JPH06504439A

JPH06504439A - 低温耐性植物およびその作製法

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Publication number: JPH06504439A
Application number: JP4502792A
Authority: JP
Inventors: 西沢　治
Original assignee: 麒麟麦酒株式会社
Priority date: 1991-01-16
Filing date: 1992-01-14
Publication date: 1994-05-26
Anticipated expiration: 2015-11-13
Also published as: DE69207749D1; WO1992013082A1; JP3107820B2; US5516667A; DE69207749T2; KR930703451A; EP0567648A1; AU1163392A; ES2083732T3; DK0567648T3; CA2100674C; EP0567648B1; KR100191015B1; CA2100674A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】低温耐性植物およびその作製法発明の技術分野本発明は、脂質の脂肪酸の組成が変化した植物、より詳細には、脂質の脂肪酸の組成が変化したことによって低温傷害に対する耐性を与えられた植物およびそのような植物の作製法に関する。

発明の背景低温は種々の高等植物に傷害を与えるが、この傷害は大きく二つに大別される。

ひとつは０℃あるいはそれ以下の温度で引き起こされる傷害であり、凍結傷害（１＋ｅｅｚｉｎｇ　１ｎｉｕ＋ｙｊ　と呼ばれる。もう一つは本発明の主題であり、低温傷害（ｃｈｉｌｌｉｎｇ　１ｏｉｕ＋ｙ）　と呼ばわ、凍結傷害とは全く異なる。熱帯・亜熱帯植物の多くは、５〜１５℃の範囲の温度によって、植物体全体および／または（の組織が傷害を受け、さまざまな生理的障害および激しい場合には最終的に死にまでいたる。

低温傷害を受けやすい植物を「低温感受性」植物と呼び、これには多くの主要な農作物、たとえばイネ、トウモロコシ、ヤマイモ、サツマイモ、キュウリ、ピーマン、ナス、カポチャ、バナナ、メロン、カランコニ、シクラメン、ユリ、バラ、ヒマ、ヘチマ、タバコが含まれる。これらの植物は５〜１５℃、多くは１０℃ 前後の温度で、発芽や成長の阻害、組織の壊死、さらには植物体全体の枯死などさまざまな傷害を受けるため、冷害や霜害にあいやすい。また、低温感受性植物の収穫物である果実、野菜などは低温保存ができない（バナナを冷蔵庫から取り出すとすぐに黒変することにみられるように）ため、収穫後の長期保存が難しい。

これに対し、多くの温帯起源の植物は０℃付近の低温でも傷害を受けない低温耐性植物である。低温耐性の農作物には、コムギ、オオムギ、ホウレンソウ、レタス、ダイコン、エントウ、ネギ、キャベツ、などを挙げることができる。野生の植物では、タンポポ、ンロイヌナズナなども低温耐性である。

低温傷害は、細胞の生体膜を構成する膜脂質の流動性ど関連が深い。生体膜は生細胞の基本構造単位の一つである。それらは細胞膜として細胞の中と外を区切るだけでなく、真核細胞においては、さまざまな膜構造体（細胞内小器官）を形成して、細胞内を種々の機能単位に分画する。生体膜は種々の高分子物質や荷電低分子物質に対して単なる物理的なバリアではなく、膜中のタンパク質の働きにより、特定の物質を選択的に透過させたり、および／または濃度勾配に逆らって能動輸送したりすることができる。このように生体膜は、細胞質や細胞内小器官内の微環境をそれぞれの目的に応じて好適な状態に保つ。いくつかの生化学的過程では、たとえば呼吸や光合成によるエネルギー生成のように、生体膜の中と外の特定物質の特定の濃度勾配が必要になる。光合成の場合には、光エネルギーによって葉緑体中のチラコイド膜の両側に水素イオンの濃度勾配が形成さね、この濃度勾配のエネルギーが、チラコイド膜中のタンパク質によって、生細胞中で利用される高エネルギー物質であるＡＴＰに変換されるのである。従って、もしも生体膜に前記したようなバリア能がなければ、細胞中の微環境が損なわれるばかりでなく、濃度勾配に基づくこれらの細胞機能も損なわわ、生細胞に大きな機能障害が生じるであろう。

生体膜を構成する膜脂質は主にリン脂質および、葉緑体においては糖脂質である。リン脂質はグリセロールの１位と２位に長鎖アルキル基ａ旨肪酸アシル基）が、３位にリン酸基を介して極性基が結合した物質である。それらはひとつの分子中に親水性部分（極性基）と疎水性部分ａ旨肪酸アシル基）を持つ両性（ａｍｐｈｉｐａ＋ｈｉｅ）物質であり、そのため水中に分散させると、疎水性部分を内側、親水性部分を表面側にした脂質二分子層を形成する。この脂質二分子層は生体膜の基本構造であり、その内部および／または表面に種々のタンパク質が「埋め込まれて」いる。脂質二分子層は、生理条件下では二分子層内部が高い流動性を持っており、タンパク質や脂質分子の膜中での自由な横方向拡散や回転を可能にしている。このような生体膜の流動性は細胞の機能にとって必須である（Ｄａ＋ｎｅｌｌ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、　’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ’、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋ＋、　１９８６　）　。

液晶状態にある脂質二分子層の温度を相転移温度（Ｔｃ）と呼ばれる特定の温度まで下げていくと、その二分子層は膜内部の流動性が低いゲル状態に移行する。

生体膜のように種々の脂質が混在した膜では、ある温度においてＴｃの高い脂質がゲル化し始めるが、Ｔｃの低い脂質はまだ液晶状態のままであるので、膜中に液晶相とゲル相とが混在した状態になる。相分離状態では生体膜は荷電低分子物質に対するバリア能を失う。

低温傷害と膜脂質の相転移の関係が最初に提唱されたのは１９７０年代の初頭である（Ｌ７ｏｎｓ、Ｊ、ｌＬ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｉ’ｈ７ｓｉｏ１．、　２４：４４５．　１９７３１　ａ　しかしながら、この時点ではその関係を裏付ける具体的な知見はなかった。その後、モデル生物としてシアノバクテリア（藍藻）を用いて行われた一連の実験では、低温において細胞膜が相分離状態になり、その結果イオンなどの電解質が非可逆的に細胞外へ流出することによりシアノバクテリアに低温傷害が起きることが明らかにされた（Ｍａｌａｙａ、　Ｎ、　ａｎｄ　Ｎ１５ｈｔｄａ、　Ｉ、　ｉｎ　’Ｔｈｅ　ｂｉｏｃｈｅｍｉＮｒ７　ａＩ山ｎ’ｓ　ｖｏｌ、９　Ｌ奄垂■ ｄｇ：　Ｓ＋＋ｕｃｔｏｒｅ　ｘｎｄ　Ｉｕｎｅ＋ｉｏｎ’、ｐＪ１５．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｔｌａｎｄｏ、１９８７）j。

通常脂質は極性基によって分類される膜脂質の構造は前記参照）が、これは、カラムや薄層クロマトグラフィなどにおける挙動が、極性基によってほぼ決まるからである。しかし、極性基が同じであっても、結合しているふたつの脂肪酸アシル基の組合せによって多くのさまざまな分子が存在する。これらの分子を区別するために、「分子種」という言葉が用いられる。各脂質分子種のＴｃは脂肪酸アシル基の鎖長や不飽和度（二重結合の改、および極性基の種類、さらにある場合には周囲の塩濃度などに依存する。これらの中でも最も影響の大きいのは脂肪酸アシル基の不飽和度であり、脂肪酸アシル基がふたつとも飽和している特定の分子種のＴｃは室温よりも高く、一方の脂肪酸アシル基にひとつ二重結合が入ると、Ｔｃは０℃前後まで下がる（Ｓａｎｌａｒｅｎ、Ｊ、Ｆ、ｅｌａｔ、、　ＢｉｏｃｂｅＩＬＢｉｏｐｈ７ｔ　Ａｃ＋ａ、６８７：２３１．　１９８２）　（ただしその二重結合がトランス型の立体配座をとる場合には、Ｔｃに対する効果は非常に小さい（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、　ＫＣ，ｅＩａｔ、、Ｃｈｅｔ　Ｐｈ７ｓ、Ｌｉｐｉｄｓ、８１２７、＋９７２゜膜脂質のほとんどの二重結合はシス型立体配座であり、トランス型立体配座は比較的まれである）。このことは、脂肪酸アシル基中に二重結合を少なくとも１個持つような脂質分子種（以下「不飽和分子種」という）は、低温傷害がおきる１０℃前後の温度で相転移を起こさないことを意味する。したがってふたつの脂肪酸アシル基がともに飽和している脂質分子種（以下、「飽和分子種」という）のみが低温傷害の起因（ｐｒｉａｕｒ７　ｅｖｅｎｔ］　と考えられる生体膜の相分離の原因となりつる。

種々の低温感受性および低温耐性植物の膜脂質を抽出し、極性基の種類ごとに分離して脂肪酸組成および分子種組成を調べた。その結果、植物の膜脂質の中で飽和分子種が明らかに多いのはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のみであること、およびＰＧ中の飽和分子種の割合が、低温感受性植物では高い（３０〜７０％）のに対し、低温耐性植物では低い（〈２０％）ことが見いだされた（Ｍａｌａｙａ、　Ｎ、、　Ｐｌａｎｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　２４：８１．１９８３；　Ｒｏａｇｈａｎ、　Ｐ、Ｇ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　V７：７４Ｇ。

＋９８５）。ＰＧはプラスチド１緑体、色素体）の生体膜の主な成分であるから、ＰＧ分子種組成と低温感受性間のこの関係は、高等植物の低温傷害の主な起因がＰＧの相転移によって引き起こされるプラスチド生体膜の相分離であることを強く示唆している（Ｍａｌａｙａ、　Ｎ、ａｎｄ　Ｎ１５ｈｉｄａ、　１．、　ｉｎ　Ｃｈｉｌｌｉｎｇ　１ｎｊｕ＋７　ｏｌ　ｈｏｒ＋１ｃ浮戟{ｕｒａｌ　ｃｒｏｐｓ、　ｐ、　１８１．　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　１９９０１゜ＰＧはプラスチドに局在するが、緑葉においてはもっばら葉緑体で合成される（Ｓｐａ＋ａｃｅ、Ｓ、Ａ、ａｎｄ　Ｍｕｄｄ、１．Ｂ、、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ７＋ｉｏ１．、　７０：１２６０．　１９８２）　ｏその生合成経路は次のようなステップで進む。

１、グリセロール−３−リン酸の５ｎ−１位に脂肪酸アシル基が転移。

２．５ｎ−２位にもうひとつの脂肪酸アシル基が転移。

３．３−リン酸基にグリセロールがエステル結合。

４、　脂肪酸アシル基の不飽和イし脂肪酸はもっばら葉緑体で合成される。合成された脂肪酸はアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）と呼ばれるタンパク質に結合したアシル−ＡＣＰとしてＰＧ合成のステップ１．２の反応に供される。葉緑体で合成される脂肪酸の大部分は、パルミチン酸（飽和Ｃ−１６酸、以下１６・０と表君己およびオレイン酸（モノ −不飽和Ｃ−１８酸、以下１８；ｌと表記）である。

前記した概要のステップ１は、Ａｃ７ｌ−ＡＣＰ：ｇ１７ｅｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｃ７ｍａｎｓｌｅ＋ａｓｅ　（ＥＣ２，３，１，１５）　（以下ＡＴａｓｅと表記）によって触媒される。この酵素は葉緑体のストローマに存在する可溶性酵素である。これはホウレンソウ、エントウで部分精製され（Ｂｅｒｔ＋ｘｍｓ、　ｔ　ａｎｄ　Ｈｅ１ｎｚ、　Ｅ、、　Ｐｌａ＋ＨＰｈ７＋ｉｏ１．、６８：６５３．　１９８１）、カポチャでは均一に精製されている（Ｎｉｓｈｉｄａ、１．　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ７ｓｉｏ１．、　２ｇ：１０７１．　１９８７］　。この酵素は核遺伝子にコードされており、カポチャ、シロイヌナズナおよび最近エントウからこの遺伝子がクローニングされている（Ｉ＋ｈｉｘａｋｉ、Ｏ，ｅｔ！１．、ＦＥＢＳ　ＬｅｔＬ、２３８：４２４．　１９８８；　Ｎ１５ｈｉｄａ、１．　ｅｔ　ａｌ、、ｉｎ　’o ｌａｎｔ　１ｉｐｉｄ　ｂｉｏｃｈｃｍｉｓｊｒ７．　Ｎｒｕｃ（ｕｒｅ　ａｎｄ　ｕ＋１ｌｉｕ＋ｉｏｎ’、Ｐｏｔ目ａｎｄ　Ｐ「ｅｓｓAＬｏｎｄｏｎ、１９９０；　Ｗｅｂｓ’、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｒｉａｌ、、　１７：１Ｑ６７、　１９９１）　庶■Xの取得源からのＡＴａｓｅは、基質であるアシル−ＡＣＰの選択性において異なる。

低温耐性であるホウレンソウ、エントウ、シロイヌナズナ由来のＡＴａｓｅは１８１−ＡＣＰに高い選択性を示すのに対し、低温感受性植物であるカポチャ由来のＡＴａｓｅは、１８：１−ＡＣＰと１６：０−ＡＣＰの両者を同程度に利用する（Ｆ＋ｅｎ＋ｘｅｎ、　Ｋ　ｅｔ　２１．　Ｅｕ＋、Ｊ、　Ｂｉｏｃｂｅａ、１２９：６２９．　１９８３；　Ｆ＋ｅｎ＋ｚｅｎ、　ｉｔ　ｅｔ　ａｌ、、　 oｌａｎＦ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ７ｓｉｏｌ、、　２８：ｌｌ９５．　１９８８）。

前記概要のステップ２を触媒する酵素は葉緑体の包膜の膜結合酵素であり、１６：Ｑ−ＡＣＰのみを利用する（Ｆ＋ｅｎｔｚｅｎ、　Ｋ　ｅｔ　ａｔ、、　ｂｒ、Ｊ、ＢｉｏｃｈｅｌＬ、１２９：６２９゜１９８３）。１６・３植物と呼ばれる多くの植物種において、ステップ１．２の中間産物であるホスファチジン酸（１，２−ｄｉａｃ７１ｇ１７ｃｅｒｏｌ−３−ｐｈａ＋ｐｈｉｊｅ）は、葉緑体で合成されるグリセロ脂質（モノ−およびジガラクトシルジアシルグリセロールおよびスルフオキノボシルジアシルグリセロール）の中間産物でもある。従って、１６・３植物の葉緑体中ではステップ１．２は脂質合成に共通である。

ＰＧ生合成のステップ３．４に関与する酵素についてはほとんどわかっていない。しかし、ＰＧ中の脂肪酸アシル基の不飽和化は、平均に起こるのではないことは知られている。５ｎ−１位においては、１８：１の多くがさらに不飽和化されて２ないし３個の二重結合を持つようになるのに対し、１６：０には不飽和化が起こらない。５ｎ−２位においては、結合した１６０のいくらかは、３−（ｒａｎｔ−へキサデセン酸（以下１６・１【と表記）になるが、シス型の二重結合は導入されない。トランス型の二重結合は相転移温度を下げる効果が非常に小さいので、ＰＧの２位において１６．０から１６：Ｉｔへの変換によってＴｃが１０ ℃程度低くなるだけで、その結果Ｔｃは低温傷害が起こる温度よりもまだ高いであろう（ｌｌｉｓｂｏｐ、Ｄ、Ｇ、ａｎｄ　Ｋｅｎ＋ｉｃｋ。

１、Ｒ，、Ｐｈｙ４ｏｃｈｅｌｌｌｉＨ＋７．　２６：３０６５．　＋９８７１　ｏそこで以下の記述においては、１６１【を結合したＰＧ分子種を飽和分子種に含めることとする。シス型の二重結合は２位の脂肪酸アシル基には導入されないので、１位の脂肪酸アシル基は飽和分子種の含量を決定する上で非常に重要である。

低温感受性の農作物には、前記したように、低温耐性および収穫後の長期保存において大きな問題がある。ところが低温感受性農作物には農業生産上非常に重要で欠かせないものが多く、たとえばイネやトウモロコシは世界各地の主要穀物である。これら農作物の低温耐性を改善できれば、低温環境で栽培すること、および／または収穫物の長期の保存が容易になる。低温感受性であるために温室で栽培されている観賞用花弁や野菜は、低温耐性の向上によって、温室が不要になったり、あるいは暖房費用を大幅に節減できることが予想される。さらに、気温が農作物の栽培限界の主因子になっている場合が多いことから、低温耐性の向上は作物を栽培する地域を拡大できると考えられる。

このように、低温耐性植物に対する強い要求があり、また低温耐性は、作物育種の重要な目標の一つとなっている。しかし従来の交雑育種では、交雑は同一種内でしかできないため、低温耐性育種には遺伝子源に限りがある。高等植物の遺伝子工学における最近の進歩は無限の遺伝子源の中の遺伝子を、作物に導入することを可能にした。そこで、遺伝子操作技術によって低温耐性能を与えることができれば、その効果は計り知れない。。

前記したように、高等植物の低温傷害の起因（ｐｒｉｍ！ｒ７　ｅｖｅｎｔ　）はプラスチド膜の相分離であり、低温感受性植物のプラスチド膜にはＰＧの飽和分子種が多く含まれており、これが相分離を起こす原因と考えられている。したがって、低温感受性植物のＰＧの脂肪酸の組成を変え、飽和分子種の含量を下げることによって低温感受性植物の低温耐性を増加させることが可能かもしれない（Ｍｕ　ｒＯＩ！、　Ｎ、　。

ＰｌａｎＦ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、２４：８１．　１９８３）。しかしながら、これはあくまで単なる仮説であり、これまでに脂質の脂肪酸組成を変化させるそのような方法あるいは脂肪酸組成が変化した植物は全く報告されていない。

発明の概要本発明は、高等植物において膜脂質、特にホスファチジルグリセロール（Ｐ　Ｇ）の不飽和脂肪酸含量を増加させる新規な方法を提供する。要約すれば、これらの方法は、植物にバルミトイル−アシルキャリアタンパク質（１６・０−ＡＣＰ）よりもオレオイル−アシルキャリアタンパク質（１８：１−ＡＣＰ）に対してより高い基質選択性を持つグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＡＴａ、ｓｅ）活性を宵するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を導入して発現させることを特徴とするものである。

本発明はまた、膜脂質の不飽和脂肪酸をある高等植物種が本来含むより多く含む高等植物を提供する。このような植物の好ましい態様は、バルミトイル−アシルキャリアタンパク質よりもオレオイル−アシルキャリアタンパク質に対してより高い基質選択性を持つグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する形質転換植物である。

ＡＴａＳｆｌ！は葉緑体中の脂質生合成の最初のステップを触媒し、異なる植物種に由来するＡＴａｓｅは、アシル−ＡＣＰに対して異なった基質選択性を示すことは、前記したところである。ホウレンソウ、エントウ、シロイヌナズナのような低温耐性植物由来のＡＴａｓｅは１８１１−ＡＣＰに高い選択性を示すのに対し、カポチャのような低温感受性植物由来のＡＴａｓｅは、１８：１−ＡＣＰと１６１０−ＡＣＰの両者を同程度に利用する。

本発明に使用し１εＩ−ＡＣＰに対してより高い基質選択性を持つＡＴａｓｅをコードするＤＮＡ配７１は、低温耐性植物のＡＴａｓｅをコードするＤＮＡ配列および高等植物以外の生物に由来するＡ、Ｔａ５ｅをコードするＤＮＡ配列の任意のものでありうる。

好ましくは低温耐性植物のＡＴａｓｅ、より好ましくはホウレンソウ、エントウ、シロイヌナズナ、のＡＴａｓｅをコードするＤＮＡ配列か用いられる。これらの外来性ＤＮＡ配列を発現させてＡＴａｓｅを産生するには、この配タリに、発現調節配列（プロモーター、ターミネータ−など）やタンパク質を葉緑体へ輸送するのに必要なトランジットペプチドをコードする配列を適宜組み合わせたものを用いることにより可能となる。ＤＮＡ構築物は、当業者に公知であって対象とする植物に適切な任意の一般的方法によって植物ゲノムに導入することができる。

本発明によれば、１８１＋−ＡＣＰに対してより高い基質選択性を持つＡＴａｓｅをコードする外来性ＤＮＡ配タリを植物に導入して発現させることにより、この植物の膜脂質の不飽和脂肪酸含量が高まる。本発明の実施において特に重要な点は、ＰＧの不飽和脂肪酸含量か増加し、その結果ＰＧの飽和分子種含量が顕著に低下することである。前記した通り、ＰＧの飽和分子種はプラスチド生体膜の相分離の原因となり、ある植物の低温傷害に対する耐性能と、ＰＧの飽和分子種の含量とは負の相関をすることが知られている。

従って、本発明はまた、ホスファチジルグリセロールの飽和分子種の含量を低下させることにより、０℃より高い低温で傷害を受ける高等植物（低温感受性植物）に、本来低温傷害を引起こす温度より低い温度でも障害をおこさないようにする方法を提供する。

さらに、本発明は、低温傷害に対する耐性が向上した高等植物を提供する。すなわち、本発明は本来低温傷害を生ずる温度より低い温度でも障害がおこらない高等植物種を提供する。この植物の好ましい態様は、バルミトイル−アシルキャリアタンパク質よりも、オレオイル−アシルキャリアタンパク質に対して、より高い基質選択性を持つグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現によって、ホスファチジルグリセロールの飽和分子種の含量が本来より少ない形質転換植物である。

図面の簡単な説明第１図は、抗シロイヌナズナＡＴａｓｅ抗体を用いた、シロイヌナズナＡＴａｓｅ導入形質転換タバコ植物体のウェスタンプロット分析の結果を示す。レーンエは大腸菌中で発現されたシロイヌナズナＡＴａｓｅ調製物５０ｎｇを含む。レーン２は非形質転換コントロール植物の全葉緑体タンパク質１０μｇを含む。レーン３〜７はそれぞれ形質転換植物Ｎｏ、１〜５に由来する各全葉緑体タンパク質１０μｇを含む。レーン８は形質転換植物Ｎｏ、１に由来する全葉片タンパク質１０μｇを含む。

第２図は、形質転換タバコ植物体の光合成活性に対する低温処理の影響を示す。

上部から下部までは、順にベクターｐＢ１１２１、シロイヌナズナＡＴａＳｅｃＤＮＡおよびカポチャＡＴａｓｅ　ｃＤＮＡで形質転換されたタバコである。

第３図は、植物体レベルでの形質転換タバコ植物体に対する低温処理をの影響を示す。上図および下図はそれぞれコントロールのｐＢＩ−１２１形質転換タバコ植物体およびシロイヌナズナＡ、Ｔａ５ｅ　ｃＤＮＡ導入形質転換植物体であり、低温処理の前（左）および後（右）である。

発明の詳細な説明一役に、あるＤＮＡ配列を発現させてそれがコードするポリペプチドを産生させるためには、そのポリペプチドに対応するコーディングＩＥ３’ｌｌの他に、発現調節配列が必須である。特に重要なのは、コーディング配列上流のプロモーター配列および下流のポリアデニル化シグナルである。本発明において、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルとしては、植物中で機能することか知られている公知のもの、例えばカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター、ツバリン合成酵素のプロモーター、リブロースニリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニットのプロモーター、およびツバリン合成酵素のポリアデニル化シグナル、オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル、などを適宜組み合わせて用いることができる。さらに発現されたポリペプチドを細胞の特定の場所、たとえば葉緑体に輸送したい場合には、ポリペプチドのＮ末端にトランジットまたはリーダーペプチド配列がなければならない。したがって、本発明でｒＡＴａｓｅ（あるいはＡＴａｓｅ活性を有するポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列」というときは、このコーディング領域のみを限定して指すのではなく、発現調節配列および／またはトランジットペプチドをコードする配ｌすをも包含するものとする。

本発明で用いる１６：０−ＡＣＰよりも１８：１−ＡＣＰに対してより高い基質選択性を持つＡＴａｓ　ｅ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列として好ましいのは、低温耐性植物、とりわけホウレンソウ、エントウ、シロイヌナズナ、のＡＴａｓｅをコードするＤＮＡ配列である。そのようなりＮＡ配列は、全部または一部を化学合成することかできるが、より好ましくは低温耐性植物からＡＴａｓｅをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをクローニングして得ることができる。以下に示す具体例では、シロイヌナズナ（Ａ＋ａｂｉｄｏｐ＋ｉ＋　ｔｈａｌｉａｎａ）のＡＴａｓｅをコードするｃＤＮＡ［Ｎｉ＋ｂｉｄａ、１．　Ｎ　ａｔ、、ｉｎ　’Ｐｌａｎｔ　１ｉｐｉｄ　Ｙｏｃｂｅｍｉ＋ｕｙ、＋ｕ＋＋ｃｎ＋＋　ｒｎｄ　ｕｔ１目ｘａｔｉｏｎ’、［’ｏｕｌａｎｄ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９１］）を用いた０しかしながら、本発明で使用できるＤＮＡ配夕ｆ１は、上記したようなシロイヌナズナＡＴａｓｅのｃＤＮＡ配３’１１に限定されるものではない。

このシロイヌナズナのＡＴａｓｅをコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示した。このｃＤＮＡの取得そのものは本発明を構成する要素ではないが、参考のために、詳細な取得方法を後記する参考例１．２に示す。要約すれば、シロイヌナズナＡＴａｓｅをコードするゲノムＤＮＡクローンはカポチャＡＴａｓｅのｃＤＮＡフラグメントをプローブとして用いシロイヌナズナのゲノムＤＮＡライブラリーから取得した。このゲノムＤＮＡをプローブとしてシロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてｃＤＮＡクローンを得た。配列番号１に示したシロイヌナズナのｃＤＮＡは、４５９アミノ酸から成る分子量５０，４３１のポリペプチドをコードしている。このポリペプチドのＮ末端から９０番目のアミノ酸までは、葉緑体への輸送に必要なトランジットペプチドであると考えられており、トランジットペプチドは輸送に際して切断さね、３６９アミノ酸から成る成熟酵素となる。このｃＤＮＡを大腸菌で発現させて得られるＡＴａｓｅは、１６０−ＡＣＰよりも１８１１−ＡＣＰに対してより高い基質選択性を示す（参考例３）。

得られたＤＮＡ配列がｃＤＮＡである場合には、このｃＤＮＡを形質転換植物中で発現させるために、ｃＤＮＡ配列の上流および下流に適当な発現調節配列が必要である。取得したＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡフラグメントで調節配列が含まれている場合は、そのフラグメントをそのまま用いてもよい。さらに、本発明によって発現されるＡ、Ｔａ５ｅは葉緑体中での脂質合成に関与するので、形質転換植物中で発現されたＡＴａｓｅは、細胞質から葉緑体に輸送されることが必要である。一般に核ケノムコードされているタンパク質を葉緑体に輸送するためには、そのＮ末端にトランジットペプチド配列が必要であるｆｆａｎ　ｄｅｎ　Ｂ＋ｏｅｃｋ　ｅ目［、。

Ｎａｔｕｒｅ、３１３：３５８．　１９８５）ｏ高等植物のプラスチドに存在するＡＴａｓｅは本来細胞質で合成されて葉緑体で機能するので、後記の具体例で用いるシロイヌナズナ、ＡＴａｓｅのｃＤＮＡに見られるように、高等植物ＡＴａｓｅをコードするＤＮＡ配列は、ＣＤ　Ｎ　ＡまたはゲノムＤＮＡフラグメントであっても、トランジットペプチドとして機能するアミノ酸配列をフードするＤＮＡ配列を含んでいると考えられる。しかし必要があれば、リブロースニリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニットのトランジットペプチドのような、公知のトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列を利用してもよい。

本発明によれば、＋６：ｏ−ＡＣＰよりも１８：１−ＡＣＰに対してより高い基質選択性を持つＡＴａｓｅのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、細菌など高等植物以外の生物由来のＡＴａｓｅをコードするＤＮＡ配列を用いることもできる。

このようなりＮＡ配列を用いる時、適当な発現調節配列およびトランジットペプチドをコードする配列を、このＤＮＡ配列の上流および／または下流に適当な配置となるようつなげることが必要になることがあろう。このような配置を生成させるための具体的な構成および操作は、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ、　（Ｓａｍｂ＋ｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　ｅｄｌ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｍｏｒ７　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９１■謔■■■■ 操作法を参照することができ、また当業者にとって容易に理解できるところである。

本発明において使用する、１６：０−ＡＣＰよりも１８：Ｉ−ＡＣＰに対してより高い基質選択性を持つＡＴａｓｅのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列としてはまた、前記したような各種ＡＴａｓｅの誘導体をコードするものであってもよい。

ここで「誘導体」とは、前記のＡＴａｓｅに対して１またはそれより多くのアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加のあるポリペプチドであって、そのアミノ酸配列の変化が、ＡＴａｓｅ活性および１８：Ｉ−ＡＣＰに対する基質選択性を低下させることのないようなものをいう。

本発明を用いて形質転換植物を作製するのに好適な低温感受性植物としては、イネ、トウモロコシ、ヤマイモ、サツマイモ、キュウリ、ピーマン、ナス、カポチャ、バナナ、メロン、シクラメン、ユリ、バラ、ヒマ、ヘチマ、タバコ、などがあげられるが、これらに限定されるものではない。

高等植物にＤＮＡ配列を導入するには、植物の形質転換のために確立されている任意の方法、たとえばアグロバクテリウムのＴｉプラスミドをベクターとして用いる方法やプロトプラストにエレクトロポレーションで導入する方法などを対象とする植物に応じて適宜用いることができる（たとえ１ｆＰｌａｎ＋　ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｉｒａｎｓｆｏｔｍａ＋ｉｏｏ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐ「ｅｓｓｉｏｎ；　ａ　１ａｂｏｔａ＋ｏ＋７　ｍｘｎａ＊ｌ’、　Ｄｔａｐｅ＋、Ｊ、ｅ煤@ａｌ、　ｅｄｓ、、　Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｉｅｎｆｉｌｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃｒｌｉｏｎｓ、１９８８参船。一般に、双子葉植物の場合には、Ｔｉプラスミドベクターを用いるのが好ましく、単子葉植物やアグロバクテリウムに感染しにくい双子葉植物の場合には、エレクトロポレーションなどの物理的導入法が好ましい。形質転換のための植物材料としては、導入法に応じて、葉片（ｌｃａｌ　ｄｉｓｋ）　、茎片（ｓｅｅｍ　ｄｉｓｋ）　、塊茎片（ｌｕｂｅ＋　ｄｉｓｋ）、プロトプラスト、カルス、花粉、花粉管などの組織片を用いることができる。

本発明においては、１６：０−ＡＣＰよりも１８：１−ＡＣＰに対してより高い基質選択性を持つＡＴａｓｅをコードするＤＮＡ配列を高等植物に組み込んで発現させることにより、特にＰＧの不飽和脂肪酸含量が増加し、その結果ＰＧ中の飽和分子種含量が顕著に低下する。

ＡＴａｓｅはＰＧ生合成の最初のステップを触媒するが、同時に、多くの植物ではこのステップは葉緑体中での他の脂質の生合成経路に共通しており溌明の背景参釦、ＡＴａｓｅの反応生成物はＰＧだけでなく他の種々の脂質に利用される。

また、基質選択性の異なる外来のＡＴａｓｅを形質転換植物で発現させても、その植物が本来持っているＡＴａｓｅが失われるわけではないので、必ずしも外来のＡＴａｓｅの基質選択性が反映されるとは限らない。したがって、外来のＡＴａｓｅを発現させても、膜脂質の脂肪酸組成、ましてやＰＧの分子種組成が変化するかどうか予測することはできなかった。これらの点から、本発明において見られるようなＰＧの飽和分子種含量の顕著な低下は全く予期せぬことであった。

本発明によりＰＧの飽和分子種、すなわち生体膜の相分離を引き起こし高等植物の低温傷害の原因となる脂質分子種を大幅に減らすことができる。これは遺伝子操作によって植物に低温耐性を賦与した最初の例である。

以下、実験例によって本発明をより具体的に説明する。

実験例１　シロイヌナズナＡＴａｓｅのゲノムＤＮＡフラグメントの単離（１）ゲノムＤＮＡライブラリーの作成約ｌａｇ　（湿重量）のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　１ｈａｌｉａｎａ　Ｈｅ７ｎｈｏｌｄｌ　（ＬａｎＩｂｅｒｇ系跣の葉および茎よりＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ７．　（Ａｃｓｂｅｔ、　ＦＪＬ　ｅｔ　ｉｆ、ｅｄｓ、　）ｖｏｌ、　１．　ｐｐ、２．３．１−２．３．３　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ７　ａｎｄ　５ｏｎ刀A１９８７１の方法に従ってゲノムＤＮＡを調製した。

ゲノムＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩで部分分解し、ラムダファージベクターλ ＤＡＳＨ（Ｓｌ＋ａｔａｇｅｎ＋ｌのｂｍｍササイト挿入し、試験管内パッケージングキット（ＧＩＧＡＰＡＣＫ　ＧＯＬＤ：Ｓ＋＋ａ＋ａｇｅｎｅ　）を用いてλフアージ粒子にパッケージングし、ゲノムＤＮＡのλフアージライブラリーを得た。

（２）ＡＴａｓｅのゲノムＤＮＡフラグメントの単離ファージライブラリーを大腸菌Ｐ２３９２株（Ｓ＋＋ａ＋ａｇｅｎｅｌに感染させ、３枚のプレート（１０ｃｍｘ１４ｃｍ）（各プレート当りプラーク６刈０３〜６刈０４個）をスクリーニングした。ファージをフィルターに移し、このフィルターを５×デンハー）［（０，１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％牛血清アルブミン）、６刈ＳＣ（９０ｍＭ　ＮａＣｌ　、９０ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，４）、１０％硫酸デキストラン、０．１％ＳＯＳおよび１００μｇ／ｌｌ１ｌのサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中で６８℃に２時間保持した。

大腸菌ＡＴ−０３（ＦＥＲＭ　ＨＰ−３０９４）から単離したカポチャＡＴａｓｅのｃＤＮＡを有する組換えプラスミドｐＡＴ−０３から、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することにより〜カボチ＋（Ｃｕｃｕ＋ｈｉｆａ　ｍｏ＋ｃｈａ＋ａＤｕｃｈ）ＡＴａｓｅのｃＤＮＡの１゜４ｋｂ　フラグメントを得た。このｃＤＮＡフラグメントをニックトランスレーションにツクトランスレーションキット；宝酒造）に供し、３２Ｐ−ｄＡＴＰでラベルして比活性約１１０８ｄｐ／μｇのプローブを得た。

このプローブをハイブリダイゼーション溶液に加えてさらに５０℃、１２時間インキュベーションした。フィルターを２　Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＤＳ液中４０℃ で洗浄した後オートラジオグラフィを行い、プローブと強くハイブリダイズするファージを選抜した。

選択されたファージＤＮＡから制限酵素／／Ｊ旧によりシロイヌナズナのゲノムＤＮＡを切り出し、０．８％アガロースゲル電気泳動後、２．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを回収した。この断片はプローブに強くハイブリダイズした。これをプラスミドベクターｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ（Ｓｍ＋ａｇｅｎｅ）　にサブクローニングしてプラスミドｐ［ｌＢ２．６を得た。

実験例２　シロイヌナズナＡＴａｓｅのｃＤＮＡの単離（１）ｃＤＮＡライブラリーの作成約１５ｇ　（湿重量）のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ＋　山１ｉａｎａ　Ｈｅ７ｎｈｏｌｄｌ　（Ｌａｎ＋ｂｅ＋ｇ系總の葉および茎よりＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐ＋ｏｊｏｃｏｌ＋　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉａｌｏｇ７．　（Ａｎｔｂｅｌ、　Ｆ、ｍ　ｅｔ　ａｌ、　ｅｄｓ、）ｖｏｌ、１．　ｐｐ、　４，３．１−４．３．４　（ｌｏｈｎ　Ｗｉｌｅ７　ａｎｄ　５ｏｎ刀A　１９８７１の方法に従って全ＲＮＡを調製した。この全ＲＮＡをもとにＷｏｌｆらの方法（Ｎｕｃｌξｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｔ　１５：２９１１．　１９８７）に従ってポリ（Ａ）　ＲＮＡを調製した。

上記のポリ（Ａ）　ＲＮＡに対して相補的なりＮＡをファルマシア社のｃＤＮＡ合成キット（コードＮｏ、　２７−９２６０−０１）を使い、そのマニュアルに従ってオリゴ（ｄＴ）ヌクレオチドをプイラマーとして合成した。このようにして合成した２本鎖からなるｃＤＮＡの各末端には、／Ｆ／Ｉ認識配列を内部にもつＩｔｔｔＲＩアダプター（Ｐｈａｒｍｘｃｉａ）を付け、これをラムダファージベクターλ２ＡＰＩｌ　（Ｓ＋ｔａｊａｇｅｎｅｌのｈｔｔＲ１部位に連結した。このＤＮＡを、試験管内パッケージングキット（ＧＩＧＡＰＡＣＫ　ＩＩ　ＧＯＬＤ；　Ｓ＋＋ａ＋ａｇｅｎｅ）を用いてλフアージ粒子にパッケージングし、ｃＤＮＡのλ２ＡＰＩＩファージライブラリーを得た。

（２）ＡＴａｓｅ　ｃＤＮＡの単離上記のようにして得られたλフアージライブラリーを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株（Ｓｊｒ［ｔｇｅｎｅｌに感染させ、１プレート当りプラーク２Ｘ１０’個を含む５枚のプレート（ｌＯｃｍ　ｘ１４ｃＩＩｌ）をスクリーニングした。ファージをフィルターに吸着させ、このフィルターを６　ｘＳＳＣ、０，０５％スキムミルク、０．０２％アジ化ナトリウムを含むハイブリダイゼーション液中で６５ ℃に１時間保持した。シロイヌナズナＡＴａｓｅのゲノムＤＮＡフラグメントを含む組換えプラスミドｐＢＢ２．６　（参考例１（２））から、制限酵素１ｙＨＩで切断することによってシロイヌナズナＡＴａｓｅのゲノムＤＮＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントをニックトランスレーションにツクトランスレーションキット；宝酒造）に供し、３２Ｐ−ｄＡＴＰでラベルして比活性約１１０７ｄｐ／μｇのプローブを得た。このプローブをハイブリダイゼーション溶液に加えてさらに６５℃、１６時間インキュベーションした。フィルターを１刈ＳＣＳＯ，Ｉ％ＳＤＳ液中６５℃で洗浄した後オートラジオグラフィーを行い、プローブと強くハイブリダイズするファージを選抜した。

選抜されたファージＤＮＡから制限酵素ｈｚＲＩにより挿入ＤＮＡを切り出し、１％アガロースゲル電気泳動でサイズを測定した。ＤＮＡフラグメントの一つは約１，４ｋｂであった。このフラグメントをプラスミドベクターｐＢＬ［ｌＥｓｃＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｃａｅ）にサブクローニングしてプラスミドｐＡＲＡＴを得た。このフラグメントの塩基配列は、ジデオキシターミネーション法（Ｐ＋ｏｃ、　Ｎ＆ｌ　１．　Ａｃｘｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４：４７６７、１９８７）によって決定した。

挿入ＤＮＡの長さは１．４４５ｂであり、その中に１．３１１０ｂ　（終止コドンを含む）からなるオーブンリーディングフレーム（ＯＦ　Ｆ）が見いださね、この塩基配列を配列番号１に示す。このオーブンリーディングフレームとカポチャＡＴａｓｅのＣＤＮＡの塩基およびアミノ酸配列と高い相同性があることから、８１１番号１の塩基番号１６から１．３９２のＤＮＡ配列は葉緑体へのトランジットペプチドを含む４５９アミノ酸２分子量５０．４３１からなるシロイヌナズナＡＴａｓｅの前駆体をコードしていると推定された。オーブンリーディングフレームの上流及び下流には、それぞれ１５１１および５３ｂからなる５′非翻訳領域および３′非翻訳領域が存在した。配列番号１に示されているアミノ酸配列−９０から−１はカポチャＡＴａｓｅとの比較から葉緑体へのトランジットペプチドと推測される。

（１）大腸菌発現ベクターの構築参考例２（２）で得られたプラスミドＤＡＲＡＴを制限酵素１７ノＩ　（配列番号１の塩基番号２８５の後を切断する）と／ｒ／ＲＩ（切断部位はｃＤＮＡの下流のベクター配列中にある）で切断した。低融点アガロースゲル電気泳動後シロイヌナズナＡＴａｓｅのｃＤＮＡを含む１．　ｌｋｂのフラグメントを、単離し、Ｋｌｅｎｏｖフラグメントで平滑末端処理した。一方プラスミドｐＥＴ３ｃ　（ｌｌｏｖａｇｅｎ）を制限酵素ｈｉ旧で切断し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端処理した後、大腸菌のアルカリホスファターゼにより５′末端のリン酸基を除去した。このようにして得たシロイヌナズナＡＴａｓｅのｃＤＮＡフラグメントとｐＫＴ３ｃをＴ４　ｆｉｌｌ＾ライゲースを用いて連結し、Ｔ７プロモーター、Ｔ７リーダー配列、シロイヌナズナＡ、Ｔａ５ｅのｃＤＮＡおよびＴ７ターミネーターを含む発現用ベクタープラスミドｐＡＲ１を得た。

大腸菌ＡＴ−０３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３０９４）から調製したカポチャＡＴａ、ｓｅのｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＴ−０３を、制限酵素ｈｔｐＲＩと＃／ｌで切断後、低融点アガロースゲル電気泳動で１．２ｋｂのカポチャＡＴａｓｅのｃＤＮＡを単離し總このフラグメントをＫｌ！ｎｏｖフラグメントで平滑末端とし、大腸菌のアルカリホスファターゼで５′　−末端のリン酸基を除去した。このようにして得たカポチャＡＴａｓｅのｃＤＮＡフラグメントとｐＥＴ３ｃをＴ４ＤＮＡライゲースで連結してＴ７プロモーター、Ｔ７リーダー配列、カポチャＡＴａｓｅのｃＤＮＡおよびＴ７ターミネーターを含む発現用ベクタープラスミドｐｓＱ１を得た。

大腸菌ＢＬ２１　（ＤＥ３）　（Ｎｏｖａｇｅｎ）のコンピテントセルをＭｏ１ｅｃｕｌａ＋　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　＋　＋　ａ　１．　ｅｄ＋、　）　ｆｌｉｔ、　２５０−２５１　（１９８２）の方法に従って調製した。得られたプラスミドｐＡＲ１とｐｓＱｌをそれぞれコンピテントセルに導入し、アンピシリンによる選別によりそれぞれの形質転換体ＢＬＡＲＩおよびＢＬＳＱＩを得た。

形質転換体ＢＬ人Ｒ１およびＢＬＳＱＩを５００　ｍｌのＬＨ培地（２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）にそれぞれ接種し、３７℃で培養した。培養液の濁度が、波長６ＧＯｎｏで０゜５０副になるまで培養を続けた。その後イソプロピルチオガラクトシドを最終濃度０．４−になるように加え、さらに３時間培養を続けてＡＴａｓｅタンパク質の発現を誘導した。１４．０００Ｘｚで１０分遠心分離して大腸菌を集め塩ペレットを５０　ｌＤＭ　ｂｉｓ＝ｆｔｃｌ　（ｐＨ７，４）で洗った後、ＨＭ緩衝液（４５ｍＭ　Ｔｒｉ＋−ＨＣｌ　（ｐＨ７゜４）、２　ｍＭ　ＤＴＴ、　１０％グリセロール、１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、ｌ　ｍＭ　Ｂｅｎｏｍｉｄｉｎｅ−ＨＣＩ、１０　μｇ／ｍｌ　１ｅｕｐｅｐ＋ｉｎ、　５　ｍＭ　６−ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｅ　ｘｃｉｄ　）に再び懸濁した。この大腸菌懸濁液を１０．０００　ｐｓｉでの圧力下フレンチプレスセルに通して細胞を破砕した。破砕液を１６．　［１ｉｌｆｌＸ　ｇで１θ分、さらにＩＨ，Ｏｉｌ　Ｘ　ｇで６０分遠心して、上溝を粗酵素画分として回収した。この粗酵素画分を１０％ポリアクリルアミドゲルＳＤＳ電気泳動で分離しクマシーブリリアントブルーで染色したところ、シロイヌナズナまたはカポチャのＡＴａｓｅが、相対分子量約４０．０１）０のタンパク質として検出された。

（２）ＡＴａｓｅ活性の確認１６：Ｄ−ＣｏＡとＬ−ＩＵ−１４ＣＩ　グリセロール−３−リン酸を基質として用い西日らの方法（Ｐｌａｎ）　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｔｉｏｌ、　２８：１０７１．　１９８７）により、粗酵素画分のＡＴａｓｅ活性を測定した。大腸菌形質転換体ＢＬＡＲＩおよびＢＬＳＱＩの粗酵素画分ちはいずれもＡＴａｓｅ活性（グリセロール−３−リン酸への１６０の転移）を示した。

それらの画分の比活性はそれぞれ２．ＧＯＧおよび５３０　ｎｍａｌ／ｍｉｎ　１■ｐｒａｔｅ１ｎであった。

得られたＡＴａｓｅの基質選択性をＦ＋ｅｎｔｘｅｎらの方法（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｔｉｏｌ、２１１１９５、　１９８７１　により解析した。反応混合液は、３０１ｎＭのグリセロール−３−リン酸、それぞれ１．ｓμＭのｆｌ −１４Ｃ１１６：０−　ＡＣＰと［１−１４Ｃ１１８：　ｌ−Ａ　ＣＰ、および約１１１０　ｐｍｏｌ／ｍｉｎ酵素活性相当の発現ＡＴａｓｅの粗酵素画分を含む。この測定はｐＨ７，４および８．２で行なった。その結果を表１に示す。シロイヌナズナＡＴａｓｅは、カポチャＡＴａｓｅと異なり、１８１１−　ＡＣＰに対して高い基質選択性を示した。

表１大腸菌で産生されたＡＴａｓｅの基買選択性ｃＤＮＡ源　リゾホスファチジン酸への取り込み※ １８：１／１６・０（ｐＨ）　７．　４　８．　２シロイヌナズナ　７３／２７　６５／３５カポチヤ　６８／３２　５６／４４１８　：　１−ＡＣＰおよび１．５μＭの［：１−１４Ｃ１１６：　０−ＡＣＰの存在下撚１　シロイヌナズナＡＴａｓｅのｃＤＮＡのタバコ植物体中での発現タバコは低温感受性植物であるが、低温感受性植物の中では比較的低温に強いと考えられている。シロイヌナズナＡＴａｓｅのｃＤＮＡを以下のようにしてタバコに導入して発現させた。

（１）植物発現用ベクターの構築植物発現型バイチリープラミドｐ［１ＩＨ１（ＣＩｏｎｉｅｃｈ）を制限酵素ｈｅＩとｈｚＨＩで切断し、にＩｅｎｏｖフラグメントで切断端を平滑末端とした後、Ｔ４　ＤＩＩＡライゲースを用いて両末端を連結した。こうして得たプラスミド９１１１１２１　（−ＧＵＳ）はβ−Ｇ［ＩＩｃｕ＋ｏｎｉｄａｔｅ　（ＧＵＳ）遺伝子を含まない。このプラスミドはカリフラワーモザイクウィルスの３５５プロモーター（以後、３５Ｓプロモーターと呼ぶ）とツバリン合成酵素（ＮＯ３）のターミネータ−の間に制限酵素ｈＩＩとＩｔｓ旧のサイトをユニークサイトとして有する。

実験例２で得たプラスミドＰＡＲＡＴを！ｔ／ＲＩで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動によりシロイヌナズナＡＴａｓｅのｃＤＮＡの１．　４ｋｂフラグメントとべフタ−ＤＮＡを分離した。ｃＤＮＡフラグメントをゲルから切り出して精製し、Ｋｌｅｎｏｖフラグメントで切断端を平滑末端とした。一方上記で得たプラスミドｐＢｌ１２１　（−ＧＵＳ）を制限酵素！ｊ／１で切断後、両末端を平滑末端とし、ｃＤＮＡフラグメントを、この平滑末端部位にクローニングし、３５Ｓプロモーター、シロイヌナズナＡＴａｓｅのｃＤＮＡおよびＮＯＳターミネータ−を含む発現用プラスミドｐＢｉ１２１−３５ＳＡＲＴを得た。

（２）　ｐＢ１１２＋−３５ＳＡＲＴのアグロバクテリウムへの導入Ａｇｒｏｂａｃｊｅ＋１ｕＩＩｌ＋ｕｍｅｆａｃｉｅｎ＋　［、ＢＡ４４［１４（ＣＩｏｎｊｅｃｈｌ　を、５０ｍ１のＹＥＢ培地（ビーフェキス５ｇハ、酵母エキス１ｇハ、ペプトン１ｇハ、ショ糖５ｇ／ｌ、２ｍＭＭｇ５０４、ＰＨ７，４）　１．：接種し、２８℃テ２４時間培養後、培養液ヲ３．００Ｏｒｐｍ　、　４℃、２０分の遠心で集菌した。菌体を１０ｍ１の１１ΩＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐ［１７，４）　で３回洗った後、３ｍｌの１０％グリセロールで１回洗い、３Ｉ１１１の１０％グリセロールに懸濁してプラスミド導入用菌液とした。

アグロバクテリウム菌液５０μＩおよびｐＢ１１２１−３５ＳＡＲ７１ｇｇをキュベツトに人ね、エレクトロポレーション装置（Ｇｅｎｅ　Ｐｕｔｓｅ＋ＨＢｉｏ　−Ｒａｄ　）を用いて２５μＦ　。

２、５００Ｖ、　２０［１Ωの条件で電気パルスをかけ、プラスミドＤＮＡをアグロバクテリウムに導入した。このエレクトロポレーション処理した菌液をエツペンドルフチューブに移し、８００μｌのＳＯＣ培地（トリプトン２０　ｇ／Ｌ酵母エキス５　ｇ／１ＳＮａＣｌ　０．５　ｇ／ｌ、　２．５　ｍＭ　ＫＣＩ、　ｐＨ７，０）を加え、２８℃で１．５時間静置培養した。この菌液５０μｍを、１００　ｐｐＩｌｌのカナマイシンを含むＹＥＢ寒天培地（寒天１．２％）上にまき、２８℃で２日間培養した。

得られたコロニ一群からシングルコロニーを選んだ。このコロニーを培養しアルカリ法でプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡを適当な制限酵素で消化後１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡフラグメントを分離し、３２ＰでラベルしたシロイヌナズナＡＴａｓｅのｃＤＮＡをプローブとしたサザン分析により、プラスミドｐＢ１１２１−３５５ＡＲＴが含まれていることを確認した。このアグロバクテリウムをＡＬＢＳＡＲＴと呼ぶ。

（３）タバコの形質転換ＡＩ、ＢＳＡＲＴを、５０ｐｐｍのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で２８℃、１２時間培養した。培養液１．５ｍｌを１０．０００　＋ｐｍ、　３分間遠心して集菌後、カナマイシンを除（ために１ｍｌのＬ８培地で洗浄後集菌し、１．５１１１１のＬＨ培地に再懸濁して感染用菌液とした。

若いタバコ葉を０．５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１０分間浸せき後、滅菌水で３回洗い、滅菌済みの濾紙上で余分の水を拭った。この葉を１片が１　ｃｍ２になるように無菌的に切断し、ＡＬＢＳＡＲＴ菌液上に葉の裏を上にして置き、２分間静かに振とうした後、滅菌済み濾紙上に葉を置いて過剰の菌液を除いた。ＭＳ−Ｂ５培地（ベンジルアデニン１．　Ｏｐｐｍ　、ナフタレン酢酸０．　ｌ　ｐｐｍおよび寒天０．８％を含むＭＳ培地）　（Ｍｕ＋ａｓｈｉｇｅ、　Ｔ、ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ、　Ｆ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ７＋ｉａ１．、１５：４７３．　１９６２）上に、１田１のトマト（品種「くりこま」）の懸濁培養細胞を広げた。ワットマンＮｏ、　ｌ濾紙（φ７、Ｏｃｍ　）をトマト細胞懸濁培養液上に置き、この濾紙に裏を上にして葉を置いた。シャーレをパラフィルムでシールし、１６時開明、８時間暗の周期で２５℃、２日間培養した。［特に記載されない限り、タバコ外植片または／および植物体はこの条件で培養した。］ついでクラホラン（ヘキスト）　２５０９９ｍを含むＭＳ−８５培地上に移し、さらにＩＯ日間培養してアグロバクテリウムを除去した。

次にクラホラン２５０　ｐｐｍおよびカナマイシン１００９１１１ｍを含む１９ −８５培地上に置床して、７日間培養した。この間に葉片の周囲がカルス化し、シュート原基が生じた。さらに１０日間培養後、伸長したシュートをクラホラン２５０９９ｍおよびカナマイシン１００　ｐｐｍを含むＭＳホルモンフリー培地に移して培養を継続した。１０日培養以内に発根したシュートを、カナマイシン耐性の形質転換体として選抜し、透明なプラスチック容器内のクラホラン２５０　ｐｐｍを含むＭＳホルモンフリー培地に移植した。

（４）形質転換タバコ植物体のウェスタンブロッティング分析乳棒と乳鉢を用いて８０ｍＭ　Ｔｒｉ＋−ＨＣｌ　（ｐｉ（６，８）、２％ＳＤＳ、　５Ｎグリセロール、７２０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む抽出バッファー中で湿重量０．５ｇのタバコ葉をすりつぶした。つぶした葉をバッファーごとエツペンドルフチューブに入ａ、１００℃で３分間熱処理した後、［５，０００ｔｐｍ、　２０℃、１０分間の遠心で上清を回収し全タンパク質粗抽出液を得た。この粗抽出液中のタンパク質濃度をタンパク質アッセイキット（［１ｉａ−Ｒａｄ）を用いて定量し、１ｇｇ／μｍの濃度に調製した。

全タンパク質粗抽出液１０μｌをサンプルローディング用バッファーと混合し、Ｌｘｅ＋ｎｍ１ｉ（Ｌａｔｕｒｅ、２２７：６ｇ０．　１９７０１の系に従い５Ｏ３−ＰＡＧＥゲル（第一化学）を用いて電気泳動を行い、タンパク質を分離した。

分離したタンパク質を電気プロッティング装置（アト−）を用いて０１０２５　Ｍ　Ｔ＋ｉｓ、　０．１９２　Ｍグリシン、２０％エタノール、０．０１％ＳＯ３を含むプロッティングバッファー中、１００ｖで１時間、　ＰＶＤＦメンブレンフィルター（ミリポア）にブロッティングした。

このメンブレンを、ミルク液（５％　スキムミルク（ＤＨｃｏ）　、ｌ０ｍＭ　Ｔ＋ｉｓ−［ＩＣＩ、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ　ＳＯ，０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ｓ　０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７，２）に浸し、室温で１０分間の振とうを３回くり返して洗った。さらにミルク液中で室温、３時間インキュベーションし、抗体の非特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行った。その後ＴＢＳ−Ｔバッファ　−（Ｉｎ　ｍＭ　Ｔ＋１５−ＭＣｌ、１５０　ｍＭ　ＮｌＣｌ　、０．０５％　Ｔｖｅｅｎ−２［１，０，０５％ＮａＮ　３、ｐｌ（７，２）で３分間の振とうを２回くり返してメンブレンを洗った。このメンブレンを、ＴＢＳ−Ｔバッファーで５００倍に希釈した抗シロイヌナズナＡＴａｓｅマウス抗血清中で室温、２時間インキュベーションし、続いて、ミルク液中で室温、１０分間の洗しようを３回、さらにＴＢＳづバッファー中で室温、３分間の洗じょうを２回行った。

抗体と反応するタンパク質はＶｅｃ４ａＮａｉｎ　：へＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒｉ、ａｂｏ＋ａ＋ｏ＋ｉｅ＋）を用いて、ペルオキシダーゼの反応により発色させて確認した。

形質転換タバコより抽出した全タンパク雪中には、シロイヌナズナＡＴａｓｅに対する抗体と反応するタンパク質が検出さね、その発現量はタバコ葉全タンパク質の約０，５％の量程度であった。

西４　形質転換タバコ葉のホスファチジルグリセロールの脂肪酸組成タバコ形質転換体および、対照の非形質転換タバコ植物体の葉からホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を抽出し、その脂肪酸組成を分析した。

（１）全脂質の抽出全脂質の抽出はＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法（Ｃａｎ、１．　Ｂｉｏｃｈｅａ　Ｐｈ７＋ｉａ１．、３７：９１１．　１９５９）で行った。０１％のブチルヒドロキシトルエンを含むイソプロパツール５ｍｌを８０℃に温めて置き、そこに湿重量２ｇの葉をメスで細断して素早（入わ、８０℃で５分間処理後、室温に冷やした。これに２０の１のクロロホルム：メタノール（１：２、体積比）を加え、ホモジナイザーで葉を破砕後、１５分間静置した。これにクロロホルム１２ｍ１および蒸留水１２の１を加え激しく混合した後、３，０００＋ｐＩｌｌ、　４℃、３０分間の遠心で水層と有機層に分けた。有機層（下層）を回収し、これに適当量のエタノールを加えた後、ロータリーエバポレーターを用い、３０℃減圧下で乾燥させた。これを２ｍｌのクロロホルム：メタノール（１：　４、体積比）に溶かし、全脂質抽出物とした。

（２）脂質の分画ＤＥＡＥ−Ｔｏ７ｏｐｅａ＋ｌ　６５０Ｃ（東ソー）の懸濁液２５ｍ１を１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ７、０）　２５　ｍｌと混ぜ活性化した。これを蒸留水、メタノールで洗浄し、最後にメタノールに懸濁して、内径２ｃｍのカラムに高さ１．５ｃｍまで詰めた。さらにカラムを５０１１のクロロホルム；メタノール（１・４、体Ｕで洗浄した。

全脂質抽出物をカラムにのせ、まず５０ｍ１のクロロホルム：メタノール（１：４、体積比）でモノガラクトシルジアシルグリセロールおよびジガラクトシルジアシルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンを溶出して除いた。次に５ｍｌの酢酸でホスファチジルセリンを溶出して除き、最後に５０ｍ１のクロロホルム：メタノール：１０Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（２０８０：０．２、体積比）でＰＧ、スルフオキノボシルジアシルグリセロール、ホスファチジルイノシトールを含む画分を得た。この両分に１５ｍ１のエタノールを加え、減圧下で溶媒を除去した後、１ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：　１、体積９に溶かした。

この画分をシリカゲル−ＴＬＣプレート（＃５７２１　（Ｍｅ＋ｅｋ）を用い、クロロホルム：アセトン・メタノール：酢酸：水（５０：２０：１０：１５：５、体ｌυを展開溶媒として分離しＰＧを分画した。ＴＬＣで分離後、プリムリンを噴霧して蛍光発色させ、標準となるＰＧと移動度を比較することによりＰＧを同定した。

（３）脂肪酸分析ＰＧの画分をシリカゲルごとＴＬＣプレートからかきとり、スクリューキャップ付試験管に入れた。これに２．５ｍｌのメタノール性５％塩酸を加え、完全密閉下８５℃で２時間半反応させ脂肪酸をメチル化した。生じた脂肪酸メチルエステルを５ｍｌのへキサンで４回抽出し、抽出物を減圧下で濃縮し、ガスクロマトグラフィーで分析した。脂肪酸の同定は標準脂肪酸メチルエステルの保持時間との比較を（、て行い、定量にはクロマトパックＣ−Ｒ２ＡＸ　（島津製作所）を用いた。結果を表２に示す。

ＰＧの飽和脂肪酸（ｉ６：ｆｌ＋１６．ｌｔ＋ステアリン酸（１８：０））含量は、対照の非形質転換タバコでは６８±１％であるのに対し、シロイヌナズナＡＴａｓｅを発現している形質転換タバコでは５３土１％と低くなっていた。ＰＧの５ｎ−２位には１６０と１５：１．＋のみが結合していることを考えると、ＰＧ中の飽和分子種含量は、非形質転換タバコで３６±１％、形質転換タバコで２６±１％と計算される（表２）。

表２ＰＧの脂肪酸および分子種組成植　物　１６　：　Ｏ＋１６　：　１ｔ＋１８・０　飽和分子種非形質転換タバコ　６８±１％　３６±１％シロイヌナズナ　６０±１％　２０±２％形質転換タバコ　６３±１％　２６±１％例１で得たタバコ形質転換体および、対照の非形質転換タバコ植物体から、無傷葉緑体を調製し、そのタンパク質を分析した。

（１）無傷葉緑体の調製あらかじめ３ｈｌのホモジナイズバッファー（５０ｍＭ　ピロリン酸ナトリウム、１１Ｉｌｕ　ＭｇＣｌ、　、ＬｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ　、　２−イソアスコルビン酸ナトリウム、ａ、　ｉＸ　ラン血清アルブミン、３３０ｍ１ノルビトール、ｐＨ７，８）を水中に冷や（、ておき、そこに湿重量１０！の葉をはさみで細断して素早く大ベボリトロノで粗く葉を破砕後、ミラクロス４層で濾過した。

濾液を２．１）ｆ）ＱＸ４．４℃、２分の遠心後、沈澱を回収し、３　ｍｌ　ノ懸濁用バッフ７−　（５０ｍＭ　［ｉｅｐｅｓ−Ｎａ１Ｍ　、３３０　ｍＭ　ソルビトール、ｐＨ７，６）を加え、筆で完全に懸濁した。ｌ［ｌＯＸｇ、４℃、２分の遠心で破砕物を除いた後、上清を２．ＨＯＸ［，４℃、２分で遠心し葉緑体画分を沈殿として回収した。この沈殿に１＠１の懸濁用バッファーを加え、筆で完全に再懸濁したパーコールＲの濃度勾配（下から、８０％２．６ｍｌ　、４０％１２ｍ１．１５％５．４ｍ１）を４℃で調製ししばらく放置した。上記葉緑体懸濁液をパーコールに載せ、７，０ＯＯＸ主、４℃、１５分遠心した。無傷葉緑体を８０％と４０％のパーコールの境界に緑色バンドとして分離し、これに５倍量の懸濁用バッファーを加えて洗い、２．００ＱＸｇ、４℃、５分の遠心によって沈殿として回収した。

（２）葉緑体全タンパク質の分析無傷葉緑体を、４００μｍの抽出バッファーに懸濁し、葉緑体全タンパク質を例１（４）と同様にして調製した。葉緑体全タンパク質１０μｇを、例１　（４）と同様の方法で、ウェスタンブロッティング分析した。その結果を東１図に示す。

形質転換タバコの葉緑体全タンパク質中に、シロイヌナズナＡＴａｓｅに対する抗体ど反応する、タンパク質が検出された。これは、タバコに導入し発現させたシロイヌナズナＡＴａｓｅが、タバコ葉緑体に移行していることを示しているさらに、形質転換タバコの無傷葉緑体から可溶性タンパク質を調製し、ウェスタンブロッティング分析をした。その結果可溶性タンパク質中にシロイヌナズナＡＴａｓｅに対する抗体と反応する、タンパク質が検出された（表示せず）。これは、葉緑体に輸送されたシロイヌナズナＡＴａｓｅが、葉緑体中のストロマに存在していることを示している。

るために、タバコにカポチャＡＴａｓｅをコードするｃＤＮＡを導入して発現させ、タバコ本来の組成よりもＰＧの飽和分子種含量が高くなった形質転換タバコを作製した。実験例３の表１に示されているように、カポチャＡＴａｓｅは１８１−ＡＣＰに対する基賀選択性がなく、１８ＩとＥ６ａをほとんど同程度にグリセロール−３−リン酸の５ｎ−１位に結合させる。

カポチャＡＴａｓ　ｅのｃＤＮＡはすでに発明者らによってクローニングされ、その塩基配列が公知となっている（ｌｓｈｉｚａｋｉｉＮｉ＋ｈｉｚａｙａ）、０．　ｅ＋　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ＋、、２３８４２４．　１９８８　）。

従って、この配列の情報に従い、化学的ＤＮＡ合成あるいはＰＣＲＣ等法伝子工学分野で通常用いられている任意の合目的方法により取得することが出来る。

カポチャＡＴａｓｅを形質転換タバコ植物体中で発現させるにあたっては、ＡＴａｓｅは、葉緑体中で機能する酵素なので、発現したＡＴａＳｅが葉緑体に輸送されるようにしなければならない（本発明の詳細な説明を参釦。そこでこの輸送が確実に起きるように、シロイヌナズナＡ、Ｔａ５ｅのトランジットペプチド部分（配列番号１のアミノ酸−９０から−１）をコードするＤＮＡ配列を、カポチャＡＴａ　ｓ　ｅの成熟タンパク質をコードするＤＮＡ配列とリーディングフレームが合うように結合させた。

ｐＡＲＡＴ　償験例２（２））を制限酵素／／／ｌ（配列番号１の塩基番号２８５の後を切断する）とｈσ１　（切断部位はｃＤＮＡの上流のベクター配列中にある）とで切断した。シロイヌナズナＡＴａｓｅのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む３２Ｑｂのフラグメントを単離し、１ａｎｏｖフラグメントで切断末端を平滑化した。

一方、カボチ＋ＡＴａＳｅのｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＴ−０３（Ｉｓｈｉｚａｋｉ　ｆＮｉｓｂＩｏｖａ）、Ｏ，ｅ＋　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｌａｔ＋、、２３８：４２４．　１９８８）を制限酵素、／ｃａＲＩで切断し、＋、ｎｂのカポチャＡＴａｓｅのｃＤＮＡ断片を単離し、プラスミドｐＵｃ１９　Ｃ宝酒造）のｈρＲ１サイトに挿入し、プラスミドｐ［１ｃＩ９／ＡＴＯ３を作製した。このプラストを制限酵素ｈｔｌで切断し、に１ｅｎｏマフラグメントで切断末端を平滑化した。

これら二つのＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡライゲースを用いて結合し、トランジットペプチドをコードするＤＮＡフラグメントが、カポチャＡＴａｓｅのＣＤＮＡに対して順方向に一つ挿入されたプラスミドｐＳＱＡＲを選抜した。ｐｓＱＡＲには、５′側から順に、カポチャＡＴａｓｅｈランジットペプチド（のおそらくは一部）と、シロイヌナズナＡＴａｓｅのトランジットペプチドとカポチャＡＴａｓｅの成熟タンパク質が融合した融合タンパク質とがコードされており、その間にはｐＡＲＡＴ由来のマルチクローニング部位がある。この融合タンパク質が形質転換植物の細胞内で発現して葉緑体中に移行した場合に生成されると考えられる成熟タンパク質のアミノ酸１％１７＋１は、Ｎ末端から二番目のアミノ酸がプロリンからロイシンに置換されていること以外は、カポチャＡＴａｓｅの成熟タンパク質本来の配列と同一であると考えられる。

９ＳＱＡＲから制限酵素ｈσＲ１で前記融合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを切り出し、Ｋｌｅｎｏｖフラグメントで切断末端を平滑化した後、植物形質転換用ベクターｐ８１１２１　（ＣＩｏｎ４ｅｃｈ）のＪ”ＪＩ／　ｌサイトに挿入し、プラスミドｐＢ１１２１−３５ＳＳＱＡＲを得た。このベクタープラスミドは、３５Ｓプロモーター、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列およびＮＯＳターミネータ−を含み、さらに融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列とＮＯＳターミネータ−の間にβ−ｇｌｕｃｕ＋ｏｎｉｄａｓｅの構造遺伝子が挿入されている。

ｐＢ１１２１−３５ＳＳＱＡＲを用いて、例１の（２）、（３）と同様にしてタバコを形質転換し、カポチャＡＴａｓｅが発現している形質転換タバコを作製した。例２と同様にして、得られた形質転換タバコの葉からＰＧを抽出してその脂肪酸組成を調べたところ、飽和脂肪酸（１６：０＋ｆ６：Ｉｔ−Ｈｉｔ：Ｏ）含量は７２±１％であり、これから計算される飽和分子種含量は４４％であった。

これは非形質転換タバコの３６％（表２参照）よりも高くなっており、得られた形質転換タバコのＰＧの脂肪酸組成か低温感受性型に変わっていることを示す。

なお、カポチャ葉のＰＧの飽和分子種含量は６４％である。

光合成は高等植物にとって最も主要かつ重要な生物学的反応の一つであり、その活性低下は、すなわち植物体全体の生理学的活性の低下につながる。従って、従って、例１．４の形質転換タバコおよびその対照としてベクタープラスミドｐＢ１１２１で形質転換したタバコの葉をそれぞれ用い、低温処理前および低温処理後の光合成による酸素発生活性を測定し比較した。

気相酵素測定用クラーク型酸素電極を用いて葉の酸素発生活性を測定した。温度可変型チャンバー内のり−ツブイック用酵素電極（Ｈｘｎｚｔｊｅｃｋ、ＬＤ２１上に湿らせたスポンジマットを敷き、その上に健全葉から採取した８、５〜ｌ０ｃｍ２の葉片を葉の裏を下にして置いた。１００Ｗタングステンランプ（ａｌｆｉ！！＋ｅｅｈ　％　ＬＳ２　）の光を熱遮蔽フィルター（ｔｌｏ７ａ、　ＨＡ−５０）に通して葉に照射した（１．０００　ｔｔＥ・ｍ−２・５ｅｃ−’）。チャンバー内の気相を７分ごとに５％二酸化炭素を含む空気で置換しながら、２７℃で、約９０分間連続的に葉片の酸素発生活性を測定した後、チャンバー内の温度を１℃に下げた。葉片を活性測定時と同じ光照射下、４時間放置し、その後チャンバー内の温度を２７℃に戻し、低温処理前と同様にして葉片の酸素発生活性を測定した。例１．４で得た形質転換タバコおよび対照のベクターｐＨ１１２１で形質転換したタバコ（すなわち低温感受性に関しては非形質転換タバコと同じである）について得られた結果を第２図に示す。

低温処理前、低温処理後とも、時間とともに酸素発生活性が徐々に上昇し、ある時間後にほぼ定常値に達した。この時の活性をそれぞれ低温処理前、低温処理後の活性とし、それらの比を表３に示すように低温感受性の指標としてめた。

表３低温処理（１℃）による形質転換タバコの光合成活性の低下タバコ　酸素発生活性の変化拠理後／処理前）ｐＢ１１２１形質転換体８１　０．８６＃２　０．７０＃３　Ｇ、７３シロイヌナズナＡＴａｓｅ　ｃＤＮＡ形質転換体＃１　０．９１＃２　０．９６＃３　０．９３＃４　０．９０カポチャＡＴａｓｅ　ｃＤＮＡ形質転換体＃１０．５３１２　０．４１対照のｐＨ１１２１形質転換タバコの酸素発生活性は、１℃、４時間の低温処理で処理前の７０−８６％に低下したのに対し、シロイヌナズナＡＴａｓｅ　ｃＤＮＡ形質転換タバコでは、同じ低温処理で酵素発生が処理前の９０−９６％にしか低下しなかった。このことはシロイヌナズナＡＴａｓｅ　ｃＤＮＡ形質転換タバコの酸素発生活性が、対照よりも低温に強くなっていることを示している。従ってこれは、シロイヌナズナＡＴａｓｅ　ｃＤＮＡ形質転換タバコが対照より低温に強くなったことを示していると結論できる。

これとは逆に、カポチャＡＴａｓｅ　ｃＤＮＡ形質転換タバコでは、１℃、４時間の低温処理で酸素発生活性が処理前の４１−５３！ＩＩにまで低下したが、この低下率は、対照より有意に大きく、カポチャＡＴａｓｅ　ｃＤＮＡ形質転換タバコが対照に比べて低温に弱くなった事を示している。

例６　形質転換タバコ植物体に対する低温処理の影響例１で得た形質転換タバコ、および対照の非形質転換タバコおよびｐＨ１１２１形質転換タバコの全植物体に対する低温処理の影響を調べた。

透明のプラスチック容器内で生育させたタバコ植物体の上部を切断し、それぞれをプラスチック容器内のクラホラン２５０ｐｐｍを含むＭＳホルモンフリー培地に移植し、１６時間明、８時間暗の周期で２５℃、２週間生育させた。この間に移植片は発根し、３〜４枚の葉を持った植物体に生育した。

このように生育したタバコ植物体をプラスチック容器ごと、庫内１℃のグローＣの蛍光燈照射下、１０日間低温処理した後、低温処理前の生育条件で２日問おき、植物体の低温傷害を観察した。第３図は低温処理前および処理後の、シロイヌナズナＡＴａｓｅを発現している形質転換タバコ植物体の１クローンおよび対照のｐＨ１１２１形質転換タバコを示している。

対照の非形質転換タバコおよびｐＨ１１２１形質転換タバコは、低温処理によって葉の多くが白色化した。これは低温により葉緑体が破壊（クロロシス）されたためである（第３図上部）。これに対し、シロイヌナズナＡＴａｓｅ　ｃＤＮＡ形質転換タバコは同じ低温処理によってほとんど傷害を受けずｆｆ３図下部）、対照のタバコより低温に強いことを示している。

以上の例は、本発明の技術の適用によって低温耐性植物のＡＴａｓｅを低温感受性植物に導入・発現させ、この植物のＰＧの飽和分子種含量を低下させることにより、低温感受性植物に低温耐性を賦与できることを証明している。またＰＧの飽和分子種含量をさらに高めるように操作されたタバコ植物体が低温傷害に対してより感受性になったことは、低温感受性とＰＧの分子種組成との相関をさらに裏付けるものであり、本発明による高等植物への低温耐性賦与技術が種々の農作物に対して普遍的応用性があることを強く示唆している。

本発明により、低温感受性植物に低温耐性を付与する遺伝子工学技術がはじめて提供された。低温感受性農作物に低温耐性を付与することの重要さはすでに前記した通りであり、本発明の農業上貢献は計り知れない。

配列表一般的情報：発明者：西沢治（出願人（米国のみ）：西沢治）発明の名称：低温耐性植物およびその作製法配列番号＝１優先権主張；出願番号二日本国特許出願、特願平３−１５８８３号出願日　：１９９１年１月１６日出願番号：日本国特許出願、特願平３−２８３８０７号出願日　・１９９１年１０月４日出願日　：１９９１年１０月４日配列番号：１特徴配列の長さ　１４４５　ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ起源生物名：アラビ　ドブシス　サリアーナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）株名：　Ｌａｎｓｂｅｒｇ配列の特徴特徴を表す記号：　５’ＵＴＲ存在位置：　１．、Ｉ５特徴を決定した方法二　Ｐ特徴を現す記号：　ＣＤＳ存在位置：　１６．．１３９５特徴を決定した方法二　Ｐ特徴を表す記号：　＋ｒｉｎ＋ｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：　１６．．２８５特徴を決定した方法：　Ｓ特徴を現す記号：　ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：　２８６．、ｌ３９２特徴を決定した方法：　Ｓ特徴を現す記号：　３’ＵＴＲ存在位置＋　１３９６．、Ｉ４４５特徴を決定した方法二　Ｐ配列番号１の配列＾ＣＣＡＡＡＣＡＣＧ　ＣＴＴＴＡ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＣＴＣＡＣＧ　ＴＴＴ　ＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＡ　ＡＣＣ４８Ｍ５＋　Ｔｂｔ　Ｌｔａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｔ　Ｓｅｒ　Ｓａｔ　Ａｌｌ　Ａｌｌ　Ｔｈｔ−９０−１１５− １ｉｔ）ＧＴＴ　ＧＣＣＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＣ’ｒ　ＧＣＡ　ＡＣＣＧＴＡ　ＡＣＣ丁ＣＣＴＣＣＧＣＴ　ＡＧＧ　［ＩＴＴ　ＣＣＧ　ＧＴＴ　９６Ｙｔｌ　Ａｆｔ　Ｖｔｌ　Ａｌａ　Ａｌｌ　Ａｌｌ　Ｔｈｒ　Ｙｘｌ　Ｔｈｒ　Ｓａｔ　Ｓｅｒ　Ａｌｌ　Ａｒｇ　Ｖｉｌ　Ｐｒｏ　ＷｉｔＴＡＴ　ＣＣＡ　ＣＴＣＧＣＴ　ＴＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＣＧＴ　ＧＧＡ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＴＣＴ　ＴＴＣＡＧＡ　ＴＴＡ　１S４Ｔ７ｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅａ　Ａｆｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｔ　Ｔｈｒ　ＬｅｌｌＡｒｇ　Ｇ１７　Ｌｅａ　Ｙｔｌ　Ｓｅ【Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｇ−６０−５５−５ｆｔＡＣＣＧＣＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　ＣＴＧ　ＣＣＧ　ＣＣＴ　ＣＴＴ　ＣＧＴ　ＴＣＴ　ＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＴ　１９２Ｔｈｒ　Ａｌｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｔ　［’ｒａ　Ｐｔｃ　Ｌａｗ　ＡｔｇＳｅｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｉ７　ＶｉｌＡＧＴ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＣＴＡ　ＧＴＴ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＴＣＧ　ＴＣＣＧＴＣ２４O Ｓｅ＋　Ｖｘｌ　Ａｕｇ　Ａ、Ｉｉ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｓｕ　Ｖａｔ　Ｇｉｎ＾ｓｐ　Ｌｌｔ　Ｇｌａ　’Ｓｅｔ　Ｓｅｒ　Ｖｓ■ ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＡＧＣＡＴＴ　ＧＣＴ　ＴＴＣＡＡＴ　ＧＡＡ　ＧＣＣＧＣＣＧＧＴ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＣＣＧ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　２８８Ａｌｓ　Ａｌｉ　Ｓｅｒ　ＩＩｓ　ＡＩｌ　Ｐｂｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｆｔ＾１１　Ｇ１７　Ｇｉｎ　Ｔｂｒｔ’ｔｏ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＣＴＴ　ＡＡＴ　ＣＡＴ　ＴＣＣＣＧＴ　ＡＣＴ　ＴＴＣ１丁ＧＧ＾τ　ＧＣＧ　ＣＧＡ　ＡＧＴ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　３３U Ｌｅａ　ＡｔｎＨｉｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｕｎ　Ａｓｐ　Ａｌｘ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｌａｗ５　Ｉｏ　１５ＴＴＡ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＡＴＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　R８４Ｌｒｕ　Ｓｅｔ　ＧＩ７　１１ｅ　Ｌ７ｔ　ＬＴＩ　ＧＩＯＡＩｌ　Ｇ１１ｌ　Ａｌｌ　ＧＩＹ　Ａｒｇ　Ｌｅａ　［’ｒａ　Ａｆｔ　Ａｓ■ Ｇ丁丁　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＴＡＴ　ＴＧＧ　ＡＡＣＴＡＣＡＡＡ　ＡＡＴ　ＧＣＡ　ＧＴＴ　４R２ＴＴＡ　ＡＧＴ　ＡＧＴ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＴＣＣＡＧＧ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＴＣＡ　ＡＡＣＡＴＧ　４W０ＬｅｕＳｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇ１７　Ａｆｔ　Ｓｅｒ　ＡｒＨＡｌｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｂｔ　Ｍｅｌ　Ｖｔｌ　Ｓａｔ　Ａｓｎ　Ｍｅｊ８　５０　５５　６Ｑ　６５ＴＣＴ　ＣＴＴ　ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＧＣＡＴＧ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＣＴ　５２８Ｓｃｒ　Ｖｘｌ　Ａｆｔ　Ｐｈｅ　ＡＨＡｒｇ　ＭｃＬ　Ｌｅａ　Ｌｅａ　ＧＩＴ　Ｖａｔ　Ｇｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　丁７ｒ　丁ｈｒ５　７Ｏ７５８ＧＴＴＴ　ＡＡＴ　ＣＣＡ　ＴＡＴ　ＣＡＴ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＴＴＴ　ＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧ　５７６Ｐｈｅ　Ａｓｓ　Ｐｅａ　Ｔ７ｒ　Ｈｉｓ　Ｌ７ｓ　Ａｆｔ　Ｖａｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｏ　Ｐｅａ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｔ７ｒ　Ｔｙｔ　１ｉｅ■ ８５　’　９０　９５ＴＴＴ　ＧＴＣＣＡＴ　ＡＣＡ　ＴＡＣＡＴＣＣＧＴ　ＣＣＴ　ＣＴＴ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣＡＡＡ　ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＴＡＣ６２４Ｐｈｅ　Ｖｓｌ　ｌ１ｉｓ　Ｔｈｒ　Ｔ７ｒ　ＩＩｓ　＋Ａｒｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｌ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌ７ｓ　Ａｎ　Ｓｅｔ　Ｔｙ■ ｔｏｏ　１０５　１１ＧＧＴＴ　ＧＧＡＡＡＴ　ＧＣＴＴＣＴ　ＡＴＡ　ＴＴＣＴＣＴ　ＧＡＧ　ＣＴＧＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＴ　ＣＧＡ　ＣＡＧ　６）２Ｖｔｌ　Ｇ１７　Ａｓａ＾Ｉｔ　Ｓｅｔ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　ＬＹｓ　ｌｌｅ　Ａｒｇ　Ｇ１ｍ１１５　１２ｆｉ　１２５ＧＧＡ　ＣＡＣＡＡＴ　ＡＴＣＧＴＧ　ＴＴＣＡ丁Ａ　丁ＣＡ　ＡＡＣＣＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＴ　ＧＡＡ　ＣＣＴ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　７２０ＧＩＹＨｉａ　Ａｔｍ　ｌｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅａ　ｌｉｅ　Ｓｅｔ　Ａａｎ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌｉ　Ａｓｐ　Ｐ＋。

ＧＣＴ　ＧＴＣＡＴＴ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＴＴＧ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＴＴＣＡＴＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　７UｇＡｆｔ　Ｖｉｌ　ｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｇ　Ｌａｗ　Ｌｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｌｌ　Ｇｌｎ　Ｓｅｔ　Ｐｔｏ　Ｐｈｅ　［ｌｅ　Ｇ［７ＧｌｕＡＡＣＡＴＴ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＣＧＡ　ＧＴＣＡＴＣＡＣＴ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＣＴＴ　ＴＧＴ　８１U Ａ＋ｎ　ｌｉｅ　１４＋　Ｃｙｓ　Ｖｘｌ　Ａｌａ　ＧＩＴ　Ａ１１ｌ　Ａｒｇ　Ｖｉｌ　Ｉｌｅ　Ｔｂｔ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅａ　Ｃｙ■ ＡＡＧ　ＣＣＧ　ＴＴＣＡＧＴ　ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＡＡＣＣＴＣＡＴＡ　ＴＧＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣＴＣＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　８６４Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｔ　Ｔｏｔ　ＧＩ７　Ａｒｇ　Ａｓａ　ＬＩＩＩＩ　ＣＦＩ　Ｖｌｌ　Ｔ７ｒ　Ｓｅｒ　Ｌ７ｍ　Ｌ７ｔＣＡＣＡＴＧ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＧＡＣＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣ９１Q Ｈｉｓ　Ｍｅｌ　Ａｓｎ　Ｖｘｌ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅａ　Ｖａｌ　Ａｔｐ　Ｍｅｔ　ＬＴＩ　Ａｒｇ　Ｌｙｔ　Ａｌｉ　ＡｓｎＡＣＡ　ＣＧＡ　ＡＧＣＴＴＡ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＡＴＣＧＣＴ　ＡＣＡ　ＡＴＧ　ＣＴＡ　ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＧＧＣＧＣＴ　ＣＡＡ　９６■■ Ｔｈｒ　Ａｕｇ　Ｓｅｒ　ＬｅＩｌＬｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｊ　ＡＩｌ　Ｔｂｔ　Ｍｅｊ　Ｌｅｅ　Ａｒｇ　Ｓａｔ　Ｇ１７　Ｇｌｌ　ＧＩｎＣＴＴ　ＡＴＡ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＡＧＣＧＧＴ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＧＡＣＣＧＣＣＣＧ　ＡＡＴ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　１０O１１Ｌｅａ　Ｉｌｅ　Ｔａｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｔ　Ｇ１７　Ｇ１７　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｔｇ　Ｐｔｏ　ＡｓＩＩＰｒｏ　５ｅｒＡＣ丁　ＧＧＧ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＧＣＡ　ＣＣＣＴＴＴ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＴＣＧ　ＧＴＡ　ＧＡＣＡＡＣ１０T６Ｔｈｒ　ＧＩＴ　Ｇｉｎ　Ｔａｐ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｌｌ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｌｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ＾ｓｐ　ＡｓｎＡＴＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＴＣＴ　ＧＧＣＧＣＴ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＣＣＡ　P１０４ｉ［ａｔ　Ａｒｇ　Ａｕｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　［Ｉｉｓ　１ｉｅｒ　ＧＩ７　Ａｌｌ　Ｐｒｏ　Ｇ１７　Ｈｔｘ　ｒｌｅ　Ｔｙｔ　oｒ。

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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＲ，Ｎｏ、　ＰＬ、　ＵＳＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくとも１種の脂質に結合した脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含量が、本来の組成よりも高くなったことを特徴とする形質転換植物。
２．パルミトイル−アシルキャリアタンパク質よりも、オレオイル−アシルキャリアタンパク質に対して、より高い基質選択性を持つグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列が細胞内に存在することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の形質転換植物。
３．ポリペプチドが、低温耐性植物由来のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼまたはその誘導体である、請求の範囲第２項記載の形質転換植物。
４．低温耐性植物が、ホウレンソウ、エンドウ、またはシロイヌナズナである、請求の範囲第３項記載の形質転換植物。
５．パルミトイル−アシルキャリアタンパク質よりも、オレオイル−アシルキャリアタンパク質に対して、より高い基質選択性を持つグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を高等植物の細胞に導入することにより、この植物の脂質に結合した脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含量を本来の組成よりもを高くする方法。
６．ポリペプチドが、低温耐性植物由来のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼまたはその誘導体である、請求の範囲第５項記載の方法。
７．低温耐性植物が、ホウレンソウ、エンドウ、またはシロイヌナズナである、請求の範囲第６項記載の方法。
８．本来低温傷害を受ける植物であって、この植物の細胞の生体膜中に含まれているホスファチジルグリセロールの飽和分子種含量が本来の組成により低下し、かつこの植物に本来傷害を引き起こす温度より低い温度でも傷害を受けないようになった、形質転換植物。
９．パルミトイル−アシルキャリアタンパク質よりも、オレオイル−アシルキャリアタンパク質に対して、より高い基質選択性を持つグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列が細胞内に存在することを特徴とする、請求の範囲第８項記載の形質転換植物。
１０．ポリペプチドが、低温耐性植物由来のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼまたはその誘導体である、請求の範囲第９項記載の形質転換植物。
１１．低温耐性植物が、ホウレンソウ、エンドウ、またはシロイヌナズナである、請求の範囲第１０項記載の形質転換植物。
１２．植物細胞の生体膜中に含まれているホスファチジルグリセロールの飽和、分子種含量を低下させることにより、本来低温傷害を受ける植物に、この植物に本来傷害を引き起こす温度より低い温度でも傷害を受けない性質を与える方法。
１３．パルミトイル−アシルキャリアタンパク質よりも、オレオイル−アシルキャリアタンパク質に対して、より高い基質選択性を持つグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を高等植物の細胞に導入することを特徴とする、請求の範囲第１２項記載の方法。
１４．ポリペプチドが、低温耐性植物由来のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼまたはその誘導体である、請求の範囲第１３項記載の方法。
１５．低温耐性植物が、ホウレンソウ、エンドウ、またはシロイヌナズナである、請求の範囲第１４項記載の方法。