CN109863997A - 一种蒙桑种苗的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蒙桑种苗的组织培养方法，该方法以蒙桑休眠芽为外植体材料，以MS为基本培养基，通过向培养基中添加不同浓度的6‑BA、2,4‑D、IBA、GA3、PVP‑40等物质，对蒙桑外植体依次进行继代培养、增殖培养和生根培养，得到完整植株。采用该方法可得到大量的蒙桑再生苗，解决了以种子繁殖产生的变异以及生长缓慢的问题，以及以扦插方式产生的病虫害传播问题。通过该方法能够明显提高蒙桑繁育系数，缩短了繁育周期。在本发明的实施例中，增殖期以9.3倍速率增殖，生根率为100％。
Description
技术领域
本发明涉及林木繁育技术领域，具体涉及一种蒙桑种苗的组织培养方法。
背景技术
蒙桑(Morus mongolica)，别名岩桑，是理想的生态经济型树种，对北方地区的水土保持及生态修复可以起到十分积极的作用。主要分布在大青山山地、阴山南部黄土丘陵区、大兴安岭南部山地，以及科左后旗大青沟自然保护区。
蒙桑是异花授粉植物，播种繁殖的苗木易产生变异，不能保持母本的优良性状，且实生苗幼苗期生长缓慢，育苗周期长、繁殖系数低。扦插繁殖虽能保持母本的优良性状，但易积累病虫害，而且对母树的数量要求以及树型的破坏性大，极大地制约了蒙桑的优良种苗的推广种植。
植物组织培养产生的幼苗可保存母树的性状，且其生产不受时间、季节、环境等因素的影响，在短时间内可大量繁殖苗木。近些年来，随着技术的发展，组织培养的成本降低，繁殖数不断增加，可以有效低蒙桑优良苗木的市场价格，对新品种的选育及推广的很大的推动作用。然而，目前没有针对蒙桑种苗的相应组织培养方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蒙桑种苗的组织培养方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明涉及一种蒙桑种苗的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)取蒙桑外植体并进行灭菌处理，得到无菌外植体；
(2)将所述无菌外植体接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到诱导苗；
(3)将所述诱导苗接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗；
(4)将所述继代苗接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到丛生芽；
(5)将所述丛生芽接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。
优选地，步骤(1)中，所述外植体为蒙桑的休眠芽。
优选地，步骤(1)中，所述灭菌处理为将所述外植体依次使用酒精溶液和氯化汞溶液浸泡后，然后用无菌水冲洗。
优选地，步骤(1)中，所述酒精溶液的体积分数为75％，所述氯化汞溶液的质量浓度为0.1％。
优选地，步骤(2)中，所述诱导培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、PVP-40、蔗糖和琼脂得到，所述诱导培养基中6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.5mg/L，PVP-40的浓度为500mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述诱导培养基的pH值为5.8～6.0。
优选地，步骤(2)中，所述诱导培养为将所述无菌外植体接种于诱导培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为1500～2000Lx、光照时间为10～14h/天的条件下进行培养20天以上，直至无菌外植体生长至3cm左右，得到诱导苗。
优选地，步骤(3)中，所述继代培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加IBA、GA3、蔗糖和琼脂得到，所述继代培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，GA3的浓度为3mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述继代培养基的pH值为5.8～6.0。
优选地，步骤(3)中，所述继代培养为将所述诱导苗接种于继代培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为15～17h/天的条件下进行培养30天以上，直至诱导苗生根并生长至5～7cm，得到继代苗。
优选地，步骤(4)中，所述增殖培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、2,4-D、蔗糖和琼脂得到，所述增殖培养基中6-BA的浓度为1.5mg/L，2,4-D的浓度为0.3mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述增殖培养基的pH值为5.8～6.0。
优选地，步骤(4)中，所述增殖培养为从所述继代苗中切取带有一个腋芽的小段后，接种于增殖培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为15～17h/天的条件下进行培养30天以上，直至该小段继代苗生长至5～7cm，得到丛生芽。
优选地，步骤(5)中，所述生根培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加IBA、蔗糖和琼脂得到，所述生根培养基中IBA的浓度为0.3mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述生根培养基的pH值为5.8～6.0。
优选地，步骤(5)中，所述生根培养为将所述丛生芽接种于生根培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为15～17h/d的条件下，生根培养20～25天，得到生根苗。
优选地，步骤(5)结束后，还包括步骤(6)：将所述生根苗洗净后，在基质中培养15～20天得到移栽苗。
优选地，所述基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3：2：1。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种蒙桑种苗的组织培养方法，该方法以蒙桑休眠芽为外植体材料，以MS为基本培养基，通过向培养基中添加不同浓度的6-BA、2,4-D、IBA、GA3、PVP-40等物质，对蒙桑外植体依次进行诱导培养、继代培养、增殖培养和生根培养，得到完整植株。采用该方法可得到大量的蒙桑再生苗，解决了以种子繁殖产生的变异以及生长缓慢的问题，以及以扦插方式产生的病虫害传播问题。通过该方法能够明显提高蒙桑繁育系数，缩短了繁育周期。在本发明的实施例中，增殖期以9.3倍速率增殖，生根率为100％。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明实施例涉及一种蒙桑种苗的组织培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)取蒙桑外植体进行灭菌处理，得到无菌外植体。
其中，外植体是作为离体培养材料的植物器官或组织的片段，其具有代谢旺盛，再生能力强的特点。在本发明的一个实施例中，外植体为蒙桑的休眠芽。
在本发明的一个实施例中，灭菌处理为将外植体依次使用酒精溶液和氯化汞溶液浸泡后，然后用无菌水冲洗。氯化汞形态为白色晶体、颗粒或粉末，可作为消毒剂和防腐剂。其中，酒精溶液的体积分数可以为75％，氯化汞溶液的质量浓度可以为0.1％。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(1)包括：将休眠后的蒙桑枝条在质量浓度为75％的酒精中消毒灭菌40～60秒后，转移到质量浓度为0.1％的升汞溶液中消毒灭菌10～15分钟，然后用无菌水冲洗3～5次，剥取长度为0.3～0.5cm的芽尖，得到无菌外植体。
本发明取休眠后的蒙桑枝条进行外植体培养，原因是休眠枝条的芽未展开，内部含菌量少，不容易发生污染。生长中的枝条没有休眠芽，且表面带菌量多，外植体感染率高。
(2)灭菌完成后，将无菌外植体接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到诱导苗。
在本发明的一个实施例中，诱导培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、PVP-40、蔗糖和琼脂得到。诱导培养基中6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.5mg/L，PVP-40的浓度为500mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且诱导培养基的pH值为5.8～6.0。
其中，MS培养基是目前使用最普遍的培养基，其配方为组培领域公知的。该培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。6-BA为苄氨基腺嘌呤，为人工合成的细胞分裂素，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点。6-BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。IBA为吲哚丁酸，对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用，也可以将其替换为吲哚乙酸。PVP-40为聚乙烯吡咯烷酮，能与特定多酚化合物(如单宁)形成络合物，改善组织培养中褐化的问题。如不加入会导致外植体褐化死亡。
在本发明的一个实施例中，诱导培养的具体条件为：将无菌外植体接种于诱导培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为1500～2000Lx、光照时间为10～14h/天的条件下进行培养20天以上，直至无菌外植体生长至3cm左右，得到诱导苗。
(3)诱导培养完成后，将得到的诱导苗接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗。
在本发明的一个实施例中，继代培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加IBA、GA3、蔗糖和琼脂得到。继代培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，GA3的浓度为3mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且继代培养基的pH值为5.8～6.0。
其中，GA3为赤霉素，为植物生长调节剂，主要用于促进作物的生长发育，提早成熟。
继代培养的作用为：诱导产生的幼苗需经此步骤使其快速幼化，才能进行增殖并得到较高的增殖率。如未经此步骤则难以进行增殖。
在本发明的一个实施例中，继代培养的具体条件为：将诱导苗接种于继代培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为15～17h/天的条件下进行培养30天以上，直至诱导苗生根并生长至5～7cm，得到继代苗。
(4)继代培养完成后，将得到的继代苗接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到丛生芽。
在本发明的一个实施例中，增殖培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、2,4-D、蔗糖和琼脂得到。增殖培养基中6-BA的浓度为1.5mg/L，2,4-D的浓度为0.3mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且增殖培养基的pH值为5.8～6.0。
其中，2,4-D又名2,4-二氯苯氧乙酸，是植物生长调节剂的一种。能够诱导木本植物愈伤组织的形成。
在本发明的一个实施例中，增殖培养的具体条件为：从继代苗中切取带有一个腋芽的小段后，接种于增殖培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为15～17h/天的条件下进行培养30天以上，直至该小段继代苗生长至5～7cm，得到丛生芽。
(5)增殖培养完成后，将得到的丛生芽接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。
在本发明的一个实施例中，生根培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加IBA、蔗糖和琼脂得到，生根培养基中IBA的浓度为0.3mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且生根培养基的pH值为5.8～6.0。
在本发明的一个实施例中，生根培养的具体条件为：将丛生芽分成单株后接种于生根培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为15～17h/d的条件下，生根培养20～25天，得到生根苗。
进一步地，步骤(5)结束后，还包括步骤(6)：将生根苗洗净残留培养基后，转移到基质中进行培养，在基质中培养15～20天得到移栽苗。期间使环境湿度保持在80％～90％，昼夜温度在20～25℃之间。移栽1周后逐渐降低湿度，共需要15～20天炼苗完成，得到移栽苗。
在本发明的一个实施例中，基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3：2：1。蛭石是一种天然、无机，无毒的矿物质，透水性较好，能够有效地促进植物根系的生长和幼苗的稳定发育。长时间提供植物生长所必需的水分及营养，并能保持根阳光温度的稳定。蛭石可使作物从生长初期就能获得充足的水分及矿物质，促进植物较快生长，增加产量。由于移栽后的生根苗会高速生长，所以需要基质中含有较多的养分，因此基质中还要加入草炭。珍珠岩是珍珠岩矿砂经预热，瞬时高温焙烧膨胀后制成的一种内部为蜂窝状结构的白色颗粒状的材料,具有多孔结构。产品的多孔性极大促进了植物的须根系生长和发育，对树木有着极好的固定作用。
本发明提供的方法有效解决了以蒙桑种子繁殖产生的变异、生长缓慢，以及以扦插方式产生的病虫害传播问题。通过该方法能够使蒙桑增殖期以9.3倍速率增殖，生根率为100％。
实施例1-1
(1)将休眠后的蒙桑枝条用质量浓度为0.5％洗衣粉水轻轻刷洗后，用自来水冲洗至无泡沫。在超净工作台中，将带休眠芽的枝条先用体积分数为75％的酒精浸泡40s，然后用无菌水清洗3～5次，再用质量浓度为0.1％氯化汞溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗5次。
(2)将经步骤(1)灭菌后的枝条以手术刀剥取长度为0.3～0.5cm的芽尖，接种于诱导培养基中。诱导培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、PVP-40、蔗糖和琼脂得到，诱导培养基中6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.5mg/L，PVP-40的浓度为500mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且pH值为5.8～6.0。培养温度为25±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12h/d，培养20天后幼苗长至3cm左右时得到诱导苗，然后进行继代培养；
(3)将步骤(2)得到的诱导苗接种于继代培养基中。继代培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加IBA、GA3、蔗糖和琼脂得到，继代培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，GA3的浓度为3mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且pH值为5.8～6.0。培养温度为25±2℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为16h/d，培养30天幼苗生长至5～7cm时得到继代苗，然后进行增殖培养；
(4)从步骤(3)得到的继代苗中选择木质化程度较低的部分，从中切取带一个腋芽的小段。这部分木质化程度低，容易产生丛生芽。将该小段接种于增殖培养基中。增殖培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、2,4-D、蔗糖和琼脂得到，其中6-BA的浓度为1.5mg/L，2,4-D的浓度为0.3mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且pH值为5.8～6.0。培养温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为16h/d，培养30天后，该小段继代苗生长至5～7cm，得到丛生芽，然后进行生根培养。
(5)将步骤(4)得到的丛生芽分成单株，接种于生根培养基中。生根培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加IBA、蔗糖和琼脂得到，其中IBA的浓度为0.3mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且pH值为5.8～6.0。培养温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为16h/d的条件下，生根培养20天得到生根苗。
(6)将步骤(5)得到的生根苗于出瓶前2周置于温室苗床上，保持环境温度为25±2℃，光照强度为1500～2000lx，进行过渡锻炼。采用容积比为草炭﹕蛭石﹕珍珠岩＝3﹕2﹕1的混合物作为基质。用常温清水洗去残留培养基，将清洗完毕的幼苗植入穴盘，常温清水饱和喷淋一次。期间使环境湿度保持在80％～90％之间，昼夜温度在20～25℃之间。1周以后，逐渐降低湿度。15天后炼苗完成，即可定植。
实施例1-2至实施例1-5
改变步骤(2)诱导培养基中的试剂种类与用量，观察不同激素组合对蒙桑萌发率和生长情况的影响。蔗糖和琼脂用量，以及培养方法同实施例1-1，结果见表1。
表1
从表1可看出，与实施例1-1相比，改变6-BA、IBA和PVP-40的加入浓度，蒙桑诱导苗的平均株高和生长情况均有所下降。因此对于诱导培养步骤，最适宜的诱导培养基配方是MS培养基+1.0mg/L的6-BA+0.5mg/L的IBA+500mg/L的PVP-40。
实施例1-6至实施例1-9
改变步骤(3)继代培养基中的试剂种类与用量，观察不同激素组合对蒙桑生长的影响。蔗糖和琼脂用量，以及培养方法同实施例1-1，结果见表2。结果采用求平均值的方法算出。
表2
从表2可看出，与实施例1-1相比，改变IBA和GA3的加入浓度，蒙桑继代苗的平均株高和茎节数均有所下降。因此对于继代培养步骤，最适宜的继代培养基配方是1/2MS培养基+0.5mg/L的IBA+3mg/L的GA3。
实施例1-10至实施例1-13
改变步骤(4)增殖培养基中的试剂种类与用量，观察不同激素组合对蒙桑生长的影响。蔗糖和琼脂用量，以及培养方法同实施例1-1，结果见表3。结果采用求平均值的方法算出。
表3
从表3可看出，与实施例1-1相比，改变6-BA和2,4-D的加入浓度，蒙桑丛生芽的增殖速率和平均株高均有所下降。因此对于增殖培养步骤，最适宜的增殖培养基配方是MS培养基+1.5mg/L的6-BA+0.3mg/L的2,4-D。
实施例1-14至实施例1-15
改变步骤(5)生根培养过程中的光照条件，其它培养方法同实施例1-1。观察对蒙桑生根率和生根条数的影响，结果见表4。
表4
从表4可看出，与实施例1-1相比，改变光照强度，蒙桑生根苗的生根率有所下降，生长情况有明显差异。因此对于生根培养步骤，最适宜的光照强度为2500～3000Lx。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种蒙桑种苗的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取蒙桑外植体并进行灭菌处理，得到无菌外植体；
(2)将所述无菌外植体接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到诱导苗；
(3)将所述诱导苗接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗；
(4)将所述继代苗接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到丛生芽；
(5)将所述丛生芽接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述外植体为蒙桑的休眠芽。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述灭菌处理为将所述外植体依次使用酒精溶液和氯化汞溶液浸泡后，然后用无菌水冲洗。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述诱导培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、PVP-40、蔗糖和琼脂得到，所述诱导培养基中6-BA的浓度为1.0mg/L，IBA的浓度为0.5mg/L，PVP-40的浓度为500mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述诱导培养基的pH值为5.8～6.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述诱导培养为将所述无菌外植体接种于诱导培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为1500～2000Lx、光照时间为10～14h/天的条件下进行培养20天以上，直至无菌外植体生长至3cm左右，得到诱导苗。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述继代培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加IBA、GA3、蔗糖和琼脂得到，所述继代培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，GA3的浓度为3mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述继代培养基的pH值为5.8～6.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述继代培养为将所述诱导苗接种于继代培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为15～17h/天的条件下进行培养30天以上，直至诱导苗生根并生长至5～7cm，得到继代苗。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述增殖培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、2,4-D、蔗糖和琼脂得到，所述增殖培养基中6-BA的浓度为1.5mg/L，2,4-D的浓度为0.3mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述增殖培养基的pH值为5.8～6.0；
优选地，所述增殖培养为从所述继代苗中切取带有一个腋芽的小段后，接种于增殖培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为15～17h/天的条件下进行培养30天以上，直至该小段继代苗生长至5～7cm，得到丛生芽。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述生根培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加IBA、蔗糖和琼脂得到，所述生根培养基中IBA的浓度为0.3mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述生根培养基的pH值为5.8～6.0；
优选地，所述生根培养为将所述丛生芽接种于生根培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为15～17h/d的条件下，生根培养20～25天，得到生根苗。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)结束后，还包括步骤(6)：将所述生根苗洗净后，在基质中培养15～20天得到移栽苗。
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| CN108575757A (zh) * | 2018-05-18 | 2018-09-28 | 安徽圣桑林业科技发展有限公司 | 一种果桑组织培养 |
Non-Patent Citations (2)
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