CN110604058B - 一种红花油茶幼胚的组培育苗方法 - Google Patents

一种红花油茶幼胚的组培育苗方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及本发明涉及植物生物工程领域，具体涉及一种红花油茶幼胚的组培育苗方法。红花油茶幼胚的组培育苗方法，包括：将红花油茶的果实幼胚子叶进行愈伤诱导培养、增殖和分化培养、生根及驯化培养；其中所述愈伤诱导培养采用暗培养方式，所述愈伤诱导培养采用的所述愈伤诱导培养基包括：NAA、Kt与TDZ的激素组合，氨基酸，有机添加物及防褐变剂，30‑70g/L蔗糖。所述方法可使红花油茶幼胚的诱导率及分化率明显得到提高，能快速培育大量的红花油茶幼苗，为油茶转基因提供受体材料。

Description

一种红花油茶幼胚的组培育苗方法
技术领域
本发明涉及植物生物工程领域，具体涉及一种红花油茶幼胚的组培育苗方法。
背景技术
红花油茶(Camellia Chekiangoleosa Hu)，山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物。红花油茶的种仁含油率高达61％，茶油中油酸的含量高达85％均显著高于普通油茶、攸县油茶、小果油茶、越南油茶等白花油茶物种。
茶油是我国特有的木本食用油料，其富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，有“东方橄榄油”之美誉，含有维生E、角鲨烯、甾醇等微量成分，是一种具有多种保健作用的功能性食用油。油酸称为“安全脂肪酸”，是评定食用油品质的重要指标。油酸易被人体吸收，能够降低低密度脂蛋白胆固醇水平，同时可预防及治疗动脉硬化，对心血管疾病、癌症、糖尿病等疾病有一定的预防作用。红花油茶种子含油率高、茶油品质优，是一种优质木本油料树种；同时其花红色，花形大而美丽，也是一种非常优良的园林观赏树种，具有广泛应用前景。
红花油茶资源分布大多处于野生或半野生状态，自然生境遭受人为因素破坏严重，接近濒危。由于自然繁殖率低，不利于红花油茶资源的挖掘和保护，急需一种新的能大量快速培育浙江红花油茶的培育方法。然而，采用现有的组配育苗方法培养红花油茶幼胚时，存在诱导率及分化率相对较低的缺陷。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种新的组培育苗方法。所述方法可使红花油茶幼胚的诱导率及分化率明显得到提高，能快速培育大量的红花油茶幼苗，为油茶转基因提供受体材料。
本发明所述红花油茶幼胚的组培育苗方法，包括：将红花油茶的果实幼胚子叶进行愈伤诱导培养、增殖和分化培养、生根及驯化培养；其中所述愈伤诱导培养采用暗培养方式，所述愈伤诱导培养采用的所述愈伤诱导培养基包括：NAA、Kt与TDZ的激素组合，氨基酸，有机添加物及防褐变剂，30-70g/L蔗糖。
本发明选择暗培养方式，相比光照培养更有利于诱导率的提高；同时选择NAA、KT和TDZ三种激素组合，结合高浓度蔗糖含量及氨基酸，有机添加物的共同作用，显著提高红花油茶幼胚的诱导率和分化率。
进一步地，所述暗培养过程包括：将幼胚切成小块，将子叶块接种到愈伤诱导培养基中进行暗培养。在一些可选的实施例中，子叶块接种量为10-20块/每皿。所述暗培养的条件：温度为23-27℃，每25-30d继代一次，50-60d获得胚性愈伤组织。
所述愈伤诱导培养基包括：MS培养基、0.2-0.8mg/L的NAA(1-naphthylaceticacid，萘乙酸)0.2-2.0mg/L的KT(6-Furfurylaminopurine，激动素)、1.0-2.0mg/L的TDZ(Thidiazuron，噻苯隆)、30-70g/L的蔗糖、7-10g/L的琼脂、100-500mg/L的水解酪蛋白、100-500mg/L的水解乳蛋白、50-200mg/L的脯氨酸、50-200mg/L甘氨酸、50-200mg/L的谷氨酰胺、40-100ml/L的椰子水，以及防褐变剂，pH为5.5-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的交联聚维酮、200-500mg/L的维生素C或5-20mg/L的硝酸银中的至少一种。
本发明通过暗条件诱导培养，在激素等组分的诱导下，使幼胚恢复全能性，再通过分化，获得大量的胚性愈伤组织。
本发明所述组培育苗方法中，所述增殖和分化培养采用先暗培养，再将分化出的子叶型体细胞胚和不定芽转移到光照条件下培养。其中所述暗培养的条件为：温度为23-27℃，每25-30d继代一次至分化出子叶型体细胞胚或不定芽。所述光照条件为：温度23-27℃，1900-2300lux光照15-18h，例如2000lux光照16h。
所述增殖和分化培养基配方包括：1/2的MS培养基，0.05-0.5mg/L的IBA(Indole-3-Butytric acid，3-吲哚丁酸)、1.0-3.0mg/L的6-BA(6-Benzylaminopurine，6-苄氨基嘌呤)、0.001-0.5mg/L的TDZ、30-80g/L的蔗糖、6-11g/L的琼脂、200-500mg/L的水解酪蛋白、200-500mg/L的水解乳蛋白、50-200mg/L的脯氨酸、50-200mg/L的甘氨酸、50-200mg/L的谷氨酰胺、40-100ml/L椰子水，以及防褐变剂，pH为5.5-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的PPVP、200-500mg/L的维生素C、1-20mg/L硝酸银中的至少一种。
研究发现，在合适的分化培养温度条件下，胚性愈伤组织分化繁育的速度较快，利于快速获得大量的不定芽体。而25-30d继代一次，避免由于培养基中的营养物质耗完，可保证胚性愈伤组织持续生长所需。将分化出的子叶型体细胞胚(愈伤组织)和不定芽转移到光照条件下继续培养，有利于子叶型体细胞胚的成熟和分化，有利于不定芽的生长。
本发明所述组培育苗方法中，所述生根及驯化培养是将增殖和分化培养得到的子叶型体细胞胚和不定芽分别进行；
子叶型体细胞胚的生根及驯化培养包括：将成熟的子叶型体细胞胚剥离下来接种到生根培养基进行生根培养；生根幼苗长至3-5cm后移栽到混合育苗基质中，覆上透光覆盖物进行驯化培养。
其中，所述生根培养的条件为：温度为23-27℃，1900-2300lux光照15-18h后，例如2000lux光照16h，培养25-35d至子叶型体细胞胚长出根。所述生根培养基包括：1/2的MS培养基、0.1-2.0mg/L的6-BA、0.01-0.5mg/L的IBA、0.01-1.0mg/LGA3、10-30g/L蔗糖、100mg/L的甘氨酸、100mg/L的谷氨酰胺、250mg/L的水解酪蛋白、250mg/L的水解乳蛋白以及2.3-2.6g/L植物凝胶，pH为5.5-5.8。
不定芽的生根培养包括：将长至2-4cm的不定芽或幼苗基部用生根剂浸泡后，移栽到已消毒的混合育苗基质中进行生根培养。培养时，覆上透光覆盖物。由于不定芽的生根和驯化同时进行，因此将不定芽的生根幼苗直接转移到常温大棚或苗圃地中，进行常规管理。
其中，所述生根培养条件为：湿度70％以上、温度18-28℃，1900-2300lux光照15-18h，例如2000lux光照16h，培养30d-50d，培养期间，浇施hogland营养液和水，至不定芽长出不定根。
所述生根剂选自浓度为0.1-0.6mg/L的ABT1、ABT2、ABT3、IBA、GGR6中的一种，不定芽在生根剂中浸泡5-45s，或10-40s。
通过生根培养，诱导子叶型体细胞胚或不定芽生根，同时通过光照培养，配合红花油茶的光周期；光照诱导叶绿体的形成，并完成光合作用，生长出来的根部完成营养物质的吸收，保证新长成的植株能自主完成新陈代谢。
在前述的一些实施例中，子叶型体细胞驯化培养和不定芽在生根培养中使用的混合育苗基质，均是由泥炭土：珍珠岩：蛭石按一定比例混合得到。泥炭土：珍珠岩：蛭石的比例可选的为3:0.5-1.5:0.5-1.5，例如为3:1:1。
本发明所述组培育苗方法还包括对红花油茶的果实幼胚子叶的前处理。
所述红花油茶的果实是在红花油茶开花后120-150d采集得到的。在一些实施例中，在6-7月间，采集开花后120-150d的红花油茶的果实带回实验室，在实验台上，用刀劈开采集得到的未成熟的红花油茶的果实。可选的，选择种皮颜色为白色或白中带有铁锈红色，质地柔软或稍硬的幼胚作为外植体材料。试验证明此状态的幼胚偏于灭菌和取出子叶，同时胚性愈伤诱导率较强。且由于幼胚种皮很软，直接用镊子就可以剥去，取材的速度更快更高效，消耗的乙醇、升汞和无菌水也更少。
在一些实施例中，消毒灭菌清洗果实幼胚的操作包括：用乙醇消毒，无菌水清洗3-4次；用HgCl2消毒并用无菌水清洗6-8次。
在实施例中，由于乙醇是很好且常用的消毒溶剂，通过乙醇能起到很好的消毒作用，同时也能清洗果实幼胚。然后通过无菌水清洗，避免乙醇长时间作用。在一些可选的实施方式中，乙醇的浓度为70-80％(v/v)，例如采用浓度为75％(v/v)的乙醇进行消毒，消毒的时间可选的为30-45s。
通过HgCl2消毒，将更多的细菌等杀死，保证幼胚的无毒状态。一方面是为了方便获得无毒的植株，另外一方面是避免在培养的过程中的细菌污染等问题。在一些可选的实施方式中，所用的HgCl2的浓度可选的为0.05-0.15％(m/m)，例如为0.1％(m/m)，消毒的时间可选的为8-10min。
本发明通过选取红花油茶的幼胚作为外植体，并通过诱导培养基诱导幼胚子叶产生胚性愈伤组织，然后通过增殖和分化培养基进行暗培养使得愈伤组织长出子叶型体细胞胚或不定芽体，将子叶型体细胞胚或不定芽体转移光照培养，将子叶型体细胞胚和不定芽分别培养，不仅能够诱导子叶型体细胞胚长出主根，同时使得不定芽体能自主进行营养物质的合成和生长而长出不定根，有效提高了育苗效率和生根效率。
本发明所取得有益效果如下：
本发明通过劈开红花油茶果实，获得红花油茶的幼胚，依次通过幼胚消毒、子叶切块、胚性愈伤诱导培养、增殖和分化培养和生根培养后，获得完整植株。相对现有技术，本发明外植体的取材和消毒操作更方便，速度更快更高效，同时减少了乙醇、升汞和无菌水的使用量。本发明胚性愈伤诱导培养和增殖和分化培养，均采用暗条件下的培养，激素搭配合理，同时加入了多种营养物质和降低愈伤组织褐化的硝酸银等，相对现有技术降低了愈伤组织的褐化率，提高了胚性愈伤组织、子叶型体细胞胚和不定芽的诱导率。不定芽浸泡生根剂后，移栽到混合基质中，进行瓶外生根和驯化，生根和驯化结合同时进行，提高了幼苗的生根率和移栽成活率，缩短了育苗周期。
本发明建立了一套红花油茶体胚发生体系，可用于红花油茶体细胞胚的长期保存和萌发培养；诱导出的胚性愈伤组织，原胚细胞团和体细胞胚可用于遗传转化、细胞工程和人工种子构建等方面的研究。本发明为红花油茶工厂化育苗提供了技术依据，并为红花油茶的遗传改良提供大量材料和奠定技术基础。
附图说明
图1为浙江红花油茶幼胚胚性愈伤诱导图；其中，a.愈伤块表面出现白色的体细胞胚，b.愈伤表面有球形和子叶型体细胞胚。
图2为胚性愈伤分化出子叶型体细胞胚和不定芽图；其中，a.胚性愈伤组织分化出子叶型体细胞胚，b.子叶型体细胞胚萌发出芽，c.胚性愈伤组织表面的体细胞胚萌发出不定芽，d.胚性愈伤组织分化出不定芽。
图3为体细胞胚和不定芽生根；其中，a.子叶型体细胞胚生根，b.子叶型体细胞胚长出的幼苗生根，c.不定芽继代培养，d.不定芽移栽到透明塑料杯中，e.不定芽幼苗放在育苗盆中生根和驯化培养，f.不定芽幼苗培养一个月后开始长出幼根。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种红花油茶幼胚的组培育苗方法，步骤如下：
1)外植体选择和消毒
6月至7月间，采集开花后120-150d的浙江红花油茶的果实带回实验室，用菜刀劈开取出幼胚。然后选择种皮颜色为白色或白中带有铁锈红色，质地柔软或稍硬的幼胚放入装有灭菌水的烧杯中。
在超净工作台中，幼胚用75％(v/v)的乙醇消毒30s，再用无菌水清洗3次，然后用0.1％(m/m)的HgCl2表面消毒8min，再用无菌水清洗6-8次。
2)愈伤组织诱导
用消毒过的镊子和解剖刀剥去幼胚的种皮，用解剖刀将子叶切成小块，将切面贴在愈伤组织诱导培养基表面进行接种。将接种好的培养皿放在培养室中进行暗条件诱导培养，温度为23-27℃，25-30d继代一次，得到红花油茶的胚性愈伤组织。
愈伤诱导培养基包括MS培养基、0.2mg/L的NAA、0.2mg/L的KT、1.2mg/L的TDZ、70g/L的蔗糖、8g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、5mg/L的硝酸银、100mL/L的椰子水，pH为5.6-5.8。
3)胚性愈伤组织增殖和分化培养
将胚性愈伤组织接种到胚性愈伤增殖和分化培养基中进行暗培养，培养温度为25℃±2℃，每25-30d继代一次至分化出子叶型体细胞胚或不定芽；然后分化出的子叶型体细胞胚(愈伤组织)和不定芽转移到光照条件下培养，1900-2300lux光照16h，温度为23-27℃。
增殖和分化培养基包括大量元素减至1/2的MS培养基、0.05mg/L的IBA、1.5mg/L的6-BA、0.005mg/LTDZ、30g/L蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、1g/L的交联聚维酮、5.0mg/L硝酸银、100mL/L椰子水，pH为5.8。
4)生根培养
将成熟的子叶型体细胞胚剥离下来接种到生根培养基进行生根培养，温度为23-27℃，1900-2300lux光照16h，培养25-35d至子叶型体细胞胚长出根，得到生根幼苗(如图3中a和b)。
子叶型体细胞胚的生根培养基为：1/2MS培养基、0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的IBA、0.3mg/LGA3、20g/L蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、250mg/L的水解乳蛋白以及2.3g/L植物凝胶，pH为5.6。
将生长至2-4cm的不定芽基部浸泡0.2mg/LIBA激素10-30s后，移栽到装有混合育苗基质(泥炭土：珍珠岩：蛭石为3:1:1)的透明塑料杯中进行生根和驯化培养，塑料杯口用保鲜膜封住，或者将塑料杯放在育苗盘上用塑料盖上，保持湿度70％以上，1900-2300lux光照16h，温度18-28℃，培养30d-50d，长出不定根((如图3中c、d、e和f))。
5)驯化和移栽
将子叶型体细胞胚的生根幼苗长至3-5cm后移栽混合育苗基质(泥炭土：珍珠岩：蛭石为3:1:1)育苗钵中，放入育苗盘上，将育苗盘上盖上透明塑料盖或盖上塑料拱棚，进行驯化培养，保持湿度70％以上，1900-2300lux光照16h，温度18-28℃，炼苗15d-20d后，移到常温大棚或苗圃地中,进行常规管理。
不定芽长出的幼苗的生根和驯化同时进行，生根后直接移栽到常温大棚或苗圃地中，进行常规管理。
实施例2
本实施例提供了一种红花油茶幼胚的组培育苗方法，其步骤及条件与实施例1相同，不同之处在于所使用的培养基不同，本实施例采用的培养基具体参照如下：
愈伤诱导培养基包括MS培养基、0.2mg/L的NAA、1.5mg/L的KT、2.0mg/L的TDZ、70g/L的蔗糖、8g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、100mg/L的脯氨酸、100mg/L的甘氨酸、100mg/L的谷氨酰胺、10mg/L的硝酸银、100mL/L的椰子水，pH为5.6-5.8。
增殖和分化培养基包括大量元素减至1/2的MS培养基、0.05mg/L的IBA、2.0mg/L的6-BA、0.005mg/LTDZ、30g/L蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、10.0mg/L硝酸银、100mL/L椰子水，pH为5.8。
子叶型体细胞胚的生根培养基为：1/2MS培养基、0.2mg/L的6-BA、0.1mg/L的IBA、0.2mg/LGA3、20g/L蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、250mg/L的水解乳蛋白以及2.4g/L植物凝胶，pH为5.6。
实施例3
本实施例提供了一种红花油茶幼胚的组培育苗方法，其步骤与实施例1相同，不同之处在于个别步骤的条件有所不同，所使用的培养基不同，本实施例采用的不同条件及培养基具体参照如下，未明确写明的实验步骤及条件请参见实施例1：
1)外植体选择和消毒
在超净工作台中，幼胚用75％(v/v)的乙醇消毒45s,再用无菌水清洗4次，然后用0.1％(m/m)的HgCl2表面消毒10min，再用无菌水清洗8次。
2)愈伤组织诱导
愈伤诱导培养基包括MS培养基、0.2mg/L的NAA、0.8mg/L的KT、1.2mg/L的TDZ、50g/L的蔗糖、8g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、10mg/L的硝酸银、100mL/L的椰子水，pH为5.6-5.8。
3)胚性愈伤组织增殖和分化培养
增殖和分化培养基包括大量元素减至1/2的MS培养基、0.1mg/L的IBA、2.0mg/L的6-BA、0.01mg/LTDZ、30g/L蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、10.0mg/L硝酸银、100mL/L椰子水，pH为5.8。
4)生根培养
子叶型体细胞胚的生根培养基为：1/2MS培养基、0.1mg/L的6-BA、0.2mg/L的IBA、0.5mg/LGA3、30g/L蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、250mg/L的水解乳蛋白以及2.3g/L植物凝胶，pH为5.8。
试验例
参考实施例1-3的方法进行再生植株的培养，观察子叶块暗条件诱导培养50d后的状态，具体观察情况如图1所示。可以观察到，子叶块诱导出胚性愈伤组织，子叶块表面有乳白色的球形体细胞胚或子叶型体细胞胚。根据统计，实施例1中，胚性愈伤诱导率为91.7％；实施例2中，胚性愈伤诱导率为96.3％；实施例3中，胚性愈伤诱导率为94.8％。
观察实施例1-3胚性愈伤组织增殖和分化的暗培养后的状态，具体观察情况如图2所示。可以观察到，胚性愈伤组织一部分分化出子叶型体细胞胚，一部分分化出不定芽。分化出的子叶型体细胞胚和不定芽转移到光照条件下培养后，子叶变绿并萌发出芽，不定芽增殖和伸长。根据统计，实施例1中，胚性愈伤组织的分化率为84.4％；实施例2中，胚性愈伤组织的分化率为90.5％；实施例3中，胚性愈伤组织的分化率为80.5％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种红花油茶幼胚的组培育苗方法，其特征在于，包括：将红花油茶的果实幼胚子叶进行愈伤诱导培养、增殖和分化培养、生根及驯化培养；其中：
所述愈伤诱导培养采用暗培养方式；
愈伤诱导培养基包括：MS培养基、0.2-0.8mg/L的NAA、0.2-2.0mg/L的KT、1.0-2.0mg/L的TDZ、30-70g/L的蔗糖、7-10g/L的琼脂、100-500mg/L的水解酪蛋白、100-500mg/L的水解乳蛋白、50-200mg/L的脯氨酸、50-200mg/L甘氨酸、50-200mg/L的谷氨酰胺、40-100ml/L的椰子水，以及防褐变剂，pH为5.5-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的交联聚维酮、200-500mg/L的维生素C或5-20mg/L的硝酸银中的至少一种；
所述增殖和分化培养采用先暗培养，再将分化出的子叶型体细胞胚和不定芽转移到光照条件下培养；
所述增殖和分化培养采用的增殖和分化培养基配方包括：1/2的MS培养基，0.05-0.5mg/L的IBA、1.0-3.0mg/L的6-BA、0.001-0.5mg/L的TDZ、30-80g/L的蔗糖、6-11g/L的琼脂、200-500mg/L的水解酪蛋白、200-500mg/L的水解乳蛋白、50-200mg/L的脯氨酸、50-200mg/L的甘氨酸、50-200mg/L的谷氨酰胺、40-100ml/L椰子水，以及防褐变剂，pH为5.5-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的PPVP、200-500mg/L的维生素C、1-20mg/L硝酸银中的至少一种；
所述生根及驯化培养包括子叶型体细胞胚的生根及驯化培养和不定芽的生根培养；
所述子叶型体细胞胚的生根及驯化培养包括：将成熟的子叶型体细胞胚剥离下来接种到生根培养基进行生根培养；生根幼苗长至3-5cm后移栽到混合育苗基质中，覆上透光覆盖物进行驯化培养；
所述生根培养基包括： 1/2的MS培养基、0.1-2.0mg/L的6-BA、0.01-0.5mg/L的IBA、0.01-1.0mg/LGA3、10-30g/L蔗糖、100mg/L的甘氨酸、100mg/L的谷氨酰胺、250mg/L的水解酪蛋白、250mg/L的水解乳蛋白以及2.3-2.6g/L植物凝胶，pH为5.5-5.8。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养中所述暗培养的条件为：温度为23-27℃，每25-30d继代一次，50-60d获得胚性愈伤组织。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖和分化培养中所述暗培养的条件为：温度为23-27℃，每25-30d继代一次至分化出子叶型体细胞胚或不定芽；
所述光照条件为：温度23-27℃，1900-2300lux光照15-18h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养的条件为：温度为23-27℃，1900-2300lux光照15-18h后，培养25-35d至子叶型体细胞胚长出根。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不定芽的生根培养包括：将长至2-4cm的不定芽或幼苗基部用生根剂浸泡后，移栽到已消毒的混合育苗基质中进行生根培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生根培养条件为：湿度70%以上、温度18-28℃，1900-2300lux光照15-18h，培养30d-50d，培养期间，浇施营养液和水，至不定芽长出不定根。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生根剂选自浓度为0.1-0.6mg/L的ABT1、ABT2、ABT3、IBA或GGR6中的一种，不定芽在生根剂中浸泡5-45s。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组培育苗方法还包括：
采集：所述红花油茶的果实是在红花油茶开花后120-150d采集得到的；
消毒灭菌清洗：先用乙醇消毒，清洗3-4次；再用HgCl2消毒并清洗6-8次。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，选择种皮颜色为白色或白中带有铁锈红色，质地柔软或稍硬的幼胚作为外植体材料。
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