JP2003250370A - 病害抵抗性イネ科植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 菌類病に対して抵抗性のあるイネ科植物を提
供する。 【解決手段】 植物に近いアミノ酸配列の保存領域を有
するファミリー１９に属している放線菌由来のキチナー
ゼＣ遺伝子をイネ科植物に導入、発現させることによ
り、病害抵抗性イネ科植物を作製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、農業生産上重要な
各種菌類病に対し抵抗性を示すイネ科植物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子工学技術を用いて植物に有
用遺伝子を導入し、植物菌類病に強い菌類病耐性植物を
作出する試みが進められている。例えば、植物菌類病の
病原菌に対する防御機構の強化を目的として、キチナー
ゼ遺伝子の植物への導入が進められている。

【０００３】植物菌類病の病原菌として種々の糸状菌が
知られているが、糸状菌は、その細胞壁を構成する主要
成分の一つとしてキチンを有している。一方、植物はキ
チンを分解する酵素、キチナーゼ（ＥＣ３．２．１．１
４）を有しており、これが植物に感染しようとする糸状
菌の細胞壁中のキチンに作用して、これらの病原菌によ
る感染・発病を防止する防御機構となっていると考えら
れている。

【０００４】上記のような防御機構に着目し、種々の生
物に由来するキチナーゼ遺伝子を植物に導入する事によ
って、防御機構が強化された耐病性植物が作出されてい
る。例えば、植物由来のキチナーゼ遺伝子を導入した例
としては、１．インゲン豆から単離したキチナーゼ遺伝
子をタバコに導入したもの［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、第２５４巻、第１１９４頁−第１１９７頁（１９
９１）］、２．タバコから単離したキチナーゼ遺伝子を
タバコ、ニンジン、ヒマワリ、トマト、ワタ、トウモロ
コシ、カモガヤに導入したもの［特開平３−３５７８３
号公報、特開平３−１１２４８８号公報］、３．マメ類
のアラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇ
ａｅａ）から単離したキチナーゼ遺伝子をタバコに導入
したもの［特開平５−７６８７３号公報］、４．トマト
から単離したキチナーゼ遺伝子をトウモロコシ、ダイ
ズ、ピート、コムギ、オオムギ、ケシ、アブラナ、ヒマ
ワリ、アルファルファ、バラ、カーネーション、ガーベ
ラ、トマト、ニンジン、レタス、チコリ、メロン、キャ
ベツ、タバコへ導入したもの［特開平６−３８７６２号
公報］、イネのクラスＩキチナーゼ（Ｃｈｔ−２）を高
発現させた組換えイネ［セオレティカルアプライドジェ
ネティクス（Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅ
ｔ．）、第９９巻、３８３頁〜３９０頁、１９９９年］
等が知られている。

【０００５】これに対し、微生物由来のキチナーゼ遺伝
子を導入した例としては、１．細菌セラチア・マルセッ
センス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）か
ら単離されたキチナーゼ遺伝子をタバコに導入したもの
［トランスジェニックリサーチ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３巻、第９０頁〜第９８頁
（１９９４）］、２．リゾプス・オリゴスポラス由来の
キチナーゼをベントグラスに導入したもの［特開平８−
１７２９５７号公報］等が知られている。

【０００６】しかしながら、高い抗真菌活性を示すキチ
ナーゼを植物細胞内で過剰発現させたにもかかわらず、
植物体の耐病性が上がらなかった例も報告されている。
例えば、タバコのクラスＩキチナーゼを過剰発現させて
もタバコ白星病（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａ）耐病性は上がらなかった例［プラントモレキュ
ラーバイオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ
ｌ．）、第１６巻、 １４１頁〜１５１頁、１９９１
年］、てん菜のクラスIIIキチナーゼをタバコで過剰発
現させてもタバコ白星（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ）耐病性は上がらなかった例［モレキュラ
ープラントマイクローブインタラクション（Ｍｏｌ．
Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ
ｎ）、第６巻、４９４頁〜５０６頁、１９９３年］等が
知られている。また、植物細胞内でキチナーゼ遺伝子を
発現させた場合、必ずしもその植物におけるキチナーゼ
活性とその植物が新たに獲得した病害抵抗性との間に、
正の相関が得られるとは限らない事が知られている。
［セオレティカルアプライドジェネティクス（Ｔｈｅｏ
ｒ．Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．）、第９９巻、３８３頁
〜３９０頁、１９９９年］。このように、キチナーゼ遺
伝子を植物に導入して病害抵抗性を増強させようと試み
る場合、必ずしも高い抗真菌活性を示すキチナーゼを植
物内で大量に発現させることが、植物の病害抵抗性の増
強に繋がるわけではないと推測されていた。

【０００７】そこで本発明者らは、キチナーゼの持つ抗
真菌活性の強弱とは別に、キチナーゼのグループ分けに
着目して病害抵抗性イネ科植物を作出すべく鋭意検討を
進めた。すなわち、自然界のキチナーゼは２つのグルー
プに大別され、１つはアミノ酸配列の保存領域の違いか
ら植物由来キチナーゼのファミリー１９と呼べるグルー
プであり、微生物を含むそれ以外はファミリー１８と呼
べるキチナーゼであることが解っていた［渡邉剛志 化
学と生物 ３５巻 ６号 ４０８頁 １９９７年］。

【０００８】しかるに、微生物由来の様々なキチナーゼ
塩基配列を検索した過程で、ストレプトマイセス・グリ
セウス由来のキチナーゼＣと命名したキチナーゼは植物
以外では唯一ファミリー１９に共通するドメイン構造を
有するキチナーゼであることが見いだされた［ＴＳＵＹ
ＯＳＨＩ ＯＨＮＯ， ＴＡＫＥＳＨＩ ＷＡＴＡＮＡＢ
Ｅ， Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ， １７８巻 １７
号 ５０６５頁 １９９６年］。さらに、該キチナーゼの
性質を調べた結果、高い抗真菌活性を有することが明ら
かとなっていた［特開２０００−９３１８２号公報］。

【０００９】このように、微生物由来であるキチナーゼ
Ｃは、高い抗真菌活性を有することはもちろんだが、こ
れまで利用されてきた微生物由来のキチナーゼと異なり
植物により近いアミノ酸配列の保存領域を有するファミ
リー１９に属している極めて特徴的なキチナーゼと考え
られるが、このキチナーゼＣ遺伝子をイネ科植物に導入
発現させて病害抵抗性を付与するという試みは未だ知ら
れていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる観点か
らなされたものであり、菌類病に対して抵抗性を示すイ
ネ科植物を作出する事を課題とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため、鋭意検討を進めた結果、ストレプトマイ
セス・グリセウス由来のファミリー１９に属するキチナ
ーゼＣ遺伝子をイネ科植物に導入することにより病害抵
抗性を増強することに初めて成功し、これまで作出され
たキチナーゼを過剰発現させた形質転換イネより極めて
高い病害抵抗性を示すイネ科植物を作出する事が可能と
なり、本発明を完成するに至った。すなわち本発明の要
旨は以下の通りである。

【００１２】（１）下記タンパク質をコードするＤＮＡ
で形質転換され、病害抵抗性を有するイネ科植物： （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表され
るアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（Ｂ）配列番
号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表されるアミノ酸配
列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、
もしくは挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、キチナ
ーゼ活性を有するタンパク質。 （２）前記タンパク質をコードするＤＮＡが、さらに配
列番号４に示すアミノ酸配列を有する植物細胞外分泌シ
グナルペプチドをコードし、同シグナルペプチドと前記
タンパク質との融合タンパク質を発現する（１）に記載
のイネ科植物。 （３）イネ科植物がイネである（１）又は（２）に記載
のイネ科植物。 （４）病害が菌類病であるである（１）〜（３）のいず
れかに記載のイネ科植物。 （５）前記菌類病がイネいもち病である（４）に記載の
イネ科植物。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本願発明を詳しく説明す
る。本発明の病害抵抗性イネ科植物の作出は、ストレプ
トマイセス・グリセウス由来のキチナーゼＣをコードす
るＤＮＡを導入して形質転換することにより得られる。
前記キチナーゼＣをコードするＤＮＡの塩基配列は、特
開２０００−９３１８２号公報に記載されている。ま
た、キチナーゼＣをコードするＤＮＡは、例えば同ＤＮ
ＡをｐＵＣ１１９に上に含むプラスミドｐＧＣ０１（特
開２０００−９３１８２号公報）を鋳型とするＰＣＲ法
（Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ３７， １７
２（１９８５））により、同プラスミドから調製するこ
とができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例え
ば配列番号６及び７に示すオリゴヌクレオチドが挙げら
れる。

【００１４】本発明においては、キチナーゼＣは、キチ
ナーゼ活性を有し、かつ、イネに病害抵抗性を付与する
ことができる限り、その一部であってもよい。例えば、
配列番号２に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号
１〜３０で表される領域は、欠失していてもよい。具体
的には、本発明に用いるＤＮＡとしては、下記タンパク
質をコードするＤＮＡが挙げられる。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表され
るアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（Ｂ）配列番
号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表されるアミノ酸配
列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、
もしくは挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、キチナ
ーゼ活性を有するタンパク質。

【００１５】前記「数個」とは、アミノ酸残基のタンパ
ク質の立体構造における位置や種類によっても異なる
が、具体的には２から３５個、好ましくは、２から２０
個、より好ましくは２から１０個である。尚、 配列番
号２に示すキチナーゼＣのアミノ酸配列において、アミ
ノ酸番号１〜２９は、シグナルペプチドであると推定さ
れる。

【００１６】本発明に用いるＤＮＡは、キチナーゼＣ又
はその一部に加えて、後述する植物細胞において分泌シ
グナルとして機能するシグナルペプチドをコードする配
列をさらに含み、同シグナルペプチドと前記タンパク質
との融合タンパク質をコードするＤＮＡであってもよ
い。さらに、シグナルペプチドと前記タンパク質との間
に、他のタンパク質由来の配列又はリンカー等の人為的
な配列が挿入された融合タンパク質であってもよい。本
発明おいては、このような融合タンパク質を、単に「キ
チナーゼＣ」と呼ぶことがある。

【００１７】本発明を適用することが出来る植物はイネ
科植物であり、イネ科に属する物であれば特に制限はさ
れない。具体的には、イネ、ムギ（コムギ、オオムギ、
ライムギ等）、ヒエ、アワ、シバ、トウモロコシ等があ
げられ、本発明においては特にイネが好ましい。

【００１８】本発明においては、キチナーゼＣをコード
するＤＮＡは、適当なベクターを用いてイネ科植物細胞
に導入される。その際、キチナーゼＣをコードするＤＮ
Ａは、その５’末端側にイネ科植物で機能するプロモー
ターを、及び３’末端側にイネ科植物で機能するターミ
ネーターを連結して導入される。このような、キチナー
ゼＣをコードするＤＮＡに加えて、これを発現させるた
めに必要な配列、例えばプロモーター及びターミネータ
ーを含むＤＮＡを、「キチナーゼＣ遺伝子」と呼ぶこと
がある。

【００１９】具体的には例えば、キチナーゼＣをコード
するＤＮＡは、イネ科植物で機能するプロモーター、及
びイネ科植物で機能するターミネーターを有するプラス
ミドに挿入してキチナーゼＣ発現プラスミドを調製し、
同プラスミドを用いて導入することができる。例えば、
プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウィルス
由来の３５ＳＲＮＡ遺伝子（ＣａＭＶ３５Ｓ）のプロモ
ーター等が使用できる。また、ターミネーターとして
は、アグロバクテリウム由来のノパリン合成酵素（ＮＯ
Ｓ）遺伝子由来のターミネーター等が使用できる。もち
ろんこれらに限定されるわけではない。

【００２０】キチナーゼＣタンパク質が植物において安
定して蓄積するように、例えば、キチナーゼＣをコード
する配列の前に分泌シグナルペプチドを結合して、キチ
ナーゼＣを細胞外に分泌させても良い。分泌シグナルペ
プチドはイネ科植物細胞内で機能するものであれば特に
制限されない。例えば、配列番号４に記載されたアミノ
酸配列を有するイネ由来キチナーゼのシグナルペプチド
等が使用できるが、もちろんこれに限定されるわけでは
ない。同シグナルペプチドは、例えば配列番号３に示す
塩基配列によってコードされ得る。同シグナルペプチド
とキチナーゼＣとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一
例を、配列番号５に示す。前記イネ由来キチナーゼで
は、成熟タンパク質のＮ末端はグルタミン酸残基であ
る。したがって、前記配列番号５に示す融合タンパク質
の設計に当たっては、シグナルペプチドと成熟タンパク
質との切断を確実にするために、配列番号３に示すアミ
ノ酸配列には、シグナルペプチドのアミノ酸配列に加え
て、Ｃ末端にグルタミン酸残基が付加されている。一
方、キチナーゼＣの成熟タンパク質からは、Ｎ末端と推
定されるアラニン残基（配列番号２中、アミノ酸番号３
０）を除去してある。このように、本願発明において、
配列番号４に示すアミノ酸配列を有するシグナルペプチ
ドとは、シグナルペプチドと、そのＣ末端に付加された
グルタミン酸残基からなるペプチドである。本発明にお
いては、このグルタミン酸残基は必須なものではなく、
シグナルペプチドとキチナーゼＣとの切断が起こり、活
性のあるキチナーゼＣを生成し得るものであれば、切断
部位の前後の配列は特に制限されない。

【００２１】病害抵抗性イネ科植物の選抜を容易にする
ために、キチナーゼＣ遺伝子と同時に薬剤耐性遺伝子を
選抜マーカー遺伝子として導入する手法を用いても良
い。この手法を用いると、形質転換されたイネ科植物に
導入される遺伝子は、キチナーゼＣ遺伝子と薬剤耐性遺
伝子となる。薬剤耐性遺伝子としては、形質転換体の選
抜が容易であることが望ましい。例えば、ネオマイシン
フォスフォトランスフェレース（ＮＰＴ）遺伝子、ハイ
グロマイシンフォスフォトランスフェレース（ＨＰＴ）
遺伝子等が好適に用いられ得るが、これらに限定されな
い。

【００２２】薬剤耐性遺伝子を発現させるプロモーター
としては、上記植物遺伝子プロモーター、例えばＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げら
れるがこれらに限定されない。

【００２３】組み換えたキチナーゼＣ遺伝子が発現し得
るように、キチナーゼＣ遺伝子とその発現を調節するプ
ロモーター、ターミネーター、シグナルペプチド等の種
々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動しうる状態で
連結されている核酸配列を発現カセットという。この発
現カセットは定法によって構築され得る。

【００２４】発現ベクターの構築に用いるベクターとし
ては、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクター等が用
いられ得る。バイナリーベクターであるｐＢＩ系のベク
ターはアグロバクテリウムを介して植物に発現カセット
を導入し得る。例えばｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐ
ＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３等が挙げられる。ｐ
ＵＣ系のベクターは、直接植物に発現カセットを導入し
得る。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が
挙げられる。本発明では、ｐＢＩ−ＥＮ４が好適に用い
られ得る。このベクターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモー
ターのエンハンサー領域４反復を含む発現カセットと、
マーカー遺伝子としてＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの
支配下で発現されるＨＰＴ遺伝子を含んでいる。

【００２５】発現カセットや発現ベクターをイネ科植物
細胞に導入するには、上記のようにアグロバクテリウム
を介する方法と、直接細胞に導入する方法とがある。ア
グロバクテリウムを介する方法は、例えばＮａｇｅｌら
の方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２
５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、
例えば発現ベクターをエレクトロポーレション法等を用
いてアグロバクテリウムに形質転換し、ついで、形質転
換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ． Ｇ
ｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞に
導入する方法である。発現カセット、発現ベクターを直
接導入する方法としては、エレクトロポーレーション
法、遺伝子銃法等が挙げられる。

【００２６】発現カセット又は発現ベクターを導入され
たイネ科植物細胞は、まずハイグロマイシン耐性等の薬
剤耐性で選択され、ついで常法により、植物体に再生さ
れうる。

【００２７】形質転換されたイネ科植物における外来遺
伝子の確認には、周知の方法が用いられ得る。例えば、
Ｗａｌｂｏｔらの方法（Ｗａｌｂｏｔ ａｎｄ Ｗａｒｒ
ｅｎ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２１１，
２７−３４，（１９８８））に準じた方法で植物からＤ
ＮＡを抽出し、ＰＣＲ法（Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅ
ｎｅｔ．， ３７， １７２（１９８５））もしくはサザ
ン法（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ９８，５０５（１９
８０））により確認できる。

【００２８】また、形質転換されたイネ科植物が組み込
まれたキチナーゼＣ遺伝子を発現していることは、例え
ば、キチナーゼＣ遺伝子のあるいはその一部をプローブ
として用いるノザン法（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７，５２０
１−５２０５（１９８０））によりキチナーゼ遺伝子転
写産物を確認する方法、あるいはキチナーゼＣに対する
抗血清を用いたウエスタン法（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ， ７６， ４３５０−４３５４（１９７９））に
よりキチナーゼＣ遺伝子産物を確認する方法等により明
らかに出来る。

【００２９】得られた形質転換体は、各種病原に対する
抵抗性試験に供試される。病原としては対象とする植物
に応じて異なることもあるが、例えばイネの場合、イネ
いもち病、イネ紋枯病などが代表的な菌類病としてあげ
られ、特にイネいもち病に対する効果が顕著である。か
かる抵抗性試験には再生当代の個体（Ｒ０世代）を用い
ても良いし、自殖後代の個体群（Ｒ１世代以降）を用い
ても良い。

【００３０】接種用のイネいもち病菌胞子は、定法に従
いイネいもち病菌をオートミール寒天培地上で２５℃、
約２週間生育させた後、蛍光灯あるいはブラックライト
ランプを数日間照射することにより得られる。イネいも
ち病に対する抵抗性は、かかるイネいもち病菌胞子懸濁
液を植物体に接種することで容易に判定できる。例えば
定法により栽培したイネの４〜５葉期苗に、Ｔｗｅｅｎ
２０等の展着剤を０．０５％加えたイネいもち病菌の胞
子懸濁液を噴霧接種する。接種後２０〜２４時間、湿度
ほぼ１００％の２５℃チャンバーにおき、以降温室にて
７〜８日間栽培する。抵抗性は接種葉上の病斑出現程度
等により判定できる。

【００３１】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り本例
に制約されるものではない。

【００３２】

【実施例１】＜キチナーゼＣ遺伝子発現用ベクターの構
築＞キチナーゼＣ遺伝子の発現用ベクターの構築を、図
１に基づいて説明する。プロモーター、選抜マーカー遺
伝子、ターミネーターを有するベクターとして、カリフ
ラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター及びその
エンハンサー領域を４反復させた人工プロモーターＥＮ
４、大腸菌のハイグロマイシンフォスフォトランスフェ
レース遺伝子、及びアグロバクテリウムのノパリンシン
ターゼ遺伝子由来のターミネーターを有するプラスミド
ｐＵＣ−ＥＮ４（独立行政法人農業生物資源研究所、広
近洋彦博士より入手）を用いた。

【００３３】キチナーゼＣ遺伝子を有するベクターとし
ては、ｐＵＣ−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣを用いた。同ベク
ターは、キチナーゼＣをコードするＤＮＡをｐＵＣ１１
９に上に含むプラスミドｐＧＣ０１（特開２０００−９
３１８２号公報）からＳａｃＩ及びＫｐｎＩで切り出し
た断片と、イネ由来キチナーゼ遺伝子のｃＤＮＡクロー
ン（ＥＭＢＬ Ａｃｃ． ＃Ｘ５６７８７）を鋳型にして
５’−ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣ
ＧＡＧＡＧＣＧＧ−３’プライマー（配列番号６）と
５’−ＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧＣＡ
ＧＧＴＣＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴ−３’プ
ライマー（配列番号７）を用いてＰＣＲを行って得られ
たイネ由来キチナーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコー
ドする断片をＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで処理した断片
を、ＤＮＡライゲーションキット（東洋紡製）を用いて
ｐＵＣ１９ベクターのＢａｍＨＩとＫｐｎＩサイト間に
連結することにより調製した。

【００３４】ｐＵＣ−ＥＮ４を制限酵素ＸｂａＩ及びＫ
ｐｎＩで切断して得られた大断片と、ｐＵＣ−ＲＣ２ｓ
ｓ／ＣｈｉＣをＸｂａＩ及びＫｐｎＩで切断して得られ
たキチナーゼＣ遺伝子を含む断片を連結することによ
り、ｐＥＮ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣを構築した。

【００３５】このｐＥＮ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣをＥ
ｃｏＲＩで切断して得られた断片と、これとは別にバイ
ナリーベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の
Ｔ−ＤＮＡ領域に３５Ｓプロモーターとハイグロマイシ
ンフォスフォフォトランスフェレース（ＨＰＴ）遺伝子
とノパリンシンターゼ遺伝子由来ターミネーターを有す
るプラスミドｐＢＩ−ＨＰＴ（筑波大学、鎌田博 博士
より入手）をＥｃｏＲＩで処理して得られた大断片を連
結し、キチナーゼＣ遺伝子導入用プラスミドｐＢＩ−Ｅ
Ｎ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣを構築した。このプラスミ
ドの構造を図１に示した。

【００３６】形質転換アグロバクテリウムは、Ｎａｇｅ
ｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．， ６
７， ３２５（１９９０））に従って、発現ベクターｐ
ＢＩ−ＥＮ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣをエレクトロポー
レーション法によりアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｃｅ）に導入した後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンと２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む培地
上、２８℃で培養することによって得た。

【００３７】

【実施例２】＜発現ベクターのイネへの導入＞イネの形
質転換は、超迅速形質転換法（特許３１４１０８４号公
報）に従って行った。すなわち、籾殻を取り除いたイネ
の完熟種子を無傷の状態で２．５％次亜塩素酸ナトリウ
ム溶液中で殺菌し、滅菌水で十分に洗浄後、２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を含むＮ６Ｄ培地
（３０ｇ／Ｌスクロース、０．３ｇ／Ｌカザミノ酸、
２．８ｇ／Ｌプロリン、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ
／Ｌゲルライト、ｐＨ５．８）に播種し、５日間２８℃
に静置した。

【００３８】形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁
液に前培養した上記の種子を浸漬した後、２Ｎ６・ＡＳ
培地（３０ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌグルコース、
０．３ｇ／Ｌカザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、１
０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン、４ｇ／Ｌゲルライト、
ｐＨ５．２）に移植し、２８℃暗黒下で３日間共存培養
した。

【００３９】ゲルライトを除いたＮ６Ｄ培地にアグロバ
クテリウム用抗生物質であるカルベニシリンを５００ｍ
ｇ／Ｌを加えた洗浄液を用いて、種子からアグロバクテ
リウムを十分洗浄した後、カルベニシリン５００ｍｇ／
Ｌと選抜マーカーとしてハイグロマイシンを５０ｍｇ／
Ｌ加えたＮ６Ｄ培地に洗浄した種子を置床して、２８℃
で約２週間選抜培養した。

【００４０】選抜されたカルスを再分化培地（５００ｍ
ｇ／Ｌカルベニシリン、３０ｍｇ／Ｌハイグロマイシ
ン、３０ｇ／Ｌスクロース、３０ｇ／Ｌソルビトール、
２ｇ／Ｌカザミノ酸、２ｍｇ／Ｌカイネチン、０．００
２ｍｇ／Ｌ α−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、４ｇ／Ｌゲ
ルライト、ｐＨ５．８となるよう添加したＭＳ培地）に
移植して、２８℃で再分化するまで培養を続けた。

【００４１】再分化固体を発根培地（ハイグロマイシン
３０ｍｇ／Ｌとなるように添加した、ホルモンフリーの
ＭＳ培地）に置床し、ハイグロマイシン耐性を検定し
た。非形質転換体は新しい根が伸長せず１週間ほどで枯
死するのに対し、遺伝子が導入されたと考えられる形質
転換体は耐性を示し、野生株と同様の生育を示した。形
質転換植物が大きくなったところで、馴化を経てポット
に移植し温室内で生育させたところ、成熟した完全な形
質転換イネ植物体が得られた。

【００４２】

【実施例３】＜形質転換イネ植物体のキチナーゼＣの発
現の確認＞再生した形質転換イネ植物体の葉から水溶性
タンパク質を抽出し、ウエスタン法（Ｔｏｗｂｉｎ ｅ
ｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ， ７６， ４３５０，（１９７９））により
キチナーゼＣタンパク質の検出を試みた。

【００４３】イネの葉をｐＨ６．０に調整したクエン酸
−リン酸バッファーで抽出後、１５０００ｒｐｍ、４
℃、２０分間で遠心分離を行った。上清をサンプルとし
て、常法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。泳動後のゲルをＩｍ
ｍｏｂｉｌｏｎメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に
密着させ、ブロッティングバッファー（２５ｍＭ トリ
スヒドロキシアミノメタン， １９２ｍＭ グリシン，
１５％メタノール）で、セミドライブロッティング装置
（日本エイドー製）を用いて、１８０ｍＡ、６Ｖ、１時
間の条件で通電することにより、ゲルからメンブランに
タンパク質を転写した。

【００４４】メンブラン上のキチナーゼＣタンパク質の
検出は、１次抗体としてウサギをキチナーゼＣで免疫し
て得られたキチナーゼＣタンパク質に対する抗血清を、
２次抗体としてウサギＩｇＧに対するアルカリフォスフ
ァターゼ結合したヤギＩｇＧ（ＩＣＮ社製）を用い、こ
れらを含む溶液及びアルカリフォスファターゼの基質で
あるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及びブロモ
クロロインドールフォスフェート（ＢＣＩＰ）を含む溶
液にメンブランを順次浸漬し、基質を発色させることに
よって行った。

【００４５】その結果、キチナーゼＣタンパク質に対す
る抗血清に反応する約３１．５ｋＤａのバンドを主とす
るタンパク質が検出された。

【００４６】

【実施例４】＜自殖次世代へのキチナーゼＣ遺伝子の伝
達＞形質転換後代における導入遺伝子（ＨＰＴ遺伝子）
の存在をＰＣＲによって確認した。実施例２で得られた
再生植物体を温室にて常法により育成することにより、
約４ヶ月後に自殖種子（Ｒ１世代）を得た。

【００４７】それら自殖種子の籾殻を除去後、１％次亜
塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、２５ｍｇ／Ｌハイグロ
マイシンを含む１％寒天プレート上で約１０日間栽培
し、ハイグロマイシン耐性個体を各系統１０個体ずつボ
ンソル培養土（住友化学）に鉢上げした。

【００４８】非形質転換体を含む各系統の葉身約１ｃｍ
から、川崎努の方法（「ＰＣＲ解析用の簡便なイネゲノ
ムＤＮＡの単離法」植物のＰＣＲ実験プロトコール 秀
潤社）に従って全ＤＮＡを抽出した。

【００４９】抽出した各系統のＤＮＡ溶液１００μｌの
うち１μｌを鋳型とし、プライマー１：ＡＴＧＡＡＡＡ
ＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡ（配列番号１
０）、およびプライマー２：ＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴ
ＴＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＣＡ（配列番号１１）を用いて
アニーリング温度６０℃でＰＣＲを行った。

【００５０】ＰＣＲ後、反応液の一部を１．２％アガロ
ースゲルで電気泳動し、バンドの有無、および、コント
ロールとして実施例１で構築したプラスミドｐＢＩ−Ｅ
Ｎ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣを鋳型に用いたＰＣＲ産物
の長さとの比較を行った。その結果、自殖次世代に導入
遺伝子が遺伝していることが確認された。

【００５１】

【実施例５】＜形質転換植物の病害抵抗性＞実施例２で
得られた形質転換イネのイネ葉いもち病に対する抵抗性
を検定した。接種用のイネとしては、再分化植物の自殖
種子（Ｒ１世代）の籾殻を除去後、１％次亜塩素酸ナト
リウムで滅菌し、２５ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含む
１／４×ＭＳ培地上で約１０日間栽培し、ハイグロマイ
シン耐性個体を各系統１０個体ずつボンソル培養土（住
友化学）に鉢上げし、温室内で４〜５葉期まで栽培した
個体を用いた。コントロールとしては、非形質転換イネ
（日本晴）の籾殻を除去した種子を上記と同様に滅菌
後、ハイグロマイシンを含まない１／４×ＭＳ培地上で
同様に生育させ、以下、形質転換イネと同様に栽培した
植物体を用いた。また、キチナーゼＣ以外のキチナーゼ
遺伝子を導入したイネとの比較として、イネのクラスＩ
キチナーゼ（Ｃｈｔ−２）を高発現させた組換えイネ
［セオレティカルアプライドジェネティクス（Ｔｈｅｏ
ｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．）、第９９巻、３８３頁
〜３９０頁、１９９９年］を対照に用いた。

【００５２】いもち病菌胞子懸濁液は、イネいもち病菌
をオートミール寒天培地上で２５℃、約２週間生育させ
た後、ブラックライトランプを４日間照射することによ
り形成させた胞子を滅菌した絵筆でかき取り、５×１０
⁵／ｍｌになるように０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０水溶
液に懸濁して調製した。このイネいもち病菌胞子懸濁液
を噴霧した植物体を、湿度１００％、２５℃、暗黒下の
接種箱に２４時間静置した後、２８〜３０℃（夜間２３
℃）の隔離温室にて７〜８日間栽培した。

【００５３】抵抗性検定は、農林水産省（旧）中国農業
試験場の古田研究室が開発した罹病面積を基にした葉い
もち病抵抗性判定図に従って行った。すなわち、接種葉
上に形成されたいもち病斑の程度を判定図に照らし合わ
せて病斑面積率で表し、元品種の病斑面積率と比較して
防除価を算出し、キチナーゼＣを発現しない形質転換イ
ネの防除価と比較した。非形質転換体と比較して、キチ
ナーゼＣ遺伝子を恒常的に発現する形質転換イネでは病
斑の数と伸展が著しく抑えられていた。また、イネキチ
ナーゼを高発現する形質転換イネと比較しても、キチナ
ーゼＣを恒常的に発現する形質転換イネは病斑の数と伸
展が著しく抑えられ、防除価が高まっていた。この結果
を図２に示した。

【００５４】尚、防除価は、下記式により算出した。 防除価（％）＝（コントロールの平均病斑面積率−被験
系統の平均病斑面積率）／コントロールの平均病斑面積
率×１００

【００５５】

【実施例６】＜同一系統内でのキチナーゼＣ発現量と病
害抵抗性＞同一系統内でのいもち病抵抗性を調べ、それ
ぞれのキチナーゼＣ発現量をウェスタン法により分析
し、キチナーゼＣ発現量といもち病抵抗性の相関関係を
調査した。

【００５６】実施例２で得られた形質転換イネの再分化
植物の自殖種子（Ｒ１世代）を、１系統につき１０粒ず
つボンソル培養土（住友化学）に播種し、温室内で４〜
５葉期まで栽培した個体を用いて、実施例５に示した抵
抗性検定を行った。その後、いもち病抵抗性検定後の接
種葉を回収し、実施例３で示したウェスタン法を用いて
キチナーゼＣの発現量の確認を行った。

【００５７】その結果、表１に示すように、キチナーゼ
Ｃを発現している個体でのみ、いもち病抵抗性を示す高
い防除価を示し、キチナーゼＣの発現がいもち病抵抗性
の付与に関与していることが強く示唆された。

【００５８】

【表１】 Ａ、Ｂ：キチナーゼＣ遺伝子導入形質転換イネ系統 ＋ ：ウェスタン分析によるキチナーゼＣ発現有り − ：ウェスタン分析によるキチナーゼＣ発現無し

【００５９】〔配列表の説明〕 配列番号１：キチナーゼＣ遺伝子の塩基配列 配列番号２：キチナーゼＣのアミノ酸配列 配列番号３：イネ由来キチナーゼのシグナルペプチドを
コードするＤＮＡの塩基配列 配列番号４：イネ由来キチナーゼのシグナルペプチドの
アミノ酸配列 配列番号５：シグナルペプチドとキチナーゼＣとの融合
タンパク質のアミノ酸配列 配列番号６：イネ由来キチナーゼ遺伝子のシグナル配列
増幅用プライマー 配列番号７：イネ由来キチナーゼ遺伝子のシグナル配列
増幅用プライマー 配列番号８：導入遺伝子確認用プライマー 配列番号９：導入遺伝子確認用プライマー

【発明の効果】本発明の病害抵抗性イネ科植物は、キチ
ナーゼＣ遺伝子を導入されて形質転換されたことによ
り、イネいもち病等の菌類病に対する抵抗性が上昇し、
農業生産上重要なイネ科植物を提供することが出来る。

【００６０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Agrobiological Sciences （独立行政法人農業生物資源研究所） Dainippon Ink and Chemicals （大日本インキ化学工業株式会社） <120> 病害抵抗性イネ科植物 <130> P-9700 <140> <141> 2002-03-04 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００６１】 <210> 1 <211> 1080 <212> DNA <213> Streptomyces griseus <220> <221> CDS <222> (121)..(1005) <400> 1 cggcaccttc ttcgaggatg gtctagacct tgacaggtcc agaccatcct cgcttgagta 60 tcggcacccc caccggcggc gcaggccgga cgtcgcgccg cgtccaagga gtgtgatcac 120 gtg tat cga cgt gtc atg agt ctg ctg gtc gcg ctc ggc gcg atc gtc 168 Met Tyr Arg Arg Val Met Ser Leu Leu Val Ala Leu Gly Ala Ile Val 1 5 10 15 gcg gcg ctc atc gtt ctt ccc gcc acc acc gcg cag gcg gcc acc tgc 216 Ala Ala Leu Ile Val Leu Pro Ala Thr Thr Ala Gln Ala Ala Thr Cys 20 25 30 gcc acg gcc tgg agc tcc tcc tcc gtc tac acg aac ggc ggc acg gtc 264 Ala Thr Ala Trp Ser Ser Ser Ser Val Tyr Thr Asn Gly Gly Thr Val 35 40 45 tcg tac aac ggc cgt aac tac acc gcc aag tgg tgg acc cag aac gag 312 Ser Tyr Asn Gly Arg Asn Tyr Thr Ala Lys Trp Trp Thr Gln Asn Glu 50 55 60 cgt ccc ggc acg tcg gac gtc tgg gcc gac aag ggt gcg tgt ggc acc 360 Arg Pro Gly Thr Ser Asp Val Trp Ala Asp Lys Gly Ala Cys Gly Thr 65 70 75 80 ggc ggt gag ggc ccg ggc ggc aac aac ggc ttc gtc gtc agc gag gcc 408 Gly Gly Glu Gly Pro Gly Gly Asn Asn Gly Phe Val Val Ser Glu Ala 85 90 95 cag ttc aac cag atg ttc ccg aac cgg aac gcc ttc tac acc tac aag 456 Gln Phe Asn Gln Met Phe Pro Asn Arg Asn Ala Phe Tyr Thr Tyr Lys 100 105 110 ggc ctc acc gac gcc ctg agc gcc tac ccg gct ttc gcc aag acc ggc 504 Gly Leu Thr Asp Ala Leu Ser Ala Tyr Pro Ala Phe Ala Lys Thr Gly 115 120 125 agc gac gag gtg aag aag cgc gag gcc gcg gcc ttc ctc gcc aac gtc 552 Ser Asp Glu Val Lys Lys Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Ala Asn Val 130 135 140 agc cac gag acc ggc gga ctg ttc tac atc aag gaa gtc aac gag gcg 600 Ser His Glu Thr Gly Gly Leu Phe Tyr Ile Lys Glu Val Asn Glu Ala 145 150 155 160 aac tac ccg cac tac tgc gac acc acg cag tcg tac ggc tgc ccg gcc 648 Asn Tyr Pro His Tyr Cys Asp Thr Thr Gln Ser Tyr Gly Cys Pro Ala 165 170 175 ggc cag gcc gcc tac tac ggc cgc ggc ccg atc cag ctg agc tgg aac 696 Gly Gln Ala Ala Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Ile Gln Leu Ser Trp Asn 180 185 190 ttc aac tac aag gcg gcc ggt gac gcc ctg ggc atc aac ctg ctc gcc 744 Phe Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Asp Ala Leu Gly Ile Asn Leu Leu Ala 195 200 205 aac ccc tac ctg gtg gag cag gac ccg gcc gtg gcg tgg aag acc ggc 792 Asn Pro Tyr Leu Val Glu Gln Asp Pro Ala Val Ala Trp Lys Thr Gly 210 215 220 ctc tgg tac tgg aac tcc cag aac ggc ccc ggc acc atg acc ccg cac 840 Leu Trp Tyr Trp Asn Ser Gln Asn Gly Pro Gly Thr Met Thr Pro His 225 230 235 240 aac gcc atc gtc aac aac gcc ggc ttc ggc gag acg atc cgc tcg atc 888 Asn Ala Ile Val Asn Asn Ala Gly Phe Gly Glu Thr Ile Arg Ser Ile 245 250 255 aac ggc gct ctg gag tgc aac ggc ggc aac ccg gcg cag gtc cag agc 936 Asn Gly Ala Leu Glu Cys Asn Gly Gly Asn Pro Ala Gln Val Gln Ser 260 265 270 cgc atc aac aag ttc acg cag ttc acc cag atc ctc ggc acc acc acg 984 Arg Ile Asn Lys Phe Thr Gln Phe Thr Gln Ile Leu Gly Thr Thr Thr 275 280 285 ggt ccg aac ctg agc tgc tga tgtcgtaccg cccctcaccg acccgcgagg 1035 Gly Pro Asn Leu Ser Cys 290 295 gccgctgagg atcccgagga ccccacccga aacgggggtg tgtcc 1080

【００６２】 <210> 2 <211> 294 <212> PRT <213> Streptomyces griseus <400> 2 Met Tyr Arg Arg Val Met Ser Leu Leu Val Ala Leu Gly Ala Ile Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Ile Val Leu Pro Ala Thr Thr Ala Gln Ala Ala Thr Cys 20 25 30 Ala Thr Ala Trp Ser Ser Ser Ser Val Tyr Thr Asn Gly Gly Thr Val 35 40 45 Ser Tyr Asn Gly Arg Asn Tyr Thr Ala Lys Trp Trp Thr Gln Asn Glu 50 55 60 Arg Pro Gly Thr Ser Asp Val Trp Ala Asp Lys Gly Ala Cys Gly Thr 65 70 75 80 Gly Gly Glu Gly Pro Gly Gly Asn Asn Gly Phe Val Val Ser Glu Ala 85 90 95 Gln Phe Asn Gln Met Phe Pro Asn Arg Asn Ala Phe Tyr Thr Tyr Lys 100 105 110 Gly Leu Thr Asp Ala Leu Ser Ala Tyr Pro Ala Phe Ala Lys Thr Gly 115 120 125 Ser Asp Glu Val Lys Lys Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Ala Asn Val 130 135 140 Ser His Glu Thr Gly Gly Leu Phe Tyr Ile Lys Glu Val Asn Glu Ala 145 150 155 160 Asn Tyr Pro His Tyr Cys Asp Thr Thr Gln Ser Tyr Gly Cys Pro Ala 165 170 175 Gly Gln Ala Ala Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Ile Gln Leu Ser Trp Asn 180 185 190 Phe Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Asp Ala Leu Gly Ile Asn Leu Leu Ala 195 200 205 Asn Pro Tyr Leu Val Glu Gln Asp Pro Ala Val Ala Trp Lys Thr Gly 210 215 220 Leu Trp Tyr Trp Asn Ser Gln Asn Gly Pro Gly Thr Met Thr Pro His 225 230 235 240 Asn Ala Ile Val Asn Asn Ala Gly Phe Gly Glu Thr Ile Arg Ser Ile 245 250 255 Asn Gly Ala Leu Glu Cys Asn Gly Gly Asn Pro Ala Gln Val Gln Ser 260 265 270 Arg Ile Asn Lys Phe Thr Gln Phe Thr Gln Ile Leu Gly Thr Thr Thr 275 280 285 Gly Pro Asn Leu Ser Cys 290

【００６３】 <210> 3 <211> 99 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (1)..(99) <400> 3 atg tcg acg ccg aga gcg gcg gcg agc ctc gcc aag aag gcg gcg ctg 48 Met Ser Thr Pro Arg Ala Ala Ala Ser Leu Ala Lys Lys Ala Ala Leu 1 5 10 15 gtg gcg ctg gcc gtc ctg gcc gcg gcg ctc gcg acg gcg gcg cgc gcc 96 Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ala Ala Arg Ala 20 25 30 gag 99 Glu

【００６４】 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 4 Met Ser Thr Pro Arg Ala Ala Ala Ser Leu Ala Lys Lys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ala Ala Arg Ala 20 25 30 Glu

【００６５】 <210> 5 <211> 297 <212> PRT <213> Streptomyces griseus <400> 5 Met Ser Thr Pro Arg Ala Ala Ala Ser Leu Ala Lys Lys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ala Ala Arg Ala 20 25 30 Glu Thr Cys Ala Thr Ala Trp Ser Ser Ser Ser Val Tyr Thr Asn Gly 35 40 45 Gly Thr Val Ser Tyr Asn Gly Arg Asn Tyr Thr Ala Lys Trp Trp Thr 50 55 60 Gln Asn Glu Arg Pro Gly Thr Ser Asp Val Trp Ala Asp Lys Gly Ala 65 70 75 80 Cys Gly Thr Gly Gly Glu Gly Pro Gly Gly Asn Asn Gly Phe Val Val 85 90 95 Ser Glu Ala Gln Phe Asn Gln Met Phe Pro Asn Arg Asn Ala Phe Tyr 100 105 110 Thr Tyr Lys Gly Leu Thr Asp Ala Leu Ser Ala Tyr Pro Ala Phe Ala 115 120 125 Lys Thr Gly Ser Asp Glu Val Lys Lys Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu 130 135 140 Ala Asn Val Ser His Glu Thr Gly Gly Leu Phe Tyr Ile Lys Glu Val 145 150 155 160 Asn Glu Ala Asn Tyr Pro His Tyr Cys Asp Thr Thr Gln Ser Tyr Gly 165 170 175 Cys Pro Ala Gly Gln Ala Ala Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Ile Gln Leu 180 185 190 Ser Trp Asn Phe Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Asp Ala Leu Gly Ile Asn 195 200 205 Leu Leu Ala Asn Pro Tyr Leu Val Glu Gln Asp Pro Ala Val Ala Trp 210 215 220 Lys Thr Gly Leu Trp Tyr Trp Asn Ser Gln Asn Gly Pro Gly Thr Met 225 230 235 240 Thr Pro His Asn Ala Ile Val Asn Asn Ala Gly Phe Gly Glu Thr Ile 245 250 255 Arg Ser Ile Asn Gly Ala Leu Glu Cys Asn Gly Gly Asn Pro Ala Gln 260 265 270 Val Gln Ser Arg Ile Asn Lys Phe Thr Gln Phe Thr Gln Ile Leu Gly 275 280 285 Thr Thr Thr Gly Pro Asn Leu Ser Cys 290 295

【００６６】 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 6 cacggatccg catgtcgacg ccgagagcgg 30

【００６７】 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 7 aggagctcca ggccgtggcg caggtctcgg cgcgcgccgc cgt 43

【００６８】 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 8 atgaaaaagc ctgaactcac cgcga 25

【００６９】 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 9 tccatcacag tttgccagtg ataca 25

【図面の簡単な説明】

【図１】 キチナーゼＣ遺伝子導入用プラスミドｐＢＩ
−ＥＮ４−ＲＣ２ｓｓ／ＣｈｉＣの構造の模式図。

【図２】 形質転換植物のイネ葉いもち病に対する抵抗
性の試験結果を表すグラフ。

【符号の説明】

３５Ｓ：ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター ＨＰＴ：ハイグロマイシン耐性遺伝子 ＮＯＳ３’：ＮＯＳ遺伝子ターミネーター ＥＮ４：ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（エンハンサー
４反復） ＲＣＣ２ＳＳ／ＣｈｉＣ：イネ・キチナーゼ遺伝子のシ
グナル配列を持つキチナーゼＣキメラ遺伝子 ＲＢ， ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡ右側ボーダー配列、左側ボー
ダー配列 ＮＰＴＩＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子 ＮＴ：非形質転換体（コントロール） Ｐ：キチナーゼＣ遺伝子を含まないプラスミドによる形
質転換イネ Ｃ：Ｎ−ＥＲ２−５５−５−１（イネキチナーゼ高発現
形質転換イネ） １、２，３，４：キチナーゼＣ発現形質転換イネ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 宥司 茨城県つくば市観音台２−１−２ 独立行 政法人農業生物資源研究所内 (72)発明者 瀧澤 啓信 千葉県印旛郡酒々井町東酒々井５−５− 339 (72)発明者 西橋 秀治 千葉県佐倉市大崎台２−23−９ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 CA17 CA19 CD03 CD07 CD09 CD13 CD17 CD21 4B024 AA08 BA11 CA04 DA01 EA01 EA04 FA02 GA11

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記タンパク質をコードするＤＮＡで形
   質転換され、病害抵抗性を有するイネ科植物： （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表され
   るアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（Ｂ）配列番
   号２のアミノ酸番号３１〜２９４で表されるアミノ酸配
   列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、
   もしくは挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、キチナ
   ーゼ活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 前記タンパク質をコードするＤＮＡが、
   さらに配列番号４に示すアミノ酸配列を有する植物細胞
   外分泌シグナルペプチドをコードし、同シグナルペプチ
   ドと前記タンパク質との融合タンパク質を発現する請求
   項１に記載のイネ科植物。
3. 【請求項３】 イネ科植物がイネである請求項１又は２
   に記載のイネ科植物。
4. 【請求項４】 病害が菌類病であるである請求項１〜３
   のいずれか一項に記載のイネ科植物。
5. 【請求項５】 前記菌類病がイネいもち病である請求項
   ４に記載のイネ科植物。