PT97965B - Processo para a preparacao de novos fragmentos peptidicos, de sequencias de dna que os codificam,de moleculas de dna que as contem e plantas transgenicas que compreendem tais moleculas - Google Patents

Processo para a preparacao de novos fragmentos peptidicos, de sequencias de dna que os codificam,de moleculas de dna que as contem e plantas transgenicas que compreendem tais moleculas Download PDF

Info

Publication number
PT97965B
PT97965B PT97965A PT9796591A PT97965B PT 97965 B PT97965 B PT 97965B PT 97965 A PT97965 A PT 97965A PT 9796591 A PT9796591 A PT 9796591A PT 97965 B PT97965 B PT 97965B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
plant
sequence
dna
gene
targeting
Prior art date
Application number
PT97965A
Other languages
English (en)
Other versions
PT97965A (pt
Inventor
Thomas Boller
Jean-Marc Neuhaus
John Ryals
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=4223728&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT97965(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of PT97965A publication Critical patent/PT97965A/pt
Publication of PT97965B publication Critical patent/PT97965B/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8221—Transit peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/244—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01006—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01039—Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase (3.2.1.39)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01058—Glucan 1,3-beta-glucosidase (3.2.1.58)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01073—Licheninase (3.2.1.73)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Stereo-Broadcasting Methods (AREA)
  • Networks Using Active Elements (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

3 -
I
0 presente invento está relacionado cora novos fragmentos peptídicos [sinal de direccionamento] de proteínas dos vacúolos vegetais e que, em ligação operacional com qualquer molécula proteica pretendida, assegura que as proteínas associadas com aqueles fragmentos peptídicos sejam dirigidas específica-mente para o vacúolo vegetal, 0 presente invento está relacionado também com sequências de DNA que codificam fragmentos peptídicos caracterisados mais detalhadamente a seguir e que, em ligação operacional com qualquer DNA expressável pretendido, resulta num produto do gene que ê dirigido especificamente para o vacuolo vegetal e seus rautantes e variantes, 0 presente invento está relacionado ainda com moléculas de DNA recombiante que compreendem a sequência de DNA de acordo com o invento em ligação operacional com um DNA expressável e cora vectores derivados dele. Também estão incluidas células hospedeiras e/ou organismos hospedeiros, incluindo plantas transgénicas, que compreendem o referido DNA recombinante ou vectores derivados dele. 0 presente invento está relacionado também com processos para a produção das sequências de DNA de acordo com o invento e com moléculas de DNA recombinante e vectores compreendendo aquelas sequências de DNA e com a sua utilização na produção de plantas transgénicas.
Em engenharia genética, houve recentemente um interesse cada ves maior em ir para lá da expressão pura de um gene estranho inserido para identificar sequências de DNAcodificadoras das chamadas sequências sinal que permitem ao produto do gene associado, de acordo com a sua função, atingir um destino especifico, 4 - %
onde pode desenvolver a sua actividade óptima ou ser guardado de forma adequada, Relativamente à planta como um todo, isto significa que foram feitas tentativas por exemplo para identificar ou desenvolver promotores que permitam a expressão específica de tecido e/ou de desenvolvimento de um gene estranho inserido. A colocação de genes estranhos ou seus produtos de expressão sob direccionamento ou destino orientado não é só importante ao nível vegetal como também pode ter grande importância mesmo ao nível celular, especialmente em relação à eficácia da transformação.
Por exemplo, sabe-se que nas células vegetais tal como noutras células eucarióticas se bem que a maioria das proteínas seja sintetizada em ribossomas citoplasmãtieos, um grande número daquelas proteínas são necessárias em compartimentos subcelulares muito diferentes. A única exeepção é constituída por algumas proteínas mitocondriais e de cloroplastos, as quais são produzidas no local onde são usadas. As proteínas produzidas no citoplasma por outro lado são transportadas ao longo do sistema endomembranar passando através da célula para o compartimento lítico [vacuolo, lisossoma] da célula e para o espaço extrace-iul&r ou são retiradas directament-e pelo seu compartimento particular Evaeúolo, cloroplasto, peroxissoma],
Para a manutenção desta compartimentalisação ao nível suboelular, deve haver transporte específico e sistemas de mobilizadores dentro da célula que assegurem que as proteínas produzidas no citoplasma sejam distribuídas de acordo com a sua função, estas proteínas devem portanto conter um ou mais elementos de- informação que permitam que o referido sistema de transporte da célula reconheça o seu próprio substrato particular e dirija-o para o seu destino específico. Assim, por exemplo, em Ν' /
* i « «C muitos dos precursores citoplasmãticos de proteínas mitocondriais e de cloroplastos foi possível detectar no extremo N-terminal ct chamado peptídeo de trânsito que assegura que as proteínas sejam internaiiaadas pelo seu compartimento particular. De uma forma semelhante, as proteínas nucleares têm uma sequência específica do núcleo. É de particular importância para o transporte intracelular de proteínas o sistema endornembranar da célula. Este sistema endornembranar, que passa através da célula e é composto pelo z^eticulo endoplasmático e aparelho de Golgi serve essencialmente para transportar proteínas especialemente proteínas produ-sidas no citoplasma, para o compartimento lítico Evacúolo, lisossomal e para o espaço extracelular.
As proteínas transportadas através do sistema endomeia-hranar passam primeiro para o retículo endoplasmático. 0 sinal de transporte necessário para este passo sendo representado por uma sequência sinal e o extremo N-terminal da molécula, o chamado peptídeo sinal. Logo que este sinal desempenhe as suas funções é clivado proteoliticamente. da proteína pz'ecursora. Devido à sua função específica, este tipo de sequência de peptídeo sinal foi conservado num gz-au elevado durante a evolução em todas as células vivas, independentemente de serem bactérias, leveduras, fungos, animais ou plantas.
Um outro passo de o o mpart i menta1is a ção tem então lugar no vaparelho de Golgi. onde a separação das proteínas destinadas ao compartimento lítico Evacuolo, lisossomal das proteínas destinadas â secreção para o espaço extracelular tem lugar. Em experiências com leveduras e animais encontrou-se que as proteínas que não contêm um sinal adicional são aparentemente seereta-das automaticamente para o espaço extracelular, enquanto que as ι
proteínas que não contêm tal sinal adicional de compartimentali-sação são despejadas no compartimento lítico. Â natureaa deste sinal de compartimentaliaação pode variar muito. Nos animais até agora estudados, por exemplo, ela é uma modificação específica dentro da cadeia de glicanos de glicoproteínas, nomeadamente um grupo manose-6-fosfato. Este grupo é reconhecido por um receptor específico de manose-6-fosfa-to, com o resultado de o as correspondentes proteínas em vesículas específicas serem libertadas do aparelho de Golgi e transportadas para os lisossomas. No entanto, não foi até aqui possível determinar qual a sequência polipeptídica que dá impeto à fosfo-rílação de um grupo rnanose na cadeia lateral de glicanos.
Em leveduras, o correspondente sinal de corapartimenta-lísação para o compartimento lítico não é uma cadeia de glicano mas uma sequência de aminoãcidos que apôs desprender-se do peptídeo sinal forma o extremo N da proteína. Este sinal de díreccionamento N-terminal para o vacúolo é geralraente retirado no vacúolo por meio de uma proteinase A. Muitas veses a proteína transportada para o vacúolo torna-se uma enaima cataiiticamente aefcíva apenas como resultado da remoção do sinal de direcciona-mento»
Nas plantas, a questão do sinal de díreccionamento responsável pelo díreccionamento de proteínas para o vacúolo é de particular interesse- especialmente do ponto de vista da aplicado- pois o vacúolo não sõ representa o compartimento lítico da célula vegetal como também forma o maior compartimento de reservas para o armasenamento de substâncias de reserva, produtos de desintoxicação e substâncias de defesa CBoller e Wiemken (1986)3.
Será portanto vantajoso ser capas de dirigir proteínas associadas ao melhoramento do teor nutritivo de urna planta especificarnente para o vacúolo e guardá-las lá, pois este é de longe o maior compartimento na célula vegetal para substâncias dissolvidas. As proteínas de reserva mais importantes dos tubérculos, bolbos, raízes e caules, estão por exemplo localizadas nos vacúolos das células que compõem aquees orgãos CBoller e Wiemke C19S6)]. Ainda, as proteínas de reserva da maior parte das sementes estão situadas nos chamados corpos proteicos, vacúolos especializados aos quais os mesmos sinais de direccionamento dos vacúolos dos orgãos vegetativos parecem aplicar-se.
Considerações semelhantes também se aplicara a substâncias que podem ser usadas no controle de pragas ou doenças, especialmente quando aquelas substâncias são tóxicas para a própria planta. É portanto vantajoso depositar aquelas substâncias também no vacúolo vegetal. Finalmente em certos casos o vacúolo também serve como orgão de desintoxicação de produtos sintetizados pela planta CBoller e Wiernke (1986)3. Foram feitas tentativas para dirigir enzimas de desintoxicação especificarnente também para o vacúolo.
No entanto, surge precisamente o problema oposto, por exemplo, no caso do ataque das plantas cultivadas por certos fungos patogénieos. Estes gatogénios infectam a sua planta hospedeira espalhando o seu rnieélio através dos espaços interee-lulares da planta. Uma vez que as quitinases e glucanases que podem ser usadas no controle destes patogénios estão muitas vezes localiaadas no vacúolo, a sua biodísponibilidade no espaço intercelular está naturalmente muito limitada. Neste caso, será portanto desejável poder-se descarregar aquelas proteínas especi-ficamente par o compartimento extracelular de forma a aumentar a t t
Modisponibilidade daquelas substâncias no espaço intercelular e permitir assim o controle eficaz do fungo patogénico. A secreção para o espaço extracelular é também vantajosa quando substâncias específicas têm de ser produzidas usando culturas celulare. Naquele caso, as proteínas estranhas dirigidas podem muito facilmente ser isoladas a partir do meio circundante pois são secretadas para o espaço extracelular, 0 rebentamento das células que é necessário no caso da produção intracelular pode ser omitido.
No entanto, não foi até agora possível identificar ou isolar tal sinal de direccionamento para o vacúolo vegetal.
Assumindo que um sinal de direccionamento N-terminal comparável ao das leveduras poderá ser responsável nas plantas pelo direeionamento das proteínas para o vacúolo, Tague e Chris-peels (1987) ligaram várias partes da molécula da fito-hema-glutinina de ervilhas a um gene repórter e testaram-nas em leveduras. Encontrou-se que no hospedeiro levedura, também rio caso da fito-hemaglutinina, a parte N-terminal da molécula actua como um sinal de direccionamento para o vacúolo.
Uma outra proteína do vacúolo, S-l,3-glucanase básica, foi sintetizada com uma extensão C-terminal que é perdida à medida que a molécula sofre maturação. 0 mesmo se aplica às leetinas do arroz, cevada e trigo Caglutinina de germén de trigo), á função desta extensão foi até aqui desconhecida.
Uma vez que uma comparação dos extremos C de várias proteínas do vacúolo não revelou homologias aparentes neste campo, a. hipótese até agora favorecida foi que, tal coroo com as f.
leveduras, a actlvidade sinal decisiva nas plantas deriva do extremo N daquelas proteínas dos vácuolos.
Um dos principais problemas a ser resolvido dentro do âmbito deste invento foi portanto identificar e isolar um frag-) mento peptídico [sequência de direccionamento] responsável pelo direccionamento de uma molécula de proteína associada especifi-camente para o vacúolo da célula vegetal e também a sequência de BM codificadora do refeido fragmento peptídico. * Surpreendentemente, dentro do âmbito do presente invento foi agora possível solucionar este problema pela utilisa-ção de processos, alguns dos quais sao conhecidos.
Betalhadamente, o presente invento está relacionado com um fragmento peptídico curto que é responsável pelo direccionamento de qualquer molécula proteica associada com interesse espeeificamente para o vacúolo vegetal e com o DM codificador do referido fragmento peptídico. A referida molécula de proteína associada pode ser uma proteína de origem homóloga ou heteróloga relativamente â sequência de direccionamento usada. É dada preferência a um fragmento peptídico curto obtido a partir da região C-terminal de uma molécula de proteína presente naturalmente no vacúolo e que em associação com qualquer molécula de proteína pretendida leva a que aquela molécula sela dirigida de forma orientada para o vacúolo. É dada preferência também a um DNA codificador do referido fragmento peptídico e obtido a partir da correspondente região terminal 3 * do gene correspondente codificador da molécula de proteína presente naturalmente no vacúolo. É dada preferência especial a um fragmento peptídico curto que é obtido a partir da região C-terminal de uma molécula de quitinase presente naturalmente no vacúolo e que em associação coi» qualquer molécula de proteína pretendida fas com que aquela molécula seja dirigida de forma orientada para o vacúolo e ao PM que codifica o referido fragmento peptídico e sendo obtido a partir da região terminal 3’ de um gene de quitinase vegetal. É dada preferência especial a um fragmento peptídico que actua como sinal de direcionamento para o vacúolo vegetal e qu tem a seguinte sequência de aminoácidos que está apresentada em SEQ ID NQ: 1 e 2:
Arg Ser Fen Gli Asn Gli Leu Leu Vai Asp Tre Met
e a sequências de DM que codificam o referido fragmento peptídico que tem a seguinte fórmula geral, que é conhecida como SEQ ID Wí' l
CGK/AGR TCH/AGW TTY GGH AAY GGH CTR/TTR TTR/CTH GTN GAY km ÃTG TAA N é. A ou G ou R G ou A; 8 § A ou T/U; Y é T/U ou C. S dada preferência âs sequências de BNA que compreendem na sua maior parte os eodoes preferencialmente usados pela planta. 11 -
É dada preferência especial a uma sequência de DNA que está na forma substancialmente pura e que é obtido, por exemplo, a partir de do extremo 3’ [extensão C-terminal] de um gene da quitínase básica de Nicotiana tabacum L.c.v. de plantas Havana 425 e tendo essencialmente a seguinte sequência de aminoãcidos, que está apresentada em SEQ ID NO:2:
AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA S dada também preferência a uma sequência de DNA numa forma substancialmente pura e que é obtida, por exemplo, a partir do extremo 3*-terminal [extensão C-terminal] de um gene de glucanase básica de Nicotiana tabacum L.c.v. Havana 425 e tera essencialmente a seguinte sequência de DNA, que está apresentada na SEQ ID NO: 12:
GTC TCT GGT GGA GTT TGG GAC AGT TCA GTT GAA ACT AAT GCT ACT GCT TCT CTC GTA AGT GAG AG TGA 0 fragmento peptídico codificado pela referida sequência de DNA, fragmento peptídico esse que actua como sinal de direcionamento para o vacúolo vagetal e tem a seguinte sequência de aminoácidos, que está apresentada em SEQ ID NO: 12, está também inoluido no presente invento:
Vai Ser Gli Gli Vai Trp Asp Ser Ser Vai Glu Tre Asn Ala Tre Ala Ser Leu Vai Ser Glu Set
Também estão inoluidos todos os derivados das sequências de DNA descritas mais detalhadamente atrás que. são substan-cialmente homólogas daquelas sequências e ainda possuem as propriedades essenciais do invento, ou seja que codificam um i i
peptídeo C-terminal que actua como o sinal de direocionamento para o vacúolo vegetal.
Dentro do âmbito deste invento, uma sequência de BNA é substancialmente homóloga de uma segunda sequência de DNA se pelo menos 60%, de preferência pelo menos 80% e muito especialmente de preferência pelo menos 90% das secções activas das sequências de DNA forem homólogas umas das outras.
Os referidos derivados das sequências de DNA de acordo com o invento podem ser variantes ou mutantes naturais ou, especialmente, eles podem ser variantes ou mutantes que podem ser produsidos especificamente por meio de métodos de mutagenisação conhecidos. A mutação deve ser entendida como englobando a deleção e a inserção de uma ou mais bases e a substituição de uma ou roais bases ou uma combinação de ambos os meios. Iste é o caso especialmente quando a referida substituição de bases é acompanhada de uma mutação silenciosa que não resulta na substituição de amino-ácidOS.
Exemplos de tais mutantes. que também estão incluídos no presente invento, são representados pelas sequências de DNA referidas abaixo e mostradas em SEQ ID NO; 3 a 7. Estes mutantes podem ser produsidos a partir de sequências parentais mostradas ero SEQ ID MO; 1 e 2 por mutagénese mediada por oligonucleótidos e codificara fragmentos peptídicos que ainda possuem algumas propriedades de direocionamento como os fragmentos codificados pelas referidas sequências parentais; 13 -
Ca) GGA i» s Cb) GGA MT Cc) GGA AAT Cd) A GAT CTT TTG GGA AAT Ce) ATC GGT
GAT CTT TTA GTG GAT ACT ATG TAá GGA CTT TTA GTC AAT ACT ATG ΤΑΔ GGÂ CTT TTA GTC CGT ACT ATG TAA GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TM GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TM
Os espaços vasios nas sequências (a) a (c) estão relacionados com a região da sequência de direcionamento mutage-nisada que não tem diferenças comparado com a sequência de partida.
Também estão incluídos no presenta invento fragmentos peptídicos que são codificados pelas sequências de DNA atrás referidase que ainda têm as mesmas propriedades de direcionamento dos fragmentos peptídicos naturais não midifiçados codificados peias referidas sequências parentais de acordo com SEQ ID NO:1 e E dada especial preferência a fragmentos peptídicos que aotuam como sequência sinal para o vacúolo e que têm as seguintes sequências de aminoácidos, que estão apresentadas em SEQ ID NO: 3 a 1 ' (a) Cb) Ce) Cd) Ce)
Asp Tre Het fim Asn Tre Met Fim Arg Tre Met Fia Asp Tre Met Fia Asp Tre Met Fia
Gli Lis asp Leu Leu Vai Gli Asn Gli Leu Leu Vai Gli Asn Gli Leu Leu Vai Asp Leu Leu Gli Asn Gli Leu Leu Vai Ile Gli Asp Leu Leu Vai relacionados
Os espaços vasios nas com a região da sequências (a) a (c) estão sequência de direcionamento iButageniaada que não tem diferenças comparado com as sequências de partida.
Esta lista, que ê dada como exemplo, não pretende ser limitante servindo apenas para demonstrar que variantes das sequências referidas atrás sendo preferidas podem ser facilmente produzidas pelos familiarizados com a matéria sem que a propriedade daquelas sequências que é essencial para o invento seda perdida. 0 presente invento também inclui fragmentos ou sequências parciais que são obtidas a partir das sequências de DMA descritos mais detalhadamente acima ou a partir de derivados daquelas sequências de BNA e que ainda têm as propriedades específicas das sequências de partidva. S dada especial preferência dentro do âmbito deste invento a fragmentos de DM que são obtidos a partir da sequência de BM do invento de acordo com SEQ IB NO: 2 e têm essencialmente as seguintes sequências de nucleótidos, as quais estão apresentadas em SEQ ID NO;8 e 9:
CTT ΤΤΔ GTC GAT ACT ATG TAA GGâ CTT ΤΤΔ GTC GAT ACT ATG TAA que
As sequências de BNA mostradas atrás codificam fragmentos peptidioos que aetuam como sinal de direcionamento para o vacúolo vegetal e têm a seguinte sequência de aminoácidos, está apresentada em SEQ ID NO:8 e 3:
Leu Leu Vai Asp Tre Met Fia Gli Leu Leu Vai Asp Tre Met Fias O presente invento está portanto também relacionado com os referidos fragmentos. 0 presente invento está ainda relacionado com moléculas de EJNA recombinante- que compreendem uma construção genética quimérica em que qualquer DMA expressável pretendido está opera-cionalmente ligado a uma das sequências de DMA de acordo com o invento assim como a sinais de expressão activos em células vegetais e, facultativamente, a outras sequências codificadoras e/ou não codificadoras da região 3’ e/ou 5S, de forma que quando da transformação de uma célula vegetal, o produto de expressão é dirigido especificamente para o vacôolo vegetal. É vantajoso para o DNA expressável na região terminal 5* compreender uma sequência que codifica um peptídeo sinal N-terminal capas de funcionar na célula vegetal, ou estar ligado a tal sequência. Ainda a molécula de DNA pode compreender outras secções da sequência que codificam fragmentos peptídicos que como um todo contribuem para o melhoramento da competência para admissão no vactiolo, por exemplo o fragmento propeptidico descoberto por Matsuoka K e Nakamura K na extensão N-terminal de esporamina íMatsuoka K e NakamuraK na extensão N-terminal de esporamina [Matsuoka K e Nakamura K (1991)3. 0 presente invento também inclui clonagem, transformação e vectores de expressão que compreendem a referida molécula de DNA recombinante de acordo com o invento e organismos hospedeiros transformados com os referidos vectores.
Este invento, está ainda relacionado com os chamados vectores vai-vern ou vectores binários que compreendem a referida molécula de DNA reeombinante de acordo com o invento e que são capaaes de se replicarem estavelmente tanto em E. coli como em iL. tumefaciens.
Dos organismos hospedeiros é dada preferência especial a hospedeiros vegetais seleccionados do grupo constituído por protoplastos, células, cios, tecidos, orgãos, aigotos, embriões, polen e/ou sementes de plantas e também, especialmente, plantas completas de preferência férteis que tenham sido transformadas com o referido DNA reeombinante. As plantas completas podem ser transformadas dire-ctamente como tal com a molécula de DNA recom-binante de acordo com o invento ou podem ser obtidas por regeneração de protoplastos, células e/ou tecidos previamente transformados.
Sao muito especialmente preferidas as plantas transgé-nicas, mas especialmente plantas transgénicas férteis, que compreendem uma das construções de acordo com o invento e em que o produto do gene expresso, conforme pretendido está situado no vacúolo. 0 presente invento também inclui todo o material de propagação de uma planta transgénioa, a referida planta transgé-nioa tendo sido formada por transformação directa com uma das moléculas de DNA reeombinante de acordo com o invento ou sendo obtida por regeneração de protoplastos, células, calos, tecidos, orgãos, aigotos, embriões, pólen e/ou sementes previamente transformados mas sem lhes estar limitado.
Dentro do âmbito deste invento, a propagação de material vegetal deve ser entendida como sendo qualquer material 17 vegetal que possa ser propagado sexuadamente ou assexuadamente e in vitro ou In vivo, sendo dada preferência a protoplastos, células, calos, tecidos, orgãos, óvulos, zigotos, embriões, pólen ou sementes que são obtidas a partir de uma planta transgénica de acordo com o invento. Iste invento está relacionado também com a progénie das referidas plantas e com seus mutantes e variantes, incluindo os derivados das plantas obtidas por fusão de células somáticas, modificação genética ou selecção de mutantes. O presente invento está ainda relacionado com processos Λ ía) para a produção de uma das sequências de DNA de acordo com o invento;
Cb) para a produção das moléculas de. DNA recombinante de acordo com o invento que compreendem a sequência de DNA atrás citada de acordo com o invento em ligação operacional com qualquer sequência de DNA expressãvel pretendida, a referida sequência de DNA estando preferencialmente sob o controle regulador de sinais de expressão vegetais; (c> para a produção de vectores de clonagem, transformação e/ou expressão que compreendem a referida molécula de DNA recombinante de acordo com o invento;
Cd) para a produção de organismos hospedeiros transformados, especíalmente hospedeiros vegetais seleccionados do grupo constituído por protoplastos, células, calos, tecidos, orgãos, sigotos, embriões, pólen e/ou sementes e também, especialmente plantas completas férteis;
Ce) para a produção de material de propagação partindo do material vegetal vegetal transformado, mas especialmente para a produção de progénie sexuada e assexuada. 18
Está também incluido neste invento um processo para o direcionamento orientado dos produtos de expressão para o vacôolo vegetal, processo que se caracterisa essencialmente por ía> em primeiro lugar isolamento, a partir de uma fonte adequada ou síntese por meio de processos conhecidos, da sequência de DM responsável para o direcionamento específico para o vacúolo; íb> inserção da referida sequência de DM de forma operacional no extremo 3*-terminal de qualquer sequência de DNÂ expressável pretendida; íc) clonagem da construção finalizada num vector de expressão vegetal sob o controle de sinais de expressão aetivos em plantas; (d) transformação do referido vector de expressão num hospedeiro vegetal e sua expressão nele. É vantajoso para o DNA expressável na região 5‘-terminal compreender uma sequência que codifica um peptídeo sinal N-terminal capas de funcionar na célula vegetal ou estar ligado de forma operacional a tal sequência. Ainda, a molécula de BHA pode compreender outras secções da sequência que codificai» fragmentos peptidicos que como um todo contribuem para o melhoramento da admissão para o vacúolo, por exemplo o propeptídeo descoberto por Matsuoka K e Nakamura K na extensão N-terminal de esporamina CHatsuoka K e Nakamura K (1991)].
Ho decurso dos estudos realizados dentro do âmbito deste invento, encontrou-se que proteínas que contêm naturalmente, uma das sequências de direcionamento de acordo com o invento e que sãoportanto normalmente dirigidas para o vacúolo são secreta-das para o espaço extracelular quando perdem a sequência sinal de acordo com o invento. 19 0 presente invento está portanto relacionado com um processo para a descarga para o espaço extracelular de proteínas vegetais que naturalraente compreendem uma sequência de direciona-raento e que portanto são normalmente dirigidas para um dos compartimentos celulares, mas especialmente para o vacóolo , processo que essencialmente se caracteriaa por ia} isolamento de uma sequência de DNA codificadora de tal proteína, mas especialmente uma proteína do vacúolo; íb) remoção da grelha de leitura aberta da sequência de direcio-namento no extremo C responsável pelo dtrecionamento para o compartimento celular particular, por exemplo através da inserção de um codão de paragem directamente antes da extensão C-terminal ou por remoção da extensão C-terminal; (c) inserção da referida sequência de DNA mutageniaada num vector de expressão vegetal adequado; e
Cd)transformação da construção acabada num hospedeiro vegetal.
Beflalgoes
Na descrição que se segue é usada uma série de expressões habituais na tecnologia de DNA recombinante e em genética de pl&ntas, Para assegurar uma compreensão clara e uniforme da descrição e reivindicações e também do âmbito em que as referidas expressões estão inseridas, são dadas as definições que se seguem.
Material vegetal: Partes de plantas que são viáveis eis cultura ou que são viáveis como tal, como seda protoplastos, células, calos, tecidos, embriões, orgãos vegetais, rebentos, sementes, etc,, e também plantas completas, - 20 - Célula vegetal: Unidade estrutural e fisiológica da planta, compreendendo um protoplasto e uma parede vegetal.
Frotoplasto: Célula vegetal "nua" que não tem parede celular e que foi isolada a partir de células ou tecidos vegetais e tem o potencial para regenerar para um clone celular ou planta completa.
Tecido vegetal: Grupo de células vegetais organizadas na forma de urna unidade estrutural e funcional.
Orgão vegetal: Unidade estrutural e funcional compreendendo vários tecidos, por exemplo raiz, caule, folha ou embrião.
Gene(s) ou DM heterólogo: Uma sequência de DNA que codifica um produto ou produtos específicos ou desempenha uma função biológica e que deriva de uma espécie daquela em que se vai inserir o referido gene; a referida sequência de PM é também referida como um gene estranho ou DNA estranho.
Gene(s) ou DMA_homólogo: Uma sequência de DNA que codifica um ou mais produros específicos ou desempenha uma função biológica e que deriva da mesma espécie era que o referido gene vai ser inserido.
Ssae (S)......OU_DNA Sintético: Uma sequência de DNA que codifica um produto ou produtos específicos ou desempenha uma função biológica e que é produzido por meios sintéticos.
Fromótor .vegetal: Uma sequência de controle da expressão de dNA que assegura a transcrição de qualquer sequência de DNA homologa ou heterôloga numa planta, desde que a referida sequência de gene esteia ligada operacionalraente a tal promotor.
Sequência de_______terminação: Sequência de DM no fim de unidade de transcrição que assinala o fim do processo de transcrição.
Promotor vegetal de súper-produção (QFP): Promotor vegetal que é capaz, numa célula vegetal transgénica, de realizar a expressão de qualquer sequência de um ou mais genes operacionalmente ligada num grau (medido na forma de ENA ou de quantidade de polipeptídeo) que é marcadamente superior ao observado no estado natural nas células hospedeiras que não foram transformadas com o referido QFP,
Região 3*/5* não traduzida: secções de DM localizadas a Jusante/montante da região codificadora que, se bem que transcritas em mBM,, não são traduzidas num polipeptídeo. Esta região contem sequências reguladoras, por exemplo o sitio de ligação ao ribossoma (5’) ou o sinal de poliadenilação (3‘).
Veotor d.e clonagem de DMA: Veículo de clonagem, por exemplo um plasmídeo ou um bacteriofago, contendo todas as sequências sinal necessárias à clonagem de um DM inserido numa célula hospedeira adequada.
Vector de expressão de PM: Veículo de clonagem, por exemplo um plasmídeo ou um bacteriôfago, contendo todas as sequências sinal necessárias à expressão de um DMA inserido numa célula hospedeira adequada.
Vector de transferência de DM; Veículo de transferência. por exemplo urn plasmídeo Ti ou um vírus, que permite a inserção de material genético numa célula hospedeira adequada.
Hutantes. variantes de_piratas tranffgé&iC-agí Derivado de uma planta transgénica que se formou espontaneamente ou artificialmente usando processos conhecidos, por exemplo tratamento com UV, tratamento com agentes mutagénicos, etc. e que ainda tem as características e propriedades da planta de partida que são essenciais para o invento.
Sequência de DM substancialmente pura: Uma sequência de DM isolada na forma substancialmente pura a partir de uma fonte natural ou não natural. Tal sequência pode estar presente num sistema natural, por exemplo em bactérias, vírus ou em células vegetais ou animais, ou, alternativamente, pode ser obtida na forma de DNA sintético ou de cDNA. DNA substanciamente puro é geralmente isolado na forma de um vector que compreende o referido DNA como inserção. Substancialmente puro significa que outras sequências de DNA estão presentes apenas em quantidades negligiveis e totaliaam, por exemplo menos de 5%, de preferência menos de 1% e muito especialmente de preferência menos de 0,1¾.
Taís sequências e os vectores contendo tais sequências estão geralmente em solução aquosa, nomeadamente numa solução tampão ou num dos meios de cultura normalmente usados.
Dentro do âmbito do presente, inventofoi pela primeira ves possível identificar e isolar uma sequência de DNA que codifica um fragmento peptidico curto que ê responsável pelo direcionamento de qualquer produto de gene associado pretendido especificamente para o vacõolo vegetal. São especialmente adequados como material de partida para o isolamento da referida sequência de DNA de acordo com o invento clones de cDNA e/ou DMA genómíco de proteínas que estão presentes naturalmente no vaeúo-lo, por exemplo um clone- de quitinase ou glucanase vegetal. 23 0 presente invento está portanto relacionado especialmente com uma nova sequência de DM substancialmente pura que é obtida a partir da região terminal 3’ de um gene codificador de uma proteína presente naturalmente no vácuolo e que, em ligação operacional com qualquer DNA expressável pretendido, resulta num produto de gene que é dirigido especificamente para o vaeúolo vegetal e com seus mutantes e variantes.
Dentro do âmbito deste invento, é dada preferência especial a uma sequência de DNA que é obtida a partir da região 3’-terminal de um gene de uma quitinase vegetal. É dada igualmert-te pteferência a uma sequência de DNA que é- obtida a partir da região 3’-terminal de um gene de glucanase vegetal.
Fara o isolamento de um gene adequado, mais especialmente de um gene de quitinase ou glucanase adequado, como a fonte da sequência de DNA de acordo com o invento sao preferencialmente usadas bibliotecas genómicas ou de cDNA que possam ser produzidas pelo métodos de convencionais bem conhecidos dos familiarizados com o campo. Os métodos básicos de produção de bibliotecas genómicas ou de cDNA estão descritos detalhadamente, por exemplo, em Maniatis et al. (1982), enquanto que a informação relacionada com a transferência e aplicação daqueles métodos a sistemas vegetais serão encontrados, por exemplo, na referência Mohnen *1985). DNA genômico e cDNA podem ser obtidos de várias formas. DNA genômico, por exemplo, pode ser extraído, usando métodos conhecidos, a partir de células adequadas e purificados.
Numa realização específica do presente invento, o material de partida usado para a produção de cDNA é geralmente mENA, que pode ser isolado a partir de células ou tecidos
seleccionados, mas especialmente a partir de células ou tecidos que se sabe possuírem concentrações elevadas de proteínas presentes naturalmente no vacúolo, mas especialmente concentrações elevadas de quitinase ou de glueanase. 0 mRNA isolado pode então ser usado numa transcrição reversa como matrix para a produção de um correspondente cDNA. São especialmente preferidos como material de partida de acordo com o invento para a produção cDNA a partir de células ou tecidos vegetais ou outro material vegetal adequado que tenham sido previamente estimulados por meios adequados para produair níveis elevados de quitinase ou de glueanase. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através da inoculação de células ou tecidos ou material vegetal adequado em cultura num meio sem hormonas e cultura durante um período suficiente para a indução de níveis elevados de quitinase ou glueanase. Dentro do âmbito deste invento, é dada preferência especial a um meio base tendo a concentração de sal e de hidrocloreto de tiamina proposta por Linsmaier e Skoog (1965) (meio LS). "f
Os métodos de isolamento de RNA poli (A ) e de produção de cDNA são conhecidos dos familiarisados com a matéria e estão descritos detalhadamente nos Exemplos.
As preparações de DNA extraído e purificado foram então clivadas em fragmentos para clonagem subsequente. 0 DNA genésico ou cDNA a ser clonado pode ser fragmentado para um tamanho adequado para inserção num veículo de clonagem por corte mecânico ou de preferência com ensimas de restrição. Vectores de clonagem adequados que são habitualmente usados para a produção de bibliotecas genómicas e/ou cDNA, incluem por exemplo, vectores fãgicos, tais como fagos lambda Charon ou vectores bacterianos, tais como o plasmídeo pBR322 de E. coll. Outros vectores adequados são conhecidos dos familiarizados com a matéria. A partir das bibliotecas de genes produsidas desta forma, clones adequados compreendendo o gene pretendido, por exemplo um gene de quitinase ou um gene de glucanase, ou partes deles podem então ser identificados num programa de despiste, por exemplo corn a ajuda de oligonucleõtidos sonda (molécula sonda) e depois isolados. Existem váriso métodos para a identificação de clones adequados, por exemplo hibridação diferencial de colónias ou hibridação de placas. Podem também ser usados métodos de detecção imunológica baseados na identificação de produtos de tradução espcíficos.
Podem ser usados como molécula sonda, por exemplo um fragmento de DNA que já foi isolado anteriormente a partir do mesmo gene ou a partir de um gene estruturalmente relacionado e que é capas de hibridar com a correspondente secção de sequência dentro do gene pretendido que se pretende identificar.
Desde que a sequência de aminoácidos do gene a ser isolado ou ou pelo menos partes daquela sequência selam conhecidas» urna correspondente sequência de DNA pode ser detectada com base naquela informação de sequência. Uma ves que se sabe que o código genético é degenerado, diferentes codões podem na maioria dos casos ser usados para um único aminoácido. Como resultado disto para além de uns casos especiais, uma sequência de aminoácidos particular pode ern regra ser codificada por uma série de oligonucleõtidos que são semelhantes uns aos outros. No entanto, deve-se ter cuidado para assegurar que apenas um membro daquela série de oligonucleõtidos coincide de facto com a correspondente sequência dentro do gene que se pretende deteetar. Para limitar a série de oligonucleõtidos possíveis, podem ser usadas por exemplo - 26 - as regras sobre a utilização de codões descritas por Lathe R. ai. (1985), que dá conta da frequência com que um eodão particular é de facto usado em células eucarióticas.
Com base naquela informação é assim possível progJectar algumas moléculas de oligonucleótidos que podem ser usadas como moléculas sonda para a identificação e isolamento de clones adequados através de hibridação das referidas moléculas sonda com DNA genómico ou cDNA num dos métodos descritos atrás.
Fara facilitar a detecção do gene pretendido, por exemplo um gene codificador de quitinase ou de glucanase, a molécula sonda de DNA atrás descrita pode ser marcada com um grupo facilmente detectável. Dentro do âmbito deste invento, um grupo detectável deve ser entendido como sendo qualquer material tendo uma propriedade física ou química facilmente identificável.
Tais materiais são já largamente usados especialmente no campo dos irnunoensaios e a maioria deles podem também ser empregues no presente pedido. Nesta altura pode ser feita menção especial aos grupos ensimaticamente actívos, susbtratos de ensimas, coenaimas e inibidores de enaimas e também agentes fluorescentes e luminescentes, cromóforos e radioisótopos, por exemplo ""H, °S, ‘'P, °I e χ,*0. A facilidade de detecção destas marcas baseia-se por um lado nas suas propriedades físicas inerentes (e.g. marcas fluorescentes, cromóforos, radioisótopos) e por outro lado as suas propriedades de reacção e ligação (e.g, ensimas, substratos, coenaimas inibidores).
Também adequado como molécula sonda è um cDNA de cadeia simples derivado de um RNÂ poli(A)+, o qual por sua ves é isolado a partir de um tecido ou célula induzido no sentido de produzir níveis elevados de quitinase ou glucanase. - 27
Os clones das bibliotecas de genes atrás descritas que Mbridam com uma molécula sonda e que. podem ser identificados por meio de um dos métodos de detecção atrás referidos podem então ser analisados para determinar detalhadamente o grau e natureza da sequência codificadora,
I
Um método alternativo de clonagem de genes, mas especialmente genes da quitinase ou glucanase, baseia-se na construção de. uma biblioteca de genes composta por vectores de expressão, Naquele método, analogamente aos métodos já descritos atrás, ) TMk genõrnico, mas de preferência eBNA, é primeiro isolado a partir de uma célula ou tecido capas de expressar um produto do gene pretendido - no presente caso quitinase ou glucanase - e depois inserido num vector de expressão adequado. As bibliotecas de genes assim produzidas podem então ser despistadas usando meios adequados, de preferência usando anticorpos, por exemplo anticorpos anti-quitinase ou anti-glucanase, e seleceionados os clones que compreendem o gene pretendido ou ou pelo menos parte do gene como inserção.
Usando os métodos descritos atrás é assim possível isolar um gene que codifique um produto de gene presente natural-mente no vacúolo, por exemplo um gene de quitinase ou de glucana-J se, mas especialmente um gene de uma quitinase Msica ou glluca-nase derivado de plantas do tabaco, gene esse que tem na sua extensão C-terminal uma sequência de BNA que, em ligação operacional com qualquer gene estrutural pretendido, leva a que o produto do gene seja dirigido especificamente para o vacúolo do material vegetal transformado.
Para melhor caracterização, as sequências de dNApurifi-e&das e isoladas como descrito atras são sujeitas a análise da sequência. 0 BNA previamente isolado é primeiro clivado era 28 - fragmentos por meio de enzimas de restrição adequadas e depois elonadas em vectores de clonagem adequados, por exemplo os vectores M13 mpl8 e mpl9. A sequenciação é realizada na direoção 5’ para 3’, sendo preferencialraente usados o método de terminação de cadeias didesoxi segundo Sanger CSanger et al.. 1977] ou o método de Maxarn e Gilbert, 19803. Para evitar erros na sequen-eiação, é vantajoso sequenciar as duas cadeias do DNA paralela-mente. A análise da sequência de nucleõtidos e a correspondente sequência de aminoãcidos é vantojoso usar software de computadores convencional que pode ser adquirido comereialrnente [e.g. software GCG da Universidade de Wisconcin].
Usando processos conhecidos de um modo geral, as sequências de BM de acordo com o invento podem ser então isoladas muito facilmente a partir de elones de DNA produzidos como descrito atrás, mas especialmente a partir de elones da quitinase ou da glucanase.
Dentro do âmbito deste invento, é dada preferência especial a uma sequência de DNA que esteja numa forma substancialmente pura e que seja obtida, por exemplo, a partir do extremo 3* terminal [extensão C-terminal] de um gene de quitinase básica de plantas de Nlcotiana tabacum L. c.v. Havana 425 e tem essencialmente a seguinte sequência de DNA, que está apresentada como SE« ID NO; 2; AGG TOT TTT GGA ΔΑΤ GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAá A sequência de DNA apresentada atrás codifica um fragmento peptídioo que, na ligação operacional com uma molécula de proteína, actua como o sinal de direcionamento para o vácuolo vegetal e tem a sequência de aminoãcidos que se segue, a qual está apresentada em SEQ ID NO: 2; 29
Arg Ser Fen Gli Leu Leu Yal Asp Tre Met 0 presente invento está relacionado também com o fragmento peptídico referido. ê dada preferência também a uma sequência de DNA que está na forma substancialmente pura e que é obtida, por exemplo, a partir do extremo 3'-terminal [extensão C-terminal] de um gene de glucanase básica de plantas de Nicotina tabacum L. c.v. Havana 425 e tendo essencialmente a sequência de DNA que se segue, a qual está apresentada em SEQ ID NO: 12:
GTG TCT GGT GGA GTT TGG GAC AGT TCA GTT GAA ACT AAT GGT ÂGT GGT TCT CTC GTA AGT GAG AG TGA 0 fragmento peptídico codificado pela referida sequência de DNA, fragmento peptídico esse que em ligação operacional cojb um DNA expressãvel, actua corno sinal de direcionamento para o vaciiolo vagetal e tem a seguinte sequência de aminoácidos, que está apresentada em SEQ ID NO: 12, está também incluído no presente invento:
Yal Ser Gli Gli Yal Trp Asp Ser Ser Yal Glu Tre Asn Ala Tre Ala Ser Leu Yal Ser Glu Met
Deve-se diser que as sequências de DNA de acordo com o invento, a sequência base da qual é conhecida, não têm de ser isolados de. novo a partir de um gene adequado de quitinase ou glucanase. cada ves que sejam necessárias podendo ser sintetizadas muito facilmente em qualquer altura por meio de processos químicos conhecidos. Processos adequados para a síntese de oligonuele-ótidos curtos de DNA, por exemplo o método fosfotriéster ou fosfito, são do conhecimento geral. Actualmente a maioria das sínteses de oligonucleótidos são mecanizadas e automatizadas, de tal forma que podem ser produzidos fragmentos de DNA curtos em pouco tempo. 0 mesmo se aplica também às sequências de aminoácidos dos correspondentes peptídeos de direcionamento, sequências essas que podem derivar directamente da sequência de bases.
Através de deleção, inserção ou substituição de um ou sais pares de bases na sequência de DNA atrás referida de acordo oom o invento, portanto, variantes ou mutantes daquelas sequências podem ser facilmente produzidas e testadas quanto a serem adequadas como sequência de direcionamento.
Dentro do âmbito do presente invento é divulgado um grande número de sequências que podem ser produzidas muito facilmente a partir de uma sequência de partida natural por meio de mutagénese.
Em detalhe, o processo pode ser o de um gene compreendendo uma das sequências de DNA de acordo com o invento que é primeiro identificado e isolado. Após inserção num vect-or de elonagem adequado, aquele gene, rnas especialraente a sequência de direcionamento 3'-terminal, pode então ser modificada por meio de processos conhecidos. Um método especialmente adequado de produção de mutantes específicos é a chamada mutagénese mediada por oligonucleótidos. Naquele método são sintetizados fragmentos oligonucleotídicos pequenos que, se bem que substancialmente homólogos da sequência tipo selvagem, diferem dela em nucleótidos individuais. As referidas diferenças podem ser inserções, delações, inversões ou substituições de um ou mais nucleótidos, ou podem ser uma combinação dos processos atrás referidos. Estes fargrne ritos mutagenizados substituem então as contrapartes 31 - homólogas no gene tipo selvagem por métodos conhecidos. A construção finalizada pode então, como descrito atrás, ser clonada num vector de expressão vegetal adequado e usado para transformar uma planta.
Ho entanto, a mutação de certos fragmentos de DNA pode também ser realizada preferencialmente usando a reacção de polimerase em cadeia EPCR3. Neste processo ln vitro são usados oligonucleótidos sintetizados quimicamente que geralmente derivam das regiões periféricas do fragmento de DNA a ser mutagenizado e são específicos de cadeia. Nas condições adequadas, dá-se hibri-dação dos oligonucleótidos com as regiões complementares nas cadeias simples de DNA produzidas por desnaturação. As regiões de cadeia dupla produzidas deste modo são usadas como iniciadores para a subsequente reacção com polimerase. Neste processo pode ser usado para além de DNA-polimerases de E. coli especialmente polimerases derivadas de bactérias termófilas, por exemplo Thermus aguaticus. 0 presente invento não está portanto limitado à sequência de bases descrita detalhadamente atrás mas também inclui todos os mutantes e/ou variantes daquelas sequências de DNA que podem ser produzidos por deleção ou inserção de uma ou mais bases ou, especialmente, através da substituição de uma ou mais bases, e que ainda tem as propriedades específicas, de acordo com o invento, das sequências de partida.
Dentro do âmbito deste invento, é dada preferência especial aos variantes que se seguem, os quais podem ser produzidos por mutagênese mediada por oligonucleótidos a partir das sequências de partida mostradas em SEQ ID NO: 1 e 2 e que codificam peptídeos que ainda têm as mesmas propriedades de 32 direcionamento dos peptídeos codificados pelas referidas sequências de partida CSEQ ID NO: 3 a 7]: (a) Cb> tc) íd) íe>
GGA ΑΑΔ GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA
GGA ΔΑΤ GGA CTT TTA GTC ΑΔΤ ACT ATG TAA
GGA AAT GGA CTT TTA GTC CGT ACT ATG TAA
A GAT CTT TTG GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA
ATC GGT GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA
Os espaços vazios nas sequências (a) a íc) estão relacionados com a região da sequência de direcionamento rautage-nisada que não tem diferenças comparado com a sequência de partida.
As sequências de DNA de acordo com o invento que podem ser isoladas ou produzidas como descrito atrás podem agora ser usadas para identificar sequências de DNA homólogas tendo a mesma função por exemplo através da produção de bibliotecas de DNA genõmico ou de cDNâ e analisando-as como descrito atrás, usando sequências de DNA de acordo com 0 invento como moléculas sonda, relativamente à presença de sequências de DNA que sejam capazes de hibridar com aquelas moléculas sonda. 0 presente invento está também relacionado com os processos para a localização de sequências de DNA homólogas tendo a mesma função.
Também estão incluídos no presenta invento fragmentos peptídicos que são codificados pelas sequências de DNA atrás referidas e que ainda têm as mesmas propriedades de direcionamento dos fragmentos peptídicos naturais não modificados codificados 33
pelas referidas sequências parentais de acordo com SEQ ID NO;1 e É dada especial preferência a fragmentos peptídicos que actuam como sequência sinal para o vácuolo e que têm as seguintes sequências de aminoácidos, CSEQ ID NO;3 a 73; (a) Cb) íc) íd) Ce)
Gli Lis asp Leu Leu Vai Asp Tre Met Fim
Gli ásn Gli Leu Leu Vai Asn Tre Met Fim
Gli Asn Gli Leu Leu Vai Arg Tre Met Fim
Asp Leu Leu Gli Asn Gli Leu Leu Vai Asp Tre Met Fim
Ile Gli Asp Leu Leu Vai Asp Tre Met Fim
Os espaços vaaios nas sequências (a) a (c) estão relacionados com a região da sequência de direcionamento mutage-nisada que não apresenta diferenças relativamente à sequência de partida, 0 presente invento também inclui fragmentos ou sequências parciais que são obtidos a partir de sequências de DMA descritas rnais detalhadamente atrás ou a partir de derivados daquelas sequências de DNA e que ainda possuem as propriedades especificas das sequências de partida.
Dentro do âmbito deste invento, é dada preferência especial a fragmentos de DNA que são obtidos a partir da sequência de DNA de acordo com o invento e têm essencialmente a sequências de nucleôtidos que se seguem, as quais estão apresentadas em SEQ ID NO; 8 e 9;
CTT TTA GTC GAT AGT ÂTG TAá GGA CTT TTA GTC GAT AGT ATG TAA 34
As sequências de BNA mostradas atrás codificam fragmentos peptídicos que aotuam como sinal de direeionamento para o vaeiiolo vegetal e tem a sequência de aminoácidos que se segue, a qual está apresentada em SEQ ID NO: 8 e 9:
Leu Leu Vai Asp Tre Het Gli Leu Leu Vai Asp Tre Mefc 0 presente invento também está portanto relacionado com os fragmentos peptídicos referidos.
Dentro do âmbito do presente invento, foi agora pela primeira vea possível mostrar que as sequências de DNA de acordo com o invento e caracterisadas mais detalhadamente atrás, que codifica um fragmento peptidico C-terminal curto que é responsável pelo direeionamento específico do gene estrutural que lhe está naturalmente associado, pode continuar a desempenhar a sua função de direeionamento mesmo quando ligado a genes heterõlogos.
Numa realisação específica do presente invento, a sequência de DNA de acordo com o invento é, por meio de métodos descritos acima, ligada de forma operacional a um gene heterólo-go. de preferência um gene de quitinase heterólogo, o qual não tem uma correspondente sequência terminal 3 * e usado para transformar um hospedeiro vegetal. Um produto de gene que é dirigido especificamente para o vacúolo vegetal é então expresso naquela planta hospedeiro transformada.
Detalhadamente, o processo pode ser o de uma biblioteca de cDNA ser primeiro produaida a partir de meterial vegetal adequado e um clone adequado de cDNA de quitinase que não tem uma extensão terminal 3* isolado a partir da referida biblioteca de genes com a ajuda de moléculas sionda adequadas. Após aquele 35 clone de cDNA ser inserido num vector de clonagem adequado, o referido clone pode ser modificado por inserção ou deleção de sítios de restrição de forma a que a sequêncda de DNA de direcio-namento de acordo com o invento possa ser ligado de forma operacional ao gene beterólogo da quitinase. A construção finalisada I pode então ser clonada num vector de expressão vegetal adequado, pelo que fica sob o controle regulador de sinais de expressão aetivos em plantas. Nesta altura pode ser referido como exemplo o vector de expressão vegetal pGYl, o qual compreende o promotor 35S do vírus CaMV e também as suas sequências de termi-1 nação; no entanto isto não limita de forma alguma o objectivo do presente invento. Certamente, qualquer outro vector adequado pode também ser usado nesta altura.
Por exemplo, através da ligação à sequência de direcio-namsnto de acordo com o invento é possível dirigir especificamen-te para o vacfiolo vegetal uma quitinase ácida de pepino que não tem um peptídeo sinal C-terminal e portanto é normalmente seere-tado para o espaço extracelular. 0 presente invento está portanto também relacionado com a construção de moléculas quiméricas de DNA recombinante que compreendem um DNA expressável, mas especialmente um gene estru-1 tural, de preferência um gene estrutural heterólogo, em ligação operacional com a sequência de DNA de acordo com o inventoi e com sinais de expressão aetivos em células vegetais, tais como sequências de promotor e de terminação, assim como, facultativa-mente, com outras sequências codificadoras e/ou não codificadoras ,·1 da região 5* e/ou 3‘. S muitas vezes vantajoso incorporar uma sequência líder entre a sequência do promotor e a sequência de DNA codificadora adjacente, o comprimento da sequência líder sendo seleccionado de 36 forma a que a distância entre o promotor e a sequência de DNA de acordo com o invento é a distância óptima para a expressão do gene estrutural associado. Ê também vantajoso para a molécula de DNA a ser inserida compreender uma sequência que codifica um peptídeo sinal N-terminal capas de funcionar na célula vegetal ou ser ligada na região terminal 5’ a tal sequência. Ainda, a molécula de DNA pode compreender outras secções da sequência que codificam fragmentos peptídicos que como um todo contribuem para o melhoramento da competência da admissão para o vaeúolo, por exemplo o fragmento propeptídico descoberto por Matsuoka K e Nakamura K na extensão N-terminal de esporamina [Matsuoka K e Nakamura K (1831)], São adequados para usar no processo de acordo com o invento especialmente todos os genes estruturais que conduzem a um efeito protector nas células vegetais transformadas e também nos tecidos desenvolvidos a partir delas e especialmente nas plantas, por exemplo aumento da resistência a patogénios (por exemplo a fungos, bactérias, vírus, etc. patogénieos); resistência compostos químicos [por exemplo a herbicidas (e.g. triazinas, sulfonilureias, imidazolinonas, triazole-pirimidinas, bialafos, glifosato, etc.), ínsectieldas ou outros biocidas3; resistência a factores ambientais adversos (por exemplo ao calor, frio, vento» condições adversas do solo, humidade, secura, etc.).
Dentro do âmbito deste invento, é feita menção especial a genes estruturais que estão associados ao controle de patogé-níos vegetais e parasitas, A resistência a ínsectos pode ser conferida, por exemplo, por um gene codificador de um polipeptídeo que é tíxico
X λ
para insectos e/ou respectivas larvas, por exemplo a proteína cristalina de BaaillaaJbhwring.igíjasLÍS·.
Uma segunda classe de proteínas que medeiam a resistência a insectos compreende os inibidores de proteases. Os inibidores de proteases são um constituinte normal das estruturas de reservas vegetais e estão portanto normalmente localizadas em vacúolos ou corpos proteicos. Foi demonstrado que um inibidor de proteases Bowman-Birk isolado a partir de grãos de soda e purificado inibe a protease intestinal de larvas de Tenebrio CBirk et. al, (1963)]. 0 gene que codifica o inibidor da tripsina da ervilha está descrito em Hilder et- al. (198T).
Dentro do âmbito do presente invento, é agora possível usar quaisquer inibidores de proteases pretendidos independente-mente da sua origem [por exemplo inibidores de proteases derivadas fontes que não sejam plantas ou puramente sintética] através da sua ligação de forma operacionãvel a um peptídeo sinal N-terminal capas de funcionar na célula vegetal e à sequência de direcionarnento C-terminal de acordo com o invento. Como resultado, os inibidores de proteases assim modificados são dirigidos especificamente para o vacúolo, onde eles podem ser guardados de forma adequada.
Um gene que codifica um inibidor de proteases pode, num vector adequado, ficar sob o controle de um promotor vegetal, especialmente de um promotor constitutivo, por exemplo o promotor 35S de GaMV. 0 gene, por exemplo a sequência codificadora do inibidor de proteases Bowman-Birk a partir da soja, pode ser obtido pelo métodode clonagem de cDNA. Um outro método possível para -a produção de um inibidor de proteases é a produção sintéti-oa, desde que o inibidor de proteases compreenda menos de 1M aiainoãcddos, por exemplo o inibidor da tripsina do feijão-de- - 38 lima. A sequência codificadora pode ser prevista por tradução reversa da sequência de aminoáeidos. Em adição, são incorporados em ambos os extremos sítios de restrição adequados para o vector pretendido em cada caso particular. 0 gene sintético é produsido pela síntese de fragmentos oligonucleotidicos sobreponíveis de 30 a 80 pares de bases, sujeitando primeiro aqueles fragmentos a uma reação com cinase, depois ligando-os uns aos outros [Maniatis st al. (1982)3 e finalmente clonagem num vector adequado. Por meio de sequenciaçao de DNA é então possível Identificar um clone que tenha a inserção numa orientação correcta. Para inserção nos protoplastos pode ser usado DNA de plasmídeo.
Em relação com isto, deverá ser feita referência a ensimas hidrolíticas, as quais são capaaes de destruir a parede celular dos próprios patogénios para as plantas ou pelo menos ajudar a destruir juntamente com outras substâncias no sentido de sinergia. â maioria dos insectos, por exemplo, têm um esqueleto outieular em que as alceias de quitina nas fases lamelares estão eabebidasnuma substância base. Um grande número de fungos patogé-rticos também contêm quitina como parte constituinte das suas hifas e estruturas de esporos, por exemplo os Basidiomicetes (fungos das ferrugens), Aseomieetes e Fungos Imperfeitos {incluindo Alternaria, e Bino lar is. Exeroubilum turcic-um. Colletotri-m Gleooercospora e Cereospora). A quitinase ê capas de inibir o crescimento de mieéliode certos patogénios in vitro. Um orgão vegetal ou tecido que é capas de expressar constitutivamente quitinase ou em resposta â penetração de um patogénio poderá autoproteger-se do ataque por um grande número de fungos diferentes. 33
As quitinases endógenas que estão presentes naturalmen-te 13a planta são extracelulares (quitinases ácidas) ou situadas dentro do vacúolo (quitinases básicas), de forma que são contem-piados dois processos alternativos dentro do âmbito do presente invento.
Por um lado, os genes das quitinases ácidas, que não possuem a sequência C-terminal que é responsável pelo direciona-mento para o vacúolo, pode ser modificada usando a sequência de DNA de acordo com o invento de forma que os produtos do gene passam especificamente para o vacúolo, onde podem ser capases de aJudar as quitinases básicas endógenas que ali aparecem naturalmente na sua actividade contra patogénios penetrantes.
Na segunda variante, a extensão C-terminal de um gene da quitinase básica presente naturalmente no vacúolo é removida da grelha de leitura aberta por meio de métodos de engenharia genética ou é pelo menos inactivada, por exemplo através da inserção de um codão de paragem directamente antes da extensão C-terminal. Como resultado disto, o produto do gene é secretado para o espaço intercelular onde pode entrar directamente em contacto com o patogénio penetrante.
Um outro aspecto do presente invento está portanto relacionado com moléculas de DNA recombínante que compreendem um gene estrutural que está presente naturalmente no vacúolo e está em ligação operacional com sinais de expressão activos em células vegetais, nesse gene vegetal a sequência de direcionamenteo 3s, que está naturalmente presente no gene, foi eliminada ou de outra forma inacativada. Quando da transformação de um hospedeiro vegetal, estas construções produsem um produto de expressão que não contem uma sequência sinal C-terminal funcional e é portanto secretado para o espaço extracelular da planta. 40 - É dada preferência especial a uma molécula de DNÂ recombinante que compreende um gene da quitinase básica que está ligado operacionalmente a sinais de expressão activos em células vegetais e em que a sequência de direcionamento 3’-terminal, que está naturalmente presente no gene, foi eliminada ou de outra forma inactivada e que portanto, quando da transformação de um hospedeiro vegetal produs um produto de expressão que não contem uma sequência sinal C-terminal funcional e é portanto secretado para o espaço extracelular da planta. lima outra ensima que presumivelmente desempenha um papel central no mecanismo de defesa da planta contra patogénios é a 6-1,3-glucanase, a utilisação da qual em combinação com a sequência de DNA de acordo corn o invento é portanto também preferida dentro do âmbito deste invento. É portanto dada também preferência a uma molécula de BHÃ recombinante que compreende um gene de glucanase básica que está em ligação operacional com sinais de expressão activos em células vegetais e em que a sequência de direcionamento 3'-terminal, que está naturalmente presente no gene, foi eliminada ou de outra forma iinactivada e que portanto, quando da transformação de um hospedeiro vegetal, produs um produto de expressão que não contem uma sequência sinal C-terminal funcional e é portanto secretado para o espaço extracelular da planta,
Este invento está ainda relacionado com a ligação da sequência de direcionamento de acordo com o invento aos chamados peptideos líticos. Estes são peptídeos naturais ou sintéticos tendo actividade antipatogénica que são capases de penetrar, lisar ou de outra forma danificara membrana celular de patogénios. Representantes de tais polipeptídeos líticos que podem ser usados dentro do âmbito do presente invento são conhecidos de
fontes animais [incluindo insectosle de fontes vegetais e microbianas e incluem, por exemplo, as defensinas, cercopinas, tioni-nas e melitinas de mamíferos e as defensinas, magaininas, ataci-nas, dipterinas, sapecinas, cerulinas e xenopsinas de insectos e seus híbridos, As sequências de aminoácidos de vários peptídeos liticos estão apresentadas nas seguintes publicações; WO 89/11291; W= 86/04356; WO 88/05826; US 4,810,777; WO 89/04371, e eia Bohlmann et al. . (1988), Selsted e Hartwig (1987) e Terrv afc al. (1988).
Peptídeos líticos no sentido mais lato do termo devem ser enetendidos como sendo compostos cuja capacidade para penetrar, lisar ou danificar membranas celulares se baseia na ctivida-de enzimática, por exemplo, lisosimas e fosfolipases.
Dentro do âmbito deste invento é dada preferência especial à expressão combinada de peptídeos hidrolíticos e líticos coro subsequente direcionaroento orientado para o vacúolo, ou sempre que adequado para o espaço extracelular. Ainda, a utilização recíproca de expressão e aplicação exógena podem também ser considerados, os peptídeos líticos sendo especialmente vadequados para esta última finalidade, conjuntamente com os auxiliares e/ou aditivos normalmente usados para este fim. A sequência de DNA de acordo com o invento pode também ser usada de forma ideal para a produção de compostos desejáveis e úteis na célula vegetal como tal ou como parte de uma unidade de organização superior, por exemplo um tecido, calo, orgão, embrião ou planta completa
Os genes que podem também ser usados dentro do âmbito do presente invento incluem, por exemplo, os que conduzem a uma maior informação sobre substâncias de reserva em folhas, 42 sementes, tubérculos, raízes caules, etc. ou nos corpos proteicos de sementes. As substâncias desejáveis que podem ser produzidas por plantas transgénicas incluem, por exemplo, proteínas, açucares aminoácidos, vitaminas, alcaloides, flavinas, perfumes, corantes, gorduras, etc..
Podem estar também associadas com a sequência de DNA de acordo com o invento genes estruturais que codificam substâncias activas farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo hormonas, imunomoduladores e outras substancias fisiologicamente activas.
Os genes que podem ser considerados dentro do âmbito deste invento incluem portanto, mas não estão limitados, a genes específicos de plantas, tais como o gene da seina do milho, o gene da avenina da aveia, o gene da glutenina do arroz, etc., genes específicos de mamíferos tais como o gene da insulina, o gene da somatostatina, os genes da interleuquina, o gene do t-PA, etc., ou genes de origem microbiana, tais como o gene NPT II, etc., e genes sintéticos, tais como o gene da insulina, etc..
Ainda, o conceito largo do presente invento também inclui genes que são produzidos totalmente por síntese química. Os genes ou sequências de DNA que podem ser usados dentro do âmbito do presente invento são portanto gene(s) homólogos e heterõlogos e também genes sintéticos ou DNA de acordo com a definição dada dentro do âmbito do presente invento. 0 gene da insulina pode ser referido nesta altura como um exemplo de um gene sintético.
As sequências de DNA que podem ser usadas dentro do âmbito do presente invento podem ser construídas exclusivamente a partir de DNA genõmico, a partir de cDNA ou a partir de cDNA sintético. Uma outra possibilidade é a construção de uma / 43 sequência de DNA híbrida compreendendo cDNA e também DNA genómieo e/ou DNA sintético.
Naquele caso, o cDNA pode derivar do mesmo gene como DNA genómieo ou cDNA e DNA genómieo podem derivar de genes diferentes. Em qualquer um dos casos, no entanto, tanto DNA genómieo e/ou cDNA podem ser produzidos individualmente a partir do mesmo gene ou de genes diferentes.
Se a sequência de DNA possuir fraeções de mais de um gene, estes genes podem derivar de apenas um organismo, de vários orgvanismos pertencentes a diferentes estirpes ou variedades da mesma espécie ou de espécies diferentes do mesmo género ou de organismos pertencentes a mais de um género da mesma unidade taxonómiea ou de uma unidade taxonómiea (reino) diferente.
Para assegurar a expressão dos referidos genes estruturais na célula vegetal, é vantajoso para as sequências codificadoras serem primeiro ligadas de forma operacional a sequências de expressão capazes de funcionarem em células vegetais.
As construções de genes híbridas dentro do âmbito do presente invento compreendem portanto, para além da sequência de DNA de acordo com o invento, um ou mais genes estruturais e em ligação operacional com eles, sinais de expressão que incluem sequências de promotor e de terminador e outras sequências reguladoras das regiões 3’ e 5* não traduzidas.
Qualquer promotor e qualquer terminador capas de faaer uma indução da expressão de uma sequência de DNA codificadora (gene estrutural) pode ser usado corno constituinte da sequência de gene híbrido. Especialmente adequados são sinais de expressão derivados de genes de plantas ou de vírus de plantas. São 44 / exemplos de promotores e terminadores adequados os dos genes do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) ou sequências de Wh homólogas que ainda tenham as propriedades caraeterísticas dos sinais de epressão referidos. São também adequados sinais de expressão bacterianos, especialmente os sinais de expressão dos genes da nopalina-sintetase (nos) ou dos genes da octopina-sinte-tase (ocs) dos plasmídeos Ti de Aerobaoterium tumefaciens.
Dentro do âmbito deste invento, é dada preferência aos sinais de expressão de 35S e 19S do genoma de CaMV ou seus homólogos que possam ser isolados a partir do referido genoma usando métodos de biologia molecular, como descrito, por exemplo, em Maniatis et al. (1982) e ligado à sequência de DNA codificadora.
Dentro do âmbito deste invento, sinais de expressão homólogos de 35S e 19S devem ser entendidos como sendo sequências que. apesar de ligeiras diferenças na sequência ainda desempenham as mesmas funyõe das sequências de partida.
De acordo com o invento pode ser usado como material de partida para as sequências de controle da transcrição de 35S, por exemplo, o fragmento Seal do CaMV estirpe ”S", que incluie os nucleôtidos 6808-7632 do mapa genético CFrank G et al. (1980)3. O promotor 19S e a região não traduzida 5S estão situados num fragmento de genoma entre o sítio PstI (posição 5386) e o sítio HindiII (posição 58505 do mapa genético do CaMV CHohn et al. (1982)]. 0 correspondente terminador e região 3’ não traduzida estão situados num fragmento EcoRV/BglII entre as posições 7342 e 7643 do genoma de CaMV. 45 São também preferidos dentro do âmbito deste invento os sinais de expressão de CaMV estirpe CM1841, a sequência de nucleótidos completa que está descrita em Gardner EC et ai,. (1981).
Um outro representante eficaa de um promotor vegetal que pode ser usado é um promotor vegetal de super-produção. Desde que este tipo de promotor seja operacionalmente ligado â sequência do gene que codifica um produto de gene pretendido, ele deverá ser capas de mediar a expressão da referida sequência do gene*
Promotores vegetais de super-produção que podem ser usados dentro do âmbito do presente invento incluem o promotor da subunidade pequena (ss) da ribulose-l,5-bifosfato carboxilase da soja e também o promotor da proteína de ligação à clorofila-a/b.
Estes dois promotores são conhecidos pelo facto de serem induzidos pela lua em células vegetais eucarióticas [ver, por exemplo, Genetic Ingineering of Plants, An Agricultural Perspective, Cashmore A (1983)]. 0 presente invento está portanto também relacionado cora moléculas de DMA reeombinante que compreendem uma construção genética quimérica em que a sequência de DNA de acordo com o invento está operacionalmente ligada a um DNA expressável e com & sinais de expressão activos em células vegetais assim como, facultativamente, outras sequências transcritas e/ou não trans-critas da região 51 e/ou 3s, de forma que. quando da transformação de uma célula hospedeira, os produtos de expressão são dirigidos especificamente para o vaoúolo vegetal.
É dada especial preferência a moléculas de DNA recorobi-nante que compreendem uma construção genética quimérica em que a sequência de DNA de acordo com o invento está operacionalmente associada a um gene estrutural que confere às células vegetais não transformadas e também aos tecidos desenvolvidos a partir delas e especialmente nas plantas, um efeito protector contra patogénios, químicos e também factores ambientais adversos. É dada preferência muito especial dentro do âmbito deste invento a moléculas de DNA recombinante que compreendem uma construção de genética quimérica em que a sequência de DNA de acordo com o invento está operacionalmente associada a um gene estrutural que expressa quitinase mas, especialmente quitinase ácida ou glucanase, mas especialmente quitinase ácida ou glucana-sef nas células vegetais. O presente invento também inclui moléculas de DNA recombinante que compreendem uam construção genética quimérica em que a sequência de DNA de acordo com o invento está operacional-mente associada ao gene estrutural que, quando expresso na célula vegetal transformada como tal ou como parte de uma unidade de organização superior seleccionada do grupo constituído por ut& tecido, orgão, calo, embrião e planta completa, condus ao dire-cionamento dos compostos pretendidos e úteis para o vacúolo vegetal. S dada preferência ainda a moléculas de DNA reeombinan-te que compreendem uma construção genética quimérica em que um gene que codifica uma molécula de proteína presente naturalmente no vacúolo, mas preferencialmente um gene da quitinase básica e muito especialmente de preferência um gene da quitinase Msica de plantas do tabaco ou do pepineiro, foi modificado de forma a ser seoretado para o espaço extraeelular. Detalhadamente, isto pode ser conseguido removendo ou inaetivando a extensão C-terminal que está presente naturalmente nos referidos genes, mas especialmente em genes da quitinase e compreende as sequências de DNA responsáveis pelo direeionamentop para o vacúolo, com a ajuda de métodos de engenharia genética, por exemplo através da inserção de um codão de paragem directamente antes da extensão C-terminal.
Outras sequências de DNA reguladoras que podem ser usadas para a construção de genes quiméricos incluem, por exemplo, sequências que são capazes de regular a transcrição de uma sequência de DNA associada em tecidos vegetais no sentido da indução ou repressão.
Existem, por exemplo, certos genes vegetais que se sabem induzirem vários factores internos e externos, tais como hormonas vegetais, choque térmico, químicos, patogénios, deficiência em oxigénio, lua, tensão, etc..
Como exemplo da regulação de genes por uma hormona vegetal, deverá ser feita referência ao ácido abscisíco (ABS), que se sabe induzir o excesso de mRNAs que ocorre durante a fase erabrionária tardia no algodão. Um outro exemplo é o ácido giberé-lico CGA3) que induz a transcrição de malato-sintetase em feijão castor e isoenz irnas de cc-amilase nas camadas de aleurona de cevada. A actividade da glucanase e quitinase nas folhas de feijoeiro pode ser mareadamente aumentado pelo tratamento com a a hormona de pressão etileno. No caso da quitinase, este efeito indutor ê controlado através do promotor do gene da quitinase e foi possível demonstrar isto pelo teste do gene repórter usando um promotor do gene da quitinase de feijão (Phaese.nluf, vuigaris). 43 - A regulação dos genes de proteínas sensíveis ao choque térmico da soja foi estudada detalhadamente. 0 tratamento de plantas durante várias horas a urna temperatura de 40°C resulta na síntese de novo das chamadas proteínas de choque térmico. Um grande número daqueles genes foi isolado e analisada detalhada-mente a sua regulação. A exprerssão daqueles genes é controlada essencialmente a nível da transcrição. Por exemplo, se o promotor do gene hps70 for fundido com o gene da neomicina-fosfotransfera-se II {NPT II), o gene quimérico assim formado pode ser induzido por um choque térmico CSpena et al.. 19851. tlj»a outra classe de genes que é induzida em plantas compreende os genes regulados pela lua, especialmente o gene codificado pelo núcleo da subunidade pequena da ribulose-l,5-bi- fosfato-carboxilase (RUBISCO). Morelli et.......al. mostraram que a sequência delimitante 5f de um gene RUBISCO da ervilha é capas de transferir a capacidade de indução pela luz a um gene repórter, desde que este último esteja ligado na forma quimérica àquela sequência. & também possível estender esta observação a outros genes induzidos pela lua, por exemplo a proteína de ligação à clorofila a/b.
Os genes áleool-desidrogenase {genes adh) do milho foram alvo de estudos intensivos. 0 gene adh-l-s do milho foi isolado e demonstrou-se que uma parte do DNA delimitante 5’ é capas de indusir a expressão de urn gene repórter quimérico (e.g, eloranfenicol-acet.il-transferase; CAT> quando o tecido temporâri-amente transformado foi sujeito a condições anaeróbicas [Howard et al. (19875 1.
Um outro grupo de sequências de DNA reguláveis quimicamente que estão presentes, por exemplo, nos genes da 49
proteína PR (relacionada com patogénese) do tabaco e são indusi-veis por meio de reguladores químicos.
As sequências de DNA reguláveis referidas como exemplo atrás podem ser de origem natural ou sintética ou podem compreender uma mistura de sequências de DNA naturais e sintéticas. É também vantajoso para o DNA expressável, mas espeei-almente para o gene estrutural que é inserido, ter uma sequência que codifique um peptídeo sinal N.-terminal capas de funcionar na célula vegetal ou ser ligado na região 5*-terminal a tal sequência. 0 peptídeo sinal é um sinal de transporte que se encontra no extremo N-terminal de proteínas transportadas via sistema endo-membranar. Esta sequência sinal assegura que as referidas proteínas passem primeiro para o retículo endoplasmático, onde o peptídeo sinal é separado proteoliticamente da proteína precursora logo que desempenhe as suas funções. Devido à sua função especial, este tipo de sequência de peptídeo sinal foi conservada em grau elevado durante a evolução em todas as células vivas, independentemente de serem bactérias, leveduras, fungos, animais ou plantas.
Ainda5 a molécula de DNA pode compreender ainda outras secções de sequência que codifiquem fragmentos peptídicos que como um todo contribuam para o melhoramento da competência para admissão para o vácuolo , por exemplo o fragmento propeptídico descoberto por Matsuoka K e Nakamura K na extensão N-terminal de esporamina [Matsuoka K e Nakamura K (1991)3.
0 presente invento inclui também construções de genes quiméricos que compreendem, para além da sequência de direciona-raento de acordo com o invento presente em ligação operacional com uia gene estrutural ou quaisquer outras sequêncdas de DNA 50 - expressáveis, outras secções reguladoras da sequência de DM permitindo por exemplo, a indução ou repressão controlada da expressão de genes.
As várias secções da sequência podem ser ligadas umas âs outras por métodos conhecidos ner se para formar uma sequência de E*NÂ codificadora completa. Métodos adequados incluem por exemplo, a recombinação in vivo de sequências de DM tendo secções homólogas e a ligação in vitro de fragmentos de restrição.
Como vectores de clonagem são geralmente· usados vecto-res plasmídeo ou virais íbacteriofago) tendo sequências de replicação e de controle derivadas de espécies que são compatíveis com a célula hospedeira. 0 veet.or de clonagem de um modo geral é portador de uroa origem de replicação, especialmente uma origem de replicação que é capas de de funcionar em E. coli. em Agrobacterium ou em ambos, e ainda genes específicos que conduzam a características de selecção fenotípica na célula hospedeira transformada, especialmente a resistência a antibióticos ou a herbicidas específicos. Os vectores transformados podem ser seleccionados com base naquelas marcas fenotípicas após transformação numa célula hospedeira.
As marcas fenotipioas seleccionáveis que podem ser usadas dentro do âmbito do presente invento incluem, por exemplo, resistência â sapieilina, tetraciclina, higromicina, canamicina, metotrexat-o, G418 e neomicina, mas esta lista, que é dada como exemplo, não pretende limitar o âmbito do invento. 51 - Células hospedeiras adequadas dentro do âmbito deste invento são procariotas, incluindo hospedeiros baeterianos, por exemplo A. turoefaciens. E. ooli. _tohimEi.Uffi e SariaMâ marcescens e também cianobactérias. Hospedeiros eucarióticos, tais como leveduras, fungos formadores de mieélio e células vegetais podem também ser usados dentro do âmbito deste invento. A inserção da construção do gene híbrido de acordo com o invento num vector de clonagem adequado é realiaada usando métodos convencionais, tais como os descritos, por exemplo, em Maniatis et al. (1982).
Como regra geral, o vector e a sequência de BNA a ser inserida são primeiro clivados com enzimas de restrição adequadas. Enzimas de restrição adequadas são por exemplo, as que dão fragmentos com extremos cerses, por exemplo Smal, Hpal e- EcoRV ou enzimas que formam extremos coesivos, por exemplo IcoRI, Saci e BamHL
Ambos os fragmentos têm extremos cerses e os que têm extremos coesivos que são complementares uns dos outros podem ser ligados novamnete usando DNA-ligases para formar uma molécula de DNA uniforme continua.
Os extremos cerses podem também ser produzidos por tratamento dos fragmentos de DNAque têm extremos protuberantes coesivos com o fragmento Klenow da DNA-polimerase de F,. coli para preencher os intervalos com os correspondentes nucleótidos complementares.
Por outro lado, os extremos coesivos podem também ser produzidos artifieialmente, por exemplo pela adição de caudas hoi&opoliméricas complementares aos extremos de uma sequência de 52 DNApretendida e à molécula vector clivada usando uma transferase terminal de desoxinucleótidos ou pela adição de sequências de oligonucleótidos sintéticos (adaptadores) que são portadores de um sítio de restrição e subsequente clivagem da enzima adequada.
Dentro do âmbito do presente invento, na construção de mutantes da quitinase, várias partes dos clones da quitinase usados são ligados umas às outras. Para se conseguir isto aquelas partes devem ser compatíveis, ou seja sítios de clivagem adequados devem ser introduzidos nas várias sequências. Numa realização específica deste invento, os sítios de restrição referidos atrás são preferencialmente usados todos eles levando aos mesmos extremos coesivos*.
Bastfll CG/GATCC1 Bell [T/GATCAl BglII CA/GATCT3 A grelha de leitura em todos os casos é preferencialmente seleccionada de forma a que GAT funcione como codão para aspartato.
Os vectores de clonagem e a célula hospedeira transformada com aqueles vectores são geralmente usados para aumentar o número de cópias das construções neles inseridas. Com um maior número de cópias é possível isolar o vector portador da construção de gene híbrido e prepará-lo, por exemplo, para inserção da sequência de gene quimérico numa célula vegetal.
Num outro passo do processo, estes plasmídeos são usados para inserir os genes estruturais codificadores de um produto de gene pretendido ou sequências de DNA não codifiadoras 53
tendo uma função reguladora numa célula vegetal e, facultativa-mente, para integrá-las num genoma de planta. 0 presente invento está portanto também relacionado com a produção de células vegetais recipientes que se earaeterizam por terem o referido gene estrutural ou outros genes pretendidos ou fragmentos de genes ou outras sequências de DNá incorporadas no seu genoma. A inserção da construção genética quimérica é de preferência realizada em protoplastos vegetais usando processos de transferência de genes conhecidos.
Existe uma série de processos muito eficazes para a introdução de DNA em células vegetais, processos esses que se baseiam na utilização de vectores de transferência de genes ou processos de transferência directa de genes.
Um método possível compreende, por exemplo, colocar as células em contacto com vírus ou com Agrobacterium. Isto pode ser conseguido através da infecção de células vegetais ou através da cocultura de protoplastos derivados de células vegetais. Dentro do âmbito deste invento, o vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) pode também ser usado como veetor para a inserção da construção genética quimérica de acordo com o invento numa planta. 0 genoma de DNA virai total de CaMY é integrado num plasmideo parental bacteriano para formar uma molécula de DNA reeombinante que pode ser propagada em bactérias. Apôs realização da clonagem, o plasmideo reeombinante é clivado, usando enzimas de restrição, ao acaso ou em sítios rauito específicos não essenciais dentro da parte virai do plasmideo reeombinante, e.g, cora o gene que codifica a transmissão do vírus por afídeos e a construção* do gene híbrido é clonada naquele sítio de clivagem. - 54 -
Pode também ser integrado um pequeno oligonucleótido , chamado adaptador, que tem um único sitio de restrição específico. 0 plasmídeo recombinante assim modificado é novamente clonado e ainda modificado por inserção da construção de gene híbrido num sitio de restrição que só surge uma vez. A fracção virai modificada do plasmídeo recombinante pode então ser removida do plasmídeo parental bacteriano e usada para inoculação de células vegetais ou de plantas completas.
Um outro método de inserção da construção de gene quimérico numa célula utiliza a infecção da célula vegetal com âgrobacterium tumefaciens e/ou Agrobaoterium rMs^genes.. as quais foram transformadas com a referida construção de genes. As células vegetais transgénicas são então cultivadas em condições de cultura adequadas conhecidas dos familiarizados com a área, de forma a que caules e raízes e plantas completas sejam finalmente formadas.
Ainda um outro método possível de transformação de material vegetal compreende a infecção mista usando AgrobacteriuTfi rhigoaenes. e Agrobaoterium tumefaciens transformada como descrito por Fetit et a.l, (19865 para a transformação de cenouras. Δ proporção da mistura deve ser tal que as colónias de rdículas foramadas como resultado da transformação de A. rhizoge-nes também corâpreende uma elevada proporção de plasmídeo Ti de A. tinmefaolens. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através da aplicação de A. rtizigenes. e A. tumefaciens juntamente com omate-rial vegetal de modo conhecido numa proporção de mistura de 1; 1 a 1:1@@, mas preferencialmente numa proporção de mistura de 1;10. As plantas transgénicas são então cultivadas em condições de cultura adequadas conhecidas dos familiarizados com a matéria, de finalmente plantas forma a dar origem a rebentos e raízes e completas. Com vantagem, as duas espécies de Ãgrobacterium não são misturadas até imediatamente antes da inoculação do material vegetal a ser transformado. A construção de gene quimérico de acordo com o invento pode pois ser transferida para células vegetais adequadas por meio do plasmídeo Ti de ãgrobacterium tumefaciens ou do plasmideo Bi de Ãgrobacterium rhiaogenes. 0 plasmídeo Ti ou o plasmídeo Ri é transferido para a planta no decurso da infecção por Agrobacte-riuro e integrado de forma adequada no genoma da planta.
Tanto os plasmídeos Ti como Ri têm duas regiões que são essenciais para a produção de células transformadas. Uma daquelas regiões, a região do DNA de transferência (T-DNA), é transferida para a planta e condus à indução de tumores. A outra região, a região que confere virulência (vir), é essencial apenas para a formação dos tumores, não para a sua manutenção. As dimensões da região do DNA de trnasferência pode ser alargada através da incorporação da construção de gene quimérico sem que a capacidade de transferência seia afectada. Através da remoção dos genes indutores de tumores e incorporação de uma marca seleccionável, o plasmideo Ti ou Ri modificado pode ser usado como um vector para a transferência da construção de gene de acordo com o invento para uma célula vegetal adequada. Â região vir realiaa a transferência da região de T-DNA de Ãgrobacterium para o genoma da célula vegetal independentemen-te da região de T-DNA e da região vir estarem presentes no mesmo vector ou em vectores diferentes dentro da mesma célula de ãgrobacterium. A região vir num cromossoma também indus a transferência do T-DNA de um vector para a célula vegetal. 58
Dentro do âmbito deste invento, é pois preferencialmente usado um sistema para a transferência de urna região de T-BNA de Agrobacterium para células vegetais, sistema esse em que a região vir e a região de T-BNA estão situados em diferentes veetores. Tal sistema é conhecido como um "sistema binário de vectores" e o vector contendo o T-DNA é assim designado um "vector binário".
Qualquer vector contendo T-DNA que possa ser transferido para células vegetais e permita a seleccão das células transformadas é adequado para usar dentro do âmbito deste invento. É especialmente preferido dentro do âmbito deste invento um vector vai-vem que compreenda a construção genética quimérica de acordo com o invento clonado entre a sequência delimitante esquerda (LB) e a sequência de-limitante direita (EB) e é capaa de se replicar estavelmente em E. coli e em A. tumefa-aissSSL*
Usando técnicas de transformação recentemente desenvolvidas foi também possivel em princípio transformar in vitro espécies vegetais que não sedam plantas hospedeiras naturais de Agrobacterium. Por exemplo, Plantas monocotiledõnias, especial-mente as espécies de cereais e várias gramineas, não são hospedeiros naturais de Agrobacterium. 1 cada ves mais evidente que as monocotiledõnias podem também ser transformadas usando Agrobacterium de forma que usando novas formulações experimentais agora disponíveis, cereais e gramineas podem também ser transformadas CGrimsley NH et. ai. (1987)3. 57
-V
Dentro do âmbito do presente invento é preferido a chamada transformação de discos de folhas usando Agrobacterium CHorsch et al. (1985)1. Discos de folhas estéreis derivados de uma planta alvo adequada são incubados com células de Agrobacterium compreendendo uma das construções genéticas quiméricas de acordo com o invento e são então transferidas para um meio nutritivo adequado. São especialmente adequados e portanto preferidos dentro do âmbito deste invento, os meios LS que foram solidificados pela adição de agar e enriquecido com um ou rnaís dos reguladores normalmente usados, especialmente os seleeciona-dos do grupo das auxinas consistindo em ácido a-naftilacético, piclorame, ácido 2,4,5-triclorofenoxiaeético, ácido 2,4-dicloro-fenoxiacético, ácido indole-3-butírico, ácido indole-3-láctieo, ácido indole-3-succinico, ácido indole-3-acético e ácido p-cloro-fenoxiacético e do grupo das citocininas consistindo em cinetina, 6-bensiladenina, 2-isopenteniladenina e seatina. A concentração preferida de auxinas e citocininas está na gama de 0,1 mg/1 a 10
Após incubação durante vários dias, mas preferencial-mente após incubação durante 2 a 3 dias a uma temperatura de 20°C a 40°C, preferencialmente de 23°C a 35°C e mais especialmente a 25 e em lus difusa, os discos de folhas foram transferidos para um meio adequado para a indução de rebentos. 1 especialmente preferido para a seleção dos transforraantes um meio LS que não contem auxina mas contem em seu lugar citocinina e a que foi •adicionada uma substância selectiva. as culturas foram mantidas à lus e transferidas para meio fresco em intervalos adequados, mas preferencialmente em intervalos de uma semana. Os rebentos verdes em desenvolvimento são cortados e cultivados num meio que indus os rebentos para formar raíaes. S especialmente preferido dentro do âmbito deste, invento um meio LS que não contenha auxina ou citocinina mas que tenha uma substância seleetiva para selecção dos transformantes.
Para além da trransformação mediada por Agrohaoterium. dentro do âmbito deste invento é possível usar métodos de transformação directa para a inserção das construções de genes de acordo com o invento para material vegetal.
Por exemplo, o material genético contido num vector pode ser inserido direetamente numa célula vegetal, por exemplo usando processos puramente físicos, por exemplo por microinjecção usando micropipetas finas CNeuhaus et al. (1987)3 ou por bombardeamento das células com microprojécteis que estão revestidos cora o DNA transformante ["MicroProjectile Bombardment"; Wang Y-C gi al. (1988)3.
Outros métodos possíveis para a transferência directa de material genético para uma célula vegetal compreende o tratamento de protoplastos usando processos que modificam a membrana plasiaática, por exemplo tratamento com polietilenoglicol, tratamento com choque térmico ou electroporação ou uma combinação daqueles processos CShillito et al. (1985)3.
Na técnica de electroporacão, protoplastos vegetais imrtamente com plasmídeos que compreendem a construção de genes híbridos são sujeitos a pulsos eléctricos de alta força de campo. Isto resulta num aumento reversível na permeabilidade das biomem-branas e permite assim a inserção dos plasmídeos. Os protoplastos vegetais eleotroporados renovam a sua parede celular, dividem-se e formam o tecido do calo. á seieeção das células vegetais transformadas pode ter lugar com a ajuda das marcas fenotípicas atrás descritas.
Um outro método para a introdução directa de material genético em células vegetais, que se baseia em processos puramente químicos e que permite que a transformação sela realisada eficaa e rapidamente, está descrito em Negrutiu et al. (1987) e em Goodall G et al.,.
Também é adequado para a transformação de material vegetal é a transferência directa de genes usando cotransformação (Sehoeher RJ et al. 1988). A cotransformação é um método que se baseia na interna-lisação simultânea e integração de várias moléculas de DNA (genes seleccionãveis e não seleccionãveis) no genoma vegetal e que portanto permite a detecção de células que foram transformadas com genes não seleccionãveis. A lista de métodos de transformação possíveis dada atrás como exemplo não pretende ser completa e não limita de forma alguma o âmbito do invento.
Aqueles clones de células que compreendem a construção de gene híbrido incorporado no seu genoma são seleceionadas usando métodos convencionais de selecção, despiste e detecção e são usados para a regeneração de plantas transgénicas. A regeneração de protoplastos mantidos em cultura para formar plantas completas está descrito, por exemplo em Fotrykus I e Shillito RD (1988).
Os processos de regeneração diferem de espécie vegetal para espécie vegetal. No entanto, em geral, os protoplastos, nua dos meios de cultura conhecidos, são estimulados para se dividirem e formarem paredes celulares, formam-se finalmente culturas de elos que podem ser induzidas para formarem raízes através do tratamento com agentes activos específicos, por exemplo auxinas e eítocininas.
As plântulas assim obtidas podem ser transferidas para o solo e cultivadas ainda como plãntulas normais. A regeneração depende especialmente do meio, do genóti-po e da história da cultura. Se estas três variáveis forem adequadamente controladas, a regeneração é totalmente reprodutível e repetível.
As plantas transgénicas regeneradas, as quais compreendem um gene estrutural expressãvel na célulavegetal, das construções de genes híbridos atrás descritos como um componente integral do genoma vegetal, pode ser propagado vegetativamente, de preferência na forma de culturas estéreis de rebentos. A integração estável de um gene expressável operacional no genoma vegetal das plantas transgénicas regeneradas foi verificada por treferência à estabilidade mitótica do gene integrado e com base no seu comportamento como característica Mondeliana durante a meiose e usando análise de transferência Southern (Southern EM, 1875). 0 conceito lato deste invento também inclui portanto material de plantas transgénicas, seleccionado do grupo constituído por protoplastos, células, calos, tecidos, orgãos, sementes, embribes, pólen, óvulos, sigotos, etc. e especialmente, Plantas férteis completas, que foram transformadas por meio dos processos descritos atrás e compreendem o DNA recombinante de acordo com o invento na forma expressável e processos para a produção do referido material vegetal transgénico. - 61 0 processo para a produção de material vegetal transformado compreendendo um produto de um gene que é dirigido especificamente para o vacúolo vegetal caracterisa-se essencial-mente por: (a) em primeiro lugar isolamento a partir de uma fonte adequada ou síntese por meio de processos conhecidos da sequência de BNA responsável pelo direcionamento específico para o vacúolo; (b) inserção da referida sequência de DNA de forma operacional no extremo 3s-terminal de qualquer sequência de DNA expressável pretendida;
Ce) clonagem da construção acabada num vector de expressão vegetal sob o controle de sinais de epxressao activos em plantas; e
Cd) transformação de material vegetal com o referido vector de expressão por meio de processos conhecidos e sua expressão nele.
Se o DNA a ser expresso não for um gene estrutural que codifique naturalrnente um peptideo sinal N-terminal, é vantajoso inserir ainda, de forma operacional na região 5*-terminal do DNA a ser expresso, uma sequência de DNA que codifique tal peptídeo--sinal.
Também está incluido no presente invento um processo para a produção de material vegetal transformado compreendendo ura gene que ê secretado especificamente para o espaço extracelular, processo esse que se caraoterisa es seno ia1mente por:
Ca) isolamento de uma sequência de DNA codificadora de tal produto de gene; íb) remoção do extremo C-terminal da sequência de direcionamento responsável pelo direcionamneto para o compartimento celular adequado; (e) inserção da referida sequência removida num vector de expressão vegetal adequado; e Cã) transformação da construção acabada em material vegetal.
Dentro do âmbito deste invento, é dada preferência a plantas transgénicas, incluindo a sua progénie sexuada e assexuada, que pode ser regenerada a partir de material vegetal selee-eionado a partir do grupo constituido por protoplastos, células, calos, tecidos, orgãos, sementes, embriões, pólen, óvulos, sigotos, etc. e compreende uma das moléculas de DMA recombinante de acordo com o invento. É dada preferência também a plantas transgénicas, incluindo a sua progénie sexuada e assexuada, que tenha um teor proteico significativamente aumentado no vacúolo vegetal e/ou no espaço extracelular da planta coaparativamente com o tipo selva- È dada preferência especial a plantas transgénicas, incluindo a sua progénie sexuada e assexuada, que têm um teor em quitinase substancialmente aumentado no vacúolo vegetal em coiaparaç-ão com o tipo selvagem.
Também é dada preferência especial a plantas transgéni-cas, incluindo a sua progénie sexuada e assexuada, a qual tem um teor em quitinase substancialmente aumentado no espaço extracelu-lar da planta em comparação com o tipo selvagem, A expressão "progénie assexuada e/ou sexuada de plantas transgénicas", como definido dentro do âmbito deste invento, também inclui portanto todos os mutantes e variantes que podem ser obtidos por meio de processos conhecidos, por exemplo através de fusão celular ou seiecçao de mutantes e que ainda possuem as
earaeterísticas da planta transformada de partida e todos os produtos de hibridação e fusão obtidos usando o material vegetal transformado.
Este invento também está relacionado com a propagação de material de plantas transgenicas.
Dentro do âmbito deste invento, material de propagação de plantas transgénieas deve ser entendidocomo qualquer material vegetal que pode ser propagado sexuadamente ou assexuadamente e irt vivo ou in vitro. 0 material de propagação que deve ser considerado como especialmente preferido dentro do âmbito deste invento é especialmente proptoplastoss células, calos, tecidos, orgãos, sementes, embriões, pólen, óvulos e sigotos, assim como qualquer outro material de propagação que possa ser obtido a partir de plantas transgénieas.
Iste invento está também relacionado com partes de plantas, por exemplo, flores, caules, frutos, folhas e raíaes, que derivam de plantas transgénieas ou da sua progénie que foram ariteriormente transformadas por meio do processo de acordo com o invento e que são constituídas pelo menos parcialmente por células transgénieas. tr si 0 processo de acordo com o invento é adequado para a ansformação de todas as plantas especislmente das dos grupos stemáticos ânglospermae e Gvmnospertftae,
I
De entre as gyriinos.per.lMe.., são de especial interesse as Plantas da classe Coniferae.
De entre as Anglosnermae são de para aléra de árvores caduca e arbustos, especial interesse, Plantas das famílias
SplaRaasae., Cru-clterae, Compositae. Liliaceae., Vitaceae, Chenopg-Cliagsaa·. Batagaag., Alliaceae. Aroarvlliaceae. Asnaragaceae. OrchidafiftasL. Ealms., Bromei iaceae. Rubiaceae. Thea.c..eae, Musaceae. Malvaceae ou Gramineae e da ordem Leguminosae.. e, destas, especial mente a família Papilionaceae. São preferidos representantes das famílias Solanaceae.. Cruciferae e Gramineae.
Os cultivares alvo dentro do âmbito do presente invento também incluem, por exemplo, os seleccionados da série: Fragaria. Lotus., MfiAicflKQ., Ongbrychig, Trifolium, Trigfflaõlla, Viena. Qitr»g., L.inuia, Saranlma. tolho,h, Daucus, AmMd.op.sis, Brassica. fiapbaawa. Slnapis, àtram, Cap.si.oum, Datam, Hyaafizaiaag·. Lycoper-síon.« Ricotdam, Solanum. Eetunia. Dieitalis. MMoram, Cichori-Uffi, Helianthus, Lactuca., Br.om.us., Gossypium. Asparagus. Antirrhi-mim, He.me.r._Q-oaild.s,, BsiossIsl, Pe.lar.gQ.nium., Eandcura, Pennisetum. Banunculus, genecic?., SalPiglossis. Cucumis. Browallia, Glzolno, Lolium, 2â&. lJ-it.io.um, Sorghum, Jpomooa., Passiflora. Cyclaroen. lialus. Er.ua.us, Bosa, Rubus. PopuIus . Santa lum, AI li,um, Lilium, BargJLssaig, Ãnanas. Am.ch.ig., Ehasoo.luss-.e. Eis um.
Devido ao novo desenvolvimento no campo da cultura in vit.ro de plantas, especialmente no campo da regeneração de plantas, foi agora possível, mesmo com elementos da família Gramineae. regenerar plantas completas a partir de protoplastos vegetais. Exemplos de experiências de regeneração com êxito com Gramineae estão descritos, int.er alia em Yamada Y et,_ al. (1888) para protoplastos de arros, em Rhodes et al. (1988) e Shillito RD et al. (1889) para protoplastos de milho e em Horn et al. (188*3) para protoplastos de Da civil st glomexaía.·
Dentro do âmbito do presente invento é agora possível usar também as seguintes plantas: Lolium. Zea. Triticum. Sorghum, Sssshazum, Beaibusl, Qjvaas., Avena. Borisum, Sfiaals. e Sedaria.
V
Assim este invento está preferencialmente relacionado também com plantas transgénicas do grupo das Graminaceae. incluindo a sua progénie sexuada e assexuada, a qual pode ser regenerada a partir de material vegetal seleceionado do grupo constituído por protoplastos, células, calos, tecidos, orgãos, sementes, embriões, pólen, óvulos, zigotos, etc. e que contem as moléculas de BM recombinante de acordo com o invento.
As plantas maduras que derivaram de células vegetais transformadas são cruzadas entre si para produzirem sementes. Algumas das sementes contêm os genes que codificam uma propriedade útil e desejável numa proporção que obedece exactamente às leis estabelecidas da hereditariedade. Estas sementes podem ser usadas para a produção de plantas transgénicas.
Linhas homosigõticas podem ser obtidas por auto-polinização repetida e a produção de linhas "inbred". Estas linhas "inbred" podem então ser usadas por sua vez no desenvolvimento de híbridos. Neste processo uma linha "inbred” que compreende o referido gene estranho é cruzada com uma outra linha "inbred" com a finalidade de produção.
Após a descrição geral do presente invento, com a finalidade de melhorar a compreensão é feita referência a Exemplos específicos que são incluídos na descrição com fins ilustrativos e não são de natureza limitante a menos que haja uma indicação específica em contrário.
Na realização especifica do presente invento descrita detalhadamente abaixo, uma quitinase básica e uma quitinase classe III não relacionada [quitinase do pepineirol, que ê naturalmente secretada para o espaço extracelular e não tem homologia com as quitinases classe I e II, corn e sem a sequência - 68 de direcionamneto de acordo com o invento são expressas em plantas de Nicotiana sylvestris e a sua localização dentro da célula vegetal determinada. A necessidade da extensão C-terminal das proteínas presentes naturalmente no vacúolo para a localização direcionada para o vacúolo e possibilidade em principio de descarregar as referidas proteínas especificamente para o espaço extracelular pode ser demonstrado por meio de uma quitinase básica e de glueanase básica do tabaco. Com esta finalidade, os 7 ou 22 aminoácidos C-terminais que formam a extensão C-terminal destas proteínas presentes naturalmente no vacúolo são removidas ou inactivadas colocando um codão de paragem adequado no sítio adequado dentro dentro da sequência codificadora por meio de mutagénese mediada por oligonucleótidos. Isto resulta subsequentemente na descarga de quitinase mutagenisada ou glueanase para o espaço extracelular.
Para demonstrar, por outro lado, que a referida sequência de direcionamneto de acordo com o invento é também capas de dirigir uma molécula proteica proteica associada especificamente para o vacúolo, a sequência C-terminal de urna quitinase básica do tafcco é ligada a uma quitinase ácida de folhas do pepineiro. 0 processo é como se segue; primeiro a sequência não codificadora 5S de uma quitinase básica do tabaco e a sequência, igualmente situada naquela região, codificadora de um peptídeo sinal estão ligadas â sequência codificadora da quitinase madura do pepineiro. 0 extremo 35 daquela construção é então adicionado através de um fragmento ligante a uma sequência codificadora dos 9 aminoácidos da extensão C-terminal do gene da quitinase do tabaco.
As construções atrás descritas foram então colocadas sob o controle de urn promotor forte de CaMV 35S e. inserido em piais tas de Nicotiana svlvestris por meio da transformação de Ãgnahagterium.
Quando a transformação foi realizada, as plantas tr-ansgénicas que apresentaramuma forte expressão de quitinase foram seleccionadas e usadas para análise da localização da quitinase. Os protoplastos foram produzidos e comparadas as actividades especificas da quitinase nos homogenatos e protoplastos.
Com a finalidade de determinar a localização subcelular da quitinase intracelular, isolaram-se vacftolos a partir dos protoplastos.
EXEMPLOS MO LIMITASTES Técnicas Gerais de DNÃ Recombinante
Uma vez que muitas das técnicas de DNA recombinante empregues neste invento são técnicas de rotina para os familiarizados com a área, é melhor dar uma descrição curta destas técnicas geralmente usadas em vez de as descrever todas as vezes que surgirem. Excepto sempre que haia indicação específica em contrário todos estes processos estão descritos na referênciá Maniatis et al. (1882). A, Clivagem com endonucleases de restrição
Lima mistura de reacção contem tipicamente cerca de 50 a 500 de DNA na solução tampão recomendada pelo fabricante, New Ingland Biolabs, Beverly, MA. 2 a 5 unidades das endonucleases de restrição são adicionadas para cada mg de DNA e a mistura de reacção é incubada entre uma e três horas ã temperatura recomendada pelo fabricante. A reacção foi parada pelo aquecimento a 65°C durante 10 minutos ou por extracção com fenol, seguido de precipitação do DNA com etanol. Esta técnica está também descrita nas páginas 104 a 106 da referência Maniatis et al. (1962). B. Tratamento do DNA com polimerase para produzir extremos eerses 50 a 500 jig/ml de fragmentos de DNA foram adicionados à mistura de reacçãono tampão recomendado pelo fabricante, New England Biolabs. A mistura de reacção contem os quatro trifosfa-tos de desoxinuoleõtidos nas concentrações de de 0,2 mM. A reacção teve lugar durante 30 minutos a 15°C e depois terminada por aquecimento a 65°C durante 10 minutos. Para os fragmentos obtidos por clivagem com endonucleases de restrição que produzem extremos protuberantes 5*, como seja IcoRI e BamHI, usa-se o fragmento grande, ou fragmento Klenow, da DNA-polimerase. Para fragmentos obtidos por meio de endonucleases que produzem extremos protuberantes 3», como seja PstI e Saci, usou-se a DNA-poli- merase de T4. A utilização destas duas enzimas está descrita nas páginas 113 a 121 da referência Maniatis et al. (1982). 69 C. Electroforese em gel de agarose e purificação de fragmentos de DM dos géis A electroforese em gel de agarose foi realizada num sistema horizontal, como descrito nas páginas 150 a 163 da referência Maniatis et al. 0 tampão usado é o tampão tris-boraio aqui descrito. Os fragmentos de PM são corados usando 0,5 ug/ml de brometo de etidio que estava presente no gel ou no tanque do atmpão durante a electroforese ou é adicionado apôs a electroforese, 0 DNA foi observado por iluminação com luz ultravioletade comprimento de onda longo. Se os fragmentos se destinarem a ser separados num gel, utilisa-se uma agarose que gelifica a temperatura baixa e que pode ser adquirida à Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Após a electroforese, o fragmento pretendido é removido, colocado em tubo de ensaio de plástico, aquecido a 65 °C durante cerca de 15 minutos, extraído três vezes com fenol e precipitado duas vezes com etanol. Este processo é ligeiramente diferente do descrito por Maniatis et al. (1982) na página 17®,
Como alternativa, o DNA pode ser isolado a partir da agarose com a ajuda do kit Geneclean (Bio 101 Inc., CA, USA). D* AdieSo de fragmentos adaptadores sintéticos aos extremos de Dtfá
Caso se pretenda adicionar um novo sítio de clivagem com endonucleases ao extremo de uma molécula de DNA, a molécula é facultativamente tratada primeiro com DNA-polímerase para produzir extremos cerses, como descrito na secção atrás, Cerca de 0,1 a 1,0 Mg deste fragm.ento é adicionado a cerca de 10 ng de DNA adaptador fosforilado, adquirido á New England Biolabs, num 70 volume de 20 a 30 μ.1 com 2 μ.1 de DNA-ligase de T4 da New England Biolabs e ImM ΔΤΡ no tampão recomendado pelo fabricante. Apôs incubação durante a noite a 15°C a reacção foi parada pelo aquecimento a 65°C durante 10 minutos. â mistura de reacção foi diluida para cerca de 100 μΐ num tampão adequado para a endonuclease de restrição que cliva a sequência do adaptador sintético. Cerca de 50 a 200 unidades desta endonuclease sao adicionadas. A mistura é incubada durante 2 a 6 horas â temperatura adequada, em seguida o fragmento é suieito a electroforese em gel de agarose e purificado como descrito atrás. 0 fragmento resultente terá então extremos com terminações que foram produsidas por clivagem com a endonuclease de restrição. Estes extremos são geralmente coesivos, de forma que que o fragmento resultante pode ser então facilmente ligado a outros fragmentos tendo os mesmos extremos coesivos.
E- Bemoção dos fosfatos terminais 5* dos fragmentos de DM
Durante os passos de clonagem em plasmídeo, o tratamento do plasmídeo vector com fosfatase redus a circularisação do vector (discutido na página 13 da referência Maniatis et al,). Apôs clivagem do DNÂ com a endonuclease de restrição correcta, adícionou-se uma unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela adquirida à Boehringer-Mannheim, Manmnheim. 0 DNA foi incubado a 37°C durante uma hora e depois extraído duas veses com feaol e precipitado com etanol. - 71 -
F. Ligação de fragmentos de DM
Se os fragmentos tiverem extremos coesivos complementares se destinam a ser ligados uns aos outros, cerca de 100 ng de cada fragmento são incubados numa mistura de reacção de 20 a 40 μΐ contendo cerca de 0,2 unidades de DNA-ligase de T4 da New England Biolabs no tampão recomendado pelo fabricante. Δ incubação foi realiaada durante 1 a 20 hors a 15 °C. Se os fragmentos de DM tendo extremos coesivos se destinam a ser ligados eles podem ser incubados como atrás excepto a quantidade de DNA-ligase de T4 ser aumentada para 2 a 4 unidades. O, Transformação de E. coli com BNÃ E, coli estirpe HB101 foi usada na maior parte das experiências. 0 DNA foi introdusido em E. coli usando o método do cloreto de cálcio, como descrito por Maniatis et a. (1982), páginas 250 e 251. H. Despiste de E. coli relativamente a plasmideos
Apôs transformação, as colónias resultantes de E. coli foram testadas quanto à presença do plasmídeo pretendido por meio de um processo de isolamento rápido. Nas páginas 366 a 369 da referência Maniatis et al. (1982) estão descritos dois métodos geralmente usados. I, Isolamento em larga escala de DNA de plasmídeo
Nas páginas 88 a 94 da referência Maniatis et ai._ Í1982) estão descritos processos para o isolamento de plasmídeos a partir de E. coli em larga escala. J, Clonagem em vectores fágicos M13
Na descrição que se segue deve ser entendido que a forma replicativa dos derivados do fago M13 é usada para processos de rotina, tais como clivagem com endonucleases de restrição, ligação, etc.. A menos que haja uma indicação específica em contrário, as enaimas podem ser obtidas da Boehringer, Biolabs (BRL). Elas foram usadas de acordo com as intruções do fabricante a menos que de outra forma indicado. K. Análise de transferências Southern 0 DNA e-xtraido foi primeiro tratado com ensimas de restrição agarose, , depois sujeito a electroforese num gel de 0,8¾ a 1¾ de transferido para uma membrana de nitrocelulose [Southern EM (1975)1 e hibridado com o DNA a ser detectado que foi previa-mente sujeito a “nick-translation" (actividades especificas do DNA de 5 x 10d a 10 x 10® c.p. m./ug). Os filtros foram lavados
três veaes durante 1 hora de cada ves com uma solução aquosa de citrato de sódio 0.Θ3Μ e cloreto de sódio 8,3H a 65°C. 0 DNA 73 hibridado foi tornado vísivel por sensibilização de um filme de raios X durante um período de 24 a 48 horas.
Ii~ Análise de transferências Western
Após electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, as proteínas foram transferidas eletroforeticamente para um filtro de nitrocelulose ou de nylon. Este filtro foi então primeiro pré-tratado com um agente de bloqueio (por exemplo leite em pó desnatado a 5% em PBS: leite/PBB), 0 filtro foi então incubado durante várias horas com um anti-soro que reage com o composto a ser detectado (no presente caso: quitinase). 0 filtro pré-tratado desta forma é lavado varias vezes coro leite/PBS e depois incubado com um anticorpo secundário adquirido comercialmente que está acoplado a uma enzima [por exemplo anticorpos de cabra anti-coe-Iho acoplados com peroxidase (BIORAB), 1:2000 diluído em leite /PBS 3. 0 filtro foi novamente lavado em PBS e depois corado com cloronaftol e peróxido de hidrogénio de acordo com as instruções do fabricante [BIORAB], Outros detalhes estão apresentados em Sambrook et al. (1989). 15- Técnicas gerais para a geração, purificação e sequeneiação automática de peptídeos.
Redução e alguilacao: Proteína purificada, liofilizada é dissolvida em hidrocloreto de guanidina 6M contendo 1M Tris-HCl <pH 8,6) e 10 mM EDTA. Adicionou-se ditiotreitol ÍDDT) para uma concentração final de 20 raM e adicionou-se 4-vinilpiridina para uma concentração final de 50 mM, Esta mistura foi então incubada eia atmosfera de azoto durante 1,5 horas. 0 material piridiletila-do foi então libbertado do sal por meio de HFLC [coluna Aquapore fenilo (2,1 x 10 cm, Brownlee)]. A coluna foi eluida com um gradiente linear, indo de 5% a 80% de um gradiente linear de aoetonitrilo:isopropanol (1:1) em 0,1% ácido trifluoroacético (TFA).
Clivagem ..com_br-ometo_dê_cianogénio_s_digestão com atroaiataroato-amlnopeptidase: A clivagem coro brometo de cianogénio foi realizada in situ de acordo coro Simpson e Nice 81984). A digestão coro piroglu-tamato-aminopeptidase [Boehringer Mannheim] pode ser realizada de acordo com Allen (1981).
Digestão com LisC: A proteína foi digerida com endopro-teinase Lis-C [Boehringer Mannheiml em 0,1M Tris HC1 (pH 8,5) durante um período de 24 horas à temperatura ambiente, usando uma proporção de enzima:substrato de 1:10. Os peptídeos resultantes foram isolados por meio de HPLC [coluna Aquapore C-8 (1 x 22 cm, - 75
Brownlee)]. Como eluente usou-se um gradiente linear de acetoni-trilo:isopropanol (1:1) (0% a 60%) em 0,1% TFA. SJjB£@iJúS-J3SD____tripsina: A digestão da proteína com tripsina [Cooperl foi realiaada em bicarbonato de amónio CpH 8,2) contendo cloreto de cálcio 0,115 a uma temperatura de 37°C e uma proporção de enaima:substrato de 1:100. A duração da incubação é de 5 horas. Os peptídeos resultantes foram separados por meio de HFLC [ver secção C atrás]. Como alternativa, a digestão pode ser realiaada usando uma proporção de enaima:substrato de 1:50 em 0flM Tris-HCl (pH 8,5) a uma temperatura de 37°C. Naquele caso, a duração da incubação é de 24 horas. Os peptídeos resultantes são separados por meio de HPLC [coluna Vydac C-18 (2,1 x 150 mm)3 usando uma gradiente linear (0% a 60%) de acetonitrilo:isopropanol (1:1) em 0,1% TFA.
SeQuenciacão: A degradação automática de Edman foi realiaada com a ajuda de um sequenciador de fase gasosa Applied Biosystems 470A. Á identificação dos aminoácidos feniltio-hidan-toína (PTH) foi realiaada usando um analisador de PTH Applied Biosystems 129A.
Com a finalidade de ilustrar a descrição geral e para uma melhor compreensão do presente invento, será feita referência a Exemplos específicos que não são de natureaa limitante a menos que seja dada Indicação específica em contrário. 0 mesmo se aplica também a todas as listas apresentadas como exemplo na descrição acima. i--froducão de bibliotecas de genes de cDNA e genôroicas a_mrt.ir da.. Planta do tabaco
Exemplo 1: Material vegetal
Plantas de Nicotiana tabaoum L.c.v. Havana 425foram cultivadas numa estufa ou partindo de uma semente com a superfície esterilizada, A esterilização da superfície das sementes foi realizada como segue: 20 a 30 sementes foram colocadas num filtro tendo um poro de cerca de 200 um e incubadas em 10 ml de uma solução comrecial de lixívia (NaOCl) a 10%. As sementes foram então lavadas repetidamente com âgua destilada estéril.
Hos Exemplos que se seguem é preferencialmente usado uma linha clonada de tecido parenquimatoso (N) que pode ser isolado a partir de plantas de Nicotiana tabacura L.c.v. Havana 425 de acordo com Eichhola et al. (1983).
Exemplo 2: Cultura de., tecidos 0 tecido de tabaco foi cultivado num meio básico que tem uma concentração de sal e de hidrocloreto de tiamina de acordo com Linsmeier e Skoog (1985) (LS) e que foi solidificado pela adição de 10 g/1 de agar. Como aditivo este meio básico contem um indicador de pH5 por exemplo 5 mg/1 de vermelho de clorofenol. Outros meios baseados neste meio básico LS e que são usados em Exemplos subsequentes compreendem como aditivos, por exemplo cinetina (1,4 uM) [meio de citocinina] ou um ácido a-naftilaeético [meio auxina/citocinina (meio A)]. 0 meio selectivo B e C não contêm um ácido a-naftilacé-tico, mas em seu lugar contem uma substância seleetiva através da qual os transformantes podem ser seleccionados a partir de um grande número de células e tecido não transformados. A composição precisa destes meios selectivos está apresentada na Secção YIX (meios). â linha isolada (275N) a partir de plantas de Nicotiana -hahacum L.c.v. Havana 425 foi subcultivada em intervalos de 21 dias num meio auxina/citocinina (10 ml), ou seda é de cada ves inoculada num novo meio (10 ml) e cultivada a 25°C na luz.
Para a indução de níveis elevados de quitinase nos tecidos em cultura, os tecidos foram inoculados do meio auxina/-citocinina para um meio básico sem hormonas. Outros detalhes relacionados com a cultura de tecidos vegetais e indução de quitinase estão descritos em Felix e Meins (1985), fe.%PlP 3: Produção de_ protonlastos do tabaco 100 ml de uma suspensão de células do atbaco com 2 dias de idade de acordo com o Exemplo 1 foram misturados com igual volume de uma solução de enzima de concentrada duas vezes. A solução de enzima compreende os seguintes constituintes: - 78
celulase R.10 Onozuka/ 10,0 g/i (Yakult Honsha, Tokvo, Japan) jaacerase (pectinase de Rhiaopus sp,_ Behring Diagnostics, La Jolla, CA) 2,5 g/1 peetoliase Y-23/ (Seíshin Pharm. Co. , Tokyo, Japan) 1,0 s/i CaHOg.4H20 1,45 g/1 MgS04.7Ii20 0,5 g/1 hh4b^po4 S80f3 0,23 1,2 g/1 g/1 D-manitol <pH 5,70) 73,0 g/1 A solução de enaima foi centrifugada e esterilizada através de um filtro de 0,2 mm. A mistura consistindo na cultura em suspensão de células de tabaco e solução de enaima foi agitada cuidadosamente num agitador rotativo (40 rpm) durante 5 horas á temperatura ambiente. Em intervalos específicos retiraram-se amostras da mistura e analisou-se ao microscópio. A digestão enaimática continuou até cerca de 80% das células terem-se transformado em esferoplastos esféricos. Os vasos de incubação foram então removidos do agitador. A suspensão de células/proto-plastos foi deixada a sedimentar e metade do meio, que não contem células ou protoplastos foi removida por sucção com uma pipeta e rejeitado, 0 restante foi transferido para tubos de centrífuga de §@ ml e centrifugado durante 10 minutos a 580 rpm numa centrífuga clínica (modelo HN-SII, IIC). Os sedimentos contendo protoplastos foram ressuspensos em solução delavagem I [ver Secção VII] e depois centrifugado novamente durante 18 minutos a 1008 rpm. A banda contendo os protoplastos está situada na parte superior do tubo de centrífuga. A fracção de protoplastos foi colhida e depois lavada novamente na solução I. Os protoplastos - 79 voltaram para um tubo de centrífuga e guardados em gelo até ser necessário usá-los.
Exemplo 4: Construção de uma biblioteca genética—de
qMA
Uma biblioteca genética de cDNA foi produsida partindo de RHA poli(A)+, o qual pode ser obtido a partir de uma linha clonada de tecido parenquimatoso de plantas de Hicotiana_tahamim L.c.v. Havana 425 (ver Exemplo 15. 0 tecido do tabaco foi primeiro estimulado para produzir níveis elevados de quitinase de acordo com o Exemplo 2 através da cultura do tecido num meio básico LS sem hormona. 4.1, Isolamento de RNA total A preparação de RM total foi efectuada substancialmente de acordo com o método descrito em Lagrimini LM et al. (1987).
Tecido de tabaco congelado em azoto líquido foi primeiro triturado num almofariz e depois colocado num tampão de homogenisação adequado [(1) Mdrocloreto de guanidina 7,56$, mereaptoetanol 0,7313, acetato de sódio 18,9 mM pH 5,0? ou (2) 4% (p/v) SDS, 8,1$ Tris-HCl pH 7,8 (1 parte por volume) + 80% fenol (v/v), 8,1% (p/v) hidroxiquinolina, 0,1M Tris-HCl pH 7,8 (1 parte por volume9; ou (3) de acordo com Lagrimini LM et al, (1987)3 (2,5 ml de tampão por grama de tecido). Apôs a adição de uma parte igual por volume de fenol, a mistura foi homogeniaada, por exemplo num homogeniaador Polytron. Adicionou-se então metade do
volume de clorofórmio e a emulsão foi misturada cuidadosamente durante cerca de 15 minutos. As várias fases foram então separadas umas das outras por centrifugação (10 400 g durante 18 minutos); a fase aquosa foi rejeitada. Nesta altura é possível, caso se pretenda, adicionar outros passos de extracção, por exemplo na forma de uma extracção adicional com fenol/clorofõr-mio;ácool isoamílico (25:24:1). A extracção foi seguida do passo de precipitação. Este passo foi realiaado pela adição de acetato de sódio 0,313 e 2,5 partes por volume de etanol, 0 precipitado foi colhido por centrifugação (18 400 g durante cerca de 15 minutos) e ressuspenso em 2 ml de água estéril. Após a adição de cloreto de lítio numa concentração final de 3M, toda a mistura foi incubada durante a noite a 4°C. 0 precipitado foi novamente colhido por centrifugação e o sedimento formado foi lavado com etanol arrefecido em gelo. 0 sedimento foi então seco e ressupen-so em 500 μ.1 de água estéril. A concentração de RNA total nesta preparação foi determinada por espectrofotometria.
Como alternativa ao processo descrito atrás, o SNA total pode também ser isolado a partir de tecido do calo. Neste caso também, são usados os passos do processo atrás descrito, mas o material de partida usado é tecido do calo cortado em cubos (cerca de 3 mm), o qual antes do passo de homogenisação foi congelado em asoto liquido e depois triturado para dar um pó fino num almofaris préviamente arrefecido,
Isolamento de SNA poliadenilado SNA poli (AH foi isolado por meio de cromatograf ia era oligo-d(T) celulose (Collaborative Research, Lexington, MA, USA) de acordo com métodos conhecidos ner se [ver por exemplo, Mohnen (1979)].
Oligo-dCT) celulose foi primeiro lavada durante 15 minutos em 20 partes por volume de 2,0M NaCl, depois ressupenso em água estéril e empacotado numa coluna (1,5 cm de diâmetro e 20 oia de comprimento). A coluna foi lavada com uma solução tampão (44@ mM NaCl, 0,8mM EDTA, 9 mM Tris-HCl, pH 7,5; ou 0.5M NaCl, 10 mi3 Tris-HCl, pH 7,5) até o eluato ter um valor de pH entre 7,0 e 7,6. As soluções de RNA tendo um teor em EM entre 0,6 mg e 6,0 mg de EM num volume de 4,0 ml foram então ajustadas a uim. concentração final de 1 mM EDTA e piperasina-1,4-bis(ácido 2-etanossulfônico), pH 7,5. 0 RNA foi desnaturado por aquecimento durante 5 minutos a 70°C e depois arrefecido em gelo. Toda a solução foi então ajustada a um valor de 0.36M NaCl com 0,1 parte por volume de 4M NaCl. A solução de RNA foi aplicada numa coluna e o F.NA não poliadenilado CRNA poli (A)-1 foi eluido com a solução tampão atrás referida. A absorção dos eluatos foi determinada por meio de um espectofotõmetro (Hitachi modelo 100-40, Hitachi, Tokyo, Japan) com um registador ligado W+W (Scientific Instruments, Basle, Switaerland). Assim que a absorção atingiu a linha de base, o RNA poli(A)t que se ligou à coluna foi eluido com ImM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5. Os eluatos foram introduaidos numa solução de 0,5 mM EDTA e acetato de sódio 0,3M pH 5,0 e precipitado pela adição de 2,5 partes por volume de etanol. 0 RNA foi então colhido por centrifugação a 83000 x g (30 a 45 minutos), seco em atmosfera de aaoto e ressuspenso em ImM EDTA, 18 mM Tris, pH 7,5 ou em água-
á_JL_ Coast,c.»gaa.....g.„ seleccão... de cloucs .de_cBHA RNA poli(A)+ foi separado em fracções individuais por meio de ultracentrifugação preparativa (17 horas a 57000 g) sobre um gradiente de sacarose 5-25% (p/v) (1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCL, pH 7,5). As fracções que compreendem a informação para a quitina-se podem ser identificadas por meio de tradução in vitro usando anticorpos anti-quitinase. Estas fracções foram então combinadas e usadas para serem usadas pósteriormente. 0 processo para a produção de anticorpos anti-quitinase é conhecido dos familiariaados com a matéria e pode ser realisa-do, por exemplo, de acordo com o método descrito em Shinshi et al,_ (.1985) e Mohnen (1985). Naquele método, essencialmente emulsões compreendendo preparações de quitinase purificada em adjuvante completo de Freund são injectadas em coelhos fêmea de três meses de idade (coelho branco New Zealand). As outras injecções foram dadas após uma e duas semanas e depois com intervalos mensais. Retirou-se sangue 7 a 10 dias após cada injeeção, as amostras de soro sendo guardadas a ~20°C. Imunoglo-bulina G foi purificada por meio de cromatografia de afinidade numa coluna de proteína A-Sepharose Cl 4B (Pharmacia), depois liofiliaadas e guardadas a -20°O, A síntese de DNA de cadeia dupla partindo da rnatria de SNA poli(A)+, clonagem de DNA de cadeia dupla em pBR322, hibrida-ção diferencial de colónias e isolamento de plasmídeos foram realizadas essencialmente de acordo cora as instruções e descrição em Maniatis et al. (1982).
Para a síntese de cerca de 0,8 ug de DNA de cadeia dupla, 3 ug de- ENÂ poli(A)t isolado e enriquecido em mSNA de - 83
quitinase foram incubados com transcriptase reversa (Life Sciences, St. Petersburg, FL) e DNA-polimerase I (New England Biolabs, Beverly, MA). 0 oDNA resultante foi inserido no sítio de clivagem FstI do pBR322 por meio do método de colocação de caudas homopoli-méricas dC-dG, que permite que o cDNA e o DNA vector seia dotado de extremos coesivos complementares e que está descrito detalha-damente em Maniatis et al. (1982) [páginas 217-219]. 0 vector PBB322 lineariaado com PstI tendo extremos oligo-dC pode ser adquirido comercialmente. O plasmídeo recombinante resultante foi então usado na transformação de células competentes i. coli DH1. A clonagem em piasmídeos está descrito detalhadamente em Maniatis et al. (1982.) nas páginas 242-246 e 391. A biblioteca de cDNA construída desta forma, que esta na forma de colónias bacterianas em placas de agar, é então primeiro despistada por meio de hibridação diferencial de colónias usando cDNA marcado radioactivamente.
Na hibridação diferencial de colónias, fiaeram-se duplicados de colónias bacterianas em filtros de nitrocelulose colocando os filtros na placa de agar e depois removendo-os cuidadosamente de novo. A placa de agar original foi guardada para posterior identificação de colónias positivas. Os filtros com colónias bacterianas aderentes foram então colocados num meio nutritivo e deixadas lá até as colónias terem crescido em clones de aproximadamente 2 mm de tamanho. Os filtros foram então
tratados com solução de hidróxido de sódio, que resulta na lise das células bacterianas e na desnaturação e fixação do DNA bacteriano no filtro. Apôs neutralisação do pH, os filtros foram repetidaraente lavados, secos e finalmente incubados a uma 84 temperatura de 80°C in vácuo., de forma a que o DNA se ligue covalentemente aos filtros.
Os filtros foram então hibridados duas vezes em sucessão com sondas de cDNA marcadas radioactivarnente (não clonadas). Estas sondas de cDNA são RNAs poli(A)+ de tecido de tabaco que foi previamente induzido para produzir quitinase (incubação durante 7 dias num meio basal sem adição de hormonas) e RNA poli(A)+ de tecido de tabaco não induzido (incubação durante 7 dias em meio auxina/citocinina). Os possíveis clones positivos de cDNA que reagiram mais fortemente com o cDNA do tecido induzido do que com o DNA testemunha de tecido não induzido, foram então sujeitos a análise usando o método de tradução de "híbridos seleccionados" de acordo com o métod descrito em Mohnen et al. (1985)e Mohnen (1985). 0 DNA de plasmídeo foi desnaturado por fervura durante 1 minuto em NaOH 0,2M-0,3M, NaCl 3M e depois arrefecido em gelo. A reacçao de hibridação foi realizada eia filtros quadrados de nitrocelulose BA/85 (Sehleicher and Schull, Dassel, FRG) usando Ξ00 jmg a 250 de EM total por filtro. 0 RNA hibridado nos filtros foi eluido, precipitado com etanol e dissolvido em 10 μΐ de água e analisado eoia a ajuda de tradução in vitro (usando um extracto de germén de trigo comercial). Os produtos marcados radioactivarnente foram precipitados com anticorpos contra a proteína pretendida e analisados por electroforese em gel de SDS-poliaerilamida. £l£>.ne..de-gDM. ..P.Ç.MN48 A biblioteca genêtca de cDNA foi despistada de acordo ooa Maniatis et al. (1982) usando a hibridação de colónias ou de placas, Gomo sonda de DNA usou-se o clone de cDNA pCHN58 descrito 85 em Shinshi et al. (1987 3 , que compreende toda a sequência de BM codificadora da proteína madura mas sem a sequência do peptídeo sinal N-terminal completa. Desta forma, vários clones de diferentes comprimentos foram obtidos. 0 maior destes clones foi selec-eionado e sujeito a análise da sequência de nucleótidos. Este elone, designado pCHN48, tem uma inserção de 1,14 Kb tendo 7 adenosinas no extremo poli(A), uma única grelha de leitura grande (grelha de leitura aberta) de 987 nucleótidos de comprimento, correspondendo a um polipeptídeo de 329 aminoácidos e um nucleô-tido na região 5* não traduzida. A sequência de aminoácidos derivada da sequência de DNA da região codificadora ajusta-se com a sequência dos 28 primeiros aminoácidos N-terminais de quitina-ses conhecidas do tabaco. 1zcbp1o_......Çonatrucao_de uma biblioteca de genes S.^L- Isolamento de DNA oromossómico do tabaco
Com a finalidade de lisar os protoplastos, 188 ml de suspensão de protoplastos arrefecidos em gelo foram misturados com 488 ml de um tampão TINP (ver Secoão VII). Os núcleos foram separados deste lisado por meio de centrifugação durante 18 minutos numa centrífuga clínica IIC a 2888 rpm. 0 sedimento assim obtido foi ressuspenso em 588 ml de tampão TENP arrefecido em gelo e sedimentados novamente como descrito atrás. Em seguida preparam--se 8 tubos de ensaio com gradientes de cloreto de césio; em cada tubo de ensaio foi colocado 26 ml de tampão TE dea veaes concentrado (ver Secção VII). Com a finalidade de lisar núcleos celulares, adicionou-se 5 ml de uma solução de lauril-sarcosinato de 88 -
sódio a 20% íp/v) e 32,2 g de CsCl e adicionou-se 2,89 ml de brometo de etídio CEtBr, 10 mg/ml) (EtBr; 10 mg/ml) à mistura. Toda a mistura foi agitada suavemente para dissolver o CsCl.
Os lisados assim obtidos foram transferidos para tubos de polialómero (Beckman VTÍ50, tubos de 39 ml) e centrifugados a 45000 rpm e uma temperatura de 20°Ο durante 16 horas num rotor VT150 (Beckman). As bandas fluorescentes sob lua UY foram removidas do gradiente por meio de seringas de 3 ml com agulhas de 16 gauge. A restante manipulação do DNA foi efectuada por repetição da centrifugação de equilibrio CsCl/EtBr. As bandas fluorescentes foram novamente colhidas e o EtBr aderente foi removido por seis passos sucessivos de extração usando isopropanol saturado com 20x SSC (ver secção VII) (igual volume). 0 DNA foi precipitado desta solução de gradiente, purificado como descrito atrás, através da adição em sucessão de duas partes por volume de água destilada, 0,1 parte por volume de acetato de sódio 3,0M, pH 5,4 e 2 partes por volume de etanol. 0 DNA filamentosos foi retirado da solução por enrolamento numa pipeta de Pasteur, lavado em 70% etanol e ainda extraído com uma parte igual por volume de clorofórmio. 0 DNA foi precipitado pela adição de 0,1 parte por volume de acetato de sódio 3m, pH 5,4 e 2,0 partes por volume de etanol. O filamento de DNA foi novamente enrolado, lavado com 70% etanole seco ao ar durante 5 minutos. Foi então dissolvido num volume total de 7 ml de tampão TE (ver Secção VII) e guardado a 4°C até ser necessário usar. fiJL. construção de uma biblioteca de genes genfimlca.il 0 DNA do tabaco previamente isolado foi digerido com a ensiísa de restrição Sau3A e separado durante 20 horas por meio de um gradiente de 10%-40% de sacarose num rotor SW41 (Beckman) a 20000 rpm. As fracções obtidas a partir do gradiente foram analisadas por meio de electroforese em gel (gel de 0,5¾ de agarose em tampão TBE). As fraeções que contêm fragmentos com o tamanho correcto foram reunidas. 0 DNA foi precipitado usando 1/10 do volume de acetato de sódio 3M (pH 4,8} e 2 partes por volume de etanol e ligado a DNA de EMBL3 digerido com BamHI e tratado com fosfatase (Stratagen; La Jolla, CA). A reacção de ligação foi realiaada de acordo com as intruções do fabricante, sendo usadas misturas de reacção de 5 μΐ que compreende luig de DBA vector 1 e 0,1 μg de DNA do tabaco a ser incorporado. A incorporação do DBA resultante desta mistura de ligação nas cabeças de fagos 1 foi realiaada usando o kit Gigapack Plus da Stratagen de acordo com as instruções do fabricante. A produção de fagos após infecção de E. coli CES201 (Glover DM) é de aproxi-madamente 2 x 10 fagos por μg de DNA inserido. ILJL- Pespigts .das—bibliotecas de genes e isolamento de clones genômiç.os A biblioteca de genes genômioa foi despistada de acordo com M&ràatis ei_&!,, (1982) usando a hibridação de colónias ou placas. 0 clone de oBNA PCHN50 descrito em Shinshi et al. (1987) e o clone PGHN48 isolado na Secção 4.4 foram usados como sonda de DNA.
Os recombinantes obtidos desta forrna são purificados e pareialmente caracteriaados usando análise de transferências Southern. Um destes clones, que deu ura sinal de hibridação muito forte cora as moléculas sonda de cDNA pCHN50 e pCHN4S e, de acordo com a análise de transferências Southern, compreende o gene completo da quitinase, foi seleccionado para posteriores testes e designado 1CHN17.
Exemplo,...6.:.. Clone genómico da quitinase do tabaco 1CHH17 LL. Sequenciacão de DNA e análise da sequência
Após digestão com a ensima de restrição HindIII obteve--se ura fragmento de DNA de 5,4 Kb que compreende o gene completo da quitinase e está de acordo com um fragmento do mesmo tamanho do DNA do tabaco. Um fracção deste fragmento, que compreende 3850 pb e contem toda a sequência codificadora foi então sequenciada.
Os fragmentos de restrição foram clonados em vectores de clonagem adequados, por exemplo H13mpl8 ou M13mpl9 CYanisch--Perron et al. (1985)1 e sequenciado em ambas as direcções pelo método de didesoxinucleôtidos CDidesoxynucleotide chain-termina- tion ffiethod"; 8 e de aminoácido anger êt_a.l.,.„ (1977)3. As sequências de nueleótidos s determinadas foram analisadas ainda com a ajuda de computador usando software Genetics Computer Group CDevereux et al. (1884)3.
A sequência de DNA completa do gene da quitinase básica do tabaco, que foi designado gene 48, está apresentada em SEQ ID NO: 10. Uma comparação daquela sequência cora os clones de cDNA 89 PCHN48 e pCHN50 torna claro que dentro da região codificadora do gene 48 existem duas secções intervinientes da sequência Cin-trões). 0 primeiro destes codões compreende 274 pares de bases e está situado entre o primeiro e os segundo nucleótidos do codão 148 que codifica glicina. 0 segundo intrão tem 269 pb de comprimento e está situado entre o segundo e o terceiro nucleótidos do codão 199, o qual codifica histidina. Ambos os introes, com outros intróes conhecidos de plantas e de animais, têm sequências se splicing consensus que têm uma sequência dadora e uma sequência aceitadora (GTAAGTC e ACM). Ainda ambos os introes têm a sequência CTCG/A)A(C/T) , de 33 nucleótidos desde o extremo 3% tendoi semelhanças com outras sequências consensus animais (PyTPuPy). Estas sequências consensus participam na formação de produtos intermediários em ansa na exoisão, A sequência de nucleótidos do exão do gene 48 é idêntica ã sequência de DNA da região do clone pCHN48.
IyemPÍQ -7-L Eo^íâíLJ3ê^lBãJbiMií3±efia_de genes de cDHA a partir de folhas do Penineiro X*-l Eur.lf Icac-ão e_sequência proteica da oultinase de.
Uma proteína quitinase induaível por patogênios foi isolada a partir de folhas infectadas do pepineiro de acordo com o método descrito em Métraux (1988). Os fragmentos peptídicos foram então gerados a partir desta preparação homogénia de proteína por meio de processos conhecidos. A sequência de aminoã-eidos destes fragmentos peptídicos está resumida abaixo: - 98 -
ifftreipp amina Ala Gli He Asn Glu Gli Gli Asn Tir PeFtMeog Ligfi. (Lis) Asn Fen Pro Gin Cis Ala Ala He (Lis) Tre Gli Fen Tir Asn Asn Ala Asp (Lis) Leu Tir Ala Ala Pro (Lis) Ala Ser Trp Ser Lis EepM.âeoa.,IMEE (Met) Fen Ala (Met) Gli Leu Ser Gli Gli Ser Gin Vai Feptídeoa Tr.ípti.QQ£ Vai Leu Leu Tre Gli Leu Leu tir Met Ala Ser Ser Fen Asp Ser Ile Gli Gli Gli Ala Fen Asp ? Vai Gli Leu Pro Ala Ala Asn Tir Gli Gli Vai Asn Gli Tir
Ala Ile Tir Trp Gli Gin Asn Gli Ser Leu Ala Ser Tre Cis Ala Tre Glu Fen Vai Asn Ile Ala Fen Leu
Gli Gin Vai Ile Leu Ser Ala Ala Fro Ile Pro Asp Ala His Leu Asp Lis
Leu Fen Asp Ser Vai Trp Vai Gin Asn Pro Pro Cis Met Fen Ala Asp Asn Leu Leu Ser
Met Gli Leu Pro Ala Ala Arg Glu Ser Gli Gli Fen Ile Pro Ala Asp Ser Asn Tir Gli Gli Vai Met Leu
Asp Asn Ala Asp Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ala Arg Glu Ala Ala Pro Fen Ile Pro Ala Asp Vai Leu Ile Leu Pro Tre Ile ! TLZ Produção de uroa biblioteca de cDNA_a partir—ds-folhas_d£
pgpi*iei,ro_in£agta.flas coffi-IM
As folhas de pepineiro foram infectadas com o vírus da necrose do tabaco (TNV). 5 dias após a infecção, o RNA é isolado de acordo com a descrição acima [ver Exemplo 4.1]. RNA poliadenilado [RNA pcli(A)+3 foi isolado por meio de processos convencionais [ver Secção 4.23 e usou-se para a produção de uma biblioteca de cDNA. Esta foi produzida essencialmente de acordo com o processo descrito em Gubler e Hoffman Í1983) num vector de clonagem lambda Zap [STRATAGEN3. T..3 Isolamento de clones .de_cBM. Qftáiflaaflores .dajana_guitinase do pepineiro
Duas regiões das sequências proteicas determinadas atrás foram seleccionadas relativamente à produção de oligonu-eleõtidos sondas. Os oligonucleótidos sondas sintetizados cobrem todas as combinações possíveis de mRNA capazes de codificar os peptideos seleceionados; G T â
Sonda 1: 5* - CCATTCTGNCCCCAGTA - 3*
G G G C
Sonda 2: 5* - GGATTATTAAMTTGHACCCá -3*
Aproximadamente 300000 placas foram semeadas a partir da biblioteca de cBNA anterior mente construida. Cópias em duplicado destas placas foram testadas com uma mistura 1 de oligonu-eleôtidos marcados com P“'“ (sonda 1) ou 2 (sonda 2). As placas que deram resultados positivos com ambas as sondas foram isoladas, 0 isolamento das placas e a excisão automática foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante CStratagene Laiabda Zap Laboratory Manual, Stratagen, San Diego, USA],
Um clone positivo adequado foi inserido no plasmídeo "Bluescript.” e foi designado pBSCucChtõ. A sequência deste clone de cDNA pode ser determinada por sequenciação didesoxi [ver SSG IB NO 11]. XL_ Construção de mutantes da quitinase edaglucanase II,1. Mutantes da quitinase
Exemplo 8: Introdução de novos sítios de restrição
Na construção de mutantes da quitinase, várias aprtes de clones da quitinase usados foram ligados uns aos outros. Para se conseguir isto, as partes devem ser compatíveis, ou seia sítios de clivagem de restrição adequados devem ser intridusidos nas várias sequências. Daqui em diante são usados os sítios de clivagem de restrição apresentados abaixo, todos eles conduzindo aos mesmos extremos coesivos:
BamHI [6/QATCC] - 93
Bell ET/GATCA]
Bgll EA/GATCT3 A grelha de leitura foi em cada um dos casos seleccio-nada de forma a GAT funcionar como codão para aspartato.
EaemPlo_9:_ Cona.to.cao de. mxbmúiQs. do gene, da_guitinase do-iLafeasp.
Através da inserção do fragmento EcoRI/HindIII de PCHN87, um fragmento subclonado do clone genómico da quitinase CHH17 [para a sua produção ver Secção 12.2], no plasmídeo pTZ18R, obteve-se pTRCHl. 0 plasmídeo pTZ18R pode ser adquirido â PHARMA-Glã. A inserção do clone de cDNA pCHN48 [ver Secção 4.43 que compreende toda a sequência de- cDNA foi isolada por digestão parcial com PstI e clonado no plasmídeo pUC8. 0 clone assim formado foi designado pCHNS. 0 fragmento grande PstI do pCHNS foi clonado no plasmídeo gUC 18, formando dois clones diferentes CpUCH2 e ρϋ€-Η3] que diferem na orientação da inserção inserida no ρο1i-adaptador. 0 fragmento EcoRI/HindiII do pUCH2 foi então isolado e inserido no plasmídeo pTZISU. 0 plasmídeo pTUCH2 foi assim obtido. 0 Plasmídeo pTZISU foi igualmente adquirido â PHARMACIA. 0 fragmento EcoRI/HindIII derivado do pUCH3 foi igual-mente isolado e clonado no plasmídeo pTZISR. 0 clone assim formado foi designado pTRCH3.
Exemplo 10: Mutagénese mediada por oligonucleótidos
Para a mutagénese mediada por oligonucleótidos, os oligonucleótidos que se seguem foram sintetizados por meio de métodos convencionais conhecidos'
Ho- 1 CTGCCTCGGC IGAICA ATGTGG Ho- 2 TTTGGAAATt GACTG TTAGTCG Ho- 3 CCAG AGATCT TTTÇGGAMTSG Ho- 4 GACTTTT AGTCA ATACTATGTAA Ho- 3 GACTTTTAGTCOGTACTATGfâá Ho. 6 CTTTTGAAA AGâlGT TTTAGTCS Ho- 7 CCGCTCTTC GGAIGC GGCTGG Ho- 8 CAGCATCGG/\TGAIGA GGAAGCTG HO. 9 CATCT TCTAGA TTTAGTCTC
Os nucleótidos que foram alterados em comparação com o tipo selvagem estão sublinhados.
Os sitios de clivagem de restrição estão indicados por um espaço em branco. A deleção no oligonucleôtido No. 8 está representada por £1, A inserção nos oligonucleótidos No. 3 e No. 8 está apresentado em itálico. 95
IfLl Mutagénese dos clones da guitiriase do tabaco
Para produzir plasmídeos de cadeia simples, os plasmí-deos de partida são introduzidos numa estirpe dam- de E. coli através da infecção de uma cultura crescida durante a noite daquelas bactérias com o fago auxiliar M13K07 [PHARMACIA]. Estes plasmideos podem então ser facilmente precipitados do sobrenadan-te da cultura por meio de acetato de amónio e polietilenoglicol (FEG 6000) e extraídos com fenol/clorofórmio e clorofórmio. Apôs precipitação novamente com etanol, o DNA isolado foi usado para autagénese [DNA de aproximadamente 5 ml de cultura por mutagéne-se], 20@ pmoles de cada oligonucleótido foram fosforilados durante um período de 45 minutos a uma temperatura de 37°C em 30 M-l de 0,1M Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl0, dinitrotreitol (DTT) 6 mM , 2 mM ATP e 5 unidades de polinuleõtidos-cinase de T4. A re&cção foi parada por incubação subsequente durante 10 minutos a 6*eC. 0 DNA de cadeia simples foi misturado com 2,5 jj.1 de oligonucleótido fosforilado e 1 nl da solução A C0,2M Tris-HCl (pH 7,5), 0,1M MgClg, 0,5M NaCl, 10 mM DTT] num volume final de 30U.1 e incubado primeiro durante 5 minutos a 80°C e depois durante 20 minutos â temperatura ambiente. 13 ui da seguinte- mistura de reacção foram adicionados a cada tubo de ensaio: 18,5 ui de H?0
Cjc 2,9 ui da solução B [0,2 M Tris-HCl CpH 7,5), 0,1M MgCl2, 0,1 DTT 3
2,0 Ml de 10 roM ATF 98
2,® Ul de mistura de cada) dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 10 mM de 1,® Ml do fragmento Klenow 0,5 Ml de DNA-ligase de T4 Esta mistura foi incubada durante 30 minutos a uma temperatura de 32°C e depois durante mais 2 a 18 horas à temperatura ambiente.
Um quarto desta mistura foi usada para transformar células competentes E. coli mutS (estirpe deficiente na reparação). Estas células foram agitadas durante 3 a 6 horas em meio 2 x L ou 2 x TY a 37°C. 0 DMA de plasmídeo foi então isolado por meio de um me'todo minipreparativo bem conhecido. 0 DNA isolado foi então usado para transformar células competentes E. coli DHSaque foram semeadas num meio contendo ampicilina. Os mutantes podem ser então identificados muito facilmente por hibridação de colónias usando o oligonucleótido mutagénico marcado radioactiva-mente. Em adição, pode ser realizada uma análise de restrição pois todos os mutante ganharam ou perderam um sítio de clivagem como resultado da mutação. 8.1.2 PTRCH4 0 plasmídeo pTRCHl foi mutagenisado usando o oligonucleótido NQ 1. 0 plasmídeo formado foi designado pTRCH4. Mesta mutação, um sitio de clivagem de restrição Bell foi introduzido no primeiro codão da sequência de DMA codificadora da quitinase madura, o aminoácido codificado sendo alterado de ácido glutâmico para ácido aspártico CGlul->Aspl]. 10.1.3 pTRCH4 0 plasmídeo pTRCH3 foi mutageniaado usando o oligonu-cleótido NS2. 0 plasmídeo formado foi desigando pTRCH6. Nesta mutação, o oodão 300 da sequência de DNA codificador da quitinase madura foi alterado de glicina para um codão de paragem (G1Í300 -> Stop300) e. um sitio de restrição Hinfl foi introdusido ao rnesmo tempo.
10.1.4 pTUCHB 0 fragmento HindIII/PvulI do pTRGH3 e o fragmento PvuII/-HindlII do pTRCH8, que contem a mutação acima, foram inseridos no vector PTZ18U que foi previamente clivado com HindIII/EcoRI. 0 plasmídeo pTUCH6 foi assim obtido.
18.1.5 pTUGHT 0 plasmídeo pTUCH2 foi mutageniaado usando o oligonu-cleótido ΝΩ3, 0 plasmídeo formado foi designado pTUGHT. Nesta mutação, um sítio de restrição BglII foi introdusido na região do codão 295/286 da sequência de PNA codificadora da quitinase madura. Uma ves que este sito de clivagem de restrição está situado numa grelha de leitura diferente dos outros mutantes até agora descritos, um G inserido no codão 297. Obteve-se assira uma grelha de leitura compatível. 93 18.1.6 pT0CH8 0 plasmídeo pTUCH2foi mutagenizado usando o oligonuele-ótido N24. 0 plasmídeo assim formado foi designado pTUCH8. Nesta mutação, o codão 304 da sequência codificadora da quitinase madura foi alterado de ácido aspãrtieo para asparagina [Asp304 -> Asn304]. Isto leva à perda de um sítio de clivagem Taql. 18.1.7 PT0GH9 o plasmídeo pTUCH2 foi mutagenizado usando o oligonu-cleótido ΝΩ5. 0 plasmídeo assim formado foi designado pTUCH9. Nesta mutação, o codão 304 foi alterado de ácido aspãrtieo para arginina lAsp304 -> Ãrg304], que igualmente conduz à perda de ura sitio de clivagem Taql. 18.1.8 PTDCH18 0 plasmídeo pTUCH2 foi mutagenizado usando o oligonu-oleótido NQ6. 0 plasmídeo formado foi designado pTUCH10. Nesta mutação, o codão 299 foi mudado de asparagina para lisina [Asn299 -Ϊ· Lls299] e o codão 300 foi alterado de glicina para ácido aspãrtieo [G1Í308 -> asp300]. Um sitio de clivagem BglII foi introduzido ao mesmo tempo. A mutagénese dos clones da quitinase de pepineiro foi reallsada de forma análoga ao processo descrito no Exemplo 11. 1, A inserção EcoRI do eDNA da quitinase do pepineiro clone pBSCuGlitã [ver Secção 7] foi clonada no plasmídeo pTZIBU. 0 plasmideo assim construído foi designado pTUCU2, 10-2-1 pT0C04 0 plasmídeo pTUCU2 foi mutagenisado usando o oligonu-cleotidoNQ7. 0 plasmídeo formado foi designado pTUCU4. Nesta mutação, um sítio de restrição BarnHI foi introdusido no último codão da sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal, como resultado disto o codão que se segue foi alterado de forma a codificar o aminoácido prolina em vea de alanina íAla-1 -> Pro-13. 18.2.2 PTUC05 0 plasmideo pTUCD2 foi mutagenisado usando o oligonu-cleõtido N28. 0 plasmideo assim formado foi designado pTUCOS. Nesta mutação, um sitio de clivagem Bell foi introdusido na região do codão de paragem da quitinase do pepineiro. Como resultado, o codão de paragem foi convertido num codão de ácido aspártico [Stop268 -> Asp2683. 18.2.2 pTocoe
O plasmídeo pTUCU2 foi mutagenizado usando o oligonu-eleótido NQ9. 0 plasmídeo formado foi designado pTUCU6. Nesta mutação, um sítio de restrição Xbal foi introduzido na região da sequência não codificadora 35 da sequência de cDNA [na região dos nucleõtidos 981-986 do clone pBSCucGht.5] como resultado disto é possível clonagem no vector pGYL ΙΣ.2. Mutantes da glucanase
Exemplo 11: Hatanénese mediada PorPCB 0 tripleto de bases [GTC = valina] codificador do primeiro aminoácido da extensão C-terminal foi convertido no codão de paragem TGA usando o método PCE.
Os métodos de realização de uma mutagénese por FCR são bem conhecidos. Eles estão descritos, por exemplo, nas referências que se seguem; Wang et al. (1989); Innis et al. (1990) e Erlich (1989), Ainda, um kit de FCR correspondente pode ser adquirido à FERKIN-ELMER CETUS ENorwalk, Conn., USA] ou outros fabricantes e o processo pode ser realizado seguindo as instruções do fabricante.
11.1: Construção de pCIB1θΘ5Bde1ta¥TP
Esta construção pode ser produzida partindo do plasmídeo PCIB1005B o qual foi depositado na “American Type Cultura 101
Collection" [ATCC] em Rockville, Maryland, USA, com o número de acesso ATCC 40770 e a construção do qual está descrita detalhada-mente em EP-A 0,392,225, 0 plasmídeo pCIB1005B codifica uma prepro-B-l,3-gluca-nase básica quimérica do tabaco com uma sequência sinal N-termi-nal completa e uma extensão C-terminalç compreendendo 22 aminoã-eidos, num vector de expressão CaMV 35S. 0 plasmídeo pCIB1005B-deltavTR, a produção do qual está descrita abaixo, que codifica a mesma glucanase, mas em que a extensão C-terminal compreendendo 22 aminoácidos foi eliminada funcionalmente através da inserção de um codão de paragem no extremo da sequência codificadora da proteína madura.
Os oligonucleõtidos que se seguem foram usados na amplificação PCB.:
Oligo 1: 5’~ GGG ACA CAC GTG CAC CTT -3 a Oligo 2: 5a- CTG TCC GAA ACT CCÁ ATA TTA TAT T -3a GAT CAC CCA AAG TTG Oligo 3: 5a- AAT ATA ATA TCA ACT TTT GGG ACA G -3a TTG GGT GAT CTG GTG GAG Oligo 4: 5a- GCC TCC CCT TCA TCG TCC -3 a 0 oligonueleótido 1 Coligo 13 corresponde a uma sequência na região codificadora do DNA da glucanase que está situado a montante do sitio de clivagem Xhol ali situado, 0 oligormcleõtido 3 Coligo 33 compreende a região na região do extremo 3» da sequência codificadora da proteína glucanase madura seguido do codão de paragem a ser introduaido e uma parte da sequência codificadora da extensão C-terminal, pendente 0 oligonucleótido 2 Coligo 2] tem uma sequência corres-a oligo 3 , mas na orientação anti-codão. O oligonucleótido 4 Coligo 43 compreende uma sequência que está situada na região terminal 3* do pCIB1005B, a jusante do sítio de clivagem Saci ali situado. 103
Bealisaram-se três reacções PCR:
Cl) PCR1 com oligol e oligo2 como iniciadores e pCIB1005B como molde; (2) PCR2 com oligo2 e oligo4 como iniciadores e pCIB1005B co» molde; (3) FCR3 com oligol e oligo4 como iniciadores e os produtos das reacções PCR1 e PCR2 como moldes. Os dois primeiros ciclos da reaccão PCR3 foram realizados apenas com moldes; sô então foram adicionados iniciadores. 0 produto da reacção PCR3 foi digerido com Saci e Xhol e separado por meio de gel de agarose. A banda correspondente a 725 pb foi cortada do gel e purificada. 0 plasmídeo pCIB1005B foi então igualmente digerido com Xhol e Saci e ligado durante a noite ao fragmento de FCR3 purificado numa reacoão com ligase. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. coli DH5oc. A selecção dos transformantes foi realizada usando ampicilina. Os plasmídeos PCIB1005B e pCIB1005B/\VTP podem ser isolados a partir de culturas crescidas durante a noite de células transformadas e usados para subsequente transfecção de protoplastos de Nicotiana nlumba-ginifolia. A correcção das construções obtidas deste modo foi confirmado por análise de sequências. 4 104 -
\
III- InçoxpoxaçIjQ...........áos......mutântes____dã_auiMnase.-. expressão vegetal
Exemplo 12: Construção do PlasraídeoxpSCHlt 0 plasmídeo pSCHl® contem a sequência codificadora da quifcínase do tabaco, compreendendo o clone genómico CHN17 assim como o clone de cDNA CHN48, inserido no plasmídeo vector pGYl. Esta sequência está delimitada pelo promotor 35S do vírus CaMV e pelas suas sequências de terminação. Esta construção é portanto a construção da quitinase tipo selvagem. Está descrito detalhada-mente abaixo.
12,-.1 Construção do Plasmídeo jbGYI 0 plasmídeo pGYl deriva do vector de expressão vegetal pDHSl descrito em Pietrsak et al. (1988). No plasmídeo pGYl, o sítio de clivagem Ncol do plasmídeo de partida pDHõl foi substituído por um sítio de clivagem Xhol, O plasmídeo pDH51 foi clivado com Ncol e os extremos protu.berantes foram preenchidos usando polirnerase Klenow. Os extrmos, que estão agora cerses, foram então ligados a um adaptador Xhol (CCTCGAGG). 0 plasmideo p5CH10 compreende a sequência codificadora da quitinase, a sequência não codificadora 5' transcrita, 21 pares de bases do gene 48 da quitinase situados a montante do local de iniciação da transcrição e uma sequênica não codificadora de 31 pb, inserido no sítio de elonagem BamHI/Pstl do veetor de expressão vegetal 35S de CaMV, pGYl.
Os passos do processo necessários para a produção de PSCH10 estão descritos mais de ta1hadamente abaixo; íl) 0 clone genómico 1CHN17, que compreende o gene 48 da quitinase, foi clivado com HindIII. 0 fragmento resultante HindIII de 5,6 Kb foi isolado e inserido no sítio de clonagem HindIII do plasmideo pUC8, formando o plasmideo pCHN65. C2) 0 plasmideo pCHN65 foi clivado com ecoRI e o fragmento resultante de 2,5 Kb compreendendo o extremo 5' da região codificadora da quitinase foi igualmente clonado em pUC8. 0 plasmideo resultante foi designado pCHN68, (3) 0 plasmideo pCHN68 foi digerido com PstI e religado (ligado a ele próprio) com a perda de um fragmento Pstl/IeoRI de 0,5 Kb. 0 plasmideo resultante foi designado pCHN74. Í4> Para clonar a região não codificadora 5* do produto da transcrição do gene 48 após um sítio de clivagem BamHI, o plasmi-deo pOHN74 foi primeiro digerido com Hphl, depois dotado de extremos cerses pela aeção da DNA-polimerase de T4 e finalmente clivado com PstI. 0 fragmento Hphl/PstI foi isolado e inserido no 106
plasmídeo pUC>8 digerido com HincII/PstI [Vieira & Messing (1982)]. 0 plasmídeo resultante foi designado pCHN87.
Após sequenciação, pode-se ver por referência à sequência de DNA que durante o ôltimo passo do processo uma base do meio do sítio de clivagem HincII foi perdido. C5> pCHN87 foi digerido com EcoRI e HindIII e inserido no vector de elonagem pUC9 [Vieira & Messing (1982)]. 0 plasmídeo resultante foi designado pCHN88. <6> 0 fragmento PstI de 1Kb do clone 48 de cDNA (pCHN 48) foi inserido no sítio de elonagem PstI do plasmídeo pUC8, formando (7) A inserção PstI do plasmídeo pCHN78 foi retirado por clivagem do plasmídeo com a enzima de restrição PstI e inserido no sítio PstI do pCHN88, de forma a que seja restabelecida a sequência de DNA completa codificadora da quitinase. 0 plasmídeo resultante foi designado pCHN89. (8) 0 plasmídeo pCHN89 foi então digerido totalmente com BamHI e parcialmente com PstI. 0 fragmento resultante de 1,5 Kb foi clonado no vector de expressão vegetal pGYl, o qual foi clivado previamente com BamHI e PstI, formando pSCH10. Como resultado deste passo de elonagem, a sequência de DNA codificadora de quitinase foi colocada entre o promotor CaMV e a sequência de terminação CaMV. 107
Exemplo 13: Incorporacao dos mutantes da guitinase.. no—plasmídeo de espressào vegetal pSCH10 13,1 IncorporacSo de mutantes da quitiaase do tabaco 0 fragmento PstI do plasmídeo pSCH10 foi substituído pelos seguintes fragmentos PstI··
Fragmento PstI do pTUCH6 -> pSCH3
Fragmento PstI do PTDCH7 -> pSCM25
Fragmento PstI do pTDCH8 --> pSCM22
Fragmento PstI do pTUCH9 -> pSCM23
Fragmento PstI do pTDCH18 -> pSCH24
Estes plasmídeos agora compreendem as sequências de direcionamento 3* terminais mutagenizadas, as quais têm as seguintes sequências de- nucleõtidos: PSCH10: 5’- GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT AGT TAÂ -3* PSCS24: 5*- GGA AM GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TM -3* PSCH22: 5*- GGA AAT GGA CTT TTA GTC AAT ACT ATG TM -3* pSCM23: 5*- GGA AAT GGA CTT TTA GTC SfiT ACT ATG ΤΔΑ -3*
Os nucleõtidos que foram alterados Cmutagenisados) relativamente ao Plasmídeo tipo selvagem LpSCH101 estão apresentados com sublinhado. 13-2 Incorporação dos routantes da quitinase ..4o -PePlaeíro 13.2.1 Plasmídeo pSCOl O fragmento EeoRI/BclI do plasmídeo pSCMl e o fragmento BamHI/EcoRI do pTUCU4 foram clonados no plasmídeo ρΤΖΙδϋ, o qual foi clivado anteriorrnente com EcoRI. Formou-se o plasmídeo pTOCHT. 0 fragmento EcoRI/Nsil do plasmídeo pTUCU7 e o fragmento Nsil/EcoRI do pTUCU6 foram clonados no plasmídeo pTZ18U, o qual foi clivado antes com EcoRI. Formou-se o plasmídeo pTUCCJll. 0 plasmídeo pTOGUll foi então digerido com BamHI e Xbal e isolado o fragmento BamHI/Xbal. este foi então inserido no plasmídeo pGYl, o qual foi clivado antes com BamHI/Xbal, formando-se o plasmídeo pSCUl. 13.2.2 Plasmídeo pSC03 0 fragmento EcoRI/Nsil do plasmídeo pT0C07 e o fragmento NsiII/EcoRI do pTUCUS foram então clonados no plasmídeo pTZ18Ut o qual foi antes clivado com IcoRI. 0 plasmídeo ρΤϋΟΟΙΘ foi assim obtido. 0 plasmídeo pSCU3 foi formado pela clonagem do fragmento Xhol/Bcll do plasmídeo pTUCU10 e o fragmento BglII/PstI do plasmídeo PTUCD7 no plasmídeo pGYl, o qual foi antes clivado com Xhol/PstI. 13.2.3 Flasmídeo pSCUó 0 plasmídeo pSCUó foi obtido por clonagem do fragmento Xhol/Bcll do pTUCUlO e o fragmento BglII/PstI do pTUCHl® no plasmídeo pG Y1, o qual foi antes clivado com Xhol/PstI.
Os plasmídeos pSCU3 e pSCUó agora compreendem, ao contrário do plasmídeo testemunha pSCUi, sequências de direciona— mento 3’—terminais que têm as seguintes sequências de nucleótidos tobacco chitinase gene
TTGt GGA AAT GGA CTT
pSCU3: ATC GG,T GAT CTT'TTA GTC GAT ACT ATG TAA ^- cucumber chitinase gene tobacco chitinase gene pSCU6: ATC GG^T GAT 'CljT TTA GTC GAT ACT ATG TAA
Bcll/Bgin ligation
Os nucleótidos que foram alterados (mutagenizados) relativamente ao tipo selvagem estão a carregado e sublinhados. novo por
Os nucleótidos que foram introduzidos de inserção estão apresentados em itálico. 110
Exemplo 14: Inserção das construções pSCM—a-BSCB_SUS vector vegetal binário MJL Construção do plasmídeo pCIB200 A construção deste vector binário baseia-se no plasmi-deo pTJS75 descrito em Schmidhauser e Helinski (1985), o qual é um derivado do RK2 (An G et al. . 1985) e cobre uma larga gama de hospedeiros e tem um gene de resstência à tetraciclina. Este plasmídeo foi clivado com a ensima de restrição NarI e depois ligado ao fragmento do pUC4K [Vieira e Messing (1982)], o qual é portador do gene NptI. 0 plasmídeo pTJS75kan formado desta forma, que agora compreende para além do gene de resistência à tetraei-clina, também o gene NptI, foi então digerido com a ensima de restrição Sall.
Ha mesma altura, o plasmídeo pCIB7, que está descrito em Eothstein SJ et ai. (1987), foi clivado com a ensima de restrição EcoRV e o fragmento EcoRV resultante, o qual compreende a sequência delimitante direita e esquerda de T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobacteriuro..tumefaciens assim como um gene quimérico Nos/NptII e a região do poli&daptador pUC, foi ligado a adaptadores Xhol, A construção resultante foi então digerida com Xhol e olonado no sítio de clivagem do plasmídeo pTJS75kan, 0 plasmídeo resultante cujo raapa está apresentado na Figura 1, foi designado 111 -
MJL CIoiiagígm.„.áo^JzagmsJíilies.....Icj5RI...^.m.....bCIBSM 0 plasmídeo pCIB200 foi primeiro clivado com ecoRI. Em seguida os fragmentos EcoRI que se seguem foram clonados no PCIB200 clivado:
Fragmento EcoSI do plasmídeo pSCH18 -> pSCH12
Fragmento EcoRI do plasmídeo pSCM3 -> pSCM13
Fragmento EcoRI do plasmídeo pSCUl -> pSCDll
Fragmento EcoRI do plasmídeo pSCU3 -> pSC013 !?.«. Transformação -de-protoplastos do tabaco
Os plasmídeos atrás descritos foram testados in vitro em protoplastos de Nicotiana -plurobaginifolia usando um “sistema de expressão transitória".
Eramplo 15l- Produção e cultura de protoplastos de
Plmlwâaifolia A produção e- cultura de protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia foi realiaado por meio de processos conhecidos» de forma análoga ao processo descrito para o tabaco [ver Secção 33. Oma descrição detalhada será encontrada em Shillito e Fotry-kus (18873 ou em Negrutiu et al.. 198T.
Bgeaplo. .16.: Transformação dos protoplastos A transformação de protoplastos de Nicotiana plumbaai-nifolia foi realisada de acordo com o processo descrito en Negrutiu et al. (198T).
Os protoplastos produaidos de acordo com o processo acima foram resssuspensos após o último passo de purificação numa solução tendo a seguinte composição'* manitol 8,4H GaClg 15-30 m HES 0,1% (p/v> 8 A densidade de protoplastos era de 1,6 - 2 x 10 /ml 3 ml desta suspensão de protoplastos foram primeiro misturadas em tubos de centrífuga de 15 ml com 5ug de DNA de plasmídeo na forma de uma suspensão aquosa estéril [Passkowski et al. (1984)]. Alguns minutos mais tarde, adicionou-se à mistura 0,3 ml de uma solução de polietilenoglicol [40% (p/v) PEG 6000 em 0,4M manitol, ο,ΙΜ Ca(N0o)o* pH 7,0] e a mistura foi misturada euidadosamente. Vários minutos mais tarde, adicionou-se 4 ml de meio K3 CZ FlflanzenphFSiol, 78: 453-455 (1976); Shillito et al. (1981)] e os tubos foram incubados durante 24 horas no escuro a uma temperatura de 25°C a 27 °C.
Para melhorar as propriedades de sedimentação dos protoplastos, foi então adicionada uma solução salina W5 CNegru-tiu et al. . 1987] [5,4 rnll. Os protoplastos foram então centrifligados a baixa velocidade Caproximadamente 60-100 x g], Uma amostra do sobrenadante foi removida para subsequente análise da 113
actividade de quitinase e o restante foi rejeitado. Os proto-plastos que foram separados foram resssuspensos no restante meio e tansferidos para tubos Eppendorf, onde o volume foi aproximada-isente determinado, Amostras desta suspensão foram usadas para análise da actividade de quitinase e para transferências Western. A transformação de protoplastos de Njcotiana_plumbagi- nifoli com o plasmídeo pCIB1005B e pGIB1005BZ\VTP pode também ser realisada de acordo com o processo de "Negrutiu" modificado por Goodall et al. (1990).
3L. TMBSFQBMACaO EPBOPUCãO DE PLAHTAS TRANSSêKICAS teTOlQ-.,Π ...1 Transformação de Agorbacterium tumefaciens com vectores .binários
Os vectores binários descritos abaixo no Exemplo 14 foram usados para transformar Agrobacterium tumefaciens estirpe LB4404 usando o seguinte processo. A. tumefaciens LBA 4404 contem um plasmídeo Ti que não possui a região de T-BNA mas que ainda tem uma região vir Intacta EHoekema et al. (1983)3.
Agrobaeterium tumefaciens estirpe LB4404 foi cultivada a uma temperatura de 30°C numa cultura crescida durante a noite e a mistura total foi bem misturada até se obter uma densidade óptica de 00=0,6 (a 800 nm). As células foram então coibidas por meio de centrifugação a 80Θ0 g e ressuspensas em 5 ml de meio MG/L. 200 Ml desta suspensão de células foram incubados com 0,2 Mg a 1 Mg de DNA do plasmídeo binário em meio MG/L e após agitação suave a mistura foi imediataraente congelada num banho de neve 114 -
carbónica/gelo durante 5 minutos. Adicionou-se então 2 ml de meio MG/L, Esta suspensão foi então incubada durante 2 a 3 horas num banho maria a 30°C. As células foram então colhidas por meio de centrifugação. As células foram ressuspensas numa pequena quantidade de meio MG/L e depois semeadas num meio selectivo (placas líG/L· com 100 ug/ml de gentamicina). As primeiras colónias surgem após 2 a 3 dias a 30°C.
EzsrnuXs^U^.Z. Transformação de Agrobacterium tumefaciens com vectores binários
Muma forma alternativa, os vectores binários descritos atrás no Exemplo 14 foram transferidos por meio de hibridação triparental [Rogers SG et al. (1386)] usando uma estirpe auxiliar de E. .co.ll que tenha um plasmídeo com uma função tra, em Aerobac-ter.ium tumefaciens estirpe LB4404. A estirpe auxiliar de E. colf usada pode ser, por exemplo, E. coli BHB1011 que contem o plasmídeo pRK2013 tendo as funções tra necessárias para a transferência dos vectores binários. A. tumefaciens LBA4404 foi cultivada durante a noite a 28 °0 em meio LB com 20 mg/1 de rifampicina e 500 mg/1 de estrep-tomieina. e. ooli BHB1011 e as estirpes de E._coli tendo os vectores binários foram cultivadas durante a noite a 37 °C em meio LB com 25 mg/1 de canamicina. 1 ml daquelas culturas foi centri-fusado a 8000g, lavado em 1 ml de água estéril ou de uma solução de MgSO^, novamente centrifugado e ressuspenso em 100 μΐ de água ou de uma solução de MgSO^. Uma placa contendo meio LB sólido foi divídada em quatro secções. Gotas das três estirpes bacterianas foram aplicadas umas sobre as outras nestes sectores de tal forma
V q.ue em três dos quatro sectores as três combinações possíveis das duas culturas foram misturadas. Istas actuam como testemunhas. No entanto, no quarto sector as três culturas foram misturadas. Apôs as gotas terem secado, as placas foram incubadas durante a noite a 28 °G. Em seguida retirou-se uma amostra de cada sector e ressuspensdeu-se em água ou MgSO^. Preparam-se diluições daquelas suspensões e semearam-se em placas LB contendo 20 mg/ml de rifampicina, 500 mg/1 de estreptomicina e 25 rng/1 de canamicina e incubou-se durante dois a três dias a cerca de 28°C. As colónias que cresceram numa diluição elevada do híbrido triparental [nada é capas de crescer numa diluição semelhante dos híbridos testemunhal foram limpas de qualquer bactéria parental que pudesse estar ainda presente através de sementeira repetida de colónias individuais.
Exemplo 18 Transformação de discos de folhas de N, svlvestris β N. tabaoum A transformação dos discos de folhas foi realisada substancialmente de acordo com o método descrito em Horsch et al. (1885). A. tumefaolens LBA 4484 (pCIB200; PSCH12; pSCM13; pSCOllj pS013> foi cultivada durante a noite a urna temperatura de 28 °0 num meio com sal glutamato enriquecido ora 20 mg/ml de rifampicina, 588 mg/1 de estreptomicina e 25 mg/rol de canamicina e ajustado a um pH de 5,6. Nesta cultura crescida durante a noite, a qual contem aproximadamente 3,3 x 10® células, os discos de folhas estéreis (5 mm a 10 mm de diâmetro) de N. svivestris ou de N, tabacum c.v. Havana 425 foram incubados durante 5 minutos. Os discos foram então removidos da cultura e secos sobre toalhas de papel estéreis antes de serem transferidas para placas de Petri de 100 mm. de diâmetro contendo uma cultura nutritiva. 116 -
Esta cultura nutritiva consiste num meio básico (30 ml), de acordo com Linsmeier e Skoog (1965), solidificado com 1% de asar (DIFCO) e contendo ainda como adtivos um indicador de pH (vermelho de clorofenol; 5 mg/1) e as substâncias de crescimento vegetal cinetina (0,3 mg/ml) e ácido a-naftilacético (2 mg/ml). Este meio de agar (meio A) foi coberto com uma camada de 1 ml a 2 ml de uma cultura em suspensão com 2 semanas de idade de S275N derivadas de tecido de N. tabcum c.v. Havana 425 (Eichhols et al.. 1983) e coberto com papel de filtro (NQ1 papel de filtro Whataman). Os discos de folha foram então colocados sobre o papel de filtro.
Após 48 horas, com a finalidade induzir a formação de rebentos os explantes foram colocados num meio selectivo tendo tendo a mesma composição mas também contendo 350 mg/1 de cefota-xime e 100 mg/1 de canamicina (meio B) e foram incubadas a 25°C e em lua difusa (80 a 100 uEinstein). 0 tecido testemunha cocultl-vado foi inoculado no mesmo meio sem canamicina. Os explantes foram transferidos para meio fresco B em intervalos de 1 semana. 4 a 8 semanas após a cocultura, os rebentos verdes que se desenvolveram a partir do explantes foram colhidos e transferidos para 25 ml de meio C (meio sólido contendo 0,6¾ Phytagar) em frascos de 50 ml. Todo o tecido foi cultivado a uma temperatura de 24°0 a 28°Q com uma intensidade de luz de 80 a 100 uEins-tein. Os rebentos deram origem a raízes após 1 a 2 semanas. XL- AHáLl£E_I30 MATEBIâL DE PLANTAS TBANSGfiNICÃS (â) Demonstração indirecta da localização no vaeáolo 117 .Exemplo 19 Análise dos ..pmk&P-Iasi/Qs.. transformados Δ análise dos protoplastos transformados foi realizada de acordo com o processo descrito detalhadamente nas Secções 17 e 20.3. 19.1- Actividade de quitinase
Como se pode ver pelos resultados de actividade na Tabela 1, se bem que os protoplastos testemunha tenham uma actividade de quitinase endógena, apenas se pode demonstrar uma actividade ligeira no sobrenadante.
Pelo contrário, todas as construções da quitinase do tabaco apresentam um aumento marcada actividade total no sedimento e no sobrenadante. 0 aumento global na actividade de quitinase nas amostras de sobrenadante testadas é presumivelmente devido a sobrecarga do sistema. No entanto podem ser observadas diferenças mareadas:
No caso das construções pSOH10, pSCM22, pSCM23 e PSCM24, a actividade de quitinase no sedimento ê 3-4 veaes superior â medida nas testemunhas. No caso da construção p3CM3, no entanto, a actividade da quitinase no sedimento aumentou apenas 35¾.
No e-aso das construções da quitinase do pepineiro pSCOl, pS0U3 e pSCU6, a actividade de quitinase no sedimento foi ausentada apenas 10-20%, enquanto que a actividade no sobrenadan-te era superior por um factor de 7 a 8 [ou 4 no caso de pSCU3] em comparação com as testemunhas. 118 -
Os resultados apresentados na Tabela 1 foram confirmados por resultados de transferências Western. Os dados da transferência Western para as construções da quitinase do pepineiro, por exemplo, mostram claramente que, no caso do pSCUl (tipo selvagem), estava presente apenas muito pouca quitinase está presente nos protoplastos transformados, enquanto os protoplastos transformados com pSCUS e pSCD6 contêm concentrações de quitinase muito elevadas. JSLZl Áctividade. de KlWMmagft
Os resultados obtidos om os protoplastos testemunha Cver Tabela 10] mostram que a B-1,3-glucanase de Nicotiana plumbaginifoll é retida na célula.
Um resultado comparável pode ser obtido usando a construção Intacta CpCIB1005Bl, neste caso sendo observado apenas simplesmente um sinal rnais forte nos extractos de protoplastos. Isto mostra que a glucanase do tabaco fica também retida nos protoplastos e portanto é dirigida correetamente para o compartimento celular.
Quando se usa a construção tendo a extensão C-terrainal eliminada ou inactivada [pCIB1005B6YTF], no entanto, a B-l,3-glu-oanase é secretada para o meio de cultura. 119
Análise das plantas, transformadas
As plantas transformadas de acordo com o Exemplo 18 foram analisadas por meio dos processos descritos abaixo.
2IL.1 Bjcfarac.cga.flo fluido intracelular.. .(ICEI A extraeção do fluido intracelular do tecido vegetal pode ser realiaada de acordo com o método descrito em Parent e
Asselin (1984). Naquele método folhas de plantas transgénicas regeneradas são primeiro colhidas e cortadas em pedaços de 4 a 5 o ciíT que são então infiltradas com um grande excesso de tampão frio (cerca de 4°C), ín__vácuo durante 30 segundos cada, com agitação suave. 0 referido tampão vantaiosamente tem a seguinte composição*
Tris-HCl EpH 7,81 com 8,5M sacarose 25,0 mH MgCLg 10,0 mH CaCL, 10,0 mH flaoreto de fenilmetilsulfonilo CFMSF) 0,5 mH 2-mercaptoetano1 5,0 mH
Como alternativa é também possível usar um tampão citrato 50 mM ípH 5,5). A operação pode ser realisada ã temperatura ambiente*
Quando se retira o vácuo o tampão penetra nas folhas* Os pedaoos de folha foram então cuidadosamente secos e transferidos para uma seringa de 20 ml. A seringa foi suspensa num tubo de centrífuga e centrifugada durante 10 minutos a baixas velocidades (cerca de 1000 x g) e a urna temperatura baixa (4°C). 23,Z Extraccao da fraccão de proteína intracelular
Os pedaços de folha tratados de acordo cora a Secção 20.1 foram então homogeniaados no mesmo tampão. As partículas mais grossas foram separadas por centrifugação. gfh.3. Determinação da actividade de quitinase A concentração proteica nos dois extractos foi determinada por meio de um ensaio radiométrico usando quitina marcada radioactivamente [tritiada] CBoller et al. (1983)]. Os resultados para os transformantes da quitinase do tabaco estão apresentados na Tabela 2 e os transformantes da quitinase do pepineiro na Tabela 3.
Resumidamente, os resultados das expriências de transformação aqui realisados com protoplastos e plantas completas mostram que o fragmento peptídico de acordo com o invento no extremo C de uma quitinase básica do tabaco è responsável pelo direcionamento da quitinase especificamente para o vácuolo na planta. Ainda, os resultados com PSCM22. pSCM23 e pSCM24 claramente demonstram que uma certa variação dentro da sequência de aíaínoacidos no extremo C é permitida sem que a função de direcionamento daquela sequência seia perdida. Se a sequência de direcionamento 35 terminal faltar tpSCM3; pSCM13] então uma gransde parte do gene da quitinase que de outra forma estaria presente no vaeúoloé secretada para o espaoo extracelular.
Ainda, com base nestes resultados é também possível mostrar que a sequência de DNA de acordo com o invento actua como um sinal de direcionamento mesmo quando operacionalmente ligado a um gene heterõlogo [gene da quitinase do pepineiro; pSCU3,; pSCU6; pSCU13] por a proteína quitinase que é naturalmente secretada sestar retida na célula vegetal, mais provavelmente dentro do vacúolo. ÍB) Demonstração directa da localiaacão no vacúolo
Baremelp. 21,...1i. Isolamento de. pro-toplastos (adaptado de acordo com Muller et al.. 1983):
Folhas de plantas transgénicas de N. svlvest-ris foram cortadas em pedaços de 1-1,5 g e colocados em placas de Petri num meio osmoticamente controlado K3M. K3M contem metade da concentração de maeroelementos K3 (portanto para 1 litro 75 mg de NaH^PO*,-450 mg de CaClg^HgO, 1250 mg de KNOg, 125 mg de NH^NOg, 67 mg de (NH^ígSO^, 125 rag de MgSO^.7H2O} e 84 g de manitol, pH 5,6; a osmolaridade foi ajustada a 500 mOsm. As folhas foram então cortadas em tiras finas e incubadas no mesmo meio osmoticamente controlado durante uma hora. As tiras de folhas foram então
escorridas e colocadas em 10 mg/placa de solução de digestão. A solução de digestão compreende 0,4¾ de macerosirna R10 (Serva) e 0,6¾ de celulisina (Calbiochem) em K3M (que compreende 75,6 g de manitol, de forma que a osmolaridade com as enzimas é novamente 500 mOsm). As placas de Petri foram fechadas com Farafilm e 122 - incubadas durante a noite no escuto a 28°C sem agitação. Para acelerar a digestão as tiras de folhas podem também ser infiltradas com vácuo com o dobro da concentração de enzima e depois incubadas durante 2 a 3 horas com agitação lenta (30-40 rpm).
Os protoplastos foram filtrados através de um filtro de 100 gm, o qual foi então lavado com metade do volume de sacarose 0,6M, A suspensão foi transferida para tubos de centrífuga de 15 ml, cobertos com uma camada de 2 ml de K3M e centrifugados durante 10 minutos a 1000 g. Os protoplastos foram removidos da interfase por sucção, diluidos com K3M e removidos por centrifugação durante 10 minutos a 700 g. Os protoplastosremovidos por centrifugação foram então ressuspensos em meio K3M.
Exemplo 21.2; Isolamento. de. -V.acúo.los (adaptado segundo Boudet e Alibert, 1387);
Os protoplastos foram ressuspensos num meio K3M (pH6,5) compreendendo 20% Ficoll. Transferiu-se 2,5 rnl para tubos de centrífuga e depois cobriu-se com camadas sucessivas das seguintes soluções; 2 ml de 15% Ficoll, 7 mg de DEAE-dext-rano (pH 6.5); 2 ml de 10% Ficoll, 3 mg de dextransulfato CpH 8,0); 2 ml de 6% Ficoll, 3 mg de dextransulfato (pH 8,0); e aproximadamente 4 ml de 0% Ficoll (pH 8,0) (totalmente cheios). Os tubos foram centrifugados num rotor de centrífuga (SW 41.14, Kontron) primeiro durante 15 minutos a 3500 rpm e depois durante 105 minutos a 40 000 rpm. Os vacôolos foram removidos da interfase de 0-6% Ficoll por sucção.
Os marcadores foram removidos de acordo com Boller e Kende (1979). Para medir a hexose-fosfato-isomerase, o dextransulfato deve ser primeiro precipitado com DEAE-dextrano antes da 123 medição ser possível. Uma determinação de proteína segundo Bradford não é possível pois ambas as polibases interferem com aquela determinação. Os resultados na Tabela 5 foram normalizados relativamente â enzima marcadora do vacúolo α-manosidase como 1@0%,
Uma comparação das actividades específicas de quitinase mostradas na Tabela 4 confirma os resultados da Tabela 2:
No caso das plantas M13.4 e Ull.4.2 transformadas com o plasraídeo pSCM13 ou pSCUll, respectivamente, encontra-se secreção da quitinase enquanto no caso das plantas M10.4 e U13.15 transformadas com o plasmídeo pSCH12 e pSCU13, a localização intracelular pode ser claramente demonstrada. As transferências Western-confirmam que a quitinase. endógena de N. sylvestris está presente no espaço intracelular e no caso dos protoplastos M13.4 é responsável pela maioria da actividade residual, É possível isolar protoplastos a partir das plantas NI®,7.4 e U13.15. A medição das várias marcas (Tabela 5) confirma a localização no vacúolo das quitinases portadoras de uma sequência C-terminal. Neste caso também, a transferência Western confirma esta localização. Δ quitinase endógena está igualmente situada no vacúolo.
As sementes de uma ou mais plantas autopolinizadas foram obtidas a partir de todas as séries. Foi possível demonstrar que a superprodução de quitinase e a sua localização é passada para as gerações subsequentes. »
I
pgposna
As estirpes que- se seguem foram depositadas na “American Type Oulture Collection" em Rockville, Maryland, USA de acordo com os requesitos do Tratado de Budapeste: j | | — 1 JPlasmideo | Data do Depósito j Número do Depósito | i I I EATCC3 j pBscueehi/quitinase] 29.12.1988 | 40528 Cabb,:pBSCucChtS) | | i 1 1 pBSGluc39.1 } 29.12.1988 1 [ 40526 1 PCIB1005B 1 13.03.1990 1 1 40770
í_i___i_____________J
HeiS-á mmm 1650 mg/1 ΚΚΟλ 1900 mg/1 CaCln. 2HnQ j't Λ*\ 440 mg/1 MgS04. 7R?0 370 mg/1 kh,?po4 170 mg/1 NajEDTA 37,3 mg/1 FeS04. 7HgO 27,8 mg/1 h3bo3 6,2 mg/1 MriSD4. 4H(?0 η o o Õ £-* 3 KJ mg/1 ZnSO-.7H^O 8,6 mg/1 Kl 0,83 mg/1 Ha?Mo04.2HgO 0,25 mg/1 CuS04.5H2cT 0,025 mg/1 CoClrj , 6H*jO Ci ώ 0,025 mg/1 sucrose 30,0 g/1 hidrocloreto de tiamina 0,400 mg/1 aioínosítol 100,0 mg/1 oinetina 0,3 mg/1 áeido «-naftilaeétioo 2,0 mg/1 vermelho de olorofenol 5,0 mg/1 agar 10,0 g/1
Meio B a mesma composiç com os seguintes oefotxim canamicina o do meio A mas sem o ácido α-naftilacético e constituintes adicionais; 500 mg/1 75 mg/1 a mesma composição do meio B mas sem cinetina feio MG/b para Agrobacterlaitt caldo L 501 meio de manitol-glutamato (Holsters et al. 1978) 50% feio K3M osmoticaroente controlado [500 mOsm; pH 5,83
NaHUPO,. E-f0 £ *k £ 75 ffig/1 OaCl^, 2E-,0 450 mg/1 KNO» 1250 mg/1 nh4no3 125 mg/1 Ç»H4)2S04 67 mg/1 MgS04T7H20 125 Mg/1 laauitol 84 g/1 128 128
SoIa^ajÍ^jaaiaLJSI·
NaCl 154 íbM CaCl^.SHgO 125 í»H KC1 " 5 m glucose 5 fflM PH 5,6-6,0
Solyggo ds..lay.ageiB J sucrose 154,0 g/i HES 0,59 g/1 KNO„ o 250,0 mg/1 NH«NO, Hb »5 25,0 mg/1 NaEjNOo iL* *3 15,0 rng/1 CaCL,. 2E-,0 é f £ .. 90,0 mg/1 MgS04. 7H20 25,0 mg/1 (HH4)2S04 13,4 mg/1
Tampão TiHF Tris-HCl (pH 8,0) EDTA 10Θ mM 10 mM NP-40 (Sigma Chem.) 1¾ (v/v)
Tris-borato 89 mH
ácido bórico 89 mH
SDTA 2 mM
Iãmma TE
Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM
SDTA 1 mH ssc
NaCl 1,54 mM
citrato de sódio 0,154 mH (PH 7,0) 130 -
XÃPfeii AS
Tabela 1: Actividade de quitinase após expressão transitória em protoplastos de Nicotiana plmahagln.ifo3.ia i-1-1 j Sobrenadante jProtoplastos | I-1-1-1 JFlasmideo jncat/mistura ± SD Jncat/mistura ± SD j - j 0,07 0,01 | 0,81 0,04 pGYl (0,10 0,00 | 0,81 0,02 PSCH 10 12,05 0,05 [2,95 0,08 PSCM3 [2,10 0,09 j 1,08 0,01 PSCM22 11.64 0,10 [2,59 0,4 PSCM23 12,65 0,34 12,64 0,14 PSGM24 i 1,55 0,3 [2,12 0,52 pSCO 1 | 0,70 0,02 [0,76 0,01 psco 3 j 0,38 0,02 [0,87 0,05 PSCU 6 10,87 0,09 10,92 0,04 i-1-1-i I 131 Λ
w a; ο Η • 2 Cd Ο 00 2 a! CC H 00 H 2 Ij Oj 2 ta o o *a! PQ •a! E-*
Cd oo a! 2 H H 2 Ph CL. Cd Q § n > H H O •a!
CVJ *a! 2 ta CQ a! H
S-. i-i % (0 1—1 ó 3 O rH CU <U c/5 O 0) (ti S-. Ctí -P C c •H *H -P •H o 3 Ό cr •rd 3 i—1 ΓΧ4 -tf1 '8 D O. o cd • o o m (2 o 4J « cti ro C tti V β to •H o p â c o -C !·< c <υ % in ICF 1 % 1 % H t—< t—< LO OO (S oo oo cs cs cn cS 'ti- j! vo cn m co oo oo t'- co 'ti· 'ti- CO O --ti· f inooh-»Hooov CS CS cS 'ti- vb Γ-~ oo Ov oo i »-< 'ti- cn cn cn υ c bo iο O OOCCfihti) VO VO Ov 1 LO I o CO O Tf t" VO Ov —i 'to-ti-voo cd õ rH cn —( cs «O CS —i vo cn cs r* o OLOOh-OOH c o n- r-' co cs ov 'ti· co t-ι O m Ov cs 1 cd υ <O ▼*“< t> t-h ov oó cb vd dti-plOti-ti· 1—( —( cs cs ψ-* "ti· cs VO cs oo oo 'ti-rr Ovwn cn ηΗΗΗ p p oo oo CS H 00 Ov Ov —1 t~~ VO CO CO —< CS >—1 ^ inwooHcs «n cn <-i oo -ti- i S d d dddddo cs cs cs r-ι d £ cn cn ( y—< CS *"H l> 00 CS CS OO VO T-t H, Tj· cn cn vo vo co t". O vo cn vb -ct ov bO •"ti· cn vo -ti- vo —. © ό Ov OO VO o cd co —< t-ι t-- co cs τ·Ή τ·"< vH t—4 i-H 'ti" Ov vo OO y~4 o c CS Ό rHionor^vo cn o\ cs -ti- B CS co l/~Í vo cb vo «n -ti- HrtOvOti cd 'ti·f- O vo —< cn CO rH r—< t—^ rH «nsoN cn cs cs cs o c i cd o Ov có vo vo cs cs vo tn cs cs" Ov cb cs" —<’ cs’ r-· cs cn tc vo (o cs cs cn cs cs CS vo Tf Ov oo Ov vb cn o —ϊ Ov ov cn vo cs —' —( —( c I B 4.00 1.87 O-iVDNVDn· cn vo cs o cs oo O O CS CS CS T-H LO OV Tt O 'tico co VO vo 'ti- tí O O d O 1 c (ti r-t(ti PL+P CIO Cll cn vo oo cs cn f*· —<—i —< cTcT cf ο" θ'o' τ—H τ—H t—H i—H r""( ssssss o cs_Tf_in vo^-( cn~ cn" cn'cn" cn' T-H i—H r-H r—H 1 o o CS CS CS CS CS CS cn cn cn cn cn Ή O o 1—Η h-H ^ η—H r—^ S CS CS gw Μ Μ Μ Μ Μ M KM μΡ μΡ μΡ MU (JL( Ϊ5 O uuuuuu uuuuu rH^ uu on on co co on oo co co co co 00 O., d, n. Oh Oh Oh Oh Oh Oh Qh Ph Oh Cu Qh 4 132
w a! O H Z ω o m z =í
CC H CG aj H Z C J Λ 2 ω ο CC Η ω S ΗΟ. ωα. 8
ω 0Q <! Ζ Μ Η Η ίο σ w Q
ω Q -¾ Q > Μ Η Ο «ai (Ο «a< «J (Τ' «a! Ε-< UU U μ-ί G 74% 71 % Ό Ό rj· Ό VO owoc^vot^ mmtvcfd· ÇO i-H r-H cd υ C 00*0 ts Ό O Ο <Ν Ο Ο; >ο m σ\ οό οό !> ’ Tt τ—1 OO «—1 Os CO CS d O vo ^ cs " oi U) I cd Ο C 11.2 4.9 207.4 122.4 63.63 56.41 23.0 17.01 6.82 12.0 8.19 ICF yH 1 cd υ S ο r—< Ον CO Ό Ό οο *0 ΓΟ οο οο νο Ch ΟΝ (Ν ' *4 CO τ—ί τ—( , 'd- Γ"- O c^j <n »n t-4 'vf ^ r-i d i—C I ε ΟΟ 00 CS s-t 0\ΜΟ τ-ι ’-η cn cs cS οοσ\θΝθη u C Ο OS τ—1 r“H -d" <Μ Ον Ον C-ΟΟ t~^ CO 4—1 νο " «d· c4 ’ τ-J «O .-a co «?}· u-> Γ^Γ^'Ονοη oi CO ΟΝ (N 1-3 00 < £ W Ο Ο S bfl 1 cd υ C 1 cd υ C CNJCO οο ό VO Os O O oo «-3 cs cs CJ\ o ΟηΌ *t «-J C; *—i O CO OÍ r—4 t—( 4.5 2.3 2.19 4.50 5.79 12.12 17.8 4.6 •67 .34 ο Β 1—< 1 Η 4.0 1.87 Mncn r-~ 00 CO co ts oo Os oo m oo O; 't OO 0\ T-i ÇCj r-< | plantas C10 C11 Ull.l U11.2 U11.3 UI 1.4 U11.5 U13.1 U13.2 U13.3 U13.5 U13.15 I g C2C οπ υϋ PC1B200 PC1B200 pSCUll pSCUll pSCUll pSCUll pSCUll CO CO CO CO CO r™< τ-< i—( τ—^ r-< DDDDD UUUUU co co co co c<o cu Qh õ* Õk cu 133
κ> -=¾ Ο Η s ωο κι S «a! CC Η C0 =¾ Ε-· S -=¾ J Οι li] Q Κ) Ο Η ΚΙ -=¾α.ο Η Ο Κα. S ΚΙ ΚΙ κι -=¾ S Η Ε- Η S α ω Q ω Q ã Η ί=- Η Ε-< U -=¾ -=¾ •J ω PQ =¾ Η ui jg LO tí .3 "" cl, ° 2 o. UJ & vo n d 52 --I i-l "'t 1—1 ι—1 t—H Protoplastos [spec. activ.] ncat/mg 173.7 19.2 0.11 48.0 [chitin.] ncat/ral «i C3 rt U") (N O 3 ^ á Γ—1 o P £j mg/ml 0.13 0.23 2.13 0.25 Homogenat o fspec. activ.] ncat/mg 157 153 4.25 32.5 [chitin.] ncat/ml o «f. ΓΊ ^ CD £> o xf OO v_l (S r—( «“*< P-^ 2 & mg/ml 0.98 1.19 2.40 0.75 Plant as M10.4 M13.4 UI 1.4.2 U13.15 (D (Λ 7Í £ pSCH12 pSCM13 pSCUll pSCU13 ο ρ (fr JO (ti -Ρ <υ Ό (D m •Η -Ρ γΗ 3 σ ι •Η •Ρ ΰ (0 ω οα, S-, ο ο -Η -Ρc «β (L) Ό >—I 3 οο ω •σ (0 ο> c ω m ω uα, π)c m <d •σ •rH •σ ωa ρ ο (η CQ (D •α (ti •α •Η -rí -Ρ ο (ti W (ti -Ρ κ> w (ti
Tabela 5: Localização das marcas intracelulares nas preparações de vacúolo de plantas super-produtoras de quitinase
Experiência 1. Localização da quitinase do tabaco sequência C-terminal (planta M10.7 com a sua .4) Marca Unidadesa/106 protoplastos Onidades/106 vacúolos % total em vacúolos a-manosidase 89 89 100% quitinase do tabaco 66300 75100 113% hexose-6-fosfato isomerase 2640 170 6% clorofila 27 <4,5 <17% Experiência 2. Localização da quitinase do pepíneiro com a sequência C-terminal da quitinase do tabaco (planta U13.15) Marca Unidadesa/10® protoplastos Unidades710® vacúolos % total em vacúolos a-manosidase 59 59 100% quitinase do pepíneiro 12000 12200 102% hexose-6-fosfato isomerase 490 90 18% clorofila 52 <2,25 <4% ^ pcat para enzimas, para clorofila J figuras normalizadas relativamente à a-manosidase 100%
Tabela 6: SEGREGAÇÃO DA RESISTÊNCIA A CAMMICINA HA PRIMEIRA GERAÇÃO SUBSEQUENTE DE PLANTAS TRANSGÊNICAS CRUZADAS ENTRE SI Cespera-se 3eanR:lcan) 1 j Flasmídeo 1_ ( JCélulas parentais 1- j CanR I -1 1 J CanS | 1 1 1 j pCIB200 |C2 1 I - -1 I 1 - 1 i | | C4 } | 39 i I ii 1 1 1 1 |pSCH12 JM10.3 1 i 27 1 1 1 12 1 1 JM10.7 | 36 1 14 1 1 i |M10.13 | 39 i 9 1 f 1 1 |pS0M13. 2 1 JM13.2 1 | 37 1 1 1 n 1 1 |M13.4 | 39 1 14 1 1 JM13.7 i " 1 - 1 i 1 |M13.10 | j 24 t 1 12 ! 1 I I jpSCUli 1 JU11.3 1 j 33 —j j 1 13 | | [U11.4 i is 1 99 i
Tabela 7: ANÁLISE DA PROGÉNIE DE PLANTAS TRANSGéNICAS (foram testadas apenas plantas canR)
Concentração em folhas homogenizadas
Plasmideo Planta parental Planta mg/ml ncat/ml ncat/ml pCIΒ20Θ C2 C2.1 C2.2 C2.3 2,77 rj r·. 2,®1 27,3 21,7 42,5 9,9 9,3 21,1 C4 C4.Í C4.2 C4.3 C4.4 2,88 2,82 2,15 2,66 8,3 9,6 6,1 7,2 2,9 3,4 2,3 2,7 pSCH12 Mi®.3 Ml®.3.1 Ml®.3.2 Ml®.3.3 Ml®.3.4 1,59 .1,82 2,69 1,8® 243.4 179.9 212.4 163.9 152,3 98,3 71,7 91,1 Mi®.7 Ml®.7 Ml®.7.3 'Ml®.7.4 1,92 1,72 2,23 196.5 148,2 112.5 102,1 86,3 5®, 5 Ml®.13 Ml®.13. Ml®.13.2 . [2,81 2,52 '283,6 èi7,ó 1®®, B áò,5 pSCM13 L_ M13.2 M13.2.1 ήΐ3«2»2 M13.2.3 M13.2.4 1,43 1 ,®3 2.15 1.15 3·—*®, 1 8,5’ 65,9 1, i 231,4 '8,2' 3®, 7 €*,9 M13.4 M13.4.1 M13.4.3 M13.4.5 MÍ-3.4,6 1,78 2,36 1,14 í ,64 332.7 357.8 11,0 324,7 186,7 124,9 9,7 198,6 M13.7 M13.7.3 2,6® 1259,3 99,9 MÍ3.1® 1 1 M13.1®.1 M13.10.2 M13.10.3 1,83 J235,1 2,89 153,1 2,53 5®4,9 123,6 52,9 199,3
Tabela 8: ANÁLISE DA PROGÉNIE DE PLANTAS TRANSGÉNICAS (foram testadas apenas plantas eanR)
Concentração em folhas horoogenizadas 1-1 |Plasmideo j i | 1 [Planta parental 1 1 |Planta T Jmg/ml I T [ncat/ml ! . 1-i j ncat/ml J I 1 I |pGIB200 ! l [ C2 1 |C2. 1 1 [2,77 i ? O { Lt i , O 1 1 i 9,9 | i 1 |C2.2 [2,23 | 21,7 I 9>S 1 1 I 1 1 JC2.3 1 [2.01 1 .... | 42,5 l | 21,1 | I 1 1 JFSC011 1 [011.3 1 JU11.3. 1 1 [2,52 1 [ 7,38 1 i | 2,93 j i 1 I [011.3.2 I [2,14 I [ 7,69 I ... 1 3,59 | I [U11.4 1 [011. 4.1 1 [1,87 T [ 35,58 1 I [19,05 j i i i 1 [011. 4. 2 | [1,81 [ 46,75 j 25,77 [ _1... I 1 1 j 011.5 1 [011.5. 1 1 Í2,30 [ 6,95 1 ! | 3,02 | 1 1_ 1 1 [011.5.2 _i_ [2,79 j_ | 13,88 1 j 4,98 [ J_1 â actividade de quitinase foi medida na presença de imunoglobul nas contra a quitinase do tabaco 138 tu U 1—1 £ •'d' LO LO Tf r- Cl LO f- fl) £ co LO Cl O Ft CS O Ol Ό % OO 00 O t» r-H cd O « tuo o cS ol lo a co —< Ol t~-~ \— ϊ> UÍ rH CO rH 1¾ ed <—i CO Tf o rH co α <υ ο tU 1 í o t"- t"~ LO Μ S LO LO O 00 S ω u > LO Ol CS o W a υ c CS 1“< r-C <d 1 ri o Tf LO >—< tH co 1—t CS LO CO E E-t a ;> o o o o a ε oo OL OO r-l CU 0J3 LO cs > co co s cd ω o s o K H 1x1 bXJ E Tt* "d- O Tf· co LO t"; Tf co a W s oo o H H cd Oí ω < o c o, £ ω O O O O O o Q rH L—< t-» LO o S o > ui rH CO rH ω co <l{ á cd o c ?—< rH H ffi· | r-( Ol CO oo E-» H Tf LO Ví H S) fc?> co i—1 rH rH a B § Ctí CS i cS s <S co Tf Tf ω jg HHH Q cu U rH rH r-H ã 1 H cd > cu H f-H α (d h a cd CO Tf Tf *=u C -p Tf rH rH rH Π) c U rH rH rH H 0) CU £. DDD O cr. «ti o O rH rH rH <u 5 o rH rH rH a ω ω · U 00 CS Q DDD c uuu <aj o u co co 00 H u CU Çii Cl, 35
Tabela 10: probo-
Actividade de B-l,3-glucanase madura marcada com S em plastos Nicotiana Plumbaglnifolia
i 1 |Extracto de i Meio de j | Plasmídeo 1 |protoplastos 1 incubação | 1 | 1 j moderado í vestígios | 1 |pGIB1005B I J forte j vestígios j |pCIB1005BZXVTP ! I |moderado j_ moderado [ _I 140 -
Allen G, "Sequencing of proteins and peptides", in: Laboratory Techniques in Biochemistrv and Molecular Biology, Vol 8, eds. TS Work and RH Bordon, Elsevier, North-Holland Biomedical Press, Amsterdam (1981).
An G et al, EMBO J., 4: 277-284 (1985).
Birk Y et al, Biochim, Biophvs. Acta, 67: 326-328 (1963). Bohlmann et al, EMBO J 7: 1559-1565 (1988)
Boller et al, Planta, 157: 22-31 (1983).
Boller T and Wiemken A, Ann Rev Plant Phvsiol, 37: 137-164 (1986)
Boller T and Kende H, Plant. Phvsiol. 63; 1123-1132 (1979) Boudet AM and Alibert G, Meth. Enzymol. 148: 74-81 (1987) Cashmore A, Genetlc Enqineerinq of Plants, an Aqricultural Perspective, Plenum, New York 1983, pages 29-38.
Devereux et al, Nucl. Acids Res., 12: 387-395 (1984).
Erlich et al, PCR Technology Principies and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, New York (1989)
Eichholz R et al, Planta, 158: 410-415 (1983) .
Facciotti and Pilet, Plant Science Letters, 15: 1-7 (1979) . Felix G and Meins FJr, Planta, 164: 423-428 (1985) .
Frank G et al, Cell, 21: 285-294 (1980).
Gardner RC et al, Nucl, Acids Res., 9: 2871-2888 (1981) . Garfinkel and Nester, J. Bact., 144: 732-743 (1980).
Glover DM, DNA cloning, volume 1; a practical approach; DM Glovered., IRL Press, Oxford and Washington DC, p. 33 (198)
Goodall G et al, Methods in Enzvmoloqy, 181; 148-161 (1990) GrimsleyNH et al, Nature, 325: 177-179 (1987) .
Gubler U and Hoffman BJ, Gene, 25: 263 (1983).
Haymes BT et al, Nucleic Acid Hybridisation a Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1985).
Hilder et al,. Nature, 330: 160-163 (1987) .
Hoekema et al, Nature, 303: 179-180 (1983) .
Hohn T et al, in: "Molecular Biology of Plant Tumors",
Academic Press, New York, pp. 549-560 (1982) . 141 -
Horn et al, Plant Cell Reports, 7:469-472 (1988).
Horsch et al, Science, 227: 1229 (1985) .
Howard et al, Planta, 170: 535 (1987).
Innis et al, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., New York, 1990 Lagrimini LM et al, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 84: 7542, (1987).
Laurell andMcKay, Methods Enzymolocrv, 73: 339-361 (1981) .
Lathe R et al, J. Mol. Bio., 183: 1-12 (1985) .
Linsmeier and Skoog, Physiol. Plant., 18: 101-127 (1965). Maniatis et al, Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
Matsuoka K and Nakamura K, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 834-838 (1991)
Maxam and Gilbert, 'Sequencinq end-labelled DNA with base-specific Chemical cleavaqe/, in: Methods in Enzvmoloqy 65: 499-560, Academic Press, New York, London, (1980) .
Meins & Lut2, Differentiation, 15: 1-6 (1979). Métraux JP et al, Physiol Mol Plant Pathol, 33: 1-9 (1988). Mohnen, "Regulation of Glucanohydrolases in Nicotiana tabacum on the messenger RNA levei", Dissertation University of Illinois at Urbana-Champaign, 1985.
Mohnen et al, EMBO J., 4: 1631-1635 (1985).
Morelli et al, Nature, 315: 200 (1985) .
Muiler JP et al, Physiol. Plant. 57: 35-41 (1983)
Murashige and Skoog, Physiol. Plant., 15: 473-497 (1962) . Negrutiu I et al, Plant Mol. Biol., 8: 363-373 (1987) .
Neuhaus et al, Theor. Appl. Genet., 74; 30-36 (1987) .
Parent and Asselin, Can J Bot, Vol 62: 564-569 (1984). Paszkowski J et al, EMBO J, 3: 2717 (1984).
Petit et al, Mol. Gen. Genet., 202: 388 (1986).
Pietrzak et al, Nucl. Acids Res., 14: 5857-5868 (1986). Potrykus I and Shillito RD, Methods in Enzymology. Vol 118, Plant Molecular Biology, eds. A and HWeissbach, Academic Press, Orlando, 1986.
Rhodes et al, Biotechnology, 6: 56-60 (1988) . 142
Rogers SG et al, Methods in Enzymology, 118: 630-633 (1986). Rothstein SJ et al, Gene, 53: 153-161 (1987).
Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (1989)
Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 74: 5463-5467 (1977).
Schmidhauser and Helinski, J. Bacteriol., 164: 446-455 (1985).
Schocher RJ et al, Bio/Technology, 4: 1093-1096 (1986).
Selsted et al,Infection and Immunitv, 55: 2281-2286 (1987) Shillito et al, Bio Technology, 3: 1099-1103 (1985).
Shillito RD and Potrykus I, In: Methods in Enzymology, eds. Wu R and Grossman L, Academic Press, Orlando, Florida, Vol. 153: 313-306 (1987).
Shillito RD et al, Biotechnology, 7: 581-587 (1989).
Shinshi et al, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 84: 89-93 (1987). Shinshi et al, Planta, 164: 423-428 (1985) .
Shinshi et al, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 85: 5541-5545 (1988) .
Simpson RJ and Nice, Biochem Intl, 8: 787 (1984).
Southern EM, J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975).
Spena et al, EMBO J., 4: 2736 (1985) .
Tague BW and Chrispeels MV, J Cell Biol, 105: 1971-197 9 (1987).
Terry et al, J. Biol. Chem. 263: 5745-5751 (1988)
Vierra and Messing, Gene, 19: 259-268 (1982) .
Wang Y-C et al, Plant Mol. Biol., 11: 433-439 (1988) .
Wang et al, Proc. Nattl. Acad. Sei. USA, 86: 9717-9721 (1989) Yamada Y et al, Plant Cell Rep, 5:85-88 (1986) . Yanisch-Perron et al, Gene, 33: 103-119 (1985). WO 89/1 1291 EP-A 0,332,104 WO 86/0 4356 EP-A 0,392,225 WO 88/0 5826 WO 89/0 4371 US-P 4,810,777
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleotidos com correspondente peptídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 39 pares de bases TIPO DE MOLÉCULA: sequência de DNA hipotética produzida com bas na degeneração do código genético. PROPRIEDADES: codifica uns peptídeo sinal responsável pela locali saçao no vacuolo das moléculas de proteína que lhe estão associa das. GGN7AGR TCN/AGW TTY GGN ΔΑΥ GGN CTN/TTR TTR/CTN GTN Arg Ser Fen Gli Ãsn Gli Leu Leu Vai GAY ACN ATG TAA Asp Tre Met Fim SEQ ID NO: 2 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente peptídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 39 P-sres de bases TIPO DE MOLÉCULA: cDNA derivado ORGANISMO FONTE ORIGINAL: HjLgo-friara. fa&assan FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE: pCHN48 PROPRIEDADES: codifica o peptideo sinal responsável pela locali-saoão no vacúolo dã proteína que lhe está associada. AGG TCT TTT GGA AÂT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Arg Ser Fen Gli Asn Gli Leu Leu Yal Asp Tre Met Fim SEQ ID NO: 3 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente peptideo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 39 pares de bases TIPO DE MOLÉCULA: cDNA derivado de mRNA (mutagenisado por meio de mutagénese mediada por oligonucleôtidos) ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Nicotiana tabacua FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE: pCHN48 PROPRIEDADES: codifica o peptideo sinal responsável pela locali-sacão no vacúolo da proteína que lhe está associada. AGG TCT TTT GGA ΔΔΑ GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Arg Ser fen Gli Lis Asp Leu Leu Yal Asp Tre Met Fim SEQ ID NO: 4 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente peptideo COMPRIMENTO Dá SEQUÊNCIA: 39 pares de bases t
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA derivado de rnRNA Cmutageniaado por meio de routagénese mediada por oligonucleótidos) ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Nicotiana tabacum FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE: pCHN48 PROPRIEDADES: codifica o peptídeo sinal responsável pela locali-saoão no vacúolo da proteína que lhe está associada. AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Arg Ser Fen Gli Asn Gli Leu Leu Vai Asp Tre Met Fim 3EQ ID NO: 5 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos coro correspondente peptídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 39 pares de bases TIPO DE MOLÉCULA: cDNA derivado de rnRNA (mutageniaado por meio de mutagénese mediada por oligonucleótidos) ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Nicotiana tabacuia FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE: pCHN48 PROPRIEDADES: codifica o peptídeo sinal responsável pela locali-saçlo no vacúolo da proteína que lhe está associada. AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC CGT ACT ATG TAA Arg Ser Fen Gli Asn Gli Leu Leu Vai Arg Tre Met Fim 146
SEQ ID HO: 6 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nueleôtidos coi» correspondente peptídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 40 pares de bases TIPO DE MOLÉCULA: cBNA derivado de mRNA (mutagenizado por meio de mutagênese mediada por oligonucleótidos) ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Nicotiana tabaeum FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLQNE: pCHN48 PROPRIEDADES: codifica o peptideo sinal responsável pela locali-saoão no vacúolo da proteína que lhe está associada. A/T GAT CTT TTG GGA AAT GGA CTT TTA GTC CGT ÃCT ATG TAA Asp Leu Leu Gli Asn Gli Leu Leu Vai Arg Tre Met Fia SEQ ID NO: 7 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nueleôtidos com correspondente peptídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 30 pares de bases TIPO DE MOLÉCULA: cDNA derivado de mRNA (mutagenizado por meio de mutagênese mediada por oligonucleótidos) ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Nicotiana tabacum/penineiro FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE: pCHN48 PBOPBIEDADES: codifica o peptídeo sinal responsável pela locall-aação no vacúolo da proteína que lhe está associada. ATG GGT GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Ile Gli Asp Leu Leu Vai Arg Tre Met fiffl SEG ID NO: 8 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente peptídeo CGMFRIMENTQ DA SEQUÊNCIA: 21 pares de bases TIPO DE MOLÉCULA: cDNA derivado de raRNA [fragmento da sequência apresentada em SEQ ID 2] ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Nlcotlana tabacum FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE: PCHN48 PROPRIEDADES: codifica o peptídeo sinal responsável pela loeali-8aação no vacúolo da proteína que lhe está associada. CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Leu Leu Vai Arg Tre Met Fia SEQ ID NO: 9 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente peptídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 24 pares de bases TIPO DE MOLÉCULA; cDNA derivado de mlNA [fragmento da sequência apresentada em SEQ ID 23 ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Nicotiana tabacum FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE: pCHN48 PROPRIEDADES: codifica o peptídeo sinal responsável pela locali-aação no vaeúolo da proteína que lhe está associada. GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAâ Gli Leu Leu Vai Arg Tre Met Fim SEQ ID NO: 18 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente peptídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 3850 pares de bases TIPO DE CADEIA: dupla
TOPOLOGIA: LINEAR TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Nicotiana tabacum L.cv. Havana 425
FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE CELULAR: 1CHN17 LI fago] PROPRIEDADES: gene da quitinase básica GAATTCAATC AAAATGTGTT TTGTATATAG GGTGTCAACT ACTAATATAT 50 TGTTATTTTC TAAAGACATA CATGTATACA TGTAAAATTT ACCGAACTTT 100 ACGGATGTCG ATAACCCCTC TCGATATAGC ATAGGTCCGC CTCTGATTTA 150 CGAAGGGACA CGAGGAAATT CCTCTATGTA ATTAGTTTTA GCAGTTACAC 200 GTTAAAGTAT AAATACATAT TACTTTACCA TAGTTAAGAC CAAACATGTG 250 TATGATTGAC ATACATCTTG CATTCATTAA TTAATTTGAT TTGATGCGAT 300 TAAATTTTTT AAGGATAGAG TTTTTAGTCC AAGTTGAGCT AGTGTAACTC 350 TTATAGTCAA TTGGACTCTC TATTACTAGA TACTATATCA GTTCAAAAGA 400 CACCAATATT GTATTTTAAC AGAAGGAGGC AAATAAGAAA TTGCAAATTC 450 TCAATTCTTT TTAATTATAT CTAATGAACC AAAAGGAGGA AGAGGAGCTA 500 CATATTGGAT TTATAAATAT AAAGCTAGCT GAGGCTCAAA TAATTGTGGA 550
TGCAATACAA GCAATTTACT TAAAACACGA AACAGAAGAG GÁTTTCGGTC AAATATCGAC ACCTAAGTTT TGAAATACAT TACTGAACAA ATTATGAGAT CATAGACTAG TAATTTAGGA TATTATTCTG TGATTGACTT GATTTTGCAC ATGAAGAAAC GTGAACGGCT TTCTTTTTAG GGCTGCCGTA GAATTGATCA AAACATATCT CAACATATTA AAATAGGGTC TCAACTAAAC CGGATTCATG CGGAATGAGA CCCATTTAAA AGGAGCAGTG GTTCCTATTC AAAGAATTAG ATACATTTCT ACATATTTTT AATTATGAAA ATTACTCCTA TACTAATTTG TGTGGTTTTA ATCGAATATG TAAATTTTAT TTGAAAATAA AATAAAAAAT CACAGTCCAA CTTTAATCAT AACACTCAAA TTAAATTCAG CTATCTTTCT AGGACATAGG AAACATTATC AGTGGAAATA TTATATTATA TCCATAAGAC TTTAGCAAAT CCTATAAGAA GTCTAAACAT GTAATTGACT ACTTTTAGAA GACGCACTTA TCTAACCCAA GAAACACCTG GCGTAACTCG AATTTGCTTT TGCCAAAACC AAAAGTCTAG GAATTAAGCT CCAAATTAAA GACATAGATT TTGGCTTACT TTTTTTCAAA AAAAAAATAA AATTAAAAAT TAAAATATTT TTTGTTCATG TAATTTAATC AGTTTTTGGG TGAAATTTTT TCTTCCACAC ACAAGATTTT AACTTTTTTC CAAATAAAAT ACACGTCGAA ACATAAATTC AAATTTCAGA ACTATTTTTC AACGTAATTT TAAAATTTTT ATTTTCTAGT TTTAACTAAA TCTATGTCCT GATTAAGTCT CCAGTCTTAA CTCTTAAAGT ATTGAAAATA CATGTTCGAG AATTGTCTGG GATGAAGCTA AGAGCCGCCA CTAAGAAAAA AAATCTAAAA ATATATAAAA AGGTAAGAGC CGCCACATAA TATATGTAAC CTGTCGGCGT AATCTACTGA ATTAATTTTC TGGATAAGAA AGATATGACT GAGCTCCGGT TTGCTCATAG ATTTTGACTT TACTTTTTTA ATTTCTTTTT GAAAATATTG TTTGTTTAAT AAAATATGAT CATGTTTTAG AAAAACAAAT TTCAAAAAAC TTCAAGTTCC CAAAAGTTGT ATGTCCAAAC ACAACTTTCA AAAATTATTT TTTAAAACAA CTTTAAAAAC TTTTTTTTTA AATTTTAATT AAATCTATGT CCAAACTAGC CGAAATTCGA GCCTTGGTTA TTCAACCAAT TGATTTGGTC AGAAAGTCAG TCCTCTCAAC AACTAAAATA GACATTAATT AAGCCATGTC TCCAGCATCT TCCTTAGCAA TAAATACCTT GCATTTCACC AGTTTACTAC TACATTAAA ATG AGG CTT TGT AAA TTC
Met Arg Leu Cys Lys Phe
ACA GCT CTC TCT TCT CTA CTA TTT TCT CTC CTA CTG CTT TCT
Thr Ala Leu Ser Ser Leu Leu Phe Ser Leu Leu Leu Leu Ser
GCC TCG GCA GAA CAA TGT GGT TCC CAG GCC GGA GGT GCG CGT
Ala Ser Ala Glu Gin Cys Gly Ser Gin Ala Gly Gly Ala Arg 150 - TGT o o o TCG GGT CTC TGC TGC AGC AAA TTT GGT TGG TGT GGT 2123 Cys Pro Ser Gly Leu Cys Cys Ser Lys Phe Gly Trp Cys Gly AAC ACC AAT GAC TAC TGT GGC CCT GGC AAT TGC CAG AGC CAG 2165 Asn Thr Asn Asp Tyr Cys Gly Pro Gly Asn Cys Gin Ser Gin TGC CCT GGT GGT CCC ACA CCT ACA CCC CCC ACC CCA CCC GGT 2207 Cys Pro Gly Gly Pro Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro Pro Gly GGT GGG GAC CTC GGC AGT ATC ATC TCA AGT TCC ATG TTT GAT 2249 Gly Gly Asp Leu Gly Ser Ile Ile Ser Ser Ser Met Phe Asp CAG ATG CTT AAG CAT CGC AAC GAT AAT GCA TGC CAA GGA AAG 2291 Gin Met Leu Lys His Arg Asn Asp Asn Ala Cys Gin Gly Lys GGA TTC TAC AGT· TAC AAT GCC TTT ATC AAT GCT GCT CGG TCT 2333 Gly Phe Tyr Ser Tyr Asn Ala Phe Ile Asn Ala Ala Arg Ser TTT CCT GGC TTT GGT ACC AGT GGC GAT ACC ACT GCC CGT AAA 2375 Phe Pro Gly Phe Gly Thr Ser Gly Asp Thr Thr Ala Arg Lys AGA GAA ATC GCG GCT TTC TTT GCT CAA ACC TCC CAT GAA ACT 2417 Arg Glu Ile Ala Ala Phe Phe Ala Gin Thr Ser His Glu Thr ACT GGT AAGTCTAGTT ACGTTGAACT ATATGATCGT CTTATTCAAA 24 63
Thr Gly AGTTTAATCA ATTAGAGAGA TCATACTTTT ATTTAATCAT ACTGGTCTAT 2513 TCTGATTTCA TGAGACAAAC ACATAGAACT TCCTTTTAAA ATGATTGCGC 2563 TGAGACTTGA ATTCAGGACC TCTATCTGCT CATCACTGGA GTATCCAATT 2613 TTGAGATATC ACAATGCTTC TTAAATTTCG AAGTTTTTTA TAAGCTGACG 2663 CGTTCAATAA TTGACCATGT AACCGTTGAC AGGA GGA TGG GCA ACA 2709
Gly Trp Ala Thr GCA CCA GAT GGT CCA TAT GCA TGG GGT TAT TGC TGG CTT AGA 2751 151
Ala Pro Asp Gly Pro Tyr Ala Trp Gly Tyr Cys Trp Leu Arg GAA CAA GGT AGC CCC GGC GAC TAC TGT ACC CCA AGT GGT CAG 2793 Glu Gin Gly Ser Pro Gly Asp Tyr Cys Thr Pro Ser Gly Gin TGG CCT TGT GCT CCT GGT CGA AAA TAT TTC GGA CGA GGC CCC 2835 Trp Pro Cys Ala Pro Gly Arg Lys Tyr Phe Gly Arg Gly Pro ATC CAA ATT TCA CAG TAAGTTCCTT CTTACCCACA CGGAGTGTTT 2880 Ile Gin Ile Ser His ACACCAAAGT CGTGGGACGG AATGCTTACT ACCTACTATA TATTTCATTG 2930 TGAGAGTAGG TACACAATAT CATGATATTT CTATGATTAT AAGAGTATGT 2980 GATTAATTTC TATGAGAAGT GTAAAGTTAA ATAGTTTCCA CAACACAAAA 3030 AAAATGTCAT TTTTTTAACA GATTAAAAAA GAAAAAGTAT ATGATGAACT 3080 TGTAGGATCT AATTAAGTGT ATTTTGACAT AAATACAGC AAC TAT AAC 3128 Asn Tyr Asn TAC GGG CCT TGT GGA AGA GCC ATA GGA GTG GAC CTG CTA AAC 3170 Tyr Gly Pro Cys Gly Arg Ala Ile Gly Vai Asp Leu Leu Asn AAT CCT GAT TTA GTG GCC ACA GAT CCA GTC ATC TCA TTT AAG 3212 Asn Pro Asp Leu Vai Ala Thr Asp Pro Vai ile Ser Phe Lys TCA GCT CTC TGG TTC TGG ATG ACT CCT CAA TCA CCA AAA CCT 3254 Ser Ala Leu Trp Phe Trp Met Thr Pro Gin Ser Pro Lys Pro TCT TGC CAC GAT GTC ATC ATC GGA AGA TGG CAG CCA TCA GCT 3296 Ser Cys His Asp Vai Ile Ile Gly Arg Trp Gin Pro Ser Ala GGT GAT CGC GCA GCC AAT CGC CTC CCT GGA TTT GGC GTC ATC 3338 Gly Asp Arg Ala Ala Asn Arg Leu Pro Gly Phe Gly Vai Ile ACA AAC ATC ATC AAT GGT GGC TTG GAA TGT GGT CGT GGC ACT 3380 Thr Asn Ile Ile Asn Gly Gly Leu Glu Cys Gly Arg Gly Thr 152
GAC TCA AGG GTC CAG GAT CGC ATT GGG TTT TAC AGG AGG TAT 3422 Asp Ser Arg Vai Gin Asp Arg Ile Gly Phe Tyr Arg Arg Tyr TGC AGT ATT CTT GGA GTT AGT CCT GGT GAC AAT CTG GAT TGC 3464 Cys Ser Ile Leu Gly Vai Ser Pro Gly Asp Asn Leu Asp Cys GGC AAC CAG AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT 3506 Gly Asn Gin Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Vai Asp Thr ATG TAATTTCATG ATCTGTTTTG TTGTATTCCC TTGCAATGCA 3549
Met GGGCCTAGGG CTATGAATAA AGTTAATGTG TGAATGTGAA TGTGTGATTG 3599 TGACCTGAAG GGATCACGAC TATAATCGTT TATAATAAAC AAAGACTTTG 3649 TCCCAATATA TGTGTTAATG AGCATTACTG TAGTTGGTTT AATTCGGCAC 3699 CAGATAAATA GATAACCACC CGCACTATTA TATTTCATTA TTTAGAAAAC 3749 CGAGATCTTT ATTTGAGTGA ATGAAAATCT TCCTAACCAG ATAGTCATAC 3799 TAATCAGTCA AAAAAAAATC TAACCTCAAA ATTTAAGCAT CCGAGCTGCAG 3850 153 SIQ ID NO: 11 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 1103 pares de bases
TIPO DE CADEIA: dupla TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Folhas de pepineiro infectadas com TNV
FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE CELULAR: pBSCucChtS CATCC 405283 PROPRIEDADES: gene da quitinase ácida AAAGAAAGCT CTTTAAGCAA TGGCTGCCCA CAAAATAACT ACAACCCTTT 50 CCATCTTCTT CCTCCTTTCC TCTATTTTCC GCTCTTCCGA CGCGGCTGGA 100 ATCGCCATCT ATTGGGGTCA AAACGGCAAC GAGGGCTCTC TTGCATCCAC 150 CTGCGCAACT GGAAACTACG AGTTCGTCAA CATAGCATTT CTCTCATCCT 200 TTGGCAGCGG TCAAGCTCCA GTTCTCAACC TTGCTGGTCA CTGCAACCCT 250 GACAACAACG GTTGCGCTTT TTTGAGCGAC GAAATAAACT CTTGCAAAAG 300 TCAAAATGTC AAGGTCCTCC TCTCTATCGG TGGTGGCGCG GGGAGTTATT 350 CACTCTCCTC CGCCGACGAT GCGAAACAAG TCGCAAACTT CATTTGGAAC 400 AGCTACCTTG GCGGGCAGTC GGATTCCAGG CCACTTGGCG CTGCGGTTTT 450 GGATGGCGTT GATTTCGATA TCGAGTCTGG CTCGGGCCAG TTCTGGGACG 500 TACTAGCTCA GGAGCTAAAG AATTTTGGAC AAGTCATTTT ATCTGCCGCG 550 CCGCAGTGTC CAATACCAGA CGCTCACCTA GACGCCGCGA TCAAAACTGG 600 ACTGTTCGAT TCCGTTTGGG TTCAATTCTA CAACAACCCG CCATGCATGT 650 TTGCAGATAA CGCGGACAAT CTCCTGAGTT CATGGAATCA GTGGACGGCG 700 TTTCCGACAT CGAAGCTTTA CATGGGATTG CCAGCGGCAC GGGAGGCAGC 750 GCCGAGCGGG GGATTTATTC CGGCGGATGT GCTTATTTCT CAAGTTCTTC 800 CAACCATTAA AGCTTCTTCC AACTATGGAG GAGTGATGTT ATGGAGTAAG 850 154 GCGTTTGACA ATGGCTACAG CGATTCCATT AAAGGCAGCA TCGGCTGAAG 900 GAAGCTCCTA AGTTTAATTT TAATTAAAGC TATGAATAAA CTCCAAAGTA 950 TTATAATAAT TAAAAAGTGA GACTTCATCT TCTCCATTTA GTCTCATATT 1000 AAATTAGTGT GATGCAATAA TTAATATCCT TTTTTTCATT ACTATACTAC 1050 CAATGTTTTA GAATTGAAAA GTTGATGTCA ATAAAAACAT TCCAAGTTTA 1100 TTT 1103 SEG ID NO: 12 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente peptídeo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 69 pares de bases
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA derivado de mRNA ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Micotiana tabaema
FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA NOME DO CLONE: pBS-Gluc39.1 EATCC 40526; descrito em EP-A 0,332,1043 PROPRIEDADES: codifica o peptídeo sinal responsável pela loeali-saçao no vacôolo da proteína que lhe está associada PROPRIEDADES: codifica o peptídeo sinal responsável pela loeali-sação no vacôolo da proteína que lhe está associada. GTG TCT GGT GGA GTT TGG GAC AGT TCA GTT GAA ACT ΑΔΤ GCT ACT ¥al Ser Gli Gli Yal Trp Asp Ser Ser Vai Glu Tre Âsn Ala Tre
155 J GCT TCT CTC GTA AGT GAG ATG TGÃ Ala Ser Leu Vai Ser Glu Met Fiis

Claims (2)

  1. RF.TVTNDICACOES lâ. - Processo para a preparação de uma sequência de DNA que codifica um fragmento peptídico pequeno que é responsável pelo direccionamento ["targeting"] de qualquer produto de um gene pretendido associado, especificamente para o vacúolo vegetal, caracterisado por se isolar uma extensão C-terminal de uma sequência de DNA codificadora de uma molécula de proteína presente naturalmente no vacúolo, com o auxílio de um processo conhecido, a partir da região terminal 3' do gene estrutural correspondente e por eventualmente se modificar esta, sem no entanto se alterarem as propriedades do direccionamento ["targeting"], 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carácter is ado por se preparar uma sequência de DNA que é obtida a partir da região terminal 3' de um gene codificador de uma molécula de proteína presente naturalmente no vacúolo e que codifica um fragmento peptídico C-terminal curto [extensão C-terminal] que é responsável pelo direccionamento ["targeting”] do produto do gene associado especificamente para o vacúolo vegetal. 3a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracter ia ado por se preparar uma sequência de DNA que é obtida a partir da região terminal 3' de um gene de quítinase vegetal e codifica um pequeno fragmento peptídico C-terminal [extensão C-terminal] que é responsável pelo direccionamento ["targeting"3 do produto do gene associado especificamente para o vacúolo vegetal. 4â, - teriaado por se Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-preparar uma sequência de DNA que é obtida a > τ 157 -
    partir da região terminal 3' de um gene de glucan&se vegetal e codifica um pequeno fragmento peptídico C-terminal [extensão C-terminal] que é responsável pelo direceionamento ["targeting"1 do produto do gene associado especificamente para o vacúolo vegetal. 5â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-teriaado por se preparar uma sequência de PM que codifica um fragmento peptídico pequeno que é responsável pelo direceionamento [“targeting"] do produto do gene associado especificamente para o vacúolo e tem a sequência de nucleótidos geral que se segue, a qual está apresentada em SEQ ID NO:1: CG8/AGE TGN/AGW TTY GGN ΔΑΥ GGH CTN/TTR TTR/CTH GTE GAY ACN ATG TAá em que 8 é A ou G ou C ou T/0; 8 é S ou A; W é A ou T/0; e Y é T/0 ou C ou um seu mutante ou variante que codifica um fragmento peptídico que ainda possui as propriedades de direceionamento típicas do fragmento peptídico original. gã. - Processo de acordo com a reivindicação 3, carácter ia a.do por se preparar uma sequência de DM que está numa forma substancialmente pura e que é obtida a partir da região terminal 3* de um gene de quitinase básica de plantas Nicotiana tabacum L. o,v Havana 425 e tem essencialmente a sequência de nucleótidos que- se segue, a qual está apresentada em SEQ ID NQ:2; 158 3'- AGG TCT TTT GGA MT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TM -5* ou um seu mutante ou variante que codifica um fragmento peptídico que ainda tem as propriedades de direccionamento típicas do fragmento peptídico original. 7â, - Processo de acordo cora a reivindicação 4, carac-terisado por se preparar uma sequência de DNA que está numa forma substancialmente pura e que é obtida a partir da região terminal 3* de um gene de glucanase básica de plantas Nicotiana tabacum L. c.v Havana 425 e tem essencialmente a sequência de nucleótidos que se segue, a qual está apresentada em SEQ ID NO:12: GTC TCT GGT GGA GTT TGG GAG AGT TCâ GTT GAA ACT AAT GGT ACT GCT TCT CTC GTA AGT GAG ATG TGA ou um seu mutante ou variante que codifica um fragmento peptídico que ainda tem as propriedades direccionantes típicas do fragmento peptídico original. 5â. - Processo para a preparação de um fragmento peptídico que é responsável pelo direccionamento ["targeting"] de qualquer molécula de proteína pretendida associada especificamen-te para o vacúolo vegetal e que ê codificado por uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterisado por se isolar o referido fragmento peptídico da secção C-terminal de uma molécula de proteína presente naturalmente no vacúolo ou por se sintetizar quimicamente o referido fragmento peptídico. 8â. - Processo de acordo coro a reivindicação 8, caracterisado por se preparar um fragmento peptídico que é responsável pelo direccionamento ["targeting"] de qualquer molécula proteica Pretendida associada especificamente ao vacúolo vegetal e que é 159 -\ obtida a partir da extensão C-terminal de uma molécula de proteína naturalmente presente no vacúolo. Ιβδ, - Processo de acordo com a reivindicação 9, earacterizado por se preparar um fragmento peptídico que é obtido a partir da extensão C-terminal de uma quitinase vegetal. llã. - Processo de acordo com a reivindicação 9, earacterizado por se preparar um fragmento peptídico que é obtido a partir da extensão C-terminal de uma glucanase vegetal. 12â. - Processo de acordo com a reivindicação 10, earacterizado por se preparar um fragmento peptídico que actua como sinal de direccionamento para o vacúolo vegetal e que tem a sequência de aminoácidos que se segue, a qual está apresentada em SEQ ID NO: 1 e 2: Arg Ser Fen Gli Asn Gli Leu Leu Vai Asp Tre Met ou um seu mutante ou variante que ainda possui as propriedades de direccionamento típicas do peptídeo original. 13Sl, - Processo de acordo cora a reivindicação 11, earacterizado por se preparar um fragmento peptídico que actua como sinal de direccionamento para o vacúolo vegetal e que tem a sequência de aminoácidos que se segue, a qual está apresentada em SEQ ID NO:12; Yal Ser Gli Gli Vai Trp Asp Ser Ser Vai Glu Tre Asn Ala Tre Ala Ser Leu Vai Ser Glu Met ou um seu mutante ou variante, que ainda possui as propriedades de direccionamento típicas do fragmento original. 160 - 143l. - Processo para a preparação de uma sequência de DNA que é substancialmente homóloga da sequência de DNA apresentada em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e que ainda tem as propriedades daquela sequência que são essenciais para o invento, ou seja que codifica um peptideo C-terminal que actua como sinal de direccionamento para o vacúolo vegetal, caracteriaado por se obter a referida sequência com o auxílio de um processo de mutação através das sequências de partida. 15&. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteriaado por se preparar uma sequência de DNA que é uma variante ou rnutante natural da sequência de DNA apresentada em qualquer uma das reivindicações 1 a 7. 16&, - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteriaado por se preparar uma sequência de DNA produaida por meios de métodos de mutação conhecidos conhecidos per se. 17â. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracteriaado por se preparar urna sequência de DNA em que o referido método de mutação é mutagénese mediada por oligonucleo-tideos. 18S. - Processo de acordo com a reivindicação 17, oaracterisado por se preparar uma sequência de DNA que tem uma ou raais sequências de nueleótidos mostradas em SEQ ID NO: 3 a 7: Ca) AGG TCT TTT GGA AAA GAT CTT ΤΤΔ GTG GAT ACT ATG ΤΔΑ Cb> AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC AAT ACT ATG ΤΔΑ (c) AGG TCT TTT GGA MT GGA CTT TTA GTC CGT ACT ATG TAA (d) A/T GAT CTT TTG GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA Ce) ATC GGT GAT CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA t
    19â, - Processo para a preparação de um fragmento peptídico modificado que é codificado por uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18 e que ainda possui as mesmas propriedades de direccionamento do fragmento peptídico não modificado localizado na região terminal C de poléculas de proteína presentes naturalmente no vácuolo, caracte-risado por se isolar o referido fragmento peptídico da secção C-terminal de uma molécula de proteína presente naturalmente no vacúolo ou por se sintetizar quimicamente o referido fragmento peptídico. 28ã„ - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterisado por se preparar um fragmento peptídico modificado que, em associação com uma molécula de proteína actua como o sinal de direccionamento para o vacáolo vegetal e que tem uma das sequências de aminoácidos apresentados em SEQ ID ϋΟ: 3 a 7: (a) (b) Cc) Cd) Ce) Arg Ser Fen Gli Lis Asp Leu Leu Vai Asp Tre Met Fim Arg Ser Fen Gli Asn Gli Leu Leu Vai Asn Tre Met Fim Arg Ser Fen Gli Asn Gli Leu Leu Vai Arg Tre Met Fim Asp Leu Leu Gli Asn Gli Leu Leu Vai Asp Tre Met Fim Ile Gli Asp Leu Leu Vai Asp Tre Met Fim 21â. - Processo para a preparação de um fragmento ou sequência parcial que é obtida a partir de uma sequência de DM ou a partir de um derivado de uma sequência de DNA de acordo com qualquer urna das reivindicações 1 a 7 e 14 a 18 e que codifica um fragmento peptídico que ainda tem as propriedades de direccionamento especifico do fragmento peptídico codificado pela sequência de partida, caracterisado por se isolar o referido fragmento de DNA ou a referida sequência parcial , com o auxílio de um processo conhecido, a partir da região 3‘ terminal de um gene que codifica 162
    naturalrnente uma molécula de proteína presente naturalmente no vaeúolo ou que a sintetiza quimicamente. 22â, - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracteriaado por se preparar uma sequência de DNA parcial que tem essencialmente uma das sequências nucleotídicas mostradas em SEQ ID NO: 8 e 9: GTT TTA GTC GAT ACT ATG TAá GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA ou um seu mutante ou variante que codifica um fragmento peptídico que ainda possui as propriedades de direccionamento típicas do fragmento peptídico codificado pela sequência de partida. 23S.„ - Processo para a preparação de um fragmento peptídico que é codificado por uma das sequências parciais de DNA de acordo com a reivindicação 18 e que actua como sinal de direccionamento par o vaeúolo vegetal e tem uma das sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NO: 8 e 9: Leu Leu Vai Asp Tre Met Fim Gli Leu Leu Vai Asp Tre Met Fim ou um seu mutante ou variante que ainda possui as propriedades de direccionamento típicas do fragmento peptídico original, caracteriaado por se isolar o referido fragmento peptídico da secção C-terminal de uma molécula de proteína presente natural-mente no vaeúolo ou por se sintetizar quimicamente o referido fragmento peptídico. 24â. - Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante que compreende uma construção genética quimérica na qual um DNA expressável está ligado operacionalmente a uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 14 a 18 ou 21 a 22, caracteriaado por se ligar operacional-mente um qualquer DNA expressável a uma sequência de DNA obtida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, assim como a sinais de expressão activos em células vegetais e facultativamente a outras sequências codificadoras e/ou não codificadoras da região 3'e/ou 5', de forma que aquando da transformação num hospedeiro vegetal o produto de expressão seia dirigido espeeifi-camente para o vacúolo vegetal. 25â. - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracteriaado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que compreende uma construção genética quimérica na qual qualquer DNA pretendido expressável está operacionalmente ligado a uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 14 a 18 ou 21 ou 22 assim como a sinais de expressão activos em células vegetais e facultativamente a outras sequências codificadoras e/ou não codificadoras da região 3’ e/ou 5’ de forma que quando da transformação de um hospedeiro vegetal o produto de expressão é dirigido espeeificamente para o vacúolo vegetal. 26a. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracteriaado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, em que os sinais de expressão são derivados de genes plantas ou de vírus de plantas ou são sinais de expressão bacterianos. 27a. - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracteriaado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, em que os sinais de expressão são promotores e/ou sinais de terminação de genes do Vírus do Mosaico da Couve Flor (CaMV). *
    28ã, - Processo de acordo com a reivindicado 26, earaeterisado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, em que os sinais de expressão são os sinais de expressão dos genes da nopalina-sintetase (nos) e/ou dos genes da oetopina-sin-tet-ase (ocs) dos plasmldeos Ti de Agrobac.terium tumef.adens, 29ã. - Processo de acordo com a reivindicado 25, earaeterisado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que compreende sequências de DNA adicionais reguladoras não codificadoras da região 3’ e/ou 55 que são capazes de regular a transcrição de uma sequência de DNA associada em tecidos vegetais no sentido da indudo ou da repressão. 38â, - Processo de acordo com a reivindicado 25, earaeterisado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, em que o referido DNA compreende naturalmente na sua região terminal 5* uma sequência que codifica um peptídeo sinal N-termi-nal capaz de funcionar na célula vegetal ou que está ligado de forma operacional a tal sequência. 3lã. - Processo de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicado 25, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, em que o DNA expressável associado à sequência de direccionamento é um gene estrutural que é capas de conferir nas células vegetais transformadas e também nos tecidos que se desenvolveram a partir delas e especialmente nas próprias plantas, um efeito protector contra patogénios, produtos químicos e factores ambientais adversos. 32ã, - Processo de acordo com a reivindicação 31, earaeterisado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, em que o referido gene estrutural é um gene que expressa quitina-se era células vegetais. 165 33ã. - Processo de acordo cora a reivindicação 31, caracterisado por se preparar uma molécula de DM recombinante, em que o referido gene estrutural é um gene que expressa glucana-se em células vegetais, 34ã. - Processo de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicação 25, caracterisado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, em que o DNA expressãvel associado à sequência de direccionamento, quando da expressão na célula vegetal transformada como tal ou como parte de uma unidade de organização superior seleccionada do grupo constituido por um tecido, orgão, calus, embrião e planta completa, resulta num produto de expressão que é dirigido para o vacúolo vegetal. 35ã. - Processo de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicação 25, caracterisado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que compreende ainda uma sequência de DNA que codifica uma marca fenotípica seleccionável. 36ã. - Processo de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicação 25, caracterisado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que compreende ainda uma origem de replicação que permite a replicação num ou mais microorganismos. 37â. - Processo para a a preparação de uma molécula de DNA recombinante, caracterisado por compreender a ligação operacional de um gene estrutural a sinais de expressão activos em células vegetais e que codifica ura produto genético presente naturalmente no vacú.olo e em que a sequência de direccionamento terminal 3 , que esta naturalmente presente no gene, foi eliminada ou de outra forma inactivada e que portanto quando da transformação de um hospedeiro vegetal, produs um produto de expressão 1 166
    que não contem uma sequência sinal C-terminal funcional e que é secretado para o espaço extraeelular da planta. 38â, - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterisado por se preparar uma molécula de DNA recorobinante, em que o referido gene estrutural é o gene da quitinase básica. 39â. - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterisado por se preparar uma molécula de DNA recombinante, em que o referido gene estrutural é o gene da glucanase básica. 40fi. - Vector de clonagem, caracterisado por compreender uma molécula de DNA recombinante preparada de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 39. 4lã. - Vector de transformação e/ou vector de expressão, caracterisado por compreender uma molécula de DNA recombinante preparada de acordo com qualquer urna das reivindicações 24 a 39. 42êl - Vector vai-vem, caracterisado por comkpreender uma molécula de DNA preparada de acordo com a reivindicação 36, vector esse que é capas de se replicar de forma estável em £L_ .J ooli e em A. turoefadens. 43â. - Organismo hospedeiro, caracterisado por compreender uma molécula de DNA recombinante preparada de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 39 ou um vector de acordo ^ com qualquer uma das reivindicações 48 a 42. 44â. - Organismo hospedeiro de acordo com a reivindicação 43, caracterisado por ser uma bactéria ou ser material vegetal seleccionado do grupo constituído por protoplastos, células, calus, tecidos, orgãos, sementes, embriões, pólen, óvulos, aigotos, etc. 45â. - Planta transgénica, incluindo a sua progénie sexuada ou assexuada, caracteriaada por compreender uma molécula de DM recombinante preparada de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 39 e/ou um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 42. 46â. - Planta transgénica, incluindo a sua progénie sexuada e assexuada, caracteriaada por ter um teor proteico significativamente aumentado no vacúolo vegetal comparativamente com o tipo selvagem. 47â. - Planta transgénica, incluindo a sua progénie sexuada e assexuada, caracteriaada por ter um teor em quitinase significativamente aumentado no vacúolo vegetal coffiparativamente com o tipo selvagem. 48â. - Planta transgénica, caracteriaada por ser regenerada a partir de material vegetal transformado de acordo com a reivindicação 44. 49a. - Planta transgénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 48, caracteriaada por ser uma planta fértil.
  2. 502. - Material de propagação, caracterisado por ser de uma planta transgénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49. 168
    5 lã. - Parte de planta, caracteriaada por ser de uma planta transgénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49. 52ã. - Processo para o direccionamento dirigido de produtos de expressão para o vacúolo vegetal, essencialmente caracterisado por compreender*. {a) em primeiro lugar o isolamento a partir de uma fonte adequada ou a síntese através de processos conhecidos da sequência de DM responsável pelo direccionamento específico para o vacúolo; Cb) a inserção da referida sequência de DM de forma operacional no extremo 3' de qualquer sequência de DM expressável pretendida; (c) a clonagem da construção terminada num vector de expressão vegetal sob o controle de sinais de expressão activos em plantas; e {d) a transformação do referido vector de expressão num hospedeiro vegetal e sua expressão nele. 53â. - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterisado por o referido DM expressável compreender na sua região terminal 5" uma sequência que codifica ura peptideo sinal N-terminal capas de funcionar na célula vegetal ou que está ligado operacionalmente a tal sequência. 54&. - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterisado por a referida sequência de DM expressável ser um ge-ne estrutural. 169
    55a, - Processo de acordo com a reivindicação 54, caracteriaado por o referido gene estrutural ser heterõlogo relativamente à sequência de direccionamento associada. 56a, - Processo para enviar para o espaço extracelular de uma planta, proteínas que naturalmente compreendem uma sequência de direccionamento e que são portanto normalmente dirigidas para o vacúolo vegetal, essencialmente caracteriaado por compreender; (a) o isolamento de uma sequência de DM codificadora de tal proteína; Cb) a remoção da grelha de leitura aberta da sequência de direccionamento no extremo C-terminal responsável pelo direccionamento para o compartimento celular particular; Çc) a inserção da referida sequência de DM mutagenisada num vector de expressão em plantas adequado; e Cd) a transformação da construção terminada num hospedeiro vegetal. 57â. - Processo para a produção de uma sequência de DM curta que codifica urn fragmento peptidico que é responsável pelo direccionamento í"targetíng"] de qualquer produto genético associado pretendido especifieamente para o vacúolo vegetal, caracteriaado por compreender o isolamento da região 3' terminal do gene estrutural associado por meio de processos conhecidos de uma sequência de DM que codifica a extensão C-terminal de uma molécula de proteína presente naturalmente no vacúolo e, sempre i 170
    que adequado, modificação daquela sequência mas sem alteração das propriedades de direccionaraento. 58ã. - Processo para a produção de uma sequencia de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 14 a 18 ou 21 ou 22, caracterisado por compreender a sua síntese por meio de processos químicos. 59ã. - Processo de acordo com a reivindicação 57, caracteriaado por comprender o isolamento da referida sequência codificadora de DNA do extremo 3' terminal de um clone adequado de cDNA ou de DNA genõmico. 60â. - Processo para a produção de uma molécula de DNA recombinante, earacterisado por compreender a ligação de qualquer DNA expressável pretendido de forma operacional a uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 14 a 18 ou 21 ou 22 assim como a sinais de expressão activos em células vegetais e, facultativamente, a outras sequências codificadoras e/ou não codificadoras da região 3' e/ou 5', de forma que quando da transformação num hospedeiro vegetal, o produto de expressão é dirigido especificamente para o vaeáolo vegetal. 6ia. - Processo de acordo com a reivindicação 60, caracterisado por o referido DNA expressável compreender na sua região terminal 5' uma sequência que codifica um peptídeo sinal N-terminal capas de funcionar na célula forma operacional a tal sequência. vegetal ou está ligado de com- 62a. - Processo para a produção de material vegetal transformado compreendendo um produto de gene que é dirigido especificamente para o vaoGolo vegetal, caracterisado por prender: 171 -
    (a) em primeiro lugar o isolamento a partir' de uma fonte adequada ou a síntese por meio de processos conhecidos da sequência responsável pelo direocionamento específico para o vacúolo; Cb) a insergao da referida sequência de DMA de forrna operacional no extremo 3'-terminal de qualquer sequência de DMA expressável pretendida; (c) a clonagern da construcao terminada num vectore de expressão vegetal sob o controle de sinais de expressão activos em plantas; Cd) a transformação do referido veetor de expressão num hospedeiro vegetal por meio de processos conhecidos e expressão nele; e íe) a deteccão do material vegetal assim tratado e o isolamento de transformantes positivos. 63a. - Processo para a produção de material vegetal transformado compreendendo um produto de gene que é secretado especificamente para o espaço extracelular, caracterisado por compreender.· (a) o isolamento de uma sequência de DMA codificadora de tal proteína; Cb) a remoção da grelha de leitura aberta a sequência de direocionamento no extremo C-terminal responsável pelo direocionamento para o compartimento celular particular; 172 (c) a inserção da referida sequência de DNA mutageniaada nura vector de expressão em plantas adequado; e (d) a transformação da construção terminada num hospedeiro vegetal; e Ce) a deteoção do material vegetal assim tratado e o isolamento de transformantes positivos. 64â. - Processo para a localização de novas sequências de direccionamento, caraeterizado por se produzir em primeiro lugar bibliotecas de cBM ou de genes genõmicos a partir de material vegetal adequado e seu estudo, usando uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 14 a 15 ou 21 ou 22 como molécula sonda relativaisente à presença de sequências de DNA homólogas que selam capazes de hibridar com a referida molécula sonda. Lisboa, 14 de Junho de 1991
    RUA VICTOR COHPON, lo-A 3." 1200 LISBOA
PT97965A 1990-06-15 1991-06-14 Processo para a preparacao de novos fragmentos peptidicos, de sequencias de dna que os codificam,de moleculas de dna que as contem e plantas transgenicas que compreendem tais moleculas PT97965B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH200790 1990-06-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT97965A PT97965A (pt) 1992-03-31
PT97965B true PT97965B (pt) 2004-02-27

Family

ID=4223728

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT97965A PT97965B (pt) 1990-06-15 1991-06-14 Processo para a preparacao de novos fragmentos peptidicos, de sequencias de dna que os codificam,de moleculas de dna que as contem e plantas transgenicas que compreendem tais moleculas

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6054637A (pt)
EP (1) EP0462065B1 (pt)
JP (2) JPH04229182A (pt)
AT (1) ATE290087T1 (pt)
AU (1) AU653526B2 (pt)
BR (1) BR9102461A (pt)
CA (1) CA2044476A1 (pt)
DE (1) DE59109267D1 (pt)
ES (1) ES2235150T3 (pt)
HU (1) HUT58758A (pt)
IE (1) IE912039A1 (pt)
IL (1) IL98476A0 (pt)
NZ (1) NZ238533A (pt)
PT (1) PT97965B (pt)
TR (1) TR27970A (pt)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0418695A1 (de) * 1989-09-13 1991-03-27 Ciba-Geigy Ag Regulatorische DNA-Sequenz
DE4004800C2 (de) * 1990-02-13 2000-12-21 Aventis Cropscience Gmbh Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen
US6512166B1 (en) 1991-06-17 2003-01-28 Cornell Research Foundation, Inc. Combinations of fungal cell wall degrading enzyme and fungal cell membrane affecting compound
US6020540A (en) * 1993-04-14 2000-02-01 Cornell Research Foundation, Inc. Gene encoding endochitinase
FR2748480B1 (fr) * 1996-05-09 1998-09-04 Biocem Plantes transgeniques exprimant la glycoproteine g de la rage, et glycoproteines ainsi obtenues
US20050032211A1 (en) * 1996-09-26 2005-02-10 Metabogal Ltd. Cell/tissue culturing device, system and method
IL155588A0 (en) 2003-04-27 2003-11-23 Metabogal Ltd Methods for expression of enzymatically active recombinant lysosomal enzymes in transgenic plant root cells and vectors used thereby
AU770211B2 (en) * 1998-07-15 2004-02-19 The New Zealand Institute For Plant And Food Research Limited Chimeric polypeptides allowing expression of plant-noxious proteins
US6534265B1 (en) * 1999-02-16 2003-03-18 New Mexico State University Technology Transfer Corporation Oryzacystatin-I applications and methods
EP1379668B1 (en) * 2001-04-18 2009-08-19 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. The use of genes encoding abc transporters to stimulate the production of secondary metabolites in biological cells
US20030100945A1 (en) 2001-11-23 2003-05-29 Mindguard Ltd. Implantable intraluminal device and method of using same in treating aneurysms
US20100196345A1 (en) * 2003-04-27 2010-08-05 Protalix Production of high mannose proteins in plant culture
US7951557B2 (en) 2003-04-27 2011-05-31 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
US9551003B2 (en) * 2006-09-13 2017-01-24 22Nd Century Limited, Llc Increasing levels of nicotinic alkaloids in plants
WO2008135991A2 (en) 2007-05-07 2008-11-13 Protalix Ltd. Large scale disposable bioreactor
KR20100044813A (ko) * 2007-07-03 2010-04-30 이데미쓰 고산 가부시키가이샤 돼지 부종병 백신
CA2749356A1 (en) * 2009-02-06 2010-09-12 Syngenta Participations Ag Modification of multidomain enzyme for expression in plants
JP6617694B2 (ja) * 2016-12-12 2019-12-11 株式会社豊田中央研究所 植物体におけるゲノムシャッフリングのためのポリペプチド及びその利用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3711776A1 (de) * 1987-04-08 1988-10-27 Huels Chemische Werke Ag Verwendung von n-polyhydroxyalkylfettsaeureamiden als verdickungsmittel fuer fluessige waessrige tensidsysteme
EP0351924A3 (en) * 1988-07-20 1991-04-03 Nickerson Seeds Limited Improvements relating to transgenic plants
CA1340685C (en) * 1988-07-29 1999-07-27 Frederick Meins Dna sequences encoding polypeptides having beta-1,3-glucanase activity
WO1990007001A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Overexpression of chitinase in transgenic plants
ES2199931T3 (es) * 1989-03-24 2004-03-01 Syngenta Participations Ag Plantas transgenicas resistentes a enfermedades.
US5360726A (en) * 1989-09-12 1994-11-01 Board Of Trustees Operating Michigan State University Polypeptides enabling sorting of proteins to vacuoles in plants
EP0418695A1 (de) * 1989-09-13 1991-03-27 Ciba-Geigy Ag Regulatorische DNA-Sequenz
IL97020A (en) * 1990-01-30 2000-12-06 Mogen Int Recombinant polynucleotides comprising a chitinase gene and a glucanase gene
DE4004800C2 (de) * 1990-02-13 2000-12-21 Aventis Cropscience Gmbh Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen
JPH03246265A (ja) * 1990-02-22 1991-11-01 Kao Corp 脂肪酸アミドの製造方法
PH30997A (en) * 1990-03-12 1997-12-23 Ciba Geigy Antipathologenically effective compositions comprising lytic peptides and hydrolytic enzymes.
EP0460753A3 (en) * 1990-06-07 1992-04-15 Mogen International N.V. New antifungal preparations, process for making such preparations, process for obtaining plants with decreased susceptibility to fungi
JPH06510326A (ja) * 1991-09-06 1994-11-17 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー カルシウム及びポリヒドロキシ脂肪酸アミド（ｐｆａ）を含む洗剤組成物

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003180354A (ja) 2003-07-02
BR9102461A (pt) 1992-01-21
NZ238533A (en) 1993-09-27
ATE290087T1 (de) 2005-03-15
IE912039A1 (en) 1991-12-18
EP0462065A3 (en) 1992-05-20
PT97965A (pt) 1992-03-31
HU911994D0 (en) 1991-12-30
AU653526B2 (en) 1994-10-06
ES2235150T3 (es) 2005-07-01
EP0462065B1 (de) 2005-03-02
AU7841591A (en) 1991-12-19
IL98476A0 (en) 1992-07-15
HUT58758A (en) 1992-03-30
TR27970A (tr) 1995-11-07
JPH04229182A (ja) 1992-08-18
EP0462065A2 (de) 1991-12-18
DE59109267D1 (de) 2005-04-07
US6054637A (en) 2000-04-25
CA2044476A1 (en) 1991-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100225352B1 (ko) 화학적으로 조절가능한 dna 서열 및 유전자 그리고 이들의 용도
ES2199931T3 (es) Plantas transgenicas resistentes a enfermedades.
PT97965B (pt) Processo para a preparacao de novos fragmentos peptidicos, de sequencias de dna que os codificam,de moleculas de dna que as contem e plantas transgenicas que compreendem tais moleculas
US5254801A (en) Heterologous dominant conditional lethal gene which is a phosphonate monoester hydrolase and use thereof in plants
CA2193123A1 (en) Plant virus resistance gene and methods
HU209143B (en) Method for producing nitrilase specific to halogenated benzonitryl, sequences containing its coding gene and cells containing said sequences
PT96999A (pt) Processo para a preparacao de composicoes eficazes que compreendem peptideos liticos e enzimas hidroliticos
AU645990B2 (en) Regulatory DNA sequence
EP0639642A1 (en) Chitinase, DNA coding therefore and plants containing same
JPH06504439A (ja) 低温耐性植物およびその作製法
AU672636B2 (en) Antifungal chitin binding proteins and DNA coding therefor
NO885091L (no) Spleisede gener samt fremstilling derav.
AU656907B2 (en) Recombinant gene coding for a protein having an endochitinase activity
Ng et al. ENGINEERING BARLEY WITH GASTRODIANIN FOR IMPROVED RESISTANCE TO FUSARIUM HEAD BLIGHT.
de Jong Characterization of an endochitinase able to rescue the carrot somatic embryo variant ts11
CA2106309A1 (en) Plant chitinase gene and use thereof
PL162317B1 (en) Method for controlling transcription of a chemically controlled gene in plant material
EP0667905A1 (en) Antifungal chitin binding proteins and dna coding therefor

Legal Events

Date Code Title Description
BB1A Laying open of patent application

Effective date: 19911114

FG3A Patent granted, date of granting

Effective date: 20031231

MM3A Annulment or lapse

Effective date: 20060630