JP3234534B2 - 形質転換されたホモノ科植物 - Google Patents
形質転換されたホモノ科植物Info
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、形質転換されたホ
モノ科植物に関するものである。
モノ科植物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】土壌細
菌アグロバクテリウム・テュメファシエンス (Agrobact
erium tumefaciens)の病原性株 (virulent strains) は
双子葉植物に感染してこれらの植物に新生物形成応答を
引き起こさせることが知られている。該細菌中の腫瘍誘
導剤はそのＤＮＡのいくつかを宿主植物細胞中に伝達
し、そこで宿主植物細胞の染色体に組み込まれることに
よって機能するプラスミドである。このプラスミドはＴ
i プラスミドと呼ばれ、Ａ．テュメファシエンスの種々
の株の病原性はＴi プラスミドの、Ｔ−ＤＮＡの可動化
及び伝達に関与するｖｉｒ領域によってある程度決定さ
れる。Ｔ−ＤＮＡ部はそれぞれ右境界部（right borde
r) 及び左境界部 (leftborder) と名づけられる２つの
２３塩基対反復によって境界が定められている。これら
２つの境界部配列の間に位置する遺伝情報はいずれも可
動性であり、感受性宿主に伝達される。ひとたび染色体
中に入るとＴ−ＤＮＡ遺伝子は通常の優勢な植物遺伝子
と同様にふるまう。すなわちＴ−ＤＮＡ遺伝子は形質転
換された植物によって安定に維持され、発現されそして
有性的に伝えられ、通常のメンデル形式で遺伝される。
菌アグロバクテリウム・テュメファシエンス (Agrobact
erium tumefaciens)の病原性株 (virulent strains) は
双子葉植物に感染してこれらの植物に新生物形成応答を
引き起こさせることが知られている。該細菌中の腫瘍誘
導剤はそのＤＮＡのいくつかを宿主植物細胞中に伝達
し、そこで宿主植物細胞の染色体に組み込まれることに
よって機能するプラスミドである。このプラスミドはＴ
i プラスミドと呼ばれ、Ａ．テュメファシエンスの種々
の株の病原性はＴi プラスミドの、Ｔ−ＤＮＡの可動化
及び伝達に関与するｖｉｒ領域によってある程度決定さ
れる。Ｔ−ＤＮＡ部はそれぞれ右境界部（right borde
r) 及び左境界部 (leftborder) と名づけられる２つの
２３塩基対反復によって境界が定められている。これら
２つの境界部配列の間に位置する遺伝情報はいずれも可
動性であり、感受性宿主に伝達される。ひとたび染色体
中に入るとＴ−ＤＮＡ遺伝子は通常の優勢な植物遺伝子
と同様にふるまう。すなわちＴ−ＤＮＡ遺伝子は形質転
換された植物によって安定に維持され、発現されそして
有性的に伝えられ、通常のメンデル形式で遺伝される。
【０００３】Ａ．テュメファシエンス感染の部位で未分
化状態で生長する植物腫瘍組織の瘤はクラウンゴールと
呼ばれる。Ａ．チュメファシエンスによって引き起こさ
れたクラウンゴールの細胞はオパインと呼ばれる通常で
ないアミノ酸を合成する。Ａ. テュメファシエンスの異
なる菌株がクラウンゴール細胞による異なったオパイン
の合成を指示し、誘導された特定のオパインは植物に感
染した菌株の１つの特性となる。さらに与えられた菌株
によって誘導された特定のオパインを異化する能力もそ
の菌株の特性である。オパインは通常Ａ. テュメファシ
エンスや未感染宿主植物によっては合成されない。オパ
インの合成に関与する酵素、オパインシンターゼをコー
ドするのはＴ−ＤＮＡであるが、これらの遺伝子は感染
した植物組織中でのみ発現される。このような発現はこ
れらの遺伝子がＴ−ＤＮＡ上の真核調節配列の調節のも
とにあるという所見と一致する。もっとも通常のオパイ
ンはオクトピン及びノパリンである。オクトピンの合成
を触媒するオパインシンターゼはリゾピンデヒドロゲナ
ーゼであり、ノパリンの合成を触媒するオパインシンタ
ーゼはノパリンデヒドロゲナーゼである。クラウンゴー
ル細胞を培養すると、通常の植物細胞が培養物中で生長
するようにするために加えねばならない植物ホルモンを
欠く培地中でも生長してカルス培養物を生ずる。カルス
培養物は比較的に未分化な植物細胞の組織化されていな
い塊である。クラウンゴール細胞の無ホルモン培地中で
生長する能力も形質転換された宿主細胞中のＴ−ＤＮＡ
の存在に帰せられる。なぜなら、植物ホルモンの合成を
指示する遺伝子も又Ｔ−ＤＮＡと連合しているからであ
る。
化状態で生長する植物腫瘍組織の瘤はクラウンゴールと
呼ばれる。Ａ．チュメファシエンスによって引き起こさ
れたクラウンゴールの細胞はオパインと呼ばれる通常で
ないアミノ酸を合成する。Ａ. テュメファシエンスの異
なる菌株がクラウンゴール細胞による異なったオパイン
の合成を指示し、誘導された特定のオパインは植物に感
染した菌株の１つの特性となる。さらに与えられた菌株
によって誘導された特定のオパインを異化する能力もそ
の菌株の特性である。オパインは通常Ａ. テュメファシ
エンスや未感染宿主植物によっては合成されない。オパ
インの合成に関与する酵素、オパインシンターゼをコー
ドするのはＴ−ＤＮＡであるが、これらの遺伝子は感染
した植物組織中でのみ発現される。このような発現はこ
れらの遺伝子がＴ−ＤＮＡ上の真核調節配列の調節のも
とにあるという所見と一致する。もっとも通常のオパイ
ンはオクトピン及びノパリンである。オクトピンの合成
を触媒するオパインシンターゼはリゾピンデヒドロゲナ
ーゼであり、ノパリンの合成を触媒するオパインシンタ
ーゼはノパリンデヒドロゲナーゼである。クラウンゴー
ル細胞を培養すると、通常の植物細胞が培養物中で生長
するようにするために加えねばならない植物ホルモンを
欠く培地中でも生長してカルス培養物を生ずる。カルス
培養物は比較的に未分化な植物細胞の組織化されていな
い塊である。クラウンゴール細胞の無ホルモン培地中で
生長する能力も形質転換された宿主細胞中のＴ−ＤＮＡ
の存在に帰せられる。なぜなら、植物ホルモンの合成を
指示する遺伝子も又Ｔ−ＤＮＡと連合しているからであ
る。
【０００４】Ａ．テュメファシエンス及び遺伝子操子操
作によってＴ−ＤＮＡを挿入される宿主植物の双方にと
って外来のＤＮＡ分節もＡ．テュメファシエンスによっ
て宿主細胞中に伝達される。このようにＴi プラスミド
は宿主植物の遺伝子工学のためのベクターとして用いる
ことができる。野性型Ａ．テュメファシエンスにおいて
は細菌あたり１個のＴi プラスミドしかないが、遺伝学
的にＡ. テュメファシエンスではＴ−ＤＮＡの伝達が起
こるために、ｖｉｒ領域とＴ−ＤＮＡとは同じＴi プラ
スミド上に担持される必要はない。ｖｉｒ領域とＴ−Ｄ
ＮＡとは同じアグロバクテリウムに含まれる別のプラス
ミド上に担持することができる。Ａ. テュメファシエン
スの宿主範囲は双子葉類に限り、単子葉類の形質転換は
この細菌では行われないと一般に考えられてきた。実際
Ａ. テュメファシエンスの感染による単子葉類ホモノ科
植物の形質転換について誰も報告していない。しかしな
がら、最近 Hooykass-Van Slogteren らは Nature ３１
１、７６３（１９８４）でユリ科及びヒガンバナ科の単
子葉類にＡ. テュメファシエンスが感染した傷部位に小
さなふくれが生成することを報告した。感染植物の傷部
から取り出した植物細胞中のオパインが検出された。
又、Hernalsfeensらは The EMBO Journal,３，３０３８
（１９８４）において、Ａ. テュメファシエンスＣ５８
株に感染したユリ科の１メンバーである、単子葉類アス
パラガス・オフィシナリス (officinalis)の培養した茎
断片が腫瘍状増殖を発展させることを報告した。これら
の腫瘍状増殖物の１つは無ホルモン培地で増殖でき、ま
たこの腫瘍状増殖物から導かれた樹立カルス培養物中に
オパインが検出された。
作によってＴ−ＤＮＡを挿入される宿主植物の双方にと
って外来のＤＮＡ分節もＡ．テュメファシエンスによっ
て宿主細胞中に伝達される。このようにＴi プラスミド
は宿主植物の遺伝子工学のためのベクターとして用いる
ことができる。野性型Ａ．テュメファシエンスにおいて
は細菌あたり１個のＴi プラスミドしかないが、遺伝学
的にＡ. テュメファシエンスではＴ−ＤＮＡの伝達が起
こるために、ｖｉｒ領域とＴ−ＤＮＡとは同じＴi プラ
スミド上に担持される必要はない。ｖｉｒ領域とＴ−Ｄ
ＮＡとは同じアグロバクテリウムに含まれる別のプラス
ミド上に担持することができる。Ａ. テュメファシエン
スの宿主範囲は双子葉類に限り、単子葉類の形質転換は
この細菌では行われないと一般に考えられてきた。実際
Ａ. テュメファシエンスの感染による単子葉類ホモノ科
植物の形質転換について誰も報告していない。しかしな
がら、最近 Hooykass-Van Slogteren らは Nature ３１
１、７６３（１９８４）でユリ科及びヒガンバナ科の単
子葉類にＡ. テュメファシエンスが感染した傷部位に小
さなふくれが生成することを報告した。感染植物の傷部
から取り出した植物細胞中のオパインが検出された。
又、Hernalsfeensらは The EMBO Journal,３，３０３８
（１９８４）において、Ａ. テュメファシエンスＣ５８
株に感染したユリ科の１メンバーである、単子葉類アス
パラガス・オフィシナリス (officinalis)の培養した茎
断片が腫瘍状増殖を発展させることを報告した。これら
の腫瘍状増殖物の１つは無ホルモン培地で増殖でき、ま
たこの腫瘍状増殖物から導かれた樹立カルス培養物中に
オパインが検出された。
【０００５】１９８２年に、Anne C.F. Gravesは“Some
Tumorigenic Activities of Agrobacterium Tumefacie
ns (Smith and Town) Conn. ”（アグロバクテリウム・
テュメファシエンスのいくつかの腫瘍発生活性）（Bowl
ing Green State University) 題する彼女の博士論文中
でＡ. テュメファシエンスＣ５８Ｎ及びＢ６の植菌によ
ってグラジオラス円板上に組織の不規則な塊りが発育す
ることを報告した。これらの組織塊はじゃがいも塊茎円
板に発育させた組織塊と同じようであり、同様な細胞形
態を有しているように見えた。電気泳動中オクトピン標
品と一緒に移動した化合物はＢ６株によって誘導された
グラジオラス円板上の増殖物中に見い出された。又、オ
クトピン標品のすぐ後を移動した化合物はＣ５８Ｎ株に
よって誘導されたグラジオラス円板上の増殖物中に生じ
ていた。オクトピンデヒドロゲナーゼも又、テュメファ
シエンスＢ６によって誘導された細胞増殖物抽出液中に
見い出されたが、Ａ. テュメファシエンスＣ５８Ｎによ
って誘導された細胞増殖物抽出液中には見い出されなか
った。Dr. Gravesは又他のある単子葉植物のＡ. テュメ
ファシエンスの植菌に対する応答について記述した。し
ょうが根茎円板上には細胞増殖はみられず、チューリッ
プ球根円板についての結果ははっきりしなかった。がま
及びざぜんそうの根茎円板上での細胞増殖は早春におけ
る維管束の先端 (end)での輪郭がくっきりした細胞 (cl
ean cells)のくつかの層に限られた。DeCleene及びDeLe
y は The Botanical Review,４２，３８９（１９７６）
において、Ａ. テュメファシエンスの植物宿主範囲につ
いての広範囲に亘る研究の結果を報告した。彼らの論文
はLiliales及びArales目の単子葉植物はＡ. テュメファ
シエンスの感染に感受性であるが、一般に単子葉類は
Ａ. テュメファシエンス感染に非感受性であることを教
示している。特に彼らの論文はホモノ科(Gramineae) 植
物がＡ. テュメファシエンス感染に感受性でないことを
報告している。Ａ. テュメファシエンスに対する感受性
は傷部位でふくれや腫瘍が発育するかどうかによって決
定された。
Tumorigenic Activities of Agrobacterium Tumefacie
ns (Smith and Town) Conn. ”（アグロバクテリウム・
テュメファシエンスのいくつかの腫瘍発生活性）（Bowl
ing Green State University) 題する彼女の博士論文中
でＡ. テュメファシエンスＣ５８Ｎ及びＢ６の植菌によ
ってグラジオラス円板上に組織の不規則な塊りが発育す
ることを報告した。これらの組織塊はじゃがいも塊茎円
板に発育させた組織塊と同じようであり、同様な細胞形
態を有しているように見えた。電気泳動中オクトピン標
品と一緒に移動した化合物はＢ６株によって誘導された
グラジオラス円板上の増殖物中に見い出された。又、オ
クトピン標品のすぐ後を移動した化合物はＣ５８Ｎ株に
よって誘導されたグラジオラス円板上の増殖物中に生じ
ていた。オクトピンデヒドロゲナーゼも又、テュメファ
シエンスＢ６によって誘導された細胞増殖物抽出液中に
見い出されたが、Ａ. テュメファシエンスＣ５８Ｎによ
って誘導された細胞増殖物抽出液中には見い出されなか
った。Dr. Gravesは又他のある単子葉植物のＡ. テュメ
ファシエンスの植菌に対する応答について記述した。し
ょうが根茎円板上には細胞増殖はみられず、チューリッ
プ球根円板についての結果ははっきりしなかった。がま
及びざぜんそうの根茎円板上での細胞増殖は早春におけ
る維管束の先端 (end)での輪郭がくっきりした細胞 (cl
ean cells)のくつかの層に限られた。DeCleene及びDeLe
y は The Botanical Review,４２，３８９（１９７６）
において、Ａ. テュメファシエンスの植物宿主範囲につ
いての広範囲に亘る研究の結果を報告した。彼らの論文
はLiliales及びArales目の単子葉植物はＡ. テュメファ
シエンスの感染に感受性であるが、一般に単子葉類は
Ａ. テュメファシエンス感染に非感受性であることを教
示している。特に彼らの論文はホモノ科(Gramineae) 植
物がＡ. テュメファシエンス感染に感受性でないことを
報告している。Ａ. テュメファシエンスに対する感受性
は傷部位でふくれや腫瘍が発育するかどうかによって決
定された。
【０００６】Longらは Mol. Gen. Genet.,１９９，１７
８（１９８５）において、Fromm らは Nature,３１９，
７９１（１９８６）において、及び Portrykus らは M
ol.Gen. Genet.,１９９，１８３（１９８５）におい
て、プロトプラストへの直接遺伝子伝達によるホモノ科
植物の形質転換について報告した。プロトプラストは細
胞壁が酵素による消化によって取り除かれた植物細胞で
ある。Longらはノパリンシンターゼプロモーター、及び
オクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化調節シグ
ナルを含有するＤＮＡを用いるTriticum monococcumの
プロトプラストを形質転換した。Fromm らはプラスミド
ｐＣａＭＶＮＥＯ（カリフラワーモザイクウィルス３５
Ｓプロモーター、トランスポゾンＴｎ５からのネオマイ
シンホスホトランスフェラーゼ１リットル遺伝子、及び
ノバリンシンターゼ３′領域を含有する）のとうもろこ
しプロトプラストへのエレクトロポレーションによる伝
達の結果として、カナマイシン抵抗性の、安定に形質転
換されたとうもろこし細胞が得られることを開示してい
る。Hooykass-Van Slogteren ら、Hernalsteensら、Gra
ves、及び DeCleene 及びDeLey の感染技術、又は Long
ら、Fromm ら及び Portrykusらの直接遺伝子伝達技術
を用いて発生した、形質転換された細胞から形質転換さ
れた植物を得るためには、プロトプラスト又は単一細胞
培養物から植物が再生 (regenerated)されなければなら
ない。しかしながらホモノ科植物のプロトプラスト又は
単一細胞培養物から植物を再生することに未だ誰も成功
していない。実際、ホモノ科の形質転換された植物又は
他の形質転換された分化した器官もしくは組織を生産す
る手段は現在知られておらず、又ホモノ科植物の農業上
重要な形態又は部分、例えば種子、花粉、穂 (ears) 又
は植物体において外来ＤＮＡの発現を許容する手法でホ
モノ科植物を形質転換する手段は未だ存在しない。最後
に、１９８６年２月１３日に発行されたＰＣＴ国際公開
第ＷＯ８６／００９３１ (Simpson ら）は完全な植物体
を形質転換し再生する生体内手法を教示している。この
特許出願はその発明の方法はＡ. テュメファシエンス苗
条（shooty) 変異株の感染につづいて苗条腫瘍 (shooty
tumor) を形成するいかなる植物の形質転換にも用いる
ことができることができると記載している。しかしなが
ら上記したごとく、ホモノ科植物がＡ. テュメファシエ
ンスの植菌によって腫瘍又はふくれさえも生ずることは
知られていない。この発明の実施において、Ａ. テュメ
ファシエンスの植菌によるいかなる種類の腫瘍、ふくれ
(swellings)又は細胞増殖もホモノ科植物に観察されて
いない。
８（１９８５）において、Fromm らは Nature,３１９，
７９１（１９８６）において、及び Portrykus らは M
ol.Gen. Genet.,１９９，１８３（１９８５）におい
て、プロトプラストへの直接遺伝子伝達によるホモノ科
植物の形質転換について報告した。プロトプラストは細
胞壁が酵素による消化によって取り除かれた植物細胞で
ある。Longらはノパリンシンターゼプロモーター、及び
オクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化調節シグ
ナルを含有するＤＮＡを用いるTriticum monococcumの
プロトプラストを形質転換した。Fromm らはプラスミド
ｐＣａＭＶＮＥＯ（カリフラワーモザイクウィルス３５
Ｓプロモーター、トランスポゾンＴｎ５からのネオマイ
シンホスホトランスフェラーゼ１リットル遺伝子、及び
ノバリンシンターゼ３′領域を含有する）のとうもろこ
しプロトプラストへのエレクトロポレーションによる伝
達の結果として、カナマイシン抵抗性の、安定に形質転
換されたとうもろこし細胞が得られることを開示してい
る。Hooykass-Van Slogteren ら、Hernalsteensら、Gra
ves、及び DeCleene 及びDeLey の感染技術、又は Long
ら、Fromm ら及び Portrykusらの直接遺伝子伝達技術
を用いて発生した、形質転換された細胞から形質転換さ
れた植物を得るためには、プロトプラスト又は単一細胞
培養物から植物が再生 (regenerated)されなければなら
ない。しかしながらホモノ科植物のプロトプラスト又は
単一細胞培養物から植物を再生することに未だ誰も成功
していない。実際、ホモノ科の形質転換された植物又は
他の形質転換された分化した器官もしくは組織を生産す
る手段は現在知られておらず、又ホモノ科植物の農業上
重要な形態又は部分、例えば種子、花粉、穂 (ears) 又
は植物体において外来ＤＮＡの発現を許容する手法でホ
モノ科植物を形質転換する手段は未だ存在しない。最後
に、１９８６年２月１３日に発行されたＰＣＴ国際公開
第ＷＯ８６／００９３１ (Simpson ら）は完全な植物体
を形質転換し再生する生体内手法を教示している。この
特許出願はその発明の方法はＡ. テュメファシエンス苗
条（shooty) 変異株の感染につづいて苗条腫瘍 (shooty
tumor) を形成するいかなる植物の形質転換にも用いる
ことができることができると記載している。しかしなが
ら上記したごとく、ホモノ科植物がＡ. テュメファシエ
ンスの植菌によって腫瘍又はふくれさえも生ずることは
知られていない。この発明の実施において、Ａ. テュメ
ファシエンスの植菌によるいかなる種類の腫瘍、ふくれ
(swellings)又は細胞増殖もホモノ科植物に観察されて
いない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、(1) 形
質転換された花粉粒、(2) vir+ Ａ. テュメファシエン
スに感染した実生から生長した植物によって生産され
た、形質転換された花粉粒、(3) 遺伝学的に設計された
Ｔ−ＤＮＡを含有するベクターを含有する vir+ Ａ. テ
ュメファシエンスに感染した実生から生長した植物によ
って生産された形質転換された花粉粒、(4) その細胞が
Ｔ−ＤＮＡの少くとも１つの分節（segment)を含む花粉
粒、及び(5) これら４つの花粉粒から導かれるホモノ科
植物が提供される。さらに(1) 形質転換されたホモノ科
植物体 (Gramineae plant 。以下、同様に Gramineaeに
対してはホモノ科植物、Gramineae plant に対してはホ
モノ科植物体という) 、(2) vir+ Ａ. テュメファシエ
ンスに感染した実生から導かれた、形質転換されたホモ
ノ科植物体、(3) 伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有
するベクターを含有する vir+ Ａ. テュメファシエンス
に感染した実生から導かれた、形質転換されたホモノ科
植物体、及び(4) その細胞がＴ−ＤＮＡ分節を含有する
ホモノ科植物体が提供される。最後に vir+ Ａ. テュメ
ファシエンスに感染した実生から導かれた、形質転換さ
れたホモノ科植物、及び遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮ
Ａを含有するベクターを含有する vir+ Ａ. テュメファ
シエンスに感染した実生から導かれた、形質転換された
ホモノ科植物が提供される。
質転換された花粉粒、(2) vir+ Ａ. テュメファシエン
スに感染した実生から生長した植物によって生産され
た、形質転換された花粉粒、(3) 遺伝学的に設計された
Ｔ−ＤＮＡを含有するベクターを含有する vir+ Ａ. テ
ュメファシエンスに感染した実生から生長した植物によ
って生産された形質転換された花粉粒、(4) その細胞が
Ｔ−ＤＮＡの少くとも１つの分節（segment)を含む花粉
粒、及び(5) これら４つの花粉粒から導かれるホモノ科
植物が提供される。さらに(1) 形質転換されたホモノ科
植物体 (Gramineae plant 。以下、同様に Gramineaeに
対してはホモノ科植物、Gramineae plant に対してはホ
モノ科植物体という) 、(2) vir+ Ａ. テュメファシエ
ンスに感染した実生から導かれた、形質転換されたホモ
ノ科植物体、(3) 伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有
するベクターを含有する vir+ Ａ. テュメファシエンス
に感染した実生から導かれた、形質転換されたホモノ科
植物体、及び(4) その細胞がＴ−ＤＮＡ分節を含有する
ホモノ科植物体が提供される。最後に vir+ Ａ. テュメ
ファシエンスに感染した実生から導かれた、形質転換さ
れたホモノ科植物、及び遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮ
Ａを含有するベクターを含有する vir+ Ａ. テュメファ
シエンスに感染した実生から導かれた、形質転換された
ホモノ科植物が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】本明細書には、さらに、急速に分
裂している細胞を含む実生 (seedling) 部分に傷をつ
け、ついでその傷に vir+ Ａ. テュメファシエンスを植
菌することを特徴とする、形質転換されたホモノ科植物
（禾本科植物、Gramineae)の生産方法が開示され、その
好ましい態様において、その傷は生殖系列細胞のもとと
なる実生部分につけられる。又好ましくは遺伝学的に設
計された (genetically-engineered) Ｔ−ＤＮＡを含有
するベクターを含有する vir+ Ａ. テュメファシエンス
についても開示される。葉、植物体及び花粉のような形
質転換された、分化した器官及び組織の生産に帰結する
ホモノ科植物を形質転換する方法は有用である。かくの
ごとく、この方法はホモノ科植物の農業上重要な形態や
部分に外来のＤＮＡの発現を可能にする、ホモノ科植物
を形質転換する方法である。ホモノ科植物（例えばとう
もろこし、オート麦、ライ麦、大麦、ソルガム、米及び
小麦）の多くはもちろん人及び他の動物の商業上重要な
食料源であり、特に、変更した特性又はより優れた特性
を有するホモノ科株、例えばより高い収量をもたらす
株、除草剤抵抗性又はよりよい栄養価値を有する株の開
発を、そのような特性をコードする外来ＤＮＡをホモノ
科植物に入れることによって可能にする。
裂している細胞を含む実生 (seedling) 部分に傷をつ
け、ついでその傷に vir+ Ａ. テュメファシエンスを植
菌することを特徴とする、形質転換されたホモノ科植物
（禾本科植物、Gramineae)の生産方法が開示され、その
好ましい態様において、その傷は生殖系列細胞のもとと
なる実生部分につけられる。又好ましくは遺伝学的に設
計された (genetically-engineered) Ｔ−ＤＮＡを含有
するベクターを含有する vir+ Ａ. テュメファシエンス
についても開示される。葉、植物体及び花粉のような形
質転換された、分化した器官及び組織の生産に帰結する
ホモノ科植物を形質転換する方法は有用である。かくの
ごとく、この方法はホモノ科植物の農業上重要な形態や
部分に外来のＤＮＡの発現を可能にする、ホモノ科植物
を形質転換する方法である。ホモノ科植物（例えばとう
もろこし、オート麦、ライ麦、大麦、ソルガム、米及び
小麦）の多くはもちろん人及び他の動物の商業上重要な
食料源であり、特に、変更した特性又はより優れた特性
を有するホモノ科株、例えばより高い収量をもたらす
株、除草剤抵抗性又はよりよい栄養価値を有する株の開
発を、そのような特性をコードする外来ＤＮＡをホモノ
科植物に入れることによって可能にする。
【０００９】また、本明細書には、急速に分裂している
細胞を含む実生部分に傷をつけ、その傷に vir+ Ａ. テ
ュメファシエンスを植菌することを特徴とする、形質転
換されたホモノ科植物を生産する方法が開示される。こ
こで用いられるホモノ科植物(Gramineae) の語は植物体
(plaants)、種子、実生、花粉、穀粒 (kernels)、穂(e
ars)、葉、茎 (stalks) 、胚を含むホモノ科植物のすべ
ての形態及び部分をいうものとする。同様に「とうもろ
こし」「オート麦」、「小麦」、「ライ麦」及び「大
麦」の語はとうもろこし、オート麦、小麦、ライ麦及び
大麦のすべての形態及び部分を含むことを意味する。
「形質転換された」の語は外来ＤＮＡを細胞中に入れる
ことによって遺伝的に修飾されることを意味するものと
してここでは用いられる。「外来ＤＮＡ」(exogeous Ｄ
ＮＡ）の語は形質転換されるホモノ科株中に通常では見
い出されないＤＮＡを意味する。外来ＤＮＡは形質転換
されるホモノ科株以外のホモノ科株を含んで原核源又は
真核源から得ることができる。上記方法を実施するにあ
たり、形質転換されるホモノ科株は殺菌され、ついで種
子から幼根（最初の根）及び茎が出るまで発芽させる。
この状態は発芽後約４日で到来するが、この期間は最初
に種子を浸漬することによって短縮することができる。
細胞を含む実生部分に傷をつけ、その傷に vir+ Ａ. テ
ュメファシエンスを植菌することを特徴とする、形質転
換されたホモノ科植物を生産する方法が開示される。こ
こで用いられるホモノ科植物(Gramineae) の語は植物体
(plaants)、種子、実生、花粉、穀粒 (kernels)、穂(e
ars)、葉、茎 (stalks) 、胚を含むホモノ科植物のすべ
ての形態及び部分をいうものとする。同様に「とうもろ
こし」「オート麦」、「小麦」、「ライ麦」及び「大
麦」の語はとうもろこし、オート麦、小麦、ライ麦及び
大麦のすべての形態及び部分を含むことを意味する。
「形質転換された」の語は外来ＤＮＡを細胞中に入れる
ことによって遺伝的に修飾されることを意味するものと
してここでは用いられる。「外来ＤＮＡ」(exogeous Ｄ
ＮＡ）の語は形質転換されるホモノ科株中に通常では見
い出されないＤＮＡを意味する。外来ＤＮＡは形質転換
されるホモノ科株以外のホモノ科株を含んで原核源又は
真核源から得ることができる。上記方法を実施するにあ
たり、形質転換されるホモノ科株は殺菌され、ついで種
子から幼根（最初の根）及び茎が出るまで発芽させる。
この状態は発芽後約４日で到来するが、この期間は最初
に種子を浸漬することによって短縮することができる。
【００１０】傷は生殖系列細胞 (germ line cells)のも
ととなる急速に分裂している細胞の部分につけるのが好
ましい。傷をつけた後、実生に傷の中に vir+ Ａ. テュ
メファシエンスの溶液をたらすことによって植菌する。
vir+ Ａ. テュメファシエンスはＴ−ＤＮＡを宿主植物
細胞中に可動化し伝達することができる細菌であり、こ
れらの機能をコードする天然の又は合成のプラスミドを
担持するＡ. テュメファシエンスは vir+ である。かく
して、野性型のＴi プラスミドを担持するＡ.テュメフ
ァシエンス株は vir+ であり、上記方法に用いることが
できる。かかる菌株は数多く知られており、又公衆が入
手することができる。例えば AmericanType Culture Co
llection Catalogue (ATCC) of Strain I、p66 (15th e
ddition, 1982) 参照。野性型Ｔi プラスミドの vir+
領域を同じＴi プラスミド上のＴ−ＤＮＡを可動化し伝
達するために、又は同じ細菌中に含まれる別のプラスミ
ド上のＴ−ＤＮＡを引き渡すために用いることができ
る。さらに可動化及び伝達機能はヘルパープラスミドに
よって供給され得る。そのようなヘルパープラスミドは
Ditta らによってＰＮＡＳ，７７，７３４７（１９８
０）及び Bagdasarianらによって Gene,１６，２３７
（１９８１）に記述されている。したがって、ヘルパー
プラスミドを担持するＡ. テュメファシエンス株も vir
+ である。最後に可動化及び伝達機能はＴ−ＤＮＡを含
有する同じ設計の (engineered) プラスミドにコードす
ることができ、かかるプラスミドを含有する細菌も vir
+ である。
ととなる急速に分裂している細胞の部分につけるのが好
ましい。傷をつけた後、実生に傷の中に vir+ Ａ. テュ
メファシエンスの溶液をたらすことによって植菌する。
vir+ Ａ. テュメファシエンスはＴ−ＤＮＡを宿主植物
細胞中に可動化し伝達することができる細菌であり、こ
れらの機能をコードする天然の又は合成のプラスミドを
担持するＡ. テュメファシエンスは vir+ である。かく
して、野性型のＴi プラスミドを担持するＡ.テュメフ
ァシエンス株は vir+ であり、上記方法に用いることが
できる。かかる菌株は数多く知られており、又公衆が入
手することができる。例えば AmericanType Culture Co
llection Catalogue (ATCC) of Strain I、p66 (15th e
ddition, 1982) 参照。野性型Ｔi プラスミドの vir+
領域を同じＴi プラスミド上のＴ−ＤＮＡを可動化し伝
達するために、又は同じ細菌中に含まれる別のプラスミ
ド上のＴ−ＤＮＡを引き渡すために用いることができ
る。さらに可動化及び伝達機能はヘルパープラスミドに
よって供給され得る。そのようなヘルパープラスミドは
Ditta らによってＰＮＡＳ，７７，７３４７（１９８
０）及び Bagdasarianらによって Gene,１６，２３７
（１９８１）に記述されている。したがって、ヘルパー
プラスミドを担持するＡ. テュメファシエンス株も vir
+ である。最後に可動化及び伝達機能はＴ−ＤＮＡを含
有する同じ設計の (engineered) プラスミドにコードす
ることができ、かかるプラスミドを含有する細菌も vir
+ である。
【００１１】vir+ Ａ. テュメファシエンスによって伝
達されるＴ−ＤＮＡは生来のＴ−ＤＮＡであってもよい
が、好ましくは遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡである
のがよい。遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡは作動でき
る順序に結合したＴ−ＤＮＡ境界配列、異種構造遺伝子
（heterologous gene)及び転写単位を含有するＤＮＡ構
築物である。かかる構築物を調製する方法は当業界で公
知である。異種構造遺伝子はＴ−ＤＮＡ中に通常見い出
されず、かつ形質転換されるホモノ科株のＤＮＡ中にも
通常見い出されない遺伝子である。異種構造遺伝子は形
質転換される株以外のホモノ科株を含め原核及び真核源
から単離することができる。それらを含有する植物に耕
種学上重要な特性を授与する異種構造遺伝子が特に興味
深い。異種構造遺伝子の横には形質転換されたホモノ科
株中の当該異種構造遺伝子を発現することができる、例
えばプロモーター及びターミネーターを含有する転写単
位が並んでいる。この異種構造遺伝子−転写単位構築物
の横には境界配列が位置する。生来のものであろうと合
成されたものであろうといかなるＴ−ＤＮＡ境界配列
も、それが異種構造遺伝子を形質転換されるホモノ科株
の細胞ゲノム中に組み込むように機能する限り、異種構
造遺伝子−転写単位構築物にとなりあわせるために用い
ることができる。遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡはホ
モノ科株中で機能的であるレプリコンを含むＤＮＡ断片
に結合してベクターを形成させる。
達されるＴ−ＤＮＡは生来のＴ−ＤＮＡであってもよい
が、好ましくは遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡである
のがよい。遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡは作動でき
る順序に結合したＴ−ＤＮＡ境界配列、異種構造遺伝子
（heterologous gene)及び転写単位を含有するＤＮＡ構
築物である。かかる構築物を調製する方法は当業界で公
知である。異種構造遺伝子はＴ−ＤＮＡ中に通常見い出
されず、かつ形質転換されるホモノ科株のＤＮＡ中にも
通常見い出されない遺伝子である。異種構造遺伝子は形
質転換される株以外のホモノ科株を含め原核及び真核源
から単離することができる。それらを含有する植物に耕
種学上重要な特性を授与する異種構造遺伝子が特に興味
深い。異種構造遺伝子の横には形質転換されたホモノ科
株中の当該異種構造遺伝子を発現することができる、例
えばプロモーター及びターミネーターを含有する転写単
位が並んでいる。この異種構造遺伝子−転写単位構築物
の横には境界配列が位置する。生来のものであろうと合
成されたものであろうといかなるＴ−ＤＮＡ境界配列
も、それが異種構造遺伝子を形質転換されるホモノ科株
の細胞ゲノム中に組み込むように機能する限り、異種構
造遺伝子−転写単位構築物にとなりあわせるために用い
ることができる。遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡはホ
モノ科株中で機能的であるレプリコンを含むＤＮＡ断片
に結合してベクターを形成させる。
【００１２】実生に vir+ Ａ. テュメファシエンスを植
菌した後、これを形質転換が起こるまでインキュベート
し、ついで植え、少なくとも花粉を生ずるようになるま
で生長させる。本発明方法を用いることによってクラウ
ンゴール、カルスもしくは腫瘍状生長過多を含めいずれ
の種類の腫瘍生長も観察されなかった、最初に植菌され
た実生でさえも観察されなかったことは興味深いことで
ある。実生の好ましい部位に植菌することによって花粉
の形質転換がなされた。得られた形質転換された花粉は
形質転換され及びされていない植物体を受精させるのに
用いることができる。得られる子孫の穂から胚を切り取
り、これを生長させることにより形質転換された植物体
を得ることができる。又は、もちろんこの交配により得
られる植物体に種子をつくらせ、これを種子の別の収穫
を生ずる形質転換された植物体を生長させるために用い
ることもできる。かくのごとく、有性生殖によって最初
に形質転換された実生から後の世代を導くことができ
る。当業者は種々の多くの外来遺伝子によってコードさ
れた特性を担持する子孫を既知の育種技術を用いて生産
することができることを認識するであろう。
菌した後、これを形質転換が起こるまでインキュベート
し、ついで植え、少なくとも花粉を生ずるようになるま
で生長させる。本発明方法を用いることによってクラウ
ンゴール、カルスもしくは腫瘍状生長過多を含めいずれ
の種類の腫瘍生長も観察されなかった、最初に植菌され
た実生でさえも観察されなかったことは興味深いことで
ある。実生の好ましい部位に植菌することによって花粉
の形質転換がなされた。得られた形質転換された花粉は
形質転換され及びされていない植物体を受精させるのに
用いることができる。得られる子孫の穂から胚を切り取
り、これを生長させることにより形質転換された植物体
を得ることができる。又は、もちろんこの交配により得
られる植物体に種子をつくらせ、これを種子の別の収穫
を生ずる形質転換された植物体を生長させるために用い
ることもできる。かくのごとく、有性生殖によって最初
に形質転換された実生から後の世代を導くことができ
る。当業者は種々の多くの外来遺伝子によってコードさ
れた特性を担持する子孫を既知の育種技術を用いて生産
することができることを認識するであろう。
【００１３】
【実施例】とうもろこしの形質転換
実施例１
Ａ. 細菌に調製
Ａ. テュメファシエンスＢ６株の単一コロニーを水中に
溶解した0.１％酵母エキス、0.８％栄養ブロス及び0.５
％ショ糖を含有する酵母抽出ブロス（ＹＥＢ）に植菌し
た。酵母抽出ブロス及び栄養ブロスは Difco Laborator
ies 、デトロイト、ミシガンより購入した。ショ糖は F
isher Scientific、デトロイト、ミシガン又は Sigma、
セントルイス、ミズーリより購入した。細菌は振盪させ
た水浴中該ＹＥＢで２７℃で４８時間インキュベートす
るか、最終濃度が3.８×１０9 cells ／ｍl になるまで
インキュベートした。Ｂ６株はＡ. テュメファシエンス
の標準野性型株である。該菌は病原性 (virulent) （ v
ir+ ）で適当な植物宿主中でリゾピンデヒドロゲナーゼ
を生産するためのコードを有している。この株は North
western 大学、Evanston、イリノイのJames 及びBarbar
a によって取得された。この株の性質のいつくかは Sto
nier、J. Bact., ７９、８８９（１９６０）に記述され
ている。Ｂ６株は又アメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ＡＴＣＣ）、Rockville 、メリーランドに寄託
されており、受入れ番号２３３０８を与えられている。
溶解した0.１％酵母エキス、0.８％栄養ブロス及び0.５
％ショ糖を含有する酵母抽出ブロス（ＹＥＢ）に植菌し
た。酵母抽出ブロス及び栄養ブロスは Difco Laborator
ies 、デトロイト、ミシガンより購入した。ショ糖は F
isher Scientific、デトロイト、ミシガン又は Sigma、
セントルイス、ミズーリより購入した。細菌は振盪させ
た水浴中該ＹＥＢで２７℃で４８時間インキュベートす
るか、最終濃度が3.８×１０9 cells ／ｍl になるまで
インキュベートした。Ｂ６株はＡ. テュメファシエンス
の標準野性型株である。該菌は病原性 (virulent) （ v
ir+ ）で適当な植物宿主中でリゾピンデヒドロゲナーゼ
を生産するためのコードを有している。この株は North
western 大学、Evanston、イリノイのJames 及びBarbar
a によって取得された。この株の性質のいつくかは Sto
nier、J. Bact., ７９、８８９（１９６０）に記述され
ている。Ｂ６株は又アメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ＡＴＣＣ）、Rockville 、メリーランドに寄託
されており、受入れ番号２３３０８を与えられている。
【００１４】Ｂ．とうもろこしの調製
とうもろこしの生得の黄色 Iochief株の種子は Anderso
ns, Maumee, オハイオ又は Botzum, 43, East Market,
Akron,オハイオより取得した。この株は商業的に購入で
きる標準株である。黄色 Iochief種子は以下の手法によ
り殺菌した。種子をまず９５％エタノール７部及び蒸留
水2.５部を含有する溶液に２分間浸漬した。ついで、種
子を蒸留水中の0.５％（ｗ／ｖ）HgCl2 溶液中で５分イ
ンキュベートした。種子を蒸留水中の１５％（ｖ／ｖ）
Clorox（Cloroxは5.２５％次亜塩素酸ナトリウムを含有
する水溶液である）及び0.１％（ｖ／ｖ）のPalmolive
のような皿洗い用液体洗剤又は他の適当な湿潤剤の溶液
中で全部で３０分洗浄した。最後に種子を殺菌した２度
蒸留した水中で５回洗った。殺菌した種子を胚側を上に
してペトリ皿中の殺菌し湿らせた Whatman No.３濾紙上
に置いた。種子を一定の暗さに保つべくカバーしたペト
リ皿中２５℃で４日間インキュベートした。濾紙はイン
キュベート期間中湿りを維持させた。
ns, Maumee, オハイオ又は Botzum, 43, East Market,
Akron,オハイオより取得した。この株は商業的に購入で
きる標準株である。黄色 Iochief種子は以下の手法によ
り殺菌した。種子をまず９５％エタノール７部及び蒸留
水2.５部を含有する溶液に２分間浸漬した。ついで、種
子を蒸留水中の0.５％（ｗ／ｖ）HgCl2 溶液中で５分イ
ンキュベートした。種子を蒸留水中の１５％（ｖ／ｖ）
Clorox（Cloroxは5.２５％次亜塩素酸ナトリウムを含有
する水溶液である）及び0.１％（ｖ／ｖ）のPalmolive
のような皿洗い用液体洗剤又は他の適当な湿潤剤の溶液
中で全部で３０分洗浄した。最後に種子を殺菌した２度
蒸留した水中で５回洗った。殺菌した種子を胚側を上に
してペトリ皿中の殺菌し湿らせた Whatman No.３濾紙上
に置いた。種子を一定の暗さに保つべくカバーしたペト
リ皿中２５℃で４日間インキュベートした。濾紙はイン
キュベート期間中湿りを維持させた。
【００１５】Ｃ．実生へのＡ. テュメファシエンスの植
菌 とうもろこしの実生中で急速に細胞が分裂している２つ
の基本的な場所は根冠、及び胚盤瘤 (scutellar node)
のふもとから中茎を通って子葉鞘瘤 (coleoptile node)
よりわずかに先にまでまたがる部分である。これらの場
所は第１Ａ図及び１Ｂ図に示されている。中茎は胚盤瘤
と子葉鞘瘤の間の部分である。本発明を好ましく行うた
めには胚盤瘤のふもとから子葉鞘瘤を通ってその少し先
までにまたがる部分に傷をつける。その理由は生殖系列
細胞 (germ line cells)のもととなる組織がその領域に
含まれているからである。特にこの領域の葉腋原始細胞
(axillary primordia) のもとになる組織が見い出さ
れ、この組織は今度は若木 (tillers)及び穂 (ears)
（雌生殖器官）のもとになる。この領域には又ふさ毛の
もととなる頂端分裂組織があり、ふさ毛は今度は花粉
（雄生殖器官）のもととなる。この好ましい領域の実生
に接種することによって、生殖系列細胞の形質転換体が
得られる。この実施例のＣ部で調製した、発芽しつつあ
る各とうもろこし実生の表面の、胚盤瘤のふもとから子
葉鞘瘤を通ってその少し先までにまたがる部分に全部で
４つの傷をつけた。実生は前面から第１Ｂ図に示すよう
にみえるが、この傷はこの地域を縦に２分する線（中心
線）を目にみえるようにつけることによってなされた。
切込みは中心線に垂直に、中心線から実生の外側の縁に
向けて、実生を第１Ｂ図のようにみるときは実生の前面
から切込みがなされる部分におけるすべての組織を通し
て、なされた。切込みは胚盤瘤の部位になすときは前面
からすべての組織を通して胚盤中にまで、中茎になすと
きは前面からすべての組織を完全に通してなされた。４
つの傷は第１Ｂ図の数字１によって示す。これら４つの
傷に上記Ａ部で記述したようにして培養したＹＥＢ中の
Ａ. テュメファシエンスＢ６株の１０9 cells ／ｍl 懸
濁液を全部で１００μl たらすことによって接種した。
コントロールとしていくつかの実生には0.９％ NaCl
（食塩水）を接種した。接種後、実生を胚側を上にして
ペトリ皿中のバクト寒天（Bactoagar)層上に、皿あたり
５実生置いた。ペトリ皿は蒸留水中２０ｇ／ｌの濃度の
殺菌バクト寒天（Difco Laboratoriesより購入）２０ｍ
l を含んでいた。カバーしたペトリ皿を一定の暗さで２
７℃でさらに７−１４日インキュベートした。
菌 とうもろこしの実生中で急速に細胞が分裂している２つ
の基本的な場所は根冠、及び胚盤瘤 (scutellar node)
のふもとから中茎を通って子葉鞘瘤 (coleoptile node)
よりわずかに先にまでまたがる部分である。これらの場
所は第１Ａ図及び１Ｂ図に示されている。中茎は胚盤瘤
と子葉鞘瘤の間の部分である。本発明を好ましく行うた
めには胚盤瘤のふもとから子葉鞘瘤を通ってその少し先
までにまたがる部分に傷をつける。その理由は生殖系列
細胞 (germ line cells)のもととなる組織がその領域に
含まれているからである。特にこの領域の葉腋原始細胞
(axillary primordia) のもとになる組織が見い出さ
れ、この組織は今度は若木 (tillers)及び穂 (ears)
（雌生殖器官）のもとになる。この領域には又ふさ毛の
もととなる頂端分裂組織があり、ふさ毛は今度は花粉
（雄生殖器官）のもととなる。この好ましい領域の実生
に接種することによって、生殖系列細胞の形質転換体が
得られる。この実施例のＣ部で調製した、発芽しつつあ
る各とうもろこし実生の表面の、胚盤瘤のふもとから子
葉鞘瘤を通ってその少し先までにまたがる部分に全部で
４つの傷をつけた。実生は前面から第１Ｂ図に示すよう
にみえるが、この傷はこの地域を縦に２分する線（中心
線）を目にみえるようにつけることによってなされた。
切込みは中心線に垂直に、中心線から実生の外側の縁に
向けて、実生を第１Ｂ図のようにみるときは実生の前面
から切込みがなされる部分におけるすべての組織を通し
て、なされた。切込みは胚盤瘤の部位になすときは前面
からすべての組織を通して胚盤中にまで、中茎になすと
きは前面からすべての組織を完全に通してなされた。４
つの傷は第１Ｂ図の数字１によって示す。これら４つの
傷に上記Ａ部で記述したようにして培養したＹＥＢ中の
Ａ. テュメファシエンスＢ６株の１０9 cells ／ｍl 懸
濁液を全部で１００μl たらすことによって接種した。
コントロールとしていくつかの実生には0.９％ NaCl
（食塩水）を接種した。接種後、実生を胚側を上にして
ペトリ皿中のバクト寒天（Bactoagar)層上に、皿あたり
５実生置いた。ペトリ皿は蒸留水中２０ｇ／ｌの濃度の
殺菌バクト寒天（Difco Laboratoriesより購入）２０ｍ
l を含んでいた。カバーしたペトリ皿を一定の暗さで２
７℃でさらに７−１４日インキュベートした。
【００１６】Ｄ．検定
1.実生中の酵素活性の検定
７−１４日のインキュベーション期間の終わりに実生を
0.５Ｍショ糖、0.１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸及び0.
１％（ｗ／ｖ）システイン−ＨＣl を含有する0.１Ｍト
リス−ＨＣl バッファー（ｐＨ8.０）中でWheaton 組織
粉砕機を用いてホモゲナイズ物が均質性を有するに至る
までホモゲナイズした。実生は暗やみで生長したので、
色素形成は遅れ、細胞壁は通常と異なり柔軟なまま残さ
れた。従って実生の細胞は容易に破れた。ついでホモゲ
ナイズ物を Fisher Microfuge 中で１3,０００×ｇで２
分間回転して細胞のない抽出物を得た。この無細胞抽出
物の一部を同量の、リゾピンデヒドロゲナーゼ活性を検
出すべく企画した反応培地に加えた。この培地は0.２Ｍ
リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ7.０）中で溶解した
３０mMＬ−アルギニン、７３mMピルベート及び２０mMＮ
ＡＤＨよりなっていた。酵素反応は室温で以下に示す時
間行わせた。酵素反応生成物はWheaton ３ＭＭ紙上で電
気泳動によって分離した。酵素反応の開始時点（時間
零）で反応混合物の５μl サンプルを紙の陽極部位につ
け、乾燥させた。次いで、合成オクトピン (Calbioche
m, Division of American Hoescht, La Jolla, Califor
niaより購入）の１００μｇ／ｍl 溶液の５μl サンプ
ル、及び合成ノパリン（Sigma, St. Louis, Missouriよ
り購入) の100 μｇ／ｍl溶液の５μl サンプルを紙の
上につけ乾燥させた。電気泳動はギ酸（９0.８％）／氷
酢酸／水（５：１５：８０、ｖ／ｖ）溶液（ｐＨ1.８）
中、４５０ボルトで2.５時間行われた。紙を乾燥させ、
ついで無水エタノール中の0.０２％（ｗ／ｖ）フェナン
トレンキノン１部及び６０％（ｖ／ｖ）エタノール中の
１０％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ１部を含有する溶液に浸して
汚した(stained)。乾燥後、スポットを長波長紫外線灯
（３６６ nｍ）のもとで視覚化した。
0.５Ｍショ糖、0.１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸及び0.
１％（ｗ／ｖ）システイン−ＨＣl を含有する0.１Ｍト
リス−ＨＣl バッファー（ｐＨ8.０）中でWheaton 組織
粉砕機を用いてホモゲナイズ物が均質性を有するに至る
までホモゲナイズした。実生は暗やみで生長したので、
色素形成は遅れ、細胞壁は通常と異なり柔軟なまま残さ
れた。従って実生の細胞は容易に破れた。ついでホモゲ
ナイズ物を Fisher Microfuge 中で１3,０００×ｇで２
分間回転して細胞のない抽出物を得た。この無細胞抽出
物の一部を同量の、リゾピンデヒドロゲナーゼ活性を検
出すべく企画した反応培地に加えた。この培地は0.２Ｍ
リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ7.０）中で溶解した
３０mMＬ−アルギニン、７３mMピルベート及び２０mMＮ
ＡＤＨよりなっていた。酵素反応は室温で以下に示す時
間行わせた。酵素反応生成物はWheaton ３ＭＭ紙上で電
気泳動によって分離した。酵素反応の開始時点（時間
零）で反応混合物の５μl サンプルを紙の陽極部位につ
け、乾燥させた。次いで、合成オクトピン (Calbioche
m, Division of American Hoescht, La Jolla, Califor
niaより購入）の１００μｇ／ｍl 溶液の５μl サンプ
ル、及び合成ノパリン（Sigma, St. Louis, Missouriよ
り購入) の100 μｇ／ｍl溶液の５μl サンプルを紙の
上につけ乾燥させた。電気泳動はギ酸（９0.８％）／氷
酢酸／水（５：１５：８０、ｖ／ｖ）溶液（ｐＨ1.８）
中、４５０ボルトで2.５時間行われた。紙を乾燥させ、
ついで無水エタノール中の0.０２％（ｗ／ｖ）フェナン
トレンキノン１部及び６０％（ｖ／ｖ）エタノール中の
１０％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ１部を含有する溶液に浸して
汚した(stained)。乾燥後、スポットを長波長紫外線灯
（３６６ nｍ）のもとで視覚化した。
【００１７】Ｂ６植菌実生の無細胞抽出液をリゾピンデ
ヒドロゲナーゼ反応培地に加えて調製した生産物の電気
泳動の結果を第２Ａ図に示す。この図中、レーン (lan
e) １は時間零点で１０個のＢ６植菌実生の無細胞抽出
液の一部を同量のリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地に
加えて生産した反応混合物のサンプルを含み、レーン２
は１０個のＢ６植菌実生の無細胞抽出液の一部を同量の
リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュ
ベートして生産した生産物を含み、レーン３は合成オク
トピンを含み、レーン４は時間零点で１０個の食塩水接
種実生の無細胞抽出液を同量のリゾピンデヒドロゲナー
ゼ反応培地に加えて作成した生産物を含み、レーン５は
１０個の食塩水接種実生の無細胞抽出液の一部を同量の
リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュ
ベートして作成した生産物を含み、レーン６は合成ノパ
リンを含む。第２Ａ図はオクトピン生産がＢ６植菌とう
もろこし実生の無細胞抽出液によって引き起こされるが
（レーン２）、食塩水コントロールでは引き起こされな
い（レーン５）ことを示している。さらに、フェナント
レンキノリン蛍光の増加で測定される、生産されたオク
トピンの量はインキュベーションの時間に比例して増加
する。時間零点ではオクトピンは検出されないのに（レ
ーン１）、１５時間のインキュベーションの後では明ら
かに存在している（レーン２）。このような結果は反応
が酵素によって触媒され、Ｂ６感染とうもろこし実生か
ら抽出した酵素がリゾピンデヒドロゲナーゼであるとい
う提案と一致する。形質転換された植物組織のみがオパ
イン合成遺伝子を発現することが知られているので、こ
れらの結果はとうもろこし実生が vir+ Ａ. テュメファ
シエンスＢ６株の感染で形質転換されたとする提案とも
一致する。
ヒドロゲナーゼ反応培地に加えて調製した生産物の電気
泳動の結果を第２Ａ図に示す。この図中、レーン (lan
e) １は時間零点で１０個のＢ６植菌実生の無細胞抽出
液の一部を同量のリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地に
加えて生産した反応混合物のサンプルを含み、レーン２
は１０個のＢ６植菌実生の無細胞抽出液の一部を同量の
リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュ
ベートして生産した生産物を含み、レーン３は合成オク
トピンを含み、レーン４は時間零点で１０個の食塩水接
種実生の無細胞抽出液を同量のリゾピンデヒドロゲナー
ゼ反応培地に加えて作成した生産物を含み、レーン５は
１０個の食塩水接種実生の無細胞抽出液の一部を同量の
リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュ
ベートして作成した生産物を含み、レーン６は合成ノパ
リンを含む。第２Ａ図はオクトピン生産がＢ６植菌とう
もろこし実生の無細胞抽出液によって引き起こされるが
（レーン２）、食塩水コントロールでは引き起こされな
い（レーン５）ことを示している。さらに、フェナント
レンキノリン蛍光の増加で測定される、生産されたオク
トピンの量はインキュベーションの時間に比例して増加
する。時間零点ではオクトピンは検出されないのに（レ
ーン１）、１５時間のインキュベーションの後では明ら
かに存在している（レーン２）。このような結果は反応
が酵素によって触媒され、Ｂ６感染とうもろこし実生か
ら抽出した酵素がリゾピンデヒドロゲナーゼであるとい
う提案と一致する。形質転換された植物組織のみがオパ
イン合成遺伝子を発現することが知られているので、こ
れらの結果はとうもろこし実生が vir+ Ａ. テュメファ
シエンスＢ６株の感染で形質転換されたとする提案とも
一致する。
【００１８】２．基質特異性の検定
リゾピンデヒドロゲナーゼはオクトピンの合成を触媒す
るが、ノパリンの合成は触媒しない。実生抽出液をノパ
リンデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出に許容される試薬
を含有する反応培地に加えることによって得た生産物の
電気泳動の結果を第２Ｂ図に示す。ノパリンデヒドロゲ
ナーゼ反応培地は0.２Ｍリン酸ナトリウムバッファー
（ｐＨ7.０）中に溶解した６０mMＬ−アルギニン、６０
mMα−ケトグルタレート及び１６mMＮＡＤＨよりなる。
α−ケトグルタレートはノパリンデヒドロゲナーゼによ
ってのみ基質として用いられる。第２Ｂ図のレーン１〜
６は第２Ａ図のレーン１〜６と反応培地がノパリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地であることを除き同じである。第
２Ｂ図はＢ６株を植菌した実生の無細胞抽出液はアルギ
ニンとの縮合反応でα−ケトグルタレートを用いてノパ
リンを生産することができないことを示している。この
基質特異性はＢ６株によって形質転換された実生によっ
て生産された酵素のリゾピンデヒドロゲナーゼとしての
同定を確認するものである。
るが、ノパリンの合成は触媒しない。実生抽出液をノパ
リンデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出に許容される試薬
を含有する反応培地に加えることによって得た生産物の
電気泳動の結果を第２Ｂ図に示す。ノパリンデヒドロゲ
ナーゼ反応培地は0.２Ｍリン酸ナトリウムバッファー
（ｐＨ7.０）中に溶解した６０mMＬ−アルギニン、６０
mMα−ケトグルタレート及び１６mMＮＡＤＨよりなる。
α−ケトグルタレートはノパリンデヒドロゲナーゼによ
ってのみ基質として用いられる。第２Ｂ図のレーン１〜
６は第２Ａ図のレーン１〜６と反応培地がノパリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地であることを除き同じである。第
２Ｂ図はＢ６株を植菌した実生の無細胞抽出液はアルギ
ニンとの縮合反応でα−ケトグルタレートを用いてノパ
リンを生産することができないことを示している。この
基質特異性はＢ６株によって形質転換された実生によっ
て生産された酵素のリゾピンデヒドロゲナーゼとしての
同定を確認するものである。
【００１９】３．形質転換効率
この問題に対処するために、単一実生の検定を行い、オ
クトパンを生産した単一実生の無細胞抽出液の数を決定
した。結果を第３Ａ図に示すが、そこですべてのレーン
は単一Ｂ６植菌実生からの無細胞抽出液をリゾピンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地で４時間インキュベートして得た
生産物を含有する。第３Ａ図に示されるごとく、１０の
レーンのうち８つはフェナントレンキノンをつけ、オク
トピン標品と共に移動するスポットを有している。すな
わち、この実験での形質転換効率は８０％であった。
クトパンを生産した単一実生の無細胞抽出液の数を決定
した。結果を第３Ａ図に示すが、そこですべてのレーン
は単一Ｂ６植菌実生からの無細胞抽出液をリゾピンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地で４時間インキュベートして得た
生産物を含有する。第３Ａ図に示されるごとく、１０の
レーンのうち８つはフェナントレンキノンをつけ、オク
トピン標品と共に移動するスポットを有している。すな
わち、この実験での形質転換効率は８０％であった。
【００２０】４．コントロール
生産されたオクトピンがある第２の及び興味のないでき
ごとの結果であったという可能性を除外するために、い
くつかの追加のコントロールを用いた。第４Ａ図に示す
ごとく、上記Ａ部に記述したようにして４８時間培養し
たＢ６の懸濁液の無細胞超音波処理液の電気泳動は、蓄
積したオクトピンを記していない（レーン１及び２）。
さらに、これらの超音波処理液をリゾピンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地と混合して４時間インキュベートしたと
き、リゾピンデヒドロゲナーゼ活性は検出されなかっ
た。第４Ｂ図、レーン１、２及び３参照（そこではこの
インキュベーションの生産物が電気泳動された）。かく
のごとく、リゾピンデヒドロゲナーゼ活性は４８時間細
菌培養物中に見い出されない。又、リゾピンデヒドロゲ
ナーゼ反応培地単独はオクトピンを含有していなかっ
た。第４Ｂ図、レーン４参照（そこではこの反応培地単
独が電気泳動された）。同様にこのデヒドロゲナーゼが
未感染とうもろこし実生中に存在するという証拠は見い
出されていない。第４Ｃ図参照（該図は電気泳動図であ
り、そこでレーン１〜５は未感染単一実生の無細胞抽出
液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地で４時間インキ
ュベートして得た生産物を含有している）。これらの結
果はＢ６植菌実生の無細胞抽出液中におけるリゾピンデ
ヒドロゲナーゼ活性の存在が実生の形質転換によるもの
であり、ある第２の又は興味のないできごとによるもの
でないことを確認している。
ごとの結果であったという可能性を除外するために、い
くつかの追加のコントロールを用いた。第４Ａ図に示す
ごとく、上記Ａ部に記述したようにして４８時間培養し
たＢ６の懸濁液の無細胞超音波処理液の電気泳動は、蓄
積したオクトピンを記していない（レーン１及び２）。
さらに、これらの超音波処理液をリゾピンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地と混合して４時間インキュベートしたと
き、リゾピンデヒドロゲナーゼ活性は検出されなかっ
た。第４Ｂ図、レーン１、２及び３参照（そこではこの
インキュベーションの生産物が電気泳動された）。かく
のごとく、リゾピンデヒドロゲナーゼ活性は４８時間細
菌培養物中に見い出されない。又、リゾピンデヒドロゲ
ナーゼ反応培地単独はオクトピンを含有していなかっ
た。第４Ｂ図、レーン４参照（そこではこの反応培地単
独が電気泳動された）。同様にこのデヒドロゲナーゼが
未感染とうもろこし実生中に存在するという証拠は見い
出されていない。第４Ｃ図参照（該図は電気泳動図であ
り、そこでレーン１〜５は未感染単一実生の無細胞抽出
液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地で４時間インキ
ュベートして得た生産物を含有している）。これらの結
果はＢ６植菌実生の無細胞抽出液中におけるリゾピンデ
ヒドロゲナーゼ活性の存在が実生の形質転換によるもの
であり、ある第２の又は興味のないできごとによるもの
でないことを確認している。
【００２１】実施例２
Ａ．微生物の調製：Ａ. ツメファシエンス菌株Ｃ５８の
単コロニーをＹＥＢに接種し、この微生物を実施例１の
パートＡで菌株Ｂ６について記載したようにしてインキ
ュベートした。Ｃ５８菌株はＡ. ツメファシエンスの標
準野外タイプの菌株である。この菌株は vir+ であり適
当な植物宿主中でノパリンデヒドロゲナーゼの産生をコ
ードする。この菌株はイリノイ州エバンストンのノース
ウエスタン大学のジェムス（James)氏及びバーバラ リ
ッピンコット氏(Barbara Lippincott)からあるいはカル
ホニア州デービスのカルホルニア大学植物病理学部門の
クラレンス カド（Clarence Kado)氏より入手した。こ
の菌株はデピッカー (Depicker) 等の“プラスミド (Pl
asmid)、３、１９３（１９８０）”及びカオ(Kao) 等の
“Molec. Gen.Genet.,１８８，４２５（１９８２）”
に記載されている。菌株Ｃ５８はまたＡＴＣＣに寄託し
てあり、寄託番号３３９７Ｄが与えられている。 Ｂ．とうもろこしの形質転換：とうもろこしの近交黄色
イオチーフ (Jochief)系を滅菌し、発芽させ、接種し、
さらに実施例１のパートＢ及びＣに記載したようにして
７〜１４日間インキュベートしたが、とうもろこし実生
(seedlings) は菌株Ｂ６ではなくて菌株Ｃ５８を接種し
た。
単コロニーをＹＥＢに接種し、この微生物を実施例１の
パートＡで菌株Ｂ６について記載したようにしてインキ
ュベートした。Ｃ５８菌株はＡ. ツメファシエンスの標
準野外タイプの菌株である。この菌株は vir+ であり適
当な植物宿主中でノパリンデヒドロゲナーゼの産生をコ
ードする。この菌株はイリノイ州エバンストンのノース
ウエスタン大学のジェムス（James)氏及びバーバラ リ
ッピンコット氏(Barbara Lippincott)からあるいはカル
ホニア州デービスのカルホルニア大学植物病理学部門の
クラレンス カド（Clarence Kado)氏より入手した。こ
の菌株はデピッカー (Depicker) 等の“プラスミド (Pl
asmid)、３、１９３（１９８０）”及びカオ(Kao) 等の
“Molec. Gen.Genet.,１８８，４２５（１９８２）”
に記載されている。菌株Ｃ５８はまたＡＴＣＣに寄託し
てあり、寄託番号３３９７Ｄが与えられている。 Ｂ．とうもろこしの形質転換：とうもろこしの近交黄色
イオチーフ (Jochief)系を滅菌し、発芽させ、接種し、
さらに実施例１のパートＢ及びＣに記載したようにして
７〜１４日間インキュベートしたが、とうもろこし実生
(seedlings) は菌株Ｂ６ではなくて菌株Ｃ５８を接種し
た。
【００２２】Ｃ．アッセイ：
1. 実生中の酵素活性のアッセイ：７〜１４日インキュ
ベーション期間の終了時に、細胞を含まない抽出物（エ
キス）、即ち、無細胞抽出物を調製し実施例１、パート
Ｄに記載したようにして酵素活性をアッセイした。使用
した反応培地はノパリンデヒドロゲナーゼ活性をアッセ
イするように意図したものであった。この培地は実施例
１、パートＤで示したように、0.２Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ＝7.０）中に溶解させた６０mMのＬ−アル
ギニン、６０mMのα−ケトグルタル酸及び１６mMのNAOH
とからなっていた。結果は第２Ｂ図に示す。第２Ｂ図の
レーン８は時間零で１０回Ｃ−５８接種実生無細胞抽出
物部分を等容量のノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地と
混合することによって生成させた生成物を含み、レーン
７は１０回Ｃ−５８接種実生の無細胞抽出物の部分を等
容量のノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間イ
ンキュベートすることによって生じた生成物を含む。即
ち、第２Ｂ図はノパリンがＣ５８接種とうもろこし実生
の無細胞抽出物によって産生されるが（レーン７）、そ
のような産生は塩水対照では生じない（レーン５）こと
を示している。さらに、フェナンスレンキノン蛍光の増
加によって測定したときの産生ノパリン量はインキュベ
ーション時間に比例して増大するが、時間零ではノパリ
ンは反応混合物中に検出されず（レーン８）、１５時間
のインキュベーション後に明らかに存在し（レーン
８）、かかる結果は反応が酵素触媒されかつＣ５８接種
実生から抽出した酵素はノパリンデヒドロゲナーゼであ
るという命題に従っている。形質転換植物組織のみがオ
パインシンターゼ遺伝子を発現することは知られている
ので、これらの結果はまたとうもろこし実生が vir
+ Ａ. ツメファシエンス菌株Ｃ５８による感染によって
形質転換されているという命題によっている。
ベーション期間の終了時に、細胞を含まない抽出物（エ
キス）、即ち、無細胞抽出物を調製し実施例１、パート
Ｄに記載したようにして酵素活性をアッセイした。使用
した反応培地はノパリンデヒドロゲナーゼ活性をアッセ
イするように意図したものであった。この培地は実施例
１、パートＤで示したように、0.２Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ＝7.０）中に溶解させた６０mMのＬ−アル
ギニン、６０mMのα−ケトグルタル酸及び１６mMのNAOH
とからなっていた。結果は第２Ｂ図に示す。第２Ｂ図の
レーン８は時間零で１０回Ｃ−５８接種実生無細胞抽出
物部分を等容量のノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地と
混合することによって生成させた生成物を含み、レーン
７は１０回Ｃ−５８接種実生の無細胞抽出物の部分を等
容量のノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間イ
ンキュベートすることによって生じた生成物を含む。即
ち、第２Ｂ図はノパリンがＣ５８接種とうもろこし実生
の無細胞抽出物によって産生されるが（レーン７）、そ
のような産生は塩水対照では生じない（レーン５）こと
を示している。さらに、フェナンスレンキノン蛍光の増
加によって測定したときの産生ノパリン量はインキュベ
ーション時間に比例して増大するが、時間零ではノパリ
ンは反応混合物中に検出されず（レーン８）、１５時間
のインキュベーション後に明らかに存在し（レーン
８）、かかる結果は反応が酵素触媒されかつＣ５８接種
実生から抽出した酵素はノパリンデヒドロゲナーゼであ
るという命題に従っている。形質転換植物組織のみがオ
パインシンターゼ遺伝子を発現することは知られている
ので、これらの結果はまたとうもろこし実生が vir
+ Ａ. ツメファシエンス菌株Ｃ５８による感染によって
形質転換されているという命題によっている。
【００２３】２．ピロノパインアッセイ：Ｃ５８により
形質転換した実生からの抽出物によるノパリンの合成は
電気泳動性よりはむしろ他の基準によって確認される。
ノパリンを水によるペーパークロマトグラムにより溶出
し、減圧により蒸発させて容量を減じ等容量のホット
（１００℃）２Ｍ酢酸と１時間反応させると、ピロノパ
リンが生成する。この転換反応はノパリン用の検証であ
り他のオパリン用ではない。第２Ｃ図においては、レー
ン１は合成ノパリンを上述したようにホット２Ｍ酢酸で
処理することによって合成ノパリンから生成させたピロ
ノパリンであり、レーン２は合成ノパリン（そのいく分
かが同時にピロノパリンに転換する）であり、レーン３
は１０回Ｃ−５８接種の実生からの無細胞抽出物の部分
を等容量のノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時
間インキュベートすることによって産生させた生成物で
あり、レーン４はこの生成物を上述のようにしてホット
２Ｍ酢酸によって処理したものである。明らかに、Ｃ５
８接種実生からの無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応混合物でインキュベートすることによって産生
させた生成物（レーン３）はピロノパリン（レーン４）
に完全に転換されており、Ｃ５８接種実生がノパリンデ
ヒドロゲナーゼを産生していることが確認される。
形質転換した実生からの抽出物によるノパリンの合成は
電気泳動性よりはむしろ他の基準によって確認される。
ノパリンを水によるペーパークロマトグラムにより溶出
し、減圧により蒸発させて容量を減じ等容量のホット
（１００℃）２Ｍ酢酸と１時間反応させると、ピロノパ
リンが生成する。この転換反応はノパリン用の検証であ
り他のオパリン用ではない。第２Ｃ図においては、レー
ン１は合成ノパリンを上述したようにホット２Ｍ酢酸で
処理することによって合成ノパリンから生成させたピロ
ノパリンであり、レーン２は合成ノパリン（そのいく分
かが同時にピロノパリンに転換する）であり、レーン３
は１０回Ｃ−５８接種の実生からの無細胞抽出物の部分
を等容量のノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時
間インキュベートすることによって産生させた生成物で
あり、レーン４はこの生成物を上述のようにしてホット
２Ｍ酢酸によって処理したものである。明らかに、Ｃ５
８接種実生からの無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応混合物でインキュベートすることによって産生
させた生成物（レーン３）はピロノパリン（レーン４）
に完全に転換されており、Ｃ５８接種実生がノパリンデ
ヒドロゲナーゼを産生していることが確認される。
【００２４】３．ノパリンの異化作用：最後に、ノパリ
ンをＣ５８でインキュベートしノパリンがＣ５８の唯一
のエネルギー源として作用する場合には、この微生物は
ノパリンを分解させるにつれて増殖するであろう。しか
しながら、ノパリンを唯一のエネルギー源として含む培
地で増殖させたＢ６はノパリンを破壊せず分解しないで
あろう。何故ならば、Ｂ６はノパリンの異化作用に必要
な特異性オパインオキシダーゼを欠如しているからであ
る。この原理に基づくアッセイを用いてＣ５８接種実生
の無細胞抽出物により産生された生成物のノパリン同一
性を確認した。このアッセイの結果は第２Ｄ図に示して
おり、レーン１は合成ノパリンを含み、レーン２は１０
回Ｃ５８接種実生の無細胞抽出物の部分を等容量のノパ
リンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベー
トすることによって産生させた生成物であって、ピロノ
パリンアッセイに関して上述したようにして電気泳動さ
せ、水で溶出し、蒸発し、菌株Ｂ６で２４時間インキュ
ベートさせたものを含み、レーン３は１０回Ｃ−５８接
種実生の無細胞抽出物の部分を等容量のノパリンデヒド
ロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベートすること
によって産生させた生成物であって、電気泳動させ、溶
出しさらに菌株Ｃ５８で２４時間インキュベートさせた
ものを示す。Ｃ５８接種実生の無細胞抽出物により産生
させた生成物は菌株Ｃ５８により消滅した（レーン３）
が、菌株Ｂ６によっては消滅せず（レーン２）、生成物
がノパリンであることを確認した。
ンをＣ５８でインキュベートしノパリンがＣ５８の唯一
のエネルギー源として作用する場合には、この微生物は
ノパリンを分解させるにつれて増殖するであろう。しか
しながら、ノパリンを唯一のエネルギー源として含む培
地で増殖させたＢ６はノパリンを破壊せず分解しないで
あろう。何故ならば、Ｂ６はノパリンの異化作用に必要
な特異性オパインオキシダーゼを欠如しているからであ
る。この原理に基づくアッセイを用いてＣ５８接種実生
の無細胞抽出物により産生された生成物のノパリン同一
性を確認した。このアッセイの結果は第２Ｄ図に示して
おり、レーン１は合成ノパリンを含み、レーン２は１０
回Ｃ５８接種実生の無細胞抽出物の部分を等容量のノパ
リンデヒドロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベー
トすることによって産生させた生成物であって、ピロノ
パリンアッセイに関して上述したようにして電気泳動さ
せ、水で溶出し、蒸発し、菌株Ｂ６で２４時間インキュ
ベートさせたものを含み、レーン３は１０回Ｃ−５８接
種実生の無細胞抽出物の部分を等容量のノパリンデヒド
ロゲナーゼ反応培地で１５時間インキュベートすること
によって産生させた生成物であって、電気泳動させ、溶
出しさらに菌株Ｃ５８で２４時間インキュベートさせた
ものを示す。Ｃ５８接種実生の無細胞抽出物により産生
させた生成物は菌株Ｃ５８により消滅した（レーン３）
が、菌株Ｂ６によっては消滅せず（レーン２）、生成物
がノパリンであることを確認した。
【００２５】４．形質転換の効率：Ａ. ツメファシエン
ス菌株Ｃ５８を用いた近交黄色イオチーフとうもろこし
の形質転換の効率を試験した。結果は第３Ｃ図に示され
ており、１０ケのレーンすべてが１回Ｃ５８接種実生か
らの無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地
で６時間インキュベートすることによって産生した生成
物を含んでいる。明らかなように、１０の実生のうちの
９つが形質転換されていた。追加の１回接種実生のアッ
セイをＢ６またはＣ５８のいずれかで形質転換させた実
生を用いて行った。菌株Ｂ６またはＣ５８のいずれかで
１回接種した実生の合計１５０回のアッセイのうち、６
０％が形質転換されていた。
ス菌株Ｃ５８を用いた近交黄色イオチーフとうもろこし
の形質転換の効率を試験した。結果は第３Ｃ図に示され
ており、１０ケのレーンすべてが１回Ｃ５８接種実生か
らの無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地
で６時間インキュベートすることによって産生した生成
物を含んでいる。明らかなように、１０の実生のうちの
９つが形質転換されていた。追加の１回接種実生のアッ
セイをＢ６またはＣ５８のいずれかで形質転換させた実
生を用いて行った。菌株Ｂ６またはＣ５８のいずれかで
１回接種した実生の合計１５０回のアッセイのうち、６
０％が形質転換されていた。
【００２６】５．対照（コントロール）：産生したノパ
リンがある二次的な興味のない事実の結果である可能性
を削除するために、いくつかの対照試験を行った。第４
Ａ図に示すように、実施例２のパートＡで記載したよう
にして４８時間培養したＣ５８の懸濁液の無細胞音波処
理物の電気泳動は何らの含有ノパリンを示さなかった
（レーン３及び４）。さらに、これらの音波処理物をノ
パリンデヒドロゲナーゼ反応培地と混合し２５℃で４時
間インキュベートさせたときも、ノパリンデヒドロゲナ
ーゼ活性は検出できなかった。このインキュベーション
の生成物を電気泳動させている第４Ｂ図のレーン６およ
び７を参照されたい。即ち、ノパリンデヒドロゲナーゼ
活性は４８時間後の微生物培養物中で見い出されなかっ
た。また、ノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地単独も何
らのノパリンを含んでいなかった。この反応培地単独を
電気泳動させている第４Ｂ図レーン５を参照されたい。
同様に、未感染とうもろこし実生中にもこのデヒドロゲ
ナーゼの証拠は見い出せなかった。レーン６〜１０が未
感染単実生の無細胞抽出物を６時間ノパリンデヒドロゲ
ナーゼ反応培地でインキュベートすることによって産生
させた生成物を含んでいる電気泳動図を示す第４Ｃ図を
参照されたい。これらの結果は、Ｃ５８接種実生の無細
胞抽出物中のノパリンデヒドロゲナーゼ活性が上記実生
の形質転換に基づくものであり何らかの二次的な興味の
ない事実によるものでないことを明確にしている。
リンがある二次的な興味のない事実の結果である可能性
を削除するために、いくつかの対照試験を行った。第４
Ａ図に示すように、実施例２のパートＡで記載したよう
にして４８時間培養したＣ５８の懸濁液の無細胞音波処
理物の電気泳動は何らの含有ノパリンを示さなかった
（レーン３及び４）。さらに、これらの音波処理物をノ
パリンデヒドロゲナーゼ反応培地と混合し２５℃で４時
間インキュベートさせたときも、ノパリンデヒドロゲナ
ーゼ活性は検出できなかった。このインキュベーション
の生成物を電気泳動させている第４Ｂ図のレーン６およ
び７を参照されたい。即ち、ノパリンデヒドロゲナーゼ
活性は４８時間後の微生物培養物中で見い出されなかっ
た。また、ノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地単独も何
らのノパリンを含んでいなかった。この反応培地単独を
電気泳動させている第４Ｂ図レーン５を参照されたい。
同様に、未感染とうもろこし実生中にもこのデヒドロゲ
ナーゼの証拠は見い出せなかった。レーン６〜１０が未
感染単実生の無細胞抽出物を６時間ノパリンデヒドロゲ
ナーゼ反応培地でインキュベートすることによって産生
させた生成物を含んでいる電気泳動図を示す第４Ｃ図を
参照されたい。これらの結果は、Ｃ５８接種実生の無細
胞抽出物中のノパリンデヒドロゲナーゼ活性が上記実生
の形質転換に基づくものであり何らかの二次的な興味の
ない事実によるものでないことを明確にしている。
【００２７】実施例３
Ａ．とうもろこしの形質転換：菌株Ｃ５８を実施例２、
パートＡで記載したようにして培養し、近交系黄色イオ
チーフとうもろこしを実施例２、パートＢで記載したよ
うにして滅菌し、発芽させ、接種し、インキュベートさ
せた。７日間のインキュベーション後に、感染実生を鉢
植え土壌を含む鉢に植付けた。 Ｂ．アッセイ： １．萌芽系の葉の中の酵素活性のアッセイ：植付け３週
間後に、３本の別々の植付物からの萌芽系 (embryonic
origin) の３枚の葉をノパリンデヒドロゲナーゼ活性の
存在を測定するためにアッセイした。アッセイ用に選定
した葉はまだ大きくなっていない植付物の幹からの第１
葉であった。各萌芽葉は接種時に各実生中に存在する分
化構造に由来するが、これらの分化構造は接種領域には
存在しない。アッセイを行うために、３枚の各萌芽葉を
それぞれトリス−ＨＣl バッファー中で均質化し、遠心
して実施例２、パートＣにおいて実生について記載した
ようにして酵素活性をアッセイした。３枚の各萌芽葉の
無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で２
４時間インキュベートすることによって産生した生成物
の電気泳動の結果は第５Ａ図に示され、この図において
は、レーン１、２および３がこのインキュベーションの
生成物を含んでいる。第５Ａ図から明らかなように、各
萌芽葉の無細胞抽出物はノパリンデヒドロゲナーゼを含
むものではなくこれらの葉は上記の接種手順によっては
形質転換されてないことを示していた。
パートＡで記載したようにして培養し、近交系黄色イオ
チーフとうもろこしを実施例２、パートＢで記載したよ
うにして滅菌し、発芽させ、接種し、インキュベートさ
せた。７日間のインキュベーション後に、感染実生を鉢
植え土壌を含む鉢に植付けた。 Ｂ．アッセイ： １．萌芽系の葉の中の酵素活性のアッセイ：植付け３週
間後に、３本の別々の植付物からの萌芽系 (embryonic
origin) の３枚の葉をノパリンデヒドロゲナーゼ活性の
存在を測定するためにアッセイした。アッセイ用に選定
した葉はまだ大きくなっていない植付物の幹からの第１
葉であった。各萌芽葉は接種時に各実生中に存在する分
化構造に由来するが、これらの分化構造は接種領域には
存在しない。アッセイを行うために、３枚の各萌芽葉を
それぞれトリス−ＨＣl バッファー中で均質化し、遠心
して実施例２、パートＣにおいて実生について記載した
ようにして酵素活性をアッセイした。３枚の各萌芽葉の
無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で２
４時間インキュベートすることによって産生した生成物
の電気泳動の結果は第５Ａ図に示され、この図において
は、レーン１、２および３がこのインキュベーションの
生成物を含んでいる。第５Ａ図から明らかなように、各
萌芽葉の無細胞抽出物はノパリンデヒドロゲナーゼを含
むものではなくこれらの葉は上記の接種手順によっては
形質転換されてないことを示していた。
【００２８】２．分裂系の葉中の酵素活性アッセイ：分
裂組織に由来する葉（萌芽葉以外のすべての葉）を、実
生の植え付け７週間後に、ノパリンデヒドロゲナーゼの
存在についてアッセイした。分裂組織は分裂して器官お
よび他の分化組織を形成できる急速分裂性の未分化小細
胞からなる組織である。葉に分化する分裂組織は接種領
域に存在している。アッセイを行うために、分裂組織由
来の葉から一部を切り取り、各葉から切り取った部分を
トリス−ＨＣl バッファー中で一緒に均質化し、遠心
し、実施例２のパートＣで実生について記載したように
して酵素活性についてアッセイした。アッセイに用いた
各葉の部分は第５Ｂ図の数字２および３で示される。数
字３で示される部分は線６および７に沿って切り取っ
た。線７は葉の中央脈と一致している。部分３は通常植
物に結合している葉の基幹部に位置する。この葉の基幹
部は葉の成長端であり、この領域は葉の最も新しい細胞
を含んでいる。数字２で示される部分は中央脈４に水平
である線５に沿って切ることによって切り取った。部分
２、２は葉の先端部にあり、葉の最も古い細胞を含んで
いる。各部分２および３は葉の表面積の約１／６を占め
る。分裂組織系の４枚の葉の上記部分の無細胞抽出物を
ノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュベーショ
ンすることによって産生した生成物の電気泳動の結果を
第５Ｃ図に示す。第５Ｃ図において、レーン１はノパリ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地を含み、レーン２〜５は葉
の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ培地で１２
時間インキュベートすることによって産生した生成物を
含んでいる。図示するように、４枚の葉のうちの３枚の
無細胞抽出物がノパリンを産生しこれらはノパリンデヒ
ドロゲナーゼ活性を含むことを示していた。これらの葉
は細胞分裂および分化による分裂組織に由来するので、
これらの結果は実生の接種領域中の細胞がとうもろこし
細胞の次の世代に対してノパリンデヒドロゲナーゼを合
成する能力を促進できることを示している。即ち、これ
らの結果は接種した領域の細胞およびこれらの細胞に由
来する細胞の形質転換が起こっていることを示してい
る。
裂組織に由来する葉（萌芽葉以外のすべての葉）を、実
生の植え付け７週間後に、ノパリンデヒドロゲナーゼの
存在についてアッセイした。分裂組織は分裂して器官お
よび他の分化組織を形成できる急速分裂性の未分化小細
胞からなる組織である。葉に分化する分裂組織は接種領
域に存在している。アッセイを行うために、分裂組織由
来の葉から一部を切り取り、各葉から切り取った部分を
トリス−ＨＣl バッファー中で一緒に均質化し、遠心
し、実施例２のパートＣで実生について記載したように
して酵素活性についてアッセイした。アッセイに用いた
各葉の部分は第５Ｂ図の数字２および３で示される。数
字３で示される部分は線６および７に沿って切り取っ
た。線７は葉の中央脈と一致している。部分３は通常植
物に結合している葉の基幹部に位置する。この葉の基幹
部は葉の成長端であり、この領域は葉の最も新しい細胞
を含んでいる。数字２で示される部分は中央脈４に水平
である線５に沿って切ることによって切り取った。部分
２、２は葉の先端部にあり、葉の最も古い細胞を含んで
いる。各部分２および３は葉の表面積の約１／６を占め
る。分裂組織系の４枚の葉の上記部分の無細胞抽出物を
ノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュベーショ
ンすることによって産生した生成物の電気泳動の結果を
第５Ｃ図に示す。第５Ｃ図において、レーン１はノパリ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地を含み、レーン２〜５は葉
の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ培地で１２
時間インキュベートすることによって産生した生成物を
含んでいる。図示するように、４枚の葉のうちの３枚の
無細胞抽出物がノパリンを産生しこれらはノパリンデヒ
ドロゲナーゼ活性を含むことを示していた。これらの葉
は細胞分裂および分化による分裂組織に由来するので、
これらの結果は実生の接種領域中の細胞がとうもろこし
細胞の次の世代に対してノパリンデヒドロゲナーゼを合
成する能力を促進できることを示している。即ち、これ
らの結果は接種した領域の細胞およびこれらの細胞に由
来する細胞の形質転換が起こっていることを示してい
る。
【００２９】３．花粉中の酵素活性のアッセイ：実生植
付け６０日後に、２本の植付物の花粉サンプルをそれぞ
れノパリンデヒドロゲナーゼの存在についてアッセイし
た。。アッセイを行うために、約５〜１０×１０5 個の
花粉粒子を含む0.５〜1.０ｍl の花粉をトリス−ＨＣl
バッファー中で均質化し、遠心し実施例２、パートＣで
実生について記載したようにして酵素活性をアッセイし
た。２本の植付け物からの花粉の無細胞抽出物をノパリ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地で１２時間インキュベート
することによって産生した生成物の電気泳動の結果は第
５Ｄ図に示しており、レーン２と３がこのインキュベー
ションの生成物を含んでおり、レーン１はノパリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地を含んでいる。この図から分ると
おり、２本の植付け物からの花粉はノパリンデヒドロゲ
ナーゼ活性を含んでいた。花粉は細胞分裂および分化に
より頂端分裂組織から誘導されるので、これらの結果
は、上記の分裂組織系の葉の結果同様に、形質転換が起
っていることを示している。 ４．形質転換花粉からの実生中の酵素活性のアッセイ：
上記パートＢの３で示した２本の形質転換植付け物から
の花粉を用いて未感染黄色イオチーフとうもろこし種か
ら生長した植付け物の穂に受精させた。この交配の結果
として受精植付け物により育成したＦ1 種実を収穫し、
発芽させ、実施例１のパートＢおよびＣで記載したよう
にして（ただし、実生は接種させなかった）、インキュ
ベートした。７〜１４日のインキュベーション後に、実
生を実施例２のパートＣに記載したようにして酵素活性
についてアッセイした。これらの実生の無細胞抽出物は
ノパリンを産生することが分り、この実生のＦ1 世代が
形質転換されていることを示している。
付け６０日後に、２本の植付物の花粉サンプルをそれぞ
れノパリンデヒドロゲナーゼの存在についてアッセイし
た。。アッセイを行うために、約５〜１０×１０5 個の
花粉粒子を含む0.５〜1.０ｍl の花粉をトリス−ＨＣl
バッファー中で均質化し、遠心し実施例２、パートＣで
実生について記載したようにして酵素活性をアッセイし
た。２本の植付け物からの花粉の無細胞抽出物をノパリ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地で１２時間インキュベート
することによって産生した生成物の電気泳動の結果は第
５Ｄ図に示しており、レーン２と３がこのインキュベー
ションの生成物を含んでおり、レーン１はノパリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地を含んでいる。この図から分ると
おり、２本の植付け物からの花粉はノパリンデヒドロゲ
ナーゼ活性を含んでいた。花粉は細胞分裂および分化に
より頂端分裂組織から誘導されるので、これらの結果
は、上記の分裂組織系の葉の結果同様に、形質転換が起
っていることを示している。 ４．形質転換花粉からの実生中の酵素活性のアッセイ：
上記パートＢの３で示した２本の形質転換植付け物から
の花粉を用いて未感染黄色イオチーフとうもろこし種か
ら生長した植付け物の穂に受精させた。この交配の結果
として受精植付け物により育成したＦ1 種実を収穫し、
発芽させ、実施例１のパートＢおよびＣで記載したよう
にして（ただし、実生は接種させなかった）、インキュ
ベートした。７〜１４日のインキュベーション後に、実
生を実施例２のパートＣに記載したようにして酵素活性
についてアッセイした。これらの実生の無細胞抽出物は
ノパリンを産生することが分り、この実生のＦ1 世代が
形質転換されていることを示している。
【００３０】５．形質転換花粉からの作物から採取した
萌芽系の葉の酵素活性のアッセイ：本実施例のパートＢ
の４で記載した交配により生じた種実を収穫し、発芽さ
せ、実生を接種しないことを除いて実施例１のパートＢ
およびＣで記載したようにしてインキュベートする。７
〜１４日のインキュベーション後に、実生を本実施例の
パートＡで記載したようにして植え付ける。植付け３週
間後に、萌芽葉を本実施例のパートＢの１で記載したよ
うにしてノパリンーデヒドロゲナーゼ活性についてアッ
セイし、この萌芽葉の無細胞抽出物はノパリンを産生
し、形質転換されていることを示している。
萌芽系の葉の酵素活性のアッセイ：本実施例のパートＢ
の４で記載した交配により生じた種実を収穫し、発芽さ
せ、実生を接種しないことを除いて実施例１のパートＢ
およびＣで記載したようにしてインキュベートする。７
〜１４日のインキュベーション後に、実生を本実施例の
パートＡで記載したようにして植え付ける。植付け３週
間後に、萌芽葉を本実施例のパートＢの１で記載したよ
うにしてノパリンーデヒドロゲナーゼ活性についてアッ
セイし、この萌芽葉の無細胞抽出物はノパリンを産生
し、形質転換されていることを示している。
【００３１】実施例４
Ａ．とうもろこしの形質転換：黄色イオチーフとうもろ
こしを滅菌し、発芽させ、接種し、さらに実施例１のパ
ートＢおよびＣで記載したようにして７〜１４日間イン
キュベートした。ただし、とうもろこし実生の別々のグ
ループをＡ．ツメファシエンスの菌株Ａ３４８、菌株Ｊ
Ｋ１９５または菌株２３８ＭＸのいずれかで接種した。
Ａ３４８菌株は菌株Ａ６ＮＣからの広域宿主範囲のプラ
スミドｐＴｉＡ６ＮＣを担持する。この菌株は vir+ で
あり適当な植物ホスト中でリソパインデヒドロゲナーゼ
の産生をコードする。菌株Ａ６ＮＣとプラスミドｐＴｉ
Ａ６ＮＣはシアキイ（Sciaky）等の“プラスミド（Plas
mid)、１、２３８（１９７７）”に記載されている。使
用したＡ３４８はワシントン州シアトルのワシントン大
学の微生物学および免疫学部門のユーゲン ネスター
（Eugene Nester)氏より入手した。この菌株は実施例１
のパートＡで菌株Ｂ６について記載したようにして培養
した。菌株ＪＫ１９５と２３８ＭＸは、それぞれ、臨界
的なｖｉｒ領域に突然変異を有しており vir- である。
従って、これらはそのそれぞれの宿主へＴｉプラスミド
の必要な部分を運ぶことができない。結果として、これ
らの微生物を接種した材料から製せられた植物抽出物は
適当な反応培地に加えたとき何らのオパインも産生する
ことは期待されないであろう。２３８ＭＸは背景的およ
び起源的にはＡ３４８菌株と同じであるが、ｖｉｒ領域
vir- とするｖｉｒ領域に挿入された微生物トランスポ
ズンＴｎ３を有する。菌株２３８ＭＸはユーゲン ネス
ター氏（前出）から入手した。この菌株は実施例１のパ
ートＡで菌株Ｂ６について記載したようにしてインキュ
ベートし１００μg ／mlのカルベニシリンを含むＹＥＢ
上で用いた。ＪＫ１９５菌株はＣ５８由来の vir- ミュ
ータントである。この菌株はｖｉｒ領域の相補群ＶＩ中
に挿入された微生物トランスポズンＴｎ５を有する。菌
株ＪＫ１９５の詳細な記載はカオ（Kao)等の“Mol. Ge
n. Genet., １８８、４２５（１９８２）”およびラン
ギスト（Lundguist)等の“Mol. Gen. Genet., １９３、
１（１９８４）”に見い出し得る。使用したＪＫ１９５
はクラーレンス カオ氏（前出）より入手した。また、
この菌株は実施例１のパートＡで記載したようにしてイ
ンキュベートし、５０μg ／mlのリファムピシンを含む
ＹＥＢで使用した。
こしを滅菌し、発芽させ、接種し、さらに実施例１のパ
ートＢおよびＣで記載したようにして７〜１４日間イン
キュベートした。ただし、とうもろこし実生の別々のグ
ループをＡ．ツメファシエンスの菌株Ａ３４８、菌株Ｊ
Ｋ１９５または菌株２３８ＭＸのいずれかで接種した。
Ａ３４８菌株は菌株Ａ６ＮＣからの広域宿主範囲のプラ
スミドｐＴｉＡ６ＮＣを担持する。この菌株は vir+ で
あり適当な植物ホスト中でリソパインデヒドロゲナーゼ
の産生をコードする。菌株Ａ６ＮＣとプラスミドｐＴｉ
Ａ６ＮＣはシアキイ（Sciaky）等の“プラスミド（Plas
mid)、１、２３８（１９７７）”に記載されている。使
用したＡ３４８はワシントン州シアトルのワシントン大
学の微生物学および免疫学部門のユーゲン ネスター
（Eugene Nester)氏より入手した。この菌株は実施例１
のパートＡで菌株Ｂ６について記載したようにして培養
した。菌株ＪＫ１９５と２３８ＭＸは、それぞれ、臨界
的なｖｉｒ領域に突然変異を有しており vir- である。
従って、これらはそのそれぞれの宿主へＴｉプラスミド
の必要な部分を運ぶことができない。結果として、これ
らの微生物を接種した材料から製せられた植物抽出物は
適当な反応培地に加えたとき何らのオパインも産生する
ことは期待されないであろう。２３８ＭＸは背景的およ
び起源的にはＡ３４８菌株と同じであるが、ｖｉｒ領域
vir- とするｖｉｒ領域に挿入された微生物トランスポ
ズンＴｎ３を有する。菌株２３８ＭＸはユーゲン ネス
ター氏（前出）から入手した。この菌株は実施例１のパ
ートＡで菌株Ｂ６について記載したようにしてインキュ
ベートし１００μg ／mlのカルベニシリンを含むＹＥＢ
上で用いた。ＪＫ１９５菌株はＣ５８由来の vir- ミュ
ータントである。この菌株はｖｉｒ領域の相補群ＶＩ中
に挿入された微生物トランスポズンＴｎ５を有する。菌
株ＪＫ１９５の詳細な記載はカオ（Kao)等の“Mol. Ge
n. Genet., １８８、４２５（１９８２）”およびラン
ギスト（Lundguist)等の“Mol. Gen. Genet., １９３、
１（１９８４）”に見い出し得る。使用したＪＫ１９５
はクラーレンス カオ氏（前出）より入手した。また、
この菌株は実施例１のパートＡで記載したようにしてイ
ンキュベートし、５０μg ／mlのリファムピシンを含む
ＹＥＢで使用した。
【００３２】Ｂ．アッセイ：
1. 実生中の酵素活性のアッセイ：第３Ｂ図および第３
Ｄ図に示すように、２３８ＭＸ菌株またはＪＫ１９５菌
株を接種した実生の無細胞抽出物はオパイン類を産生し
ない。第３Ｂ図においては、レーン６〜１０が２３８Ｍ
Ｘ接種単実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナ
ーゼ反応媒質で４時間インキュベートすることによって
生じた生成物を含む。明らかに、オクトパインが無細胞
抽出物によって合成されないので実生は何ら形質転換さ
れない。第３Ｄ図においては、１０のレーンすべてがＪ
１９５接種単実生の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲ
ナーゼ反応培地で６時間インキュベートすることによっ
て生じた生成物を含んでいる。ここでも、ノパリンが産
生されないので実生はどれも形質転換されてない。しか
しながら、Ａ３４８株は形質転換に関して適格性があ
る。第３Ｂ図においては、レーン１〜５はＡ３４８接種
単実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反
応培地で４時間インキュベートすることによって生じた
生成物を含んでいる。明らかに、リソパインデヒドロゲ
ナーゼがＡ３４８を接種した５つの単実生のうちの１つ
の無細胞抽出物中に見出されて実生が形質転換されてい
ることを示している。即ち、Ｔ−ＤＮＡを転写できる v
ir+ Ａ．ツメファシエンス菌株のみがとうもろこし実生
を形質転換している。ｖｉｒ領域に突然変異を有し従っ
て転写マイナスであるものは感染植物から生成させた抽
出物中のオパインシンターゼ活性を刺激しない。
Ｄ図に示すように、２３８ＭＸ菌株またはＪＫ１９５菌
株を接種した実生の無細胞抽出物はオパイン類を産生し
ない。第３Ｂ図においては、レーン６〜１０が２３８Ｍ
Ｘ接種単実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナ
ーゼ反応媒質で４時間インキュベートすることによって
生じた生成物を含む。明らかに、オクトパインが無細胞
抽出物によって合成されないので実生は何ら形質転換さ
れない。第３Ｄ図においては、１０のレーンすべてがＪ
１９５接種単実生の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲ
ナーゼ反応培地で６時間インキュベートすることによっ
て生じた生成物を含んでいる。ここでも、ノパリンが産
生されないので実生はどれも形質転換されてない。しか
しながら、Ａ３４８株は形質転換に関して適格性があ
る。第３Ｂ図においては、レーン１〜５はＡ３４８接種
単実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反
応培地で４時間インキュベートすることによって生じた
生成物を含んでいる。明らかに、リソパインデヒドロゲ
ナーゼがＡ３４８を接種した５つの単実生のうちの１つ
の無細胞抽出物中に見出されて実生が形質転換されてい
ることを示している。即ち、Ｔ−ＤＮＡを転写できる v
ir+ Ａ．ツメファシエンス菌株のみがとうもろこし実生
を形質転換している。ｖｉｒ領域に突然変異を有し従っ
て転写マイナスであるものは感染植物から生成させた抽
出物中のオパインシンターゼ活性を刺激しない。
【００３３】実施例５
Ａ．ツメファシエンス菌株Ｔ３７の単コロニーをＹＥＢ
中に接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株Ｂ
６について記載したようにしてインキュベートした。Ｔ
３７菌株はＡ．ツメファシエンスの標準野外タイプ菌株
である。この菌株はvir+ であり、適当な植物ホスト中
でノパリンデヒドロゲナーゼの産生をコードする。Ｔ３
７はワシントン州マジソンのワシントン大学植物生理学
部門のジョンケンプ（John Kemp)氏から入手したが、オ
ハイオ州トレンドのトレンド大学生物学部門のアンＣ．
Ｆ．グレーブス（Anne C. F. Graves)氏からも入手でき
る。この菌株はチューゲオン（Turgeon)等の“ＰＮＡ
Ｓ、７３、３５６２（1976）”およびシアキイ（Sciak
y）等の“Plasmid,１，２３８（１９７８）”に記載さ
れている。近交黄色イオチーフ系とうもろこしの種実を
滅菌し、発芽させ、さらに実施例１のパートＢおよびＣ
で記載したようにして７〜１４日間インキュベートし
た。ただし、とうもろこし実生は菌株Ｂ６でなく菌株Ｔ
３７で接種した。７〜１４日インキュベーション期間終
了時に、実生を実施例２のパートＣで記載したようにし
て酵素活性についてアッセイした。この手順により、Ｔ
３７接種とうもろこし実生の細胞なし抽出物によるノパ
リン産生が示され実生は形質転換されていることを示し
た。
中に接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株Ｂ
６について記載したようにしてインキュベートした。Ｔ
３７菌株はＡ．ツメファシエンスの標準野外タイプ菌株
である。この菌株はvir+ であり、適当な植物ホスト中
でノパリンデヒドロゲナーゼの産生をコードする。Ｔ３
７はワシントン州マジソンのワシントン大学植物生理学
部門のジョンケンプ（John Kemp)氏から入手したが、オ
ハイオ州トレンドのトレンド大学生物学部門のアンＣ．
Ｆ．グレーブス（Anne C. F. Graves)氏からも入手でき
る。この菌株はチューゲオン（Turgeon)等の“ＰＮＡ
Ｓ、７３、３５６２（1976）”およびシアキイ（Sciak
y）等の“Plasmid,１，２３８（１９７８）”に記載さ
れている。近交黄色イオチーフ系とうもろこしの種実を
滅菌し、発芽させ、さらに実施例１のパートＢおよびＣ
で記載したようにして７〜１４日間インキュベートし
た。ただし、とうもろこし実生は菌株Ｂ６でなく菌株Ｔ
３７で接種した。７〜１４日インキュベーション期間終
了時に、実生を実施例２のパートＣで記載したようにし
て酵素活性についてアッセイした。この手順により、Ｔ
３７接種とうもろこし実生の細胞なし抽出物によるノパ
リン産生が示され実生は形質転換されていることを示し
た。
【００３４】実施例６
Ａ．ツメファシエンス菌株Ｃ５８の単コロニーをＹＥＢ
中に接種し、この微生物を実施例２のパートＡで記載し
たようにしてインキュベートした。とうもろこしの近交
ＰＡ９１株の種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さら
に、実施例１のパートＢとＣで近交黄色イオチーフ株に
ついて記載したようにして７〜１４日間インキュベート
した。ＰＡ９１株は商業的に入手できる標準のとうもろ
こし近交株である。この株はインデアナ州グリーンビル
のイーライ リリー社のジーン ロバーツ（Jean Rober
ts）氏より入手した。７〜１４日間のインキュベーショ
ン期間終了時に、実生を実施例２のパートＤで記載した
ようにしてアッセイした。第７図に示すように、無細胞
抽出物によるノパリン産生が示されＰＡ９１株とうもろ
こしは形質転換されていることが示された。第６図にお
いては、レーン１〜１０が一回Ｃ５８接種実生の無細胞
抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で６時間イ
ンキュベートすることにより生じた生成物を含んでい
る。明らかに、無細胞抽出物の１０すべてがノパリンを
産生し実生が形質転換されていることを示していた。
中に接種し、この微生物を実施例２のパートＡで記載し
たようにしてインキュベートした。とうもろこしの近交
ＰＡ９１株の種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さら
に、実施例１のパートＢとＣで近交黄色イオチーフ株に
ついて記載したようにして７〜１４日間インキュベート
した。ＰＡ９１株は商業的に入手できる標準のとうもろ
こし近交株である。この株はインデアナ州グリーンビル
のイーライ リリー社のジーン ロバーツ（Jean Rober
ts）氏より入手した。７〜１４日間のインキュベーショ
ン期間終了時に、実生を実施例２のパートＤで記載した
ようにしてアッセイした。第７図に示すように、無細胞
抽出物によるノパリン産生が示されＰＡ９１株とうもろ
こしは形質転換されていることが示された。第６図にお
いては、レーン１〜１０が一回Ｃ５８接種実生の無細胞
抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で６時間イ
ンキュベートすることにより生じた生成物を含んでい
る。明らかに、無細胞抽出物の１０すべてがノパリンを
産生し実生が形質転換されていることを示していた。
【００３５】実施例７
Ａ．ツメファシエンス菌株Ｂ６の単コロニーを酵母エキ
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で記載したようにしてインキュベートした。近交黄色イ
オチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接
種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載したように
して７〜１４日間インキュベートしたが、種実は次のよ
うにして発芽させた。滅菌後、種実を約１２時間滅菌蒸
留水に浸した。次いで、種実を滅菌ペトリ皿中の滅菌湿
潤ワットマンNo.3紙上でインキュベートしたが、浸漬し
た種実は浸漬しない種実よりも短時間で発芽するので1.
５〜2.０日の間インキュベートさせたのみであった。７
〜１４日間のインキュベーション期間の終了時点で、実
生を実施例１のパートＤで記載したようにして酵素活性
についてアッセイした。この手順により、感染実生の無
細胞抽出物によるオクトパイン産生が認められ実生が形
質転換されていることを示していた。
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で記載したようにしてインキュベートした。近交黄色イ
オチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接
種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載したように
して７〜１４日間インキュベートしたが、種実は次のよ
うにして発芽させた。滅菌後、種実を約１２時間滅菌蒸
留水に浸した。次いで、種実を滅菌ペトリ皿中の滅菌湿
潤ワットマンNo.3紙上でインキュベートしたが、浸漬し
た種実は浸漬しない種実よりも短時間で発芽するので1.
５〜2.０日の間インキュベートさせたのみであった。７
〜１４日間のインキュベーション期間の終了時点で、実
生を実施例１のパートＤで記載したようにして酵素活性
についてアッセイした。この手順により、感染実生の無
細胞抽出物によるオクトパイン産生が認められ実生が形
質転換されていることを示していた。
【００３６】実施例８
Ａ．ツメファシエンス菌株ＬＢＡ４０１３の単コロニー
をＹＥＢ中に接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で菌株Ｂ６について記載したようにしてインキュベート
した。ＬＢＡ４０１３菌株はＡ．ツメファシエンス菌株
Ａch５由来の変異株である。ＬＢＡ４０１３は vir+ で
ある野外タイプTiプラスミドｐTiAch ５を含んでおり、
またＬＢＡ４０１３は適当な植物宿主中でリソパインデ
ヒドロゲナーゼの産生をコードする。ＬＢＡ４０１３は
インデアナ州インデアナポリスのイーライリリー社のク
レッグワルドロン（Clegg Wardron)氏より入手した。こ
の菌株はマートン（Marton）等の“Mature，２７７、１
２９（１９７９）”に記載されている。近交黄色イオチ
ーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接種
し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載したようにし
て７〜１４日間インキュベートしたが、とうもろこし実
生は菌株Ｂ６ではなく菌株ＬＢＡ４０１３を接種した。
７〜１４日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例１のパートＤに記載したようにして酵素活性に
ついてアッセイした。この手順によりＬＢＡ４０１３形
質転換実生の無細胞抽出物によるオクトパイン産生が認
められ、実生は形質転換していることが示されていた。
をＹＥＢ中に接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で菌株Ｂ６について記載したようにしてインキュベート
した。ＬＢＡ４０１３菌株はＡ．ツメファシエンス菌株
Ａch５由来の変異株である。ＬＢＡ４０１３は vir+ で
ある野外タイプTiプラスミドｐTiAch ５を含んでおり、
またＬＢＡ４０１３は適当な植物宿主中でリソパインデ
ヒドロゲナーゼの産生をコードする。ＬＢＡ４０１３は
インデアナ州インデアナポリスのイーライリリー社のク
レッグワルドロン（Clegg Wardron)氏より入手した。こ
の菌株はマートン（Marton）等の“Mature，２７７、１
２９（１９７９）”に記載されている。近交黄色イオチ
ーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接種
し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載したようにし
て７〜１４日間インキュベートしたが、とうもろこし実
生は菌株Ｂ６ではなく菌株ＬＢＡ４０１３を接種した。
７〜１４日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例１のパートＤに記載したようにして酵素活性に
ついてアッセイした。この手順によりＬＢＡ４０１３形
質転換実生の無細胞抽出物によるオクトパイン産生が認
められ、実生は形質転換していることが示されていた。
【００３７】実施例９
Ａ．微生物の調製：Ａ．ツメファシエンス菌株ＣＡ１９
の単コロニーをＹＥＢ中に接種し、この微生物を実施例
１のパートＡで菌株Ｂ６について記載したようにしてイ
ンキュベートした。ＣＡ１９菌株は菌株ＬＢＡ４０１３
に由来し、実施例８で記載したように vir+ であるｐＴ
ｉＡch５を含んでおり、また菌株ＣＡ１９は適当な植物
宿主中でリソパインデヒドロゲナーゼの産生をコードす
る。菌株ＣＡ１９はまたミクロ−ＴｉプラスミドｐＣＥ
Ｌ４４を含んでいる。ミクロプラスミドｐＣＥＬ４４は
オクトパインシンターゼ遺伝子の５′プロモーターと会
合アミノ末端領域をコードしている配列およびオクトパ
インシンターゼ遺伝子の３′末端配列間に挿入されたハ
イグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ I
V）をコードする遺伝子からなる構築体である。この構
築体は広域宿主範囲のベクターｐＫＴ２１０中のＴ−Ｄ
ＮＡのより広いフラグメント間に集まっている。ミクロ
プラスミドｐＣＥＬ４４は植物細胞を形質転換しハイグ
ロマイシン耐性とすることができる。菌株ＣＡ１９は次
の如くして調製する。
の単コロニーをＹＥＢ中に接種し、この微生物を実施例
１のパートＡで菌株Ｂ６について記載したようにしてイ
ンキュベートした。ＣＡ１９菌株は菌株ＬＢＡ４０１３
に由来し、実施例８で記載したように vir+ であるｐＴ
ｉＡch５を含んでおり、また菌株ＣＡ１９は適当な植物
宿主中でリソパインデヒドロゲナーゼの産生をコードす
る。菌株ＣＡ１９はまたミクロ−ＴｉプラスミドｐＣＥ
Ｌ４４を含んでいる。ミクロプラスミドｐＣＥＬ４４は
オクトパインシンターゼ遺伝子の５′プロモーターと会
合アミノ末端領域をコードしている配列およびオクトパ
インシンターゼ遺伝子の３′末端配列間に挿入されたハ
イグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ I
V）をコードする遺伝子からなる構築体である。この構
築体は広域宿主範囲のベクターｐＫＴ２１０中のＴ−Ｄ
ＮＡのより広いフラグメント間に集まっている。ミクロ
プラスミドｐＣＥＬ４４は植物細胞を形質転換しハイグ
ロマイシン耐性とすることができる。菌株ＣＡ１９は次
の如くして調製する。
【００３８】1. エシェリキア コリ（Escherichia co
li）ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ３０の培養とプラスミド
ｐＣＥＬ３０の単離：プラスミドｐＣＥＬ３０はＴ−Ｄ
ＮＡの右手方向に広い配列およびプラスミドｐＴｉＡ６
６由来のオクトパインシンターゼ（ｏｃｓ）の５′末端
からなる。特異なＢｇｌIIサイトを含むリンカーをｏｃ
ｓ遺伝子の１１番目のコドンに結合している。リンカー
にはプラスミドｐＴｉＣ５８のノパリンシンターゼ遺伝
子の末端化およびポリアデニル化信号が結合されてい
る。これらの配列にはプラスミドｐＴｉＡ６６由来のＴ
−ＤＮＡの左手方向に広い配列を含む配列が結合してい
る。プラスミドｐＣＥＬ３０の制限サイトと機能マップ
は第８図に示されている。プラスミドｐＣＥＬ３０はエ
シエリキアコリＫ１２ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ３０か
ら都合よく単離される。Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣ
ＥＬ３０はイリノイ州ペオリア６１６０４のノーサン
リージョナル リサーチ ラボラトリー（National Reg
ional Research Laboratory ：ＮＲＲＬ）に寄託されて
おり、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５９１５を有してい
る。単離は次のようにして行う。Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１
５／ｐＣＥＬ３０を５０mg／mlのアンピシリンを含むＬ
培地（１０ｇ／ｌのカゼイン水解物、５ｇ／ｌの酵母抽
出物、５ｇ／ｌのNaCl、１ｇ／ｌのグルコース、ｐＨ7.
４）の750 ml中で通常の微生物手法により増殖させる。
この培養株は激しく振とうさせながら３７℃で２４時間
インキュベートさせた後に収穫する。培養株を遠心し、
細胞ペレットを５０mlの新に調製した溶解バッファー
（50mMのトリス−HCl 、ｐＨ8.０、１０mM ＥＤＴＡ、
９mg／mlのグルコース、２mg／ｌのリソザイム）に再懸
濁させる。４５分間の氷上インキュベーションの後、懸
濁液を0.２M NaOHと１％のＳＤＳである溶液１００mlと
混合する。続いて懸濁液をさらに５分間氷上に保持す
る。３Ｍの酢酸ナトリウムにさらに９０mlを加え、混合
物をさらに追加の６０分間氷上に保持する。
li）ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ３０の培養とプラスミド
ｐＣＥＬ３０の単離：プラスミドｐＣＥＬ３０はＴ−Ｄ
ＮＡの右手方向に広い配列およびプラスミドｐＴｉＡ６
６由来のオクトパインシンターゼ（ｏｃｓ）の５′末端
からなる。特異なＢｇｌIIサイトを含むリンカーをｏｃ
ｓ遺伝子の１１番目のコドンに結合している。リンカー
にはプラスミドｐＴｉＣ５８のノパリンシンターゼ遺伝
子の末端化およびポリアデニル化信号が結合されてい
る。これらの配列にはプラスミドｐＴｉＡ６６由来のＴ
−ＤＮＡの左手方向に広い配列を含む配列が結合してい
る。プラスミドｐＣＥＬ３０の制限サイトと機能マップ
は第８図に示されている。プラスミドｐＣＥＬ３０はエ
シエリキアコリＫ１２ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ３０か
ら都合よく単離される。Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣ
ＥＬ３０はイリノイ州ペオリア６１６０４のノーサン
リージョナル リサーチ ラボラトリー（National Reg
ional Research Laboratory ：ＮＲＲＬ）に寄託されて
おり、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５９１５を有してい
る。単離は次のようにして行う。Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１
５／ｐＣＥＬ３０を５０mg／mlのアンピシリンを含むＬ
培地（１０ｇ／ｌのカゼイン水解物、５ｇ／ｌの酵母抽
出物、５ｇ／ｌのNaCl、１ｇ／ｌのグルコース、ｐＨ7.
４）の750 ml中で通常の微生物手法により増殖させる。
この培養株は激しく振とうさせながら３７℃で２４時間
インキュベートさせた後に収穫する。培養株を遠心し、
細胞ペレットを５０mlの新に調製した溶解バッファー
（50mMのトリス−HCl 、ｐＨ8.０、１０mM ＥＤＴＡ、
９mg／mlのグルコース、２mg／ｌのリソザイム）に再懸
濁させる。４５分間の氷上インキュベーションの後、懸
濁液を0.２M NaOHと１％のＳＤＳである溶液１００mlと
混合する。続いて懸濁液をさらに５分間氷上に保持す
る。３Ｍの酢酸ナトリウムにさらに９０mlを加え、混合
物をさらに追加の６０分間氷上に保持する。
【００３９】細胞片を遠心により除去し、上清を５００
mlのエタノールと混合する。−20℃で２時間後、核酸を
遠心によりペレット化し、１０mMのトリス−HCl 、ｐＨ
８、１０mM ＥＤＴＡの９０ml中に再懸濁させる。核酸
溶液を９０gmの塩化セシウム、および１０mg／mlの臭化
エチジウム含有溶液0.９mlと混合する。この混合物を次
いで４0,０００rpm で２４時間遠心してプラスミドＤＮ
Ａを精製する。プラスミドＤＮＡバンドを回収し次いで
４0,０００rpm で１６時間遠心する。プラスミドＤＮＡ
バンドを再び回収し通常の方法により塩化セシウムと臭
化エチジウムを除去する。次にプラスミドＤＮＡバンド
を９０ｇ／ｌの酢酸アンモニウムを含む２容量のエタノ
ールで沈澱させる。ペレット化ＤＮＡをＴＥバッファー
（１０mMトリス−HCl 、ｐＨ８、１mM ＥＤＴＡ）に0.
２mg／mlの濃度で溶解させる。
mlのエタノールと混合する。−20℃で２時間後、核酸を
遠心によりペレット化し、１０mMのトリス−HCl 、ｐＨ
８、１０mM ＥＤＴＡの９０ml中に再懸濁させる。核酸
溶液を９０gmの塩化セシウム、および１０mg／mlの臭化
エチジウム含有溶液0.９mlと混合する。この混合物を次
いで４0,０００rpm で２４時間遠心してプラスミドＤＮ
Ａを精製する。プラスミドＤＮＡバンドを回収し次いで
４0,０００rpm で１６時間遠心する。プラスミドＤＮＡ
バンドを再び回収し通常の方法により塩化セシウムと臭
化エチジウムを除去する。次にプラスミドＤＮＡバンド
を９０ｇ／ｌの酢酸アンモニウムを含む２容量のエタノ
ールで沈澱させる。ペレット化ＤＮＡをＴＥバッファー
（１０mMトリス−HCl 、ｐＨ８、１mM ＥＤＴＡ）に0.
２mg／mlの濃度で溶解させる。
【００４０】2. Ｅ．コリＪＡ２２１／ｐＯＷ２０の培
養およびプラスミドｐＯＷ２０の単離：Ｅ．コリＪＡ２
２１／ｐＯＷ２０を本実施例のパートＡの１でＥ．コリ
ＲＲ１ＡΔＭ１５／ｐＣＥＬ３０について記載したよう
にして増殖させ、プラスミドｐＯＷ２０を本実施例のパ
ートＡの１でプラスミドｐＣＥＬ３０について記載した
ようにして調製する。 3. Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ４０の構築：５
μｇのプラスミドｐＣＥＬ３０ＤＮＡを酵素製造業者に
より推奨される組成の１５０μｌ反応混合物中の５０単
位のＢｇｌII制限酵素によって消化する。制限酵素およ
び他の酵素は次の供給者より容易に入手できる： ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ インコーポレッド （メイランド州 ロックビル 20850 ボックス 6010） ベーリンガー マンハイム ビオケミカルズ （インデアナ州 インデアナポリス 46250 P.O. ボックス 50816 ） ニューイングランド バイオ ラボラトリーズ インコーポレッド （マサチュセッツ州 ベバリー 01915 32 トーゼルロード） 消化は３７℃、９０分で進行せしめる。反応混合物を先
ず0.５Ｍトリス−HCl 、ｐＨ８、１mMのＥＤＴＡの8.７
５μlと混合し、次いで1.２５単位の子牛腸ホスファタ
ーゼ（ベーリンガーマンハイム社より購入できる）と混
合し、３７℃で１５分間インキュベートする。混合物を
次に緩衝化フェノールで次いでエーテルで抽出し、酢酸
アンモニウム含有エタノール２容量で沈澱させる。−７
０℃で３０分後に、ＤＮＡをペレット化しＴＥバッファ
ー中に１０μｇ／mlの濃度で再溶解する。約２０μｇの
プラスミドｐＯＷ２０ＤＮＡを制限酵素ＢamＨＩとＢｇ
ｌIIにより酵素製造業者が推奨する手順に従って消化し
ａｐｈIV遺伝子を得る。ａｐｈIV遺伝子はハイグロマイ
シンに耐性の遺伝子を含む植物を形成するＥ．コリ遺伝
子である。
養およびプラスミドｐＯＷ２０の単離：Ｅ．コリＪＡ２
２１／ｐＯＷ２０を本実施例のパートＡの１でＥ．コリ
ＲＲ１ＡΔＭ１５／ｐＣＥＬ３０について記載したよう
にして増殖させ、プラスミドｐＯＷ２０を本実施例のパ
ートＡの１でプラスミドｐＣＥＬ３０について記載した
ようにして調製する。 3. Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ４０の構築：５
μｇのプラスミドｐＣＥＬ３０ＤＮＡを酵素製造業者に
より推奨される組成の１５０μｌ反応混合物中の５０単
位のＢｇｌII制限酵素によって消化する。制限酵素およ
び他の酵素は次の供給者より容易に入手できる： ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ インコーポレッド （メイランド州 ロックビル 20850 ボックス 6010） ベーリンガー マンハイム ビオケミカルズ （インデアナ州 インデアナポリス 46250 P.O. ボックス 50816 ） ニューイングランド バイオ ラボラトリーズ インコーポレッド （マサチュセッツ州 ベバリー 01915 32 トーゼルロード） 消化は３７℃、９０分で進行せしめる。反応混合物を先
ず0.５Ｍトリス−HCl 、ｐＨ８、１mMのＥＤＴＡの8.７
５μlと混合し、次いで1.２５単位の子牛腸ホスファタ
ーゼ（ベーリンガーマンハイム社より購入できる）と混
合し、３７℃で１５分間インキュベートする。混合物を
次に緩衝化フェノールで次いでエーテルで抽出し、酢酸
アンモニウム含有エタノール２容量で沈澱させる。−７
０℃で３０分後に、ＤＮＡをペレット化しＴＥバッファ
ー中に１０μｇ／mlの濃度で再溶解する。約２０μｇの
プラスミドｐＯＷ２０ＤＮＡを制限酵素ＢamＨＩとＢｇ
ｌIIにより酵素製造業者が推奨する手順に従って消化し
ａｐｈIV遺伝子を得る。ａｐｈIV遺伝子はハイグロマイ
シンに耐性の遺伝子を含む植物を形成するＥ．コリ遺伝
子である。
【００４１】この消化により得たＤＮＡフラグメントを
アガロースゲル電気泳動の通常方法により分画しアガロ
ースゲル中に挿入したＮＡ−４５ＤＥＡＥ紙（ニューハ
ンプシャー州０３４３１のキーンのシュレイチャー ア
ンド シュウェル社）上に電気泳動中に包括させること
によって単離した。ＤＮＡを上記の紙から上記紙を５秒
間十分量の高塩バッファー（1.０M NaCl 、0.１mM Ｅ
ＤＴＡ、および２０mMトリス、ｐＨ8.０）でスピニング
することにより溶出して紙をミクロ遠心機中に回収す
る。この紙を５５〜６０℃で１０〜４５分間必要に応じ
て渦巻かせることによってインキュベートする。バッフ
ァーを除去し、紙を約 ５０μl のバッファーで洗浄す
る。ＤＮＡを先ずフェノールで次いでエーテルで抽出
し、ＴＥバッファー中に約２５μg ／mlの濃度で再懸濁
させる。１０ngのホスホターゼ処理ＢｇｌII切断プラス
ミドｐＣＥＬ３０を１５μl の0.８ユニットＴ4 ＤＮＡ
リガーゼ含有リガーゼバッファー（５０mMトリス−HC
l、ｐＨ7.６、１０mM MgCl2、１０mM ＤＴＴ、および
１mM ＡＴｐ）中で５０ngの精製〜1.３kbＢａｍ−Ｂａ
ｌIIフラグメントと混合する。この混合物を一夜１５℃
でインキュベートする。この連結反応混合物を１５μl
の滅菌６０mM CaCl2溶液と混合する。次に−７０℃で３
０mM CaCl2、１５％グリセロール中で２０倍濃縮で貯蔵
した適格Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５細胞の懸濁液７０μl
を加える。氷上で６０分経過後、形質転換混合物を４２
℃で２分間加熱処理し、次いで0.５mlＬ培地で３７℃、
９０分間インキュベートする。混合物のサンプルをアン
ピシリンを５０mg／l で含むＬ培地上に拡散させ寒天に
より１５ｇ／l で固化する。これらのサンプルを次いで
一夜３７℃でインキュベートして形質転換細胞からのコ
ロニーの増殖を行う。形質転換により得られるコロニー
をアンピシリンを５０mg／l で含む５mlのＬ培地中に接
種し、３７℃で一夜増殖させる。プラスミドＤＮＡは、
これら培養物の１mlサンプルから、ホルメス（Holmes）
とキーグレイ（Quigley)の“Analytical Biochemistry,
１１４、１９３（１９８１）”の方法により調製し、５
０μlのＴＥバッファー中に再溶解させる。
アガロースゲル電気泳動の通常方法により分画しアガロ
ースゲル中に挿入したＮＡ−４５ＤＥＡＥ紙（ニューハ
ンプシャー州０３４３１のキーンのシュレイチャー ア
ンド シュウェル社）上に電気泳動中に包括させること
によって単離した。ＤＮＡを上記の紙から上記紙を５秒
間十分量の高塩バッファー（1.０M NaCl 、0.１mM Ｅ
ＤＴＡ、および２０mMトリス、ｐＨ8.０）でスピニング
することにより溶出して紙をミクロ遠心機中に回収す
る。この紙を５５〜６０℃で１０〜４５分間必要に応じ
て渦巻かせることによってインキュベートする。バッフ
ァーを除去し、紙を約 ５０μl のバッファーで洗浄す
る。ＤＮＡを先ずフェノールで次いでエーテルで抽出
し、ＴＥバッファー中に約２５μg ／mlの濃度で再懸濁
させる。１０ngのホスホターゼ処理ＢｇｌII切断プラス
ミドｐＣＥＬ３０を１５μl の0.８ユニットＴ4 ＤＮＡ
リガーゼ含有リガーゼバッファー（５０mMトリス−HC
l、ｐＨ7.６、１０mM MgCl2、１０mM ＤＴＴ、および
１mM ＡＴｐ）中で５０ngの精製〜1.３kbＢａｍ−Ｂａ
ｌIIフラグメントと混合する。この混合物を一夜１５℃
でインキュベートする。この連結反応混合物を１５μl
の滅菌６０mM CaCl2溶液と混合する。次に−７０℃で３
０mM CaCl2、１５％グリセロール中で２０倍濃縮で貯蔵
した適格Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５細胞の懸濁液７０μl
を加える。氷上で６０分経過後、形質転換混合物を４２
℃で２分間加熱処理し、次いで0.５mlＬ培地で３７℃、
９０分間インキュベートする。混合物のサンプルをアン
ピシリンを５０mg／l で含むＬ培地上に拡散させ寒天に
より１５ｇ／l で固化する。これらのサンプルを次いで
一夜３７℃でインキュベートして形質転換細胞からのコ
ロニーの増殖を行う。形質転換により得られるコロニー
をアンピシリンを５０mg／l で含む５mlのＬ培地中に接
種し、３７℃で一夜増殖させる。プラスミドＤＮＡは、
これら培養物の１mlサンプルから、ホルメス（Holmes）
とキーグレイ（Quigley)の“Analytical Biochemistry,
１１４、１９３（１９８１）”の方法により調製し、５
０μlのＴＥバッファー中に再溶解させる。
【００４２】4. ミクロＴｉプラスミドｐＣＥＬ４４の
構築：プラスミドｐＣＥＬ４０はアグロバクテリウム中
の複製たり得ないので、プラスミドｐＣＥＬ４０のミク
ロＴ−ＤＮＡを先ずＥcoＲＩフラグメントとして広域宿
主範囲のベクターｐＫＴ２１０中に転写した。この広域
宿主範囲ベクターはカルホルニア州（９４３０５）のパ
ロアルトのスタンフオード大学のプラスミドリファレン
スセンターより入手できる。５μｇのプラスミドｐＫＴ
２１０を酵素製造業者の推奨する組成の１５０μlの反
応液中でＥcoＲＩ制限酵素の５０単位で消化する。３７
℃で９０分後に、反応物を本実施例のパートＡの３で記
載したような子牛腸ホスファターゼで処理しＴＥバッフ
ァ中に１０μg ／mlの濃度に溶解する。本実施例のパー
トＡの３で記載したようにして増殖させたプラスミドｐ
ＣＥＬ４０ＤＮＡ調製物１５μl を１０単位のＥcoＲＩ
制限酵素で２０μl 反応液中で３７℃、９０分間消化
し、次いでフェノールで抽出し、エーテルで抽出する。
消化したＤＮＡを酢酸アンモニウム含有エタノールの２
容量で−２０℃で沈澱させ、２０μl のＴＥバッファー
中に再溶解する。１０ngのホスファターゼ処理ＥcoＲＩ
切断ｐＫＴ２１０を本実施例のパートＡの３で記載した
ようにして５μl のＥcoＲＩ切断ｐＣＥＬ４０と連結反
応させて本実施例のパートＡの３で記載したようにして
Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５に形質転換する。ｐＣＥＬ４４
含有の形質転換細胞をその能力により用いてクロラムフ
ェニコールを１０mg／l 含む固化Ｌ培地上で増殖させ
る。ｐＣＥＬ４４の制限サイトおよび機能マップは第９
図に示される。
構築：プラスミドｐＣＥＬ４０はアグロバクテリウム中
の複製たり得ないので、プラスミドｐＣＥＬ４０のミク
ロＴ−ＤＮＡを先ずＥcoＲＩフラグメントとして広域宿
主範囲のベクターｐＫＴ２１０中に転写した。この広域
宿主範囲ベクターはカルホルニア州（９４３０５）のパ
ロアルトのスタンフオード大学のプラスミドリファレン
スセンターより入手できる。５μｇのプラスミドｐＫＴ
２１０を酵素製造業者の推奨する組成の１５０μlの反
応液中でＥcoＲＩ制限酵素の５０単位で消化する。３７
℃で９０分後に、反応物を本実施例のパートＡの３で記
載したような子牛腸ホスファターゼで処理しＴＥバッフ
ァ中に１０μg ／mlの濃度に溶解する。本実施例のパー
トＡの３で記載したようにして増殖させたプラスミドｐ
ＣＥＬ４０ＤＮＡ調製物１５μl を１０単位のＥcoＲＩ
制限酵素で２０μl 反応液中で３７℃、９０分間消化
し、次いでフェノールで抽出し、エーテルで抽出する。
消化したＤＮＡを酢酸アンモニウム含有エタノールの２
容量で−２０℃で沈澱させ、２０μl のＴＥバッファー
中に再溶解する。１０ngのホスファターゼ処理ＥcoＲＩ
切断ｐＫＴ２１０を本実施例のパートＡの３で記載した
ようにして５μl のＥcoＲＩ切断ｐＣＥＬ４０と連結反
応させて本実施例のパートＡの３で記載したようにして
Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５に形質転換する。ｐＣＥＬ４４
含有の形質転換細胞をその能力により用いてクロラムフ
ェニコールを１０mg／l 含む固化Ｌ培地上で増殖させ
る。ｐＣＥＬ４４の制限サイトおよび機能マップは第９
図に示される。
【００４３】5. 菌株ＣＡ１９を形成するためのｐＣＥ
Ｌ４４のＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４０１３への接
合：ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ４４とＥ．コリｐＲＫ２
０１３を固化Ｌ培地上で３７℃、一夜増殖させる。Ａ．
ツメファシエンスＬＢＡ４０１３は固化Ｌ培地上で２８
℃、２日間増殖させる。Ｅ．コリ１Ｋ１２ ＲＲ１ΔＭ
１５／ｐＣＥＬ４４の１個のループ、Ｅ．コリｐＲＫ２
０１３の１個のループおよびＡ．ツメファシエンスＬＢ
Ａ４０１３の１個のループとを１mlの３０mM硫酸マグネ
シウム溶液中に混合する。次に、この混合物の１滴を固
化ＴＹ培地（５ｇ／l のカゼイン水解物、５ｇ／l の酵
母抽出物、１５ｇ／l の寒天）上に乗せ２８℃で一夜イ
ンキュベートする。上記細菌増殖物を３mlの１０mM硫酸
マグネシウム溶液に再懸濁し、0.１mlの階階希釈サンプ
ルを１００mg／l のナリジキシン酸と２mg／l のクロラ
ムフェニコールとを含む固化ＴＹ培地上に拡散し２８℃
でインキュベートする。接合完了体は２〜４日間増殖後
個々のコロニーに生長する。これらのコロニーを１００
mg／l のナリシキシン酸と２ｍ／l のクロラムフェニコ
ールを含む液体ＴＹ培地２５ml中に１回接種しさらに２
日間振とうさせながら２８℃でインキュベートする。接
合完了体のプラスミド含有量を次いでカッセ（Casse)等
の方法（Journal of General Microbiology, 113、 229
−242 、1979）によりチェックし、野外タイプｐＴｉＡ
ch５プラスミドとｐＣＥＬ４４プラスミドを含む菌株Ｃ
Ａ１９を単離する。本発明の方法を実施するのに用いる
ＣＡ１９はインジアナ州インジアナポリスのイライ リ
リー社のクレック ウォルトロン氏より入手した。菌株
ＣＡ19の調製はウォルトロン等の“Plant Molec. Bio
l., ５、１０３（１９８５）”にも記載されており、そ
の記載は本明細書に参考として引用する。 Ｂ．とうもろこしの形質転換：近交黄色イオチーフ株と
うもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接種しさらに実
施例１のパートＢとＣで記載したようにして７〜１４日
間インキュベートしたが、とうもろこし実生は菌株Ｂ６
ではなく菌株ＣＡ１９で接種した。
Ｌ４４のＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４０１３への接
合：ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ４４とＥ．コリｐＲＫ２
０１３を固化Ｌ培地上で３７℃、一夜増殖させる。Ａ．
ツメファシエンスＬＢＡ４０１３は固化Ｌ培地上で２８
℃、２日間増殖させる。Ｅ．コリ１Ｋ１２ ＲＲ１ΔＭ
１５／ｐＣＥＬ４４の１個のループ、Ｅ．コリｐＲＫ２
０１３の１個のループおよびＡ．ツメファシエンスＬＢ
Ａ４０１３の１個のループとを１mlの３０mM硫酸マグネ
シウム溶液中に混合する。次に、この混合物の１滴を固
化ＴＹ培地（５ｇ／l のカゼイン水解物、５ｇ／l の酵
母抽出物、１５ｇ／l の寒天）上に乗せ２８℃で一夜イ
ンキュベートする。上記細菌増殖物を３mlの１０mM硫酸
マグネシウム溶液に再懸濁し、0.１mlの階階希釈サンプ
ルを１００mg／l のナリジキシン酸と２mg／l のクロラ
ムフェニコールとを含む固化ＴＹ培地上に拡散し２８℃
でインキュベートする。接合完了体は２〜４日間増殖後
個々のコロニーに生長する。これらのコロニーを１００
mg／l のナリシキシン酸と２ｍ／l のクロラムフェニコ
ールを含む液体ＴＹ培地２５ml中に１回接種しさらに２
日間振とうさせながら２８℃でインキュベートする。接
合完了体のプラスミド含有量を次いでカッセ（Casse)等
の方法（Journal of General Microbiology, 113、 229
−242 、1979）によりチェックし、野外タイプｐＴｉＡ
ch５プラスミドとｐＣＥＬ４４プラスミドを含む菌株Ｃ
Ａ１９を単離する。本発明の方法を実施するのに用いる
ＣＡ１９はインジアナ州インジアナポリスのイライ リ
リー社のクレック ウォルトロン氏より入手した。菌株
ＣＡ19の調製はウォルトロン等の“Plant Molec. Bio
l., ５、１０３（１９８５）”にも記載されており、そ
の記載は本明細書に参考として引用する。 Ｂ．とうもろこしの形質転換：近交黄色イオチーフ株と
うもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接種しさらに実
施例１のパートＢとＣで記載したようにして７〜１４日
間インキュベートしたが、とうもろこし実生は菌株Ｂ６
ではなく菌株ＣＡ１９で接種した。
【００４４】Ｃ．アッセイ：
1. 実生のリソパインデヒドロゲナーゼ活性のアッセ
イ：７〜１４日間インキュベーション期間終了時に、実
生を実施例１のパートＤに記載したようにして酵素活性
についてアッセイした。結果は第６図に示すとおりであ
り、レーン１〜１０は一回ＣＡ１９接種実生の無細胞抽
出物をリソパインヒドロキゲナーゼで４時間インキュベ
ートすることによって生じた生成物を含んでいる。それ
より明らかなように、１回接種ＣＡ１９とうもろこし実
生の無細胞抽出物１０のうちの９つにおいてオクトパイ
ン産生が認められ、実生がリソパインデヒドロゲナーゼ
を含有して形質転換されていることが示された。 2. 実生のハイグロマイシン耐性のアッセイ：菌株ＣＡ
１９を接種したいくつかの実生を接種後３〜４日間のみ
インキュベートし、その時点で次のようにしてハイグロ
マイシン耐性をアッセイした。実生を内乳および胚盤
（第１Ａ図および第１Ｂ図参照）から切り取り約３mmの
断面積に切断した。これらの断面切断物を各々２００μ
g ／mlのカルベニシリン（シグマ）とバンコマイシン
（リリー）とを加えたダンカン培地（ダンカン等により
“Plants, １６５、３２２（１９８５）”中に記載され
ている）、または各々２００μg ／mlのカルベニシリン
とバンコマイシンを加えたＢＮ4 培地〔ムラシージ（Mu
rashige)およびスクーグ（Skoog)の主要および微量塩
（Physiol. Plant，１５，４７３（１９６２）に記載さ
れている）、４mg／l のオーキシンとしての２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸、９ｇ／l のデフコバクトアガー
（Difco Bactoager)、および２０ｇ／l のサクロース〕
上で暗中で２５〜２７℃で３週間培養し、さらに３週間
抗菌剤への通過を行った。上記とうもろこし実生由来の
組織培養物のハイグロマイシンに対する応答性を試験す
るためには、全断面プラス断面から生長した組織または
１００mgのカルスサンプルのいずれかをファルコン１０
０５ペトリ皿中の上記濃度のバンコマイシンおよびカル
ベニシリンを加え約１２５μg ／mlのハイグロマイシン
Ｂ（リリー社）を含む５０mlのダンカン培地またはＢＮ
4 培地上に乗せる。この試験は２７℃での暗中インキュ
ベーション３週間後に増殖の観察チェックにより読み取
る。増殖中の培養物は淡色であり粒度の増大を示してい
る。この試験を用いて、正増殖表現型をＣＡ１９接種実
生由来の培養物から回収し、実生が異種ハイグロマイシ
ン遺伝子により形質転換されていることを示す。
イ：７〜１４日間インキュベーション期間終了時に、実
生を実施例１のパートＤに記載したようにして酵素活性
についてアッセイした。結果は第６図に示すとおりであ
り、レーン１〜１０は一回ＣＡ１９接種実生の無細胞抽
出物をリソパインヒドロキゲナーゼで４時間インキュベ
ートすることによって生じた生成物を含んでいる。それ
より明らかなように、１回接種ＣＡ１９とうもろこし実
生の無細胞抽出物１０のうちの９つにおいてオクトパイ
ン産生が認められ、実生がリソパインデヒドロゲナーゼ
を含有して形質転換されていることが示された。 2. 実生のハイグロマイシン耐性のアッセイ：菌株ＣＡ
１９を接種したいくつかの実生を接種後３〜４日間のみ
インキュベートし、その時点で次のようにしてハイグロ
マイシン耐性をアッセイした。実生を内乳および胚盤
（第１Ａ図および第１Ｂ図参照）から切り取り約３mmの
断面積に切断した。これらの断面切断物を各々２００μ
g ／mlのカルベニシリン（シグマ）とバンコマイシン
（リリー）とを加えたダンカン培地（ダンカン等により
“Plants, １６５、３２２（１９８５）”中に記載され
ている）、または各々２００μg ／mlのカルベニシリン
とバンコマイシンを加えたＢＮ4 培地〔ムラシージ（Mu
rashige)およびスクーグ（Skoog)の主要および微量塩
（Physiol. Plant，１５，４７３（１９６２）に記載さ
れている）、４mg／l のオーキシンとしての２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸、９ｇ／l のデフコバクトアガー
（Difco Bactoager)、および２０ｇ／l のサクロース〕
上で暗中で２５〜２７℃で３週間培養し、さらに３週間
抗菌剤への通過を行った。上記とうもろこし実生由来の
組織培養物のハイグロマイシンに対する応答性を試験す
るためには、全断面プラス断面から生長した組織または
１００mgのカルスサンプルのいずれかをファルコン１０
０５ペトリ皿中の上記濃度のバンコマイシンおよびカル
ベニシリンを加え約１２５μg ／mlのハイグロマイシン
Ｂ（リリー社）を含む５０mlのダンカン培地またはＢＮ
4 培地上に乗せる。この試験は２７℃での暗中インキュ
ベーション３週間後に増殖の観察チェックにより読み取
る。増殖中の培養物は淡色であり粒度の増大を示してい
る。この試験を用いて、正増殖表現型をＣＡ１９接種実
生由来の培養物から回収し、実生が異種ハイグロマイシ
ン遺伝子により形質転換されていることを示す。
【００４５】実施例１０
Ａ．除草剤グリホサイトに対する耐性を与える遺伝子を
担持するＡ．ツメファシエンス菌株の調製： 1. Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ３０の培養とプ
ラスミドｐＣＥＬ３０の単離：Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５
／ｐＣＥＬ３０を実施例９のパートＡの１で記載したよ
うにして増殖し、プラスミドｐＣＥＬ３０を実施例９の
パート１のＡで記載したようにして単離する。 2. プラスミドｐＣＥＬ３０のＢｇｌII消化と子牛腸ホ
スファターゼによる処理：５ｇのプラスミドｐＣＥＬ３
０ＤＮＡを実施例９のパートＡの３で記載したようにし
て消化し子牛腸ホスファターゼで処理する。
担持するＡ．ツメファシエンス菌株の調製： 1. Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５／ｐＣＥＬ３０の培養とプ
ラスミドｐＣＥＬ３０の単離：Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５
／ｐＣＥＬ３０を実施例９のパートＡの１で記載したよ
うにして増殖し、プラスミドｐＣＥＬ３０を実施例９の
パート１のＡで記載したようにして単離する。 2. プラスミドｐＣＥＬ３０のＢｇｌII消化と子牛腸ホ
スファターゼによる処理：５ｇのプラスミドｐＣＥＬ３
０ＤＮＡを実施例９のパートＡの３で記載したようにし
て消化し子牛腸ホスファターゼで処理する。
【００４６】3. グリホサイト耐性ＥＰＳＰシンターゼ
遺伝子の単離：グリホサイト耐性５−エノールピルボイ
ルシキミ酸−３リン酸シンターゼ遺伝子（ＧＲＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子）をコードする遺伝子をコマイ（Comai)等の
“Nature, ３１７、７１４（１９８５）”およびスタル
カー（Stalker)等の“J. Biol. Chem., ２６０、４７２
４（１９８５）”に記載されたようにして単離する（こ
れら文献の記載は参考として本明細書に引用する）。こ
の方法の最終工程において、プラスミドｐＰＭＧ３４か
ら切断されたＢamＨＩのフラグメント中のＧＲＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子をプラスミドｐＵＣ７にクローン化してプラス
ミドｐＰＭＧ３８を得る。ＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子はその
後プラスミドｐＰＭＧ３８からＥcoＲＩフラグメントと
して切り取る。ＥcoＲＩフラグメントは次いで適当な商
業的に入手できる分子リンカーを用いて修飾してＢｇｌ
II消化 ｐＣＥＬ３０プラスミド上の特異的ＢｇｌIIサ
イトと連結反応できるようにまたＥcoＲＩサイトを除去
できるようにする。除草剤グリホサイト（Ｎ−ホスホノ
メチル−グリシン）は雑草および作物種の両方を殺す広
汎に使用される広域スペクトル除草剤である。この除草
剤は芳香族化合物の生合成の代謝段階を抑制し、グリホ
サイトの細胞ターゲットは５−エノールピルボイルシキ
ミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰシンターゼ）で
あり、これはホスホエノールピルベイトとシキメートか
らの５−エノールピルボイルシキミ酸３−リン酸の形成
を触媒し、該シキミ酸塩経路のこの段階の抑制が実際に
細胞死をもたらしている。ＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子はサル
モネラ チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の
ａｒｏＡ部位の変異体対立遺伝子であり、この遺伝子は
ＥＰＳＰシンターゼをコードし、セリンのプロリンへの
置換により該酵素のグリホサイトに対する親和性を減少
せしめる。
遺伝子の単離：グリホサイト耐性５−エノールピルボイ
ルシキミ酸−３リン酸シンターゼ遺伝子（ＧＲＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子）をコードする遺伝子をコマイ（Comai)等の
“Nature, ３１７、７１４（１９８５）”およびスタル
カー（Stalker)等の“J. Biol. Chem., ２６０、４７２
４（１９８５）”に記載されたようにして単離する（こ
れら文献の記載は参考として本明細書に引用する）。こ
の方法の最終工程において、プラスミドｐＰＭＧ３４か
ら切断されたＢamＨＩのフラグメント中のＧＲＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子をプラスミドｐＵＣ７にクローン化してプラス
ミドｐＰＭＧ３８を得る。ＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子はその
後プラスミドｐＰＭＧ３８からＥcoＲＩフラグメントと
して切り取る。ＥcoＲＩフラグメントは次いで適当な商
業的に入手できる分子リンカーを用いて修飾してＢｇｌ
II消化 ｐＣＥＬ３０プラスミド上の特異的ＢｇｌIIサ
イトと連結反応できるようにまたＥcoＲＩサイトを除去
できるようにする。除草剤グリホサイト（Ｎ−ホスホノ
メチル−グリシン）は雑草および作物種の両方を殺す広
汎に使用される広域スペクトル除草剤である。この除草
剤は芳香族化合物の生合成の代謝段階を抑制し、グリホ
サイトの細胞ターゲットは５−エノールピルボイルシキ
ミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰシンターゼ）で
あり、これはホスホエノールピルベイトとシキメートか
らの５−エノールピルボイルシキミ酸３−リン酸の形成
を触媒し、該シキミ酸塩経路のこの段階の抑制が実際に
細胞死をもたらしている。ＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子はサル
モネラ チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の
ａｒｏＡ部位の変異体対立遺伝子であり、この遺伝子は
ＥＰＳＰシンターゼをコードし、セリンのプロリンへの
置換により該酵素のグリホサイトに対する親和性を減少
せしめる。
【００４７】4. 連結反応：実施例９のパートＡの３で
調製した１０ngのホスファターゼ処理ＢｇｌＩ切断プラ
スミドｐＣＥＬ３０を１５μl の0.８ユニットＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼ含有リガーゼバッファー中で５０ngのＧＲＥ
ＰＳＰＳ遺伝子（結合リンカーを含む）と混合する。混
合物を１５℃で一夜インキュベートする。この連結反応
混合物を用いて実施例９のパートＡの３で記載したよう
にして適格Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５細胞を形質転換す
る。 5. ＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子を担持するミクロ−Ｔｉプラ
スミドの構築：実施例９のパートＡの３に記載したよう
なアンピシリン含有Ｌ培地上での本実施例のパートＡの
４で記載したようにして生成させた形質転換細胞の選定
後、形質転換Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５細胞からのプラス
ミドを、実施例９のパートＡの４で記載したように、Ｅ
coＲＩフラグメントとして、広域宿主範囲のベクターｐ
ＫＴ２１０に転写する。 6. Ａ．ツメファシエンスＬＢＡ４０１３への接合：広
域宿主範囲ベクターｐＫＴ２１０上にＧＲＥＰＳＰＳ遺
伝子を担持するプラスミドを、実施例９のパートＡの５
に記載したような接合により、Ａ．ツメファシエンス菌
株ＬＢＡ４０１３へ転写する。得られた接合完了体を実
施例９のパートＡの５に記載したようにして選択し、Ｇ
ＲＥＰＳＰＳ遺伝子を担持するＡ．ツメファシエンスの
新規な菌株（以下、菌株ＬＢＡ４０１３／ＧＲＥＰＳＰ
Ｓと称す）を単離する。 Ｂ．とうもろこしの形質転換：近交黄色イオチーフ株と
うもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに
実施例１のパートＢとＣで記載したようにしてインキュ
ベートしたが、とうもろこし実生は菌株Ｂ６ではなく菌
株ＬＢＡ４０１３／ＧＲＥＰＳＰＳを接種した。７日間
のインキュベーション後、この感染実生を鉢植土壌を含
む鉢に植付ける。
調製した１０ngのホスファターゼ処理ＢｇｌＩ切断プラ
スミドｐＣＥＬ３０を１５μl の0.８ユニットＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼ含有リガーゼバッファー中で５０ngのＧＲＥ
ＰＳＰＳ遺伝子（結合リンカーを含む）と混合する。混
合物を１５℃で一夜インキュベートする。この連結反応
混合物を用いて実施例９のパートＡの３で記載したよう
にして適格Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５細胞を形質転換す
る。 5. ＧＲＥＰＳＰＳ遺伝子を担持するミクロ−Ｔｉプラ
スミドの構築：実施例９のパートＡの３に記載したよう
なアンピシリン含有Ｌ培地上での本実施例のパートＡの
４で記載したようにして生成させた形質転換細胞の選定
後、形質転換Ｅ．コリＲＲ１ΔＭ１５細胞からのプラス
ミドを、実施例９のパートＡの４で記載したように、Ｅ
coＲＩフラグメントとして、広域宿主範囲のベクターｐ
ＫＴ２１０に転写する。 6. Ａ．ツメファシエンスＬＢＡ４０１３への接合：広
域宿主範囲ベクターｐＫＴ２１０上にＧＲＥＰＳＰＳ遺
伝子を担持するプラスミドを、実施例９のパートＡの５
に記載したような接合により、Ａ．ツメファシエンス菌
株ＬＢＡ４０１３へ転写する。得られた接合完了体を実
施例９のパートＡの５に記載したようにして選択し、Ｇ
ＲＥＰＳＰＳ遺伝子を担持するＡ．ツメファシエンスの
新規な菌株（以下、菌株ＬＢＡ４０１３／ＧＲＥＰＳＰ
Ｓと称す）を単離する。 Ｂ．とうもろこしの形質転換：近交黄色イオチーフ株と
うもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに
実施例１のパートＢとＣで記載したようにしてインキュ
ベートしたが、とうもろこし実生は菌株Ｂ６ではなく菌
株ＬＢＡ４０１３／ＧＲＥＰＳＰＳを接種した。７日間
のインキュベーション後、この感染実生を鉢植土壌を含
む鉢に植付ける。
【００４８】Ｃ．アッセイ：
1. 花粉中の酵素活性のアッセイ：実生の植付け６０日
後に、５本の植付け物の花粉の各サンプルを、それぞ
れ、実施例３のパートＢで記載したようにして、リソパ
インデヒドロゲナーゼの存在についてアッセイする。５
本の植付け物から花粉の無細胞抽出物をインキュベート
することによって生じた生成物の電気泳動の結果は花粉
の無細胞抽出物の５つのうちの３つがオクトパインを産
生することを示しており、花粉が形質転換していること
を示している。 2. ＥＰＳＰシンターゼ活性のアッセイ：分裂組織から
の葉を、実生の植付け７週間後に、ブーコック（Boococ
k)とコギンズ（Coggins)の方法（“ＦＥＢＳ Letters,
１５４、１２７（1983）”；その記載は参考として本明
細書に引用する）により、ＥＰＳＰシンターゼ活性につ
いてアッセイする。５本の個々の植付け物からの５枚の
葉をアッセイし、３枚がＥＰＳＰシンターゼ活性を含む
ことが認められ、形質転換が起っていることを示してい
る。 3. グリホサイトに対する耐性のアッセイ：本実施例の
パートＣの２の結果として葉中にＥＰＳＰシンターゼ活
性を含んでいることを確認した３本の植付け物に0.５kg
／ヘクタールに等価のグリホサイトイソプロピルアミン
塩を噴霧する。３本の植付け物はすべて対照に比べ著し
いグリホサイト耐性を示す。好ましい実施態様を示す以
上の記載により、特許請求する本発明の範囲を何ら限定
する積りはない。当業者ならば多くの修正、変形および
応用が可能であることは理解されるであろう。
後に、５本の植付け物の花粉の各サンプルを、それぞ
れ、実施例３のパートＢで記載したようにして、リソパ
インデヒドロゲナーゼの存在についてアッセイする。５
本の植付け物から花粉の無細胞抽出物をインキュベート
することによって生じた生成物の電気泳動の結果は花粉
の無細胞抽出物の５つのうちの３つがオクトパインを産
生することを示しており、花粉が形質転換していること
を示している。 2. ＥＰＳＰシンターゼ活性のアッセイ：分裂組織から
の葉を、実生の植付け７週間後に、ブーコック（Boococ
k)とコギンズ（Coggins)の方法（“ＦＥＢＳ Letters,
１５４、１２７（1983）”；その記載は参考として本明
細書に引用する）により、ＥＰＳＰシンターゼ活性につ
いてアッセイする。５本の個々の植付け物からの５枚の
葉をアッセイし、３枚がＥＰＳＰシンターゼ活性を含む
ことが認められ、形質転換が起っていることを示してい
る。 3. グリホサイトに対する耐性のアッセイ：本実施例の
パートＣの２の結果として葉中にＥＰＳＰシンターゼ活
性を含んでいることを確認した３本の植付け物に0.５kg
／ヘクタールに等価のグリホサイトイソプロピルアミン
塩を噴霧する。３本の植付け物はすべて対照に比べ著し
いグリホサイト耐性を示す。好ましい実施態様を示す以
上の記載により、特許請求する本発明の範囲を何ら限定
する積りはない。当業者ならば多くの修正、変形および
応用が可能であることは理解されるであろう。
【００４９】実施例１１
Ａ．とうもろこしの形質転換：菌株ＣＡ１９を実施例９
のパートＡで記載したようにして培養し、黄色イオチー
フとうもろこしを滅菌し、発芽させ、ＣＡ１９を接種
し、実施例１のＢとＣで記載したようにしてインキュベ
ートした。実生をまたＡ．ツメファシエンス菌株ＣＡ１
７でも接種した。ＣＡ１７は菌株ＣＡ１９と同じてある
が、ハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子が反対方
向に挿入されている。さらに、実生はまたＹＥＢ単独で
も接種した。７日間のインキュベーション後、接種した
実生すべてを植付けた。 Ｂ．アッセイ： 1. 形質転換植付物の上部葉中の酵素活性のアッセイ：
植付け物が成熟に達したとき、その上部の葉を実施例３
のパートＢの２に記載したようにしてリソパインデヒド
ロゲナーゼ活性の存在についてアッセイした。ただし、
リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いた。ＣＡ１
９接種実生からの５本の植付け物の葉、ＣＡ１７接種実
生からの２本の植付け物の葉およびＹＥＢ接種の３本の
植付け物の葉をアッセイした。結果は第１４図に示す。
第１４図において各レーンは次の物質を含む。
のパートＡで記載したようにして培養し、黄色イオチー
フとうもろこしを滅菌し、発芽させ、ＣＡ１９を接種
し、実施例１のＢとＣで記載したようにしてインキュベ
ートした。実生をまたＡ．ツメファシエンス菌株ＣＡ１
７でも接種した。ＣＡ１７は菌株ＣＡ１９と同じてある
が、ハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子が反対方
向に挿入されている。さらに、実生はまたＹＥＢ単独で
も接種した。７日間のインキュベーション後、接種した
実生すべてを植付けた。 Ｂ．アッセイ： 1. 形質転換植付物の上部葉中の酵素活性のアッセイ：
植付け物が成熟に達したとき、その上部の葉を実施例３
のパートＢの２に記載したようにしてリソパインデヒド
ロゲナーゼ活性の存在についてアッセイした。ただし、
リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いた。ＣＡ１
９接種実生からの５本の植付け物の葉、ＣＡ１７接種実
生からの２本の植付け物の葉およびＹＥＢ接種の３本の
植付け物の葉をアッセイした。結果は第１４図に示す。
第１４図において各レーンは次の物質を含む。
【００５０】
各レーンの含有物
植付物コ 実生上に用
レーン ード番号 いた菌株 採取した植物部位 備 考
１ − − − 合成オクトパ
イン標準物
２ Ｓ−１ ＹＥＢ 刀状葉 −
３ １９−６ ＣＡ１９ 刀状葉の下の葉 −
４ １９−６ ＣＡ１９ ひこばえ −
５ １７−４ ＣＡ１７ 穂の苗条 −
６ １９−３ ＣＡ１９ 〃 −
７ １９−３ ＣＡ１９ 刀状葉の下の葉 −
８ Ｓ−５ ＹＥＢ 〃 −
９ １７−３ ＣＡ１７ 刀状葉の下の葉 −
１０ １７−３ ＣＡ１７ 刀状葉の下の第２葉 −
１１ １９−４ ＣＡ１９ 刀状葉の下の葉 −
１２ Ｓ−８ ＹＥＢ 〃 −
１３ １９−５ ＣＡ１９ 刀状葉 −
１４ １９−５ ＣＡ１９ 刀状葉の下の葉 −
１５ １９−２ ＣＡ１９ 刀状葉 −
１６ １９−２ ＣＡ１９ 刀状葉の下の葉 −
【００５１】第１４図に示すように、ＹＥＢ接種実生か
らの葉の抽出物はいずれもオクトパインを産生せず、一
方ＣＡ−１９接種およびＣＡ−１７接種実生の１２抽出
物のうちの８つがオクトパインを産生した。 2. 形質転換植付物の上部葉中の微生物のアッセイ：本
実施例のパートＢの２で記載したリソパインデヒドロゲ
ナーゼアッセイに用いた葉の抽出物のアリコートを塗抹
してこれらの抽出物中に何らかの微生物が存在するかど
うかを測定した。これらの塗抹の結果として増殖する微
生物コロニーをアクロバクテリウム検出用ラクトーズ含
有培地に転写した。原塗抹の結果として増殖しラクトー
スを酸化してラクトン酸として微生物はなく（ＹＥＢ接
種実生、ＣＡ１９接種実生またはＣＡ１７接種実生の葉
からのいずれの抽出物においても）、微生物中には実生
を接種するのに用いた種類のアグロバクリウムは存在し
ないことが示された。
らの葉の抽出物はいずれもオクトパインを産生せず、一
方ＣＡ−１９接種およびＣＡ−１７接種実生の１２抽出
物のうちの８つがオクトパインを産生した。 2. 形質転換植付物の上部葉中の微生物のアッセイ：本
実施例のパートＢの２で記載したリソパインデヒドロゲ
ナーゼアッセイに用いた葉の抽出物のアリコートを塗抹
してこれらの抽出物中に何らかの微生物が存在するかど
うかを測定した。これらの塗抹の結果として増殖する微
生物コロニーをアクロバクテリウム検出用ラクトーズ含
有培地に転写した。原塗抹の結果として増殖しラクトー
スを酸化してラクトン酸として微生物はなく（ＹＥＢ接
種実生、ＣＡ１９接種実生またはＣＡ１７接種実生の葉
からのいずれの抽出物においても）、微生物中には実生
を接種するのに用いた種類のアグロバクリウムは存在し
ないことが示された。
【００５２】3. Ｆ1 植付物の葉中の酵素活性のアッセ
イ：上記アッセイの結果を用いて、植付物１９−５およ
び１９−３を用いてさらに試験を行った。植付物１９−
５はその最上部の２枚の葉の抽出物が該植付物が房毛
（tassel）まで拡大する形質転換領域を有し得ることを
示すリソパインデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性であ
ったので用いた。植付物１９−３はその“穂の苗条”、
および“刀状葉の下の葉”の抽出物が該植付け物が穂ま
で延びた形質転換領域および房毛まで延びた形質転換領
域を有し得ることを示すリソパインデヒドロゲナーゼ活
性に対して陽性であるので用いた。これら２本の植付物
は自己受粉させた。次いで、受粉２６〜２７日後、植付
物１９−３と １９−５の未成熟穂を採取し表面を滅菌
した。これら植付物からの穂の遅成熟胚を切り取り半強
力カラシゲースリーグ培地に植付けた。胚を光中で８〜
１０日間無菌状態で発芽させ、その時点で土壌に植付け
た。土壌に移植して生長したＦ1 種実の分裂組織由来の
葉を実施例３のパートＢの２に記載したようにして、た
だし、リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてリ
ソパインデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。
オクトパインと共遊走（co-migration）した電気泳動図
上のスポットの染色度を評価した。結果は第１表に示
す。そこで示されるように、実生のいくつかはオクトパ
インを産生し、本特性のＦ1 世代への有性伝播を示し
た。
イ：上記アッセイの結果を用いて、植付物１９−５およ
び１９−３を用いてさらに試験を行った。植付物１９−
５はその最上部の２枚の葉の抽出物が該植付物が房毛
（tassel）まで拡大する形質転換領域を有し得ることを
示すリソパインデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性であ
ったので用いた。植付物１９−３はその“穂の苗条”、
および“刀状葉の下の葉”の抽出物が該植付け物が穂ま
で延びた形質転換領域および房毛まで延びた形質転換領
域を有し得ることを示すリソパインデヒドロゲナーゼ活
性に対して陽性であるので用いた。これら２本の植付物
は自己受粉させた。次いで、受粉２６〜２７日後、植付
物１９−３と １９−５の未成熟穂を採取し表面を滅菌
した。これら植付物からの穂の遅成熟胚を切り取り半強
力カラシゲースリーグ培地に植付けた。胚を光中で８〜
１０日間無菌状態で発芽させ、その時点で土壌に植付け
た。土壌に移植して生長したＦ1 種実の分裂組織由来の
葉を実施例３のパートＢの２に記載したようにして、た
だし、リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてリ
ソパインデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。
オクトパインと共遊走（co-migration）した電気泳動図
上のスポットの染色度を評価した。結果は第１表に示
す。そこで示されるように、実生のいくつかはオクトパ
インを産生し、本特性のＦ1 世代への有性伝播を示し
た。
【００５３】
植付物１９−３から採取した 植付物１９−５から採取した
評 価 胚より生じた植付物の葉 胚より生じた植付物の葉
死 滅 ８５ ９
（試験せず）
陰 性 ７１ ７６
（その後死滅２５） （その後死滅７）
弱陽性 ５ １７
（その後死滅３） （その後死滅０）
陽 性 ３４ ２７
（その後死滅８） （その後死滅３）
強陽性 ３ ３
（その後死滅０） （その後死滅０）
【００５４】実施例１２
Ａ．ツメファシエンス菌株Ｂ６の単コロニーを酵母エキ
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で記載したようにしてインキュベートした。ライムギの
種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１の
ＢとＣで記載したようにして７〜１４日間インキュベー
トした。実生は先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生じ
る急速分裂細胞領域に接種した。７〜１４日インキュベ
ーション期間終了時に、実生を実施例１のパートＤで記
載したようにして酵素活性についてアッセイした。Ｂ６
接種ライムギ実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロ
ゲナーゼ反応培地に加えることによって生じた生成物の
電気泳動の結果は第１０図に示す。この図においては、
レーン１が合成オクトパイン標準物を含み、レーン２−
６は単Ｂ６接種ライムギ実生の無細胞抽出物をリソパイ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュベートすること
によって生じた生成物を含む。第１０図に示された結果
はオクトパイ産生が試験した４つのＢ６接種ライムギ実
生（レーン２、３、４および６）のうちの３つにより生
じていることを示している。これらの結果はライムギ実
生が vir+ Ａ．ツメファシエンス菌株Ｂ６による感染に
よって形質転換されていることを示している。
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
で記載したようにしてインキュベートした。ライムギの
種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１の
ＢとＣで記載したようにして７〜１４日間インキュベー
トした。実生は先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生じ
る急速分裂細胞領域に接種した。７〜１４日インキュベ
ーション期間終了時に、実生を実施例１のパートＤで記
載したようにして酵素活性についてアッセイした。Ｂ６
接種ライムギ実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロ
ゲナーゼ反応培地に加えることによって生じた生成物の
電気泳動の結果は第１０図に示す。この図においては、
レーン１が合成オクトパイン標準物を含み、レーン２−
６は単Ｂ６接種ライムギ実生の無細胞抽出物をリソパイ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュベートすること
によって生じた生成物を含む。第１０図に示された結果
はオクトパイ産生が試験した４つのＢ６接種ライムギ実
生（レーン２、３、４および６）のうちの３つにより生
じていることを示している。これらの結果はライムギ実
生が vir+ Ａ．ツメファシエンス菌株Ｂ６による感染に
よって形質転換されていることを示している。
【００５５】実施例１３
Ａ．ツメファシエンス菌株Ｂ６の単コロニーを酵母エキ
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
に記載したようにしてインキュベートした。オオムギの
種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１の
ＢとＣに記載したようにして７〜１４日間インキュベー
トした。実生は先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生ず
る急速分裂細胞領域で接種した。７〜１４日インキュベ
ーション期間の終了時に、実生を実施例１のパートＤで
記載したようにして酵素活性についてアッセイした。Ｂ
６接種オオムギ実生の無細胞抽出物をリソパインデヒド
ロゲナーゼ反応培地に加えることによって生じた生成物
の電気泳動の結果は第１１図に示す。この図において
は、レーン１が合成オクトパイン標準物を含み、レーン
２〜６は単Ｂ６接種オオムギ実生の無細胞抽出物をリソ
パインデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュベートする
ことによって生じた生成物を含む。第１１図に示す結果
はオクトパイン産生がＢ６接種オオムギ実生の５つの無
細胞抽出物のうちの５つによって生じていることおよび
実生が形質転換されていることを示している。
スブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡ
に記載したようにしてインキュベートした。オオムギの
種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１の
ＢとＣに記載したようにして７〜１４日間インキュベー
トした。実生は先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生ず
る急速分裂細胞領域で接種した。７〜１４日インキュベ
ーション期間の終了時に、実生を実施例１のパートＤで
記載したようにして酵素活性についてアッセイした。Ｂ
６接種オオムギ実生の無細胞抽出物をリソパインデヒド
ロゲナーゼ反応培地に加えることによって生じた生成物
の電気泳動の結果は第１１図に示す。この図において
は、レーン１が合成オクトパイン標準物を含み、レーン
２〜６は単Ｂ６接種オオムギ実生の無細胞抽出物をリソ
パインデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュベートする
ことによって生じた生成物を含む。第１１図に示す結果
はオクトパイン産生がＢ６接種オオムギ実生の５つの無
細胞抽出物のうちの５つによって生じていることおよび
実生が形質転換されていることを示している。
【００５６】実施例１４
Ａ．ツメファシエンス菌株Ｃ５８の単コロニーをＹＥＢ
に接種し、この微生物を実施例２のパートＡに記載した
ようにしてインキュベートした。オ−トムギの種実を滅
菌し、発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢと
Ｃで記載したようにして７〜１４日間インキュベートし
た。実生を先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生じる急
速分裂細胞領域に接種した。７〜１４日間のインキュベ
ート期間終了時に、実生を実施例２のパートＤに記載し
たようにしてアッセイした。結果は第１２図に示す。第
１２図では、レーン１がノパリンデヒドロゲナーゼ反応
培地のみを含み、レーン２はノパリン標準物を含み、レ
ーン３〜１１は１回Ｃ５８接種オートムギ実生の無細胞
抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュ
ベートすることによって生じた生成物を含み、レーン１
２は合成オクトパインを含む。明らかに、１回Ｃ５８接
種オートムギ実生の無細胞抽出物を９つのうちの６つは
ノパリンを産生し実生が形質転換されていることを示し
ている。
に接種し、この微生物を実施例２のパートＡに記載した
ようにしてインキュベートした。オ−トムギの種実を滅
菌し、発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢと
Ｃで記載したようにして７〜１４日間インキュベートし
た。実生を先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生じる急
速分裂細胞領域に接種した。７〜１４日間のインキュベ
ート期間終了時に、実生を実施例２のパートＤに記載し
たようにしてアッセイした。結果は第１２図に示す。第
１２図では、レーン１がノパリンデヒドロゲナーゼ反応
培地のみを含み、レーン２はノパリン標準物を含み、レ
ーン３〜１１は１回Ｃ５８接種オートムギ実生の無細胞
抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュ
ベートすることによって生じた生成物を含み、レーン１
２は合成オクトパインを含む。明らかに、１回Ｃ５８接
種オートムギ実生の無細胞抽出物を９つのうちの６つは
ノパリンを産生し実生が形質転換されていることを示し
ている。
【００５７】実施例１５
Ａ．ツメファシエンス菌株Ｃ５８の単コロニーをＹＥＢ
に接種し、この微生物を実施例２のパートＡに記載した
ようにしてインキュベートした。コムギの種実を滅菌
し、発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣ
に記載したようにして７〜１４日間インキュベートし
た。実生は先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生じる急
速分裂細胞領域に接種した。７〜１４日間のインキュベ
ーション期間終了時に、実生を実施例２のパートＤに記
載したようにしてアッセイした。結果は第１３図に示
す。第１３図において、レーン１はノパリン標準物を含
み、レーン２〜６は１回Ｃ５８接種コムギ実生の無細胞
抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュ
ベートすることによって生じた生成物を含み、レーン７
は合成オクトパインを含み、レーン８は合成オクトパイ
ンとリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地との混合物を
含み、レーン９〜１５は１回Ｃ５８接種コムギ実生の無
細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でイ
ンキュベートすることによって生じた生成物を含む。明
らかに、Ｃ５８接種コムギ実生の５つの無細胞抽出物の
うちの３つがノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地とイン
キュベートさせたときノパリンを産生し、実生が形質転
換されていることを示している。リソパインデヒドロゲ
ナーゼ反応培地でインキュベートした場合にはノパイン
を産生した無細胞抽出物はなかった。
に接種し、この微生物を実施例２のパートＡに記載した
ようにしてインキュベートした。コムギの種実を滅菌
し、発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣ
に記載したようにして７〜１４日間インキュベートし
た。実生は先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生じる急
速分裂細胞領域に接種した。７〜１４日間のインキュベ
ーション期間終了時に、実生を実施例２のパートＤに記
載したようにしてアッセイした。結果は第１３図に示
す。第１３図において、レーン１はノパリン標準物を含
み、レーン２〜６は１回Ｃ５８接種コムギ実生の無細胞
抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュ
ベートすることによって生じた生成物を含み、レーン７
は合成オクトパインを含み、レーン８は合成オクトパイ
ンとリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地との混合物を
含み、レーン９〜１５は１回Ｃ５８接種コムギ実生の無
細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でイ
ンキュベートすることによって生じた生成物を含む。明
らかに、Ｃ５８接種コムギ実生の５つの無細胞抽出物の
うちの３つがノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地とイン
キュベートさせたときノパリンを産生し、実生が形質転
換されていることを示している。リソパインデヒドロゲ
ナーゼ反応培地でインキュベートした場合にはノパイン
を産生した無細胞抽出物はなかった。
【図１】第１図は９６時間令のとうもろこし実生を示
す。第１Ａ図は実生の側面図であり、第１Ｂ図は同じ実
生の前面図である。
す。第１Ａ図は実生の側面図であり、第１Ｂ図は同じ実
生の前面図である。
【図２】第２Ａ図はＡ．テュメファシエンスＢ６株を植
菌した黄色 Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽出液を
リゾピンデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出ができる試薬
を含有する反応培地（リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培
地）を用いてインキュベートすることによって生産した
生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気
泳動グラムの図である。ある種のコントロールも電気泳
動した。第２Ｂ図は黄色 Iochiefとうもろこし実生の無
細胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ酵素活性を検出
することができる試薬を含有する反応培地（ノパリンデ
ヒドロゲナーゼ反応培地）を用いてインキュベートする
ことによって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、
展開したペーパー電気泳動グラムの図である。ある種の
コントロールも電気泳動した。第２Ｃ図は種々の物質中
のピロノパリンの存在又は不存在を示す、展開したペー
パー電気泳動グラムの図である。第２Ｄ図は展開したペ
ーパー電気泳動グラムの図である。電気泳動された物質
はＡ．テュメファシエンスＣ５８を植菌した黄色 Iochi
efとうもろこし実生の無細胞抽出液をノパリンデヒドロ
ゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートすることによ
って生産した生産物をＡ．テュメファシエンスのある菌
株によって異化することによって生産された。ある種の
コントロールも電気泳動した。
菌した黄色 Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽出液を
リゾピンデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出ができる試薬
を含有する反応培地（リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培
地）を用いてインキュベートすることによって生産した
生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気
泳動グラムの図である。ある種のコントロールも電気泳
動した。第２Ｂ図は黄色 Iochiefとうもろこし実生の無
細胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ酵素活性を検出
することができる試薬を含有する反応培地（ノパリンデ
ヒドロゲナーゼ反応培地）を用いてインキュベートする
ことによって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、
展開したペーパー電気泳動グラムの図である。ある種の
コントロールも電気泳動した。第２Ｃ図は種々の物質中
のピロノパリンの存在又は不存在を示す、展開したペー
パー電気泳動グラムの図である。第２Ｄ図は展開したペ
ーパー電気泳動グラムの図である。電気泳動された物質
はＡ．テュメファシエンスＣ５８を植菌した黄色 Iochi
efとうもろこし実生の無細胞抽出液をノパリンデヒドロ
ゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートすることによ
って生産した生産物をＡ．テュメファシエンスのある菌
株によって異化することによって生産された。ある種の
コントロールも電気泳動した。
【図３】第３Ａ図は単一Ｂ６植菌黄色 Iochiefとうもろ
こし実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反
応培地を用いてインキュベートすることによって生産し
た生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電
気泳動グラムの図である。第３Ｂ図はＡ．テュメファシ
エンスＡ３４８株または２３８ＭＸ株を植菌した単一黄
色 Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽出液をリゾピン
デヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートする
ことによって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、
展開したペーパー電気泳動グラムの図である。第３Ｃ図
は単一Ｃ５８植菌黄色 Iochiefとうもろこし実生の無細
胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。第３Ｄ図はＡ．テュメファシエンスＪＫ１９
５株を植菌した単一黄色 Iochiefとうもろこし実生の無
細胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用い
てインキュベートすることによって生産した生産物の電
気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラム
の図である。
こし実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反
応培地を用いてインキュベートすることによって生産し
た生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電
気泳動グラムの図である。第３Ｂ図はＡ．テュメファシ
エンスＡ３４８株または２３８ＭＸ株を植菌した単一黄
色 Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽出液をリゾピン
デヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートする
ことによって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、
展開したペーパー電気泳動グラムの図である。第３Ｃ図
は単一Ｃ５８植菌黄色 Iochiefとうもろこし実生の無細
胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。第３Ｄ図はＡ．テュメファシエンスＪＫ１９
５株を植菌した単一黄色 Iochiefとうもろこし実生の無
細胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用い
てインキュベートすることによって生産した生産物の電
気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラム
の図である。
【図４】第４Ａ図はＡ．テュメファシエンスＢ６及びＣ
５８株の無細胞超音波処理液の電気泳動の結果である、
展開したペーパー電気泳動グラムの図である。第４Ｂ図
はＡ．テュメファシエンスＢ６及びＣ５８株の無細胞超
音波処理液を適当な反応培地を用いてインキュベートす
ることによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。反応
培地単独も電気泳動した。第４Ｃ図はとうもろこしの黄
色 Iochief株の単一未感染実生の無細胞抽出液をリゾピ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地又はノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地を用いて４時間インキュベートすることに
よって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、展開し
たペーパー電気泳動グラムの図である。
５８株の無細胞超音波処理液の電気泳動の結果である、
展開したペーパー電気泳動グラムの図である。第４Ｂ図
はＡ．テュメファシエンスＢ６及びＣ５８株の無細胞超
音波処理液を適当な反応培地を用いてインキュベートす
ることによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。反応
培地単独も電気泳動した。第４Ｃ図はとうもろこしの黄
色 Iochief株の単一未感染実生の無細胞抽出液をリゾピ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地又はノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地を用いて４時間インキュベートすることに
よって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、展開し
たペーパー電気泳動グラムの図である。
【図５】第５Ａ図はＣ５８植菌黄色 Iochiefとうもろこ
し実生から生長した植物からの単一のほう芽期の葉の無
細胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用い
てインキュベートすることによって生産した生産物の電
気泳動の結果である、展開した電気泳動グラムの図であ
る。第５Ｂ図はノパリンデヒドロゲナーゼ活性の検定の
ために切開した部分を示す分裂起源（meriste-matic or
igin）のとうもろこし葉の図である。第５Ｃ図はＣ５８
植菌黄色 Iochiefとうもろこし実生から生長した４つの
植物体からの４つの分裂葉の切開部の無細胞抽出液をノ
パリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベー
トすることによって生産した生産物の電気泳動の結果を
示す、展開した電気泳動グラムの図である。第５Ｄ図は
Ｃ５８植菌黄色 Iochiefとうもろこし実生から生長した
個々の植物体からの花粉の無細胞抽出液をノパリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートすること
によって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、展開
した電気泳動グラムの図である。
し実生から生長した植物からの単一のほう芽期の葉の無
細胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用い
てインキュベートすることによって生産した生産物の電
気泳動の結果である、展開した電気泳動グラムの図であ
る。第５Ｂ図はノパリンデヒドロゲナーゼ活性の検定の
ために切開した部分を示す分裂起源（meriste-matic or
igin）のとうもろこし葉の図である。第５Ｃ図はＣ５８
植菌黄色 Iochiefとうもろこし実生から生長した４つの
植物体からの４つの分裂葉の切開部の無細胞抽出液をノ
パリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベー
トすることによって生産した生産物の電気泳動の結果を
示す、展開した電気泳動グラムの図である。第５Ｄ図は
Ｃ５８植菌黄色 Iochiefとうもろこし実生から生長した
個々の植物体からの花粉の無細胞抽出液をノパリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートすること
によって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、展開
した電気泳動グラムの図である。
【図６】第６図はＡ．テュメファシエンスＣＡ１９株を
植菌した、黄色 Iochiefとうもろこしの単一実生の無細
胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果である、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。
植菌した、黄色 Iochiefとうもろこしの単一実生の無細
胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果である、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。
【図７】第７図はとうもろこしＰＡ９１株の単一Ｃ５８
植菌実生の無細胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反
応培地を用いてインキュベートすることによって生産し
た生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電
気泳動グラムの図である。
植菌実生の無細胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反
応培地を用いてインキュベートすることによって生産し
た生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペーパー電
気泳動グラムの図である。
【図８】第８図はプラスミドｐＣＥＬ３０の制限部位及
び機能地図である。
び機能地図である。
【図９】第９図はプラスミドｐＣＥＬ４４の制限部位及
び機能地図である。
び機能地図である。
【図10】第１０図は単一Ｂ６植菌ライ麦実生の無細胞抽
出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてイン
キュベートすることによって生産した生産物の電気泳動
の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図で
ある。
出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてイン
キュベートすることによって生産した生産物の電気泳動
の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図で
ある。
【図11】第１１図は単一Ｂ６細菌大麦実生の無細胞抽出
液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキ
ュベートすることによって生産した生産物の電気泳動の
結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図であ
る。
液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキ
ュベートすることによって生産した生産物の電気泳動の
結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図であ
る。
【図12】第１２図は単一Ｃ５８細菌オート麦実生の無細
胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。
胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。
【図13】第１３図は単一Ｃ５８細菌小麦実生の無細胞抽
出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地及びリゾピデ
ヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートするこ
とによって生産した生産物の電気泳動の結果である、展
開した電気泳動グラムの図である。
出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地及びリゾピデ
ヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートするこ
とによって生産した生産物の電気泳動の結果である、展
開した電気泳動グラムの図である。
【図14】第１４図はＣＡ１９接種実生からの５本の植付
け物の葉、ＣＡ１７接種実生からの２本の植付け物の葉
およびＹＥＢ接種の３本の植付け物の葉の無細胞抽出液
をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキ
ュベートすることによって生産した生産物の電気泳動の
結果を示す、展開した電気泳動グラムの図である。これ
らすべての図において、「Ｏ」及び「ＯＣＴ」はオクト
ピンを、「Ｎ」又は「ＮＯＰ」はノパリンを表わす。こ
れらの記号は各図において、合成オクトピン又はノパリ
ン標品を含有する電気泳動グラムのレーンに言及するた
め、又電気泳動後の合成オクトピン又はノパリン標品に
よって生じたスポットの位置を示すために用いられてい
る。いくつかの図面においては、合成オクトピン又はノ
パリン標品と共に移動しないスポットがある。これらの
スポットは反応培地中の未反応試薬によって、又とうも
ろこし実生の無細胞抽出液中に見い出される天然に生じ
た物質によって形成される。
け物の葉、ＣＡ１７接種実生からの２本の植付け物の葉
およびＹＥＢ接種の３本の植付け物の葉の無細胞抽出液
をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキ
ュベートすることによって生産した生産物の電気泳動の
結果を示す、展開した電気泳動グラムの図である。これ
らすべての図において、「Ｏ」及び「ＯＣＴ」はオクト
ピンを、「Ｎ」又は「ＮＯＰ」はノパリンを表わす。こ
れらの記号は各図において、合成オクトピン又はノパリ
ン標品を含有する電気泳動グラムのレーンに言及するた
め、又電気泳動後の合成オクトピン又はノパリン標品に
よって生じたスポットの位置を示すために用いられてい
る。いくつかの図面においては、合成オクトピン又はノ
パリン標品と共に移動しないスポットがある。これらの
スポットは反応培地中の未反応試薬によって、又とうも
ろこし実生の無細胞抽出液中に見い出される天然に生じ
た物質によって形成される。
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フロントページの続き
(72)発明者 アン シー エフ グレイヴス
アメリカ合衆国 オハイオ州 43402
ボーリング グリーン クレストヴィュ
ー ドライヴ 627
(56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．319（1986)
ｐ．791−793
高水準種苗関係技術開発委員会編集
「組織培養技術の今後の展開方向」（昭
59年３月）社団法人日本種苗協会 ｐ.
49−89
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，ｐ．43−50
（1986)
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．236，ｐ.
1259−1262（５ Ｊｕｎｅ 1987)
ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏ
ｌ．８，Ｎｏ．６，ｐ．535−542（Ｊｕ
ｎｅ 1990)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．アグロバクテリウムを介して形質転換されたとうも
ろこし植物であって、新たに出現した幼根及び幹を有す
るとうもろこしの実生中に傷をつけ、その傷を急速に分
裂している細胞を含む実生の胚盤瘤の基盤から子葉鞘瘤
のわずかに先までまたがるような領域内に傷を作り、そ
の傷にvir+アグロバクテリウム・テュメファシエンスを
植菌することを含む方法により生産された該とうもろこ
し植物。 ２．遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有するベクタ
ーを含むvir+アグロバクテリウム・チュメファシエンス
に感染した実生から導かれた形質転換されたとうもろこ
し植物体である請求項１に記載のとうもろこし植物。 ３．遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有するベクタ
ーを含むvir+アグロバクテリウム・チュメファシエンス
に感染した実生から生長した植物体によって生産され
た、とうもろこし植物の形質転換された花粉粒である請
求項１に記載のとうもろこし植物。 ４．遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含有するベクタ
ーを含むvir+アグロバクテリウム・チュメファシエンス
に感染した実生から生長した植物体によって生産され
た、とうもろこし植物の形質転換された花粉粒から導か
れたとうもろこし植物である請求項１に記載のとうもろ
こし植物。 ５．アグロバクテリウムがvir+アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンスである請求項１に記載のとうもろこし
植物。 ６．アグロバクテリウムがノパリン−利用株である請求
項５に記載のとうもろこし植物。 ７．分裂組織から誘導された細胞を形質転換することに
より得られた形質転換されたとうもろこし植物体であっ
て、新たに出現した幼根及び幹を有するとうもろこしの
実生中に傷をつけ、その傷を急速に分裂している細胞を
含む実生の胚盤瘤の基盤から子葉鞘瘤のわずかに先まで
またがるような領域内に傷を作り、その傷にvir+アグロ
バクテリウム・テュメファシエンスを植菌して、分裂組
織から誘導された細胞を形質転換することを含む方法に
より生産された該とうもろこし植物体である請求項１に
記載のとうもろこし植物。 ８．生殖系列細胞のもととなる細胞を形質転換すること
により得られた形質転換されたとうもろこし植物体であ
って、新たに出現した幼根及び幹を有するとうもろこし
の実生中に傷をつけ、その傷を急速に分裂している細胞
を含む実生の胚盤瘤の基盤から子葉鞘瘤のわずかに先ま
でまたがるような領域内に傷を作り、その傷にvir+アグ
ロバクテリウム・テュメファシエンスを植菌して、生殖
系列細胞のもととなる細胞を形質転換することを含む方
法により生産された該とうもろこし植物体である請求項
１に記載のとうもろこし植物。 ９．急速分裂性の、比較的に未分化な細胞を形質転換す
ることにより得られた形質転換されたとうもろこし植物
体であって、新たに出現した幼根及び幹を有するとうも
ろこしの実生中に傷をつけ、その傷を急速に分裂してい
る細胞を含む実生の胚盤瘤の基盤から子葉鞘瘤のわずか
に先までまたがるような領域内に傷を作り、その傷にvi
r+アグロバクテリウム・テュメファシエンスを植菌し
て、急速分裂性の、比較的に未分化な細胞を形質転換す
ることを含む方法により生産された該とうもろこし植物
体である請求項１に記載のとうもろこし植物。 １０．異種構造遺伝子及び転写単位を作動できる順序で
含む遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮＡを含む形質転換さ
れたとうもろこし植物体であって、新たに出現した幼根
及び幹を有するとうもろこしの実生中に傷をつけ、その
傷を急速に分裂している細胞を含む実生の胚盤瘤の基盤
から子葉鞘瘤のわずかに先までまたがるような領域内に
傷を作り、その傷に、更に異種構造遺伝子及び転写単位
を作動できる順序で含む遺伝学的に設計されたＴ−ＤＮ
Ａを含むvir+アグロバクテリウム・テュメファシエンス
を植菌することを含む方法により生産された該とうもろ
こし植物体である請求項１に記載のとうもろこし植物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US88027186A | 1986-06-30 | 1986-06-30 | |
| US880271 | 1986-06-30 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62163867A Division JP2693443B2 (ja) | 1986-06-30 | 1987-06-30 | ホモノ科植物を形質転換する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1052186A JPH1052186A (ja) | 1998-02-24 |
| JP3234534B2 true JP3234534B2 (ja) | 2001-12-04 |
Family
ID=25375913
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62163867A Expired - Lifetime JP2693443B2 (ja) | 1986-06-30 | 1987-06-30 | ホモノ科植物を形質転換する方法 |
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- 1987-06-30 JP JP62163867A patent/JP2693443B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
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| ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．６，ｐ．５３５−５４２（Ｊｕｎｅ １９９０） |
| Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１９（１９８６）ｐ．７９１−７９３ |
| Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，ｐ．４３−５０（１９８６） |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３６，ｐ．１２５９−１２６２（５ Ｊｕｎｅ １９８７） |
| 高水準種苗関係技術開発委員会編集「組織培養技術の今後の展開方向」（昭５９年３月）社団法人日本種苗協会 ｐ．４９−８９ |
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