CN115433740A - 一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法 - Google Patents

一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115433740A
CN115433740A CN202211281883.9A CN202211281883A CN115433740A CN 115433740 A CN115433740 A CN 115433740A CN 202211281883 A CN202211281883 A CN 202211281883A CN 115433740 A CN115433740 A CN 115433740A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ruby
callus
pdr5
culture medium
xyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211281883.9A
Other languages
English (en)
Inventor
王江英
汤雪燕
葛金涛
邵小斌
朱朋波
孙明伟
赵统利
华小平
葛徐芳
李先民
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lianyungang Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Lianyungang Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lianyungang Academy of Agricultural Sciences filed Critical Lianyungang Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202211281883.9A priority Critical patent/CN115433740A/zh
Publication of CN115433740A publication Critical patent/CN115433740A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法，该方法将木糖标记基因xylA构建到pDR5:RUBY表达载体上，以白花油茶未成熟胚为外植体材料进行遗传转化，一方面利用木糖代替潮霉素筛选，避免潮霉素对外植体的毒害作用；另一方面，利用RUBY进行红色显示标记进行原位观察，不用进行取样或试剂处理，有效规避了无菌材料被污染的风险，同时也减少外植体的损伤。最后，在遗传转化过程中添加适量的纳米硅，可以缓解外植体褐化以及激素沉积，促进愈伤组织的诱导增殖以及植株再生。

Description

一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法
技术领域
本发明涉及一种山茶属植物组织培养技术领域，特别是一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法。
背景技术
山茶属植物离体再生困难，转化效率低，最终转基因成功的报导极少。2005年范正琪研究发现卡那霉素、潮霉素对山茶愈伤组织诱导及生长有较大的影响，抗生素浓度较高时，愈伤组织容易褐变，分化状态不佳，因此未能获得再生植物。本实验前期以木糖筛选系统对杜鹃红山茶愈伤组织诱导及生长的影响进行了研究，发现25g/L的木糖浓度适合愈伤组织诱导及生长的筛选，然而后期通过RT-PCR检测不定芽，阳性率较低且芽体损伤不易生长。
报告系统已广泛应用于可视化基因表达、蛋白定位和其他细胞活动中，但常用的报告系统需借助特殊仪器设备或昂贵底物才得以观察。甜菜红素是一类可以由酪氨酸为底物经CYP76AD1、DODA和GT酶催化合成的植物天然产物。比如，甜菜、火龙果和其他植物中见到的鲜红色就是甜菜红素积累的结果。酪氨酸是各类生物最常用的氨基酸之一，因此若能使用酪氨酸作为底物来合成甜菜红素，并以甜菜红素作为报告分子，就可以避免外源底物的添加。研究发现，RUBY报告系统，将CYP76AD1，DODA和GT偶联到一个开放的阅读框中。利用RUBY报告系统，可以从产生的红色推断出特定基因的表达情况（赵云德，2020）。然而RUBY系统在遗传转化过程中使用的潮霉素抗性，如将此系统直接用于山茶属植物中依然会对外植体的愈伤诱导及不定芽的分化产生毒害作用。
可缓解外植体的褐化，吸收多余生长调节剂，促进愈伤组织的诱导增殖以及植株再生。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提出了一种有效规避无菌材料被污染的风险、减少外植体的损伤，可促进愈伤组织的诱导增殖以及植株再生的油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法。
本发明要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的，一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法，其特点是：
一．植物表达载体pDR5:RUBY-xylA构建
1.1载体材料
（1）pDR5:RUBY植物载体：细菌抗性为卡那霉素，植物抗性为潮霉素抗性；
（2）pGEM-T-xylA载体；
1.2植物表达载体pDR5:RUBY-xylA构建及重组载体鉴定
用Xho I酶分别酶切pDR5:RUBY和pGEM-T-xylA，回收pDR5:RUBY载体大片段和pGEM-T-xylA的小片段，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接大小片段；形成pDR5:RUBY-xylA的重组区域，具体为xylA替换pDR5:RUBY载体中潮霉素抗性基因（hygromycinphosphotransferase II, hptII）基因；由于hptII基因两端酶切位点均为XhoI，扩增xylA基因的上下游引物引入了XhoI酶切位点，因此xylA可能以正反两种方向插入到载体上；
重组载体鉴定时首先用XhoI酶切验证xylA基因的插入，在有xylA基因的插入的情况下：在pDR5:RUBY载体CaMV35S promoter末尾端设计的一条上游引物F2：5’-GATGTGATATCTCCACTGACG-3’，在CaMV35S polyA初始端设计一条下游引物R2：5’-AGCTTGTCGATCGACAGATC-3’，xylA基因片段正向插入时可扩增出预期1532 bp的条带，反向插入则无条带， 有正向插入的命名为：pDR5:RUBY-xylA，
1.3 pDR5:RUBY-xylA转化农杆菌EHA105及PCR检测
取-80℃保存的EHA105感受态于冰上自然融化，每100 μl感受态细胞加入1μlpDR5:RUBY-xylA质粒DNA，移液枪轻轻混匀，依次于冰上5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min，
加入1 ml LB无抗生素液体培养基于28℃，180 rpm震荡培养2~3 h；6000 rpm离心1 min收菌，留取100 μl上清轻轻吹打混匀菌块，于超净工作台涂布于含20 mg/L Rif和50mg/L Kan的LB平板上，倒置放于28℃培养箱2~3 d；
挑取单克隆菌落于5 ml 含20 mg/L Rif和50 mg/L Kan的LB液体培养基中28℃，180 rpm震荡培养24~36 h；提取菌液质粒，设计一对引物扩增RUBY全长序列， 其中上游引物RUBY-F: 5’-ATGGATCATGCGACCCTCGC-3’；下游引物RUBY-R: 5’-TCACTATCACTGGAGGCTTG-3’；
扩增出RUBY的CDS区域3939 bp，说明pDR5:RUBY-xylA质粒成功转化至农杆菌EHA105；
二. 外植体选择及消毒
2.1 材料选择
选择白花油茶未成熟果实作为外植体试验材料，采集时间每年8月下旬至9月初，果皮呈青绿色，种胚浅黄色，种皮质地软易去除，内部种胚乳白色；
2.2 消毒
选择发育良好的未成熟果实，洗涤剂搓洗表面灰尘，自来水反复冲洗至无泡沫，流水冲洗30 min，置于干净的培养瓶中；进行消毒：
三. 白花油茶遗传转化
3.1 pDR5:RUBY-xylA菌液培养及外植体侵染
在含50 mg/L Rif和50 mg/L Kan的LB固体培养基上活化含有pDR5:RUBY-xylA载体的EHA105菌株，28℃培养24~48 h；挑取单菌落于100 ml含有20 mg/L Rif 和50 mg/LKan的 LB液体培养基180 rpm摇菌培养；待OD600为0.4~0.6时取菌液50 ml，室温5000 rpm离心10 min，弃废液，用200 ml MS液体培养基重悬备用；
超净工作台中，将消毒后无菌的种胚切成2~4份置于重悬液中轻轻摇动，侵染5min，无菌水清洗3~5次，无菌滤纸吸干转接至共培养基中，28℃黑暗条件下共培养1~2 d；
3.2胚性愈伤组织诱导
共培养结束后，培养基中若有多余农杆菌生长，外植体用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干后转接至胚性愈伤诱导培养中进行选择培养；共培养中若无多余农杆菌生长则直接将外植体转接至选择培养基中；培养温度25℃，光照强度2500~3000 lx；每15 d继代1次，期间观察胚性愈伤组织出现和生长情况，培养条件同上；
胚性愈伤组织诱导过程为：外植体刚接种呈乳白色，培养10 d后由白色转变成乳黄色，切口边缘开始隆起，说明愈伤组织诱导开始启动；再经过15 d后，外植体蓬大生长，质地水润，呈乳黄色至浅绿色；接种50 d后，胚性愈伤组织逐渐增多，整体呈浅绿色至绿色，表面覆浅红色，中间夹杂红色；
3.3 胚状体诱导及不定芽产生
培养60 d的胚性愈伤组织再经1次继代培养后，体积逐渐膨大；将愈伤组织转接至胚状体诱导培养基中培养15 d，愈伤组织表面及其周围产生大量浅绿色至绿色体细胞胚，部分夹杂红色组织，体细胞胚呈球形、心型、鱼雷状和子叶状等多种形状，且多种相互重叠生长。胚状体诱导30 d，伴随体细胞胚的膨大，红色组织逐渐增多；将其转接至不定芽分化培养基中15~20 d后可诱导体细胞产生不定芽；
3.4 阳性愈伤检测
超净工作台中，将胚性愈伤、体细胞胚以及不定芽显示红色的部位用干净手术刀片轻轻切下，绿色组织为对照；液氮研磨后分别提取RNA，反转录成cDNA，利用上游引物RUBY-F: 5’-ATGGATCATGCGACCCTCGC-3’；下游引物RUBY-R: 5’-TCACTATCACTGGAGGCTTG-3’进行PCR扩增，以胚性愈伤、体细胞以及不定芽红色组织中均能扩增出RUBY基因条带，而绿色组织无条带。
本发明要解决的技术问题还可以通过以下技术方案来进一步实现，步骤2.2中所述消毒工艺包括：
（1）未剥果皮直接消毒
超净工作台中，利用75 %酒精震荡消毒5 min和0.1 %升汞处理15 min对外植体进行组合消毒，消毒结束后无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。用干净手术刀片切开果皮，取出种胚后轻轻剥去种皮，每个种胚切成2~4份；
（2）剥去果皮后消毒
超净工作台中，用干净手术刀片切开果皮，取出种胚，利用75 %酒精震荡消毒60s和0.1 %升汞处理8min对外植体进行组合消毒，消毒结束后无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，轻轻剥去种皮，每个种胚切成2~4份。
本发明要解决的技术问题还可以通过以下技术方案来进一步实现，步骤3.1中所述培养基组分为：MS+0.5 mg/L2,4-D+2.0 mg/L6-BA+ 20 mg/L纳米硅，其中MS培养基中添加蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L，灭菌前调pH至5.8，121 ℃高温高压灭菌20 min。
本发明要解决的技术问题还可以通过以下技术方案来进一步实现，步骤3.2中所述胚性愈伤组织诱导的选择培养基组分为：MS+0.5 mg/L2,4-D+2.0 mg/L6-BA+20 mg/LnSiO2； MS培养基为25g/L木糖+5g/L蔗糖，其中还添加100 ml/L CW、100 mg/L Gln、100mg/L Pro，琼脂7.5 g/L；培养基灭菌前调pH至5.8，121 ℃高温高压灭菌20 min。
本发明要解决的技术问题还可以通过以下技术方案来进一步实现，步骤3.3中所述胚状体诱导培养基组分为：MS+0.2 mg/LNAA+1.0 mg/L6-BA+20 mg/L nSiO2；不定芽分化培养基组分为：MS+0.5 mg/LNAA+2.25 mg/L6-BA+20 mg/L nSiO2；其中MS培养基为25g/L木糖+5g/L蔗糖，其是还添加100 ml/L CW、100 mg/L Gln、100 mg/L Pro，琼脂7.5 g/L；培养基灭菌前调pH至5.8，121 ℃高温高压灭菌20 min。
本发明与现有技术相比，将木糖标记基因xylA构建到pDR5:RUBY表达载体上，以白花油茶未成熟胚为外植体材料进行遗传转化，一方面利用木糖代替潮霉素筛选，避免潮霉素对外植体的毒害作用；另一方面，利用RUBY进行红色显示标记进行原位观察，不用进行取样或试剂处理，有效规避了无菌材料被污染的风险，同时也减少外植体的损伤。最后，在遗传转化过程中添加适量的纳米硅，可以缓解外植体褐化以及激素沉积，促进愈伤组织的诱导增殖以及植株再生。
附图说明
图1为pDR5:RUBY-xylA重组区域结构示意图；
图2 为pDR5:RUBY-xylA载体XhoI酶切验证（A）及xylA基因正反向插入检测（B）图；
图3 为pRUBY:DR5-xylA转化EHA105 PCR检测图；
图4 为白花油茶未成熟果实及种胚；
图5 为白花油茶胚性愈伤组织诱导图；
图6 为白花油茶胚状体诱导及不定芽分化图；
图7为 pRUBY:DR5-xylA白花油茶PCR检测图。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，而不构成对其权利的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法，
如图所示：
图1为pDR5:RUBY-xylA重组区域结构示意图；
图2 pDR5:RUBY-xylA载体XhoI酶切验证（A）及xylA基因正反向插入检测（B）；图中M: DL2000 DNA Marker; 1,2,4: 初步判断有xylA基因片段插入; 2,5: 非重组子; 6,8,9,10: xylA基因正向插入; 7: xylA基因反向插入; +: pDR5:RUBY质粒; -: ddH2O；
图3 pRUBY:DR5-xylA转化EHA105 PCR检测；图中M: DL 5000 DNA Marker; +1:pRUBY:DR5质粒; +2: pRUBY:DR5-xylA质粒; -: ddH2O; 1-6: pRUBY:DR5-xylA成功转入EHA105；
图4 白花油茶未成熟果实及种胚；图中a.未成熟果实; b.切开果皮; c. 揭下种胚; d. 种胚; e. 种皮柔软易去除；
图5 白花油茶胚性愈伤组织诱导；图中A: 外植体侵染接种0 d; B: 胚性愈伤组织诱导10 d; C: 胚性愈伤组织诱导25 d; D: 胚性愈伤组织诱导50 d；
图6 白花油茶胚状体诱导及不定芽分化；图中A:胚性愈伤诱导75 d; B: 体细胞胚诱导15 d; C: 体细胞胚诱导30 d; D: 体细胞胚分化出不定芽；
图7 pRUBY:DR5-xylA白花油茶PCR检测；图中M: DL 5000 DNA Marker; +1:pRUBY:DR5质粒; +2: pRUBY:DR5-xylA质粒; -1: ddH2O; -2: 绿色组织混样; 1:胚性愈伤红色组织; 2: 体细胞胚红色组织; 3: 不定芽红色组织。
具体步骤如下：
1．植物表达载体pDR5:RUBY-xylA构建
1.1载体材料
（1）pDR5:RUBY植物载体：由南京农业大学和玉兵老师馈赠，细菌抗性为卡那霉素（Kanamycin, Kan），植物抗性为潮霉素抗性（Hygromycin, Hyp）；
（2）pGEM-T-xylA载体：为本实验室前期构建保存。
1.2植物表达载体pDR5:RUBY-xylA构建及重组载体鉴定
用Xho I酶分别酶切pDR5:RUBY和pGEM-T-xylA，回收pDR5:RUBY载体大片段和pGEM-T-xylA的小片段，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接大小片段。
pDR5:RUBY-xylA的重组区域如图1所示，xylA替换pDR5:RUBY载体中潮霉素抗性基因（hygromycin phosphotransferase II, hptII）基因。由于hptII基因两端酶切位点均为XhoI，扩增xylA基因的上下游引物引入了XhoI酶切位点，因此xylA可能以正反两种方向插入到载体上。重组载体鉴定时首先用XhoI酶切验证xylA基因的插入，如图2A初步表明1、2、4号有xylA基因的插入。然后在pDR5:RUBY载体CaMV35S promoter末尾端设计的一条上游引物F2：5’- GATGTGATATCTCCACTGACG-3’，在CaMV35S polyA初始端设计一条下游引物R2：5’-AGCTTGTCGATCGACAGATC-3’，xylA基因片段正向插入时可扩增出预期1532 bp的条带，反向插入则无条带，图2B表明6、8、9、10号为xylA基因的正向插入重组子。
1.4 pDR5:RUBY-xylA转化农杆菌EHA105及PCR检测
取-80℃保存的EHA105感受态于冰上自然融化，每100 μl感受态细胞加入1μlpDR5:RUBY-xylA质粒DNA，移液枪轻轻混匀，依次于冰上5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min。加入1 ml LB液体培养基（无抗生素）于28℃，180 rpm震荡培养2~3 h。6000 rpm离心1 min收菌，留取100 μl上清轻轻吹打混匀菌块，于超净工作台涂布于含20 mg/L Rif和50 mg/L Kan的LB平板上，倒置放于28℃培养箱2~3 d。
挑取单克隆菌落于5 ml 含20 mg/L Rif和50 mg/L Kan的LB液体培养基中28℃，180 rpm震荡培养24~36 h。提取菌液质粒，设计一对引物扩增RUBY全长序列， 其中上游引物RUBY-F: 5’-ATGGATCATGCGACCCTCGC-3’；下游引物RUBY-R: 5’-TCACTATCACTGGAGGCTTG-3’。如图3表明，1~6号均可扩增出RUBY的CDS区域3939 bp，说明pDR5:RUBY-xylA质粒成功转化至农杆菌EHA105。
2. 外植体选择及消毒
2.2 材料选择
选择连云港本地白花油茶未成熟果实作为外植体试验材料，采集时间每年8月下旬至9月初，果皮呈青绿色，种胚浅黄色，种皮质地软易去除，内部种胚乳白色（图4）。
2.2 消毒
选择发育良好的未成熟果实，洗涤剂搓洗表面灰尘，自来水反复冲洗至无泡沫，流水冲洗30 min，置于干净的培养瓶中。可以采取两种方式进行消毒：
（1）未剥果皮直接消毒
超净工作台中，利用75 %酒精（C2H5OH）震荡消毒5 min和0.1 %升汞（HgCl2）处理15min对外植体（如图4a）进行组合消毒，消毒结束后无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。用干净手术刀片切开果皮，取出种胚后轻轻剥去种皮，每个种胚切成2~4份。
（2）剥去果皮后消毒
超净工作台中，用干净手术刀片切开果皮，取出种胚（如图4d），利用75 %酒精（C2H5OH）震荡消毒60s和0.1 %升汞（HgCl2）处理8min对外植体进行组合消毒，消毒结束后无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，轻轻剥去种皮，每个种胚切成2~4份。
3. 白花油茶遗传转化
3.1 pDR5:RUBY-xylA菌液培养及外植体侵染
在含50 mg/L Rif和50 mg/L Kan的LB固体培养基上活化含有pDR5:RUBY-xylA载体的EHA105菌株，28℃培养24~48 h。挑取单菌落于100 ml LB液体培养基（含有20 mg/LRif 和50 mg/L Kan）180 rpm摇菌培养。待OD600为0.4~0.6时取菌液50 ml，室温5000 rpm离心10 min，弃废液，用200 ml MS液体培养基重悬备用。
超净工作台中，将消毒后无菌的种胚切成2~4份置于重悬液中轻轻摇动，侵染5min，无菌水清洗3~5次，无菌滤纸吸干转接至共培养基中，28℃黑暗条件下共培养1~2 d。
其中共培养基组分为：MS+0.5 mg/L2,4-D+2.0 mg/L6-BA+ 20 mg/L纳米硅（nSiO2），其中MS培养基中添加蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L，灭菌前调pH至5.8，121 ℃高温高压灭菌20 min。
3.2胚性愈伤组织诱导
共培养结束后，培养基中若有多余农杆菌生长，外植体用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干后转接至胚性愈伤诱导培养中进行选择培养；共培养中若无多余农杆菌生长则直接将外植体转接至选择培养基中。培养温度25℃，光照强度2500~3000 lx。每15 d继代1次，期间观察胚性愈伤组织出现和生长情况，培养条件同上。
胚性愈伤组织诱导的选择培养基组分为：MS（25g/L木糖+5g/L蔗糖）+0.5 mg/L2,4-D+2.0 mg/L6-BA+20 mg/L nSiO2
其中MS培养基还添加100 ml/L CW（椰汁）、100 mg/L Gln（谷氨酰胺，Glutamine）、100 mg/L Pro（脯氨酸，Proline），琼脂7.5 g/L。培养基灭菌前调pH至5.8，121 ℃高温高压灭菌20 min。
胚性愈伤组织诱导过程如图5，外植体刚接种呈乳白色（图2A），培养10 d后由白色转变成乳黄色，切口边缘开始隆起，说明愈伤组织诱导开始启动（图2B）；再经过15 d后，外植体蓬大生长，质地水润，呈乳黄色至浅绿色（图2C）；接种50 d后，胚性愈伤组织逐渐增多，整体呈浅绿色至绿色，表面覆浅红色，中间夹杂红色（图2D）。
3.3 胚状体诱导及不定芽产生
培养60 d的胚性愈伤组织再经1次继代培养后，体积逐渐膨大（图6 A）。将愈伤组织转接至胚状体诱导培养基中培养15 d，愈伤组织表面及其周围产生大量浅绿色至绿色体细胞胚，部分夹杂红色组织（图6 B），体细胞胚呈球形、心型、鱼雷状和子叶状等多种形状，且多种相互重叠生长。胚状体诱导30 d，伴随体细胞胚的膨大，红色组织逐渐增多（图6 C）。将其转接至不定芽分化培养基中15~20 d后可诱导体细胞产生不定芽（图6D）。
胚状体诱导培养基组分为：MS（25g/L木糖+5g/L蔗糖）+0.2 mg/LNAA+1.0 mg/L6-BA+20 mg/L nSiO2
不定芽分化培养基组分为：MS（25g/L木糖+5g/L蔗糖）+0.5 mg/LNAA+2.25 mg/L6-BA+20 mg/L nSiO2
其中MS培养基还添加100 ml/L CW、100 mg/L Gln、100 mg/L Pro，琼脂7.5 g/L。培养基灭菌前调pH至5.8，121 ℃高温高压灭菌20 min。
3.4 阳性愈伤检测
超净工作台中，将胚性愈伤、体细胞胚以及不定芽显示红色的部位用干净手术刀片轻轻切下，绿色组织为对照。液氮研磨后分别提取RNA，反转录成cDNA，利用上游引物RUBY-F: 5’-ATGGATCATGCGACCCTCGC-3’；下游引物RUBY-R: 5’-TCACTATCACTGGAGGCTTG-3’进行PCR扩增，如图7可以看出，以胚性愈伤、体细胞以及不定芽红色组织中均能扩增出RUBY基因条带，而绿色组织无条带，由此说明RUBY基因的插入产生的红色标记可以鉴定为阳性。

Claims (5)

1.一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法，其特征在于：
构建
1.1载体材料
（1）pDR5:RUBY植物载体：细菌抗性为卡那霉素，植物抗性为潮霉素抗性；
（2）pGEM-T-xylA载体；
1.2植物表达载体pDR5:RUBY-xylA构建及重组载体鉴定
用Xho I酶分别酶切pDR5:RUBY和pGEM-T-xylA，回收pDR5:RUBY载体大片段和pGEM-T-xylA的小片段，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接大小片段；形成pDR5:RUBY-xylA的重组区域，具体为xylA替换pDR5:RUBY载体中潮霉素抗性基因（hygromycin phosphotransferase II,hptII）基因；由于hptII基因两端酶切位点均为XhoI，扩增xylA基因的上下游引物引入了XhoI酶切位点，因此xylA可能以正反两种方向插入到载体上；
重组载体鉴定时首先用XhoI酶切验证xylA基因的插入，在有xylA基因的插入的情况下：在pDR5:RUBY载体CaMV35S promoter末尾端设计的一条上游引物F2：5’-GATGTGATATCTCCACTGACG-3’，在CaMV35S polyA初始端设计一条下游引物R2：5’-AGCTTGTCGATCGACAGATC-3’，xylA基因片段正向插入时可扩增出预期1532 bp的条带，反向插入则无条带， 有正向插入的命名为：pDR5:RUBY-xylA，
pDR5:RUBY-xylA转化农杆菌EHA105及PCR检测
取-80℃保存的EHA105感受态于冰上自然融化，每100 μl感受态细胞加入1μl pDR5:RUBY-xylA质粒DNA，移液枪轻轻混匀，依次于冰上5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5min，
加入1 ml LB无抗生素液体培养基于28℃，180 rpm震荡培养2~3 h；6000 rpm离心1min收菌，留取100 μl上清轻轻吹打混匀菌块，于超净工作台涂布于含20 mg/L Rif和50mg/L Kan的LB平板上，倒置放于28℃培养箱2~3 d；
挑取单克隆菌落于5 ml 含20 mg/L Rif和50 mg/L Kan的LB液体培养基中28℃，180rpm震荡培养24~36 h；提取菌液质粒，设计一对引物扩增RUBY全长序列， 其中上游引物RUBY-F: 5’-ATGGATCATGCGACCCTCGC-3’；下游引物RUBY-R: 5’-TCACTATCACTGGAGGCTTG-3’；
扩增出RUBY的CDS区域3939 bp，说明pDR5:RUBY-xylA质粒成功转化至农杆菌EHA105；
外植体选择及消毒
材料选择
选择白花油茶未成熟果实作为外植体试验材料，采集时间每年8月下旬至9月初，果皮呈青绿色，种胚浅黄色，种皮质地软易去除，内部种胚乳白色；
2.2 消毒
选择发育良好的未成熟果实，洗涤剂搓洗表面灰尘，自来水反复冲洗至无泡沫，流水冲洗30 min，置于干净的培养瓶中；进行消毒：
白花油茶遗传转化
3.1 pDR5:RUBY-xylA菌液培养及外植体侵染
在含50 mg/L Rif和50 mg/L Kan的LB固体培养基上活化含有pDR5:RUBY-xylA载体的EHA105菌株，28℃培养24~48 h；挑取单菌落于100 ml含有20 mg/L Rif 和50 mg/L Kan的LB液体培养基180 rpm摇菌培养；待OD600为0.4~0.6时取菌液50 ml，室温5000 rpm离心10min，弃废液，用200 ml MS液体培养基重悬备用；
超净工作台中，将消毒后无菌的种胚切成2~4份置于重悬液中轻轻摇动，侵染5 min，无菌水清洗3~5次，无菌滤纸吸干转接至共培养基中，28℃黑暗条件下共培养1~2 d；
3.2胚性愈伤组织诱导
共培养结束后，培养基中若有多余农杆菌生长，外植体用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干后转接至胚性愈伤诱导培养中进行选择培养；共培养中若无多余农杆菌生长则直接将外植体转接至选择培养基中；培养温度25℃，光照强度2500~3000 lx；每15 d继代1次，期间观察胚性愈伤组织出现和生长情况，培养条件同上；
胚性愈伤组织诱导过程为：外植体刚接种呈乳白色，培养10 d后由白色转变成乳黄色，切口边缘开始隆起，说明愈伤组织诱导开始启动；再经过15 d后，外植体蓬大生长，质地水润，呈乳黄色至浅绿色；接种50 d后，胚性愈伤组织逐渐增多，整体呈浅绿色至绿色，表面覆浅红色，中间夹杂红色；
3.3 胚状体诱导及不定芽产生
培养60 d的胚性愈伤组织再经1次继代培养后，体积逐渐膨大；将愈伤组织转接至胚状体诱导培养基中培养15 d，愈伤组织表面及其周围产生大量浅绿色至绿色体细胞胚，部分夹杂红色组织，体细胞胚呈球形、心型、鱼雷状和子叶状等多种形状，且多种相互重叠生长；
胚状体诱导30 d，伴随体细胞胚的膨大，红色组织逐渐增多；将其转接至不定芽分化培养基中15~20 d后可诱导体细胞产生不定芽；
3.4 阳性愈伤检测
超净工作台中，将胚性愈伤、体细胞胚以及不定芽显示红色的部位用干净手术刀片轻轻切下，绿色组织为对照；液氮研磨后分别提取RNA，反转录成cDNA，利用上游引物RUBY-F:5’-ATGGATCATGCGACCCTCGC-3’；下游引物RUBY-R: 5’-TCACTATCACTGGAGGCTTG-3’进行PCR扩增，以胚性愈伤、体细胞以及不定芽红色组织中均能扩增出RUBY基因条带，而绿色组织无条带。
2.根据权利要求1所述的油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法，其特征在于：步骤2.2中所述消毒工艺包括：
（1）未剥果皮直接消毒
超净工作台中，利用75 %酒精震荡消毒5 min和0.1 %升汞处理15 min对外植体进行组合消毒，消毒结束后无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分；
用干净手术刀片切开果皮，取出种胚后轻轻剥去种皮，每个种胚切成2~4份；
（2）剥去果皮后消毒
超净工作台中，用干净手术刀片切开果皮，取出种胚，利用75 %酒精震荡消毒60s和0.1%升汞处理8min对外植体进行组合消毒，消毒结束后无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，轻轻剥去种皮，每个种胚切成2~4份。
3.根据权利要求1所述的油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法，其特征在于：步骤3.1中所述培养基组分为：MS+0.5 mg/L2,4-D+2.0 mg/L6-BA+ 20 mg/L纳米硅，其中MS培养基中添加蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L，灭菌前调pH至5.8，121 ℃高温高压灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法，其特征在于：步骤3.2中所述胚性愈伤组织诱导的选择培养基组分为：MS+0.5 mg/L2,4-D+2.0 mg/L6-BA+20 mg/L nSiO2； MS培养基为25g/L木糖+5g/L蔗糖，其中还添加100 ml/L CW、100mg/L Gln、100 mg/L Pro，琼脂7.5 g/L；培养基灭菌前调pH至5.8，121 ℃高温高压灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法，其特征在于：步骤3.3中所述胚状体诱导培养基组分为：MS+0.2 mg/LNAA+1.0 mg/L6-BA+20 mg/LnSiO2；不定芽分化培养基组分为：MS+0.5 mg/LNAA+2.25 mg/L6-BA+20 mg/L nSiO2；其中MS培养基为25g/L木糖+5g/L蔗糖，其是还添加100 ml/L CW、100 mg/L Gln、100 mg/L Pro，琼脂7.5 g/L；培养基灭菌前调pH至5.8，121 ℃高温高压灭菌20 min。
CN202211281883.9A 2022-10-19 2022-10-19 一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法 Pending CN115433740A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211281883.9A CN115433740A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211281883.9A CN115433740A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115433740A true CN115433740A (zh) 2022-12-06

Family

ID=84253148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211281883.9A Pending CN115433740A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115433740A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115812602A (zh) * 2022-12-19 2023-03-21 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种油茶高效组织培养及植株再生的方法
CN117158321A (zh) * 2023-10-20 2023-12-05 江苏北环生物科技有限公司 一种浙贝母组培扩繁外植体处理消毒方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080105064A (ko) * 2008-09-05 2008-12-03 아베스타겐 리미티드 자일로오스에 의한 형질전환 브라시카 준세아의 선택 및 재생 방법
CN102199619A (zh) * 2010-11-29 2011-09-28 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 一种利用红色荧光蛋白用做水稻转化筛选标记的转化方法
CN102433354A (zh) * 2011-11-15 2012-05-02 青岛农业大学 一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法
CN110604058A (zh) * 2019-10-17 2019-12-24 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种红花油茶幼胚的组培育苗方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080105064A (ko) * 2008-09-05 2008-12-03 아베스타겐 리미티드 자일로오스에 의한 형질전환 브라시카 준세아의 선택 및 재생 방법
CN102199619A (zh) * 2010-11-29 2011-09-28 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 一种利用红色荧光蛋白用做水稻转化筛选标记的转化方法
CN102433354A (zh) * 2011-11-15 2012-05-02 青岛农业大学 一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法
CN110604058A (zh) * 2019-10-17 2019-12-24 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种红花油茶幼胚的组培育苗方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HE等: "A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation", HORTICULTURE RESEARCH, vol. 7, 31 December 2020 (2020-12-31), pages 1 - 6 *
ZHANG等: "Direct and Indirect Somatic Embryogenesis Induction in Camellia oleifera Abel", FRONTIERS IN PLANT SCIENCE, vol. 12, 31 March 2021 (2021-03-31), pages 1 - 14 *
王江英等: "木糖筛选系统对杜鹃红山茶愈伤 组织诱导及生长的影响", 热带作物学报, vol. 36, no. 2, 31 December 2015 (2015-12-31), pages 321 - 328 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115812602A (zh) * 2022-12-19 2023-03-21 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种油茶高效组织培养及植株再生的方法
CN115812602B (zh) * 2022-12-19 2023-12-22 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种油茶高效组织培养及植株再生的方法
CN117158321A (zh) * 2023-10-20 2023-12-05 江苏北环生物科技有限公司 一种浙贝母组培扩繁外植体处理消毒方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5350246B2 (ja) トランスジェニック植物を作製する方法
CN115433740A (zh) 一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法
JP2002534129A (ja) ダイズ形質転換方法
Moghaieb et al. Shoot regeneration from GUS-transformed tomato (Lycopersicon esculentum) hairy root
CN107164374A (zh) 一种植物干旱诱导型人工合成启动子sp2及应用
CN100552034C (zh) 将基因导入到植物材料中的方法
CN105063086B (zh) 一种快速获得大量转基因佛甲草新品种的分子育种方法
CN102191269B (zh) 以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法
CN107475287B (zh) 一种茄子遗传转化方法
Tsvetkov et al. Gene transfer for stress resistance in grapes
JP3312867B2 (ja) 植物の形質転換方法および形質転換植物の作出方法
Sarker et al. Agrobacterium-mediated genetic transformation of two varieties of jute (Corchorus capsularis L.)
CN106978419B (zh) 矮牵牛花药早期特异表达启动子pPhGRP的鉴定及其应用
JP5334098B2 (ja) イネ属の植物を形質転換する方法
CN110699377A (zh) 一种花生转基因的方法
Burza et al. Cucumber (Cucumis sativus L.)
CN117925696B (zh) 柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法
JP6876877B2 (ja) 形質転換植物の作製方法及び形質転換剤
CN116286956B (zh) 一种发根农杆菌介导的大白菜转基因毛状根转化方法
CN115786232B (zh) 雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法
KR100799159B1 (ko) 아그로박테리움을 이용한 온주밀감의 체세포배발생캘러스의 형질전환 및 형질전환 식물체
Sando et al. A novel method for regenerating plants from mesophyll protoplasts of Arabidopsis thaliana line WS
CN117925696A (zh) 柱花草诱导转基因毛状根的方法及制备原生质体的方法
CN112746084A (zh) 一种单轮筛选全阳性的肉眼可视水稻基因筛选方法及基因
JPWO2006112034A1 (ja) 形質転換アイスプラントの作出方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination