KR20080105064A - 자일로오스에 의한 형질전환 브라시카 준세아의 선택 및 재생 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자일로오스를 유일한 탄수화물원으로 이용할 수 있는 능력에 근거하여 유전적으로 형질전환된 브라시카 준세아(Brassica juncea) 외식편의 선택 방법에 기반한 브라시카 형질전환체를 생성하는 개선된 방법을 개시한다. 상기 발명은 효소 자일로오스 이소머라아제의 발현을 위해 작제된 벡터에 의해 표적 숙주 식물체를 아그로박테리움 매개 형질전환에 의해 형질전환시키는 방법을 포함한다. 또한, 자일로오스를 유일한 탄소원으로 이용하는 대사적 이익을 수득하기 위해 상기 벡터에 의한 형질전환 후 추정적 형질전환체를 선택하는 방법이 개시된다. 본 발명은 음성 선택 방법의 단점을 경감시킨다. 선택을 위해 자일로오스 이소머라아제를 이용한 34-40%의 안정적인 형질전환 효율성이 보고된다.

브라시카 준세아, 양성 선택, 자일로오스.

Description

자일로오스에 의한 형질전환 브라시카 준세아의 선택 및 재생 방법{Method of selection and regeneration of transgenic Brassica jxmcea on xylose}

본 발명은 자일로오스를 유일한 탄수화물 원(source)으로 이용하는 능력에 근거하여 유전적으로 형질전환된 브라시카 준세아(Brassica juncea)의 외식편(explant)를 선택하는 방법에 기반한, 브라시카 형질전환체를 생성하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 효소 자일로오스 이소머라아제의 발현을 위해 작제된 벡터에 의한 표적 숙주 식물체의 아그로박테리움 매개 형질전환 방법을 포함한다. 또한, 자일로오스를 유일한 탄소원으로 이용하는 대사적 이익(metabolic advantage)을 수득하기 위해 상기 벡터에 의한 형질전환 후 추정적(putative) 형질전환체를 선택하는 방법이 개시된다. 본 발명은 음성 선택(negative selection) 방법의 단점을 완화시킨다. 선택을 위해 자일로오스 이소머라아제를 이용하여 34-40%의 안정된 형질전환 효율성이 보고된다.

형질전환 식물체의 생산은 종종 성공적으로 형질전환된 세포의 재생 및 생장을 가능하게 하는 선택 시스템의 이용을 필요로 한다. 목적 뉴클레오티드(nucleotide of interest: NOI) 또는 목적 유전자(Gene of Interest: GOI)가 형질전환에 의해 세포의 집단(population) 내로 도입되어야 하는 경우, 일부 세포들 이 성공적으로 형질변환되고, 즉, 소수의 세포들만이 NOI 또는 GOI를 수용한다. 형질전환된 세포는 형질전환되지 않은 상태로 남아있는 대다수 세포에 비해, 처리된 세포들 중 작은 분획을 구성하기 때문에, 특히, 형질전환률이 항상 낮기 때문에(10^-3 내지 10^-6) 선택 시스템은 선택 작용제(selective agent)의 존재 하에 형질전환 식물체를 회수할 확률이 선택 작용제의 부재시보다 더 크도록, 성공적으로 형질전환된 세포들을 선택하는 효율적인 스크리닝을 가능하게 해야 한다.

선택 과정은 목적 유전자와 함께 선택 마커의 도입에 의해 수행된다. 형질전환 과정에서 이 종류의 선택 마커의 이용은 형질전환된 세포에 선택적 우위(selective advantage)를 제공하여, 그들이 비-형질전환(non-transformed) 세포보다 더 빠르게, 더 잘 생장하게 하고, 비-형질전환 세포를 사멸시키는 것을 목적으로 한다.

이상적인 선택 마커 유전자는 다수의 식물 종에서 임의의 세포 또는 조직에서 발현될 수 있어야 한다. 이 발현은 식물 조직에서 임의의 내생 활성(endogenous activity)과 용이하게 구별되어, 형질전환되지 않은 조직으로부터 형질전환된 조직의 표현형을 식별할 수 있게 해야 한다. 재생 단계 동안, 죽어가는 비-형질전환 세포가 형질전환된 세포에 미치는 영향은 선택 배지에서 최소이어야 한다. 전술된 것 외에, 용이한 분석이 마커의 존재를 확인할 수 있어야 한다(ACNFP, 1994).

현재까지 확인된 선택 마커는 형질전환 식물 또는 세포가 형질전환 후 식별될 수 있게 하는 두 종류로 구별될 수 있다. 그들은 각각 선택 이익 또는 불이익 을 부여하는 양성 마커 및 음성 마커이다. 음성 선택은 도입된 DNA를 포함하지 않은 세포를 죽이고 항생제 및 제초제에 기반한 선택을 포함한다. 그들은 항생제 또는 제초제의 존재 하에 성장할 수 있는 능력에 의해 형질전환된 세포, 또는 조직 외식편의 선택을 가능하게 한다.

현재까지, 가장 광범위하게 이용되는 선택성 유전자는 아미노글리코시드, 항생제 카나마이신, 네오마이신 및 G418(Bevan et al. 1983)에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II(NPTII) 유전자(Fraley et al.1986)이다. 블레오마이신(Hille et al. 1986), 브로목시닐(Stalker et al. 1988), 클로람페니콜(Fraley et al. 1983), 2,4-디클로로페녹시아세트산(Streber and Willmitzer 1989), 글리포세이트(Shah et al. 1986), 히그로마이신(Waldron et al. 1985) 또는 포스피노트리신(De Block et al. 1987)에 대한 내성에 기반한 다수의 다른 선택 시스템이 개발되었다.

항생제 또는 제초제의 이용에 의존하는 음성 선택 방법은 다수의 단점을 갖는다. 항생제 독성에 의해 죽어가는 식물 세포들은 성장 저해제 및 독소를 분비하고, 이들은 형질전환된 세포에 부정적으로 영향을 미치고 그들의 생장을 저해하는 것으로 생각된다(Haldrup et al.1988a). 식물-독성 생성물(phyto-toxic product)의 존재 시 비-형질전환 세포들(non-transformed cells)이 사멸되고 합착 조직(coherent tissue)이 이용되는 경우, 비-형질전환 세포들의 사망이 형질전환된 세포들로의 영양분의 공급을 차단한다는 사실 또는 손상되거나 또는 사망하는 비-형질전환 세포들이 독성 화합물을 분비할 수 있다는 사실 때문에 형질전환된 세포 들도 사망할 위험이 있고, 따라서, 음성 시스템의 형질전환 효율성을 제한한다. 한, 음성 선택을 이용한 세포 또는 조직의 선택은 선택 과정과 관련하여 도입된 유전자의 발현의 정확한 시기조절(timing)을 요구한다. 형질전환 세포가 해독(detoxifying) 유전자가 발현되기 전 또는 독성 화합물의 작용을 경감시키기에 충분한 양의 유전자 생성물이 생성되기 전에 독성 화합물로 처리되는 경우, 형질전환 세포 및 비-형질전환 세포 모두 사망한다. 선택이 지연되는 경우, 형질전환 세포 또는 조직의 선택은 예를 들면, 형질전환 세포를 선택하기 위해 이용되는 화합물의 침투에 대한 장벽을 형성하는, 비-형질전환 세포 또는 조직으로부터의 신초(shoot) 또는 캘러스(callus) 형성에 의해 방해될 수 있다. 그들은 DNA 메틸화에서 게놈 전반의 변화(genome wide alteration)를 유발한다(Schmitt et al. 1997). 이 비-가역적 현상은 유전자 침묵(gene silencing)을 초래하고 형질전환 세포의 선택 및 식물 재생 과정을 저해하는 것으로 생각된다. 메틸화의 변화는 투여량 의존적이고, 서열 돌연변이를 초래할 수 있다(Bardini et al., 2003.)

섭취된 식물체 내의 항생제 내생 유전자의 존재는 환경적 우려의 문제이며, 주요한 우려는 상기 유전자들의 잠재적인 전달이 장내 미생물(gut microorganism)에 항생제 내성을 부여할 수 있다는 것이다. 기원이 원핵세포인 항생제 내성 마커 유전자의 서열과 수령체(recipient)의 DNA 서열 간의 상동성이 기원이 원핵세포인 장내 미생물에서 발견될 가능성이 더 높다. 따라서, 마커 유전자의 통합 및 발현 확률은 장 상피세포에서보다 장내 미생물에서 더 크다. 드문 전달(transfer) 사건이 선택 압력 하에서 매우 빠르게 증폭될 수 있다. 임상적으로 중요한 항생제에 대 한 내성을 부여하는 유전자가 일반적으로 상기 항생제에 의해 처리되는 병원성 미생물에 전달되어 발현된다면, 건강에 미치는 영향은 상당할 것이다. 그와 같은 생태학적 우려는 형질전환 식물체에서 항생제 내성 유전자의 이용에 대한 정부 규제를 초래할 수 있고, 따라서, 그와 같은 유전자에 의존하지 않는, 신규한 선택 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 유럽 연합은 2004년 말에 형질전환 식물 세포의 선택을 위한 항생제 내성 유전자에 대한 금지를 발효시켰고, 따라서, EU에서 판매될 미래의 유전적으로 강화된 식물체 및 식품들은 대안적인 선택 마커를 포함해야 할 것이다. 제초제 내성 유전자의 선택 마커로서의 이용의 경우도, 내성이 이종 교배(outcrossing)를 통해 농작물의 잡초 친족(weedy relative)으로 전달될 수 있는 가능성이 있다(Rieger et al.1999).

전술된 단점들은 작동 원리가 음성 선택의 반대인 양성 선택의 방법에 의해 상당한 정도까지 극복된다. 음성 선택과 대조적으로, 양성 선택은 형질전환된 세포들에게 선택 작용제인 특정한 탄소, 질소, 또는 성장 조절자를 이용하여 성장할 수 있는 능력을 부여한다(Joersbo and Okkels 1996; Bojsen et al. 1998; Haldrup et al 1998a). 형질전환 세포들은 그 세포들에 대사적 이익(metabolic advantage)을 부여하는 유전자를 수득하고, 반면에 비-형질전환 세포들은 사멸되기 보다는 아사된다.

본 발명에서 이용된 선택 방법은 선택 작용제를 이용하고, 상기 작용제는 다수의 식물 종에 의해 대사되지 않는, 탄수화물 자일로오스이다(Bojsen et al. 1994). 정상적으로 이용되는 탄수화물을 상기 화합물들 중 하나로 치환하는 것에 의해, 상기 화합물을 대사가능한 이성질체로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩하는 유전자에 의해 형질전환된 세포들은 성장에 유리하나, 비-형질전환 세포들은 아사하고, 그에 의해 상기 형질전환된 세포들에 대사적 이익을 제공한다. 자일로오스는 이 시스템에서 선택 마커로 작용하는 자일로오스 이소머라아제에 의해 자일룰로오스로 전환될 수 있다(Haldrup 1996). 양성 선택를 위한 이 마커 유전자들은 세포들의 비-형질전환 집단의 손상 또는 사멸(음성 선택) 없이 유전적으로 변형된 세포의 식별 및 선택을 가능하게 한다. 재생 과정 동안, 배양 배지에 영양소 원으로서 신규한 화합물의 첨가는 형질전환된 세포의 정상적인 성장 및 분화를 가능하게 하나, 반면에, 비-형질전환 세포는 성장할 수 없거나 또는 새로운 식물체(denovo plant)를 생성할 수 없을 것이다.

통상적으로 공지된 항생제 내성 유전자 또는 제초제 내성 유전자의 이용을 포함하지 않는 선택 방법을 이용하여 브라시카 형질전환체를 생성하는 방법이 본 발명에 개시된다. 브라시카 준세아(Brassica juncea) 종의 형질전환체를 선택하고 재생하는 방법이 기재되고, 구체적으로, 형질전환된 조직 외식편에 특정한 탄소원, 바람직하게는 자일로오스를 이용하는 능력을 부여하는 단계를 포함하는 양성 선택 방법이 예시되며, 형질전환된 외식편은 단순히 그들을 해당하는 선택 작용제를 함유하는 배지에 노출시키는 것에 의해 선택될 수 있다.

선행 기술은 선택 마커 유전자로서 써모에어로박테리움 써모술푸로게네스(Thermoaerobacterium thermosulfurogenes) 또는 스트렙토마이세스 루비기노수스(Streptomyces rubiginosus)로부터 분리된 자일로오스 이소머라아제 유전 자(xylA)를 이용하여 개발된 양성 선택 방법을 개시한다(Haldrup et al., 1998a;). 감자, 담배 및 토마토의 형질전환 식물체가 자일로오스-함유 배지에서 성공적으로 선택되었다. 본 명세서에 개시된 선택 방법은 인용된 선행 기술 문헌으로부터 구별될 정도로 명료하다. 본 발명은 구체적으로 브라시카 준세아 종에 속하는 형질전환 식물체 외식편의 양성 선택 방법을 목적으로 한다. 선택 마커 유전자는 스키조카이트리움(Schizochytrium)으로부터 분리되고 성공적인 형질전환 후 숙주 식물에서 그의 발현을 위해 적절하게 변형되었다.

선행 기술:

본 발명자들의 선행 출원은 형질전환 및 자일로오스를 유일한 탄소원으로 이용할 수 있는 능력에 기반하여 유전적으로 형질전환된 해바라기 외식편의 선택 방법을 개시한다.

"만노오스 또는 자일로오스 양성 선택(Mannose or Xylose positive selection)"이라는 명칭의 미국 특허 제5,767,378호는 하나 이상의 화합물을 포함하는 배지 상에서 또는 상기 배지에서 배양된 진핵 세포들의 집단에서, 형질전환의 결과 대사적 이익을 갖는 세포들을 식별 또는 선택하는 방법에 관한 것이다. 상기 발명은 형질전환된 사탕무 또는 감자 세포를 특이적으로 선택하는 기반을 제공한다. 전술된 선행 기술은 브라시카 준세아 자체의 양성 선택에 관한 본 발명과 대조적으로 사탕무 및 감자 세포에서의 양성 선택의 프로토콜을 청구한다. 형질전환 프로토콜은 각 식물 종마다 독특하다. 또한, 본 발명에 기재된 형질전환 방법은 인용된 선행 기술과 비교할 때 완전히 상이하다. 또한, 인용된 문헌 중 어떤 것도 브라 시카 준세아에서의 양성 선택에 기반한 형질전환 방법을 개시하지 않는다.

Haldrup 등 (1998)은 써모난에어로박테리움 써모술푸로게네스(Thermonanaerobacterium thermosulfurogenes)로부터의 자일로오스 이소머라아제 유전자는 D-자일로오스를 선택 작용제(selection agent)로 이용하여 형질전환 식물의 효과적인 선택을 가능하게 한다는 것을 확립했다(Plant Molecular Biology (1998), 37(2), 287-296). 상기 자일로오스 이소머라아제 유전자를 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 표적 식물로 이전시켰다. 최적화되지 않은(unoptimized) 선택에 관한 연구는 감자와 토마토에서, 자일로오스 이소머라아제 선택이 카나마이신 내성 선택보다 더 효율적이나, 담배 식물에서는 반대 효과가 관찰된다는 것을 보여주었다.

본 명세서에 개시된 선택 방법은 상기 인용된 종래 기술 문헌과 구별될 수 있을 정도로 충분히 명쾌하다. 일반적으로 알려진 항생제 또는 제초제 내성 유전자의 이용을 포함하지 않는 선택 방법을 이용하여 브라시카 형질전환체를 생성하는 방법이 개시된다. 또한, 브라시카 준세아 종의 형질전환체를 선택하고 재생하는 방법이 개시되고, 구체적으로 형질전환된 조직 외식편에 대안적인 탄소원, 바람직하게는 자일로오스를 이용할 수 있는 능력을 부여하는 단계를 포함하는 양성 선택 방법이 예시된다. 형질전환된 외식편은 단순히 그들을 상응하는 선택 작용제를 함유하는 배지에 노출시키는 것에 의해 선택될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 선택 마커는 해양기원 개체 스키조카이트리움(marine Organism Schiaochytrium)으로부터 분리되었고 상기 유전자는 숙주 식물체에서 유전자의 발현을 위해 코돈 최적화되었 다. 통상적으로 이용되는 hpt 히그로마이신 기반 선택 방법 대비 자일로오스 이소머라아제 XI를 이용하여 3-4배 더 많은 수의 유식물체(plantlet)가 관찰되었다. 통상적으로 이용되는 항생제 내성 또는 제초제 내성 선택 마커와 관련된 문제를 완화시키는 전술된 양성 선택의 방법을 이용하여, 35-40%의 안정적인 형질전환 효율이 보고되었다.

발명의 요약:

본 발명은 식물종 브라시카 준세아를 형질전환시키고, 자일로오스를 이용한 양성 선택 방법으로 형질전환체를 선택하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제1 양태에 따르면, 총 RNA의 분리 및 mRNA로부터 cDNA의 합성 방법이 제공된다. 일차 cDNA 라이브러리로부터 무작위로 선택된 EST 클론을 대상으로 PCR 증폭을 수행하고, 그에 의해 1481 bp의 ORF를 갖는 전장 자일로오스 이소머라아제(xylA) cDNA를 코딩하는 1.5 kb의 cDNA 클론의 식별을 가져온다.

또한, 본 발명의 추가적인 양태는 자일로오스 이소머라아제의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 양태는 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 표시된다.

본 발명의 특정한 양태는 스키조카이트리움으로부터 수득된 자일로오스 이소머라아제의 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유래된 자일로오스 이소머라아제에 대한 상동성 및 그의 pGEM-T Easy로의 클로닝을 개시한다.

또 다른 양태에 따르면, 자일로오스 이소머라아제의 서열은 9개의 뉴클레오티드의 치환을 위한 다중-부위 지향적 돌연변이생성(multi-site directed mutagenesis)에 상기 클론을 노출시켜 코돈 최적화되고 숙주 식물체에서 성공적으로 발현된다.

바람직한 일 양태에서, 상기 코돈-최적화된 유전자는 발현 벡터 내로 클로닝되고, 대장균에 형질변환되며, 자일로오스 이소머라아제 유전자의 전사 및 번역을 검출하는 실험이 기능의 증거를 위해 수행되었다.

그 후, 숙주 식물체 브라시카 준세아를 형질변환시키기 위해, 자일로오스 이소머라아제 유전자를 pCAMBIA에 클로닝한다.

본 발명의 매우 바람직한 양태에 따르면, 감염에 적합한 조건 하에서, 선택 마커 유전자를 포함하는 작제된 벡터의 숙주 식물 외식편으로의 아그로박테리움 매개 유전자 전달 및 선택 작용제를 포함하는 적합한 배지에서 함께 배양시 비-형질전환 세포에 형질전환 세포에 대사적 이익을 주는 양성 효과에 의한 형질전환 세포의 유도가 개시된다.

본 발명의 가장 유의성 있는 양태에 따르면, 배지에서 세포의 집단으로부터 하나 이상의 유전적으로 형질전환된 세포를 선택하기 위한 선택 시스템으로서, 상기 하나 이상의 유전적으로 형질전환된 세포는 상기 배지 내에 존재하는 성분 또는 그의 전구체를 전환할 수 있는 발현 생성물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 것인 시스템이 개시된다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 언급되는 선택 성분은 자일로오스이다. 용어 "세포(cell)"는 개별적인 유전적으로 형질전환된 세포들이 본 발명의 방법을 이용하여 식별되고 분리될 수 있는 임의의 종류의 세포를 의미하도록 의도된다.

개시된 형질전환 방법으로부터 보고된 형질전환 효율은 34-40%이고, 재생 효율성은 공지된 히그로마이신 기반 방법보다 3-4배 더 높다.

발명의 상세한 설명:

용어 "선택 마커 유전자(selectable marker gene)"는 바람직하게는 목적 유전자와 함께 도입된 임의의 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 상기 선택 마커 유전자에 의해 형질전환된 세포에 선택적 이익(selective advantage)이 부여된다.

용어 "마커 화합물(marker compound)" 또는 "선택 작용제(selective agent)"는 성공적으로 형질전환된 세포들만이 대사할 수 있고, 상기 선택 마커 유전자의 형질전환 및 발현에 의해 비-형질전환 세포 대비 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "선택적 이익(selective advantage)"은 용어 선택적(selective), 대사적(metabolic) 및 생리적(physiological) 이익을 포함하고 형질전환된 세포가 불리한 조건을 가진(비-형질전환) 세포보다 더 빠르게 성장할 수 있거나, 또는 불리한 조건을 가진 세포들이 이용할 수 없는 기질(예를 들면, 영양소 전구체 등)을 유리하게 이용할 수 있다는 것을 의미한다.

용어 "선택하는(selecting)"은 본 발명의 방법을 이용하여 비-유전적 형질전환 세포(non-genetically transformed cell)로부터 유전적 형질전환 세포를 식별 및/또는 분리하는 방법을 의미한다.

용어 "유전적으로 형질전환된(genetically transformed)"은 재조합 DNA 기법을 이용한 형질전환을 포함한다.

용어 "벡터(vector)"는 발현 벡터 및 형질전환 벡터를 포함한다.

도 1. SC-1 불포화효소(desaturase)의 1.5kb 서열에서 완전한 자일로오스 이소머라아제 도메인

도 2. SC-1으로부터의 모티프의 자일로오스 이소머라아제 도메인에 대한 상동성

도 3. pGEX-XI의 맵. 자일로오스 이소머라아제 유전자를 pGEX의 BamHI과 XhoI 부위 사이에 클로닝하였다.

도 4. 대장균에서 자일로오스 이소머라아제의 유도. XI 프라이머에 의한, 형질전환된 SEA 외식편의 증폭. 래인: I: 유도됨; U: 유도되지 않음; 1,2,3: 자일로오스 이소머라아제 유전자를 갖는 상이한 클론; M: 분자량(MW) 마커.

도 5. A. 자일로오스 이소머라아제 클론으로부터 ORF의 증폭. B. pCAMBIA-XI의 XhoI에 의한 처리(restriction). XhoI 부위로부터 hpt 유전자의 방출에 주목한다.

도 6. pCAMBIA-CO-XI에서 XI에 의한 hpt의 치환.

도 7. A) 수크로오스(35gm/l) B) D-자일로오스(30gm/l) 및 C) 탄소원 불포함 배지에서 배양된 브라시카 준세카 자엽병(Brassica juncea cotyledonary petiole) 외식편.

도. 8. A) 3주의 선택; B) 6주의 선택 후, pCAMBIA-CO-XI 및 pCAMBIA 1380으로 형질전환되고 각각 자일로오스(25g/l)+수크로오스(5gm/l) 및 히그로마이신(25mg/l)에서 배양된 자엽병 외식편의 발아 비교.

도. 9. pCAMBIA+XI 작제물로 형질전환된 외식편에서 양성 선택을 이용한 형질전환 신초(shoot)의 선택 및 재생.

도. 10. XI 프라이머에 의한 형질전환 자엽병 외식편의 증폭.

pCAMBIA1301-XI를 갖는, 선택된 유식물체의 게놈 DNA 100 ng을 XI 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 래인 1: dl5 플라스미드 DNA; 래인 2-6 및 8-13: 상이한 외식편으로부터의 DNA 시료; M: 1 kb 래더.

도. 11. 브라시카 준세아 변종 "바루나"(Brassica juncea var "Varuna") 자일로오스 이소머라아제 양성 식물체.

도. 12. XI 양성 T₀ 식물체의 T₁ 종자의 게놈 DNA의 증폭.

T₁ 종자로부터 분리된 게놈 DNA 100 ng을 XI 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 래인 1: 마커(1Kb), 래인 2-7: 6개의 별개의 꼬투리(pod)의 종자로부터의 XI 유전자의 증폭된 생성물(1.32 kb), 래인 8: 양성 대조구, 래인 9: 마커.

서열목록의 간단한 설명:

서열번호 1: SC1의 자일로오스 이소머라아제 전사체의 전장 서열

서열번호 2: SC1의 자일로오스 이소머라아제의 번역된 단백질 서열

서열번호 3: 식물에서의 발현을 위한 최적화 후 자일로오스 이소머라아제의 서열

서열번호 4: pCAMBIA 벡터 내에 프레임내(in frame) 융합된 SC1의 전장 코돈 최적화 자일로오스 이소머라아제 전사체(full-length codon optimized Xylose isomerase transcript)의 서열.

실시예: 1

트라우스토카이트리드(Thraustochytrid) 변종 SC-1으로부터의 자일로오스 이소머라아제의 클로닝.

고아(Goa) 주의 배수에서 분리된 트라우스토카이트리드인 스키조카이트리움(Schizochytrium) SC-1의 3일 배양물로부터 전체 RNA를 분리하였다. 수퍼스크립트 Rnase(GibcoBRL)를 이용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 pSPORTl 벡터의 NotI-SalI 부위로 클로닝시키고 대장균 DHlOB에 형질전환시켰다.

일차 cDNA 라이브러리는 2 x 106개의 클론으로 구성되고, 증폭된 라이브러리는 2 x 1010 클론/ml의 역가(titer)를 가졌다. EST 클론을 무작위로 선별하고, 삽입물을 SP6 및 T7 프라이머로 증폭시켰다. 2000개의 cDNA 클론의 5'-말단을 무작위로 선택하고 T7 프라미어로 서열을 결정하였다. SC-1의 cDNA 라이브러리로부터의 클론의 5' 말단 서열결정은 158 bp의 5' UTR 및 30 bp의 3' UTR을 갖는 1511 bp의 전장 자일로오스 이소머라아제(xylA) cDNA를 코딩하는 1.5 kb의 cDNA 클론의 식별을 가져왔다. 상기 cDNA는 1481 bp의 ORF를 갖는다.

CDS의 서열이 서열번호 1로 주어진다. CDS의 서열은 SC-1의 전장 자일로오스 이소머라아제 전사체의 서열이다. 상기 서열은 440개의 아미노산으로 구성된 단백질로 번역된다. 상기 번역된 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시된다. 상기 서열은 아라비돕시스 탈리아나( Arabidopsis thaliana )의 자일로오스 이소머라아제에 74%의 상동성(homology)을 보인다. 상기 서열은 완전한 자일로오스 이소머라아제 도메인을 포함하며 SC-1의 자일로오스 이소머라아제로 표시된다. SC-1 불포화효소의 1.5kb 서열에서 완전한 자일로오스 이소머라아제 도메인의 존재가 도 1에 도시된다.

도 2는 SC-1으로부터의 모티프의 자일로오스 이소머라아제 도메인에 대한 상동성을 나타낸다.

실시예: 2

자일로오스 이소머라아제의 코돈 최적화

SC-1의 자일로오스 이소머라아제(xylA) 서열은 식물에서 비교적 드물게 사용되는 코돈을 사용한다; SC-1은 아르기닌을 코딩하기 위해 주로 CGC를 이용하나, Arg에 대한 식물 코돈의 9% 만이 CGC이다. 따라서, CGC 코돈을 아르기닌에 대한 보다 빈번하게 사용되는 코돈으로 치환하였다. 식물로 도입하기 전에 9개의 뉴클레오티드를 치환하기 위해 클론에 2회의 다중-부위 지향적 돌연변이 생성(multi-site directed mutagenesis)을 수행하였다. 최적화된 서열은 서열번호 3으로 표시 된다.

실시예: 3

자일로오스 이소머라아제의 pGEX 발현 벡터로의 클로닝

코돈 최적화된 유전자가 전사되고 번역된다는 것을 확인하기 위해, pSPORTl로부터의 코돈 최적화된 SC-1 XylA 유전자를 BamHI 부위를 포함하는 정방향 프라이머 (5'GCGCGGATCCATGGGTGAATTCTTTC3') 및 XhoI 부위를 갖는 역방향 프라이머 (5'GAAACTCGAGCTTGTCGATTAAGAAATGTATTGGTT3')로 증폭시켰다. 증폭된 PCR 생성물(1323)을 BamHI 및 XhoI으로 처리하였다. pGEX-4T-3은 26-kDa 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(tac 프로모터의 제어 하에 있는 GST)를 갖는 융합단백질로서 단백질을 발현하기 위해 이용되는 발현 벡터이다. pGEX-4T-3을 BamHI 및 Xhol으로 처리하고 PCR 생성물(BamHI 및 XhoI으로 처리됨)을 상기 두 부위 사이에 방향성 있게(directionally) 클로닝하였다- 결과물인 클론을 pGEX-XI으로 지칭했다. pGEX-XI의 맵이 도 3에 도시된다.

대장균에서 자일로오스 이소머라아제 융합 단백질의 발현

자일로오스 이소머라아제 유전자를 갖는 pGEX-XI을 대장균 BL21에 형질전환시켰다. 형질전환된 세포들을 lOO㎍/ml의 암피실린을 포함한 LB 배지 상에서 선택하였다. 무작위로 콜로니를 채취하여 lOO㎍/ml의 암피실린을 포함한 LB 배지에서 밤새 배양시켰다. 상기와 같이 밤새 배양한 배양물의 1%를 lOO㎍/ml의 암피실린을 포함한 5 ml의 LB 배양액을 접종하기 위한 개시 배양물(starter culture)로 이용하였다. 배양액을 O.D. 600이 약 0.6-0.7에 도달할 때까지 인큐베이션하였다. 상기 각 배양액의 2ml를 1mM IPTG로 3시간 동안 유도시켰다. 동시에, 2 ml의 배양액을 대조구로서 유도 없이 펠릿으로 침전시켰다. 세포 펠릿을 lOO㎕ 시료 완충액에 재현탁시키고 50ul를 10% SDS-PAGE 겔에 로딩시켰다. 유도는 도 4에 도시된다.

클론 1 및 2의 유도된 세포에서 GST-자일로오스 이소머라아제 융합 단백질의 예상되는 크기인 76 KDa의 단백질을 관찰하였으나, 유도되지 않은 세포에서는 관찰되지 않았다. 따라서, 코돈 최적화된 자일로오스 이소머라아제는 올바른 판독 프레임으로 존재하고 전사되고 번역되었다.

대장균에서 자일로오스 이소머라아제 유전자의 기능의 증거

대장균 균주 AB477(proA2, his-4, aroCl, thi-1, lacYl, galK2, xyl-5, mtl-1, lambda^-supE44)은 자일로오스 이소머라아제(XyIA) 결함 균주이다(Haldrup et at., 1998 & 2001). 돌연변이체에서 자일로오스 이소머라아제 유전자의 보완(compelementation)은 이 균주가 자일로오스를 이용하여 성장할 수 있게 하여, 그에 의해 그 기능을 입증할 것이다. 대장균 균주 AB477은 E.coli Genetic Stock Center, USA로부터 수득했다. pGEX-4T-3에 있는 자일로오스 이소머라아제 유전자를 암피실린(lOO㎍/ml)과 함께 l%(w/v) D-자일로오스를 함유하는 MacConkey 아가 플레이트 상에 플레이팅된 대장균 균주 AB477의 적격세포(competent cell)로 형질 전환시켰다. XylA 유전자를 갖는 형질전환체는 D-자일로오스를 발효할 수 있고 자일로오스를 함유한 MacConkey 아가 플레이트 상에서 적색으로 보인다.

AB477 숙주 세포, pGEX4T-3으로 형질전환된 세포 및 pGEX-XI로 형질전환된 세포를 각각 암피실린(lOO㎍/ml)을 함유한 MacConkey 배지 및 자일로오스(1% w/v) 및 암피실린(lOO㎍/ml)을 함유한 배지에 플레이팅하였다. 자일로오스를 함유한 배지에서 pGEX-XI를 갖는 적색 콜로니를 수득하였으나, 숙주 세포 및 pGEX4-T3을 갖는 AB477은 상기 배지에서 성장하지 않았다. 따라서, SC-1으로부터 분리된 코돈 최적화된 자일로오스 이소머라아제 유전자는 번역되었고 기능을 발휘했다.

실시예: 4

자일로오스 이소머라아제의 pCAMBIA로의 클로닝

pCAMBIA-1301은 pPZP 벡터로부터 유래되었다. 상기 벡터는 CaMV35S 프로모터 하에 있고 CaMV35S 폴리A 신호에 의해 종료되는 히그로마이신 포스포-트랜스퍼라아제(hpt)를 포함한다. 상기 유전자는 히그로마이신에 대한 저항성을 제공하여 형질전환된 세포가 히그로마이신 함유 배지에서 선택될 수 있게 한다.

각각 XhoI 부위를 포함하는 정방향 프라이머(5' CTCTCTCGAGCAACCATGGGTGAATTCTTTCC 3') & 역방향 프라이머 (5'GAAACTCGAGCTTGTCGATTAAGAAATGTATTGGTT 3')를 이용하여 pSPORT에 있는 코돈 최적화된 자일로오스 이소머라아제(XylA) 유전자의 ORF를 증폭시켰다. 증폭된 단편을 XhoI으로 처리하였다. pCAMBIA-1301을 동시에 XhoI로 처리하여 hpt 유전자를 방출시키고 아가로오스 겔로부터 정제된 벡터를 상기 증폭된 단편에 라이게이션시켰다. 자일로오스 이소머라아제 클론으로부터의 ORF의 증폭 및 pCAMBIA-XI의 XhoI에 의한 처리(restrictoin)가 도 5에 도시된다.

라이게이션 믹스를 DHlOB로 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니를 채취하고 이 콜로니로부터 분리된 플라스미드를 XI 프라이머로 증폭시키고 동일한 프라이머로 서열을 결정하였다. 따라서, 올바른 배향 및 올바른 프레임으로 XI 유전자를 갖는 작제물을 확인하였다. 올바른 프레임으로 클로닝된, 상기 유전자의 서열이 서열번호 4로 주어진다.

도 6은 pCAMBIA 벡터에 프레임내(in frame)로 내포된 SC-1의 전장 코돈 최적화된 자일로오스 이소머라아제 전사체의 서열 및 pCAMBIA-CO-XI에서 hpt의 XI에 의한 치환을 도시한다. 벡터 pCAMBIA1301의 XhoI 부위들 사이에 클로닝된 히그로마이신 포스포-트랜스퍼라아제를 코딩하는 hpt 유전자가 히그로마이신 대신 코돈 최적화된 자일로오스 이소머라아제에 의해 치환되었고, 결과적으로 수득된 작제물을 pCAMBIA-XI로 명명하였다.

실시예 5

자일로오스 이소머라아제를 양성 선택 마커로 이용한 브라시카의 형질전환

형질전환에 의해 유전 물질을 세포 집단에 도입하려는 경우, 일부 세포들만이 성공적으로 형질전환된다는 것이 알려져 있다. 형질전환된 세포의 식별 및 선택은 전통적으로 음성 선택에 의해 이루어졌으며, 음성 선택에 의하면, 형질전환된 세포들은 그들이 분해할 수 있는 작용제를 함유한 배지에서 생존할 수 있으나, 비-형질전환 세포는 상기 배지에서 사멸된다. 히그로마이신은 가장 일반적으로 이용되는 항생제이고, 형질전환을 위해 이용된 작제물에서 히그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자(hpt)는 상기 항생제를 함유한 배지에서 성장한 형질전환세포에 내성을 제공한다. 카나마이신 및 제초제(포스피노트리신) 내성이 브라시카 형질전환체의 선택을 위해 이용되는 다른 마커들이다.

이 음성 선택 방법들은 일부 단점들을 갖는다. 비-형질전환 세포들은 성장 배지에서 항생제의 존재 때문에 죽을 수 있고, 그들은 배지로 독소를 배출할 수 있으며, 상기 독소는 형질전환된 세포에도 저해 효과를 발휘하며(inhibitory) 독성을 갖는다. 더욱이, 섭취되는 식물 및 미생물에서 항생제 내성 유전자의 존재는 환경 단체 및 정부 당국들에게 우려 사항이다. 또한, 음성 선택을 이용한 세포 또는 조직의 선택은 선택 과정과 관련하여 도입된 유전자의 발현의 정확한 시기조정을 필요로 한다. 해독 유전자(detoxifying gene)가 발현되기 전에, 또는 독성 화합물의 작용을 경감시키기 위해 충분한 유전자 생성물이 생성되기 전에, 형질전환 세포가 독성 화합물로 처리되는 경우, 형질전환 세포 및 비-형질전환 세포가 모두 사망한다. 선택이 지연되는 경우, 형질전환 세포 또는 조직의 선택이 예들 들면, 형질전환된 세포를 선택하기 위해 이용되는 화합물의 침투에 대한 장벽을 형성하는, 비-형질전환 세포 또는 조직으로부터의 신초 또는 캘러스 형성에 의해 방해될 수 있다.

전술된 단점들은 집단 내에서 비-형질전환 세포를 손상시키거나 또는 사멸시 키지 않으면서 항생제 또는 제초제 저항 유전자의 도입 없이 형질전환 세포를 선택적으로 성장시킬 수 있게 하는 양성 선택의 방법에 의해 상당한 정도까지 극복된다.

다수의 식물 종들은 자일로오스를 대사하는 선천적 능력을 갖지 않아서, 자일로오스가 유일한 탄소원인 배지에서 증식하지 못한다. 자일로오스 이소머라아제를 선택 마커로 갖는 작제물에 의한 그와 같은 종들의 형질전환은 형질전환된 세포에 자일로오스를 탄소원으로 이용하는 능력을 부여할 것이다.

브라시카 준세아에서 형질전환 및 선택:

식물 물질:

본 연구를 위해, 본 발명자들은 145-155 cm의 식물체 신장을 가지며, 똑바로 서고, 견고하며, 적당히 분지된, 바라나시 지역에서 선택된 브라시카 준세아 변종. '바루나'를 이용했다. 그 잎들은 크기가 중간이고, 암녹색이며, 잎의 기부는 보라색 색소를 가지며 하부 표면상에 털이 드문드문 있다. 바루나는 반점병(Alternaria blight) 및 진딧물(Aphids)에 적당하게 내성을 갖는다. 바루나는 43%의 오일 함량(21% 리놀레산) 및 20-22 qtls/ha의 수율을 갖는 중기 변종(medium duration variety)(135-140일)이다.

브라시카 준세아 '바루나'(Brassica juncea 'varuna' )의 종자를 70% 알코올로 2분간 및 0.1% 염화제2수은(Mercuric Chloride)으로 5분간 멸균시켰다. 상기 멸균된 종자를 멸균수로 4-5회 강하게 세척하고, 뒤이어 압지(blotting)에 의해 건 조시켰다. 그 후, 이 종자들을 조직 배양 용기(tissue culture bottle)에 담긴 0.8% 아가로 응고시킨 1/2 강도 호르몬 불포함 MS 배지(half strength hormone free Murashige and Skoog Medium) 상에서 발아시켰다(30-40개의 종자/용기). 모종(seedling)을 BOD, 25℃에서 암기에서 2일 및 명기(16시간 명기: 8시간 암기)에서 3일 동안 자엽이 완전히 확장되고 배축이 4 내지 5 cm 길이가 될 때까지 생장시켰다. 상이한 외식편들을 재생 효율성에 대해 테스트하였다. 이들 중에서, 자엽병 외식편이 최대 재생 가능성을 갖는 것으로 확인하고 형질전환을 위해 이용하였다.

자엽병 외식편의 분리

5일령의 건강한 모종을 채취하고 상기 모종의 하단을 절단하여 제거하였다. 원시엽 조직(leaf primordial tissue)이 포함되는 것을 피하기 위해 분열조직의 바로 위에 있는 배축과 엽병 줄기의 부착점에서 절단하여 자엽병을 분리하였다. 매우 '깔끔하게(clean)' 절단된 표면(즉, 조직이 찢어지지 않은 경우)으로 분리된 엽병이 가장 우수하게 반응하므로, 메스의 날이 날카로운 것이 중요하다. 모종 당 각각 3-5 mm의 엽병 길이를 갖는 두 개의 외식편을 수득했다. 외식편을 채취하여 사용할 때까지 엽병이 배지에 침지된 상태로 공-배양(co-cultivation) 배지에 보관하였다.

실시예 6

탄소원으로서 자일로오스를 이용하는 능력의 스크리닝

브라시카 준세아가 탄소원으로서 자일로오스를 이용할 수 있는지 여부를 결 정하기 위해, 각각 수크로오스 및 자일로오스를 포함하는 배지 상에서 외식편을 배양하였다. 100개의 자엽병 외식편을 분리하여 탄소원이 a) 3.5% 수크로오스; b) 3% 자일로오스; c) 탄소원 불포함인, MS 염, 0.2mg/l NAA, 2 mg/l BAP 및 8 g/l 아가를 포함하는 배지에서 3주 동안 배양하였다. 외식편에 대한 탄소원의 효과는 3주의 종료 시에 관찰하였다. 결과는 도 7에 도시된다.

자일로오스를 포함하는 배지에서 배양된 외식편은 2-3 주 내에 변색(bleach)되거나 또는 갈화되어(brown) 죽었다. 배지 내의 탄소원 부재 하에 배양된 외식편은 활기가 없고 건강하지 않게 보였으며 캘루스(callus)를 형성하지 않았으나, 수크로오스를 포함하는 배지에서 배양된 건강했고 잘 발달했다. 따라서, 브라시카 준세아 자엽병 외식편은 탄소원으로서 자일로오스를 이용할 수 있는 것으로 보이지 않았다.

실시예 7

pCAMBIA-XI를 이용한 브라시카의 형질전환

아그로박테리움에 의한 형질감염(transfection)

전술된 바와 같이 5일령 모종으로부터 자엽병 외식편을 분리하였다. 비교를 위해, hpt 유전자를 갖는 이중 벡터(binary vector) pCAMBIA 1301(음성 선택)을 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101과 pCAMBIA-XI(양성 선택)를 포함하는 균주를 이용하였다.

세균 활성화: 각각의 벡터를 갖는 아그로박테리움 GV3101 세포들을 염화나트 륨 10g/l, 트립톤 10g/l, 효모 추출물 5g/l, 리팜피신(10㎍/ml), 겐타마이신(lO㎍/ml) 및 카나마이신(50㎍/ml)을 포함하는 LB(Luria-Bertani) 배지에서 밤새 배양시키고 O.D₆₀₀ = 1.0에 도달할 때까지 4-6시간 동안 28℃ 진탕 배양기에서 200 rpm으로 지수적으로 성장시켰다. 상기 세포들을 4℃에서 6000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세척하고 MS 염 및 30 g/l 수크로오스를 포함하는 MS 액체에 재현탁시켜 세균의 농도를 0.3 내지 0.5의 0.D₆₀₀으로 조정했다.

감염: 자엽 외식편(cotyledonary explant)을 채취하고 엽병의 끝(tip)을 아그로박테리움 현탁액에 침지시키고 10-15초 동안 유지시키고, 엽병이 상기 배지에 침지된 상태로 즉시 공-배양 배지로 옮겼다. 공 배양 배지(2 cm 깊이의 페트리-디쉬가 세균 현탁액을 담기에 이상적임)로 다시 옮기기 전에, 자엽은 상기 현탁액에 침지되어서는 안 된다. 상기 외식편들을 암기에서 28℃에서 3일 동안 공 배양시켰다. 외식편을 선택 배지 상으로 옮길 때까지(접종 72시간 후), 엽병은 신장되고 두꺼워졌다. 그때, 상기 엽병을 선택 배지에 포매(embed)시키고 자엽 층(cotyledonary lamella)으로부터 배지를 제거할 수 있었다.

실시예 8

선택 및 재생:

양성 선택 및 재생

3일의 공-배양(co-cultivation) 후, 이식편을 MS 염, 30 g/l 수크로오스 및 250 mg/l 세포탁심을 포함하는 MS 액체로 철저히 3회 세척하였다. 이들을 멸균된 여과지로 블롯팅하여 건조시키고 MS 염, 0.2mg/l NAA, 2mg/l BAP, 25 g/l D-자일로오스, 5g/l 수크로오스, 250mg/l 세포탁심, 8gm/l 아가, pH 5.6를 포함하는 MS 배지로 옮기고 16시간의 광 조건 및 8 시간의 암 조건의 광주기(photoperiod)로 4주 동안 유지시켰다. 그 후, 이들을 MS 염, 0.1mg/l NAA, 3mg/l BAP, 29 g/l D-자일로오스, 1g/l 수크로오스, 250mg/l 세포탁심, 8gm/l 아가, pH 5.6를 포함하는 2차 선택 배지로 계대배양시키고 다시 3주간 유지시켰다. 이 기간 동안, 캘루스(callus)로부터 다수의 신초눈(shoot bud)들이 형성되었다. 선택기간 후에, 신초들을 1/2 강도의(half strength) MS 염, 15g/l 수크로오스, 250mg/l 세포탁심 및 8g/l 아가를 포함하는 pH 5.6의 1/2 MS 배지로 신장을 위해 계대배양시켰다. 2주 후에, 신장된 신초들을 1/2 강도의 MS 염, 0.01 mg/l IBA, 30g/l 수크로오스, 150 mg/l 세포탁심, 및 8 g/l 아가, pH 5.6으로 구성된 발근(Rooting) 배지로 옮겼다. 발근된 식물을 토양과 질석(1:2) 혼합물로 옮기기 전에 물에서 2주 동안 강화(harden)시켰다.

음성 선택 및 재생

3일의 공-배양 후, 이식편을 MS 염, 30 g/l 수크로오스 및 250 mg/l 세포탁심을 포함하는 액체 배지로 철저히 3회 세척하였다. 상기 이식편을 MS 염, 0.1mg/l NAA, 2mg/l BAP, 25 mg/l 히그로마이신, 250mg/l 세포탁심, 30g/l 수크로오스, 8g/l 아가, pH 5.6을 포함하는 선택 배지로 옮겼다. 선택기간 후에, 신초들을 1/2 강도의 MS 염, 30g/l 수크로오스, 250mg/l 세포탁심 및 8gm/l 아가, pH 5.6을 포함하는 1/2 MS 배지에서 2주 동안 계대배양시켰다. 신장된 신초들을 1/2 강도의 MS 염, 30g/l 수크로오스, 150 mg/l 세포탁심, 및 8 g/l 아가, pH 5.6으로 구성된 발근 배지로 옮기고, 뒤이어 발근된 식물체를 토양으로 옮겼다.

실시예 9

양성 선택과 음성 선택의 비교

외식편을 pCAMBIA 1301(hpt 포함) 및 pCAMBIA-XI(hpt를 자일로오스 이소머라아제로 치환함)로 형질전환시키고 각각 상이한 농도의 히그로마이신 및 자일로오스를 포함하는 개별적인 선택 배지 상에서 선택하였다. 1차 선택에서 생존한 외식편을 2차 선택을 위해 동일한 배지로 옮겨 21일 동안 선택하였다. 뒤이어 외식편들을 개별적인 신장 배지로 옮겼다. 2차 선택 후에, 어린 가지(shootlet)의 잎으로부터 유래된 100 ng의 DNA를 하기의 순환 조건 하에서 각각 hpt 및 XI 프라이머로 증폭시켰다: 40 사이클의 94℃에서의 1분, 55℃에서의 1분 및 72℃에서의 1.3분.

관찰사항은 하기의 표로 작성된다:

A) pCAMBIA-1301에 의한 이식편의 형질전환. 히그로마이신을 포함하는 배지에서의 선택

히그로마이신 농도(mg/l)	선택에 배치된 외식편의 갯수	2차 선택 후 수득된 PCR+ve 형질전환 식물체의 갯수
30	100	0
25	100	3
20	100	4
15	100	6

B) pCAMBIA-XI에 의한 외식편의 형질전환. 자일로오스를 함유한 배지에서의 선택

자일로오스 농도(g/l)	선택에 배치된 외식편의 갯수	2차 선택 후 수득된 PCR+ve 형질전환 식물체의 갯수
30	100	2
25	100	8
20	100	12
15	100	15

표 1: pCAMBIA-1301 및 pCAMBIA-XI에 의한 해바라기 SEA 외식편의 형질전환. 식물체의 형질전환 상태를 확인하기 위해 수득된 형질전환 식물체의 잎으로부터 추출된 1OOng의 DNA를 이용하여 유전자-특이적 프라이머에 의한 PCR을 수행하였다.

표에 표시된 바와 같이, 음성 선택 대비 양성 선택으로부터 수득된 형질전환 재생체(transgenic regenerant)의 수에는 유의성 있는 차이가 있었다. 히그로마이신을 함유한 배지에서 외식편에 대한 선택 압력은 형질전환된 세포의 발달을 저해하는 것으로 확인되었다. 또한, 히그로마이신 함유 배지에서 생장하는 외식편에 의해 형성된 눈은 발육이 저해되고 수성인(hydric) 것으로 관찰되었다. 그들은 생장하여 유식물체(plantlet)로 발달하지 않고 소수만이 신장 배지에서 생존했다. 재생 효율은 매우 낮은 농도의 히그로마이신에서도 매우 낮았다.

자일로오스는 외식편에 대해 히그로마이신보다 더 낮은 독성 효과를 갖는 것으로 보인다. 상이한 농도의 자일로오스를 함유한 배지에서 생장한 외식편은 히그로마이신에 의한 선택보다 더 우수한 발아 효율성을 보였다. 자일로오스 이소머라아제에 의한 선택으로 수득된 형질전환 식물체의 수는 히그로마이신에 의한 선택으 로 수득된 형질전환 식물체의 수보다 3-4배 컸다.

재생 효율을 증가시키기 위한 최적화:

Haldrup 등(2001)은 자일로오스와 조합된 최소량의 수크로오스 또는 임의의 다른 대안적인 탄소원의 이용이 여러 농작물에서 양성 선택의 선택 및 재생 효율성을 증가시킨다는 것을 보고했다.

형질전환된 외식편의 재생 효율성을 증가시키기 위해, 선택 배지에서 수크로오스는 형질전환되지 않은 세포의 생존을 허용하나, 생장은 허용하지 않고, 자일로오스를 이용할 수 있는 형질전환 세포는 성장하고 번식할 수 있게 하도록 상이한 농도의 자일로오스와 수크로오스의 조합이 이용되는 것인 배지 최적화를 수행하였다.

총 100개의 외식편을 각각 pCAMBIA1301-XI로 형질전환시키고 MS 염, 0.2 mg/l NAA, 2 mg/l BAP, 250mg/l 세포탁심 및, 다양한 조합의 수크로오스와 자일로오스를 함유한 아가 8g/l pH 5.6를 함유한 선택 배지에 넣고 25℃ 온도 및 60% 습도에서 16시간의 광기:8시간의 암기의 광실(light room) 조건에서 4주 동안 배양하였다. 그 후, 이들을 MS 염, 0.2 mg/l NAA, 2 mg/l BAP, 29 g/l 자일로오스, l g/l 수크로오스, 250 mg/l 세포탁심 및 아가 8g/l pH 5.6을 포함하는 2차 선택 배지로 계대배양하고 3주 동안 배양하였다. 발달한 어린 가지(shootlet)를 1/2 농도의 MS 염, 15g/l 수크로오스, 250mg/l 세포탁심 및 아가 8g/l pH 5.6을 포함하는 신장 배지로 옮겼다. 그 후, 신장된 어린 가지를 1/2 MS 염, O.Ol mg/l IBA, 30 g/l 수크 로오스, 150 mg/l 세포탁심 및 아가 8g/l pH 5.6을 포함하는 발근 배지(rooting medium)으로 옮겼다. 분자적 분석을 위해 상기 식물체로부터의 잎 시료를 채취하였다. 관찰결과는 하기와 같다:

자일로오스 농도(g/l)	수크로오스 농도(g/l)	선택에 배치된 외식편의 갯수	2차 선택 후 수득된 식물체의 수	PCR+ve 형질전환 식물체	PCR-ve 식물체 (야생화된 개체)
30	0	100	2	2	0
29	1	100	12	10	2
25	5	100	42	35	7
25	10	100	47	37	10

표: 자일로오스와 수크로오스의 상이한 조합에서 관찰된 재생. 식물체의 형질전환 상태를 결정하기 위해 수득된 식물체의 잎으로부터 추출된 lOOng의 DNA를 이용하여 유전자 특이적 프라이머에 의한 PCR을 수행하였다.

외식편은 자일로오스와 수크로오스의 조합을 포함하는 배지에서 더 잘 재생하고 생장하는 것으로 관찰되었다. 자일로오스(30g/l)와 5 및 10 g/l 수크로오스를 갖는 배지에서 보다 많은 수의 어린 가지를 수득할 수 있었다. 그러나, 수크로오스 농도의 증가에 따라, PCR 결과에 의해 확인된 바와 같이 보다 많은 야생화된 개체(escape)를 수득하였다. 따라서, 1차 선택에서 25 g/l 자일로오스와 5 g/l 수크로오스의 이용이 양성 선택을 위해 최적인 것으로 확인되었다.

A) 3주의 선택; B) 6주의 선택 후 자일로오스(25g/l) + 수크로오스(5gm/l) 및 히그로마이신(25mg/l)에서 배양된 형질전환된 자엽병 외식편에서 관찰된 발아가 도 8에 도시된다.

따라서, 양성 선택을 이용한 브라시카의 형질전환 및 재생을 위한 하기의 프로토콜은 브라시카 준세아 '바루나'에서 약 35%의 형질전환 효율성을 가져왔다:

- 종자를 70% 알코올로 2분간 멸균시키고 뒤이어 0.1%의 염화제2수은으로 5분간 처리했다.

- 상기 멸균된 종자를 멸균수로 4-5회 강하게 세척하고, 압지로 건조시키고 1/2 MS 배지(half MS media)에 배치한다. 그들을 BOD에서 25℃에서 2일 동안 및 광기에서 3일 동안 생장시켰다.

- 원시엽 조직(leaf primordial tissue)의 포함을 피하면서, 자엽병(cotyledonary petiole)을 절제했다.

- pCAMBIA1301-XI를 갖는 밤새 배양된 아그로박테리움 GV3101 2 ml를 리팜피신(lO㎍/ml), 겐타마이신(lO㎍/ml), 카나마이신(50㎍/ml)을 포함하는 LB(Luria-Bertani) 배지 25 ml에 접종하고 O.D₆₀₀ = 1.0에 도달할 때까지 4-6 시간 동안 200 rpm, 28℃로 진탕기에서 지수적으로 배양시켰다. 세포들을 4℃에서 6000 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 세척하고 MS 염 및 30g/l 수크로오스를 포함하는 액체 배지에 재현탁하여 세균의 농도를 0.3-0.5의 OD₆₀₀으로 맞추었다.

- 자엽병 외식편의 엽병 영역을 10-15초 동안 아그로박테리움 현탁액에 침지시켜 감염시키고 즉시 공-배양 배지에 배치하고 엽병 부분을 배지 내로 관통시켰다.

- MS 염, 0.2 mg/l NAA, 2 mg/l BAP, 15g/l 수크로오스, 8g/l 아가 pH 5.6를 함유한 공-배양 배지 상에서 3일 동안 공-배양했다.

- 외식편을 MS 염, 30g/l 수크로오스, 250mg/l 세포탁심 pH 5.6을 포함하는 세척 용액에서 15분 동안 세척하고 압지로 건조시켰다(blot dry).

- MS 염, 25g/l 자일로오스, 5gm/l 수크로오스, 0.2mg/l NAA, 2 mg/l BAP, 250mg/l 세포탁심, 8g/l 아가, pH 5.6를 포함하는 I 선택 배지 상에서, 25℃의 온도 및 60% 습도로 16시간 광기:8 시간 암기의 광실 조건에서 4주 동안 계대배양했다.

- MS 염, 29g/l 자일로오스, 1gm/l 수크로오스, 0.1mg/l NAA, 3 mg/l BAP, 250mg/l 세포탁심, 8g/l 아가, pH 5.6를 포함하는 II 선택 배지 상에서, 25℃의 온도 및 60% 습도로 16시간 광기:8 시간 암기의 광실 조건에서 3주 동안 계대배양했다.

- 1/2 강도 MS 염, 15g/l 수크로오스, 250mg/l 세포탁심, 8g/l 아가, pH 5.6를 포함하는 신장 배지 상에서, 25℃의 온도 및 60% 습도로 16시간 광기:8 시간 암기의 광실 조건에서 1주 동안 계대배양했다.

- 1/2 강도 MS 염, O.Olmg/l IBA, 30g/l 수크로오스, 150mg/l 세포탁심 및 pH 5.6의 8g/l 아가를 포함하는 발근 배지 상에서, 25℃의 온도 및 60% 습도로 16시간 광기:8 시간 암기의 광실 조건에서 계대배양했다.

- 최종적으로, 발근된 식물체를 용기로부터 꺼내고 뿌리를 물로 세척하였다. 상기 식물체를 2일 동안 용기 내에 넣고 수돗물로 강화시킨 후 뒤이어 레드 토양(Red soil)(20%)과 질석(80%)의 혼합물을 담은 플라스틱 컵으로 옮기고 광실 조건에서 4일 동안 배양하였다. 상기 식물체를 온실로 옮기고 레드 토양과 비료를 담은 화분으로 옮기기 전에 완전히 순응시킬 때까지 유지시켰다.

pCAMBIA+XI 작제물로 형질전환된 외식편에서 양성 선택을 이용한 형질전환 신초의 선택 및 재생이 도 9에 도시된다.

100개의 외식편으로부터 출발하여, pCAMBIA-1301에 의한 형질전환으로 hpt 유전자를 갖는 2-3개의 형질전환 식물체를 수득하였다. 그러나, 동일한 수의 외식편으로 출발하여, 80-85개의 외식편이 발아를 보였다; 40개의 외식편이 신장 배지에서 어린 가지로 발달했고 약 35개의 식물체가 생존하여 식물체로 생장했고, 정상적인 개화 및 종자 세트(seed set)를 보였다. 완전히 생장한 T₀ 식물체는 건강했고 표현형이 대조구 식물체와 유사했다. 그들은 건강하고 형질전환되지 않은 종자 만큼의 중량을 갖는 동일한 양의 종자(T₁)를 생산했다.

실시예 11

식물체의 분자적 분석

형질전환 후 수득된 T₀ 식물체로부터의 잎을 각각 XI 프라이머에 의한 증폭에 의해 선택 마커 유전자에 대해 스크리닝하였다. 도 11에 도시된다. 자일로오스 이소머라아제 양성 브라시카 준세아 식물체의 상이한 단계들이 도 10에 도시된다.

표 14. 자일로오스 이소머라아제 유전자의 증폭을 위해 이용된 프라이머.

모든 형질전환 식물체는 T₀ 형질전환 식물체의 종자 시료에서 XI 유전자의 증폭에 의해 알 수 있는 바와 같이, 그들의 게놈으로의 XI 유전자의 통합을 보였다.

따라서, 본 발명자들은 자일로오스 이소머라아제를 선택 마커로 이용한 브라시카의 성공적인 형질전환을 보고한다. 전 세계적으로 현재까지 제초제 및 항생제 내성 유전자(음성 선택)를 이용하여 보고된 15-23%의 형질전환 효율 대비 자일로오스 이소머라아제(양성 선택)를 이용한 선택 시스템을 이용하여 약 35%의 효율을 관찰하였다.

따라서, 브라시카는 양성 선택을 이용하여 성공적으로 형질전환되었다. 양성선택을 위한 SC1의 자일로오스 이소머라아제의 이용은 브라시카 외식편의 형질전환을 위한 효율적 방법이다. 이 선택 시스템은 전통적인 항생제(카나마이신, 히그로마이신) 및 제초제(포스피노트리신) 기반 시스템보다 효율적이고 더 많은 수의 형질전환 식물체를 가져왔다. 마지막으로, 상기 방법은 또한 유전적으로 변형된 식물체의 개발에서 대안적인 선택 마커에 대한 요구를 충족시키고 항생제 내성 유전자의 이용과 관련된 위험 및 환경적 우려를 회피한다.

배지 조성

MS(Murashige and Skoog) 염:

1.9g/l KNO₃

1.65g/l NH₄NO₃

370mg/l MgSO₄

170mg/l KH₂PO₄

440mg/l CaCl₂.2H₂O

15mg/l MnSO₄.7H₂O

8.6mg/l ZnSO₄.7H₂O

6.2mg/l H₃BO₃

0.025mg/l CuSO₄.5H₂O

0.025mg/l CoCl₂

0.83mg/l KI

0.025mg/l Na₂MoO₄.2H₂O

36 mg/l Na₂EDTA

28mg/l FeSO₄

1OOmg/l 미오이노시톨

1.0 mg/l 니코틴산

1.0 mg/l 티아민 HCl

0.1 mg/l 피리독신 HCl

MS 액체

MS 염

30 g/l 수크로오스

1/2 MS 배지(Half MS medium)

1/2 MS 염

30 g/l 수크로오스

8 g/l 아가

LB 배지(Luria Bartani broth)

10 g/l 트립톤

5 g/l 효모 추출물

10 g/l NaCl

브라시카 게놈 DNA의 증폭을 위한 PCR 조건.

DNA lOOng

dNTP 200μM

프라이머 0.25 μM

MgCl₂ mM

1OX 완충액 2.5㎕ (Bangalore Genei)

Taq 폴리머라아제 1U

총 부피 25 ㎕

적용된 증폭 조건.

SEQUENCE LISTING <110> Avestha Gengraine Technologies Pvt Ltd. Gengraine Technologies Pvt.Ltd, Avestha Morawala Patell, Villoo <120> Improved method of generating Brassica juncea transformants <130> 23-1-2006 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1323 <212> DNA <213> Schizochytrium <220> <221> CDS <222> (1)..(1323) <400> 1 atg ggt gaa ttc ttt ccc gag gtt ggc aag att gaa tac aag gga cca 48 Met Gly Glu Phe Phe Pro Glu Val Gly Lys Ile Glu Tyr Lys Gly Pro 1 5 10 15 ggc agc aac gat gtg ctt tcg tac agg tgg tat aac cct gat gaa gag 96 Gly Ser Asn Asp Val Leu Ser Tyr Arg Trp Tyr Asn Pro Asp Glu Glu 20 25 30 atc ctt gga aag aag atg aaa gac tgg ctt aag ttt tct gtc tgc ttt 144 Ile Leu Gly Lys Lys Met Lys Asp Trp Leu Lys Phe Ser Val Cys Phe 35 40 45 tgg cat act ttc cga ggc gtc ggc atg gac ccc ttt ggc aaa cct acg 192 Trp His Thr Phe Arg Gly Val Gly Met Asp Pro Phe Gly Lys Pro Thr 50 55 60 atc acc agc cgc ttc cag ggc gat gat gga tct gac tca gtc gaa aat 240 Ile Thr Ser Arg Phe Gln Gly Asp Asp Gly Ser Asp Ser Val Glu Asn 65 70 75 80 gcg ctc cgt cgc gta gac gcc gcc ttt gag cta ttt aca aag ctt ggc 288 Ala Leu Arg Arg Val Asp Ala Ala Phe Glu Leu Phe Thr Lys Leu Gly 85 90 95 gtt gag tac tac agc ttt cat gat gtg gat gtt tct ccc gaa ggt gca 336 Val Glu Tyr Tyr Ser Phe His Asp Val Asp Val Ser Pro Glu Gly Ala 100 105 110 aca ctc aag gag aca aat gag aac ctt gac aag att acc gac cgc atg 384 Thr Leu Lys Glu Thr Asn Glu Asn Leu Asp Lys Ile Thr Asp Arg Met 115 120 125 cta gaa ctg caa aag aaa aca gga gtg aag ctt ttg tgg ggt aca gct 432 Leu Glu Leu Gln Lys Lys Thr Gly Val Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala 130 135 140 aac ctc ttt acc aac ccc cgc tac atg aac ggt ggc tcc acg aac ccg 480 Asn Leu Phe Thr Asn Pro Arg Tyr Met Asn Gly Gly Ser Thr Asn Pro 145 150 155 160 gac ccg aat gtc ttc att cga gct gct gca cag gtt aaa aag gct atc 528 Asp Pro Asn Val Phe Ile Arg Ala Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Ile 165 170 175 gat gtt acg cac aag ctt ggt ggt caa ggt ttt gta ttc tgg ggt ggt 576 Asp Val Thr His Lys Leu Gly Gly Gln Gly Phe Val Phe Trp Gly Gly 180 185 190 cgc gaa ggc 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Ala Leu Gln 405 410 415 aat gat gag gag ccc gct aag act tca gca aaa cag gag aag ttt att 1296 Asn Asp Glu Glu Pro Ala Lys Thr Ser Ala Lys Gln Glu Lys Phe Ile 420 425 430 gct gtt ctc aac caa tac att tct taa 1323 Ala Val Leu Asn Gln Tyr Ile Ser 435 440 <210> 2 <211> 440 <212> PRT <213> Schizochytrium <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(440) <400> 2 Met Gly Glu Phe Phe Pro Glu Val Gly Lys Ile Glu Tyr Lys Gly Pro 1 5 10 15 Gly Ser Asn Asp Val Leu Ser Tyr Arg Trp Tyr Asn Pro Asp Glu Glu 20 25 30 Ile Leu Gly Lys Lys Met Lys Asp Trp Leu Lys Phe Ser Val Cys Phe 35 40 45 Trp His Thr Phe Arg Gly Val Gly Met Asp Pro Phe Gly Lys Pro Thr 50 55 60 Ile Thr Ser Arg Phe Gln Gly Asp Asp Gly Ser Asp Ser Val Glu Asn 65 70 75 80 Ala Leu Arg Arg Val Asp Ala Ala Phe Glu Leu Phe Thr Lys Leu Gly 85 90 95 Val Glu Tyr Tyr Ser Phe His Asp Val Asp Val Ser Pro Glu Gly Ala 100 105 110 Thr Leu Lys Glu Thr Asn Glu Asn Leu Asp Lys Ile Thr Asp Arg Met 115 120 125 Leu Glu Leu Gln Lys Lys Thr Gly Val Lys Leu Leu Trp Gly Thr 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Claims (15)

1. (a) 선택 작용제 자일로오스의 대사를 위해 요구되는 효소 자일로오스 이소머라아제를 코딩하고, 조절 서열에 분리가능하게 연결된(separably linked) 핵산 서열을 내포하는 재조합 벡터를 작제하는 단계,

   (b) 상기 벡터를 최적 감염 조건 하에 식물 세포 또는 식물 조직에 아그로박테리움 매개 방법에 의해 형질전환시키는 단계,

   (c) 상기 단계 (a)의 선택 작용제를 함유한 MS 배지 상에서 유전적으로 형질전환되지 않은 식물 세포 또는 식물 조직의 집단으로부터 추정적(putative) 형질전환체를 선택하는 단계, 및

   (d) 상기 선택된 식물 세포 또는 식물 조직을 재생시키는 단계를 포함하는, 양성 선택 및 재생 방법에 근거하여 브라시카 준세아(Brassica juncea) 형질전환체를 생성하는 신규한 개선된 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 사용된 식물체는 브라시카 준세아 종에 속하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 효소 자일로오스 이소머라아제를 코딩하는 핵산 서열은 개체 스키조카이트리움(Schizochytrium)으로부터 분리되고 서열번호 1로 표시되는 것인 방법.
4. 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 변형되고, 숙주 식물 외식편에서 상기 변형된 DNA의 발현이 일어나는 것인, 제3항에 따른 핵산 서열.
5. 제4항에 있어서, 상기 변형된 서열은 서열번호 3으로 표시되는 것인 핵산 서열.
6. 서열번호 2로 표시되는, 발현된 단백질의 상응하는 아미노산 서열.
7. 제1항에 있어서, 상기 형질전환의 대상인 식물 세포 또는 식물 조직은 MS 배지에서 숙주 식물체의 종자의 발아 후 자엽병으로부터 수득되는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 벡터 작제물에 의한 형질전환 전에 상기 식물 세포/조직은 자일로오스를 유일한 탄소원으로 이용할 수 없는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 브라시카 속의 식물은 자일로오스의 대사를 위해 요구되는 효소 자일로오스 이소머라아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되고, 상기 형질전환 단계에서, 하기를 포함하는 외식편의 적절한 공-배양(stagewise co-cultivation)이 이용되는 것을 특징으로 하는 방법:

   (a) 원시 조직(primordial tissue)의 포함을 피하면서 자엽병의 절제에 의해 외식편을 준비하는 단계.

   (b) 상기 벡터 작제물을 갖는 아그로박테리움에 의해 상기 외식편을 10초 동안 감염시키고 뒤이어 공-배양 배지로 옮기는 단계,

   (c) 상기 외식편을 암 조건 하에 28℃에서 3일 동안 공-배양하는 단계,

   (d) 상기 외식편을 상기 선택 작용제를 함유한 선택 배지로 옮기는 단계,

   (e) 뒤이어 선택된 외식편을 선택 및 신장 배지로 옮기는 단계, 및

   (f) 선택된 형질전환체의 재생을 더 포함하는 단계.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재생된 유식물체(plantlet)에서 상기 선택 마커 유전자의 형질전환의 확인은 공지된 분자적 스크리닝 기법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적으로 형질전환된 식물 외식편은 제3항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 가지며, 상기 서열의 발현은 상기 형질전환된 외식편에 비-형질전환(non-transformed) 세포 대비 대사적 이익(metabolic advantage)을 부여하는 것인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 제3항의 핵산에 의한 효소의 발현에서 기인된, 상기 선택 작용제, 자일로오스를 탄수화물 원으로 이용할 수 있는 상기 경쟁적 대사적 이익(competitive metabolic advantage)에 기반하여 선택되는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 수득되는 형질전환 효율성은 35%보다 높은 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 수득되는 형질전환 효율성은 30%보다 높은 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 수득되는 형질전환 효율성은 25%보다 높은 것인 방법.

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