JPH05501807A - エンドキチナーゼ活性を有するタンパクをコード化する組み換え遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はエンドキチナーゼ活性を有する新規なタンパクまたはそれの前駆体をコ ードする新規な組み換え遺伝子、この組み換え遺伝子を含有する細菌、この型の 組み換え遺伝子を含有する植物細胞、植物または植物の部分とりわけ植物の種子 、この遺伝子の形質転換の段階を含む、植物に病源性作因例えば菌類、細菌類、 節足動物とりわけ昆虫および線虫に対する抵抗性を賦与する方法、この新規なタ ンパクおよびこのタンパクの調製方法に関する。

作物用植物が病源性作因例えば菌類および細菌類の攻撃を受けると、実質的に収 穫の低下の原因となる。今のところ、これらの作因を制御する主な手段と、殺菌 または殺細菌活性を有する化学物質の使用にある。現在では、植物はこのような 攻撃に対して、自然に種々防御機構により反応するが、不幸にも、一般的に反応 が始まるのが遅すぎ、反応強度が低すぎて十分な効果が得られないということが 知られている。これらの機構の１つには、キチナーゼＥＣ３，２゜１、１４（Ａ 、　ｌ−ッパンら、アゾロノミ−２巻８２９−８３４頁（１９８２年）として知 られる酵素の誘導がある。この誘導はエチレンのような物質で人工的に刺激する とかでき、その結果、処理植物の病源性作因に対する抵抗性が増強される（ポー ラ−Ｔ５、オックスフォード・サーベイズ・オブ・プラント・モレキュラー・ア ンド・セル・バイオロジー５巻１４５−１７４頁（１９８８年））。

キチンはβ（１→４）結合を介して結合するＮ−アセチルグルコサミンから成る 直鎖多糖重合体である。これはたいていの病源性菌類の細胞壁、節足動物とりわ け昆虫の外骨格、並びに卵および線虫の包嚢の外側のさやに存在する構造化合物 である。キチナーゼとして知られている酵素は、キチンを減成する能力がある。

これらの中で２種の群が識別され、キチンの攻撃方法により定義される鎖の非還 元末端に位置するＮ−アセチルグルコサミン単位を遊離させる能力があるエクソ キチナーゼおよび鎖を断片化する能力があるエンドキチナーゼである。これらは イン・ビトロでマイセリアル・ハイファ工を阻害する能力がある唯一のキチナー ゼである（ロバーツＷ、Ｋ。

ら、ジェネチック、マイクロビオロジー、１３４巻１６９−１７６頁（１９８８ 年））。既知の植物性キチナーゼの大部分はエンド型であり、これに対して既知 の細菌性キチナーゼはエクソ型である（ロバーツＷＫ、ら、ゲン、マイクロビオ ール、１３４巻１６９−１７６頁（１９８８年））。

多数の植物性エンドキチナーゼ、とりわけトマトおよびタバコのエンドキチナー ゼ（Ｐ、アラディーら、フイトケム２９巻４号１１４３−１１５９頁（１９９０ 年））は、細菌壁のペプチドグリカンのＮ−アセチルグルコサミンおよびＮ−ア セチルムラミン酸の間のβ−（１→４）結合を開裂できるライソザイム活性をも 呈する。従って、ライソザイムおよびエンドキチナーゼ活性はかなり近接して関 連しており（ロバーツＷ、に、ら、ゲン、マイクロビオール、１３４巻１６９− １７６頁（１９８８年））、エンドキチナーゼ活性を有する新規なタンパク、と りわけトマトエンドキチナーゼおよびタバコエンドキチナーゼの間の中間的な構 造のものが、恐らくライソザイム活性を呈することが認められる。

細菌性エンドキチナーゼをコードするＤＮＡ配列がすでに単離されクローン化さ れている（ジョーンズＪ、Ｄ、Ｇら、ＥＭＢＯ・ジャーナル、５巻４６７−４７ ３頁（１９８６年）およびサンドハイムＬ。

ら、フィシオールモレツク、プラント・バソール、３３巻４８３−４９１頁（１ ９８８年））。米国特許第４７５１０８１号には、セラチア・マルセッセンス・ キチナーゼをコードする完全遺伝子の単離およびクローニング、プソイドモナス ・フルオレッセンス・ＮＺＩ３０の形質転換およびこの遺伝子を有するブセウド モナス・プチダ・ＭＫ２８０細菌が記載されている。これらの形質転換細菌は、 細菌培養培地に分散されたコロイド状キチンをわずかに減成する能力がある。ハ ープスターＭ、Ｈ，ら、ヌクル、アク、レス、１７巻５３９５頁（１９８９年） の業績では、この遺伝子はエクソキチナーゼをコードすることが示されており、 それにより、観察された減成の効率が低いことが説明される（この文献の表２の １３および１４欄参照）。

ジョーンズＪ、Ｄ、Ｇ、ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティッ クス２１２巻５３６−５４２頁（１９８８年）の開示では、種々植物性プロモー ターの制御下にあるセラチア・マルセツセンス・エクソキチナーゼのコード化部 分を含むキメラ遺伝子を含有する。

アグロバクテリウム・トゥメファシエンスでのタバコ植物の形質転換について記 載されている。この文献では、このエクソキチナーゼの発現により賦与される病 原性に対する抵抗性増強の可能性についての情報は得られない。

同じ植物性エンドキチナーゼをコードするゲノムＤＮＡおよび／または相補的Ｄ ＮＡ配列は、さらに、単離されクローン化されている（プログリ−に、　Ｅ、プ ロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ジ ・ユナイテッド・ステープ・オブ・アメリカ８３巻６８２０−６８２４頁（１９ ８６年）、およびヘトリックＳ、Ａ１、プラトン・フィジオロジー８６巻１８２ −１８６頁（１９８８年））。

国際出願ＷＯ第９０１０７００１号では、強力なプロモーターの制御下の豆ファ セオルズ・ブルガリスのエンドキチナーゼの相補的ＤＮＡ（ｃ−ＤＮＡ）を担持 するプラスミドの構築、アグロバクテリウム・トウメファシエンスの助けをかり た変換、形質転換したタバコの再生、再生植物の菌類リゾクトニア・ソラニおよ びボトリチス・シネレアに対する抵抗性増強を示す試験、豆キチナーゼを発現す る遺伝子転換したトマト植物のオブテンション（ｏｂｔｅｎｔｉｏｎ）、並びに この遺伝子による、キチナーゼ活性および非形質転換アブラナ植物に関してリゾ クトニア・ソラニに対する抵抗性の増強を有するアブラナ遺伝子転換植物のオブ テンションが開示されている。

従って、本発明は、エンドキチナーゼ活性を有するタンパクまたはその前駆体を コードすることを特徴とする新規な組み換え遺伝子であって、以下の配列（１） を含むものに関する：（配列認識番号：１）ＧＬｙ　ＧＬｙ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　 ＧＬｙ　Ｓｅｒ　ＶａＬ　ＩＬｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　 Ａｓｐ　ＧＬｎ　Ｍｅｔ@Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ＧＬｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　ＧＬｎ　 ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ@Ｔｙｒ Ａｓｎ　ＡＬａρｈｅ　ＩＬｅ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　ＡＬａ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐ ｈｅ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｐｈｅ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　fＬｙ Ａｓｐ　ＩＬｅ　Ａｓｎ　ＡＬａ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＧＬｕ　ＩＬｅ　 ＡＬａ　ＡＬａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　ＡＬａ　ＧＬｎ　Ｔｈｒ@５ｅｒ Ｈａｓ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＧＬｙ　ＧＬｙ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　 ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＧＬｙ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　ＡＬａ@Ｔｒｐ ＧＬｙ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＧＬｕ　Ａｒｇ　ＧＬｙ　 Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ@Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＧＬｎ　Ｔｒｇ　Ｐ「ｏ　Ｃｙｓ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　 Ａｒｑ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＧＬｙ　Ａｒｑ　ＧＬｙ@Ｐｒ。

ＩＬｅ　ＧＬｎ　ＩＬｅ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　 ＧＬｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　ＡＬａ　ＩＬｅ@ＧＬｙ ＶａＬ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　 ＶａＬ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　ＩＬｅ@５ｅｒ Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　ＩＬｅ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｍｌ！ｔ 　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＧＬｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒ潤@５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｈｊｓ　Ａｓｐ　ＶａＬ　ＩＬｅ　ＩＬｅ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　 Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＡＬａ　ＧＬｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ@５ｅｒ ＡＬａ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｐｈｅ　ＧＬｙ　ＶａＬ　 ＩＬｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＩＬｅ　ＩＬｅ　Ａｓｎ　ＧＬｙ@ＧＬｙ Ｌｅｕ　ＧＬｕ　Ｃｙｓ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　ＧＬｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　 Ａｒｇ　ＶａＬ　ＧＬｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　ＩＬｅ　ＧＬｙ@Ｐｈｅ Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＧＬｙ　ＩＬｅ　Ｌｅｕ　ＧＬｙ　 ＶａＬ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ@Ａｓ０ Ｃｙｓ　ＧＬｙ　Ａｓｎ　ＧＬｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　ＧＬｙ　Ａｓｎ　 ＧＬｙ　しｅｕ　Ｌｅｕ　ＶａＬ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔこの組み換え遺伝子 は、配列（１）のすぐ上流に、タンパクの成熟中に開裂するように設計された以 下の配列（２）（配列認識番号＝２）ＧＬｎ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　ＧＬｙ　Ｓｅｒ 　ＧＬｎ　ＧＬｙ　ＧＬｙ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　Ｃｙｓ　ＡＬａ　Ｓｅｒ 　ＧＬｙ　ＧＬｎ@Ｃｙｓ Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　ＧＬｙ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　ＧＬｙ　Ａｓｎ　 Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　ＧＬｙ　Ｓｅｒ@ＧＬｙ Ａｓｎ　Ｃｙｓ　ＧＬｎ　Ｓｅｒ　ＧＬｎ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　ＧＬｙ　 ＧＬｙ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ’Ｐｒｏ　ＶａＬ@Ｔｈｒ または配列（２）と実質的な程度で相同性を呈する配列を含むタンパクをコード するのが好ましい。

この組み換え遺伝子は、配列（１）の上流で、好ましくは開裂するように設計さ れた配列により配列（１）から分断されて、シグナルペプチドをコードする配列 を含む配列を有するタンパクをコードするのが好ましい。この型の遺伝子の、と りわけ優れた遺伝子は、配列（２）の、または配列（２）と実質的な程度に相同 性を呈する配列のすぐ上流に、以下の配列（３）（配列認識番号＝３）：Ｍｅｔ 　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ 　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ@ＶａＬ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＡＬａ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　ＡＬａまたは配列（３）と 実質的な程度で相同性を呈する配列を含む配列を有するタンパクをコードするも のである。

本発明はエンドキチナーゼ活性を有するタンパク、またはそれの前駆体をコード する組み換え遺伝子であって、配列（１）と実質的な程度で相同性を呈する配列 を含むものに関する。この組み換え遺伝子のコード化部分は、トマトエンドキチ ナーゼのゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡの５′部分を少なくとも１個、および タバコエンドキチナーゼのゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡの３′部分を少なく とも１個含む。組み換え遺伝子のコード化部分は少なくとも１個のイントロンを 有するのが好ましい。実際に、遺伝子のコード化部分中のイントロンの存在は、 後者の発現を増加させる（例えばＪ、カシメら、ジーンズ・アンド・テベロプメ ント１巻１１８３−１２００頁（１９８７年）の業績を参照されたい。）。

このような組み換え遺伝子の例を挙げると、コード化部分が以下の配列（配列認 識番号：４）である組み換え遺伝子である：ＡＴＣｉＡＧＣＣＧＡＡ　ＣＴＴＣ ＴＡＡＡＴＴ　０ＡＣＴＡＣＴＴＴ’ｌ’　ＴＣＴ’ｒＴＣＣＴ（：Ｔ　Ｔτ丁 ＣＴ（τＣＣＴＴＴＴＧＣＴ（ｉＡｃＴ　ＯＣＴにＣＣＴＴＧＧ　ＣＡＣＡＧＡ Ａ’！’Ｔｏ　ＴＣｉＧＴＴ（ＡＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＡＡＡ（ｉＴＴＴＯ Ｔｃｉｃ　ＧＴＣＣＧＣＡＣＡＡ　τ０ＴＴＣｉＣＡＧＣＡ　ＡＡＴＴＣＣｉＧ （ｉＴＣｉ　ＣＴＣｉＣＧＣｉＴＡＡＣＡＣＴＡＡＴＧＡＣＣＡＴＴＯＴＯＩ： ｉＴτＣＴＣＧＣＡＡＴＴＯＴ　ＣＡＡＡＧＴ（ＡＣＴ　ＣＴＣＣＡＣ（、ＴＧ ＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＴ　ＣＣＴＣＧＴＣＣτＧ　ＴＴＡＣＴＧＣＴＣ；ＯＧＧ ＡＣＣＴＣＧＧＡ　ＡＣＣＧＴＣＡＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＡＴ　（ｉＴＴＴｃ ｉＡＴｃＡＡ　ＡＴＧＣＴＴＡＡＯＣＡＴＣＣ１ＴＡＡＣＣＡ　ＡＡＡＴＴＣＴ ＴＧ丁ＣＡＡＧＧＡＡＡ（？ｉＡ　ＡＴＡＡＴττＣＴＡ　ＣＡＣττＡＣＡＡ Ｔ　ＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡ　ＣＴＧＣＴＣＣＴＡＣｉＧτＣＴＴＴＴＣＣＴ　Ｇ ＣＣτττ（ｉ（：ｉＴＡ　ＣＡ入ｃ’ｒａｃＴｃＡ　Ｔ人ＴＣＡＡＴＣＣＣＣ ＧＴＡＡＡＡＣｉＧＣＡＡＡＴＴＣｉＣＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣ ＣＴＣＣＣＡＴＣＡＡＡＣＴＡＣＴにＧＴＡＴＣＴにＴＡＣＴＡＡＴＴＣ；ＡＴ 　ＴＡＴＡＴＡＴＣＴＡ　ＧＣ；ＡＣ，ＣＡＴ（、Ｃ，ＣＣＴＴＣＣＣＣＡＣＣ ＴＣｉＡＴＧＧＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＴＣｉＧＧ　ＣＴＴＡＣＴＧＴＴＴ　ＣＣ Ｔ丁ＡＣ；ＡＯＡＡ　ＣＱ；ＡＣＣｉＴＡＡＣＣＣＣ０ＣＴ’０ＡＣＴＡＣＴＣ ＴＴＣＡＣＣＡ　ＡＣ丁＾ＧＴＣＡＡＴ　（ｉＧｃｃＴＴｃｉτＣＣＡＣＣ’ｒ ＯＧＡＡＧ（ｉ　ＡＡＡτ入ＴＴＴＣＧＧＡＣにＡＧＧＣＣＣＡＡτＣＣＡＡＡ ＴＴ　ＴＣＡＣＭ；ＴＡＡＣｉ　ＣＴＡＣＡＴＡＡＡＴ　ＣＴＡＴＡＴＡＴＣＧ ＴＡＡＡＡＴτＴＧＡ　ＴＧＡＡＣＴＴＯＴＡ　ＧＴＣＴＣＴＡＡτ丁　ＡＣに ＴＣｉＴＡＴＴＴ　τにＡＣＡＴＴＴＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＴ ＡＴＧ　Ｃ１ＧＣＣＡＴＧＴＧＧ　ＡＡＧＡＣｉＣＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＣｉＡ ＣＣＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡ　ＴＣＣＴＣｉＡＴＴτ＾　ＧＴＡ（ｉｃｃＡｃＡｃ ｉ　ＡＣＣＣＡＧＴ（ＡＴ　ＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧＡＣＴＣｉＣＴＡＴＣＴ　Ｃ １ＧＴＴＣＴＣＣｉＡＴ　ＧＡＣＣＣＣＴＣＡＡ　ＴＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣττ ＣτＴＧＣＣＡＣＧＡＴＣ；ＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣｉＡＡ（ｉＡＴ　ＧＧＡＡＣ ＣＣＡＴＣＴ（、ＣＣＧＣｉτＧＡＧ　ＣＣ１ＡＴＣＡＣｉＣＣＡＡＴＣＣＴＣ ＴＴＣＣＴＯにＡＴＴＴＣｉＧＴ　ＧＴＣＡＴＣＡＣＡＡ　ＡＣＡＴＣＡＴＣＡ Ａ　ＴＧＧＣｉＣＣｉＣＣＴＣ（ｉＡＡＴＧＴｃＧＴｃ　ＧＴＣＧＣＡＡＴＧＡ 　ＣＡＡＴＡＧＧＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＣ，ＧＡ　ＴＴＧＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧ ＣＡＧ（ｉＴＡＴ　ＴＯＣＣＧＴＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＴＴＡＧ　ＴＣＣＴＣｉ ＣＴＣＡＣＡＡＴＣＴＴＣ；ＡＴＴＧＣＧＧＡＡＡＣＣＡ　ＣＡＧＡＴＣＴＴＴ Ｔ　ＣＧＡＡＡＣＣＣｉＡＣＴＴτＴＡにＴＣＣＡ　ＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＧＡ このコード化配列は、カウリフラワー・モザイク・ウィルスの３５８プロモータ ー（オデルＪ、Ｔ、ら、ネーチャー３１３巻８１〇−８４２頁（１９８５年）参 照）のような強力なウィルス性プロモーターを含有するプロモーター配列により 先行され、次にアグロバクテリウム・トウメファシエンスのツバリン・シンター ゼ（ｓｙｎｔｈｅｓｅ）　・ターミネータ−（ベバンＭ、ら、ヌクル、アク、レ ス、１１巻３６９頁（１９８３年））を含有する終止配列が続くのが好ましい。

本発明はまた、上記に定義された組み換え遺伝子をそれの復製を許容するタクレ オチド環境または状況で含有は、従ってこの遺伝子のクローニングに用いること ができる細菌、例えばエシェリキア・コリ種の細菌並びに遺伝物質を転換するこ とにより植物に感染する能力がある細菌例えばアグロバクテリウム・リゾジェネ スおよびアグロバクテリウム・トゥメファシエンスの種の１種であって、この遺 伝子をそれの複製を許容する状況中に含有し、従って植物細胞の形質転換に用い ることができる細菌に関する。上記遺伝子による植物細胞の形質転換は、その他 の生物学的な方法、例えばポーレン・チューブ法（ゾングークサン・ルオら、プ ラント・モレツク、ビオール、レブ、６巻１６５−１７６頁（１９８８年）およ び発芽種子の直接的な形質転換（トエファーＲ９ら、ザ・プラント・セル。１巻 １３３−１３９頁（１９８９年））により、または物理学的方法例えばポリエチ レングリコールの使用、電気穿孔法（チストウＰ、ら、プロシーディング・オブ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・シ・ユナイテッド・ステ ーブ・オブ・アメリカ８４巻３６６２−３６９９頁（１９８７年））およびマイ クロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）を用いた衝撃（フ レインＴ、　Ｍ、らプロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ８５巻８５０ ２−８５０５頁（１９８８年））により行うこともできる。

本発明はまた、植物細胞が、上記で定義した組み換え遺伝子をその発現を許容す る状況で挿入することにより形質転換されることを特徴とする、植物細胞に関す る。この植物細胞は、例えばとうもろこし、大豆、ビート、小麦、大麦、けし、 西洋アブラナ、ヒマワリ、アルファルファおよびモロコシなどの主要な作物種、 またはバラ、カーネーションおよびガーベラのような花の種、またはニンジン、 トマト、レタス、チコリ、トウガラシ、メロンおよびキャベツのような食用種に 由来することができる。とりわけ検討された種はブラシカ・ナブス・西洋アブラ ナ、へりアンサス・アタス・ヒマワリおよびニコチアナ・タバクム・タバコであ る。

１または２−３個の細胞を用いた形質転換段階の次は形質転換した細胞をカルス が得られるように増殖する段階であり、これは器官形成または胚形成の方法によ り形質転換植物体を発生させ得る。これらの形質転換植物の子孫の一部は、組み 換え遺伝子を含有し発現する。

従って本発明はまた、上記で定義した遺伝子をその発現が許容できる状況で含有 することを特徴とする植物または植物部分に関する。

特に検討された植物部分は種子：穀粒またはとりわけ播種すなわち地面に埋めた 後、完全な新規な植物を形成する能力のあるその他の植物部分である。これらの 植物は上記の種の任意の１種がよい。さらに具体的にはニコチアナ・タバクム、 へりアンサス・アタスおよびブラシカ・ナブスの種である 本発明はまた、菌類、細菌類、節足動物とりわけ昆虫、および線虫のような病源 性作因に対して抵抗する植物を得る方法であって、植物細胞を本明細書上記に定 義した組み換え遺伝子により形質転換する段階、続いて形質転換細胞の増殖段階 および植物の再生段階を含むことを特徴とする方法にも関する。

植物細胞の形質転換の段階は、イン・ビトロで、上記で定義した組み換え遺伝子 を組み入れたアグロバクテリウム（すなわち、アグロバクテリウム属の細菌）を 用いて行なうのが好ましい。

本発明はまた、病源性作因に抵抗し、上記で定義した方法を用いて得られる植物 に関する。

本発明はまた、先の段落で定義した植物の部門に入る植物、または上記に定義し た組み換え遺伝子をそれの発現を許容できる状況で含有する植物を、新規な植物 変種を創るための選別プログラムにおいて親として使用することに関する。

本発明はまた、配列（１）を含むエンドキチナーゼ活性を有する新規タンパク、 並びに組み換え遺伝子により形質転換された植物細胞またはカルスの培養、これ らの細胞またはカルスの溶解、および組み換えタンパクの単離および精製を含む 、それの獲得方法にも関する。このタンパクは、例えば糸状菌病の症状の処置を 目的とした新規な医薬の活性成分として興味深い。

本発明は以下の実施例により、よりよく理解されるであろう：以下に集めた技術 の大部分は、当業者に周知であり、詳細はマニアチスらの業績に報告されている ：「モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル」コールド・ スプリング・ハーバ−・プレス・パブリケージョンズ、ニューヨークにより出版 （第２版）（１９８９年）。

以下の実施例に用いた生物学的な素材（株、ファージ、プラスミドまたは植物） は市販により入手可能であり、各々以下の文献に報告されているニ ーファージ・ラムダ・シャロン４Ａ：マニアティスら、前掲書中−シャトル・ベ クターｐＢＩＮ１９：ベバンら、ヌクル、アク、レス。

１２巻８７１１−８７２１頁（１ ９８４年）。

一プラスミドｐＢ１１２１　：ジェファーソンＲ，Ａ、ら、イーエム、ビー、オ ージエイ ６巻３９０１頁（１９８７年） −エシエリキア・コリ株ＨＢ１０６１：マニアティスら、前掲書中−アグロバク テリウム・トウメファシエンス株ＬＢＡ４４０４：ホエケマら、ネーチャー３０ ３巻１７９−１８０頁（１９８ ３年）ニ ーニコチアナ・タバクム植物変種つィスコンシン・ハバナ３８：シュナイダーＭ 、プラント・モ レク、ビオール、１４巻９３５ 一９４７頁（１９９０年）： −ンヤララ・エレガンス菌類　：ラウリングスＲ，Ｅ、、アン２モーポツト。グ ドン、２７巻５ ６１−５９８頁（１９４０年） 一二コチアナ・タバクム植物変種パラグアイ４９、タバコ・インスティチュート 、 ベルゲラツク、フランスより 入手。

−アルテルナリア・ブラシカニ菌類：ベインズおよびテヮリ、フィシオール、モ ル、プラント、パソ ール、３０巻２５９頁（１９８ ７年） 一ヘリアンサス・アヌス植物　ニルステイカ種子のユーロフローラ変種 一スビナビス・アルバ　：ベインおよびテワリ、上記に引用した参照文献 次の略語を以下の実施例において使用する：アルファ３２−ｄＣＴＰ・デオキシ シチジン５′−［アルファ３！ｐ］三リン酸、参照番号１０２０５としてアメル シャムにより市販； ０．２ＸＳＳＣ：３０ｍＭ　ＮａＣ１，３ｍＭクエン酸三ナトリウムｐＨ７，０ （マニアティスらにより前掲書中報告された）； ＳＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム； ＦＰＬＣ：高速タンパク液体クロマトグラフィー；ＰＶＤＦ　：ポリビニリデン ・ジフルオライドこの明細書は添付の図面１−６により、さらによく理解できる であろう。

一部１は、３．５キロベースのプラスミドｐＣ８３，５に挿入された、トマトエ ンドキチナーゼの、ゲノムＤＮＡ断片の制限地図を表す。

一部２は、３．５キロベースの、プラスミドｐＣＨ３，５に挿入されたトマトの エンドキチナーゼのゲノムＤＮＡ配列、および誘導されたペプチド配列を表す。

一部３は、イントロンを欠（トマト・エンドキチナーゼ・ゲノムＤＮＡ（下段） およびタバコ・エンドキチナーゼ相補的ＤＮＡ（上段）の最高の相同性に基づい て線列を表す。

−図４は、ＢａｍＨＩおよび５ａｃＩ部位によりフランキングされたキメラ遺伝 子のコード化配列、および推定されるアミノ酸配列を表す。

一部５は、完全なキメラ遺伝子の配列を表す。

−図６は、成熟組み換えエンドキチナーゼの配列を表す。

実施例１：エンドキチナーゼのトマト・タバコ組み換え遺伝子を含有するシャト ルベクターｐＢＲ１の構築１）組み換え遺伝子のコード化配列の調製ａ）トマト エンドキチナーゼｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）からの組み換え遺伝子のコード化配 列の５′部分の調製ニドマドエンドキチナーゼｇＤＮＡを含有するクローンは以 下の方法で得られた（Ｍ　デユラントータルディツーパリ・サブ大学のドクトラ ル・セシス、スペシャル・フィールド：プラント・モレキュラー・バイオロジー （１９８６年）参照）ニドマドゲノムＤＮＡライブラリーは、リコペルシコン・ エスキュレンタム・トマトゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼでの部 分消化により生じたクローニング断片により、ファージ・ラムダ・シャロン４人 中に構築した。ゲノムライブラリーが増幅されたとき、ファージＤＮＡを豆エン ドキチナーゼをコードするｃＤＮＡプローブ（プログリら、プナス８３巻６８２ ０−６８２４頁（１９８６年））を用いて、当業者に周知の技術によりニトロセ ルロース上に移した後に、６．６Ｘ１０’個のクローンをふるい分けした（マニ アテイスら、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル、コ ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８４年））。

クローン１０．２と称する、このプローブで雑種形成したクローンは、トマトエ ンドキチナーゼ遺伝子の一部を含有する、３．５キロベースのトマトゲノムＤＮ Ａ断片を含有する。この断片を次にプラスミドｐＥＭＢ　Ｌ　８　（アンテら、 ヌクル、アク、レス、１１巻１６４５−１６５５頁（１９８３年））に、Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄｕ部位の間で挿入した。得られたプラスミドはｐＣＨ３，５ と称し、エシェリキア・コリ中にクローン化した。このプラスミドを次にアルカ リ性溶解法（マニアティスらのビルンボイムおよびドリー、前掲書中）により抽 出および精製した。

いくつかの制限エンドヌクレアーゼを用いることにより、プラスミドｐＣＨ３， ５に挿入された約３，５キロベースのゲノムＤＮＡ断片の制限地図が確立でき、 図１に示す。

種々のＥｃｏＲｌ−ＨｌｎｃＩＩ、）（ｉｎｃＩＩ−ＰｖｕＩＩ、ＰｖｕＩＩ− ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＶ−Ｈｉｎｄｍ断片は、対応するエンドヌクレアーゼ で消化して調製し、アガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出により単離 した（マニアティスら、前掲書中）。これらの断片の各々を、適合する制限部位 の間で１本鎖ファージＭ１３ｍｐ１９（ファルマシア）の複製型のＤＮＡにクロ ーン化した。これらの断片を次に、ジデオキシリボヌクレオチド法（サンガーら 、ＰＮＡＳ−米国１４巻５４６３−５４６７頁（１９７７年））に準じて配列決 定した。

上記の実験から推定される配列（配列認識番号：５）は図２に示すが、：ｔＬｌ ｔｐＥＭＢ　Ｌ　８へのクローニングに用いられた制限部位、および構築の次段 階のための重要な制限部位をも示す。翻訳されたアミノ酸配列も、この図のコー ド化配列の下の線上に示し、イントロンは線形（ＺＺＺＺ２ア）をつける。

この配列は１９４０ヌクレオチドのプロモータ一部分を有し、続いて３０２アミ ノ酸をコードするコード化部分があり。ここでは２個のイントロンが挿入されて いる。このコード化部分は３゛領域で不完全である（停止コドンではない）。

５ｔｙＩ（２００６の位置）およびＨｉｎｄＩ［Ｉ（３００７の位置）制限部位 を用いることにより、１００１塩基対断片が得られた：これは低融点アガロース ゲル上の電気泳動により精製された。以下の配列を有する。断片を１と称する７ １塩基対オリゴヌクレオチドの化学合成により、ｓｔｙ工部位の上流を除去した ５゛部分が再形成でき、ＢａｍＨＩ制限部位が開始ＡＴＧコドンの翻訳の上流に 挿入できるようになる。１０７１塩基対ＢａｍＨｌ−Ｈ１ｎｄＩｎ断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて対応する部位でベクターｐＵｃ１９（ファルマシア）に サブクローン化した。得られたプラスミドはｐｃＨｌと称する。

断片１の配列：（配列認識番号：６） ＣＴＧＣ ｂ）３′部分欠損キメラ遺伝子のコード化配列の調製適当なソフトウェア（ライ スコンシン大学ソフトウェアＵＷＧＣＧ：デベロイックスら、ヌクル、アク、レ ス、１２巻８７１１−８７２１頁（１９８４年）−オプションＧＡＰ：ニードル マンおよびランシュの方法、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー４ ８巻４４３−４５３頁（１９７０年）に準じた配列の至適線列）を用いた、３′ 部分で不完全なりローンｐＣＨ３，５のコード化部分および３２９アミノ酸を含 むタバコエンドキチナーゼｃＤＮＡの公表された配列との比較（ヒデアキ・シン シら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ オブ・ジ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ８４巻８９−９３頁（１９ ８７年）およびプラント・モル・ビオール、１４巻３５７−３６８頁（１９９０ 年））により、配列間、とりわけ後者の３′部分における実質的な相同性が示さ れる（図３参照。これは、これらの２配列、下段上に位置するイントロンを欠く トマトエンドキチナーゼｇＤＮＡの配列の最高の相同性に基づくこのソフトウェ アで実施した線列を示す）。

アプライド・バイオシステムダ４６００ＤＮＡ合成機で合成したオリゴヌクレオ チドを集めて断片を得、これを断片２と称し、この配列は、７１ヌクレオチド関 してＤｒａＩＩ部位の下流に位置するトマトエンドキチナーゼｇＤＮＡ配列を、 および９２ヌクレオチドに関してタバコエンドキチナーゼｃＤＮＡの決定した配 列の３°部位に非常に類似した配列を再生し、それに２番めの停止コドンおよび ５ａｃＩ制限部位の配列を加えた。この配列は以下に示す：タバコエンドキチナ ーゼｃＤＮＡ配列の３゛部分に非常に類似した配列は下線を付し、５ａｃＩ部位 を示す（配列認識番号ニア）プラスミドｐｃＨ１を、制限酵素ＢａｍＨＩおよび ＤｒａＩ［で部分的加水分解に供し、断片３と称す９９９塩基対断片は、５′末 端でＢａｍＨＩ部位および３′末端でＤｒａＩＩ部位（２）から成る末端を有し く図２参照）、アガロースゲル電気泳動後単離および精製した；断片２および３ はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＢａｍＨＩおよび５ａｃＩ制限部位で開いたプ ラスミドｐＵｃ１９に連結した。得られたプラスミドはｐｃＨｌ、２゜と称する 。このプラスミドのＢａｍＨＩ−３ａｃＩ部分が期待される配列を含有すること が、配列決定により確認された。

後者および誘導されるアミノ酸配列を図４に示す。この配列はＢａｍＨＩおよび ５ａｃＩ制限部位によりフランキングされたキメラ遺伝子のコード化配列を含む 。この配列は、２４アミノ酸の想定される信号ペプチドを含む３２９アミノ酸の タンパクをコードする（Ｇ、ホオン・ヘイシュン、ヌクル、アク、レス、１４巻 ４８３−４９０頁（１９８６年）により報告された方法を採用したソフトウェア を使用して決定した）。このタンパクの配列に基づいて予期される分子量は、そ れの想定される信号ペプチドが開裂したとき、約３２キロダルトンである。

２）完全キメラ遺伝子の調製および後者のシャトルベクターｐＢＩＮ１９へのク ローニング 上記で得られたコード化配列を、カウリフラワー・モザイク・ウィルス（３５Ｓ 　ＣａＭＶ）のいわゆる３、５３プロモーターを含むプロモーター配列およびア グロバクテリウム、トゥメファシェンスのツバリン・シンターゼ（ＮＯ３）ター ミネータを含む終止配列の間に挿入した。

ａ）カウリフラワー・モザイク・ウィルスの３５３プロモーターを含むプロモー ター配列の調製 プラスミドｐＢ１１２１（クロンチック）で出発し、ＨｉｎｄｍおよびＢａｍＨ Ｉエンドヌクレアーゼを用いて開裂し、続いて電気泳動し、３５Ｓプロモーター を含有する約９００塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を離する。この断片 をＨｉｎｄＩＩで再び切断する。ＢａｍＨＩ部位を運ぶ、約４１０塩基対の断片 を、Ｈｉｎｄｆｆｌリンカ−（ＨｉｎｄＩｆｆ部位を含有する合成配列）の存在 下Ｔ４リガーゼで処理する。Ｈｉｎｄ　ｍエンドヌクレアーゼで開裂し電気泳動 した後、結果的に得られるＨｉｎｄｍ−ＢａｍＨＩ断片（約４２０塩基対）を単 離し精製する。

ｂ）アグロバクテリウム・トゥメファシェンスのツバリン・シンターゼ（ＮＯ３ ）ターミネータ−を含有する終止配列の調製プラスミドｐＢ１１２１（クロンチ ック）で出発し、制限酵素Ｓａｃ工およびＥｃｏＲＩを用いて開裂し、続いてア ガロース・ゲル電気泳動し、ツバリン・シンターゼ・ターミネータ−を含有する 約２５０塩基対の断片が単離された。

キチナーゼおよび終止配列のキメラ遺伝子のコード化配列であるプロモーター配 列を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＨｉｎｄＩ［［およびＥｃｏＲＩのエンド ヌクレアーゼを用いて開いた往復ベクターｐＢＩＮ１９に連結した。このベクタ ーの一部は植物に移すことができ、完全なキメラ遺伝子のすぐ上流にカナマイシ ン抵抗性遺伝子を含む（ベバン、ヌクル、アク、レス１２巻８７１１−８７２１ 頁（１９８４年）参照）。カナマイシン抵抗性遺伝子は形質転換および形質転換 した植物の子孫の分析段階で選択マーカーとして供されるであろう。

得られたベクターはｐＢＲｌと称する。配列決定により確認された完全キメラ遺 伝子の配列（配列認識番号：８）を図５に示す。プラスミドをエシェリキア・コ リ株ＭＣ１０６１（クロンチック）にクローン化する。

実施例２．エンドキチナーゼのトマト−タバコ・キメラ遺伝子を含有するプラス ミドｐＢＲ１のアグロバクテリウム・トゥメファシエンスまたはアグロバクテリ ウム・リゾジェネスへの移行 ａ）アグロバクテリウム・トゥメファシエンスへの移行以下に記載するように、 可動性プラスミドｐＲＫ２０１３を含有するエシェリキア・コリ株ＨＢ１０１を 用いて、ベクターｐＢＲ１を含有するエシェリキア・コリ株ＭＣ１０６１および アグロバクテリウム・トゥメファシエンス株ＬＢＡ４４０４（クロンチック）の 間で二親間コンジュゲートで移行させる。

プラスミドｐＢＲ１を含有するエシェリキア・コリ株ＭＣ１０６１および可動性 プラスミドｐＲＫ２０１３含有エシェリキア・コリ株ＨＢ１０１（クロンチック ）をルリア培地（ギブコ）中２５ｍｇ／ｌカナマイシンの存在下３７℃で培養す る。

アグロバクテリウム・トウメファシエンス株ＬＢＡ４４０４をルリア培地中１０ ０ｍｇ／ｌリファンピシン存在下２８℃で培養する（これは、この抗生物質に抵 抗する）：３個の培養物の各々２００μｍを混合し、ルリア寒天培地（ギブコ） 上に置き、２８℃で一晩恒温培養する。細菌を次にルリア培地５ｍ／に再懸濁し 、分画を１００１１９／１リフアンピシンおよび２５ｕ／１カナマイシンの存在 下、寒天最小培地（「プラント・モレキュラー・バイオロジー・マニュアル」ゲ ルビンら、クルワー・アカデミツク・プレス（１９８８年）に記載されている） を含有するペトリ皿上に置く。このような条件の下で、プラスミドｐＢＲ１を完 成したアグロバクテリウム・トウメファシエンス・コロニーのみ成長する。これ らのコロニーはそれの複製を許容する状況で遺伝子を含有する。

選択されたコロニーの側坑生物質に対する抵抗性は、これらのコロニーを連続し て２回、同じ選択培地上で継代培養することにより確認する。アグロバクテリウ ム・トウメファシエンス中のエンドキチナーゼのキメラ遺伝子の存在を、サザン の方法により全ＤＮＡ調製物に関して確認する。（細胞の溶解、上記で引用した ゲルビンの業績により報告された試験計画に準じたフェノール／クロロホルム混 合物を用いた抽出によるＤＮＡの精製、制限酵素を用いた精製ＤＮＡの開裂、ア ガロースゲル電気泳動、当業者に周知の技術による膜への移行および雑種形成） 。

ｂ）アグロバクテリウム・リゾジェネスへの移行この移行は、ａ）で記載された アグロバクテリウム・トウメファシエンスへの移行と同じ方法で、グエルッシュ ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティクス２０６巻３８２頁（１ ９８７年）に報告されたアグロバクテリウム・リゾジェネス株Ａ４を用いて行う 。

実施例３：形質転換したタバコ植物の産生イン・ビトロで培養したニコチアナ・ タバクム・タバコを、ホルシュらの当業者に周知の方法（ホルシュＲ，Ｂ、ら、 サイエンス２２７巻１２２９−１２３１頁（１９８５年））に準じて、プラスミ ドｐＢＲ１含有アグロバクテリウム・トウメファシエンスで感染させたが、これ の主要な段階を以下に記載する。

無菌ニコチアナ・タバクム・タバコ植物の歯の平円盤（変種ライスコンシン・ハ バナ３８、病原性菌類に対する感受性がある）をプラスミドｐＢＲ１をバーバー リング（ｈａｒｂｏｕｒｉｎｇ）するアグロバクテリウム・トゥメファシエンス の培養物中恒温培養する。平円盤をワットマン紙上に取り出し、ペトリ皿中の培 養培地上に移し、形質転換した細胞を増殖し、カルスを得、次に、セフオタキシ ム（５００μｇ／ｍ１）およびカナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下発芽 させる。カナマイシン抵抗性幼芽を、次に培地に移しセフオタキシムおよびカナ マイシン存在下発根を誘導した。苗を泥炭および混合肥料から成る基質のポット に移植し、室温で成長させる。形質転換した植物（Ｒ０世代）の全てが室温中で 再生および新環境順応の段階を行き残り、形態学的に正常で生殖力があることが 解明された。これらは自家生殖し、種子を得た（Ｒ，世代）。

実施例４：サザンプロット技法による形質転換タバコ植物のゲノムＤＮＡの分析 高分子量ゲノムＤＮＡを既に引用した「プラント・モレキュラー・バイオロジー ・マニュアル」の業績に報告されている、臭化セチルトリメチルアンモニウムを 用いて抽出して沈殿により精製する方法により、Ｒ０世代の遺伝子転換した植物 の成熟した葉から単離した。

このゲノムＤＮＡｌ０μｇを制限酵素ＨｉｎｄｍおよびＥｃｏＲＩ２０単位で、 ３７℃で一晩消化した。得られた制限断片をアガロースゲル（１％）電気泳動で 分離した。サザンプロット法によりＤＮＡをニトロセルロース・フィルター上に 移し、無作為標識化（無作為プライミング）によりα３２−ｄＣＴＰで標識化し た組み換えキメラ遺伝子の配列から成るヌクレオチドプローブで雑種形成した。

高いストリンジェント条件で、０，２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳの存在下６８℃ で洗浄し、オートラジオグラフィーに供した。オートラジオグラムの分析により 以下の結果が得られるニー転換した遺伝子の複製を持たない植物もある（信号の 欠如）。

−試験した植物の大部分は構築：ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター−エンドキチナー ゼキメラ遺伝子−ＮＯＳターミネータ−が再配列されることなく少なくとも１個 の複製を含有する。

−構築の内部再配列があることを示唆するプロフィールもあるが、これらはまれ にしかおこらない。

実施例５：組み換えエンドキチナーゼを発現する形質転換タバコ植物（Ｒｏ、Ｒ １およびＲ２世代）の決定１）ノーザンプロット技法によるメツセンジャーＲＮ Ａの分析Ｒｅ世代の形質転換植物の全ＲＮＡを、ベルウオエルドら、ナール、１ ７巻２３６２頁（１９８９年）の試験計画に準じて単離した。

葉の部分を取り、粉砕し、次にフェノール／トリス塩酸ｐＨ８，０１０，１Ｍ　 ＬｉＣ１混合物で処理する。

ＲＮＡをクロロホルムで、次に２Ｍ　ＬｉＣ１で処理して精製し、沈殿させる。

各植物のＲＮＡ１５μｇを、変性条件下アガロースゲル（１，２％）電気泳動に より分離し、次にニトロセルロース膜（ハイボンドＣ−エクストラ・アメルシャ ム）に移す。マニアティスらに報告された試験計画（前掲書中）に従って、導入 された遺伝子に対応するメッセンジ＋　−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、ａ３２−ｄＣ ＴＰの手段により予め標識化した配列（配列認識番号・９）： ５’　ＡＧＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＡ　３’のオリゴヌクレオ チドプローブおよびターミナルトランスフェラーゼ（ベーリンガー・マンハイム ）を用いこの分析により形質転換植物について、約１５００ヌクレオチドのメツ センジャーＲＮＡに対応する雑種形成信号が存在し、非形質転換植物は存在しな いことが認められた。

２）エンドキチナーゼの発現の決定 用いた方法は、免疫学的な技法により組み換えエンドキチナーゼを可視化する。

ａ）抗体の調製ニドマドカルスからトマトエンドキチナーゼを均質になるまで精 製したニドマドカルスは０．１１１ｇ／Ｉ　ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）および１ ｍｗ／ｌ　ＢＡＰ（ベンジルアミノプリン）を含有するムラシゲ・アンド・スク ーグ培地（ムラシゲＴ、およびスクーグＦ１、フィジオロジア・プランノルム１ ５巻４７３−４９７頁（１９６２年））上イン・ビトロで培養した。

細胞抽出物は、植物素材を１５ｍＭ　β−メルカプトエタノールおよび５％　ポ リビニルピロリドンを含有する５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液ｐＨ８，４中粉砕し て得られる。

この抽出物からタンパクを、以下に記載する試験計画に従って、硫酸アンモニウ ム沈殿、合成ポリマー（ファルマシアのモノＳ）を基礎とする陽イオンカラム上 ファルマシアのＦＰＬＣ技法による液体クロマトグラフィーおよび交叉架橋アガ ロース上の排除クロマトグラフィー（分子ふるい）により精製するニドマドエン ドキチナーゼの精製のための試験計画：段階１：タンパク抽出物を硫酸アンモニ ウム（６０％飽和）で沈殿させる。沈殿したタンパクを遠心（１５０００ｇ３０ 分）して取り除き、緩衝液（１００ｍＭ　酢酸アンモニウムｐＨ５，２）中可溶 化し、１００ｍＭ　酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５，２で、４℃で一晩透析する 。

次段階に進む直前に、使用するために準備されているミ二カラム（ＰＤＩＯ、フ ァルマシア）を通してタンパク抽出物中の緩衝液濃度をｌ１０１ｌＩＩに下げる 。

段階２：タンパク抽出物は、ＦＰＬＣ技法（ファルマシア）を用いて、合成ポリ マー（モノ−Ｓカラム、ファルマシア）を基礎とするイオン交換クロマトグラフ ィーにより精製する。

抽出物を、１０ｍＭ　酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５，２で平衡にしたモノ−Ｓ カラムに置（。カラムに保持されたタンパクを１０−５００ｍＭ　酢酸アンモニ ウムの直線グラジェントで溶出する。

段階３ニドマドエンドキチナーゼを含有する分画をセントリコン１０メンプラン （アミコン）上で限外濾過して濃縮する。タンパクの精製は交叉架橋アガロース （スーペローゼ１２カラム、ファルマシア）上のクロマトグラフィー（分子ふる い）により継続する；溶出は５００ｍＭ　酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５，２で 行う。

各段階でトマトキチナーゼを分子量により同定しくＳＤＳ存在下ポリアクリルア ミドゲル電気泳動−銀で可視化）、エンドキチナーゼ活性は、基質として標識化 キチンを用いる放射化学法（以下の実施例９参照）により測定する（モラノら、 アナリティカル・バイオケミストリー８３巻６４８−６５６頁（１９７７年）） 。

トマトエンドキチナーゼ２５μｇを次にフロイントの完全アジュバント５００μ ｌ中ウサギに注射した。フロイントの不完全アジュバント２５μｇ（５００μｍ ）の補助注射を３適間隔で３回行った。最後の注射後免疫血清を採取した。

ｂ）形質転換したタバコ植物（Ｒｅ世代）の粗タンパク抽出物の調製粗タンパク 抽出物と植物の種々組織（根、茎、葉等）から調製した。

組織断片を液体窒素で凍結し、粉末にし一２０℃で貯蔵した。粉末をＯ，ＬＭ　 酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５，２の存在下４℃で抽出し、１００００ｇで遠心 に供した。本明細書で以後粗タンパク抽出物と称する上清の全タンパクの濃度を 、ブランドフォードの技法（ブランドフォードＭ、　Ｍ、、アナリティカル・バ イオケミストリー７２巻２４８−２５４頁（１９７６年））に準じて定量した。

Ｃ）免疫プロットの検出（ウェスタン・プロット）種々形質転換植物および非形 質転換植物（対照）の粗タンパク抽出物を、当業者に周知で、とりわけＨ，）ウ ビンら：プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ７６巻４３５０−４３５ ４頁（１９７２年）に報告されている技法であるウェスタンプロットに供したが 、これは以下の段階を含む： −ラエムリにより報告された試験計画（Ｕ、　Ｋ、ラエムリ、ホーチャー２２フ 巻６８０−６８５頁（１９７０年））に準じた、０．１２５Ｍトリス塩酸ｐＨ６ ，８，４％　ＳＤＳ、０．００２％ブロモフェノールブルー、２０％　グリセロ ールおよび１０％　β−メルカプトエタノールから成る、ローディング緩衝液と 称する緩衝液中の１０分間の煮沸による変性； 一うエムリにより報告された試験計画（Ｕ、　Ｋ、ラエムリ、ホーチャー２２フ 巻６８０−６８５頁（１９７０年））に準じた、可溶化物中に含有される種々タ ンパクの電気泳動による分離；−ＰＶＤＦ膜上のゲルに含まれる上記タンパクの エレクトリックトランスファー（Ｈトウビンら、プロシーディング・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーブ・ オブ・アメリカ７６巻４３５０−４３５４頁（１９７９年）の技法に準じる）。

免疫検定は以下の段階から成る試験計画に準じて実施するニー３％ゼラチン溶液 中３７℃で少なくとも２時間の恒温培養による、タンパクを移したＰＶＤＦ膜の 飽和−０，０５％トウィーン２０界面活性剤含有リン酸塩緩衝生理食塩水での３ 回の洗浄 一上記で調製しく組み換えタンパクを認識するポリクローナル抗体含有）、リン 酸塩緩衝生理食塩水で１／１００００に希釈した免疫血清存在下の恒温培養（３ ７℃で１時間）−０，０５％トゥイーン２０界面活性剤含有リン酸塩緩衝生理食 塩水での３回の洗浄 次に抗原抗体複合体を使用説明書に従って用いた（アメルシャムキットＲＰＮ２ ３（プロッティング−検出キット）でアルカリ性フォスファターゼにコンジュゲ ートしたストレプトアビジン−ビオチン系を用いて可視化する。

得られたプロットは形質転換植物については約２６キロダルトンのタンパクが存 在し、対照植物からのものは存在しないことを示す（キメラ遺伝子の配列から誘 導されるタンパクは、その想定される信号ペプチドが開裂した場合、約３２キロ ダルトンの分子量を有する）。

ノーザンプロット技法に準じた、およびウェスタンプロット技法に準じた分析を ３０個の形質転換植物（サザンプロットに陽性に反応する）で実施した。２８個 の植物はノーザンプロットにおいてキメラ遺伝子のメツセンジャーＲＮＡの発現 、およびウェスタンプロットにおいて組み換えエンドキチナーゼの発現を示した 。２個の植物の場合の非発現は恐らく転写されない状況にあったキメラ遺伝子の 挿入の結果である。

ノーザンプロット技法に準じた、およびウェスタンプロット技法に準じた分析を 、組み換えタンパクを発現するＰｏ世代の形質転換植物に由来するＲ１世代の植 物、および組み換えタンパクを発現するＲ１世代の植物に由来するＲ２世代の植 物でも実施した。メンデルの分離の法則を守って（以下の実施例６参照）、全て ではないがほとんどのＲ１世代およびＲ２世代の植物が組み換えタンパクを発現 する。

従ってこれらの結果は、タバコ植物での遺伝子の挿入、および連続する世代にわ たる発現の安定性を示している。

実施例６：形質転換したタバコ植物（Ｒ１世代）の遺伝的分析カナマイシン存在 下で再生したタバコ植物（Ｒ，世代）を自家受粉させた。成熟した種子（Ｒ１世 代）を収穫しエッペンドルフ管中４°Ｃで貯蔵する。種子を２％次亜鉛素酸カル シウム水溶液を用いて表面殺菌する。この種子を次に滅菌水ですすぎ、層流フー ド中濾紙上で２４時間乾燥し、１００μｇ／ｌｎＩカナマイシンを補足したムラ シゲ・アンド・スクーグの寒天培地上で発芽させる（完全キメラ遺伝子に連結し 、および後者と同時にタバコ植物に移行したカナマイシン抵抗性遺伝子をここで は選択マーカーとして供する）。

略語Ｔｎで表す（ｎは植物に割り合てた番号）組み換えエンドキチナーゼを発現 する２８個の植物から選択した１６個の形質転換植物（Ｒ８世代）の子孫および １個の略語ＷＨ３８で表す非形質転換対照ニコチアナ・タバクム変種つィスコン シン・ハバナ３８植物の子孫に関して遺伝的分析を実施した。観察した個々の番 号（全固体群）は２７−１３９の子孫に応じて変える。発芽率は高く（９５％の 水準）、試験した植物の全てで共通している。

種子の発芽時に２種の表現型が観察される。

−１００μｇ／ｍｌカナマイシン存在下よく成長し、発達した根糸および緑の葉 を有するカナマイシン抵抗性の苗、−根糸が発達せず白い葉をつくる植物かまた は根糸が縮小し、白い部分のある葉をつくる植物に相当するカナマイシン感受性 の苗。

遺伝的分離を、カナマイシン感受性植物の数に対する抵抗性植物の数の比として 定義する。

以下の表１は得られた結果を照合する：上記表１に照合される結果の統計分析に より、エンドキチナーゼキメラ遺伝子により賦与される形質に遺伝的に連結した カナマイシン抵抗性の形質は、単一の因子座（互いに近接した遺伝子の１個の複 製または複数個の複製−３＝１）、２個の因子座（遺伝的に互いに近接した遺伝 子の１個の複製または複数個の複製を含む、遺伝的に遠（離れた２個の集合体− １５：１）または２個以上の因子座（植物Ｔ３１の場合）に存在する単一のメン デルの優性形質（メンデルの分離の法則３：１または１５：１）としてはたらく 。

各植物の因子座の数はＲ２世代の子孫の分析により確認された。

実施例７二形質転換した植物（Ｒ＋世代）の病原性菌類に対する抵抗性の測定 １６個の選択された形質転換植物、１個の、略語ＷＨ３ｇで表される、シャララ ・エレガンス（チェラビオブシス・バシコラとしても既知）に感受性があるニコ チアナ・タバクム変種つィスコンシン・ハバナ３８植物、および１個の、略語Ｐ ４９で表される遺伝的にこの菌に耐性であるニコチアナ・タバクム変種パラグア イ４９植物に由来するＲ１世代のカナマイシン抵抗性の苗を温室に移し、この菌 に対する抵抗性を評価する。後者は、細胞壁にキチンを有するタバコの病原菌の 代表的なものであるが故に選択された。この試験は植物に応じて１５−３６に変 える苗の固体群を網羅する。この試験で選択された試験計画を以下に記載する： 苗は小さなポット（３Ｘ３ｃｍ）中栽培する。５番めの葉が現れたとき、胚軸上 に内分朱子懸濁液（５Ｘ１０５胞子／ｍｌ）を載せることにより、植物に接種す る。内分止子はジャガイモデキストロース寒天培地（ディフコ）上に保持したこ の菌の菌糸の培養物から取る。シャララ・エレガンスに対する抵抗性は、接種後 ４５日の評点を割り合でることにより評価する。植物は感染の症状により、およ び接種していない対照に対するこれらの生殖能力の発達の度合により評点を、と る（この対照は、１６個の選択された形質転換植物およびＷＨ３８植物に由来す る植物に対しては未接種ＷＨ３８植物、並びにＰ４９植物に由来する植物に対し ては未接種Ｐ４９植物である）。以下の基準に従って等級を定義する： 評点０：植物死；評点１：末端の芽はまだ緑で、根系は破壊されている；評点２ ：植物の発達は対照の発達の２５％を越えないで、根系は完全に　壊：評点３： 植物の発達は対照の発達の５０％に達し、根系は健常部分であることを示す；評 点４：植物の発達は対照と同等。

形質転換植物の子孫の抵抗の指数は、この植物に由来する苗にわり合てた評点の 平均を表す。

以下の表２は得られた結果に照合する。

表２ ・ハバナ３８植物 子孫 上記の表を解読すると、形質転換植物全ての子孫Ｔｎの抵抗の指数はＷＨ３８対 照植物（非形質転換植物）の子孫の指数よりも大きく、しばしば遺伝的に抵抗性 を示すＰ４９対照植物の子孫の指数に近いかまたはそれよりも大きくなる。

実施例８・形質転換した西洋アブラナ植物の産生Ｐ、グエルッシエら（Ｐ、　グ エルッシエら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティクス２０６巻３ ８２頁（１９８７年））の試験計画に準じて形質転換を行う。種々の培養培地は ペレチアーら（ペレチアーら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティ クス１９１巻２４４頁（１９８３年））に報告されたものである。これらの組成 の詳細は後に記載する（表３）。

ａ）形質転換した根の産生 約ｌｌ１１の高さの西洋アブラナ（ブラシカ・ナブス、春変種ブルートーおよび ウェスター並びに冬変種）の頂上の先端から茎の部分をとる。これらの部分の表 面を無菌化し、滅菌水ですすぎ、約１．５ＣＩ！ｌの切片に切断し、培地Ａを含 有する試験管中に置く。

プラスミドｐＢＲ１を含有するアグロバクテリウム・リゾジュネス株の懸濁液を 載せることによりこの切片の先端に接種する。

１−２週間後、茎の切片に形質転換した根が現れる；これらを取り除き、寒天（ １５ｇ／ｌ）を含有し５００μｇセフォタキシム／ａｌを補足した培地Ｂ上に置 く。

ｂ）形質転換カルスの産生 根の断片を３ｍｇ／ｌ　２．４−ジクロロフェノキシ酢酸を含有する培地り上１ ５日間恒温培養し、次いで寒天（１５ｇ／ｌ）を含有する同じ培地上に移し、形 質転換細胞を増殖させてカルスを得、組み換えタンパクが精製される粗抽出物を 産生させる（以下の実施例１０参照）。

Ｃ）形質転換した植物の再生 根の断片を３ｍｇ／ｌ　２．４−ジクロロフェノキシ酢酸を含有する培地り上１ ５日間恒温培養し、次にＲＣＣ培地上に置いて発芽を誘導する。芽を培地Ｆおよ びＧに移すことにより発根植物が得られる。

実施例９．形質転換植物アブラナ植物（Ｒｅ世代）のゲノムＤＮＡの分析並びに 後者および組み換えエンドキチナーゼを発現するそれらの子孫の決定 １）サザンプロット技法によるゲノムＤＮＡの分析サザンプロット技法に準じて 、実施例４記載の条件下ゲノムＤＮＡの分析を行い、試験した植物の大部分が構 築ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターーエンドキチナーゼキメラ遺伝子−ＮＯＳターミ ネータ−を再配列されることなく、少なくとも１個の複製を含むことが確立され た。

２）ノーザンプロット技法によるメツセンジャーＲＮＡの分析２．３種の植物に 関してのみ、ノーザンプロット技法に準じて、実施例５記載の条件下メツセンジ ャーＲＮＡの分析を実施した。ウェスタンプロット技法による分析の方が予期さ れる情報を産みだすのが早いからである。ノーザンプロット技法による分析によ り、約１５００ヌクレオチドのメツセンジャーＲＮＡが存在し、非形質転換植物 は存在しないことが、分析した形質転換植物で認められた。

３）ウェスタンプロットによる組み換えエンドキチナーゼの発現の決定 実施例５記載の条件および抗体を用いて、形質転換西洋アブラナ植物の粗タンパ ク抽出物（実施例５の形質転換タバコ植物の粗タンパク抽出物のように調製）で ウェスタンプロット分析を行い、組み換えタンパクが可視化できた。

得られたプロットは、形質転換植物に関しては、約２６キロダルトンのタンパク が存在し、対照植物には存在せず（信号ペプチドが開裂している場合、キメラ遺 伝子から誘導されるタンパクの分子量は約３２キロダルトンである）、また抗体 により認識される約３８キロダルトンのタンパクも存在し、また非形質転換植物 にも存在することが示される。後者のタンパクは内因性エンドキチナーゼ（アッ タに、　Ｋ、ら、アブストラクツ・ザ・セカンド・インターナショナル・コンブ レス・オブ・プラント・モレキュラー・バイオロジー、エルサレム（１９８８年 ））であり、これは組み換えエンドキチナーゼのタンパクと血清学的に共通の様 相を呈する。

４２個の形質転換植物（サザンプロットに陽性に反応した）で、ウェスタンプロ ット技法による分析を実施した。３８個の植物が組み換えエンドキチナーゼの発 現を示した。４個の植物の場合に観察された非発現は恐ら（転写されない状況で キメラ遺伝子が挿入された結果である。

ウェスタン技法による分析はまた、組み換えエンドキチナーゼを発現するＲ０世 代の形質転換植物に由来するＲ１世代の植物に関しても実施した。２倍体の遺伝 形質に適用される遺伝の法則を守って、これらの植物の全てではないがほとんど が組み換えタンパクを発現した。

これらの結果は、西洋アブラナ植物の遺伝子の挿入、および何世代にもわたる発 現の安定性を示している。

実施例１０：形質転換西洋アブラナカルス（Ｒ０世代）の組み換えエンドキチナ ーゼの精製、酵素活性の測定およびアミノ末端配列の決定 １）組み換えエンドキチナーゼの精製 形質転換西洋アブラナカルスの粗タンパク抽出物から組み換えタンパクを、以下 に記載した試験計画に準じて、硫酸アンモニウム沈澱、合成ポリマーを基礎とす る陽イオン交換カラムのＦＰＬＣ液体クロマトグラフィーおよび交叉架橋アガロ ースの排除クロマトグラフィー（分子ふるい）により精製した：組み換えエンド キチナーゼの精製のための試験計画段階１：タンパク抽出物を硫酸アンモニウム （６０％飽和）で沈澱させる。沈澱したタンパクを遠心（１５０００ｇ、３０分 ）により回収し、緩衝液（１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５，２）中可 溶化し、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５，２で、４℃で一晩透析する 。

次段階に進む直前に、タンパク抽出物中の緩衝液濃度を、使用するために準備さ れたミ二カラム（ＰＤＩＯ、ファルマシア）を通して１０ｍＭに下げる。

段階２：次にタンパク抽出物を、ＦＰＬＣ技法（ファルマシア）を用いて、合成 ポリマーを基礎とするイオン交換クロマトグラフィ−（モノ−Ｓカラム、ファル マシア）で精製する。

抽出物を１０■Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５，２で平衡にしたモノ−Ｓカラ ムに置く。カラムに保持されたタンパクを１０−５００ｍＭ酢酸アンモニウムの 直線グラジェントで溶出する。

段階３：組み換えエンドキチナーゼを含有する分画をセントリコン１０メンプラ ン（アミコン）上で限外濾過することにより濃縮する。

交叉架橋アガロースの排除クロマトグラフィー（分子ふるい）（スーペローゼ１ ２カラム、ファルマシア）によりタンパクの精製を続け、溶出は５００ｍＭ酢酸 アンモニウム緩衝液ｐＨ５，２で行う。

各段階で、トマトエンドキチナーゼを分子量（ＳＤＳ存在下ポリアクリルアミド ゲル電気泳動−銀で可視化）、免疫プロット（実施例５ｃ）参照）、および記載 する、基質として標識化キチンを用いる放射化学的方法により測定した（モラノ ら、アナリティカル・バイオケミストリー８３巻６４８−６５６頁（１９７７年 ））エンドキチナーゼ活性により同定する。

２）組み換えエンドキチナーゼの酵素活性の測定ａ）方法 エンドキチナーゼ活性は、以下に要約するモラノら、アナリティカル・バイオケ ミストリー８３巻６４８−６５６頁に報告された試験計画に準じて、基質として トリチウム標識化キチンを用いる放射化学法により測定する。

予め連続して４回遠心し溶媒を新しくすることにより洗浄したトリチウム標識化 キチン５０μｌ（５０ｋＢｑ／ｍｌ）に、組み換えエンドキチナーゼを含有する 分画５０μｍを加え、続いて０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，５を２５０ μｍを加える。２０℃で４５分間恒温培養した後、２０％トリクロロ酢酸１００ μｍ加えて反応を停止させる。遠心（１００００ｇ、１０分）後、上清１００μ ｍ中に可溶化した放射活性の量を液体シンチレーションにより測定する。

上記に記載した方法による精製の各段階で、組み換えタンパク（分子量およびト マトキチナーゼに対するポリクローナル抗体での陽性反応の手段により同定）は エンドキチナーゼ活性を示す。

ｂ）結果 段階１、段階２および段階３の最後に測定した特異活性はタンパクのμｇあたり 各々１３５．７４１６および３２１９３ｃｐｍである。

３）成熟組み換えエンドキチナーゼのアミノ末端配列の決定上記で記載した試験 計画に従って組み換えエンドキチナーゼを精製した後、アミノ末端の配列決定を 行った。ＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、Ｈ，トウビンら、 プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ ジ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ４３５０−４３５４頁（１９７９ 年）により報告された方法によるエレクトロトランスファーにより、処理する試 料をＰＶＤＦ（ポリビニリデン・ジフルオライド）フィルターの表面に移す。各 減成サイクルの後、フィルターをクロマトグラフ（アプライド・バイオシステム ズ・モデル４３０）を装備したフェニルチオヒダントイン誘導体を連続的に分析 するタンパクシークエンサー（カンパニー・アプライド・バイオシステムズ（米 国）により市販されるモデル４７ＯＡ）に導入する。

決定されたアミノ末端配列（配列認識番号：１０）を以下に示し、記号Ｘａａは 未決定アミノ酸を表す： ＧＬｙ−ＧＬｙ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−ＧＬｙ−５ｅニーＶａＬ−ＩＬｅ−５ｅｒ− Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−ＧＬｎ−Ｍｅｔ| Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ａｒｇ 図６に示した成熟タンパクの配列（配列認識番号＝　１）の最初の部分は、図４ で示すようなキメラ遺伝子の配列（配列認識番号：１１）から誘導されるアミノ 末端メチオニンから７６番めのアミノ酸に対応することが認められる。

キメラ遺伝子によりコードされるメツセンジャーＲＮＡから翻訳されるタンパク は、２４個のアミノ酸の想定される信号ペプチドの開裂を受け、Ｇ、フォノ・ヘ イジン、ヌクル・アク・レス１４巻４８３−４９０頁（１９８６年）続いて成熟 して５１個のアミノ酸のアミノ末端ペプチドの開裂を産み出す。

従って、キメラ遺伝子の配列はプレプロ酵素型のタンパクの合成に必要な情報を 含み、これが成熟して活性エンドキチナーゼになる。

実施例１１：形質転換西洋アブラナ植物（Ｒ１世代）の遺伝的分析再生した西洋 アブラナ（Ｒ０世代）を自家受粉させた。成熟した種子（Ｒ＋世代）を集め、袋 に貯蔵する。次に種子を箱の中でバーミキュライト上に播種し、次いで幼苗を各 々、園芸用混合肥料が入った２リツトルポツトに移植する。組み換えタンパクの 発現は、実施例５ｂ）に記載した試験計画に従ってタンパクを抽出した後、ウェ スタンプロット技法により若葉上で強化する（実施例９）の段落３参照）。

２倍体の遺伝形質に適用される遺伝の法則に従って、これらの植物の全てではな いがほとんどが組み換えタンパクを発現する。

１５個の形質転換西洋アブラナの子孫を、実施例７記載の試験計画に準じて総計 分析した。得られた結果はエンドキチナーゼキメラ遺伝子の発現形質が、単一の 因子座（１５個のうち１２個の子孫がメンデルの分離の法則の３＝１を示す。） 、または２個の因子座（１５個のうち３個の子孫がメンデルの分離の法則の１５ ＝１を示す。）で存在する、単一のメンデルの優性形質として働くことが示され る。

実施例１２：形質転換した西洋アブラナ植物（Ｒ，世代）の病原性菌に対する抵 抗性の測定 組み換えタンパクを発現するＲ、世代の植物を自家受粉させる。

得られたＲ２世代の種子を実施例１１記載のとおり発芽させる。

本明細書の以下に要約するベインズおよびテワリ、フィシオール・モル・プラン ト・バソール、３０巻２５９頁（１９８７年）に報告された試験計画に従って、 西洋アブラナ植物の病原菌として代表的な菌類であるアルテルナリア・ブラシカ ニを用いて、培養チャンバー中で接種することにより、組み換えタンパクを発現 する西洋アブラナ植物の抵抗性をＲ２世代の植物で決定した。

西洋アブラナ植物の２１日齢の幼苗を、予め針で刺した１番めの葉の中央の葉脈 上に胞子に懸濁液を載せて接種する。２週間後に寄生した菌の成長の結果できる 順環の広がりを測定する。

１０個の形質転換植物の子孫から得られた結果は、３個の植物の子孫ではかなり 増強された抵抗性を示し、これはベインズおよびテワリの上記で言及した遺伝的 にアルテルナリア・ブラシカニに抵抗するカラシ菜変種シナビス・アルバの抵抗 性に近似している。

実施例１３：ヒマワリの形質転換した根のオブテンジョン６−１０週齢のへりア ンサス・アヌス・ヒマワリ植物（ユーロフローラ・ルスティカ種子変種）から葉 柄の切片を採る。この切片を１％次亜塩素酸カルシウム溶液中３０分間浸潤させ て殺菌する。

葉柄の切片を次に多量のゲロース含有ムラシゲ・アンド・スクーグ培養培地が入 った試験管中に置く。ｐＢＲ１プラスミド含有アグロバクテリウム・リゾジェネ ス株の懸濁液を載せることにより、これらの切片の末端に接種する。

約１カ月後、葉柄の切片に形質転換した根が現れる。これらの根をとり、５００ μｇセフォタキシム／ｍｌ含有寒天培地Ｍ（６ｇ／ｌアガロースを添加した培地 Ｍ）上に置く。培地Ｍの組成は本明細書の後に示す（表４）。これらの根を毎週 、４週間にわたって同じ培地に移植する。次にこれらを液体培地Ｍに移し、実施 例９の段落３に記載された試験計画に準じてウェスタンプロット技法により組み 換えタンパクの発現を分析するのに十分な量の根が産生されるようにする。

この分析に用いる粗タンパク抽出物を実施例５記載の技法に従って調製する。得 られたプロットは、形質転換した根に予期される分子量（２６キロダルトン）の タンパクが存在するが対照の根およびヒマワリ植物（非形質転換植物）の葉には 存在しないことを示す。

表４ ヒマワリの形質転換した根の培養に用いる培養培地Ｍの組成配列の一覧表 配列認識番号＝１ 配列の型：　アミノ酸 配列の長さ＝　２５４アミノ酸 特性：　エンドキナーゼ活性を有するタンパク配列認識番号：２ 配列の型　・　アミノ酸 配列の長さ　：　アミノ酸 特性　：　配列認識番号：１の配列のすぐ上流に位置する配列 配列認識番号、３ 配列の型　、アミノ酸 配列の長さ　・　アミノ酸 特性　：　配列認識番号：２の配列のすぐ上流に位置する配列 Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　 Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ@ＶａＬ 配列認識番号＝４ 配列の型　：　ヌクレオチド 鎖の数　：　１１５３塩基対 分子の型　：　ゲノムＤＮＡ 特性　：　配列認識番号＝１の配列を含む、エンドキチナーゼ活性を有するタン パクをコードする、キメラ遺伝子のコード化部分 特徴　：　４４３−５２１塩基対：イントロン１：　６７６−７５６塩基対：イ ントロン２ＡＴＧＡＧＧＣＧＡＡ　ＣＴＴＣＴＡＡＡＴＴ　ＧＡＣＴＡＣＴＴＴ Ｔ　ＴＣＴＴＴＧＣＴＧＴ　ＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴ　ＴＴＴＧＣＴＧＡfＴ　６ ０　。

ＧＣＴＧＣＣＴＴＧＧ　ＣＡＣＡＧＡＡＴＴＧ　ＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧ　ＧＧＣ ＧＧＡＧＧＣＡ　ＭＧＴＴＴＧＴＧＣＧＴＣＧＧＧＡＣＡＡ@１２０　’ ＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡ　ＡＡＴＴＣＧＧＧＴＧ　ＧＴＧＣＧＧＴＡＡＣＡＣＴＡ ＡＴＧＡＣＣＡＴＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＴＧＴ　P８０ ＣＡＡＡＧＴＣＡＧＴ　ＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧ　ＣＧＧＣＣＣＴＧＧＴ　ＣＣＴ ＧＧＴＣＣＴＧ　ＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧ　ＧＧＡＣＣＴＣＧfＡ　２４０ ＡＧＣＧＴＣＡＴＣＴ　ＣＡＡＡＴＴＣ，ＴＡＴ　ＧＴＴＴＧＡＴＣＡＡ　ＡＴ ＧＣＴＴＡＡＧＣＡＴＣＧＴＡＡＣＧＡ　ＡＡＡＴＴＣＴＴfＴ　３００ ＣＡＡＧＧＡＡＡＧＡ　ＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡ　ＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴ　ＧＣＣ ＴＴＴＡｎＡ　ＣＴＧＣＴＧＣＴＡＧ　ＧＴＣＴＴＴＴＣＣs　３６０ ＧＧＣＴＴＴＧＧＴＡ　ＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡ　ＴＡＴＣＡＡＴＧＣＣＣＧＴＡ ＡＡＡＧＧＧ　ＡＡＡＴＴＧＣＴＧＣ丁ＴＴＣＴＴＴＧＣＣC４２０ ＣＡＡＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＡＡＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＴ　ＡＴＡＡＣ ＣＡｎＣＡＣＡＴＣＧＡＡＣＣＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴ　４８O ＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴ　ＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴ　ＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴ　ＴＡＴ ＡＴＡＴＧＴＡ　ＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＣＡＣb５４０ ＴＧＡＴＧＧＡＣＣＡ　ＴＴＣＧＣＡＴＧＧＧ　ＧＴＴＡＣＴＧＴＴＴ　ＣＣＴ ＴＡＧＡＧＡＡ　ＣＧＡＧＧＴＡＡＣＣＣＣＧＧＴＧＡＣＴ`　６００ ＣＴＧＴＴＣＡＣＣＡ　ＡＧＴＡＧＴＣＡＡＴ　ＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣＡＣＣＴ ＧＧＡＡＧＧ　ＡＡＡＴＡＴｎＣＧ　ＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣU６０ ＡＡＴＣＣＡＡＡＴＴ　ＴＣＡＣＡＧＴＡＡＧ　ＣＴＡＣＡＴＡＡＡＴ　ＣＴＡ ＴＡＴＡＴＧＧ　ＴＡＡＡＡＴＴＴＧＡ　ＴＧＡＡＣＴＴＧsＡ　７２０ ＧＴＧＴＣＴＡＡＴＴ　ＡＣＧＴＧＴＡＴＴＴ　ＴＧＡＣＡＴＴＴＣＡ　ＡＡＡ ＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＴＡＴＧ　ＧＧＣＣＡＴＧＴＧf　７８０ ＡＡＧＡＧＣＣＡＴＣＧＧＡＧＴＧＧＡＣＣＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡ　ＴＣＣＴＧ ＡＴＴＴＡ　ＧＴＡＧＣＣＡＣＡＧ　ＡＣＣＣＡＧＴＣＡＴ@８４０ ＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧ　ＡＣＴＧＣＴＡＴＣＴ　ＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴ　ＣＡＣ ＣＣＣＴＣＡＡ　ＴＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＴＴＣＴＴＧＣＣ`　９００ ＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＧＡＴ　ＧＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＧＣＣＧ ＧＴＧＡＣＣＧＡＴＣＡＧＣＣＡ　ＡＴＣＧＴＣＴＴＣＣ９U０ ＴＧＧＡＴＴＴＧＧＴ　ＧＴＣＡＴＣＡＣＡＡ　ＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡ　ＴＧＧ ＧＧＧＣＣＴＧ　ＧＡＡＴＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＴＧ`　１０２０ ＣＡＡＴＡＧＧＧＴＣＣＡＧＧＡＴＣＧＣＡ　ＴＴＧＧＧＴＴＴＴＡ　ＣＡＧＧ ＡＧＧＴＡＴ　ＴＧＣＧＧＴＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＴＴＡＧ@１０８０ ＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴ　ＧＣＧＧＡＡＡＣＣＡ　ＧＡＧＡ ＴＣＴＴＴＴ　ＧＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡ@１１４０ ＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡ　ＴＧＡ　１１５３配列認識番号：５ 配列の型　・　ヌクレオチド 配列の長さ　：　塩基対 鎖の数　；　二本鎖 分子の型　：　ゲノムＤＮＡ 特性　ｚ　トマトエンドキチナーゼ遺伝子の５°部分特徴　・　最初の塩基対： ＥｃｏＲＩ部位：　２００６番めの塩基対：　Ｓ　ｔｙｔ部位：　２１７２番め の塩基対：ＤｒａｌＩ（１）部位：　２９３４番めの塩基対：ＤｒａｌＩ（２） 部位：　３００７番めの塩基対：　Ｈｉｎｄ　ｍ部位：　１９４２−３００７塩 基対ニドマドエンドキチナーゼの５′部分 ：　２３８４−２４６２塩基対、イントロント　２６１７−２６９７塩基対：イ ントロン２ＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴ　ＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡ　ＡＡＡＡＴＡＴＴＴ Ｔ　ＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡ　ＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴ　ＴＴＴＣＡＣＧＣbＴ　６ ０ ＡＣＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＧＣＣＣ丁Ｃ ＴＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＡ　１２O ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴ　ＡＡＡＣＴＴＴＡＣＴ　ＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡ　ＴＴＴ ＴＣＡＡＣＴＴ　ＣＡＡＡＡＴＴＴＣＡ　ＴＴＴＴＴＴＴＴbＡ　１８０ ＴＣＣＣＴＡＣＣＣＴ　ＣＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＣＧ　（７ＡＡ ＡＡＡＡＴＡ　ＡＡＡＧＴＴＴＡＡＧ　ＴＴＴＧＴＴ丁ＴＴf　２４０ ＡＡＡＡＧＴＡＴＴＴ　ＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡ　ＡＡＡＴＴＣＡＴＴＴ　ＴＴ丁 ＣＡＣＣＣＣＴ　ＡＡＣＣＴＣＡＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＡb３００ ＡＴ丁ＣＣＣＡＣＣＣｃＡＡｎｎｍ　ＴＴＴＴＡＡＧＴＴＴ　ＧＴＴＧＴＴＡＡ ＡＡ　ＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴ　ＡＣＴＴＣＡ／ＬＡＡＴ　３U０ 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配列の長さ　：　２０アミノ酸 特性　Ｎ−末端ペプチド 配列認識番号　１１ 配列の型　ヌクレオチド 配列の長さ　：　１１６３塩基対 鎖の数　二　二本鎖 分子の型　：　ハイブリッド（ゲノムＤＮＡ−相補的ＤＮＡ）特性　：　配列を コードするキメラ遺伝子特徴　：　２番めの塩基対：ＢａｍＨＩ部位：　１１６ ２番めの塩基対：５ａｃＩ部位：　７−７８塩基対：配列３ ：　７９−２３１塩基対：配列２ ：　２３２−１１”＋３塩基対：配列１：　４４９−５２７塩基対：イントロン １：　６８２−７６２塩基対：イントロン２ＡＡＣＣＡＴＴＣＡＣＡＴＣＧＡＡ ＣＣＡＴ　ＴＡＡＡＡＴＡＴＡＡ　ＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡ　ＴＴＴＴＡＴＴＴＡ Ｇ　ＴＡＡＴＴＧＡＴＴ` ＣＡＡ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＣＡ　ＧＴＡＡＧＣＴＡＣＡ　ＴＡＡＡＴＣＴＡＴＡ 　ＴＡＴＧＧＴＡＡＡＡ　ＴＴＴＧＡＴＧＡＡＣＧＬｎ　ＩＬｅ　Ｓｅｒ　Ｈｉ Ｘユ；　プラスミドｐＣＨ３，５に挿入される約３．５−ｋｂトマトエンドキチ ナーゼゲノムＤＮＡフラグメントの制限地図ｒ’１ｗ　Ｉ”ｌ’−−ｒｌ　＼　 ｒｌｎ、　Ｆ−＋ｒ＝　ｆ−４ｒ　ｒｌｌ１１ＡＡ（：ｉＣＴＴＧＣＡＣ　ＧＡ ＣＡＣＡＣ”ＴＴＧ　ＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡ　ＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡ　ＧＡＴＡ ＣＡＣＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣ　ＡＡＡＧＣ；ＧＣ口ＡＡ　ττＧＡＣＡＣ ’ＴττＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧ　ＧＴＡＡＴＡＴＣＣＣＧＡＡＡＣＣＴ口口τ　 Ｃ；（；ＡＴＴＣＣＡＴ　ＴＧＣ口ＣＡＧＣＴＡ　ＴＣτＧＴＣＡＣＴτ　τＡ Ｔ？Ｃ；ＴＧＡＡＣＡＴ’ＡＣＴＧＣ；ＡＡＡ　ＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧ　ＣＴＣ ＣＴＡＣＡＡＡ　Ｔ（；Ｃ口ＡＴＣＡＴＴ　ＧＣＧＡＴＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＣ Ｉ：ＡＴＣ　ＧττＱｉＡＡＧＡＴ’Ｇ　ＣＣＴＣτ’ＱＣＣＧＡ　ＣＡＧＴＯ ＧＴＣＣＣ　ＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＣＴＣ口ＡＣＣＣＡＣ　ＧＡＧＧＡＧＣＡＴ Ｃ　ＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧ　ＡＡＧＡＣＧＴＴＣＣ　ｋＡｃｃＡｃＧＴｃＴＴＣ ＡＡＡＧＣＡＡＧ　ＴＣ；ＧＡＴＴＣ；ＡＴ（；　ＴＣＡＴＡＴＣτＣＣ　ＡＣ ＴＧＡＣＧτＡＡ　ＧＧＧＡτＧ　Ａ　Ｃ　Ｇ　ＣＡＣＡＡτ口（：ＣＡＣ’　 ＴＡＴＣＩ：ττＣＧＣ　ＡＡＧＡＣＣ口ττＣＣτ；τＡＴＡＴＡＡ　ＧＧＡ ＡＧＴＴＣＡＴＴ”ＣＡでτ？ＧＧＡ　ＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧ　ＧＧＧＡＣ’： 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適用：病原作因に抵抗性を有する植物の獲得国際調査報告 ｌ″″″″１ｌｅｌ″ＩＡｏｏｌｌｅｌｌ１６ＲＮｏ　ＰＣＴ／ＦＲ９１１００ ６０７国際調査報告

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．エンドキチナーゼ活性を有するタンパクまたはそれの前駆体をコードするも のであって、以下の配列（１）：【配列があります】 を含む、組み換え遺伝子。
2. ２．配列（１）のすぐ上流に以下の配列（２）：【配列があります】 または配列（２）と実質的な程度の相同性を呈する配列を含むタンパクをコード する、請求項１記載の組み換え遺伝子。
3. ３．配列（１）の上流にシグナルペプチドをコードする配列を含む配列を有する タンパクをコードする、請求項１および２の何れか１項記載の組み換え遺伝子。
4. ４．配列（２）または配列（２）と実質的な程度の相同性を呈する配列のすぐ上 流に、以下の配列（３）： 【配列があります】 または配列（３）と実質的な程度の相同性を呈する配列を含む配列を有するタン パクをコードする、請求項２記載の組み換え遺伝子。
5. ５．コード化部分が、少なくとも１個のトマトエンドキチナーゼのゲノムまたは 相補的ＤＮＡの５′部分、および少なくとも１個のタバコエンドキチナーゼのゲ ノムまたは相補的ＤＮＡの３′部分を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の 組み換え遺伝子。
6. ６．コード化部分が少なくとも１個のイントロンを含む、請求項５記載の組み換 え遺伝子。
7. ７．コード化部分が以下の配列： 【配列があります】 である、請求項１〜６のいずれか１項記載の組み換え遺伝子。
8. ８．カウリフラワー・モザイク・ウィルスの３５Ｓプロモーターを含有するプロ モーター配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の組み換え遺伝子。
9. ９．アグロバクテリウム・トゥメファシエンスのノパリン・シンターゼ・ターミ ネーターを含有する終止配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の組み換 え遺伝子。
10. １０．請求項１〜９のいずれか１項記載の組み換え遺伝子をコード化する組み換 え遺伝子により形質転換される、植物細胞。
11. １１．ニコチアナ・タバクム、ヘリアンサス・アヌスおよびブラシカ・ナプスの 種の１種に属する、請求項１０記載の植物細胞。
12. １２．発現を許容できる状況で、請求項１〜９のいずれか１項記載の組み換え遺 伝子を含有する、植物または植物部分。
13. １３．ニコチアナ・タバクム、ヘリアンサス・アヌスまたはブラシカ・ナプスの 種の１種に属する、請求項１２記載の植物または植物部分。
14. １４．植物種子である、請求項１２または１３のいずれか１項記載の植物部分。
15. １５．請求項１〜９のいずれか１項で定義される組み換え遺伝子による植物細胞 の形質転換の段階、続いて形質転換した細胞の増殖段階および植物の再生段階が 含まれる、病源性要因に抵抗する植物を得るための方法。
16. １６．ニコチアナ・タバクム、ヘリアンサス・アヌスおよびブラシカ・ナプスの 種の１種に適用される、請求項１５記載の方法。
17. １７．配列（１）を含む、エンドキチナーゼ活性を有するタンパク。
18. １８．請求項１〜９のいずれか１項記載の組み換え遺伝子を発現を許容できる状 況で含有する植物細胞またはカルスの培養、これらの細胞またはカルスの溶解、 並びにこのタンパクの単離および精製を含む、請求項１７記載のタンパクを得る ための方法。
19. １９．植物細胞またはカルスをニコチアナ・タバクム、ヘリアンサス・アヌスお よびブラシカ・ナプスの種の１種から選択するものである、請求項１８記載の方 法。