CN107197746B

CN107197746B - 一种杉木野外优异资源的繁育方法

Info

Publication number: CN107197746B
Application number: CN201710622762.9A
Authority: CN
Inventors: 韦如萍; 胡德活; 晏姝; 郑会全; 王润辉
Original assignee: Guangdong Academy of Forestry
Current assignee: Guangdong Academy of Forestry
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2017-07-27
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2037-07-27
Also published as: CN107197746A

Abstract

本发明涉及林木无性繁殖技术领域，公开了一种杉木野外优异资源的繁育方法，以杉木植株半木质化侧枝作为外植体进行组织培养，得到的组培苗经炼苗移栽后，采用压干促萌方法，打破杉木成年大树侧枝具有的位置效应，获得高品质、幼态化的无性繁殖材料；再将得到的无性繁殖材料经组织培养后，得到可大量扩繁的杉木丛生芽和生根苗，从而实现杉木野外优异基因资源的高效离体保存，和快速繁育高品质的杉木组培苗木。建立了“组培苗—采穗圃—扦插繁育”相互对接又相互促进的生产模式，实现了资源的有效保存以及无性系苗木的规模化生产。

Description

一种杉木野外优异资源的繁育方法

技术领域

本发明涉及林木无性繁殖技术领域，特别涉及一种杉木野外优异资源的繁育方法。

背景技术

杉木(Cunninghamia Lanceolata)具有生长快、材质好、出材率高等特点，是我国南方重要的商品用材和造林树种。目前我国杉木遗传改良工作已进入第四代改良阶段，选育了大批具有优良特性的基因资源，成效显著。由于林木自身的生长特性、林地自然条件的复杂性以及人工林砍伐利用等压力，如何使优异基因资源得到及时有效地保存，以及如何使科研成果得到及时转化是备受重视的热点问题。利用传统的嫁接、扦插、种子园等方法进行资源的保存和繁育，具有周期长、成本高、成效低等问题，因而应用现代育种技术缩短育种周期，提高育种效率也是产业发展的必由之路。植物组织培养是保存珍稀基因资源的重要途径，也是快速繁殖植物新品种的重要方法，在保持品种优良遗传特性的同时，可在短期内大量繁育优质苗木供生产应用，极大促进了工业用材林的良种化进程。

但在林木组织培养中，解决成年树木生理年龄幼化是主要难点之一，传统方式主要采用砍伐或基部环割等手段，并结合除杂、光照、激素处理等技术，以促进大树伐桩或基部环割部位萌条的产生，此方法不仅操作困难而且成效不高，同时存在资源灭绝等风险。因此，如何经济、高效地保存和繁育林木野外优异基因资源迫在眉睫。杉木组织培养外植体材料有取自成熟种子的成熟胚、成熟和未成熟合子、子叶、下胚轴、种子萌发的嫩芽、大树基部萌芽、幼苗茎和叶等，但利用野外成年大树侧枝为外植体进行组织培养繁殖时，由于生理年龄和位置效应等限制，常存在繁殖系数低、苗木品质差等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效的杉木野外优异基因资源的繁育方法，该方法能显著缩短其繁育和利用周期，极大提高杉木优异基因资源的保存时间和效率，有效解决了杉木基因资源繁育和利用过程中高成本、低效率等问题，对保护原有资源，节省土地利用，培育杉木高品质苗木，促进速生优质杉木人工林产业快速发展具有重大意义。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种杉木野外优异资源的繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以野外杉木植株半木质化侧枝作为外植体进行组织培养，得到一代组培苗；

(2)将所述一代组培苗经炼苗后，移植于圃地中；

(3)当苗木长至一定高度时，压弯苗木主干，用土壤覆盖苗木主干基部至苗木中段，并将苗木基部的部分主干裸露在外，进行栽培；

(4)选择所述裸露主干萌发出的半木质化萌条进行再次繁育。

优选的，步骤(4)中，所述再次繁育为将所述半木质化萌条进行组织培养，得到丛生芽，用于杉木资源的离体保存。

优选的，步骤(4)中，所述再次繁育为将所述半木质化萌条进行组织培养，得到高品质的组培苗，用于生产应用。

优选的，步骤(4)中，所述再次繁育为将所述半木质化萌条进行扦插繁育，得到高品质的扦插苗，用于生产应用。

优选的，所述步骤(1)中的组织培养包括不定芽的诱导，芽的增殖培养和芽的生根培养；

其中，所述不定芽的诱导所用培养基的配方为：MS+6-苄氨基腺嘌呤0.5～1.0mg/L+蔗糖25～35g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L+聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/L；

所述芽的增殖培养所用培养基的配方为：MS+6-苄氨基腺嘌呤0.05～0.2mg/L+萘乙酸0.005～0.02mg/L+蔗糖25～35g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L；

所述芽的生根培养所用培养基的配方为：1/2MS+萘乙酸0.3～0.8mg/L+蔗糖20～30g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L。

优选的，所述外植体在进行组织培养前还包括灭菌的步骤，所述灭菌用75％酒精溶液和质量浓度为0.5％的次氯酸钠溶液进行灭菌。

优选的，所述组织培养的条件为：温度控制在25±2℃，相对湿度50％～60％，光照强度1500Lx～3000Lx，光照时间为每天12h～16h。

优选的，步骤(2)中，所述炼苗在大棚中进行，采用自然光照和湿度，温度控制在25～30℃；当组培苗根系长至1.0～1.5cm时，向组培苗中注入清水，使水面超过培养基表面0.5～1.0cm，开盖炼苗2～5天。

优选的，步骤(3)中，所述苗木高80～100cm时，压弯苗木主干，所述土壤覆盖厚度为3～5cm，所述裸露基部主干长度为10～15cm。

优选的，步骤(4)中，MS+6-苄氨基腺嘌呤0.3～0.8mg/L+蔗糖25～35g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L+聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/L。

优选的，步骤(4)中，DCR+6-苄氨基腺嘌呤0.8～1.5mg/L+苯基噻二唑基脲0.01～0.1mg/L+蔗糖25～35g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L。

优选的，步骤(4)中，所述组织培养的生根培养所用培养基的配方为：1/2MS+萘乙酸0.3～0.8mg/L+蔗糖20～30g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L。

优选的，所述丛生芽长为1.5～2.0cm时，进行芽丛的分离和转瓶。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的杉木野外优异资源的繁育方法，以野外杉木植株半木质化侧枝作为外植体进行组织培养，得到的组培苗经炼苗移栽后，采用压干促萌方法，打破杉木成年大树侧枝具有的生理年龄和位置效应，获得高品质、幼态化的无性繁殖材料；再将得到的无性繁殖材料经组织培养后，得到可大量扩繁的杉木丛生芽和生根苗，从而实现杉木野外优异基因资源的快速繁育，能够高效保存杉木优异离体资源，快速繁育高品质的杉木组培苗木。建立了“组培苗—采穗圃—扦插繁育”相互对接又相互促进的生产模式，实现了资源的有效保存以及无性系苗木的规模化生产。

附图说明

图1为本发明杉木野外优异资源离体保存和快速繁育方法的流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种杉木野外优异资源的繁育方法，包括以下步骤：

(2)将所述一代组培苗经炼苗后，移植于圃地中；

(4)选择所述裸露主干萌发出的半木质化萌条进行再次繁育。

本发明中，杉木外植体优选为杉木优良资源。本发明实施例中的杉木外植体采集的是野外资源。对杉木种源、家系或无性系测定林中经测定分析后筛选出的杉木优良单株，或者杉木成熟人工林中选择的优异个体，采集该植株中上部的半木质化侧枝，除去叶片后，作为本发明组织培养的外植体。

将采集的外植体进行组织培养，培育杉木一代组培苗。

本发明中，采集的外植体先进行预处理。预处理采用中性洗衣粉和吐温-80的混合液浸泡振荡，除去外部污物。优选浸泡振荡的时间为3～5min。将浸泡后的外植体用清水冲洗。优选清水冲洗的时间为20～30min。

将预处理后的外植体进行消毒灭菌。

本发明中，进行消毒灭菌的外植体长度优选为3～4cm，更优选为3.5cm。

本发明中，外植体依次用75％酒精和0.5％次氯酸钠溶液进行消毒灭菌。其中，外植体用75％酒精溶液浸泡的时间优选为20s～1min，更优选为30s。酒精浸泡后取出，用无菌水冲洗。本发明中优选用无菌水冲洗2～3次。将冲洗后的外植体再用0.5％次氯酸钠溶液浸泡，浸泡的同时轻微震荡。本发明中，优选0.5％次氯酸钠溶液浸泡的时间为10～15min，更优选为12～14min。取出外植体材料用无菌水冲洗，优选无菌水冲洗3～5次，更优选为4次。用无菌试纸吸去侧枝上多余的水分后，进行组织培养。

本发明的一代组织培养过程包括不定芽的诱导，芽的增殖培养和芽的生根培养。

本发明的组织培养优选在培养瓶中进行。本发明对培养瓶的材质没有特殊限定，透明培养瓶均能够应用于本发明中。本发明优选采用玻璃培养瓶。本发明对培养瓶的大小没有特殊限定。在本发明具体实施例中，采用培养瓶的容积为240mL，高90mm，口径62mm。本领域技术人员可以根据材料来源选择合适的培养瓶进行杉木资源的组织培养。

本发明中，将灭菌后的外植体插入装有无菌诱导培养基的培养瓶中进行培养。本发明中，诱导培养基的配方为MS+6-苄氨基腺嘌呤0.5～1.0mg/L+蔗糖25～35g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L+聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/L，优选为MS+6-苄氨基腺嘌呤0.6～0.8mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L+聚乙烯吡咯烷酮10mg/L。此配方的主要特点是，在MS培养基的基础上只添加细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤，不添加生长素，以充分诱导芽的分化和形成，同时添加聚乙烯吡咯烷酮，抑制杉木外植体材料酚类物质的分泌，预防外植体材料的褐化过程。采用此配方得到的外植体材料芽的诱导率为1～5倍。本发明在不定芽的诱导过程中，优选插入的外植体长度为3.0～3.5cm，每个培养瓶优选接种1～2段外植体材料。将培养瓶加盖密封后放于培养室中培养，获得无菌芽。

本发明中，将得到的无菌芽切割成合适大小的芽段后，接种到装有无菌增殖培养基的培养瓶中进行培养。本发明中，增殖培养基的配方为MS+6-苄氨基腺嘌呤0.05～0.2mg/L+萘乙酸0.005～0.02mg/L+蔗糖25～35g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L，优选为MS+6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.01mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L。第一代组培，以快速出苗为目的，所以此配方主要是促进芽的高生长，配方中细胞分裂素含量较低，同时添加了生长素，经实验对比后以细胞分裂素：生长素＝10:1的效果最好，芽的增殖倍数为1～2倍，高生长明显。本发明中，优选芽段的长度为1.5～2.5cm，更优选为2.0cm，每个培养瓶中优选接种10～12个芽段。加盖密封后放于培养室中培养。

本发明中，将得到的有效芽进行生根培养。所述有效芽为长度超过3cm、生长健壮、叶色浓绿的杉木芽。剪取有效芽带顶梢部分，插入装好无菌生根培养基的培养瓶中进行培养。本发明中，生根培养基配方为1/2MS+萘乙酸0.3～0.8mg/L+蔗糖20～30g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L，优选为1/2MS+萘乙酸0.5mg/L+蔗糖25g/L+卡拉胶7g/L。此配方中只添加了生长素，不添加细胞分裂素，目的是促进芽苗根系的形成和生长，生根率达到80％～85％。本发明中，优选每个培养瓶接种10～12个芽，加盖密封后放于培养室中培养。

本发明的组织培养过程中，对培养基的配制方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的培养基配制方法进行配制。本发明对诱导培养基中所用的原料来源没有特殊限定，均为本领域技术人员所熟知的组织培养原料，采用市售商品即可。

本发明将杉木组织培养的培养瓶置于无菌培养室中培养。本发明中，优选组织培养的温度控制在23～27℃，优选为25℃，相对湿度为50％～60％，优选为53％～57％；光照强度为1500Lx～3000Lx，优选为2000Lx～2500Lx；光照时间为每天12～16h，更优选为13～14h。

生根培养15～25天的苗木，会在基部形成肿胀的愈伤组织或者根系呈“露白”状，为生根苗。

将生根苗进行炼苗处理。优选炼苗在塑料大棚中进行。炼苗过程采用自然光照和湿度，温度控制在25～30℃，更优选为26～28℃。炼苗过程中，为了使每瓶苗都有自然光照射，优选将培养瓶单层摆放。当培养瓶中的苗根系长至1.0～1.5cm时，在培养瓶中注入清水，使水面超过培养基表面0.5～1.0cm，开盖炼苗2～5天，优选为3～4天后进行苗木移栽。

将炼苗后的生根苗木进行移栽。优选先将生根苗木移栽至育苗袋中进行养殖，再将移栽成活的苗木移栽至圃地中。

本发明中，将炼苗后的生根苗木移栽至育苗袋中。优选将生根苗木附着的培养基洗净后，移栽入装有红泥的育苗袋中。如遇晴天，移栽应在下午4：00后进行，阴雨天可全天移栽，清洗后的苗木要在当天全部移栽完。苗木移栽后可加盖薄膜和75％荫网，移栽第一个星期内，苗木生长环境湿度保持在90％左右，第二个星期后湿度保持在75％～85％左右，一个月后可撤掉薄膜只保留荫网，此时苗木可按常规育苗措施进行管护。

将移栽成活的苗木移栽至圃地中。本发明中，优选苗木高达10～15cm时，剥掉育苗袋栽植到圃地中。本发明对杉木苗在圃地的移栽和种植方式没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的移栽种植方式即可。本发明优选移栽的圃地要平坦，适合于杉木的种植。

本发明对圃地的整地方式没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的整地方式即可。在整地后的圃地中作畦，作畦方式依圃地地形而定。在本发明中，优选畦宽100～150cm，畦高20～30cm，畦距30～40cm，四周开设排水沟。本发明中，将杉木苗采用双行品字形栽植方法进行移栽。优选每个基因型杉木栽植30～50株，株距60～80cm。本发明中，优选栽植前施复合肥做基肥，用量为15～20g/株。

当圃地中的杉木苗长至高80～100cm时，进行压干促萌。具体方法为：清除基部杂草和侧枝，翻松苗木周边土壤，压弯苗木主干，然后用疏松土壤覆盖苗木主干基部至中部，覆土厚度优选为3～5cm，并裸露主干基部10～15cm。2～3个月后，苗木基部主干上即萌发出大量嫩芽。嫩芽数量多、长势一致、生理机能旺盛、形体发生能力强、灭菌容易、芽的诱导率高，是高品质、幼态化的无性繁殖材料。

采集萌发的半木质化萌条作为离体保存的外植体材料。本发明中，离体保存的方法优选为：将萌发的半木质化萌条保湿密封后，存放于4～10℃的环境中。本发明中，优选用湿毛巾将萌条包好进行保湿。本发明中，优选将采集的萌条进行编号后密封。本发明优选采用密封袋密封的方式。将材料运输至保藏地点时，优选将采集的萌条置于装有冰块的泡沫箱里，泡沫箱内温度控制在4～10℃，要求冰块不能与材料直接接触。

本发明中，萌发的半木质化的萌条也可以作为杉木繁育的无性材料。

作为一种可实施的方式，将半木质化萌条作为组织培养的外植体，进行杉木资源的再次繁育；或将半木质化萌条作为扦插繁殖材料，进行杉木资源的再次繁育。

本发明中，将采集的萌条进行预处理和消毒灭菌，作为组织培养的外植体。材料的预处理按照上述预处理的方式进行。将预处理后的外植体依次用70％酒精和0.5％次氯酸钠溶液进行消毒灭菌。其中，外植体用70％酒精溶液浸泡的时间优选为20～50s，更优选为30s。酒精浸泡后取出，用无菌水冲洗。本发明中优选用无菌水冲洗1～2次。将冲洗后的外植体再用0.5％次氯酸钠溶液浸泡，浸泡的同时轻微震荡。本发明中，优选0.5％次氯酸钠溶液浸泡2次，每次浸泡的时间为5～6min，浸泡完后用无菌水冲洗，优选无菌水冲洗2～3次。用无菌试纸吸去外植体材料上多余的水分后，进行二代组织培养。

本发明在二代组织培养的不定芽诱导过程中，不定芽诱导的培养基配方为MS+6-苄氨基腺嘌呤0.3～0.8mg/L+蔗糖25～35g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L+聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/L，优选为MS+6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L+聚乙烯吡咯烷酮10mg/L。此配方在MS培养基的基础上只添加细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤，不添加生长素，以充分诱导芽的分化和形成，同时添加聚乙烯吡咯烷酮抑制杉木外植体材料酚类物质的分泌，预防外植体材料的褐化过程，而且由于二代组织培养的外植体材料比一代的幼嫩，所以减少了6-苄氨基腺嘌呤的添加量。采用此配方外植体材料芽的诱导率为2～5倍。其余培养方式及条件同一代组织培养的不定芽诱导过程。

本发明在二代组织培养的芽增殖培养过程中，增殖培养基配方为DCR+6-苄氨基腺嘌呤0.8～1.5mg/L+苯基噻二唑基脲0.01～0.1mg/L+蔗糖25～35g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L，优选为DCR+6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L+苯基噻二唑基脲0.05mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L。二代组织培养的芽增殖培养过程以获得最优增殖系数为目的，此配方以促进芽的分化和增殖为目标，添加了2种细胞分裂素，同时去除生长素，经实验筛选出的配方可有效诱导出丛生芽，平均增殖倍数为3倍，而且芽苗生长健壮，叶色浓绿，平均继代周期1.5个月。其余培养方式及条件同一代组织培养的芽增殖培养过程。

增殖培养1.5～2.0个月后，即可形成丛生芽，增殖倍数可达2.5～3.0倍；当芽长为1.5～2.0cm时，即可进行芽丛的分离和转瓶。增殖培养基配方和接种方法保持不变，培养1.5～2.0个月后，再重复以上操作。经过这样的周期循环，即可快速实现芽的几何倍数增殖，进而实现杉木野外优异基因资源的高效离体保存。

利用增殖培养得到的有效芽繁殖杉木苗木。具体方法为，将有效芽进行生根培养。生根培养的方式及过程同一代组织培养过程中的生根培养。将生根培养得到的组培苗经炼苗后进行移栽。炼苗及移栽方式采用本领域技术人员所熟知的操作技术。在本发明具体实施例中，采用同上述描述方法进行炼苗及移栽。移栽至育苗袋中的成活苗木，即实现快速繁育高品质的杉木组培苗木，实现杉木优异基因资源的高效保存和利用。

应用本发明的方法，自2010年起，成功从野外收集并保存和快速繁育了已进入中龄期的5个速生优质杉木无性系，建立了“组培苗—采穗圃—扦插繁育”相互对接又相互促进的生产模式，实现了资源的有效保存以及无性系苗木的规模化生产。5个速生优质杉木无性系保存组培瓶苗总计近50万株，每年可生产生根苗木约20万株，利用移栽成活的组培苗木营建扦插采穗圃近5亩，每年可生产扦插苗木约30万株，有效缓解了广东省当前杉木优质壮苗供不应求的局面。此外，结合本方法，还规范了广东省杉木无性系规模化育苗，极大促进了杉木优异基因资源的保存和研究成果的快速应用，对加速我国商品林建设中杉木优质林建设步伐，以及提升杉木商品林建设的国际竞争力具有积极作用。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下面分别以杉木速生优质无性系7号和TL5号为例，详细列举本发明的具体方法。

按以下离体保存和快速繁育的配套方法进行：

实施例1

(1)2013年10月15日，从位于广东省韶关地区的8年生杉木无性系测定林中采集7号无性系中上部侧枝，适当修剪枝条，保留带顶梢部分，枝条长度10～15cm，用干净的湿毛巾包好，放入塑料封口袋中，然后放入带冰块的泡沫箱里，要求冰块不能直接接触芽条，箱内温度控制在4℃～10℃，于采集当天把材料带回实验室及时处理。

(2)在实验室内，把野外采集回来的枝条去除所有叶片，放入容积为2L的干净量杯中，加入小半勺中性洗衣粉和2滴吐温-80浸泡并震荡3min，然后置于流水下冲洗25min，取出材料，剪除已经木质化的部分，保留半木质化枝条，放入超净工作台上干净碟子中备用。

(3)在超净工作台上，把预处理后的材料截成3.5cm长的小段，然后用75％酒精溶液浸泡加震荡30s，用干净的镊子取出材料，无菌水冲洗2次，再放入0.5％次氯酸钠溶液中浸泡加轻微震荡10min，取出材料用无菌水冲洗3次，然后用无菌试纸吸去侧枝上多余的水分，放入干净碟子中备用。

(4)在超净工作台上，采用干净的器械，把已经灭菌消毒处理过的材料两端各截去0.5cm左右，使保留的材料每段长度为3.5cm，然后插入装有无菌诱导培养基的玻璃培养瓶中，诱导培养基配方为MS+6-苄氨基腺嘌呤0.8mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L+聚乙烯吡咯烷酮10mg/L，培养瓶的容积为240mL、高90mm、口径62mm，每瓶接种1段材料，共接种50瓶，加盖塑料密封盖后，置于培养室中培养。

(5)2013年11月29日，在超净工作台上，选择步骤(4)培养获得的22瓶无菌不定芽作为增殖培养的材料，对长度超过4cm的芽，切割为约2.0cm长的芽段，然后接种到装有无菌增殖培养基的玻璃培养瓶中，培养瓶规格同步骤(4)所述，培养基配方为MS+6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.01mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L，每瓶接种10～12个芽，共接种了72个芽，加盖塑料密封盖后放于培养室中培养。

(6)2014年1月20日，在超净工作台上，对步骤(5)培养获得的有效芽，选取长度超过3cm、生长健壮、叶色浓绿的芽，剪取带顶梢部分，插入装好无菌生根培养基的玻璃培养瓶中，培养基配方为1/2MS+萘乙酸0.5mg/L+蔗糖25g/L+卡拉胶7g/L，每瓶接种10～12个芽，加盖塑料密封盖后放于培养室中培养。

(7)2014年2月15日，当苗木根系呈“露白”状时，把培养瓶转入塑料大棚内进行炼苗处理；大棚采用自然光照和湿度，温度控制在25℃左右；单层摆放培养瓶，使每瓶苗都有自然光照射。

(8)2014年3月3日，苗木根系长至1.0～1.5cm，打开瓶盖，注入清水，使水面超过培养基表面0.5～1.0cm，开盖炼苗5天后可进行苗木移栽。

(9)2014年3月8日，把开盖炼苗后的生根苗从瓶中取出(共226株)，用清水洗净基部附着的培养基，移栽入装有干净红泥的塑料育苗袋中，淋透水后遮盖塑料薄膜以保持苗床的湿度和温度；移栽第一个星期内，保持苗木生长环境湿度在90％左右，第二个星期后湿度保持在75～85％左右；2014年4月10日撤掉覆盖的薄膜，移栽成活苗木有198株，成活率87.6％，此后苗木可按常规育苗措施进行管护。

(10)2014年10月20日，从移栽成活的苗木中，挑选50株生长健壮、长势良好，苗高超过10cm的苗木在圃地中定植；圃地全面整地后作畦，长约15m，畦宽120cm，畦高20cm，四周开设排水沟；采用双行品字形栽植方法，株距60cm；栽植前施复合肥做基肥，用量为15g/株；2015年8月，当苗高约80cm时，清除基部杂草和侧枝，翻松苗木周边土壤，压弯苗木主干，然后用疏松土壤覆盖苗木主干至约1/2苗高处，覆土厚度3～5cm，并保留长约10cm的基部主干裸露在外；2～3个月后，苗木基部主干上即萌发出大量嫩芽(产量约为100条/年.株)；当萌芽长至10～15cm时，即可采集作为组培外植体材料，由此亦可有效解决了杉木成年大树侧枝作为外植体所面临的生理年龄和位置效应问题。

(11)2015年10月16日上午，晴，于露水干后采集萌条，选择长度超过10cm、半木质化状态的萌条为外植体材料，材料的保存方法同上述步骤(1)，共采集萌条30条。

(12)2015年10月16日下午，进行材料的预处理，方法同上述步骤(2)；然后在超净工作台上，用70％酒精溶液浸泡材料30s，取出用无菌水冲洗1次，再用0.5％次氯酸钠溶液浸泡5min后取出用无菌水冲洗3次，然后用0.5％次氯酸钠溶液浸泡第二次，时长5min，浸泡过程中需轻微震荡，然后取出用无菌水冲洗5次，再用无菌试纸吸去芽条上多余的水分，放入干净碟子中备用。

(13)2015年10月16日下午，对上述步骤(12)获得的外植体材料进行不定芽诱导，培养基采用MS+6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L+聚乙烯吡咯烷酮10mg/L，其余措施同上述步骤(4)，共接种120个芽段。

(14)2015年12月20日，对上述步骤(13)获得的无菌不定芽进行增殖培养，培养基采用DCR+6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L+苯基噻二唑基脲0.05mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L，其余措施同上述步骤(5)，共接种192个芽。

(15)2016年2月8日，经步骤(14)培养1.5个月的芽已形成丛生芽，增殖倍数为2.5～3.0，无菌芽总数约430个；选择芽长超过1.5cm的丛生芽进行分离和转瓶，增殖培养基配方和接种方法保持不变，培养1.5个月后，无菌芽总数约为1160个，重复“增殖培养—芽丛分离—增殖培养”的操作，至2016年12月底，无菌芽总数约为6万株，实现了芽的几何倍数增殖，同时也实现了杉木野外优异基因资源的高效离体保存。

(16)2016年3月25日，对步骤(14)培养的丛生芽，选择其中长度超过3cm，生长健壮、叶色浓绿的无菌芽进行生根培养，重复实施例1中的步骤(6)～(9)，即可规模生产出高品质的杉木无性系7号组培苗，进而实现基因资源的高效保存和利用。

实施例2

(1)2013年10月10日，从位于广东省云浮市的7年生杉木无性系测定林中采集TL5号无性系中上部侧枝，适当修剪枝条，保留带顶梢部分，枝条长度10～15cm，用干净的湿毛巾包好，放入塑料封口袋中，然后放入带冰块的泡沫箱里，要求冰块不能直接接触芽条，箱内温度控制在4℃～10℃，于采集当天把材料带回实验室及时处理。

(2)在实验室内，把野外采集回来的枝条去除所有叶片，放入容积为2L的干净量杯中，加入小半勺中性洗衣粉和2滴吐温-80浸泡并震荡5min，然后置于流水下冲洗25min，取出材料，剪除已经木质化的部分，保留半木质化枝条，放入超净工作台上干净碟子中备用。

(3)在超净工作台上，把预处理后的材料截成4.0cm长的小段，然后用75％酒精溶液浸泡加震荡50s，用干净的镊子取出材料，无菌水冲洗2次，再放入0.5％次氯酸钠溶液中浸泡加轻微震荡15min，取出材料用无菌水冲洗5次，然后用无菌试纸吸去侧枝上多余的水分，放入干净碟子中备用。

(4)在超净工作台上，采用干净的器械，把已经灭菌消毒处理过的材料两端各截去0.5cm左右，使保留的材料每段长度为3.0cm，然后插入装有无菌诱导培养基的玻璃培养瓶中，诱导培养基配方为MS+6-苄氨基腺嘌呤0.6mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L+聚乙烯吡咯烷酮15mg/L，培养瓶的容积为240mL、高90mm、口径62mm，每瓶接种1段材料，共接种100瓶，加盖塑料密封盖后，置于培养室中培养。

(5)2013年11月25日，在超净工作台上，选择步骤(4)培养获得的56瓶无菌不定芽作为增殖培养的材料，对长度超过4cm的芽，切割为约2.0cm长的芽段，然后接种到装有无菌增殖培养基的玻璃培养瓶中，培养瓶规格同步骤(4)所述，培养基配方为MS+6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L+萘乙酸0.02mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L，每瓶接种10～12个芽，共接种了108个芽，加盖塑料密封盖后放于培养室中培养。

(6)2014年1月26日，在超净工作台上，对步骤(5)培养获得的有效芽，选取长度超过3cm、生长健壮、叶色浓绿的芽，剪取带顶梢部分，插入装好无菌生根培养基的玻璃培养瓶中，培养基配方为1/2MS+萘乙酸0.6mg/L+蔗糖25g/L+卡拉胶6.5g/L，每瓶接种10～12个芽，加盖塑料密封盖后放于培养室中培养。

(7)2014年2月27日，当苗木根系呈“露白”状时，把培养瓶转入塑料大棚内进行炼苗处理；大棚采用自然光照和湿度，温度控制在25℃左右；单层摆放培养瓶，使每瓶苗都有自然光照射。

(8)2014年3月11日，苗木根系长至1.0～1.5cm，打开瓶盖，注入清水，使水面超过培养基表面0.5～1.0cm，开盖炼苗4天后可进行苗木移栽。

(9)2014年3月15日，把开盖炼苗后的生根苗从瓶中取出(共536株)，用清水洗净基部附着的培养基，移栽入装有干净红泥的塑料育苗袋中，淋透水后遮盖塑料薄膜以保持苗床的湿度和温度；移栽第一个星期内，保持苗木生长环境湿度在90％左右，第二个星期后湿度保持在75～85％左右；2014年4月17日撤掉覆盖的薄膜，移栽成活苗木有479株，成活率89.5％，此后苗木可按常规育苗措施进行管护。

(10)2014年10月25日，从移栽成活的苗木中，挑选50株生长健壮、长势良好，苗高超过15cm的苗木在圃地中定植；圃地全面整地后作畦，长约15m，畦宽120cm，畦高30cm，四周开设排水沟；采用双行品字形栽植方法，株距60cm；栽植前施复合肥做基肥，用量为20g/株；2015年8月，当苗高约80cm时，清除基部杂草和侧枝，翻松苗木周边土壤，压弯苗木主干，然后用疏松土壤覆盖苗木主干至约1/2苗高处，覆土厚度3～5cm，并保留长约10cm的基部主干裸露在外；2～3个月后，苗木基部主干上即萌发出大量嫩芽(产量约为100条/年.株)；当萌芽长至10～15cm时，即可采集作为组培外植体材料，由此亦可有效解决了杉木成年大树侧枝作为外植体所面临的生理年龄和位置效应问题。

(11)2015年10月25日上午，晴，于露水干后采集萌条，选择长度超过10cm、半木质化状态的萌条为外植体材料，材料的保存方法同上述步骤(1)，共采集萌条30条。

(12)2015年10月25日下午，进行材料的预处理，方法同上述步骤(2)；然后在超净工作台上，用70％酒精溶液浸泡材料50s，取出用无菌水冲洗2次，再用0.5％次氯酸钠溶液浸泡6min后取出用无菌水冲洗2次，然后用0.5％次氯酸钠溶液浸泡第2次，时长5min，浸泡过程中需轻微震荡，然后取出用无菌水冲洗5次，再用无菌试纸吸去芽条上多余的水分，放入干净碟子中备用。

(13)2015年10月25日下午，对上述步骤(12)获得的外植体材料进行不定芽诱导，培养基采用MS+6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L+聚乙烯吡咯烷酮10mg/L，其余措施同上述步骤(4)，共接种106个芽段。

(14)2015年12月28日，对上述步骤(13)获得的无菌不定芽进行增殖培养，培养基采用DCR+6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L+苯基噻二唑基脲0.01mg/L+蔗糖35g/L+卡拉胶7g/L，其余措施同上述步骤(5)，共接种212个芽。

(15)2016年2月13日，经步骤(14)培养1.5个月的芽已形成丛生芽，增殖倍数为2.5～3.0，无菌芽总数约593个；选择芽长超过1.5cm的丛生芽进行分离和转瓶，增殖培养基配方和接种方法保持不变，培养1.5个月后，无菌芽总数约为1668个，重复“增殖培养—芽丛分离—增殖培养”的操作，至2016年12月底，无菌芽总数约为12万株，实现了芽的几何倍数增殖，同时也实现了杉木野外优异基因资源的高效离体保存。

(16)2016年3月29日，对步骤(14)培养的丛生芽，选择其中长度超过3cm，生长健壮、叶色浓绿的无菌芽进行生根培养，重复实施例1中的步骤(6)～(9)，即可规模生产出高品质的杉木无性系TL5号组培苗，进而实现基因资源的高效保存和利用。

本发明的资源保存和快速繁育情况及其效果详见表1。

表1杉木野外优异资源离体保存和快速繁育方法的实施效果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种杉木野外优异资源的繁育方法，包括以下步骤：

所述组织培养包括不定芽的诱导，芽的增殖培养和芽的生根培养；

所述芽的生根培养所用培养基的配方为：1/2MS+萘乙酸0.3～0.8mg/L+蔗糖20～30g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L；

(2)将所述一代组培苗经炼苗后，移植于圃地中；

(3)当苗木长至一定高度时，压弯苗木主干，用土壤覆盖苗木主干基部至苗木中段，并将苗木基部的部分主干裸露在外，进行栽培；所述苗木高80～100cm时，压弯苗木主干，所述土壤覆盖厚度为3～5cm，所述裸露基部主干长度为10～15cm；

(4)选择所述裸露主干萌发出的半木质化萌条进行再次繁育；所述再次繁育为将所述半木质化萌条进行组织培养，得到丛生芽或组培苗。

2.根据权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，步骤(1)中，所述外植体在进行组织培养前还包括灭菌的步骤，所述灭菌用75％酒精溶液和质量浓度为0.5％的次氯酸钠溶液进行灭菌。

3.根据权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，所述组织培养的条件为：温度控制在25±2℃，相对湿度50％～60％，光照强度1500Lx～3000Lx，光照时间为每天12～16h。

4.根据权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，步骤(2)中，所述炼苗在塑料大棚中进行，采用自然光照和湿度，温度控制在25～30℃；当组培苗根系长至1.0～1.5cm时，向组培苗中注入清水，使水面超过培养基表面0.5～1.0cm，开盖炼苗2～5天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述组织培养包括不定芽的诱导，芽的增殖培养和芽的生根培养；

其中，所述芽的诱导所用培养基的配方为：MS+6-苄氨基腺嘌呤0.3～0.8mg/L+蔗糖25～35g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L+聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/L；

所述芽的增殖培养所用培养基的配方为DCR+6-苄氨基腺嘌呤0.8～1.5mg/L+苯基噻二唑基脲0.01～0.1mg/L+蔗糖25～35g/L+卡拉胶6.5～7.5g/L；

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丛生芽长为1.5～2.0cm时，进行芽丛的分离和转瓶。