CN108450335A - 一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其技术工艺步骤如下：步骤1，不定芽诱导；步骤2，丛生芽诱导及增殖培养；步骤3，生根诱导。本发明一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法具有繁殖培养步骤少，繁殖系数高，繁殖速度块，繁殖材料用量少，褐化率低，有利于淡水沙梨扩繁和种质资源保存，操作简单方便，成本低的优点。

Description

一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养方法，具体为一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法。

背景技术

淡水沙梨，原产地在广东省惠州市惠阳区，即叶挺将军故乡，是以地方名命名的广东著名沙梨。其果实耐贮藏，果色泽朗润，果肉爽脆，多汁，深受人们的青睐，曾享誉岭南。改革开放后淡水沙梨随着惠阳区工业的发展以及惠阳区农业生产结构的变化，而且在90年代初当地大力推广种植荔枝、龙眼等果树，致使淡水沙梨栽培面积逐渐减少，淡水沙梨产业渐趋衰落。目前淡水沙梨产业有“已不存”的说法，淡水沙梨种质资源现状堪忧。淡水沙梨传统的繁殖方式主要是嫁接繁殖，少量为圈枝和扦插。嫁接、圈枝和扦插等繁殖方式速度慢效率低，很难起到改善梨苗木质量的作用而且传统的繁殖方式还会导致病害不断积累和传播。

淡水沙梨作为地方特有经济作物，适应南方高温高湿气候，具有独特和明显的种质优势，为保存淡水砂梨的种质资源，改进淡水砂梨品质和促进淡水砂梨产业的发展，需要运用组织培养技术保存当地的特色种质资源和快速繁殖高质量的无病毒种苗。但淡水沙梨的组织培养仅宋冠华等（2016）研究过淡水沙梨外植体培养和曾令达等（2017）研究过淡水沙梨的离体培养技术，而目前有关淡水沙梨从组织到试管苗，以及试管苗快速增殖和生根的技术中还存在褐化率高、繁殖系数不稳定、诱导出芽率低、芽苗质量差、出根难、操作繁琐等技术问题。

发明内容

本发明利用植物组织培养技术为淡水沙梨种苗的组培苗工厂化生产打下基础，建立了一种以淡水沙梨茎段组织作为外植体进行无菌苗的诱导、丛芽增殖和生根诱导，从而使淡水沙梨芽苗大量快速繁殖的方法。

本发明可以通过以下技术方案来实现：

一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其技术工艺步骤如下：

步骤1，不定芽诱导：选取淡水沙梨的刚萌发的新梢剪下去叶后作为快速繁殖材料，经0.1%～0.3%的氯化汞溶液中消毒10～16分钟，然后用无菌水冲洗5～6次，经无菌滤纸吸干水分后，切成具有1～3个芽的带芽茎段作为外植体接种到诱导培养基上，暗培养5～10天，然后转入光培养至萌发新芽；

步骤2，丛生芽诱导和增殖培养：将步骤1培养的高为1.0～3.0cm的新芽切下转接到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于光照强度为1500～2000Lx，培养温度为23～26℃条件下每天光照10～16小时，培养25～35天后即得丛生芽苗；

步骤3，生根诱导：将步骤2培养得到丛生芽切成单株芽苗接种到生根培养基上进行生根诱导，接种后先在23～26℃条件下按培养5～14天，然后置于光照强度为1500～2000Lx，培养温度为23～26℃条件下每天光照10～16小时，培养至生根。

本发明主要通过不定芽诱导、丛生芽诱导和增殖培养、生根诱导这三步完成对淡水沙梨茎段组织的诱导增殖，从而使淡水沙梨芽苗快速繁殖，，最终通过步骤3的生根诱导即得到大量芽苗，实现淡水沙梨芽苗大量繁殖，且各个操作步骤的操作简单，容易实施，实用经济，能为淡水沙梨种植资源的保护和规模化种植提供种苗保障。

进一步地，步骤1所述带芽茎段长度为0.5～2cm。带芽茎段的长度会影响到组织出牙和芽苗生长，长度小于0.5cm降低不定芽的出芽率，长度大于2cm则影响丛生芽生长速度和质量。

进一步地，步骤1所述光培养的条件为光照强度1500～2000Lx，培养温度23～26℃，光照时长12～16小时。光培养是为了促进不定芽生长，设置光照强度1500～2000Lx有效促进外植体萌芽和芽的生长，培养温度23～26℃为外植体最佳诱导和促进芽的生长温度范围，能最大限度降低褐化率并提高不定芽的萌发和生长，培养温度低于23℃则外植体生长速度慢，降低出芽率；培养温度高于26℃则外植体容易褐化，不定芽生长速度过快，降低其质量，从而影响下一步转接增殖培养的质量；光照时长小于12小时不利于芽叶的生长和进行光合作用，光照时长大于16小时则容易导致不定芽增长速度过快导致长出的新芽瘦长，降低增殖培养的成功率。

进一步地，步骤2所述丛生芽苗培养至高度为1.0～3.0cm时在无菌条件下切成单株芽苗再转接至增殖培养基进行增殖培养，接种后置于光照强度为1500～2000Lx，培养温度为23～26℃条件下每天光照10～16小时，培养25～35天。当丛生芽苗培养至高度为1.0～3.0cm时转接培养可加快获得大量丛生芽苗的速度，实现丛生芽苗批量化繁殖，提高获得芽苗的数量。

进一步地，步骤1所述外植体在进行不定芽诱导之前需要进行预处理，具体处理方式为将从野外采集的5～10cm长的幼嫩新梢用自来水冲洗干净表面污垢、灰尘、虫卵等杂物，再用饱和洗衣粉溶液浸泡5～10分钟，换净水漂洗3～5次后置于流动自来水冲洗5～12小时，直至冲洗干净后置于8～10℃冰箱中备用。通过此预处理可将外植体的表面污垢、灰尘、虫卵等杂物去除，用饱和洗衣粉溶液除去大多数植物的病毒、真菌和细菌，用净水漂洗后在用流动自来水将粘附在外植体表面的饱和洗衣粉溶液冲洗干净，避免残留的洗衣粉溶液腐蚀外植体。在8～10℃冰箱中保存使经处理后的外植体在低温条件下进入休眠状态，减少自身水分和养分的消耗，减轻褐化程度，保证外植体的成活。

进一步地，步骤1所述诱导培养基以MS为基本培养基，所述基本培养基每升含6-苄氨基腺嘌呤0.5～3.0mg， 1-萘乙酸0.01～0.20mg，L-半胱氨酸1.0～6.0mg，生物素0.01～0.04mg，核黄素1.0～3.0mg，D-泛酸钙0.1～0.2mg，抗坏血酸1.0～4.0mg，以及蔗糖质量浓度为2.5～3.0%，琼脂质量浓度为0.4～0.7%。

所述6-苄氨基腺嘌呤具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质分解，保绿防老，促进氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能；

所述1-萘乙酸为生长素类活性的植物生长调节剂，由根、茎、叶吸收，诱发不定根形成；

所述L-半胱氨酸可有效防止外植体出现褐化现象；

所述生物素有效诱导外植体分裂增殖；

所述核黄素促进外植体再生，促进生长；

所述D-泛酸钙有效促进外植体发育；

所述抗坏血酸能帮助外植体免受光合作用中有害副作用的侵害；

所述蔗糖和琼脂均为外植体生长提供碳源和氮源。

进一步地，：步骤2所述增殖培养基以MS为基本培养基，所述基本培养基每升含6-苄氨基腺嘌呤1.5～5.0mg， 1-萘乙酸0.1～0.5mg，赤霉素0.1～3.0mg，L-半胱氨酸1.0～6.0mg，核黄素2.0～3.0mg，D-泛酸钙0.2～0.4mg，以及蔗糖质量浓度为2.5～3.0%，琼脂质量浓度为0.4～0.7%。增加了赤霉素促进从芽苗生长和发芽。

进一步地，步骤3所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，所述基本培养基每升含吲哚丁酸0.2～1.5mg，1-萘乙酸0.2～1.5mg，核黄素2.0～3.0mg，D-泛酸钙0.2～0.4mg，以及蔗糖质量浓度为2.5～3.0%，琼脂质量浓度为0.4～0.7%。1/2MS为MS培养基配方中的大量元素含量减少了一半，所述生根培养基添加的吲哚丁酸和1-萘乙酸可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进不定根的形成，另外添加的核黄素和D-泛酸钙具有防止根和芽的生长。

进一步地，所述步骤1～3中所用的培养基pH值均为5.60～5.80。淡水沙梨体液pH值在5.60～5.80范围内，将培养基pH值调至5.60～5.80使组织细胞活性最高，适合诱导外植体生长。

本发明一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，具有如下的有益效果：

第一、繁殖方法步骤少；本发明主要通过不定芽诱导、丛生芽诱导和增殖培养，以及生根诱导三步完成从茎段组织作为外植体培养到可用于移植的带根幼苗，整个外植体培养步骤少，缩短培养周期；

第二、操作简单方便，成本低；本发明选用MS为基本培养基，此类培养基在植物组织培养中普遍使用，成本低，而且配置方法和操作均十分简单方便；

第三、节约繁殖材料，繁殖率高；本发明先对外植体诱导出不定芽，将不定芽转接至增殖培养基中进行增殖培养得到丛生芽，所得丛生芽在无菌条件下再进行分株增殖，从而实现丛生芽大量快速繁殖，这样诱导不定芽的外植体用量很少，能节约繁殖材料。所得丛生芽分株后再通过生根诱导即得可用于移植的很多生根幼苗，繁殖率高，而且新繁殖带根幼苗能保持与母株原有品种的相同优良性状；

第四、褐化率低；本发明通过严格的前处理步骤将外植体表面附着的大多数病毒、真菌和细菌除去，并在培养基中添加L-半胱氨酸等物质，有效降低褐化率，并在增殖培养得到的芽苗质量高；

第五、有利于淡水沙梨种质保存；本发明通过大量快速繁殖得到具有淡水沙梨典型性状且遗传稳定的芽苗，且芽苗质量佳，有利于进一步研究使用种质保存培养基对其进行种质保存；

第六、有利于促进淡水沙梨优良品种的推广种植和保护，促进优良品种的更新复壮，还为淡水沙梨的分子育种等研究和应用打下技术基础。

附图说明

图1为本发明一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法的不定芽诱导图；

图2为本发明一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法的丛生芽增殖图；

图3为本发明一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法的生根培养图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

1）外植体预处理

在野外采集淡水沙梨植株上的新萌发的长为5cm的幼嫩新梢，马上去掉幼叶后放入封口袋中置冰盒中带回，用自来水冲洗干净新梢表面污垢、灰尘、虫卵等杂物后置于饱和的洗衣粉溶液中浸泡5分钟，然后自来水将洗衣粉水漂洗并换水3次，再放流动自来水冲5小时，最后用封口袋密封装好置于8 ℃冰箱中备用。

2）培养过程

步骤1， 不定芽诱导

选取淡水沙梨的刚萌发的新梢剪下去叶后作为快速繁殖材料，置于0.1%的氯化汞溶液中消毒10分钟，然后用无菌水冲洗5次，经无菌滤纸吸干水分后，用接种刀切成顶芽和侧芽均为单芽的长约0.5cm的茎段迅速接种到诱导培养基上，在23℃条件下全暗培养，培养5天后转至光培养，光强为1500lx，培养温度为23℃，每天光照12小时至长出不定芽，如图1所示。

采用的诱导培养基为：以MS为基本培养基，所述基本培养基每升含6-苄氨基腺嘌呤0.5mg，1-萘乙酸0.01mg，L-半胱氨酸1.0mg，生物素0.01mg，核黄素1.0mg，D-泛酸钙0.1mg，抗坏血酸1.0mg，以及蔗糖质量浓度为2.5%，琼脂质量浓度为0.4%，pH值为5.60。

步骤2，丛生芽诱导和增殖培养

将步骤1培养的高为1.0cm的不定芽切下转接到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于光照强度为1500Lx，培养温度为23℃条件下每天光照10小时，培养25天后即得丛生芽，所得丛生芽生长至高度为1.0cm时分切为单株芽在无菌条件下再进行转接，置于光照强度为1500Lx，培养温度为23℃条件下每天光照10小时，培养25天，增殖系数为4～8，如图2所示。

采用的增殖培养基为以MS为基本培养基，所述基本培养基每升含6-苄氨基腺嘌呤1.5mg， 1-萘乙酸0.1mg，赤霉素0.1mg，L-半胱氨酸1.0mg，核黄素2.0mg，D-泛酸钙0.2mg，以及蔗糖质量浓度为2.5%，琼脂质量浓度为0.4%，pH值为5.60。

步骤3，生根诱导

将步骤2培养得到丛生芽切开呈单株芽苗接种到生根培养基上进行生根诱导，接种后先在23℃条件下暗培养5天，然后置于光照强度为1500Lx，培养温度为23℃条件下每天光照10小时，培养至生根，生根率达75%，如图3所示。

采用的生根培养基为：以1/2MS为基本培养基，所述基本培养基每升含吲哚丁酸0.2mg，1-萘乙酸0.2mg，核黄素2.0mg，D-泛酸钙0.2mg，以及蔗糖质量浓度为2.5%，琼脂质量浓度为0.4%，pH值为5.60。

实施例2

1)外植体预处理

淡水砂梨7cm幼嫩新梢去掉幼叶后放入封口袋中置冰盒中带回，用自来水冲洗干净新梢表面污垢、灰尘、虫卵等杂物后置于饱和的洗衣粉溶液中浸泡7分钟，漂洗4次后再用流动自来水冲洗8小时后用塑料封口袋密封后置于9℃冰箱中备用。

2)培养过程

步骤1，不定芽诱导

不定芽诱导：选取淡水沙梨的刚萌发的新梢剪下去叶后作为快速繁殖材料，经0.2%的氯化汞溶液中消毒13分钟，然后用无菌水冲洗6次，经无菌滤纸吸干水分后，用接种刀切成侧芽为2个芽且长为1.0cm的茎段或侧芽和顶芽共为2个芽且长为1.0cm的茎段后接种到诱导培养基上，在24℃条件下全暗培养7天，然后转入光培养，光强为1800Lx, 每天光照13小时至长出不定芽，如图1所示。

采用的诱导培养基为：以MS为基本培养基，所述基本培养基每升含6-苄氨基腺嘌呤1.8mg， 1-萘乙酸1.0mg，L-半胱氨酸3.5mg，生物素0.03mg，核黄素2.0mg，D-泛酸钙0.15mg，抗坏血酸2.5mg，以及蔗糖质量浓度为2.8%，琼脂质量浓度为0.55%，pH值为5.70。

步骤2，丛生芽诱导和增殖培养

将步骤1培养的高为2.0cm的新芽切下转接到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于光照强度为2000Lx，培养温度为25℃条件下每天光照13小时，培养30天后即得丛生芽，所得丛生芽生长至高度为2.0cm时分切为单株芽在无菌条件下再进行转接，置于光照强度为2000Lx，培养温度为25℃条件下每天光照13小时，培养30天，增殖系数为5～8，如图2所示。

采用的增殖培养基为：以MS为基本培养基，所述基本培养基每升含6-苄氨基腺嘌呤3.7mg， 1-萘乙酸0.3mg，赤霉素1.5mg，半胱氨酸3.5mg，核黄素2.5mg，D-泛酸钙0.3mg，以及蔗糖质量浓度为2.8%，琼脂质量浓度为0.6%，pH值为5.70。

步骤3，生根诱导

将步骤2培养得到丛生芽切开呈单株芽苗接种到生根培养基上进行生根诱导，接种后先在25℃条件下暗培养9天，然后置于光照强度为2000Lx，培养温度为25℃条件下每天光照13小时，培养至生根，生根率达80%，如图3所示。

采用的生根培养基为：以1/2MS为基本培养基，所述基本培养基每升含吲哚丁酸0.8mg，1-萘乙酸0.8mg，核黄素2.5mg，D-泛酸钙0.3mg，以及蔗糖质量浓度为2.8%，琼脂质量浓度为0.6%，pH值为5.70。

实施例3

1)外植体预处理

淡水砂梨10cm幼嫩新梢去掉幼叶后放入封口袋中置冰盒中带回，用自来水冲洗干净新梢表面尘埃、泥沙、虫卵等杂物后置于饱和的洗衣粉溶液中浸泡10分钟，漂洗5次后再用流动自来水冲洗12小时后用塑料封口袋密封后置于10℃冰箱中备用。

2)培养过程

步骤1，不定芽诱导

选取淡水沙梨的带芽茎段剪下作为外植体，经0.3%的氯化汞溶液中消毒16分钟，然后用无菌水冲洗6次，经无菌滤纸吸干水分后，用接种刀切成侧芽为3个芽的茎段或侧芽和顶芽共为3个芽的茎段后接种到诱导培养基上，在25℃条件下全暗培养5天，然后转入光培养，光强为2000Lx, 每天光照16小时至长出不定芽，如图1所示。

采用的诱导培养基为：以MS为基本培养基，所述基本培养基每升含6-苄氨基腺嘌呤3.0mg，1-萘乙酸0.20mg，L-半胱氨酸6.0mg，生物素0.04mg，核黄素3.0mg，D-泛酸钙0.2mg，抗坏血酸4.0mg，以及蔗糖质量浓度为3.0%，琼脂质量浓度为0.7%，pH值为5.80。

步骤2，丛生芽诱导和增殖培养

将步骤1培养的高为3.0cm的新芽切下转接到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于光照强度为2000Lx，培养温度为26℃条件下每天光照15小时，培养35天后即得丛生芽，所得丛生芽生长至高度为3.0cm时分切为单株芽在无菌条件下再进行转接，置于光照强度为2000Lx，培养温度为26℃条件下每天光照15小时，培养35天，增殖系数为4～8，如图2所示。

采用的增殖培养基为：以MS为基本培养基，所述基本培养基每升含6-苄氨基腺嘌呤5.0mg， 1-萘乙酸0.5mg，赤霉素3.0mg，L-半胱氨酸6.0mg，核黄素3.0mg，D-泛酸钙0.4mg，以及蔗糖质量浓度为3.0%，琼脂质量浓度为0.7%，pH值为5.80。

步骤3，生根诱导

将步骤2培养得到丛生芽切开呈单株芽苗接种到生根培养基上进行生根诱导，接种后先在26℃条件下暗培养10天，然后置于光照强度为2000Lx，培养温度为26℃条件下每天光照15小时，培养至生根，生根率达78%，如图3所示。

采用的生根培养基为：以1/2MS为基本培养基，所述基本培养基每升含吲哚丁酸1.5mg，1-萘乙酸1.5mg，核黄素3.0mg，D-泛酸钙0.4mg，以及蔗糖质量浓度为3.0%，琼脂质量浓度为0.7%，pH值为5.80。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上所述而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其特征在于其技术工艺步骤如下：

步骤1，不定芽诱导：选取淡水沙梨的刚萌发的新梢剪下去叶后作为快速繁殖材料，经0.1%～0.3%的氯化汞溶液中消毒10～16分钟，然后用无菌水冲洗5～6次，经无菌滤纸吸干水分后，切成具有1～3个芽的带芽茎段作为外植体接种到诱导培养基上，暗培养5～10天，然后转入光培养至萌发新芽；

步骤2，丛生芽诱导和增殖培养：将步骤1培养的高为1.0～3.0cm的新芽切下转接到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于光照强度为1500～2000Lx，培养温度为23～26℃条件下每天光照10～16小时，培养25～35天后即得丛生芽苗；

步骤3，生根诱导：将步骤2培养得到丛生芽切成单株芽苗接种到生根培养基上进行生根诱导，接种后先在23～26℃条件下按培养5～14天，然后置于光照强度为1500～2000Lx，培养温度为23～26℃条件下每天光照10～16小时，培养至生根。

2.根据权利要求1所述的一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其特征在于：步骤1所述带芽茎段长度为0.5～2cm。

3.根据权利要求2所述的一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其特征在于：步骤1所述光培养的条件为光照强度1500～2000Lx，培养温度23～26℃，光照时长12～16小时。

4.根据权利要求1所述的一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其特征在于：步骤2所述丛生芽苗培养至高度为1.0～3.0cm时在无菌条件下切成单株芽苗再转接至增殖培养基进行增殖培养，接种后置于光照强度为1500～2000Lx，培养温度为23～26℃条件下每天光照10～16小时，培养25～35天。

5.根据权利要求1至权利要求4任一项所述的一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其特征在于：步骤1所述外植体在进行不定芽诱导之前需要进行预处理，具体处理方式为将从野外采集的5～10cm长的幼嫩新梢用自来水冲洗干净表面污垢、灰尘、虫卵等杂物，再用饱和洗衣粉溶液浸泡5～10分钟，换净水漂洗3～5次后置于流动自来水冲洗5～12小时，直至冲洗干净后置于8～10℃冰箱中备用。

6.根据权利要求5所述的一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其特征在于：步骤1所述诱导培养基以MS为基本培养基，所述基本培养基每升含6-苄氨基腺嘌呤0.5～3.0mg， 1-萘乙酸0.01～0.20mg，L-半胱氨酸1.0～6.0mg，生物素0.01～0.04mg，核黄素1.0～3.0mg，D-泛酸钙0.1～0.2mg，抗坏血酸1.04.0mg，以及蔗糖质量浓度为2.5～3.0%，琼脂质量浓度为0.4～0.7%。

7.根据权利要求6所述的一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其特征在于：步骤2所述增殖培养基以MS为基本培养基，所述基本培养基每升含6-苄氨基腺嘌呤1.5～5.0mg， 1-萘乙酸0.1～0.5mg，赤霉素0.1～3.0mg，L-半胱氨酸1.0～6.0mg，核黄素2.0～3.0mg，D-泛酸钙0.2～0.4mg，以及蔗糖质量浓度为2.5～3.0%，琼脂质量浓度为0.4～0.7%。

8.根据权利要求7所述的一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其特征在于：步骤3所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，所述基本培养基每升含吲哚丁酸0.2～1.5mg，1-萘乙酸0.2～1.5mg，核黄素2.0～3.0mg，D-泛酸钙0.2～0.4mg，以及蔗糖质量浓度为2.5～3.0%，琼脂质量浓度为0.4～0.7%。

9.根据权利要求8所述的一种淡水沙梨茎段组织快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤1～3中所用的培养基pH值均为5.60～5.80。