0.1mg/L CaCL2。
作为优选，所述嫁接是指：
A，嫁接前炼苗，开瓶，光线由弱渐强，使其试管苗逐渐适应外界环境，然后贴近接穗培养基将试管苗上部全部剪切下来即可作为接穗。
B,嫁接时，将砧木苗从离根茎部3㎝～8㎝处横向切断，再沿着横断面纵切一刀，根据接穗和砧木的粗细可适当调整纵切位置，若接穗和砧木一样粗或接穗粗于砧木，沿着横断面中间纵切一刀，若接穗粗度细于砧木，沿着横断面偏向一侧纵切一刀；然后迅速将接穗楔形部位插入切口，一定要将接穗与砧木一侧韧皮部对齐；最后将接口部位用封口膜缠紧，再用塑料薄膜袋罩上扎严。后期按常规技术管理即可。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在
本发明方法中，首先，在10月-12月份，选择田间生长健壮、芽体饱满无病虫害的一年生中庸枝，若还存有少部分叶片未脱落的，人工将其上面的叶片剪去，留叶柄；用清水冲洗干净,将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝～2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入温度5℃～7℃环境条件中处理7d～10d，每隔2d换水1次，每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，最后将枝条再冲洗一遍，再用湿沙布包裹待处理；或者在翌年元月-2月份，结合冬季梨树修剪，将剪除废弃的枝条拾回，剪成小于60㎝的段，最佳是选取一年生中庸枝，用清水冲洗干净,再用湿沙布包裹待处理。然后将用湿沙布包裹待处理的枝条置温度－3℃～0℃环境中暗处理45d，取出，再将枝条基部下端呈45℃剪去2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入人工气候箱，人工气候箱设置的培养条件为:昼/夜气温为25℃/16℃，光照强度3000LX，昼/夜时间分配为16h/8h，空气相对湿度80％，隔2d换水1次,每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，直至“新梢”生长5㎝-10㎝时，采集“新梢”作为组培外植体。然后再将该外植体经消毒及预处理、诱导培养、增殖分化培养、接穗培养和嫁接等步骤获得砀山酥梨种苗。本发明方法简单，充分利用冬季修剪去除的将丢弃的枝条。通过本发明人工方式获得大量“新稍”，提供组培所需足够的外植体，可进行砀山酥梨工厂化快速繁殖脱毒的优良种苗；且本发明组培方法成活率达96％。
以下通过具体实施方式对本发明技术方案做进一步解释说明。
具体实施方式
MS培养基配方为：每升培养基中含KNO3(1900mg/L)，NH4NO3(1650mg/L)，MgSO4·7H2O(370mg/L)，KH2PO4(170mg/L)，CaCl2(330mg/L)，KI(0.83mg/L)，H3BO3(6.2mg/L)，MnSO4·H2O(16.9mg/L)，ZnSO4·7H2O(8.6mg/L)，CuSO4·5H2O(0.025mg/L)，CoCl2·6H2O(0.025mg/L)，Na2MoO4·2H2O(0.25mg/L)，FeSO4·7H2O(27.85mg/L)，Na2EDTA(37.25mg/L)，甘氨酸(2.0mg/L)，烟酸B3(0.5mg/L)，盐酸硫胺素B1(0.1mg/L)，盐酸吡哆醇B6(0.5mg/L)，肌醇(100mg/L)。
诱导培养基为：MS+1.5～2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.2～0.6％AC+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8～6.0；
继代增殖分化培养为：MS+1.0～1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA++80mg/L PG
接穗培养基为：1/4MS+80mg/L PG+0.5～1.0mg/L IBA+0.3mg/L NAA+0.3mg/LK2H2PO4+0.1mg/L CaCL2。
实施例1
1、外植体获得
2014在10月10日，选择田间生长健壮、芽体饱满无病虫害的一年生中庸枝25支，将枝上存有少部分叶片未脱落的，人工将其上面的叶片剪去，留叶柄；用清水冲洗干净,将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝～2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入温度5℃～7℃环境条件中处理10d，每隔2d换水1次，每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，最后将枝条再冲洗一遍，再用湿沙布包裹待处理；10月20日将以上用湿沙布包裹待处理的枝条置温度－3℃～0℃环境中暗处理45d，12月5日取出，再将枝条基部下端呈45℃剪去2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，放10℃环境中1d，第2d置入人工气候箱，人工气候箱设置的培养条件为:昼/夜气温为25℃/16℃，光照强度3000LX，昼/夜时间分配为16h/8h，空气相对湿度80％，隔2d换水1次,每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝。元月5日采新梢作为外植体；共培养的25枝条全部萌发“新梢”，平均每枝条萌发“新梢”6.3枝，平均长度为7.1㎝。
2.外植体的消毒及预处理：将外植体用洗衣粉浸泡30min后再用流水冲洗1h，然后先放入6％Vc(W/V)溶液中浸泡15min，并不断振荡，再置于超净工作台上，用75％(V/V)的酒精溶液消毒25s，再用无菌水冲洗3次后用0.1％(V/V)的HgCl2溶液浸泡5～7min，所述的HgCl2溶液每500mL添加有200μL吐温-80，最后用无菌水冲洗3次，进行外植体预处理；所述外植体预处理是指用经灭菌处理过的剪刀将外植体剪成2cm～3cm的小段，每段带有一个腋芽或者顶芽，之后用无菌滤纸吸干附着在表面的水分，等待接入诱导培养基。
3.诱导培养：将预处理后的外植体形态学下端向下接入诱导培养基上，于25±1℃、光照1500Lx～2500Lx；光照时间为12h～16h/d的条件下培养30d，得到分化出芽丛的试管苗；接种60瓶，成活率96％。
3.增殖分化培养：2月5日从初代培养的组培苗中，随机选50瓶进行继代增殖分化培养，平均每瓶增殖2.85倍。
4.接穗培养：4月5日将继代增殖分化培养2代的芽丛分割，逐个接入接穗培养基中，于25±1℃、光照1500Lx～2500Lx；光照时间为12h～16h/d的条件下培养32d，使试管苗具有5～7片叶时进行嫁接，所述接穗培养基为：1/4MS+80mg/L PG+0.5～1.0mg/L IBA+0.3mg/L NAA+0.3mg/L K2H2PO4+0.1mg/L CaCL2；共培养100瓶，其中有98株试管苗生长出5～7片叶，长势良好，1株生长不旺，达不到接嫁接穗的要求，1株污染；经接穗培养后的试管苗成活率达98％。
5.嫁接：嫁接前炼苗：5月7日将接穗培养的组培瓶口打开，光线由弱渐强，使其试管苗逐渐适应外界环境，然后贴近接穗培养基将试管苗上部全部剪切下来，并将其基部削成楔形即可作为接穗。
将杜梨种子经过层积处理后，播种于装有消毒过基质的营养钵中，放置于温室中培养，环境条件与接穗培养条件一致；当苗高4cm-10cm时、茎粗达0.2cm时准备嫁接；从离根茎部3㎝～8㎝处横向切断砧木苗，再沿着横断面纵切一刀，视接穗和砧木的粗细可适当调整纵切位置，若接穗和砧木一样粗或接穗粗于砧木，沿着横断面中间纵切一刀，若接穗细于砧木，沿着横断面偏向一侧纵切一刀，然后迅速将接穗楔形部位插入切口，一定要将接穗与砧木一侧韧皮部对齐。最后将接口部位用封口膜缠紧，再用塑料薄膜袋罩上扎严。5月17日当天将100株接穗全部嫁接完。
6.嫁接后管理：对嫁接苗似天气情况，光线强时进行遮荫，环境温度保持在20℃～25℃，湿度在70～80％。嫁接后的采用现有常规技术手段管理。6月20日统计，共成活93株，生长势良好。
实施例2
在10月-翌年2月提高砀山酥梨组培苗成活率的方法，包括外植体获得与消毒及预处理、诱导培养、增殖分化培养、接穗培养和嫁接，具体步骤如下：
1、外植体获得
2015年的元月10日，结合冬季梨树修剪，选取将剪除废弃的一年生中庸枝25枝，直接用清水冲洗干净,将枝条置温度－3℃～0℃环境中暗处理45d，2月25日取出，再将枝条基部下端呈45℃剪去2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，放10℃环境中1d，第2d置入人工气候箱，人工气候箱设置的培养条件为:昼/夜气温为25℃/16℃，光照强度3000LX，昼/夜时间分配为16h/8h，空气相对湿度80％，隔2d换水1次,每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝。3月25日采新梢作为外植体；共培养的25枝条全部萌发“新梢”，平均每枝条萌发“新梢”7.5枝，平均长度为7.8㎝。
2.外植体的消毒及预处理：参照实施例1。
3.诱导培养：参照实施例1。
3.增殖分化培养：4月25日从初代培养的组培苗中，随机选50瓶进行继代增殖分化培养，平均每瓶增殖2.86倍。
4.接穗培养：8月25日将继代增殖分化培养4代的芽丛分割，逐个接入接穗培养基中，于25±1℃、光照1500Lx～2500Lx；光照时间为12h～16h/d的条件下培养32d，使试管苗具有5～7片叶时进行嫁接，所述接穗培养基为：1/4MS+80mg/L PG+0.5～1.0mg/L IBA+0.3mg/L NAA+0.3mg/L K2H2PO4+0.1mg/L CaCL2；共培养100瓶，其中有97株试管苗生长出5～7片叶，长势良好，2株生长不旺，达不到接嫁接穗的要求，1株污染；经接穗培养后的试管苗成活率达97％。
5.嫁接：嫁接前炼苗：9月25日将接穗培养的组培瓶口打开，光线由弱渐强，使其试管苗逐渐适应外界环境，然后贴近接穗培养基将试管苗上部全部剪切下来，并将其基部削成楔形即可作为接穗。
杜梨苗和嫁接等管理参照实施例1。10月3日当天嫁接100株。
6.嫁接后管理：参照实施例1。11月10日统计，共成活93株，生长势良好。
上述实施例仅为发明的较佳的实施方式，除此之外，本发明还可以有其他实现方式。需要说明的是，在没有脱离本发明构思的前提下，任何显而易见的改进和修饰均应落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种获取砀山酥梨外植体的方法，其特征在于，
S1、在10-12月份，选择田间生长健壮、芽体饱满无病虫害的一年生砀山酥梨中庸枝，若还存有少部分叶片未脱落的，人工将其上面的叶片剪去，留叶柄；用清水冲洗干净,将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝～2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入温度5℃～7℃环境条件中处理7d～10d，每隔2d换水1次，每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，最后将枝条再冲洗一遍，再用湿沙布包裹待处理；
S2、在翌年元月-2月份，结合冬季梨树修剪，将剪除废弃的枝条拾回，剪成小于60㎝的段，所述枝条是选取一年生中庸枝，用清水冲洗干净,再用湿沙布包裹待处理；
S3、将S1、S2包裹待处理的枝条置于温度－3℃～0℃环境中暗处理45d，取出，再将枝条基部下端呈45℃剪去2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入人工气候箱，人工气候箱设置的培养条件为:昼/夜气温为25℃/16℃，光照强度3000Lx，昼/夜时间分配为16h/8h，空气相对湿度80％，隔2d换水1次,每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，直至新梢生长5㎝-10㎝时，采集新梢作为组培外植体。
2.一种获取砀山酥梨外植体及提高组培苗成活率的方法，包括砀山酥梨外植体获得与消毒及预处理、诱导培养、增殖分化培养、接穗培养和嫁接，其特征在于，
所述砀山酥梨外植体获得是指：
S1、在10月-12月份，选择田间生长健壮、芽体饱满无病虫害的一年生砀山酥梨中庸枝，若还存有少部分叶片未脱落的，人工将其上面的叶片剪去，留叶柄；用清水冲洗干净,将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝～2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入温度5℃～7℃环境条件中处理7d～10d，每隔2d换水1次，每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，最后将枝条再冲洗一遍，再用湿沙布包裹待处理；
S2、在翌年元月-2月份，结合冬季梨树修剪，将剪除废弃的枝条拾回，剪成小于60㎝的段，所述枝条是选取一年生中庸枝，用清水冲洗干净,再用湿沙布包裹待处理；
S3、将S1、S2用湿沙布包裹待处理的枝条置于温度－3℃～0℃环境中暗处理45d，取出，再将枝条基部下端呈45℃剪去2㎝，立即插入盛水2㎝～4㎝深的玻璃器皿中，置入人工气候箱，人工气候箱设置的培养条件为:昼/夜气温为25℃/16℃，光照强度3000Lx，昼/夜时间分配为16h/8h，空气相对湿度80％，隔2d换水1次,每次换水同时将枝条基部下端呈45℃剪去1㎝，直至新梢生长5㎝-10㎝时，采集新梢作为组培外植体。
3.根据权利要求2所述的一种获取砀山酥梨外植体及提高组培苗成活率的方法，其特征在于，
所述外植体的消毒是指：将外植体用洗衣粉浸泡30min后再用流水冲洗1h，然后先放入以W/V计6％Vc溶液中浸泡15min，并不断振荡，再置于超净工作台上，用以V/V计75％的酒精溶液消毒25s，再用无菌水冲洗3次后用以V/V计0.1％的HgCl2溶液浸泡5～7min，所述的HgCl2溶液每500mL添加有200μL吐温-80，最后用无菌水冲洗3次，进行外植体预处理；所述外植体预处理是指用经灭菌处理过的剪刀将外植体剪成2cm～3cm的小段，每段带有一个腋芽或者顶芽，之后用无菌滤纸吸干附着在表面的水分，等待接入诱导培养基。
4.根据权利要求2所述的一种获取砀山酥梨外植体及提高组培苗成活率的方法，其特征在于，所述诱导培养是指，将预处理后的外植体形态学下端向下接入诱导培养基上，于25±1℃、光照1500Lx～2500Lx、光照时间为12h～16h/d的条件下培养25d～30d，得到分化出芽丛的试管苗；所述诱导培养基配方为MS+1.5～2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.2～0.6％AC+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8～6.0。
5.根据权利要求2所述的一种获取砀山酥梨外植体及提高组培苗成活率的方法，其特征在于，所述增殖分化培养是指：将诱导培养得到的分化出芽丛的试管苗在继代培养基中培养，促使腋芽和不定芽的萌生，形成大量芽丛，通过将芽丛分割而达到扩繁的目的，所述继代培养基为：MS+1.0～1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+80mg/L PG；增殖分化培养每代间隔时间为28d～35d，最多继代培养6代。
6.根据权利要求2所述的一种获取砀山酥梨外植体及提高组培苗成活率的方法，其特征在于，所述接穗培养是指：将分化出芽丛的试管苗分割，再逐个芽接入接穗培养基中，于25±1℃、光照1500Lx～2500Lx、光照时间为12h～16h/d的条件下培养30d～35d，使试管苗具有5～7片叶时即可进行嫁接，所述接穗培养基为1/4MS+80mg/L PG+0.5～1.0mg/L IBA+0.3mg/L NAA+0.3mg/L K2H2PO4+0.1mg/L CaCL2。
7.根据权利要求2所述的一种获取砀山酥梨外植体及提高组培苗成活率的方法，其特征在于，所述嫁接是指：
A，嫁接前炼苗，开瓶，光线由弱渐强，使其试管苗逐渐适应外界环境，然后贴近接穗培养基将试管苗上部全部剪切下来即可作为接穗；
B，嫁接时，将砧木苗从离根茎部3㎝～8㎝处横向切断，再沿着横断面纵切一刀，根据接穗和砧木的粗细可适当调整纵切位置，若接穗和砧木一样粗或接穗粗于砧木，沿着横断面中部纵切一刀，若接穗粗度细于砧木，沿着横断面偏向一侧纵切一刀；然后迅速将接穗楔形部位插入切口，一定要将接穗与砧木一侧韧皮部对齐；最后将接口部位用封口膜缠紧，再用塑料薄膜袋罩上扎严，后期按常规技术管理即可。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
‘砀山酥梨’的组织培养和脱毒快速繁殖;金青 等;《植物生理学通讯》;20061031;第42卷(第5期);第900页 *
不同粗度灵武长枣休眠枝水培发芽情况及其无菌外植体的建立研究;尚雁鸿 等;《安徽农业科学》;20121231;第40卷(第11期);第6401-6402、6473页 *
水培方法在枣无菌繁殖系外植体建立中的应用;赵锦 等;《河北农业大学学报》;20050930;第28卷(第5期);第45-47页 *
砀山酥梨脱病毒苗瓶内生根的研究;金青 等;《激光生物学报》;20071231;第16卷(第6期);第768-772页 *

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