BG100360A - Хитиназа,кодираща хитиназата днк,и растения,които съдържат такава днк - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до нов клас растителни хитинази, които имат ендохитиназна и фунгицидна активност и молекулно тегло, приблизително от 40 до 43кDа, както е доказано с натриева додецилсулфат електрофореза. Изобретението се отнася и до фунгициден състав, включващ хитиназа като активен ингредиент. Изолирана е ДНК последователност, която съдържа отворена четяща рамка, кодираща новата хитиназа.Изобретението се отнася още до растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователност, която включва ДНК последователност, кодираща посочената хитиназа, и до растителни клетки, в чийто геном е включена рекомбинантната ДНК.

Description

ХИТИНАЗА КОДИРАЩА ХИТИНАЗАТА ДНК И РАСТЕНИЯ КОИТОСЪДЪРЖАТ ТАКАВА ДНК ОБЛАСГ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Настоящето изобретение се отнася до хитинази от растителен източник, кодираща хитиназата ДНК и растения, които са били такатранформирани, че да съдържат и експресират посочените рекомбинантниполинуклеотиди с оглед продуциране и свръхпродуциране на посоченатахитиназа По- нататък, изобретението предоставя методи за предпазванена растенията от въздействието на патогенни агенти, включително и наполучените по посочения по- горе начин. По- нататък изобретениетовключва антипатогенни състави, съдържащи като активен инградиентхитиназата съгласно настоящето изобретение. НИВО НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Растенията реагират на стресове като например въздействие напатогени, химикали и наранявания, посредством акумулиране на голямоколичество протеини. Един от най- добре изучените отговори нарастенията е индуцираната експресия на така наречените патогенетично -свързани протеини, PR- протеини (Bowles, D. 1990, Anna. Rev. Biochem. 59, 873- £ 907; Linthorst, H. J. M., 1991, Crit. Rev. Plant Sci 10,123-150). PR- протеините могат да бъдат групирани в поне пет семейства (PR-1go PR-5) на базата на тяхтага структура и/ или активност. У тююна, врамките на всяко семейство PR- протеини се различават кактоинтрацелуларни (клас -1), така и екстрацелуларни изоформи. Сред PR- протеините са хитиназите, които представляватсемейството PR-3 (l.egrandМ., etal, 1987, ProcNatl. Acad. Sci USA, 84, 6750-6754). Хитиназите от клас -1 притежават антигъбна активност (BroekaertW. F. et al, 1988, Physiol. Mol. Plant Pathol. 33, 319- 331), no- специално 6коминация c β-1, 3- глюканаза (Schkunbaum A. et al, 1986, Nature 324, 365- 367),са отнесени към семейството PR- 2 (Kauffmann S. et al, 1987, EMBO J. 6, 3209-3212). Наличието на хитинази и клонирането на съответстващите имсДНКи е описано за много растителни видове, както от дикотиледоне, такаи монокотиледоне (най- последен обзор - от Collinge D. В. et al, 1993, The PlantJournal 3(1), 31- 40). Съаласно тяхната първична структура хитиназите сагрупирани в три класа (Schinshi Н. et al, 1990, Plant Mol. Biol. 14, 357- 368).Напоследък е установено, че някои хитинази не пасват на тази класификация:предложено е те да формират клас - IV. Хитиназите от клас I се характеризират с наличието на участък, богат на приблизително 40молекули от амино киселината цистеин. Хитиназите от клас III не притежават секвенционно сходство с тезиот класовете I или П. Хитиназите от клас IV, както е предложено отCollinge et al, по- горе, включват хитиназа IV от захарно цвекло (Mikkelsen J. D. etal, 1992, In: Advances in Chitin and Chitosan (Brine, C. J. Sandford, P.A. andZikakis, J. P. eds. Amsterdam Elsevier, in press) и основната хитиназа у ряпа ChB4(Rasmussen U. et al, 1992, Planta, 187, 328- 334), а така също и киселатахитиназа у бобови PR4 (Margis- Pinheiro М, et al, 1991, Plant Mol. Biol. 17, 247-253), показват секвенционно сходство c хитиназите от клас-1 посъдържанието на N- краен богат на цистеин участък, но са по- малки отхитиназите от клас-1, дължащо се на множество делеции Молекулнитетегла на растителните хитинази граничат средно от около 26 до около 36kDa Посредством клониране на гените, кодиращи PR-протеините,изменение на техните образци на експресия чрез поставяне на гените подконтрола на изкуствени, т. е. конститутивни, регулаторни елементи, иповторното въвеждане на тези структури в растенията, става възможноредуцирането на възприемчивостта на растенията на въздействието наболестотворни агенти, в частност на гъби (ЕР application 0 440 304Al; ЕР 0460 753). Аналогична експресия на хитинази от клас- I и β-1, 3- глюканази втранегенни растения предизвиква подчертано повишение на устойчивосттаспрямо гъбни заболявалия у транегенните растения, което показва степентана комбиниране на антипатогенни протеини Налице е постоянна необходимост от идентифицирането на новихитинази за използване във фунгицидни състави и/ или за клонирането натези сДНКи или гени в транегенни растения и за оценка на податливостта 3 на посочените растения спрямо въздействието на патогени в частноствъздействие на гъби. Обект на настоящето изобретение е осигуряване на новиантипатогенни протеини, ДНК която ги кодира, а така също и растениякоито съдържайки и експресирайки такава ДНК, да придаде на растениятаредуцирана податливост спрямо атаките на патогени, в частност- гъба ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Настоящето изобретение предоставя протеин, свободен от другирастителни протеини, който притежава ендо- хитиназна активност,антигъбна активност и молекулно тегло от около 40 до 43 kDa, установенос Натриево- додецил сулфат полиакриламидна електрофореза. Предпочитанпротеин е този, който се получава от листа на TMV- индуцирани тютюневирастения. Особено предпочитан е протеина, притежаващ амино киселиннапоследователност, както е представена в SEQIDNO: 2 ИЛИ 8, или неговфрагмент, притежаващ хитиназна активност. Съгласно изобретението сапредоставени и протеини, в които една или повече амино киселини сазаместени, делетирани или добавени без загуба на хитиназна активност. Друг вариант на изобретението е фунгициден състав, включващ катоактивна съставка протеина по изобретението. Предпочитаният състав етози, който включва и други протеини, действащи в синергизъм с него върху'гъбите. Особено предпочитаните състави включват β-1, 3,- глюканаза а7 илихитиназа, за предпочитане хитиназа от клас-1, по възможност от тютюн. Друг вариант на изпълнение на изобретението е изолирана ДНКпоследователност, която включва отворена четяща рамка, кодиращапротеина съгласно изобретението, за предпочитане такава, притежаваща последователността, показана на SEQIDNO: 2 или SEQIDNO: 8, или ДНКхибридизиращи се с тях при строго определени условия. Изобретението включва също растителна експресионнарекомбинантна ДНК последователност, която съдържа ДНКпоследователност, кодираща протена съгласно изобретението, илипрекурсор на този протеин, като ДНК последователността е присъединенакъм регулаторни елементи, необходими за експресирането й в растенията соглед продуциране на посочения протеин. Предпочитаната растителнаекспресионна рекомбинантна ДНК последователност е такава, че кодирапротеинов прекурсор с амино киселинна последователност, представена наSEQIDNO: 2 или SEQIDNO: 7. Друга предочитана растителна експресионнарекомбинантна ДНК последователност е посочената на SEQIDNO: 1 илиSEQIDNO: 7. Изобретението обхваща също среда за клониране или вектор, койтосъдържа ДНК последователност съгласно изобретението, както ибактериални щамове, съдържащи среда за клониране или вектор. Освен това,осигурени са бактериални щамове от рода Agro bacterium, съдържащи вектор,подходящ за трансфер на ДНК съгласно изобретението в растителниклетки или растения. Друг вариант на изобретението предвижда растителни геноми,растителни клетки, вкючващи тези геноми и растения, регенерирани оттакива растителни клетки, които в резултат на това продуцират илисвръхпродуцират протеини съгласно изобретението. В иделания случай,експресията на ДНК кодиращи протени съгласно изобретението еоптимизирано да доведе до получаване на растения, по- малко податливи навъздействие на патогени, в частност на въздействието на болестотворнигъби. 5 По- нататък изобретението Включва растителен материал католуковици, цветове, плодове, листа, полен, корен или коренова култура,семена, стъбла или микростъбла и други, съдържащи една или повече клетки,които съдържат растителна експресионна ДНК съгласно изобретението. Освен тоВа изобретението предвижда метод за селекция на сортрастение с редуцирана ВъзприемчиВост спрямо гъбни въздействия,характеризиращ се с това, че поне една от родителските линии притежаварекомбинантен ДНК геном съгласно изобретението, а така също и метод занамаляване опасността от увреждане на растенията при условията накултивиране. Други аспекти на изобретението, различни начини наприложението му и някои преимущества са подчертани В подробното муописание. Изобретението се илюстрира със следните фигури ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ фиг. 1. Нуклеотидна последователност на Клустер- А гена ихомоложния сДНК клон. Пълната нуклеотидна и амино киселиннапоследователност на геномния Клустер- А клон са показани съответно налиния b и линия с. Над нуклеотидната последователност на линия а сапоказани само нуклеотидите, които са различни в сДНК клона. Поаналогичен начин, под Клустер- А протеиновата последователност в линияd са означени само амино киселините, които са различни в сДНКпоследователността Амино киселинната последователност, определеначрез съгласуване на протеина е подчертана Вероятният сайт наразграждане на сигналния пептид, между остатъците Ser (S) и Gin (Q) сапосочени със cmpe.vka. фиг. 2. Southern blot анализ на три клона, съдържащипоследователности, хомоложни на тютюневия Клустер- А ген. Три геномни 6 клона на тютюна (клон- 56; 59; 66) са пречистени и разградени с BamHI,Hindlll, Pstl, Sstl или Xbal, линии 1 go 5 съответно, и са подложени наелектрофореза върху 0. 8% агарозен гел Гелът е оцветен и хибридизиран сКлустер- АсДНК и промит при 65° С в 0.1 х SSPE, 0.1 % SDS. фиг. 3. Northern blot анализ на Клустер- А тРНК от тютюн приразлични форми на стрес. Еднакви количества обица РНК, изолирана от не-стресирани здрави листа на тютюн (Н) или от листа, инфектирани с TMV(Т), напръскани с ептефон (Е), наранени чрез срязване (W) или облъчени с UV-светлина (U) се хибридизират с Клустер- А сДНК сонда фиг. 4. Подравняване на Клустер- А от Nicotiana tabacum с екзо-хитинази от Bacillus circulans, Serratia marcescens, Streptomyces plicatus, Brugiamalayi (нематод) « Mus musculus (мишка/ Черните кутии показватучастъци с висока степен на идентичност съгласно множествения анализ задеспирализация no Schuler G. D. etal, 1991, Protein Struct, Funct. Genet. 9,180-190. Фиг. 5. Свръхпродукция на Cluster- А в E. coli. (А): Върху различни 12. 5% SDS- полиакриламидни гелни проби се анализират обща фракция(Т),клетъчни дебриси (D) и разтворима фракция (S). (В): Имуноблот анализ наидентичен протеинов гел със специфично откриване на Cluster- А протеини. фиг. 6. Пречистване на Клустер- А протеина от инфектирани с TMVтютюневи листа. SDS- полиакриламидният гел показва протеиновиятпрофил на различни пречистени фракции А проба от листен екстракт, откойто са отстранени солите. В: протеинов пул след S- сефарозокатийонообенна хроматография, С: протеинов пул след хелатообразуващасуперозна колона, D: пречистен Клустер- А след гел- филтрационнахроматография. Линията “Мг” показва предварително оцветени маркери смолекулни тегла както е посочено. Т фиг. 8. Локализация на Клустер- А 6 клетките. Антисерума срещуКлустер- А протеина се използва за определяне локализацията на Клустер- Ав клетките. Анализирани са здрави неинфектирани тютюневи растения.Проби от обща протеинова фракция (линия а), листна фракция безекстрацелуларна промивна течност (линия в), и EF- фракция (линия с), саразделени върху 12,5% SDS- гел и се подлагат на разслояване с електрическиток върху PVDF мембрана, и се използват за откриване на Клустер- Апротеини фиг. 8. Инхибиране на растежа Fusarium solani и синергистичнатаактивност на протеини от Клустер- А и β-1, 3- глюканазните протеини отклас I. Ефекта на Клустер- А върху растежа на гъбите in vitro се тестувачрез добавяне на Клустер- А към пре- герминативни спори от Fusarium solaniкакто самостоятелно, така и в комбинация с β-1,3- глюканази от клас I.Означени са количествата на протеините (в pg). След инкубация впродължение на три дни при 20° С, гъбният мицел се визуализира чрезоцветяване с лактоферон котон блу. фиг. 9. Схематично представяне на вектора pMOG183, производно наpMOG181, където сайта на разпознаване EcoRI е заместен със сайта SslI.Този вектор може да бъде взет от MOGEN International N. V. при поискване. фиг. 10. Схематично представяне на вектора pMOG185, производно наpMOG183, където сайта на разпознаване EcoRI е променен в сайт наразпознаване Xbal. фиг. 11. pMOG800: Подходящ бинарен вектор от опосредствана сAgrobacterium растителна трансформация, съдържаща растителенекспресионен резистентен на канамицин ген за подбор на трансформантитеи множествен сайт за инсерция на експресионни касети. ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Настоящето изобретение предоставя нови класове хитинази, коитомогат да бъдат изолирани от растения. По- специално, изобретениетопредоставя протеин с размер приблизително 40- 43 kDa от индуцирани сTMV тютюневи растения. Установено е, че този протеин е кодиран ототворена четяща рамка, която е сходна с сДНК, по- рано наричана Клустер-А (Hooft van Huijsduijnen R. A. M. et al, The EMBO Journal 5 (9), 2057- 2061). Bтази публикация са описани шест клустера от тРНК (A go F), които саTMV- и салицилат- индуцируеми в тютюн. Авторите охарактеризираттези тРНК от шестте клустера чрез подбрани с хибридизация in vitroтранслации Транслационните продукти на подбраните чрез хибридизациятРНК, съответстващи на най- големия Клустер- А сДНК клон продуцираткомплекс от образци на протеини от 40.35,31,28 и 25 kDa съответно (вижлиния 6, фиг. 3 на Hooft van Iluijsduijen etal, n- горе). Действителниятпротеин, продуциран от тази сДНК последователност никога не е билопределен. Ншпо един от протеиновите фрагменти не е бил пречистен, нитоструктурата на който и да е от тези фрагменти е бича определена. Не еизвестна също и физиологичната активност на нито един от тезипротеинови фрагменти Съгласно настоящето изобретение, протеинът съответстващ натази клустер- А сДНК се пречиства до хомогенност от TMV- индуциранитютюневи листа с помощта на антисерум. Антисерумът се създава срещупречистен протеин, продуциран в Е. сой, трансформиран с сДНК клон оттютюн, хибридизиран с PROB40. Клонът PROB40 е известен че влиза вкръстосана хибридизация с клустер- А сДНК (Hoof van Huijsduinen et al. по-горе). 9 С помощта на този антисерум в процеса на идентификация ипречистване, клустер- А протеинът може да бъде изолиран от инфектиранис TMV тютюневи листа в достатъчно количество за изучаване на неговатафизиологична и антипатогенна активност. Частичната аминокисслиннапоследователност на изолираният протеин е получена при съгласуване напречистения протеин от тютюн; тя е изцяло идентична с аминокиселинната последователност, изведена от сДНК (фиг. 1). Установено е, че клустер- А протеинът притежава ниска хитиназнаактивност върху белязан с тритий хшпин като субстрат, около 250- 500пъти по- ниска от хитиназите от клас I от тютюн. Обаче, при тестуване сколориметрична проба върху разтворим хитинов субстрат е установено, чеактивността му е двукратно по- висока от тази на хитиназите от клас I.Не е установена екзохитиназна активност или лизозимна активност. Най-общо, закючението е че клустер- А представя една ендохитиназа, но съссвойства, различни на присъщите за клас I ендохитинази. Заключава се, чеклустер- А е първият член на един изцяло нов клас хитинази в растенията.Установено е също, че клустер- А протеинът е локализиран интрацелуларно. Клустер- А протеинът проявява антигъбна активност в in vitroизследване срещу гъбата Trichoderma viride. В комбинация с β-1,3- глюканази,тази активност се повишава синергистично, както може да се закючи почувствителността на множество подложени на изпитване гъби.Инхибирането едновременно на лизиса и растежа може да бъде установеновърху Fusarium solani и AUemaria radicuia при използване на комбинацията затестуване клустер- А плюс (3-1,3- глюканаза. сДНК, получена след скрининг на сДНК библиотека с PROB40 се използва като сонда за скрининг на геномна библиотека за изолиране на гена, кодиращ Клустер- А протеина. Охарактеризиран е един хибридизационен 1 о

кодиращ Клустер- А протеина Охарактеризиран е един хибридизационенклон и е определена неговата нуклеотидна последователност. Пълнатапоследователност на клустер- А гена, като част от промоторния участък, епосочена на фиг. 1. (SEQIDNO: 7). Анализът на изведената амино киселиннапоследователност показва, че клустер- А протеинът е вероятно продуциранкато по- голям прекурсор, на който сигналният пептид е изрязан:предполагаемото място на срязване е означено със стрелка. Анализът поSouthern (фиг. 2) показва че клустер- А генът е част от малко генносемейство, състоящо се от 4 гена. Тази нова хитиназа, наричана от тук нататък Клустер- А протеин,може удачно да бъде използвана като активен инградиент в антипатогенни,по- специално фунгицидни състави, за предпочитане в комбинация с другипротеини, с които действа 8 синергизъм, например β-1,3- глюканази.Подходящите концентрации на Клустер- А протеина са от около 0.01 pg/mlдо около 100 pg/ml, за предпочитане от около 0. 1 ug,m] до около 10 pg/ml.Фунгицидните състави съгласно изобретението може да бъдат прилагани вселското стопанство за борба с фитопатогенни гъби в най- широк смисъл;примери за това са приложенията в растениевъдството, лесовъдството,художественото градинарство, домашното градинарство, растителнитекултури и други подобни. Аналогично, фунгицидният ефект на Клустер- Апротеина може да бъде приложим и в други индустриални области катонапример консервиране на напитки, храни, козметични средства и др. По- нататък, ДНК кодираща Клустер- А протеина, независимо дали есДНК или геномна последователност, може да бъде клонирана задрегулаторните последователности, необходими за експресия на ДНК врастенията, с оглед продуцираяе или свръхпродуциране на Клустерния- А 11 протеин в растения, трансформирани с посочената ДПК. Необходимитерегулаторни елементи включват поне транскрибционен иницииращ участъки транскрибционен иницииращ участък, функционален в растения.Регулаторните последователности могат да включват и допълнителниелементи като енхансери за промотиране на транскрибцията. Енхансеритемогат да повишават експресията по конститутивен начин или по тъканно-специфичен или еволюционен или регулиран от условията на околната среданачин. Предпочитан начин за експресия съгласно изобретението е посъщество регулативно конститутивна експресия, за предпочитане привисоки нива (за целите на това изобретение около 0. 1% от разтворимияпротеин в листата се отнася като относително високо експресионно ниво).С относително конститутивен образец на експресия се означава образец,който не е драстично регулиран съобразно стадия на развитие нарастението и който не е тъканно- специфичен. Промотор, който най- общосе счита от специалистите в областта като относително конститутивени не регулиран драстично съобразно стадия на развитие, е промоторътCaMV 35S. Предпочитана версия на такъв промотор съдържа таканареченият двоен енхансер. Други регулативно конститутивни промотори,които са подходящи за приложение по контекста на настоящетоизобретение, могат да бъдат получени от растителни вируси (напр. CaMV19S промотор, промотора на Kigwort Mosaic Virus и др.), а така също и отрастителни гени. Относително конститутивни промотори са същоизвличаните от Т- ДПК. участъка на Ti- и Ri- плазмиди от Agrobactetium.независимо дали фланкирани или не от транскрибционни фланкиращипоследователности. Известно е от литературата, че последователносттамежду - 343 и - 90 от CaMV 35S промотора повишава активността на

CaMV 35S промотора (Kay R. et al (1987), Science 236, 1299-1302) u вероятнона други конститутивни промотори (напр. манопин синтазен промотор: USPatent 5 106 739). Примери за слабо индуктивни промотори с високо ниво на експресия самалката субединица нарибулозо карбоксилазния промотор (rbcSSL1) ихлорофил а/Ь свързващия протеин промотор (Cab), които могат да бъдатприлагани съвместно съгласно настоящето изобретение. Желателно е известно ограничаваше на експресията на въведенитехимерни гени за един или няколко предварително подбрани органи или тъканинапример тези, които са мишена за гъбна атака, например корени,епидермални клетки и др. Добре известен пример за тъкано- специфиченпромотор е например пататиновия промотор от клас II. Могат да бъдатизползвани и специфични за корените промотори Подходящите промоториза приложение в метода съгласно изобретението могат да бъдат и такива,индуцирани при нараняване. Изобретението обхваща също приложението на хибридни промотори.т. е. промотори, които включват елементи получени от регулаторни елементи на различни гени. Растителните експрееионни гени обикновено обхващат таканаречените терминаторни последователности, включващи сигнал заполиаденилация. Възможно е също да се използва терминатора съгласноизобретението. Думата “ген” както е използвана тук има смисъла да включва сДИК. атака също и транскрибиран участък на геномна последователност, коятоможе да бъде както синтетична, така и частично синтетична По желание. използването на кодона може да бъде изменено в напр. монокотиледоновирастителни гостоприсмници, или в гостоприсмници. различни от растение. “Растителен ген за експресия” означава ДНК последователност, коятое оперативно свързана към регулаторни последователности, необходими затранскрибция в растителна клетка и която продуцира РНК, при чиятотранскрибция, след съответния процес, може да се транслира в протеин.Генът е “растителен експресионен” ако е експресиран в поне една тъкан ведна определена фаза на жизнения цикъл на растението. Генът се счита зарастителен експресионен дори ако не е експресиран при всички възрасти наразвитие или само след индукция с по същество вътрешни или външнистимули “Растителна рекомбинантна експресионна ДНК последователност”съгласно изобретението означава такава, която включва която и да епоследователност, която комбинира поне две последователности, които неса асоциирани в природата. Например растителна експресионнарекомбинантна ДНК може да обхваща гени, които включват комбинации отфункционални участъци на еукариотни гени като енхансери,транскрибционно/ транслационни иницииращи участъци, участъци закодиране, не- транслационни лидери, сигнални последователности, вакуоларнимишенни последоватлности, терминаторни последователности, интрони,екзони и др. такива или техни части. Всяко делетиране, добавяне илизаместване на един от тези елементи, водещо до определено ниво наекспресия или образец, различен от ситуацията 6 природата, е разгледано внастоящето изобретение. Модификацията не е задължително да доведе доповишаване нивата на експресия. Настоящето изобретение напримерразглежда срязването на С- крайната част от протеина съгласноизобретението с оглед пренасочване акумулирането му към апопластичното(екстрацелуларно) простанство, което може да бъде предпочитаналокализация за един антипатогенен протеин. Модификации като това 14 срязване може да бъдат самото модифициране на гена, оставящо спомена заотворената четяща рамка, като другите последователности коитодетерминират неговото функциониране (като промотора, терминатора,интроните и екзоните и др.), вече водят до ДНК, кодираща протенисъгласно изобретението под определението за растителна експресионнарекомбинантна ДНК. Като ефективно място за действие на антигъбните протеини призащитата на трансформирани растения срещу растителни патогенни гъбисе счита апопластичното пространство. Следователно, растението можеда бъде трансформирано с рекомбинантна ДНК структура, кодиращарастителен ген за експресия съгласно изобретението, която определядействието й 6 апопластичното пространство на растението или поестествен път или посредством генетична модификация. Гените, кодиращи протеини, които естествено се срещат въввакуолата на растителната клетка са така модифицирани, че С- крайнитеамино киселини, включени във вакуоларната мишена не са представени втранслационния продукт (напр. чрез въвеждане на транслационен стоп кодонв С- края на кодиращия учястък на гена, или по друг начин). Ефекта от товасрязване е насочването на вакуоларния протеин към апопластичнотопространство (за подробности от методиката виж ЕР 440 304 А1). Всяка от отбелязаните по- горе манипулации са добре познати наспециалиста в областта и ефекта им върху нивото на експресия,насочването и устойчивостта на заболявалия могат да бъдат правилнооценени с помощта на стандартни техники. Най- общо, трансформираните растения се оценяват за наличието нажелани свойства Щ или разширяването на които желани свойства еекспресирано. Първата оценка може да включва нивото на експресия на 15 нововъведени гени, нивото на устойчивостта на трансформираните растения спрямо гъби, стабилно онаследяване на желаните свойства, изпитания на полето и др. Второ, по желание, трансформираните растения могат да бъдаткръстосвани с други сортове, например сортове с по- висока търговскастойност или сортове в които вече са въведени други желанихарактеристики, или са използвани за развиване на хибридни семена, или дабъдат субект на друг начин на трансформация и т. н. Комбинирането на Клустер- А протеина с тютюневата β-1,3-глюканаза предизвиква синергичен фунгициден ефект ш vitro. Аналогично натова, синергитичен фунгициден ефект се очаква когато и двата протеина сепродуцират или суперпродуцират in planter Това следва от факта, че когатокомбинациите от хитинази и глюканази довеждат до синергитичен ефект тvitro, те правят това и in vivo (ЕР 440 304 Al). Примери за протеини, които могат да бъдат използвани в комбинациис ашпигъбни протеини съгласно изобретението включват, но не сеограничават до, β-1,3- глюканази и други хитинази като тези, получени отечемик (SwegleM. etal, 1989, Plant Mol. Biol. 12, 403- 412; Balance G. M. etal.1976.Can. J. Plant Sci 56, 459- 466; Hoj P. B. et al, 1988, FEBS Lett. 230, 67- 71; Hoj P. B.et at, 1989, Plant Mol. Biol 13,31- 42,1989), боб (Bolter T. etal, 1983, Planta 157, 22-31; Broglie K. E. et al, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83, 6820- 6824; Vegeli U. et at,1988 Planta 174, 364- 372); Maych F. & Staehelm L. A., 1989, Plant Cell 1, 447- 457);краставица (MetrauxJ. P.& Boiler T. (1986), Physiol. Mol, Plant Pathol. 28, 161-169); праз- лук (Spanu P. etal, 1989, Planta 177, 447- 455); царевица (Hasser W, etal, 1988, Plant Mol, Biol. 11,529- 538}; овес (Fink W. et al, 1988, Plant Physiol. 88,270- 275); грах (Mauch F. et al, 1984, Plant Physiol, 76, 607- 611; Mauch F. et al, 1988,Plant Physiol. 87, 325- 333); топола ( Parsons, T, J. et al, 1989, P. N. A. S. 86, 7895- 16 7899), картофи (Gaynor J. J. 1988, Nucl. Acids Res. 16, 5210; KombrinkE. etal, 1988,Proc. Natl. Acad. Sci USA 85, 782- 786; Laflamme D. and Roxby R., 1989, Plant Mol.Biol. 13,249- 250), тютюн (напр. Legrand M. et al 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA84, 6750- 6754; Shinshi H. et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 89- 93), домати(Joosten Μ. H. A. & De Wit P. J. G. M. 1989, Plant Rhysiol. 89, 945- 951), пшеница(Molano J. et al, 1979, J. Biol. Chem. 254, 4901- 4907) u gp. Клонирането на растителни гени, съответстващи на протеини, коитоудачно могат да бъдат използвани в комбинация с гените, кодиращиантигъбни протеини съгласно изобретението и супер- експресията на такивагени в трансгенни растения, както и манипулирането на експресията(включително бомбардирането) и преценяването на устойчивостта спрямоболести in planta е във възможностите на специалиста в областта, кактотова е посочено inter alia в заявка за Европейски патент N 0 440 304 А1 изаявка за Европейски патент 0 460 753 А2. Двете заявки са включени влитературната справка. Трансгенните растения, които носят повече от един химеренантигъбен ген може да бъде получен по различни методи, включителноследните: A. използването на един рекомбинантен полинуклеотиу, напр. плазмид,с множество хмодифицирани гени, присъединени към един селекционенмаркерен ген по физичен начин. B. Кръстосано опрашване на трансгенни растения, които са вечеспособни да експресират един или повече химерни гени, присъединени към ген,кодиращ селективен маркер, с полен от транегенно растение, което съдържаедна или повече генни структури, присъединени към друг селективен маркер.След това семената, получени чрез това кръстосване, се подбират на базата 17 на наличието на два маркера. Растенията, получени от подбраните семенаслед това могат да бъдат използвани за по- нататъшно кръстосване. C. Приложение на множество различни рекомбинантниполинуклеотиди, напр. плазмиди, всеки от които притежава един или повечехимерни гени и един друг селективен маркер. Ако честотата на ко-трансформацията е висока, тогава подбора на базата само на един маркер едостатъчен. В други случаи се предпочита подбора да бъде осъществен набазата на повече от един маркер. D. Последователно трансфорамция на трансгенни растения с нови,допълнителни химерни гени и селективни маркерни гени. E. Комбинации от отбелязаните по- горе техники. Съгласно изобретението, може да бъде предложен какъвто и да ерастителен сорт, обект на някаква форма на гъбна атака. И съобразно стова всяко растение, подложена на гъбното въздействие може да бъдетретирано със състав, включващ антигъбен протеин съгласноизобретението. Така, “растения” за целите на това изобретение ще означавагимносперми, а също и ангиосперми, дикотиледонови, а също имонокотиледонови растения, независимо дали са използвани в селскотостопанство, растениевъдството, лесовъдство, градинарство или която и дае друга форма на използване на растенията, независимо дали за директноизползване като храна или фураж, или за по- нататъшно използване в който ида е вид на индустрията, за екстракция на вещества, за декоративни нужди,размножаване, кръстосване или други цели. По принцип може да лъде използван който и да е метод затрансформация за включване на растителен експресионен ген съгласноизобретението в избраните сортове растения. Най- общо се използва

1S калциум/ полиетилен гликоловият метод за протопласти (Krens, F. A. etal,1982, Nature 296, 72- 74; Negrutiu I. et al, June 1987, Plant Mol. Biol. 8,363- 373),електропорация на протопласти (ShUlito R. D. et al, 1985 Bio/ Technol. 3,1099-1102), микроинжектиране в растителен материал (Crossway A. etal 1986, MolGen. Genet. 202,179- 185), частично бомбардиране на различни растителниматериали (Klein Т. М. et al 1987, Nature 327, 70), инфектиране с вируси и др. В предпочитан вариант на изобретението, приложението еосъществено чрез Agrobacterium- медиирав ДНК трансфер. Специално сепредпочита така наречената бинарна векторна технология, както е описанав ЕР- А 120 516 и US патент 4 940 838, Най- общо, след трансформация растителните клетки или сксплантисе селекционират по наличие на един или повече маркери, които са кодираниот растителни гени на експресия, трансферирани заедно с растителния генна експресия съгласно изобретението, при което трансормираниятматериал се регенерира в цяло растение. Макар монокотиледоновите растения да се считат за неподатливи нагенетична трансформация, те все пак е възможно да бъдаттрансформирани и да бъдат регенерирани фертилни трансгенни растенияот трансформирани клетки или протопласти. По настоящем предпочитаниметоди за трансформация на монокотиледонови са микроинжекционнобомбардиране на експланти или суспенсия от клетки, и директно взимане наДНК или електропорация (Shimamoto et al, 1989, Nature 338, 274- 276).Трансгенни царевични растения са получени чрез въвеждане на bar-ген отStreptomyces hygroscopic us, който кодирафосфинотрицин ацетилтрансфераза(ензим, който инактивира хербицида фосфинотрицин), в ембриогенни клеткина царевична суспенсионна култура чрез миероинжекционно бомбардиране 19 (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, 2,603- 618). Докладвано е за въвеждане нагенетичен материал в алеуронови протопласти на други монокотиледоновизърнени растения като пшеница и ечемик (Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13,21- 30).Регенерирани са пшенични растения от ембриогенна суспенсионна културачрез подбор само на възрастни компактни и възлести ембриогенни калуснитъкани за получаване на ембриогенни суспенсионни култури (Vasil, 1990Bio/Technol. 8,429- 434).Комбинирането с трансформационни системи затези зърнени култури позволява прилагането на настоящето изобретение икъм монокотиледонови растения. Монокотиледоновите растения, включително търговски важнитезърнени като пшеница и ориз са податливи на трансформация с щамове наAgrobacterium (Gould J, Michael D, Hasegawa O, Ulian EC, Peterson G, Smith R1T(1991) Plant Phisiol. 95, 426- 434) Hiei Y et al. (1994) Plant Journal 6, in press.) Растения и растителни части, продуциращи или супер- продуциращинови хитинази съгласно изобретението, както самостоятелно, така и вкомбинация с други антигъбни гени, или гени кодиращи протеини, коитоработят синергистично с хитиназите съгласно изобретението, могат дабъдат прилагани за ецинка на устойчивостта спрямо патогенни агенти, вчастност устойчивост срещу болестотворни гъби Съответно, могат дабъдат използвани по- устойчиви линии в селекционните програми заполучаване на търговски сортове растения с повишена устойчивост напатогенни агенти, в частност болестотворни гъби. Растенията с намалена чувствителност спрямо патогенни агенти илигъбни атаки, могат да бъдат използвани на полето или в парниците, исъответно могат да бъдат използвани за храна на животните , за(директна) консумация от хора, за продължително съхранение, захранителната и други индустриални промишлености и др. Преимуществата 20 на растенията, или техните части, съгласно изобретението са, че последните по- малко се нуждаят от фунгицидно третиране, означават по- ниски цени за материали, труд и по- слабо замърсяване на околната среда, както и удължен срок за съхранение на продуктите (плодове, семена и др.) на такива растения. Нещо повече, загубите при събиране на реколтата могат да бъдатредуцирани благодарение на присъствието на повишени нива отхитиназатасъгласно изобретението. Могат да изникнат и други преимущества на изобретението заспециалиста в областта, при което те да не излизат от обхавата наизобретението. Изложените по- долу Примери служат за подробна илюстрация наизобретението и тези примери или каквото и да е твърдение, направено втях, не могат да служат за ограничаване обхвата на изобретението. ИзолираненаеДНК, съответстваща на Клустер- АДокладвано е, че Клустерна- А тРНК е силно индуцирана след I'MV- инфекция с Nicotiana tabacum cv. Samsun NN ( Hooft van Huijsduijnen et al, 1986, no- горе) Скрининга на ламбда сДНК библиотека (виж Експерименталнатачаст) от TMV- инфектирани тютюневи растения Samsun NN със сонда,получена от PROB40 (частичен Клустерен- А сДНК клон) води до изолиранена 11 позитивно хибридизиращи се клона Анализът с рестрикционни ензими и(частичен) секвенционсн анализ показва, че всички клонове са идентични.Заключено с, че клоновете съответстват на Клустерна- А сДНК.Определена е нуклеотидната последователност на един от тези клонове 21 (сА- 3) (експериментална част) и е показана на SEQIDNO: 1 и 2. В този клонлипсват 7 кодона от 5? частта на отворената четяща рамка. ПРИМЕР 2 Клониране насДНК клон в бактериален експресионен вектор Клонът сДНК е окомплектован чрез провеждане на PCR реакция(Експериментална част) върху клон сА- 3 със следният праймер Т7: 5'- AATACGACTCACTATAG- (SEQIDNO: 3) и праймер pi:5’GITrCCTTCTCCATGGAACTAGTITGCAC ( SEQIDNO: 4). След разграждане на PCR- амплифицирания продукт с рестрикционните ензими Ncol и Xhoi, електрофореза и изолиране нафрагмента от агарозния гел, последният се прикрепва към междинния,разграден с Ncol/ Xhoi вектор pGV84, последвано от транформация с Е. coliDHScu фрагмента Ncol/ Xhoi от позитивните клонове, получени в резултатот тази трансформация в последствие се прикрепя към разграден с Ncol/ Sailбактериален експресионен вектор (pJLA6Q2, Medac, Hamburg, Germany) и сеизползва за трансформиране на DHSa от Е. coli. Позитивнитетрансформанти се скринират чрез хибридизация към белязания клон сА- 3 иприсъствието на правилния размер и ориентация на инсерта се определя чрезрестрикционен анализ. Полученият в резултат плазмид, pJLA- Л53 съдържавероятната Клустер- А отворена четяща рамка (ORF), включителнокодоните 20- 377, надолу от тандемната организация на репресивните р s ир£ промотори на фага ламбда и на високо ефективният транслационенучастък на Е. coli. Накрая, плазмид ът pJLA- <\53 се използва затрансформиране на Е. coli, щам КЛ1092 (trp65. Ion, sFiA-1, malB) (Johnson, B. F. et al, 1977, Mol, Gen, Genet. 157, 91- 97) [protease } Този щам се използва за получаване на Клустер- А протеин и за генериране на антитела. Щам КА1092, приютяващ pJLA- А53 е депозиран в Centraal Bureau voor

Schimmelcultures, 12. 08.1993, nog номер CSB 415. 93). ПРИМЕР 3 Експресия на Кдустерна - А сДНК 6 Е, coli и продуииране на антитела срещувероятният С1и- А протеин Клустерният- А сДНК ген, кодони 20 - 377 е поставен под контрола наламбдарл и р£ промотори (Schaulder В. et al., 1987, Gene 56,279- 283), застерекспресия на гена в Е. coli. На фиг. 5 е показана суперпродукция навероятния 40 kDa клустер- А протеин в щам КА1092 на Е. coli. Следразрушаване на клетките с ултразвук, агрегатите на клустер- А протеина сеизолира чрез центрофугиране с клетъчните дебриси (фигура 5, линия D),Експресията на вероятния Клустер- А сДНК ген е индуцирана чрезстимулиране растежа на културите за 3 часа при от 30°С до 45°С във воднабаня и инкубиране за още 3 часа. Бактериите се събират црезцентрофугиране и се разтварят в 1/25 обема буфер ( 25 тМ Tris, 192 тМглицин, 6 М пикочна киселина, 2,5 % SDS, 10% глицерол, 5% β- меркапто-етанол). Вероятният Клустер- А протеин, продуциран в Е, coli се пречистваи се използва за получаване на антитела (Експериментална част). фигура 5 показва Westwm blot анализа на сходни протеинови фракции,посочени на фиг. 5 и демонстрира факта, че изолираните протеини саспецифично насочени срещу вероятният Клустер- А протеин. Силен сигнал заКлустер- А протеина е намерен в общата фракция (линия Т) и фракцията наклетъчните дебриси (линия D) от индуцирани клетки на Е. coli, коитосъдържат Клустер- Л експресионната структура. Слабият сигнал намерен в линия S показва, че в разтворимата протеинова фракция е налице малкоколичество от Клустер- А протеина. След нагряване за 3 мин при 100°С, пробите се подлагат наелектрофореза върху SDS- полиакриламиден гел (Експериментална част) ипротеините се визуализират чрез оцветяване с Coomassie Brilliant Blue.Сходни гелове се оцветяват с леден 1М KCL и областите от гела,съдържащи суперпродуцирани 40 kDa протеини се изрязват. След промиване свода, акриламида се грундира и смесва с пълна имунизационна среда на Freundи суспенсия с около 200 ng вероятен Клустер- А се инжектира субкутанно(подкожно) на зайци След три допълнителни имунизации в интервали от подве седмици със сходни суспенсии в непълна среда на Freund, от зайците сесъбира по 50 ml кръв и серумните фракции се тестуват за антитела,насочени срещу вероятният Клустер- А протеин. ПЕИМЕР4 Пречистването на вероятния Клустер- А протеин от TMV-инфектирани тютюневи листа (Експериментална част) се наблюдават чрезимунодетекция с помощта на антисерум, получен съгласно Пример 3. Вероятният Клустер- А протеин очевидно се абсорбира къмкатийонообменника S- сефароза, показвайки базичната природа на протеина.Не са наблюдавани къстосано- свързващи се протеини при преминаването импрез S- еефарозната колона. Вероятният Клустер- А протеин се елуира от S-сефарозната колона в присъствието на 75 до 140 тМ NaCl. По- детайлнотоизследване на SDS- полиакриламидните гелове и имуноразслояваниятапоказват, че два протеина с почти еднакво молекулно тегла (41 kDa и 43kDa) •'а показваш кръстосана реакция спрямо антисерума. Очевидно, двата протеинаса свързани. Наличието на потенциални места за аликозилация в сДНКпоследователността (3 потенциални места за аликозилация) и в йДНКпоследователността (4 потенциални места за аликозилация) ни подсказа даизследваме свързването на предполагаемия Клустер- А протеин към Con- АСефароза. Поради това, протеините се подлагат на диализа срещу 50 тМTris, HCL, pH 6. 8, съдържащ 1.15 NaCl и се оставя за абсорбиране към Соп-А ф сефароза Повечето от 41 кОа Клустер- А протеин преминава през Con- Аколоната, докато сред свързаните протеини присъства предполагаемия 43kDa Клустер- А протеин, показвайки че този по- късен протеин е понечастично гликозилиран. Соп- А Сефароза не е прилагана при пречистванетона вероятния Клустер- А протеин. Вместо това е използвана хелатнаСефарозна хроматография. фракциите, съдържащи предполагаемия Клустер-А протеин, елуиран от S- сефарозната колона се диализират срещу 50 тМTris, Hcl буфер pH 8л 0, съдържащ 150 тМ NaCI и се оставят за абсорбиранесрещу хелатираща Сефарозна колона, активирана с ZnJ+ йони и сееквилибрират В горния буфер. Около 20% от общото количество на О протеина се задържа от активирания матрикс и показва че се състои предимно от Клустер- А протеин. Повторното прекарване през хелатиращаСефарозна колона довежда до получаване на почти чист протеин (фигура 5,линия D). Предполагаемия Клустер- А протеин се пречиства до хомогенностс последваща гелфилтрационна хроматография. Молекулното му тегло емежду около 40 и 43 kDa. ПРИМЕР 5. Уточнябане амино киселинната последователност на предполагаемияКдаперхАдетеин Смес от двата Клустер- А протеина - 41 kDA и 43 kDa се разделявърху 12л 5% SDS- полиакриламиден гел и се (оцветява електронно) срещуPVDF мембрана. Сместа след това се използва за определяне на N- крайнатаамино киселинна последователност чрез разграждане no Edman(Експериментахна част). Обаче N- краят бе блокиран, поради което не беполучена информация за последователността Присъствието на уникаленсайт, подходящ за кисела хидролиза ни позволи да определим една междиннапоследователност от същия материал : Р- V- N- Η- XI- S- G- S- D- Х2-1- N- А- ХЗ-1- Q (SEQID NO: 4).

Xl= V/I, Х2= G, Х3= W. Амино киселината, предшевстваща тази последователност е най-вероятно един Asp (D) остатък, доколкото използваното разграждане еспецифично за .Asp- Pro (London 1977, sub). Допълнителна секвснционнаинформация е поручена след разграждане на предполагаемия Клустер- Апротеин с хидроксиламин. То довежда до формирането на два пептида сприблизително еднакво молекулно тегло, които са попити заедно върхуPVDF мембраната Секвенирането на тази проба показва следнитепоследователности: G- L- N- Y- Р- V- Е- S- V- A- R- N- L- N- W (SEQID NO: 5) и:

S- H-A-Q-L-F-D- P-V-N- H-X-S-G-S- D-G-I-N-A-W-1- Q-A-G-V (SEQID NO: 6), къдсто X = I/V. Тези пептидни последователности показват пълна идентичност самино киселинната последователност, предположена от сДНК клона(фигура 1; SEQIDNO: 1 и 2). Това може да се заключи от онези сходни данни,по които двата протеина, пречистени от тютюн кореспондират спротеина, продуциран от Е. coli КА 1092, трансформирани с частичнияКлустер- A ORF. Пептидната последователност, съответстваща напозиция 233 на кодона, показва че дВете амино киселини (V/Ι) присъстват втази позиция в съотношение 1:1. Възможно е да са пречистени два силноидентични Клустер- А протеина да са пречистени и да се отличават по еднаамино киселинна позиция в съгласувания участък. Сравняването на Клустер- А протеина със сходните протеини вбазата данни показва хомология с бактериалните хитинази Chi А и ChiB отBacillus circulans и Serratia marcescens, съответно. Макар общатаидентичност на Клустер- A с Chi- А (31%) и ChiB (26%) да е ниска,специфични участъци са високо съхранени в рамките на всичките три аминокиселинни последователности, както е показано на фигура 4. В допълнение еустановена хомология с хитинази от Streptomyces plicatus, Brugia malayi(нематоди) и със секреторен протеин от Mus musculus (Murinae). Не еустановена структурна хомоложност с четирите отчетливи класарастителни хитинази ( Lawton К. el at, 1992, Plant Mol Biol. 19, 735- 743; Collingc,1993, no- горе). J. / ПЕИМЕЕб Ензимни активности и локализация на Клустер - А 6 клетката Хомоложността на Клустер- А протеина от тютюн с бактериалнитехитинази предполага, че този протеин е вероятно способен да катализирахидролизата на хитин, α-1,4- свързан полимер от Ν- ацетил- D- глюкозамин.Възможността за пречистване на Клустер- А протеина от тютюневматериал с помощта на антитяло ни позволи да изпробваме тази хипотеза,Клустер- А бе тестуван за хитиназна активност. В една ендо- хитиназнапроба, с помощта на белязан с тритий хитин като субстрат (Molatto J. et at,1977, Anal. Biochetn. S3, 648- 656}, Клустер- А протеина показва специфичнаактивност от 40 ± б ерт за gg протеин, която е около 250 до 500 пъти по-ниска от специфичните активности на клас-1 хитиназите (Legrand М. et al,1987, Proc. Natl. Acad. ScL USA 84, 6750- 6754; Sela- Buarlage Μ. B. et al, 1993, PlantPhysiol. 101, 857- 863). Ho измерената c колориметрична проба хитиназнаактивност на Клустер- А с помощта на разтворим хитин оцветяващсубстрат (Wirth and Wolf, 1990, J. Microbiol. Methd. 12,197- 205), бе двукратноno- висока от тази на хитиназа от Клас -1 (Таблица 1). Изпитването наКлустер- А за допълнителна ензимна активност показа, че този протеин непритежава екзо- хитиназна активност, хитобиазна, β-1, 3- алюканазна илилизозимна активност. Локализацията на Клустер- А в клетката бе анализирано с помощтана различни фракции от листа на TMV инфектирани тютюневи растения,включително (а) обща листна фаркция, (Ь) листен материал от който еотстранен екстрацелуларната течност (EF) и (с) EF фракцията. .Анализътno Westwrn показва, че Клустер- А протеините са локализирани предимноекстрацелуларно. както е показано на фигура 6. Силен сигнал за Клустер- А

2S протеин е намерен Във фракция - а и въб фракция - Ь. В екстрацелуларната течност на инфектираните с TMV инфектирани листа не са намерени Клустер- А протеини (фракция - с). Таблица 1, Хитиназни актц6шстц.на.Клустер- А протеини

Hi; PR- За (PR Р) 1180 ± 57 cpm 36, 2 ± 1. 10 ODe PR-3b (PR Q) 1087 ± 35 cpm 30. 9 ± 1.90 ODe 32 kDA (Chi-1) 11471 ± 347 cpm 1. 0 ± 0. 03 ODe Клустер- A 40 ± 6 cpm 2. 1 ± 0. 03 ODe екзохитиназа # 746 ± 60 cpm 7. 0 ± 0. 34 ODe СМ-хшпин, карбоксиметил- хитин, свързан с Remazol Brilliant Violet&amp; Белязан с триший хитиноВ субстрат ( Molano et al, 1977). $ р- нитрофенил освобождаваща проба, субстрат р- нитрофенил хитобиоза(Roberts and Seiitrennikoff, 1988). # екзохитиназа от S. griseus (Sigma С-1650). П£ИМЕР_7 В по- ранни доклади е показано, че хитиназите от клас -1 ( Chi-1) и β- 1. 3- алюканазите (Giu-1) могат да инхибират растежа на гъбите in vitro(Maitck et al, 1988; Sela- Buurlage et al, 1993). Двата хидролитични ензимаиграят важна роля в защитните механизми на растенията срещу гъбниинвазии. Антигъбната активност на Клустер- А е изследвана чрез изпитване на активността на лизиране на този протеин самостоятелно или 6комбинация с Chi-1 и Glu-1 върху различни гъби Клустер- А протеинасамостоятелно причинява лизис и инхибиране на растежа на Trichodermaviride при концентрация 12 pg/ml. Върху фитопатогенната гъба Altemariaradicina Клустер- А протеина инхибира растежа на гъбата при 30 до 60 pg/ml.Дори при високи концентрации (600 pg/ml) не е установено въздействие върхуFusarium solani. Но Клустер- А протеина проявява потенциален фунгициденефект върху F. solani в синергизъм с клас-1 β~ 1, 3- глюканазни (и хитиназнипротеини). Синергистичното действие на тези протеини причинява кактолизис на прегерминативни спори, така и инхибиране на F. solani, виж фиг. 7.Клустер-1 протеина не проявява въздействие върху фитопатогенните гъбиSeptoria lycopersici и Phytophthora infestans ( данни не са приведени). Таблица 2; Лнтигъбна активност на Клустер- А протеина Лизисяа активност на Клустер- А протеина върху Fusarium solani и jradicina Клустер- A Chi- I Fusarium solani Glu-1 Chi-1 Altemaria radicina Glu-1 pg/кладенче 0 0. 1 0. 5 0. 1 0.5 LI (L5 0. 1 0.5 0 0 0 0 5 56 0 0 42 54 7 0 0 0 26 96 0 0 45 34 5 0 0 5 34 95 0 0 45 38 10 0 0 5 95 95 0 0 35 30 10 den. 0 — - . . 30 изразена 6 % лизис и инхибиране на растежа (GI). Таблица 3ι

Fusarium solani Altemaria radicina протеин добавен пр. % GI % GI ug/кладенче лизис лизис Клустер-А 5-10 0% 0 ND 4 Клустер-А 100 0% 0 ND ND Глюканаза 0.1 0% 0 ND ND Клу-А+Гл. 10 :0.1 0% 2-3 ND ND Хитиназа 0. 1 0% 0 ND ND Клустер- А 10 :0. 1 5% 1 ND ND +Хитин. Данни за денатурирани контролни проби са дадени в скоби, но само вслучай когато те се отличават от 0% лизис и/ или Gi= 0. ПРИМЕР8 Геномна библиотека от Nicotiana tabacum е скринирана с помощта наКлустер- А сДНК инсерт на клона сА като сонда. Пречистени са трирекомбинантни ламбда фаги. всеки от които съдържащ различнирестрикционни фрагменти хибридизиращи се към Клустер- А сДПК.Геномнинт Клустер- А хомолог на сА се амплифицира чрез полимеразна 51 верижна реакция с помощта на специфични олиаонуклеотидни праймери,съответстващи на 5’ крайния кодиращ участък LS42: 5’-TCTCCGGCAACTAGTTTGCAC-3’ (SEQIDNO: 10)и 3’ крайния, не- кодиращ участък на Клустер- А сДНК LS42: 5'- GTCATAGTTCACATATCrGTTGCC- 3' (SEQIDNO: 11). ф Само един от трите фага показва особено силна амплификация на специфичните последователности с тези праймери, поради което е подбранза по- нататъшни анализи. Пълната нуклеотидна последователност наКлустер- А сДНК, включваща изведената първична структура на Клустср-А протеина и последователностите от 5’- фланкиращите и 3’ - фланкиращите участъци на гена, са показани на SEQIDNO: 7 и 8.Сравняването на сДНК участъка с Клустер- А гена показа, че тезипоследователности споделят висока степен на идентичност (94%). Врамките на 5' крайния участък е намерен един мотив “САЛТ” (позиция 391)и един “ТАТААТ” мотив (позиция 428). В 3’ крайния не- кодиращ участък е ф установен потенциален сигнал за полиаденилация (5^ DDJDDD-3’) припозиция 2971. Кодиращият участък на Клустер- А гена се съдържа в дваекзона и поражда прекурсорен протеин от 377 амино киселини. Клустер- Апрекурсорсн протеин съдържа предполагаем сигнален пептид от 25 аминокиселене, който с включен в транспорта през мембраната наендоплазматичния ретикулум. а така също и 4 потенциално N- свързаниместа за гликозилация (N-X-S Т). Предсказаният зрял протеин има изчисленомолекулно тегло от 39, 033 Da. Интервентните последователности от 952Ър и 349 Ър в дължина присъстват след кодов 151 и 364 съответно. За оценкана множеството от гени. кодиращи Клустер - А подобните протеини в тютюна, геномна Southern blot проба се сондира с сДНК клон. Образците отхибридизационните свързвания към сондата при ограничаващи условияпоказват, че Клустер- А е част от малко генно семейство е поне 4 различничлена (фиг. 2). За определяне индуцирането на Клустер- А генната експресия,тютюневи растения се подлагат на различни стресови състояния и сеанализират no Northern. Пробите от различни третирания се взимат тридни след инокулация с TMV, два дни след нараняване, 1 ден след третиране сетефон и 1 ден след облъчване с ултравиолетови лъчи. При тези пунктовевъв времето е докладвана максимална експресия на PR гените (PR- 1 go PR-5) от Brederode и сътрудници (1991,Plant Mol, Biol. 17, 1117- 1125) и се използватук за изследване на Клустер- А генна експресия, фигура 3 показва, че внестресирани тютюневи листа няма установена експресия на Клустер- Агена. TMV инфекция на тютюневи листа с етефон. за продуциране на етилен,или облъчване с ултравиолетова светлина води до повишаване на Клустер- АтРНК (фиг. 3, линия Е и U). В противовест на това, установена е слабаиндукция на Клустер- А експресия след нараняване на листата. Тезирезултати взети заедно показват, че Клустер- А може да бъде класифициранкато нов свързан с патогенезата ген на тютюна. Клустер- А генъте клониран като един приблизително 5. 5 kb Sstl-фрагмент. Цялата отворена четяща рамка е локализирана в този фрагмент,заемайки около две трети от фрагмента: 5’ краят на отворената четящарамка стартира приблизително от позиция 453 от един Sstl сайт. Спомощта на PCR. се въвежда Ват!II сайт нагоре от 5’ края на ORF кактоследва. Оригиналната последователност (фиг. 1) (озиция 406} 5’ - ТТГАААСТСОААОТСАСАААГТААА- 3' (SEQIDNO: 12) (позиция 432) се модифицира В (позиция 406) 5’- TITTAAACTCGGATCCACAAATTAAA- 3’ (SEQIDNO: 13) (позиция 432). По аналогичен начин EcoRI сайта 6 pMOG182 (фиг. 9) се модифицира 6

Xbal- сайт с помощта на следната адапторна последователност: 5’-AATTGTCTAGAC-3’ (SEQIDNO: 14). Модифицираната клонираща средае наречена pMOG185 и съдържа CaMV 35S промотор и nos- терминатор иBamHI- сайт за инсерция на Клестср- А гена помежду. Към този край секлонира отворената четяща рамка на Клустер- А гена като единприблизително 5. 1 kb Bamlll- Sstl сайт с помощта на новосъздаден BamHIсайт на Клустер- А фрагмента, 6 BamHI сайта на модифициранияекспресионен вектор pMOG185. Клустер- А гена е фланкиран нагоре от 35sCaMV промотор с двоен енхансср, и надолу от nos- терминатор, сега елокализиран в Xbal- Sstl фрагмент. Този фрагмент съответно се клонира. 6бинарен вектор pMOGSOC (фиг. 10). Бинарният вектор pMOGSOO съдържарастителния експресионен ген за резистентност на канамицин между ляв идесен Т- ДНК край, както и мултиплен клониращ сайт за инсерция нарестрикционни фрагменти. В Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, TheNetherlands, nog N CBS 414. 93 е депозиран един щам от Е. coli, приемащ тозивектор, е помощта на подходяща синтетична двойно- верижна, частичнокомплементарна, адаптерна последователност (напр. 5'- AGCFCACG- 3’3’- GTGC1TAA- 5 *). Така полученият бинарен вектор съдържа както посъщество конститутивно експресионен Клустер- А ген, така и растителенген за експресия NPTJI като маркер, локализиран между Т- ДНКпоследователностите от ляво и от дясно. .'4 С помощта на плазмида pRK2013, този pMOG800 бинарен Вектор следтова се мобилизира от Е. coli DH5a в Agrobacterium tumefaciens, щамMOG101, който приема хелперен плазмид с Vir- функциите,Трансконюгантите се изолират от селекционната среда, съдържаща 40 mg/1рифамицин, 250 mg/I спектиномицин и 100 mgj канамицин (за подробностивиж Експерименталната част). Клетките от Agrobacterium, които саполучили бинарния вектор се използват за трансформация на растения.

Трансформацията на домати (Lycopersicon esciiletitum cv. Moneymaker) cщамове на. Agrobacterium MOG101, приемащи pMOG800 получили бинаренвектор се провежда по същество както е описано от McCormick et at (1986,Plant Cell Rep. 5, 81- 84). За трансформация на тютюн, се използва метода на листните дискове(1985, Horsch et ai. Science 227,1229- 1231). Листните дискове се култивиратзаедно с щам на Agrobacterium MOG101, приемащ бинарния вектор и растатвърху7 селекционна среда със lOOmg/ml канамицин. Трансгенните кълноверегенерират до цели растения и се анализират за експресия на нововъведените гени. За целите на анализа се използва разслояване поWestwm, с помощта на антисерум срещу Клустер- А протеина и/ илиглюканаза. 35 с, картофи cv, Kardal Картофените клубени следва да бъдат съхранявани при +4°С. Седемдни преди трансформацията те следва да бъдат прехвърлени на стайнатемпература. Ден 1. Инокулира се щам Agrobacterium от прясна паничка в 10 ml LB + 100mg/1 канамицин + 20 mg/1 рифампицилин. Оставя се една нощ при 29° С. Ден 2. Суспенсията от Agrobacterium се разрежда 1:10 в минимална среда + 100 mg/1 канамицин. Оставя се за една нощ при 29°С. Отливат се паничкитесъс среда 1. Ден 3. Суспенсията от Agrobacterium се разрежда до OD, ±0. 15 в Минималнахранителна среда без антибиотици и расте до OD{()rt 0. 30 - 0. 70( товаотнема около 4 часа). Културата се обръща и се приготвя разреждане 1:10 ВMS!;R3. Картофите се обелват. - Промиване 1 минута с етанол 70%. - Промиване 20 минути в разреден к 5 Teepol + 0. 1% Tween 20, - Еднократно промиване със стерилна вода. - Добавяне на + 100 ml смес 1: 1 от RK: KI (Синьото оцветяване следвада се задържи около 2 минути). - Отмиване на синьото оцветяване със стерилна вода, - Клубените се нарязват на резенчета с дебелина около 2 тт. - Изрязват се малки дискчета от васкуларната тъкан. - Дискчетата се събират в големи петриеви панички (15 cm) е теченMS,R3 (около 400 за една паничка). - Изсушават се около 40 диска върху стерилна филтърна хартия и сепоставят в среда 1 като контрола (2 панички). 36

- Средата MS^IO се отстранява с пипета. - Суспенсията от Agrobacterium се премества за течна MS.0R3. - Дискчетата се изсушават на стерилна филтърна хартия и сепрехвърлят в Петриеви панички със среда (20 диска за паничка). - Затварят се зисковете с парафин и се поставят в стая завъзстановяване. Ден 4. аничките със среда 2 се отливат. Ден 5. Дискчетата се прехвърлят в панички със среда 2 (20 диска за паничка).Ден 8. Отливат се паничките със среда 3. Ден 9. Прехвърлят се дискчетата в панички със среда 3 (10 диска за паничка).От дисковете, които не са потънали на 3- тия ден се изготвят следнитеконтроли: 1. Не са потънали и няма селекция (20 диска, 2 панички) 2. Не са потънали и със селекция (20 диска, 2 панички) Правят се допълнителни контроли: 3. Потънали и няма селекция (20 диска 2 панички) Дисковете се прехвърлят всеки три седмици в свежа среда След 3 седмици могат да се видят първите кълнове. Когато кълновете станат достатъчно големи, те се нарязват и се поставят в епруветки със среда 4 (образуването на корени може да отнеме 3седмици). Получаване на основната среда: - За 1 литър MS..R3 100 ml 10 * MS соли 10 ml 100* R3 витамини30 g захароза 8 g Диахинов агар pH се довежда до 5. 8 с КОН и се стерилизира В продължение на 20 мин на 110°. Изготвяне на среда за картофения щок: - За 1 литър 1/2 MSMR3: 50ml 10 * MS соли 5 ml * MS витамини30 g захароза8 g Диахиноб агар pH се довежда до 5. 8 с КОН и се стерилизира 20 мин. при 110°СБазична хранителна среда с хормони и антибиотици: 1. MS..R3 + 3. 5 mg/l разтвор на Zeatin Ribosid 500 μΐ (3. 5 mg/ml) за500 ml; 0. 03 mg/ϊ I. A A 15 ul разтвор (0. 1 mg/ ml) за 500 ml. 2. MSWR3 + 3. 5 mg/l Zeatin Riboside, 0. 03 mg/l I. A A , 200 mgl Cefotaxime, 500 μΐ разтвор (200 mg/ml) за 500 mJ, 100 mg/l Vancomycin 500 μΐ разтВор (100 mg/ml) за 500 ml 3. MS,,R3 + 3. 5 mgl Zeatin Riboside 0. 03 mg/l I. A A200 mg/l Cefotaxime100 mg/I Vancomycin 100 mg/l Kanamvcin 500 ui разтвор (100 mg ml) за 500 miКолекционна среда c хормони и антибиотици: 4. 1/2 MS. R3 + 100 mg/l Cefotaxime 50 mg/ί Vancomycin 100 mg/I Kanamycin 4, Анализ на гетата експресия Трансгенни растения могат да бъдат анализирани за присъствие наКлустер- А протеина чрез разслояване по Western с помощта на анти-Клустер- А антисерум. Ако нивата на тРНК се тестуват no Northern, катосонда за Клустер- А се използва сДНК фрагмент. Растения с повишенапродуктивност на Клустер- А протеин се тестуват за повишени нива нарезистентност спрямо гъби. Растения, които показват аналогично повишени нива на Клустер- А ив-1, 3- глюкапаза. се очаква да притежават повишена резистентност срещугъбна инфекция. ЕКО1ЕРИМЕНТИ ДНК амплификация се осъществява в продължение на 35 цикъла на.секвенционни иткубации при 94° С за 0. 5 мин, 50° С за 2 мин и 72° С за 1. 5 минв 50 μΐ реакционна смес, съдържаща 1 ng от Клустер- А ДНК, 0. 2 μΜ отпраймер pi и 2 единици от Thermus aquaticus ДНК полимераза (Perkin- EbnerCctus, Gouda. The Netherlands). Част от реакционните продукти (4%) сеподлагат на електрофореза върху агарозен гел, за потвърждаване синтезатана ДНК фрагмента е правилия размер. Остатъка от PCR ДНК продуктитесе преципитират с етанол и се промиват за отстраняване на излишъка от соли.

3Q Синтеза и анализ на еДНК библиотеки Изолирането на поли (А) +- РНК от инфектиран тютюн, синтезата на еДНК и конструирането на еДНК библиотека, индиректно клонирана вламбда вектора Uni- ZAP XR, се осъществява съгласно инструкциите напроизводителя (Stratagene, La Jolla Са.). Рекомбинантни фаги се скринират спомощта на белязани с Pi2 инсерти на еДНК клона PROB40 като сонда(Hooft van Iluijsduijen R. A. M. et al, 1986, EMBO J. 5, 2057- 2061). След като сеизбавят от еДНК- съдържащите pBIuescript плазмиди от изолирания ламбдафаг чрез едновременно инфектиране с помощния фаг R408 (Stratagene), еДНКинсерта на Клустер- А се субклонира 6 М13 производни и се съгласува спомощта на М13 праймер и праймера се основава на еДНК последователност, получена с праймера М13. Обратно, еДНК се съгласува директно от денатурирана плазмидна ДНК с помощта на праймерите 13 или Т7 (Promega, Madison WI; Chen &amp;Seeburg, 1985, DNA 4, 165-170). Пречистване на протеина Протеините се екстрахират от тютюневи листа, 7 дни слединфектиране с вируса на мозаичната болест по тютюна и солите сеотстраняват чрез прекарване през колоната G- 25, еквилибрират се в 40 тМNaOAc, pH 5. 2 (Woloskuk С. Р. et al 1991, The Plant Cell J, 619- 628).Протеиновият разтвор, от който са отстранени солите се оставя за еднанощ върху лед преди центрофугиране за 50 мин при 20 000 g. Получената врезултат супернатанта сс натоварва върху S- Сефарозна колона (fast flow,Pharmacia) (5х 5 cm), еквилибрирана в 40 тМ NaOAc, pH 5. 2. Адсорбиранитепротеини се елуират с линеарен градиент на солта от 0 до 0. 3 М Nad вгорния буфер. Всяка трета фракция се анализира чрез имунологично разслояване и Клустер- А съдържащите фракции се прибавят и диализират в50 тМ Tris, HQ pH 8.0. Този разтвор се прекарва през хелатиращаСефарозна колона (HR 10/2; Pharmacia), активирана от слабо кисел разтвор(50 ml) на 0.1 М ZnCl2 (pH = 5. 4). Колоната екстензивно се промива с вода(500 ml) и след това се еквилибрира в горния Tris- буфер преди използване.Клустер- А съдържащия пул се натоварва в няколко опита, всеки от коитосъдържа от 3 до 4 mg протеин. Пика на задържания протеин се събира и се ф подлага отново на хелатираща Сефарозна хроматография. Макар че най- тясно свързване да се наблюдава след активиране на хелатиращатаСефарозна колона с Си1’ - йони, пречистване при тези условия е по- малкоефективно (данни не са приведени). Крайният етап на пречистване се сътоиот гелфилтрация през колона Сефадекс- 75 (HR 10/30; Pharmacia),еквилибрирана в 50 тМ ΚΗΡΟ , буфер, pH 7. 0, съдържащ 200 тМ NaCl.Гелфилтрацията се провежда при бавна скорост, възлизаща на 0.5 ml заминута и фракциите от 0. 5 ml се събират, фракциите се анализират чрезSDS- РАЛ гелелектрофореза и имунологично разслояване.

Протеиновите проби се разделят върху’ 12. 5% SDS- РАА гелове кактое описано от Laemmi ( Laemmi U. К., 1970, Nature 227, 680- 685). Имунологичноразслояване и детекция (откриване) се провежда съгласно ECL Westernметодиката, предоставена от A Mersham, UK. Антисерумът срещу PR- 4a,bхомолог от домати (PR- Р2) е любезно предоставен от Matthieu Joasten,ffagertingen, The Netherlands. За имунодетекция, антисерумът спрямопредполагаемия Клустер- А протеин се прилага в разреждане 1: 2000. 41 За целите на съгласуването, протеинът се отделя както е описано отMoos (Moos М. etal, 1988, J. Biol. Chem. 263, 6005- 6008) и се подлага наразслояване c електрически ток върху PVDF мембрана както е описано отMatsudaira et al. (Matsudaira et al, 1987, J. Biol. Chem. 262,10035-10038).Протеините се визуализират чрез оцветяване no Coomassie Brilliant Blue R-250 (Matsudarira et al, 1987, no- горе). Доколкото предполагаемият Клустер- Aпротеин е N- крайно блокиран, той се подлага на кисела хидролиза върхуPVDF мембрана както е описано от Landon М., 1977, Methods ofEnz. 47,145-149). фрагментите се съгласуват чрез Eurosequence, Groningen, TheNetherlands, c помощта на разграждане no Ednian върху Applied Biosystems477A протеинов секвенатор. Измерванията за хитиназна активност се извършват рутинно както еописано omMolano etal (1977, по- горе). Използвани са алтернативниизпитвания като синята стандартна проба, описана от Wirth и Wolf (Wirth S.J. and Wolf G. A. 1990, J. Microbiol. Meth. 12,197- 205), пробата за освобождаванена р-нитрофенила, описана от Roberts и Selitrennikoff (Roberts and SelitrennikoffC. P., 1988, J. Gen. Microbiol. 134, 169-176) и пробата за освобождаване на 4-метилумбслифсрон, описана от McCreath и Gooday G. IF. (McCreath К. J. andGooday G. W., 1991, J. Microbiol. Meth. 14, 229- 237). Лизозимната активност се определя в 50 тМ КРО4 буфер, pH 6. 0както е описано от Selsted and Martinez (1980, Anal Biochem. 109, 67- 70), Бактерия, индуцирана да експрссира и контролира сА-3 протеин иконтролна бактерия се взимат от 10 ml култури чрез центрофугиране и 42 утайката се ресуспендира в 1 ml IBS (20 тМ Tris- HQ, pH 7.5,150 mM NaCI). След обработка с ултразвук, суспенсиите се съхраняват на -20°С. Преди изпитването за хитиназна активност, се добавя 1% Triton X-100. Тоталните протеинови екстракти на здрави или TMV- инфектирани тютюневи листа се получават чрез хомогенизация в 5 ml TBS. Хомогенатите се центрофугират за кратко време за отстраняване нанеразтворимия материал и се съхраняват при - 20°С. Екстрацелуларнитепротеини се получават чрез вакуумна инфилтрация на листата с вода(наночиста). Инфилтрираните листа се поставят в спринцовка и сецентрофугират за 5 мин при 3 000 грт в table top центрофуга. Безцветнитеводи от промиването, съдържащи екстрацелуларните протеини сесъхраняват на - 20°С. Хитин- хидролизиращата активност се изпитва в 200μΐ реакционни смеси, съдържащи 50 μί от старателно промити белязани сН3 хитинова суспенсия, 50 μΐ бактериален или растителен екстракт и 100 μί50 тМ натриев фосфат, pH 6. 4. След инкубация за 30 мин при 30°С, седобавят 0. 5 ml 10% трихлороцетна киселина, сместа се центрофугира заотстраняване на преципитирания материал и 0. 5 ml от супернатантата сеотстранява и филтрува през стъклена вата. Разтворената радиоактивностсе измерва в течен сцинтилационен брояч. РЯКразслояване; и. ДНК.анализ Тоталната РНК от нестресирани или стресирани тютюневи растениясе екстрахират от замразени листни тъкани чрез хомогенизация векстракционен буфер (1 М Tris- НС1,0. 1 М LiCl, 10 тМ EDl'A. 1% SDS, pH9. 0). Хомогената се екстрахира с фенол и хлороформ и РНК преципитира с2М LIC1. РНК се подлага на електрофореза в 1. 5% агарозни гелове след глиоксилация и се разслоява върху найлонови мембрани (Genenscreen, NewEngland Nuclear or Hybond- N, Amsterdam). Изолира се геномна ДНК на тютюн,разгражда се, подлага се на електрофореза и се разслоява както е описано(Cornelissen et al, 1987, Nucl. Acids Res. 15, 6799- 6811). Хибридизация нануклеинови киселини от тютюн се провежда с Р ’ - белязан сДНК инсерт наКлустер- А 6 5х SSC, 2% SDS, 50% формамид, 100 pg/ml спермална ДНК отхеринга при 42°С (lx SDS при 50°С) и се авторадиографира. Конструиран е хелперен плазмид, получен от плазмида pTiB6, койтопридава вирулентните функции на Agrobacterium tumefaciens, MOG101. Щамът Agrobacterium tumefaciens MOG101 носи не- онкогенен Ti- плазмид откойто целия Т- участък е заместен от бактериален Spectinomycinрезистентен маркер от транспозона Тп 1831 (Hooykaas et al, 1980, Plasmid 4,64- 75).

Ti- плазмида pTiB6 съдържа два съседни Т- участъка, TL (Т- ляво) иTR (Т- дясно). За получаване на производни, в които липсват TL- и TR-участъци, създадохме междинният вектор pMOG579. Плазмидът pMOG621 еpBR322 производно, което съдържа 2 Ti- плазмидните фрагменти, които салокализирани отляво и отдясно, извън Т- участъците ( фигура 2). В pMOG579двата фрагмента (показани в тъмно) се разделят от 2. 5 kb BamHI- HindHIфрагмент от транспозон Тп1831 (Hooykaas etal, 1980 Plasmid 4, 64- 75), койтоноси маркера за резистентност спрямо спектиномицин (фигура. 2). Плазмидабе въведен в щам LBA1010 Agrobacterium tumefaciens (С58- С9 (pTiB6) = aлечебен С58 щам в който е въведен ρΤϊΒό (Коектап et al (1982), Plasmid 7,119-132) чрез трипарентално кръстосване от Е. coli, с помощта на ΙΊΒ1018 44 (pRK2013) като хелпер. Трансконюгантите са подбрани по резстинтностспрямо Rifampicin (20 mg/1) и Spectinomycin (250 mg/1). Двойно рекомбиниранемежду pMOG579 и pTiB6 води до загуба на резистентност спрямокарбеницилин (pBR322 маркер) и делеция на целия Т- участък. От 5 000трансконюганти, резистентни на спектиномицин, двойно наслоени върхукарбеницилин (100 mg/1), са намерени два чувствителни. Анализът поSouthern показва, че събитията на двоен кросинг овер са делетирали целия Τ'-участък (не е показано). Полученият в резултат щам е наречен MOG101. Ί ози щам и неговата структура са аналогични на щам GV2260 (Deblaere et al1985, Nucl. Acid Res, 13, 4777' 4788). ( MOGlOl е описан no- подробно в Hood E.Gelvin S. B., Melchers L. S. and HoekemaA., 1993, Transgene Research 2, 208- 218) uсвободно може да бъде доставен от MOGEN International N. V. припоискване. 45 СЕКВЕШИОНЕН ЛИСТИНГ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ: (i) ЗАЯВИТЕЛ (A) ИМЕ : MOGEN international N. V. (B) УЛИЦА : Einstemvweg 97

(C) ГРАД : LEIDEN (D) ЩАТ : Zuid- Holland (Е) ДЪРЖАВА : The Netherlands |F) ПОЩЕНСКИ КОД (ZIP) : N1.- 2333 СВ CO) ТЕЛЕФОН : 31. 71. 25S2S2 (Н) ТЕЛЕфЛКС : 31. 71. 221471 (A) ИМЕ : Rujksuniversiteit te Leiden (B) УЛИЦА: Stationsweg 46

(C) ГРАД: LEIDEN (D) ЩАТ: Zzuid- Holland (E) ДЪРЖАВА : Netherlands IF) ПОЩЕНСКИ КОД i ZIP): NL-2312 ΆΥ (it) НАЗВАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО : Растителна хитиназа. кодиращахитиназата ДНК и растения, които съдържат такаВа ДНК (iii) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛЕНОСТИГЕ : 14Civ) КОМПЮТЪРНО ЧИТЛЕМА фОРМЛ : (А) МЕДИУМ ТИП · флопи диск •:В| КОМПЮТЪР : IBM PC compatible

i Ci ОПЕРИРАЩА СИСТЕМА : PC- DOS , MS- DOS (Dl СОфТУЕР: Patentln Release #1. 0. Version 7 1.25 (EPOl (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO . 1 : (i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА : (A) ДЪЛЖИНА : 1253 двойки бази (B) ТИП : нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ : едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ : линеарна fii) МОЛЕКУЛЕН ТИП : сДНК към тРНК© (iii) ХИНОТЕТИЧНОСГ: НЕ {vi) ИЗТОЧНИК НА ПРОИЗХОДА: (A) ОРГАНИЗЪМ : Nicotiana tabaeum

(B) ЩАМ : Sauisun NN <Е>) ЕТАП НА РАЗВИТИЕ : Ί"MV- индуциран ( vii l НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК: (В) КЛОН : Клусшер- А

fix) ХАРАКТЕРИСТИКА :ф (А) ИМЕ/КЛЮЧ : CDS (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 14 .. 1126 (D! ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ· частична ixi) ОПИСАНИЕ ПА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : CGAGTTTTTT ТТТ ТТТ ТСТ ATT ATT ТТС ТСА TGT ТТС СТТ СТС CGG САА 49 10 Phe Ser lie lie Phe Ser Cys Phe Leu Leu Arg Gin 1 5 10 CTA GTT TGC ACA AAT AGC CAA AAT GTT ATT AAG GGA GGG TAC TGG TTT 97 Leu Val Cys Thr Asn Ser Gin Asn Val He Lys Gly Gly Tyr Trp Phe 15 15 20 25 AAG AAC AGT GGA TTA GCA TTA AAC AAC ATA GAC TCA ACA CTT TTC ACT 145 Lys Asn Ser Gly Leu Ala Leu Asn Asn He Asp Ser Thr Leu Phe Thr 30 35 40 20 CAT CTA TTT TGT GCA TTT GCT GAT CTT AAT CCA CAA TCA AAT CAG TTA 193 His Leu Phe Cys Ala Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gin Ser Asn Gin Leu 45 50 55 60 25 ATC ATT TCG CCA GAA AAT CAA GAT TCA TTC AGC CAA TTT ACA AGT ACA 241 lie lie Ser Pro Glu Asn Gin Asp Ser Phe Ser Gin Phe Thr Ser Thr 65 70 75 GTT CAA AGG AAA AAT CCT TCA GTC AAG ACT TTC TTG TCT ATA GCT GGA 289 30 Val Gin Arg Lys Asn Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser He Ala Gly 80 85 90 GGA AGA GCT GAT ACA ACT GCC TAT GGA ATT ATG GCT AGA CAA CCA AAT 337 Gly Arg Ala Asp Thr Thr Ala Tyr Gly He Met Ala Arg Gin Pro Asn 35 95 100 105 TCA AGA AAA AGT TTT ATT GAT TCA TCA ATA AGA TTG GCT AGA CAA TTT 385 Ser Arg Lys Ser Phe He Asp Ser Ser He Arg Leu Ala Arg Gin Phe no. 115 120 40 GGA TTT CAT GGC CTT GAT CTT GAT TGG GAA TAT CCA TTA TCA GCT ACA 433 Gly Phe His Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser Ala Thr 125 130 135 140 45 GAT ATG ACA AAC TTA GGG ATC CTT TTG AAT GAG TGG CGC ACC GCT ATC 481 Asp Met Thr Asn Leu Gly lie Leu Leu Asn Glu Trp Arg Thr Ala He 145 150 155 AAC ATG GAG GCG AGA AAT TCC GGC AGG GCG GCA CTG CTT CTC ACG GCG 529 50 Asn Met Glu Ala Arg Asn Ser Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Thr Ala 160 165 170 64 GCG GTT TCC TAC TCA Ser CCC Pro CGA GTC AAT GGA. TTG AAC TAC CCA GTT Val GAA Glu 577 Ala Val Ser 17 5 Tyr Arg Val Asn Gly180 Leu Asn Tyr 185 Pro 5 TCG GTG GCA AGA AAC TTA AAC TGG ATT AAC CTT ATG GCA TAT GAC TTC 625 Ser Val Ala Arg Asn Leu Asn Trp He Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe 190 195 200 TAT GGA CCA AAT TGG TCA CCA TCA CAA ACC AAT TCA CAT GCA CAA TTA 673 10 Tyr Gly Pro Asn Trp Ser Pro Ser Gin Thr Asn Ser His Ala Gin Leu 205 210 215 220 ψ’Τ'Τ' GAT CCT GTG AAC CAT A.TT AGT GGA AGC GAT GGA ATT AAT GCA TGG 721 Phe Asp Pro Val Asn His He Ser Gly Ser Asp Gly He Asn Ala Trp 15 225 230 235 ATT CAA GCT GGT GTT CCA ACA AAA AAA TTG GTA CTT GGA ATT CCA 769 He Gin Ala Gly Val Pro Thr Lys Lys Leu Val Leu Gly lie Pro Phe 240 245 250 20 TAT GGC TAT GCG TGG CGA TTG GTT AAC CCG AAT ATC CAC GAT CTT AGA 317 Tyr Gly Tyr Ala Trp Arg-Leu Val Asn Pro Asn He His Asp Leu Arg 255 260 265 25 GCA CCT GCC GCC GGA AAA TCA AAT GTA GGT GCG GTC GAT GAT GGG TCG B65 Ala Pro Ala Ala Gly Lys Ser Asn Val Gly Ala Val Asp Asp Gly Ser 270 275 280 ATG ACT TAT AAC AGA ATT AGA GAT TAT ATA GTG CAG AGT CGC GCC ACA 913 30 Met Thr Tyr Asn Arg lie Arg Asp Tyr lie Val Gin Ser Arg Ala Thr 285 290 295 300 ACT GTG TAT AAT GCT ACT ATT GTT GGA GAT TAT TGT TAC TCT GGA AGT 961 Thr Val Tyr Asn Ala Thr He Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser Gly Ser I 35 305 310 315 AAT TGG ATT AGC TAT GAT GAT ACT CAA AGT GTT AGA AAT AAG GTT AAT 1009 Asn Trp lie Ser Tyr Asp Asp Thr Gin Ser Val Arg Asn Lys Val Asn 320 325 330 40 TAT GTT AAA GGT AGA GGA TTG CTA GGT TAC TTT GCA TGG CAC GTT GCA 1057 Tyr Val Lys Gly Arg Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His Val Ala 335 340 345 45 GGG GAT CAA AAT TGG GGA CTT TCT CGT ACA GCT TCA CAA ACA TGG GGA 1105 Gly Asp Gin Asn Trp Gly Leu Ser Arg Thr Ala Ser Gin Thr Trp Gly 350 355 360 GTG TCA TCT CAA GAG ATG AAG TGATGGATTA i CGTAATTGTG TGTGTCAAGT 1156 50 Val Ser Ser Gin Glu Met Lvs 365 370

АТАСТАСТТА TAATAAGGCA ACAGATATGT GAACTATGAC ATAAATAAAT AAACAATAAA

TTGTGGTCTC CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA. AAAAAAA 55 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 2 : (i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА: (A) ДЪЛЖИНА : 371 амино киселини (B) ТИП: аминокиселина(D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (н) МОЛЕКУЛЕН ТИП : протеин (Й) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 2:

15

Phe 1 Ser lie He Phe 5 Ser Cys Phe Leu Leu Arg Gin Leu Val Cys Thr 10 15 As П Ser Gin Asn Val He Lys Gly Gly Tyr Trp Phe Lys Asn Ser Gly 20 20 25 30 Leu Ala Leu Asn Asn He Asp Ser Thr Leu Phe Thr His Leu Phe Cys 35 40 45 25 Ala Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gin Ser Asn Gin Leu He He Ser Pro 50 55 60 Glu Asn Gin Asp Ser Phe Ser Gin Phe Thr Ser Thr Val Gin Arg Lys 65 70 75 80 30 Asn Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser He Ala Gly Gly Arg Ala Asp 85 90 95 Thr Thr Ala Tyr Gly lie Met Ala Arg Gin Pro Asn Ser Arg Lys Ser 35 100 105 HO Phe He Asp Ser Ser He Arg Leu Ala Arg Gin Phe Gly Phe His Gly 115 120 125 40 Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser Ala Thr Asp Met Thr Asn 130 135 140 Leu Glv He Leu Leu Asn Glu Trp Arg Thr Ala He Asn Met Glu Ala 145 150 155 160 45

Arg Asn Ser Gly Arg Ala165 Ala Leu Leu Leu 170 Thr Ala Ala Val Ser 175 Tyr Ser Pro Arg Val Asn Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu Ser Val Ala Arg 180 185 190 Asn Leu Asn Trp He Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe Tyr Gly Pro Asn 195 200 205 56

Trp Ser 210 Pro Ser Gin Thr Asn 215 Ser His Ala Gin Leu 220 Phe Asp Pro Val Asn His lie Ser Gly Ser Asp Gly He Asn Ala Trp He Gin Ala Gly 5 22 5 230 235 240 Val Pro Thr Lys Lys Leu Val Leu Gly He Pro Phe Tyr Gly Tyr Ala 245 250 255 10 Trp Arg Leu Val Asn Pro Asn He His Asp Leu Arg Ala Pro Ala Ala 260 265 270 Gly Lys Ser Asn Val Gly Ala Val Asp Asp Gly Ser Met Thr Tyr Asn 275 280 285 15 Arg He Arg A.sp Tyr He Val Gin Ser Arg Ala Thr Thr Val Tyr Asn 290 295 300 Ala Thr He Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser Gly Ser Asn Trp He Ser 305 310 315 320 20 Tyr Asp Asp Thr Gin Ser Val Arg Asn Lys Val Asn Tyr Val Lys Gly 325 330 335 Arg Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His Val Ala Gly Asp Gin Asn 25 340 345 350 Trp Gly Leu Ser Arg Thr Ala Ser Gin Thr Trp Gly Val Ser Ser Gin 355 360 365 30 Glu Met Lys370 i2| ИИФОРМА1Ц1Я 3A SEQ ID NO : 3 : < i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА : (А) ДЪЛЖИНА : 29 gBotiki) бази! В) ТИП -. нуклеинова киселинаf C) ВЕРИЖНОСТ : едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна ill) МОЛЕКУЛЕН ТИП: еДНК t in) ХИПОТЕТИЧИОСТ : ДА fix; ХАРАКТЕРИСТИКА iА? ИМЕ КЛЮЧ : misc- feature jBl ЛОКАЛИ ЗАЩ1Я : 1. 29 iDl ДРУГА ИПфОРМАНИЯ : : функция = "per-primer’

Hi! ОПИСАНИЕ HA f {(Х‘,\ЕДОВ.АТЕЛНО< ΤΊ A : SEQ II.) NO: 3:

GTITCCTTCT CCAfGGAACT AGTT'fGCAC sr (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 4: (i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА: (A) ДЪЛЖИНА : 16 аминокиселини (B) ТИП : амино киселина (C) ВЕРИЖНОСГ : едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: nenmug(iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ: НЕ(vi) ИЗТОЧНИК НА ПРОИЗХОДА :

( А) ОРГАНИЗЪМ : Nicotiana tabacum(В) ЩЛМ : Samsun NN (D) СТАДИЙ НА РАЗВИТИЕ - TMV - индуциран (F) ТЪКАНЕН ТИП: Листа (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА: (A) ИМЕ/КЛЮЧ: nenmug (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 5

Iр) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : / маркирано = X / забележка - остатъка е Val или lie” (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА: ( А) ИМЕ/ КЛЮЧ : I fennuiд (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 10 |D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : / маркирано - х / забележка = “вероятио Gly” (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА: I. А) ИМЕ КЛЮЧ : Пептид (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 14 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : , маркирано = х / забележка = “ непознат остатък” 58 (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 4 :

Pro Val Asn His Xaa Ser Ser Gly Ser Asp Xaa Пе Asn Ala Xaa Пе Gin15 10 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 5 : (i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА : (A) ДЪЛЖИНА : 15 амино киселини (B) ТИП : амино киселина ( С) ВЕРИЖНОСТ: едноВерижна(D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна ί и) МОЛЕКУЛЕН ТИП : пешпид(iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: не {νί) ИЗТОЧНИК НА ПРОИЗХОДА : (А) ОРГАНИЗЪМ : Nicotiana tabacum (D) СТАДИЙ НА РАЗВИТИЕ : TMV- индуциран IР) ТЬКАНЕН ТИП : листа (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 5:

Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu Ser Val Ala Arg Asn Leu Asn Trp15 10 15 21 ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 6 : (i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА : (A) ДЪЛЖИНА: 26 амино киселини (B) ТИП : аминокиселина<С) ВЕРИЖНОСТ: едноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна

I (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: nenmug (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: не (vi) ИЗТОЧНИК HA ПРОИЗХОДА: (А) ОРГАНИЗЪМ : Nicotiana tabacum (D) СТАДИЙ HA РАЗВИТИЕ : TMV - индуциран (F) ТЪКАНЕН ТИП : листа(ixj ХАРАКТЕРИСТИКА: (A) ИМЕ/ КЛЮЧ : Пептид (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 12 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : / маркирано = х / забележка = “ срегцат се и Val и lie” (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO : 6 :

Ser His Ala Gin Leu Phe Asp Pro Val Asn His His Xaa Ser Gly Ser Asp15 10 15

Gly lie Asn Ala Trp lie Gin Ala Gly Val 20 25 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 7: (i) СЕКВЕНЦИОННЛ ХАРАКТЕРИСТИКА: (A) ДЪЛЖИНА : 3155 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна i D ) ТОПОЛОГИЯ : линеарнаi ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК ( геномна) (in) ХИПОТЕТИЧНОСТ: не (vi | ИЗТОЧНИК НА ПРОИЗХОДА: (A) ОРГАНИЗЪМ : Nicotiana tabacum

(B) ЩАМ: Sam sun NN

GO (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА: (A) ИМЕ / КЛЮЧ : екзон (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 454.. 907(ix) ХАРАКТЕРИСТИКА: (A) ИМЕ/КЛЮЧ: екзон (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 1859 .. 2497(ix) ХАРАКТЕРИСТИКА: (А) ИМЕ/КЛЮЧ: екзон(ix) ХАРАКТЕРИСТИКА: (A) ИМЕ / КЛЮЧ : интрон (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 90S .. 1858(ix) ХАРАКТЕРИСТИКА (A) ИМЕ / КЛЮЧ : интрон (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 2498 .. 2846(ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : слети (454.. 907, 1859.. 2497, 2847.. 2884)(xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 7 : GAGCTCTGTT AATAATTTTG ACGTAACTAG TCATCAGGTC GCAGTTCAAG TCATCAGGTA 60 35 GCAGTTCAAG TCATGAAAAT AGTCTCTTGC AGGTAAGGTT GCGTACAACA GATCCTTGTG 120 GTCCGGCCCT TTCCGAACTT CGCTTGTAGC TGGAGCTTAG TCACCGGAAT ACCCGTTGTT 180 40 CCGTTAATAA CAAGAACACA TACAAGACGA TTTGCTAACA AAAATATATA TATAAACCAA 240 AAGTGTAACG ATC-ATAAAAT TGCACAATTC TGAAGGATAT ACAGGAAAAT TTTGACCTTT 300 TCTCTATTTA GAAATATTGA GAGATTCAAC CACTTTCTAA TGGAGTAGTA AATGTATCGC 360 45 AAACTAAAAG CCC-CCGGTAG ACAGTAAACT CAAATCTTCA AACTTATTTA AACTCGAAGT 420 CACAAATTAA ATAAGCTATC AACCTTCAAT TTA ATG GCT AAT TCT GTC ACT CTT 474

Met Ala Asn Ser Val Thr Leu 50 1 5 TTC GCC ATT ATT TTC TCA TGT TTC СТС CTC CAG CAA CTA GTT TGC ACA 522

Phe Ala lie lie Phe Ser Cys Phe Leu Leu Gin Gin Leu Val Cys Thr 10 15 20 £1

35 5 10 15 20 25 30 AAT AS П AGC CAA AAT GTT AAG GGA GGA TAC TGG TTT AAG GAC AGT Ser GGA Gly TTA Leu Ser Gin25 Asn Val Lys Gly 30 Gly Tyr Trp Phe Lys 35 Asp GCA TTA AAC AA.C ATA GAT TCA AC A CTT TTC ACT CAT CTA TTT TGT GCA Ala Leu Asn Asn lie Asp Ser Thr Leu Phe Thr His Leu Phe Cys Ala 40 45 50 55 τττ GCC GAT CTT AAT CCT CAA TTA AAT CAG TTA ATT ATT TCG CCG GAA Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gin Leu Asn Gin Leu He He Ser Pro Glu 60 65 70 ААТ CAA GAT TCA TTC AGG CAA TTT ACA AGT ACA GTT CAA AGG AAA AAT As η Gin Asp Ser Phe Arg Gin Phe Thr Ser Thr Val Gin Arg Lys Asn 75 80 85 CCT TCG GTC AAG ACT TTC TTG TCT ATA GCT GGA GGA AGA GCT AAT TCA Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser lie Ala Gly Gly Arg Ala Asn Ser 90 95 100 ACT GCC TAT GGA ATT ATG GCT AGA CAA CCA AAT TCA AGA AAA AGT TTT Thr Ala Tyr Gly lie Met Ala Arg Gin Pro Asn Ser Arg Lys Ser Phe 105 110 115 ATT GAT TCA TCA ATA AGA TTG GCT AGA CAA. .TTA GGA TTT CAT GGC CTT He Asp Ser Ser He Arg Leu Ala Arg Gin Leu Gly Phe His Gly Leu 120 125 130 135 GAT CTT GAT TGG GAA TAT CCA TTA TCA GCT GCA GAC ATG ACA AAC TTA Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser Ala Ala Asp Met Thr Asn Leu 140 145 150 40 45 50

GTATTATTGA CAAACATATA TTTTCTTCAT TTGTTTTACA CATATGGATG GCCCTTACAT GAATTTATTT TTGGACAAAT ATAGCTAGTT GTGAATTTAG GAGAGGCAAT CGGGCGGGTC GTGTCGGATA TGGGATGGAT TGAAAATGGA TAATGAAAAA ATGGATAAAG TATCCGACCC GATTCATATT TAATACGGAT AATAAACCGG TCCATGACTT CTTGAATATG ATCCCTTTTG GGAGAATTTC TATTTTCCCA AACTTACCCC CAATTTGAAG CTTTATAAAT GCAAAAGTTA AACTCATTAG TTATCCATTG ATTATCCATT TTCCAAATGG ATAATATGAT TCTTATTTAT ATTTGACCCG TTTTTAAAAA GTTCATTATC CAACCCATTT TTAGTGGATA ATATGGGTGG TTAATTCTTT TCTTTTAACC ATTTTGCCAT CACTAGTTGT GATATTTGAA CTCTCATCTG TCTGTTCAGA TATTATATTG AATTATGTGA CAACAGTATT TGAAATTAGA AATTATTATA CACATAATAT ATTTTTATTT ACTTAATTAT CATATCTCTG ACTGCAATAC TAGGTTCTTG ATACTAGACA CATTATATGT AACTTTTGCA AATTATGGGT CTATGATATT TTCGAAAATA 570 613 666 714 762 810 858 907 9 67 1027 1087 1147 1207 1267 1327 1387 1447 1507 1567 62

ATAACAATTT TTTCACTCTC CTCACAGTTA TATATAATCT CGAAAGGGGA AAGATCCCTC 1627 AGAGAATCAC TCGATTATAT TGACAAGTTC AAAAAACTGA TCATAATATG ATGGCGATTG 1687 CAAGCAGGCC CCCATCATCT CATAACAACT GATAGGTTTC GTTAAACCTG CTCATTATAT 1747 CCATATGTCT ACTATGATAC CATACAATAT GAATTGTGTA ATCACTCCAT CTAGCTAACA 1807 ATTTAAACTG TTGAAGAGTA CACTTTTATT TACTTACCTG TTAATTAAAC A GG ACC Gly Thr 1863

CTT TTG Leu Leu AAT GAG TGG Trp CGC ACC GCT ATC AAC ACG GAG GCG AGA AAT TCC 1911 Asn Glu Arg Thr 160 Ala He Asn Thr Glu Ala 165 Arg Asn Ser 155 GGT AGG GCG GCA CTA CTT CTC ACG GCG GCG GTT TCC AAC TCA CCC CGA 1959 Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Thr Ala Ala Val Ser Asn Ser Pro Arg 170 175 180 185 GTC AAT GGG TTG AAC TAC CCA GTT GAA TCA TTG GCA AGA AAC TTA GAC 2007 Val Asn Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Asp 190 195 200 TGG ATT AAC CTT ATG GCC TAT GAT TTC TAT GGA CCA AAT TGG TCA CCA 2055 Trp He Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe Tyr Gly Pro Asn Trp Ser Pro 205 210 215 TCA CAA ACC AAT TCA CAT GCA CAA TTA TTT GAT CCT GTG AAC CAT GTT 2103 Ser Gin Thr Asn Ser His Ala Gin Leu Phe Asp Pro Val Asn His Val 220 225 230 AGT GGA AGT GAT GGA ATT AAT GCA TGG ATT CAA GCT GGT GTT CCA ACA 2151 Ser Gly Ser Asp Gly He Asn Ala Trp He Gin Ala Gly Val Pro Thr 235 240 245 AAA AAA TTG GTG CTT GGA ATT CCA TTT TAT GGC TAT GCG TGG CGA TTA 2199 Lys Lys Leu Val Leu Gly He Pro Phe Tyr Gly Tyr Ala Trp Arg Leu 250 255 260 265 GTT AAC GCG AAT ATT CAC GGT CTT AGA GCA CCT GCT GCC GGA AAA TCA 2247 Val Asn Ala Asn lie His Gly Leu Arg Ala Pro Ala Ala Gly Lys Ser 270 275 280 AAT GTT GGT GCG GTC GAT GAT GGG TCG ATG ACT TAT AAC AGA ATT AGG 2295 Asn Val Gly Ala Val Asp Asp Gly Ser Met Thr Tyr Asn Arg He Arg 285 290 295 GAT TAT ATA GTG GAG AGT CGC GCC ACG ACT GTG TAT AAC GCT ACC ATT 2343 Asp Tyr lie Val Glu Ser Arg Ala Thr Thr Val Tyr Asn Ala Thr Xie 300 305 310 ----- GTT GGA GAT TAT TGT TAC TCT GGT AGT AAT TGG ATT AGC TAT GAT GAT 2391

Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser Gly Ser Asn Trp lie Ser Tyr Asp Asp 315 320 325 5 ACT CAA ACT GTT AGA AAT AAG GTT AAT TAT GTT AAA GGT AGA GGA TTG 2439

Thr Gin Thr Val Arg Asn Lvs Val Asn Tyr Val Lys Gly Arg Gly Leu 330 335 340 345 CTT GGT TAT TTT GCA TGG CAC GTT GCA GGG GAT CAA AAT TGG GGA CTT 2 4 81 10 Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His Val Ala Gly Asp Gin Asn Trp Gly Leu 350 355 360 TCT CGT ACA G GTTAGACGTA GTTTTTCTTT GTTTTTTTTT TTAATTCTGG 2537

Ser Arg Thr 15 TATTTATATT TTTGTATGGA TAACACGTAA TTTTGTCGAA TACATAATTG TCAAAATACA 2597 TCATTTTTAT TGGTGCATGT TTTCTCATGA ATTCTTAGGA AAGCATGACT ATGCTATTTG 2657 20 GTCGATAGTC TTGTGAAATT TTATACATAA TCAATGCTTT TAAGGTCGGA ATTATTAGAC 2717 AATTGTCTTT CTCAATTAAT TATTATTATT ATTATTATTA TTATTATTAT TATTATTATT 2777 ATTATTATTA TTATTATTAT TATTATTATT ATTATTATTA TTTACATTTC CCCCACTTGT 2837 25 GTCTTGCAG CT TCA CAA ACA TGG GGA GTG TCA TTT CAA GAG ATG AAG 2884

Ala Ser Gin Thr Trp Gly Val Ser Phe Gin Glu Met Lys365 370 375 30 TGATGGATTA CGTAATTGTG TTTGTCAAGT ATCCTACTTA TAATAAGGTG ACAGATATGT 2944 GAACTATGAC ATAAATAAAA TAAATATAAA TCGGGTTCCC CAATTTTATT TTTCTACGAA 3004 TAATATATTT CTTCCCCCTT TGGAGTACAT TAGGTTTATT ATTGTTATTA TTGTTGTTGT 3064 35 TGTTGTTTGT ACTAATAATA TATTTCTTCG TTCCAAAATA GTTGATGCTT TTTGTTTTTC 3124 GATATTATTT TCTCGTTTTC AATTAATTAA A 3155 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 8 : © (i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА : (A) ДЪЛЖИНА : 377 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна lii) МОЛ ЕКУЛЕН ТИП : протеин

(xij ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: S 50

Met Ala Asn Ser Val Thr Leu Phe Ala He lie Phe Ser Cys Phe Leu1 5 10 15 G4 £

Leu Gin Gin Leu 20 Val Cys Thr Asn Ser Gin Asn 25 Val Lys Gly 30 Gly Tyr 5 Trp Phe Lys 35 Asp Ser Gly Leu Ala Leu Asn Asn 40 He Asp 45 Ser Thr Leu Phe Thr 50 His Leu Phe Cys Ala Phe Ala Asp Leu55 Asn 60 Pro Gin Leu Asn 10 Gin Leu 65 He He Ser Pro 70 Glu Asn Gin Asp Ser75 Phe Arg Gin Phe Thr 80 Ser Thr Val Gin Arg 85 Lys Asn Pro Ser Val Lys90 Thr Phe Leu Ser 95 He 15 Ala Gly Gly Arg 100 Ala Asn Ser Thr Ala Tyr Gly105 He Met Ala 110 Arg Gin 20 Pro Asn Ser 115 Arg Lys Ser Phe He Asp Ser Ser120 He Arg 125 Leu Ala Arg Gin Leu 130 Gly Phe His Gly Leu Asp Leu Asp Trp135 Glu 140 Tyr Pro Leu Ser 25 Ala Ala 145 Asp Met Thr Asn 150 Leu Gly Thr Leu Leu155 Asn Glu Trp Arg Thr 160 30 Ala lie Asn Thr Glu 165 Ala Arg Asn Ser Gly Arg170 Ala Ala Leu Leu 175 Leu Thr Ala Ala Val 180 Ser Asn Ser Pro Arg Val Asn185 Gly Leu Asn 190 Tyr Pro 35 Val Glu Ser 195 Leu Ala Arg Asn Leu Asp Trp He200 Asn Leu 205 Met Ala Tyr Asp Phe210 Tyr Gly Pro Asn Trp Ser Pro Ser Gin215 Thr 220 Asn Ser His Ala 40 Gin Leu 225 Phe Asp Pro Val 230 Asn His Val Ser Gly235 Ser Asp Gly He Asn 240 Ala Trp lie Gin Ala 245 Gly Val Pro Thr Lys Lys250 Leu Val Leu Gly 255 He 45 Pro Phe Tyr Gly 260 Tyr Ala Trp Arg Leu Val Asn265 Ala Asn He 270 His Gly 50 Leu Arg Ala 275 Pro Ala Ala Gly Lys Ser Asn Val280 Gly Ala 285 Val Asp Asp Gly Ser Met Thr Tyr Asn Arg He Arg Asp Tyr He val Glu Ser Arg 290 295 300 £5

Ala Thr Thr Val Tyr Asn Ala Thr lie Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser 305 310 315 320 Gly Ser Asn Trp lie Ser Tyr Asp Asp Thr Gin Thr Val Arg Asn Lys 5 325 330 335 Val Asn Tyr Val Lys Gly Arg Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His 340 345 350 10 Val Ala Gly Asp Gin Asn Trp Gly Leu Ser Arg Thr Ala Ser Gin Thr 355 360 365 Trp Gly Val Ser Phe Gin Glu Met Lys 370 375 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 9: (i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА : (A) ДЪЛЖИНА : 17 двойки бази (B) ТИП : нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП : сДНК! ш) ХИПОТЕТИЧНОСТ : ДА ixi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO : 9:

ААГАССгАСГС ACTATAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 10 : ii) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА: (А) ДЪЛЖИНА: 21 двойки бази<В) ТИП: нуклеинова киселинаiC) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна ОД МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНКЕЙ) ХИПОТЕТИЧНОСТ : ДА ixi) ОПИСА П/IE НЛ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEO ID NO: 10: 1CICCGGCAA CI AG ED GCA < G6 (п) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДЛ (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 11:

GTCATAGTTC ACATATCTGT TGCC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 12: (i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСИТИКА : (A) ДЪЛЖИНА: 25 двойки бази (B) ТИП : нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ : едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна(п) МОЛЕКУЛЕН ТИП : сДНК (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 12:

TTTAAACTCG AAGTCACAAA TTAAA 12) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 13 : €(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА : (А) ДЪЛЖИНА : 25 двойки бази (В) ТИП: нуклеинова киселина (С) ВЕРИЖНОСТ: едноберижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарнаiii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК(iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEO Го NO: 13 :

GT TTTAAACTCG GATCCACAAA ТТЛАХ

X (2) ИНФОРМАЦИЯ 3ASEQ ID NO: 14: (i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА : (A) ДЪЛЖИНА: 12двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна(й) МОЛЕКУЛЕН ТИП : сДНК(iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID N0:14 AATTGTCTAG АС

Claims (13)

ПРЕТЕНЦИИ

1. Растителен протеин, изолиран от други растителни протеини,който протеин притежава ендо- хитиназна активност, фунгициднаактивност и молекулно тегло от около 40 до 43 kDa както е установено снатриева додецилсулфат полиакриламидна електрофореза, характеризиращсе с това, че фактически няма екзо- хитиназна активност.

1. Растителен протеин, изолиран от други растителни протеини,който притежава ендо- хитиназна активност, фунгицидна активност имолекулно тегло от около 40 до 43 kDa, както следва от натриеватадодецил сулфатна полиакриламидна електрофореза.

2. Растителен протеин съагасно претенция 1, характеризиращ се стова, че хитиназната активност в третирания с тритий хитин катосубстрат е > 200 пъти по- ниска, ако растителната хитиназа е от клас 1 ихитиназна активност в разтворим хитин като субстрат. която е по- високаот тази на растителната хитиназа от клас I и за предпочитане получаванаот листа на TMV- индуцирани тютюневи растения.

2. Растителен протеин, изолиран от други растителни протеинисъгласно претенция 1, който е получен от листата на TMV- индуциранитютюневи растения.

3. Изолиран протеин съгласно която и да е от претенции 1- 2,включваща амино киселинна последователност както е представена наSEQIDNO : 1 или 7, или негов фрагмент, притежаващ хитиназнатаактивност на този протеин, където една или повече амино киселини са Q заместени, делетирани или добавени без загуба на хитиназна активонсот. 4. фунгициден състав, включващ като активна компонента протеинсъгласно която и да е от претенции от 1 до 3, за предпочитане включващ и β-1,3 - глюканаза, и най- добре включващ в допълнение към посочения протеиндруг такъв, действащ в синергизъм върху гъбите.

3. Изолиран протеин съгласно претенция 1, включващ амино киселиннапоследователност както е представена в SEQIDNO : 1 или 7, или неговфрагмент, притежаващ хитиназна активност.

4. Протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 3, където еднаили повече амино киселини са заместени, делетирани или добавени без загубана хитиназна активност. 5. фунгициден състав , включващ като активен инградиент протеин,съгласно която и да е от претенции от 1 до 4. 6. фунгициден състав съгласно претенция 5, който включва още β- 1, 3-глюканазназа и или хитиназа. 7. фунгициден състав съгласно претенция 5, който включвадопълнително към посочения протеин и друг протеин, действащ всинергизъм с него върху гъбите.

5. Изолирана ДНК последователност която включва отворена четящарамка кодираща протеин съгласно претенция 1, за предпочитане отвореначетяща рамка, кодираща амино киселинната последователност от 49 SEQIDNO: 1 или SEQ1DNO : 7 и ДНК последователност, хибридизираща се снея при строго определени условия.

6. Растителна експресионна ДНК последователност, която ВключваДНК последователност кодираща протеин съгласно претенция 1, илипрекурсор на дадения протеин, като тази ДНК последователност е свързанапо физичен начин с регулаторни елементи, необходими за експресия напосочената ДНК последователност в растения под формата на тозипротеин, за предпочитане ДНК последователност, която кодира протеиновпрекурсор с амино киселинна последователност, представена от SEQIDNO : I или 7, за предпочитане ДНК последователност която включва ДНКпоследователността както е представена на SEQIDNO: 1 или 7.

7. Среда за клониране или вектор, съдържащ ДНК последователностсъгласно претенция 6.

8. Бактериален щам съдържащ среда за клониране или вектор съгласнопретенция 7, за предпочитане бактериален щам от рода Agrobacterium.

8. Изолирана ДНК последователност, която включва отворена четящарамка. кодираща протеина съгласно претенция 1.

9. Растителен геном в който е инкорпорирана растителнаекспресионна рекомбинантна ДНК последователност съгласно претенция 6.

9. Изолирана ДНК последователност, която включва отворена четящарамка. кодираща амино киселинната последователност на SEQIDNO: 1 46 SEQIDNO Ί, u ДНК последователност, хибридизираща се c нея при строгоопределени условия.

10. Растителна клетка която притежава растителен рекомбинантенгеном съгласно претенция 9, или протопласт на тази клетка.

10. Растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователност,която включва ДНК последователност, кодираща протеин съгласнопретенция 1, или прекурсор на този протеин, при което тази ДНКпоследователност е свързана по физичен начин с регулаторни елементи,необходими за експресията на посочената ДНК последователност врастения под формата на посочения протеин.

10. Растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователност,която включва ДНК последователност, кодираща протеин съгласнопретенция 1, или прекурсор на този протеин, при което тази ДНКпоследователност е свързана по физичен начин с регулаторни елементи,необходими за експресията на посочената ДНК последователност врастения под формата на посочения протеин.

11. Растение или материал от него, като луковица, цвят, плод, листо,полен, корен или коренова култура, сем, стебло, грудка или микрогрудка и др.,съдържащи една или повече клетки съгласно претенция 10, където запредпочитане всички клетки притежават рекомбинантен растителен ДНКгеном съгласно претенция 9, още повече растение или материал от него,който е по- малко възприемчив на гъбна инфекция.

11. Растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователностсъгласно претенция 10, където посочената ДНК последователност кодирапрскурсорен протеин с амино киселиннна последователност, представена наSEQIDNO: 1или7.

11. Растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователностсъгласно претенция 10, където посочената ДНК последователност кодирапрекурсорен протеин с амино киселиннна последователност, представена наSEQIDNO : 1 или 7.

12. Метод за селекциониране на растителен сорт с намаленавъзприемчивост спрямо гъби, характеризиращ се с това. че поне една от 50 родителските линии притежава рекомбинантен ДНК геном съгласно претенция 9.

12. Растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователностсъгласно пренеция 10, която включва ДНК последователността както епредставена на SEQIDNO : 1 или 7.

13. Среда за клониране или вектор, съдържащ ДНК последователностсъгласно претенция 10.

14. Бактериален щам съдържащ клониращ вектор или среда съгласнопретенция 13.

15. Бактериален щам от рода Agro bacterium, съдържащ вектор съгласнопретенция 13.

16. Растителен геном, в който е инкорпорирана растителнарекомбинантна ДНК последователност съгласно претенция 10.

17. Растителна клетка, притежаваща рекомбинантен геном съгласнопретенция 16 или протопласт на тази клетка. 47

18. Растение или материал от него, като луковица, цвят, плод, листо,полен, корен или коренова култура, семе, стебло, грудка или микрогрудка идруги, съдържащ една или повече клетки съгласно претенция 20.

19. Растение или растителен материал, като луковица, цвят, листо,полен, корен или коренова култура, семе, стебло, грудка или микрогрудка идруги, където по същество всички клетки притежават растителенрекомбинантен ДНК геном съгласно претенция 16.

20. Растение или материал от него, съгласно претенция 19, които сапо- малко възприемчиви на гъбна инфекция.

21. Метод за селекциониране на растителен сорт с намаленавъзприемчивост спрямо гъби, характеризиращ се с това, че поне една отродителските линии притежава рекомбинантен ДНК геном съгласнопретенция 16.

22. Метод за инхибиране растежа и/ или развитието на гъби,посредспюм контактуване на гъбите , или създаване на контакт междугъбите с ефективно количество от хитиназата съгласно претенция 1. 4S ИЗМЕНЕНИ ПРЕТЕНЦИИ РСТ-6034 януари 30,1996

12. Растителна експресионна рекомбинантна ДНК последователностсъгласно пренеция 10, която включва ДНК последователността както епредставена на SEQIDNO : 1 или 7.

13. Среда за клониране или вектор, съдържащ ДНК последователностсъгласно претенция 10.

14. Бактериален щам съдържащ клониращ вектор или среда съгласнопретенция 13.

15. Бактериален щам от рода Agrobacterium , съдържащ вектор съгласнопретенция 13.

16. Растителен геном, в който е инкорпорирана растителнарекомбинантна ДНК последователност съгласно претенция 10.

17. Растителна клетка, притежаваща рекомбинантен геном съгласнопретенция 16 или протопласт на тази клетка. 47

SEQIDNO 7, и ДНК последователност, хибридизираща се с нея при строгоопределени условия.

13. Метод за инхибиране на растежа и/ или развитието на гъби, чрез контактуване на гъбите, или чрез поставянето им контакт с ефективно количество от хитиназа, съгласно претенция 1.

51