JP2812685B2 - スチルベンシンターゼ遺伝子 - Google Patents
スチルベンシンターゼ遺伝子Info
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- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
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- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、スチルベンシンターゼのための植物から単
離された遺伝子に関し、そして、ベクター、宿主生物及
び植物の形質転換のための前記遺伝子の使用及び有害生
物（pests）に対して増加した抵抗を有する植物の製造
のための前記遺伝子の使用に関する。
離された遺伝子に関し、そして、ベクター、宿主生物及
び植物の形質転換のための前記遺伝子の使用及び有害生
物（pests）に対して増加した抵抗を有する植物の製造
のための前記遺伝子の使用に関する。
スチルベンという用語は、植物中に存在しそしてそれ
らの基本的構造としてスチルベン骨格（トランス−1,2
−ジフェニルエチレン）を含有する一群の化学物質を言
う。この基本的骨格は、他の基により補足されていても
よい。２つの重要なスチルベンは、3,5−ジヒドロキシ
スチルベン（ピノシルビン）及び3,3′,5−トリヒドロ
キシスチルベン（レスベラトロール）である。
らの基本的構造としてスチルベン骨格（トランス−1,2
−ジフェニルエチレン）を含有する一群の化学物質を言
う。この基本的骨格は、他の基により補足されていても
よい。２つの重要なスチルベンは、3,5−ジヒドロキシ
スチルベン（ピノシルビン）及び3,3′,5−トリヒドロ
キシスチルベン（レスベラトロール）である。
スチルベンは、或る種の木［被子植物（angiosperm
s）、裸子植物（gymnosperms）］に見出だされるが、或
る草本植物［フトモモ科（Myrtaseae）、ブドウ科（Vit
aceae）及びマメ科（Leguminosae）の種において］にも
見出だされる。スチルベンは、有害植物、特に、菌類
（fungi）、バクテリア及び昆虫（insects）に対して毒
性でありそしてこれらの有害生物を駆除するのに好適で
ある。生物学的に最も重要であると見なされているのは
この能力である。特に草本植物においては、スチルベン
は健康な組織では非常に低い濃度でのみ存在するが、感
染又は傷害に続いて感染の時点では非常に大量のスチル
ベンが合成されるような状況が多い。この増加した濃度
は、スチルベンを合成することができるこれらの植物の
有害生物に対する増加した抵抗と関連がある。これらの
物質を合成する能力は重要な防御機構とみなされる。都
合の悪いことに、有害生物に対する十分な抵抗を植物に
付与する量でスチルベンを合成したりそれらを生成する
能力を持つのは少数の有用な植物にすぎない。
s）、裸子植物（gymnosperms）］に見出だされるが、或
る草本植物［フトモモ科（Myrtaseae）、ブドウ科（Vit
aceae）及びマメ科（Leguminosae）の種において］にも
見出だされる。スチルベンは、有害植物、特に、菌類
（fungi）、バクテリア及び昆虫（insects）に対して毒
性でありそしてこれらの有害生物を駆除するのに好適で
ある。生物学的に最も重要であると見なされているのは
この能力である。特に草本植物においては、スチルベン
は健康な組織では非常に低い濃度でのみ存在するが、感
染又は傷害に続いて感染の時点では非常に大量のスチル
ベンが合成されるような状況が多い。この増加した濃度
は、スチルベンを合成することができるこれらの植物の
有害生物に対する増加した抵抗と関連がある。これらの
物質を合成する能力は重要な防御機構とみなされる。都
合の悪いことに、有害生物に対する十分な抵抗を植物に
付与する量でスチルベンを合成したりそれらを生成する
能力を持つのは少数の有用な植物にすぎない。
すべてのスチルベンの形成にとって重要な点は基本骨
格の合成である。これまで、基本的に２つの種類の酵素
が述べられている（レスベラトロールシンターゼ及びピ
ノシルビンシンターゼ）。それらの両方共スチルベンの
基本骨格を合成するのでスチルベンシンターゼと呼ばれ
る。今日まで、ナンキンマメ（ground nut）［アラキス
・ヒポガエア（Arachis hypogaea）］レスベラトロール
シンターゼはより詳細に特徴付けられており、これらの
酵素の性質の大部分は知られている［シェップナー（Sc
hpner）及びキンドル（Kindle）、1984］。最も簡単
なスチルベンシンターゼであるピノシルビン及びレスベ
ラトロールは両方共、感染性有害生物に対して一般に毒
性作用、好ましくは殺生物性（microbiocidal）作用、
特に静菌（fungistatic）作用を有する。スチルベンシ
ンターゼにより使用される基質はマロニル−CoA及びシ
ンナモイル−CoA又はクマロイル−CoA、即ち、すべての
植物に存在する物質である。その理由はこれらの物質は
他の重要な植物成分（例えば、フラボノイド類、花の色
素）の生合成にも使用されるからである。スチルベン及
びスチルべンシンターゼの問題については下記の文献を
引用することができる［ハート・ジエイ・エイチ（198
1）アニュアル・レビュー・オブ・フィトパソロジー第1
9巻、483−458;ハート・ジエイ・エイチ、シュリンプト
ン・デイ・エム（1979）フィトパソロジー第69巻、1138
−1143;キンドル・エイチ（1985）：木材成分の生合成
及び生劣化、編者・ヒグチ・テイ、アカデミック・プレ
ス・インコーポレーテッド、349−377頁、及びシェップ
ナー・エイ、キンドル・エイチ（1984）ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー・第259巻、6806−6
811（Hart,J.H.（1981）Annu.Rev.Phaytopathology 19,
437−458;Hart,J.H.,Shrimpton,D.M.（1979）Phytopath
ology69,1138−1143;Kindl,H.（1985）in:Biosynthesis
and Biodegradation of Wood Components,Ed.Higuchi,
T.,Academic Press,Inc.,pp.349−377 and Schppner,
A.;Kindl,H.（1984）J.Biol.Chem.259,6806−681
1。）］。
格の合成である。これまで、基本的に２つの種類の酵素
が述べられている（レスベラトロールシンターゼ及びピ
ノシルビンシンターゼ）。それらの両方共スチルベンの
基本骨格を合成するのでスチルベンシンターゼと呼ばれ
る。今日まで、ナンキンマメ（ground nut）［アラキス
・ヒポガエア（Arachis hypogaea）］レスベラトロール
シンターゼはより詳細に特徴付けられており、これらの
酵素の性質の大部分は知られている［シェップナー（Sc
hpner）及びキンドル（Kindle）、1984］。最も簡単
なスチルベンシンターゼであるピノシルビン及びレスベ
ラトロールは両方共、感染性有害生物に対して一般に毒
性作用、好ましくは殺生物性（microbiocidal）作用、
特に静菌（fungistatic）作用を有する。スチルベンシ
ンターゼにより使用される基質はマロニル−CoA及びシ
ンナモイル−CoA又はクマロイル−CoA、即ち、すべての
植物に存在する物質である。その理由はこれらの物質は
他の重要な植物成分（例えば、フラボノイド類、花の色
素）の生合成にも使用されるからである。スチルベン及
びスチルべンシンターゼの問題については下記の文献を
引用することができる［ハート・ジエイ・エイチ（198
1）アニュアル・レビュー・オブ・フィトパソロジー第1
9巻、483−458;ハート・ジエイ・エイチ、シュリンプト
ン・デイ・エム（1979）フィトパソロジー第69巻、1138
−1143;キンドル・エイチ（1985）：木材成分の生合成
及び生劣化、編者・ヒグチ・テイ、アカデミック・プレ
ス・インコーポレーテッド、349−377頁、及びシェップ
ナー・エイ、キンドル・エイチ（1984）ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー・第259巻、6806−6
811（Hart,J.H.（1981）Annu.Rev.Phaytopathology 19,
437−458;Hart,J.H.,Shrimpton,D.M.（1979）Phytopath
ology69,1138−1143;Kindl,H.（1985）in:Biosynthesis
and Biodegradation of Wood Components,Ed.Higuchi,
T.,Academic Press,Inc.,pp.349−377 and Schppner,
A.;Kindl,H.（1984）J.Biol.Chem.259,6806−681
1。）］。
作物の世界の生産高の大きな割合が絶えず有害生物に
より破壊されている［1967年には、潜在的収穫高の損失
は35％であった、ケイ・エイチ・ブッヘル（K.H.Buche
l）により編集された殺有害生物剤の化学（Chemistry o
f Pesticides）、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ
（John Wiley ＆ Sons）、ニューヨーク、1983、６頁、
参照］。この故に、有害生物による作物の攻撃を減少又
は防止するのに好適なすべての可能性を研究しそして開
発することに対する差し迫った要求がある。
より破壊されている［1967年には、潜在的収穫高の損失
は35％であった、ケイ・エイチ・ブッヘル（K.H.Buche
l）により編集された殺有害生物剤の化学（Chemistry o
f Pesticides）、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ
（John Wiley ＆ Sons）、ニューヨーク、1983、６頁、
参照］。この故に、有害生物による作物の攻撃を減少又
は防止するのに好適なすべての可能性を研究しそして開
発することに対する差し迫った要求がある。
スチルベンを生産することができないか又は不十分に
にしか生産することができない植物の遺伝子型（ゲノ
ム）に導入することができ、有害生物に対するこれらの
植物の抵抗を増加させることができるスチルベンシンタ
ーゼのための新規な遺伝子（“スチルベンシンターゼ遺
伝子）が今回単離された。
にしか生産することができない植物の遺伝子型（ゲノ
ム）に導入することができ、有害生物に対するこれらの
植物の抵抗を増加させることができるスチルベンシンタ
ーゼのための新規な遺伝子（“スチルベンシンターゼ遺
伝子）が今回単離された。
スチルベンシンターゼ遺伝子とは、そのRNAへの転写
及びタンパク質への翻訳（適当な環境で）の後、スチル
ベンシンターゼの性質（適当な環境でのスチルベンの酵
素的合成）を持った酵素の生成をもたらすことができる
すべての核酸（DNA）であって、この核酸はその天然の
環境から単離されて存在するか、又はベクターに組み込
まれて存在するか又は原核生物DNAもしくは真核生物DNA
内に“外来"DNA"として又は“追加の"DNA"として含まれ
て存在する核酸（DNA）であると理解されるべきであ
る。
及びタンパク質への翻訳（適当な環境で）の後、スチル
ベンシンターゼの性質（適当な環境でのスチルベンの酵
素的合成）を持った酵素の生成をもたらすことができる
すべての核酸（DNA）であって、この核酸はその天然の
環境から単離されて存在するか、又はベクターに組み込
まれて存在するか又は原核生物DNAもしくは真核生物DNA
内に“外来"DNA"として又は“追加の"DNA"として含まれ
て存在する核酸（DNA）であると理解されるべきであ
る。
スチルベンシンターゼ遺伝子が、その始点及び／又は
終点に、遺伝子の機能を妨害しないか又は問題になる程
に妨害しないDNA配列を含むならば、“遺伝子単位”（g
ene unit）という用語も以後使用される。これらの遺伝
子単位は、その遺伝子の丁度始点及び終点に慣用の制限
酵素のための開裂部位がないことにより、例えば制限酵
素を使用する開裂（例えばEcoR I及びHind IIIによる部
分開裂）により形成される。
終点に、遺伝子の機能を妨害しないか又は問題になる程
に妨害しないDNA配列を含むならば、“遺伝子単位”（g
ene unit）という用語も以後使用される。これらの遺伝
子単位は、その遺伝子の丁度始点及び終点に慣用の制限
酵素のための開裂部位がないことにより、例えば制限酵
素を使用する開裂（例えばEcoR I及びHind IIIによる部
分開裂）により形成される。
スチルベンシンターゼ遺伝子（又は遺伝子単位）は、
植物のゲノムに含まれている状態と同じ形態で存在する
ことができ（スチルベンシンターゼをコードしていない
及び／又は調節活性を持たない（イントロンの如き）配
列を包含する“ゲノム”形態）、又は逆転写酵素／ポリ
メラーゼの助けによりmRNAから得ることができる（そし
てもはやイントロンを含まない）cDNA（相補的DNA）に
相当する形態で存在することができる。
植物のゲノムに含まれている状態と同じ形態で存在する
ことができ（スチルベンシンターゼをコードしていない
及び／又は調節活性を持たない（イントロンの如き）配
列を包含する“ゲノム”形態）、又は逆転写酵素／ポリ
メラーゼの助けによりmRNAから得ることができる（そし
てもはやイントロンを含まない）cDNA（相補的DNA）に
相当する形態で存在することができる。
スチルベンシンターゼ遺伝子（又は遺伝子単位）にお
いては、DNA切片（DNA sections）は本質的に同じよう
に作用する他のDNA切片により、置換することができ
る。それは、遺伝子（又は遺伝子単位）の操作に各場合
に適応したDNA配列（例えば“リンカー”）を端部に有
することもできる。
いては、DNA切片（DNA sections）は本質的に同じよう
に作用する他のDNA切片により、置換することができ
る。それは、遺伝子（又は遺伝子単位）の操作に各場合
に適応したDNA配列（例えば“リンカー”）を端部に有
することもできる。
この状況において、“外来"DNA"とは、特定の原核生
物又は真核生物ゲノムに天然には存在しないでヒトの介
在によってのみこのゲノムに導入されるDNAであると理
解されるべきである。“追加の"DNA"とは、問題の原核
生物又は真核生物ゲノムに天然には存在するが、ヒトの
介在により追加の量このゲノムに導入されるDNAを意味
する。特定の場合の要求及び性質に従って、“外来"DN
A"又は“追加の"DNA"は１コピー又はいくつかのコピー
で導入することができる。
物又は真核生物ゲノムに天然には存在しないでヒトの介
在によってのみこのゲノムに導入されるDNAであると理
解されるべきである。“追加の"DNA"とは、問題の原核
生物又は真核生物ゲノムに天然には存在するが、ヒトの
介在により追加の量このゲノムに導入されるDNAを意味
する。特定の場合の要求及び性質に従って、“外来"DN
A"又は“追加の"DNA"は１コピー又はいくつかのコピー
で導入することができる。
植物又は植物細胞において本発明に従うスチルベンシ
ンターゼ遺伝子（又は遺伝子単位）の助けにより合成さ
れるスチルベンシンターゼとは、有害生物に対して防御
作用をし（フィトアレキシン）スチルベン骨格を含むこ
れらの植物物質の合成を引き起こすすべての酵素を意味
する。
ンターゼ遺伝子（又は遺伝子単位）の助けにより合成さ
れるスチルベンシンターゼとは、有害生物に対して防御
作用をし（フィトアレキシン）スチルベン骨格を含むこ
れらの植物物質の合成を引き起こすすべての酵素を意味
する。
好ましいスチルベン類は、ピノシルビン（3,5−ジヒ
ドロキシスチルベン）、プテロスチルベン（3,5−ジメ
トキシ−４′−ヒドロキシスチルベン）及びレスベラト
ロール（3,3′,5−トリヒドロキシスチルベン）であ
り、ピノシルビン及びレスベラトロールが特に好まし
く、そしてレスベラトロールが中でも特に好ましい。
ドロキシスチルベン）、プテロスチルベン（3,5−ジメ
トキシ−４′−ヒドロキシスチルベン）及びレスベラト
ロール（3,3′,5−トリヒドロキシスチルベン）であ
り、ピノシルビン及びレスベラトロールが特に好まし
く、そしてレスベラトロールが中でも特に好ましい。
既に記述された如く、スチルベンは、或る種の木の種
に見出だされそしていくつかの他の、好ましくは双子葉
植物（dicotyledon plants）にも見出だされる本発明に
従う好ましいスチルベンシンターゼ遺伝子は、裸子植
物、特にマツ（Pinus）、被子植物、特に双子葉植物、
特にナンキンマメ［アラキス・ヒポガエア（Arachis hy
pogaea）、つる植物（vine）［ブドウ（Vitis）］、中
でも特にナンキンマメから単離され得るスチルベンシン
ターゼ遺伝子である。
に見出だされそしていくつかの他の、好ましくは双子葉
植物（dicotyledon plants）にも見出だされる本発明に
従う好ましいスチルベンシンターゼ遺伝子は、裸子植
物、特にマツ（Pinus）、被子植物、特に双子葉植物、
特にナンキンマメ［アラキス・ヒポガエア（Arachis hy
pogaea）、つる植物（vine）［ブドウ（Vitis）］、中
でも特にナンキンマメから単離され得るスチルベンシン
ターゼ遺伝子である。
本発明に従う特に好ましいスチルベンシンターゼ遺伝
子は、プラスミドpGS828.1（後に詳細に説明する）内に
遺伝子単離として存在するスチルベンシンターゼ遺伝子
でありそして本質的に同じように作用するDNA配列もそ
うである。
子は、プラスミドpGS828.1（後に詳細に説明する）内に
遺伝子単離として存在するスチルベンシンターゼ遺伝子
でありそして本質的に同じように作用するDNA配列もそ
うである。
スチルベンシンターゼ遺伝子は、５′−及び３′−非
翻訳領域（untranslated regions）及び暗号化領域を含
んで成り、そして（約）6.7kbp（遺伝子単位）のDNA断
片に位置付けられている。この遺伝子単位は、（３）Ec
oR I、（３）Hind III及び（１）Pst I開裂部位を有す
る。それは、プラスミドpGS828.1からEcoR I及びHind I
IIによる部分開裂により得ることができる。
翻訳領域（untranslated regions）及び暗号化領域を含
んで成り、そして（約）6.7kbp（遺伝子単位）のDNA断
片に位置付けられている。この遺伝子単位は、（３）Ec
oR I、（３）Hind III及び（１）Pst I開裂部位を有す
る。それは、プラスミドpGS828.1からEcoR I及びHind I
IIによる部分開裂により得ることができる。
５′−調節部分は、約3.3kbpサイズのEcorR I断片の
タンパク質暗号化領域の初めの７コドンに並んで位置し
ており、そして暗号化領域の残部に先行する。この領域
は、1540bpより成りそして369bpのイントロンとHind II
I開裂部位を含む。下流の３′−非翻訳領域は、完全に
存在しておりそしてEcoR I開裂部位（第１図参照）によ
り限定されている。ベクターのpSP65（プラスミドpGS82
8.1）にクローン化される遺伝子単位は、２つの内部Eco
R I、１つのPst I及び２つのHind III開裂部位を含みそ
して５′−末端におけるpSP65プラスミドのポリリンカ
ーにおけるSst I開裂部位（スチルベンシンターゼ遺伝
子の方向にEcoR I開裂部位の過ぐ隣の）と３′−末端の
Hind III開裂部位により限定される。pGS828.1からSst
I及びPvu IIの助けにより遺伝子単位を得るのが特に有
利である（第２図）。その理由は、両開裂部位共各１回
しか存在しないからである。Pvu II開裂部位は実際の遺
伝子単位の外側に位置している。しかしながら、これ
は、トランジェニック植物（transgenic plants）にお
ける遺伝子の発現には影響を及ぼさず、そしてHind III
開裂部位までの区域は、所要により慣用の方法によって
除去することができる。
タンパク質暗号化領域の初めの７コドンに並んで位置し
ており、そして暗号化領域の残部に先行する。この領域
は、1540bpより成りそして369bpのイントロンとHind II
I開裂部位を含む。下流の３′−非翻訳領域は、完全に
存在しておりそしてEcoR I開裂部位（第１図参照）によ
り限定されている。ベクターのpSP65（プラスミドpGS82
8.1）にクローン化される遺伝子単位は、２つの内部Eco
R I、１つのPst I及び２つのHind III開裂部位を含みそ
して５′−末端におけるpSP65プラスミドのポリリンカ
ーにおけるSst I開裂部位（スチルベンシンターゼ遺伝
子の方向にEcoR I開裂部位の過ぐ隣の）と３′−末端の
Hind III開裂部位により限定される。pGS828.1からSst
I及びPvu IIの助けにより遺伝子単位を得るのが特に有
利である（第２図）。その理由は、両開裂部位共各１回
しか存在しないからである。Pvu II開裂部位は実際の遺
伝子単位の外側に位置している。しかしながら、これ
は、トランジェニック植物（transgenic plants）にお
ける遺伝子の発現には影響を及ぼさず、そしてHind III
開裂部位までの区域は、所要により慣用の方法によって
除去することができる。
プラスミドpGs828.1を含む大腸菌株Nurdug2010は、特
許手続きの目的で微生物の寄託の国際的承認に基づくブ
ダペスト条約の条項に従って、ドイツ連邦共和国、Ｄ−
3300ブラウンシュバイヒ、マッシェデルベーク1b、ドイ
ツ微生物収集機関（Deutsche Sammlung von Mikroorgan
ismen（DSM）,Mascheroder wEG lb、Ｄ−3300 Brawnsch
weig,Federal Republic of Germany）に寄託されており
そして寄託番号DSM4243（寄託日付、1987年９月17日）
を持っている。
許手続きの目的で微生物の寄託の国際的承認に基づくブ
ダペスト条約の条項に従って、ドイツ連邦共和国、Ｄ−
3300ブラウンシュバイヒ、マッシェデルベーク1b、ドイ
ツ微生物収集機関（Deutsche Sammlung von Mikroorgan
ismen（DSM）,Mascheroder wEG lb、Ｄ−3300 Brawnsch
weig,Federal Republic of Germany）に寄託されており
そして寄託番号DSM4243（寄託日付、1987年９月17日）
を持っている。
この菌株及びその突然変異体（mutants）及び変異体
（variants）も本発明の一部である。通常の方法で、こ
の宿主において寄託されているプラスミドpGS828.1は、
この菌株の増殖に必要な量容易に入手することができ
る。
（variants）も本発明の一部である。通常の方法で、こ
の宿主において寄託されているプラスミドpGS828.1は、
この菌株の増殖に必要な量容易に入手することができ
る。
本発明に従えば、下記する（提唱された）スチルベン
シンターゼ暗号化DNA配列（pGS828.1からのスチルベン
シンターゼ遺伝子単位のDNA配列（タンパク質暗号化領
域及びイントロン））をイントロンを伴い又は伴わずに
含有するか又はこれらのDNA配列と本質的に同じように
作用する配列を含むスチルベンシンターゼ遺伝子又は遺
伝子単位が、特に好ましい。
シンターゼ暗号化DNA配列（pGS828.1からのスチルベン
シンターゼ遺伝子単位のDNA配列（タンパク質暗号化領
域及びイントロン））をイントロンを伴い又は伴わずに
含有するか又はこれらのDNA配列と本質的に同じように
作用する配列を含むスチルベンシンターゼ遺伝子又は遺
伝子単位が、特に好ましい。
この配列も又本発明の一部である。
更に、人工的に、即ち本質的に非生物的に生産され、
そしてこのDNA配列（イントロンを伴い又は伴わずに）
のすべてまたは一部を含み、又は本質的に同じ型の作用
を持ったDNA配列を含むすべてのDNAは本発明の一部であ
る。
そしてこのDNA配列（イントロンを伴い又は伴わずに）
のすべてまたは一部を含み、又は本質的に同じ型の作用
を持ったDNA配列を含むすべてのDNAは本発明の一部であ
る。
本質的に同じように作用する配列とは、１つ又はいく
つかの点で他のDNA又はDNA配列により置換されるが、結
果を本質的に変えることのないDNA又はDNA配列を意味す
る。
つかの点で他のDNA又はDNA配列により置換されるが、結
果を本質的に変えることのないDNA又はDNA配列を意味す
る。
本発明に従うスチルベンシンターゼ遺伝子の如き機能
的に完全な遺伝子は、調節活性（特にプロモーター）を
持った部分及びタンパク質スチルベンシンターゼを暗号
化する構造遺伝子とから成る。
的に完全な遺伝子は、調節活性（特にプロモーター）を
持った部分及びタンパク質スチルベンシンターゼを暗号
化する構造遺伝子とから成る。
遺伝子の両部分共互いに独立に使用することができ
る。例えば、調節活性を持った部分の下流に、植物のゲ
ノムへの導入の後発現されるべき異なったDNA配列（ス
チルベンシンターゼ遺伝子とは異なる）を配列すること
が可能である。植物又は植物細胞においてそれらの作用
を示すことができる少数の単離されたプロモータしか知
られていないので、本発明の構成成分であるスチルベン
シンターゼ遺伝子のプロモータは、形質転換された植物
又は植物細胞の生産のための価値ある援助で、それは暗
号化領域の始めにあるSst I及びEcoR Iの助けにより単
離することができそして慣用の方法により他の遺伝子の
上流に挿入することができる。
る。例えば、調節活性を持った部分の下流に、植物のゲ
ノムへの導入の後発現されるべき異なったDNA配列（ス
チルベンシンターゼ遺伝子とは異なる）を配列すること
が可能である。植物又は植物細胞においてそれらの作用
を示すことができる少数の単離されたプロモータしか知
られていないので、本発明の構成成分であるスチルベン
シンターゼ遺伝子のプロモータは、形質転換された植物
又は植物細胞の生産のための価値ある援助で、それは暗
号化領域の始めにあるSst I及びEcoR Iの助けにより単
離することができそして慣用の方法により他の遺伝子の
上流に挿入することができる。
スチルベンシンターゼ構造遺伝子の上流に調節活性を
持った“外来”部分を配列することも可能である。これ
は、或る種の植物において調節活性を持った或る種の
（例えば植物特異的な）遺伝子のみが十分に有効である
場合には有利でありうる。スチルベンシンターゼ暗号化
DNA配列（好ましくは、イントロン配列を伴なっている
か又は伴わないでそして下記する本質的に同じように作
用するそれらの配列を伴うか又は伴わない、スチルベン
シンターゼ暗号化DNA配列）は、それゆえにそれ自身で
使用することができる価値ある単位を表しそして既に述
べた如く、本発明の一部である。本発明に従うスチルベ
ンシンターゼ遺伝子は、慣用の方法により調節活性を持
った部分と構造遺伝子に分離することができる。好まし
くは、本発明に従う完全なスチルベンシンターゼ遺伝子
又は遺伝子単位が使用される。
持った“外来”部分を配列することも可能である。これ
は、或る種の植物において調節活性を持った或る種の
（例えば植物特異的な）遺伝子のみが十分に有効である
場合には有利でありうる。スチルベンシンターゼ暗号化
DNA配列（好ましくは、イントロン配列を伴なっている
か又は伴わないでそして下記する本質的に同じように作
用するそれらの配列を伴うか又は伴わない、スチルベン
シンターゼ暗号化DNA配列）は、それゆえにそれ自身で
使用することができる価値ある単位を表しそして既に述
べた如く、本発明の一部である。本発明に従うスチルベ
ンシンターゼ遺伝子は、慣用の方法により調節活性を持
った部分と構造遺伝子に分離することができる。好まし
くは、本発明に従う完全なスチルベンシンターゼ遺伝子
又は遺伝子単位が使用される。
慣用の方法によって、スチルベンシンターゼ遺伝子又
は遺伝子単位又はその一部を、“外来"DNA"又は“追加
の"DNA〃として、原核生物（好ましくはバクテリア）DN
A又は真核生物（好ましくは植物）DNAに、１コピー又は
それよりコピーで（例えばタンデム配列で）、好ましく
は１コピーで導入することが可能である。例えば植物又
は植物細胞の形質転換に使用することができそして形質
転換の後植物又は植物細胞に含有させられる、このよう
にして“修飾された"DNAは本発明の構成成分である。
は遺伝子単位又はその一部を、“外来"DNA"又は“追加
の"DNA〃として、原核生物（好ましくはバクテリア）DN
A又は真核生物（好ましくは植物）DNAに、１コピー又は
それよりコピーで（例えばタンデム配列で）、好ましく
は１コピーで導入することが可能である。例えば植物又
は植物細胞の形質転換に使用することができそして形質
転換の後植物又は植物細胞に含有させられる、このよう
にして“修飾された"DNAは本発明の構成成分である。
スチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単位及び／又
はその一部及び修飾されたDNAは、ベクター（特にプラ
スミド、コスミド又はファージ）中に、形質転換された
微生物（好ましくはバクテリア、特に例えば大腸菌の如
きグラム陰性菌）中に及び形質転換された植物又は植物
細胞中に又はそれらのDNA中に、“外来"DNA〃又は“追
加の"DNA"として存在することができる。これらのベク
ター、形質転換された微生物（これらのベクターを含ん
でいてもよい）及び形質転換された植物細胞及び植物及
びそれらのDNAは、本発明の構成部分である。
はその一部及び修飾されたDNAは、ベクター（特にプラ
スミド、コスミド又はファージ）中に、形質転換された
微生物（好ましくはバクテリア、特に例えば大腸菌の如
きグラム陰性菌）中に及び形質転換された植物又は植物
細胞中に又はそれらのDNA中に、“外来"DNA〃又は“追
加の"DNA"として存在することができる。これらのベク
ター、形質転換された微生物（これらのベクターを含ん
でいてもよい）及び形質転換された植物細胞及び植物及
びそれらのDNAは、本発明の構成部分である。
本発明に従うスチルベンシンターゼ遺伝子の助けによ
り、有害生物に対する抵抗又は増加した抵抗を引き起こ
すことができる挙げられる有害生物は、昆虫、ダニ及び
線虫の如き動物有害生物及び植物病原性菌類及びバクテ
リアの如き有害微生物である。有害微生物、特に植物病
原性菌類である。
り、有害生物に対する抵抗又は増加した抵抗を引き起こ
すことができる挙げられる有害生物は、昆虫、ダニ及び
線虫の如き動物有害生物及び植物病原性菌類及びバクテ
リアの如き有害微生物である。有害微生物、特に植物病
原性菌類である。
有害な昆虫は特に下記の目の昆虫である。
直翅目（Orthoptera）、革翅目（Dermaptera）、等翅
目（Isoptera）、総翅目（Thysanoptera）、異翅目（He
teroptera）、同翅目（Homoptera）、鱗翅目（Lepidopt
era）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅目（Hymenoptera）
及び双翅目（Diptera）。
目（Isoptera）、総翅目（Thysanoptera）、異翅目（He
teroptera）、同翅目（Homoptera）、鱗翅目（Lepidopt
era）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅目（Hymenoptera）
及び双翅目（Diptera）。
有害なダニは特に ホコリダニ属（Tarsonemus）の種、パノニクス属（Pa
nonychus）の種、及びハダニ属（Tetranychus）の種で
ある。
nonychus）の種、及びハダニ属（Tetranychus）の種で
ある。
有害な線虫は特に、 プラチレンクス属（Pratylenchus）の種、ヘテロデラ
属（Heterodera）の種、及びメロイドギネ属（Meloidog
yne）の種である。
属（Heterodera）の種、及びメロイドギネ属（Meloidog
yne）の種である。
有害微生物（microbial pests）は特に植物病原性菌
類（phytopathogenic fungi）： ネコブカビ類（Plasmodiophoromycetes）、卵菌類（O
omycetes）、ツボカビ類（Chytridiomycetes）、接合菌
類（Zygomycetes）、子嚢菌類（Ascomycetes）、担子菌
類（Basidiomycetes）、不完全菌類（Deuteromycete
s）、である。
類（phytopathogenic fungi）： ネコブカビ類（Plasmodiophoromycetes）、卵菌類（O
omycetes）、ツボカビ類（Chytridiomycetes）、接合菌
類（Zygomycetes）、子嚢菌類（Ascomycetes）、担子菌
類（Basidiomycetes）、不完全菌類（Deuteromycete
s）、である。
植物病原性バクテリアは特に、シュードモナス科（Ps
eudomonadaceae）、リゾビウム科（Rhizobiaceae）、腸
内細菌科（Enterobacteriaceae）、コリネバクテリア科
（Corynebacteriaceae）及びストレプトミセス科（Stre
ptomycetaceae）である。
eudomonadaceae）、リゾビウム科（Rhizobiaceae）、腸
内細菌科（Enterobacteriaceae）、コリネバクテリア科
（Corynebacteriaceae）及びストレプトミセス科（Stre
ptomycetaceae）である。
上述の一般的な用語により包含されそして例として挙
げることができるが限定として挙げるのではない菌類及
びバクテリアによる病気のいくつかの病原体は、 キサントモナス属（Xanthomonas）の種、例えばキサ
ントモナス・カンペストリス・ピーブイ・オリザエ（Xa
nthomonas campestris pv.oryzae）、シュードモナス属
（Pseudomonas）の種、例えば、シュードモナス・シリ
ンガエ・ピーブイ・ラクリマンス（Pseudomonas syring
ae pv.lachrymans）、 エルウィニア属（Erwinia）の種、例えば、エルウィ
ニア・アミロボラ（Erwinia amylovora）、 ピチウム（フハイカビ）属（Pythium）の種、例え
ば、ピチウム・ウルチムム（Pythium ultimum）、 フィトフトーラ（エキビヨウキン）属（Phytophthor
a）の種、例えば、フィトフトーラ・インフェスタンス
（Phytophthora infestans）、 シュードペロノスポーラ属（Pseudoperonosopora）
種、例えば、シュードペロノスポーラ・フムリ（Pseudo
peronospora humuli）、又はシュードペロノスポーラ・
クベンセ（Pseudoperonospora cubense）、 プラスモパラ（タンジクツユカビ）属（Plasmopara）
の種、例えば、プラスモパラ・ビチコラ（Plasmopara v
iticola）、 ペロノスポラ（ツユカビ）属（Peronospora）の種、
例えば、ペロノスポラ・ピシ（Peronospora pisi）又は
ペロノスポラ・ブラシカエ（Peronospora brassica
e）、 エリシフェ（ウドンコカビ）属（Erysiphe）の種、例
えば、エリシフェ・グラミニス（Erysiphe gramini
s）、 スファエロテカ属（Sphaerotheca）の種、例えば、ス
ファエロテカ・フリギネア（Sphaerotheca fuligini
a）、 ポドスファエラ属（Podosphaera）の種、例えば、ポ
ドスファエラ・リューコトリカ（Podosphaera leucotri
cha）、 ベンチュリア属（Venturia）の種、例えば、ベンチュ
リア・イナエクアリス（Venturia inaequalis）、 ピレノフォラ属（Pyrenophora）の種、例えば、ピレ
ノフォラ・テレス（Pyrenophora teres）又はピレノフ
ォラ・グラミネア（Pyrenophora graminea）、 ［分生子形態（conidia form）：ドレクスレラ（Drechs
lera）、シン（syn）：ヘルミントスポリウム（Helmint
hosporium）］ コクリオボルス属（Cochriobolus）の種、例えば、コ
クリオボルス・サチブス（Cochriobolus sativus） ［分生子形態：ドレクスレラ、シン（syn）：ヘルミン
トスポリウム］ ウロミセス属（Uromyces）の種、例えば、ウロミセス
・アペンディクラツス（Uromyces appendiculatus）、 プクシニア属（Puccinia）の種、例えば、プクシニア
・レコンディタ（Puccinia recondita）、 ティレチア属（Tilletia）の種、例えば、ティレチア
・カリエス（Tilletia caries）、 ウスチラゴ属（Ustilago）の種、例えば、ウスチラゴ
・ヌダ（Ustilago nuda）又はウスチラゴ・アベナエ（U
stilago abenae）、 ペリキュラリア属（Pellicularia）の種、例えば、ペ
リキュリア・ササキイ（Pellicularia sasakii）、 ピリキュラリア属（Pyricularia）の種、例えば、ピ
リキュラリア・オリザエ（Pyricularia oryzae）、 フサリウム属（Fusarium）の種、例えば、フサリウム
・コルモルム（Fusarium colmorum）、 ボツリチス属（Botrytis）の種、例えば、ボツリチス
・シネレア（Botrytis cinerea）、 セプトリア属（Septoria）の種、例えば、セプトリア
・ノドルム（Septoria nodorum）、 レプトスファエリア属（Leptosphaeria）の種、例え
ば、レプトスファエリア・ノドルム（Leptosphaeria no
dorum）、 ケルコスポラ属（Cercospora）の種、例えば、ケルコ
スポラ・カネッセンス（Cercospora canescens）、 アルテルナリア属（Alternaria）の種、例えば、アル
テルナリア・ブラシカエ（Alternaria brassicae）、 シュードケルコスポレラ属（Pseudocercosporella）
の種、例えば、シュードケルコスポレラ・ヘルポトリコ
イデス（Pseudocercosporella herpotrichoides）。更
に、ヘルミントスポリウム・カルボヌム（Helminthospo
rium carbonum）を挙げることができる。
げることができるが限定として挙げるのではない菌類及
びバクテリアによる病気のいくつかの病原体は、 キサントモナス属（Xanthomonas）の種、例えばキサ
ントモナス・カンペストリス・ピーブイ・オリザエ（Xa
nthomonas campestris pv.oryzae）、シュードモナス属
（Pseudomonas）の種、例えば、シュードモナス・シリ
ンガエ・ピーブイ・ラクリマンス（Pseudomonas syring
ae pv.lachrymans）、 エルウィニア属（Erwinia）の種、例えば、エルウィ
ニア・アミロボラ（Erwinia amylovora）、 ピチウム（フハイカビ）属（Pythium）の種、例え
ば、ピチウム・ウルチムム（Pythium ultimum）、 フィトフトーラ（エキビヨウキン）属（Phytophthor
a）の種、例えば、フィトフトーラ・インフェスタンス
（Phytophthora infestans）、 シュードペロノスポーラ属（Pseudoperonosopora）
種、例えば、シュードペロノスポーラ・フムリ（Pseudo
peronospora humuli）、又はシュードペロノスポーラ・
クベンセ（Pseudoperonospora cubense）、 プラスモパラ（タンジクツユカビ）属（Plasmopara）
の種、例えば、プラスモパラ・ビチコラ（Plasmopara v
iticola）、 ペロノスポラ（ツユカビ）属（Peronospora）の種、
例えば、ペロノスポラ・ピシ（Peronospora pisi）又は
ペロノスポラ・ブラシカエ（Peronospora brassica
e）、 エリシフェ（ウドンコカビ）属（Erysiphe）の種、例
えば、エリシフェ・グラミニス（Erysiphe gramini
s）、 スファエロテカ属（Sphaerotheca）の種、例えば、ス
ファエロテカ・フリギネア（Sphaerotheca fuligini
a）、 ポドスファエラ属（Podosphaera）の種、例えば、ポ
ドスファエラ・リューコトリカ（Podosphaera leucotri
cha）、 ベンチュリア属（Venturia）の種、例えば、ベンチュ
リア・イナエクアリス（Venturia inaequalis）、 ピレノフォラ属（Pyrenophora）の種、例えば、ピレ
ノフォラ・テレス（Pyrenophora teres）又はピレノフ
ォラ・グラミネア（Pyrenophora graminea）、 ［分生子形態（conidia form）：ドレクスレラ（Drechs
lera）、シン（syn）：ヘルミントスポリウム（Helmint
hosporium）］ コクリオボルス属（Cochriobolus）の種、例えば、コ
クリオボルス・サチブス（Cochriobolus sativus） ［分生子形態：ドレクスレラ、シン（syn）：ヘルミン
トスポリウム］ ウロミセス属（Uromyces）の種、例えば、ウロミセス
・アペンディクラツス（Uromyces appendiculatus）、 プクシニア属（Puccinia）の種、例えば、プクシニア
・レコンディタ（Puccinia recondita）、 ティレチア属（Tilletia）の種、例えば、ティレチア
・カリエス（Tilletia caries）、 ウスチラゴ属（Ustilago）の種、例えば、ウスチラゴ
・ヌダ（Ustilago nuda）又はウスチラゴ・アベナエ（U
stilago abenae）、 ペリキュラリア属（Pellicularia）の種、例えば、ペ
リキュリア・ササキイ（Pellicularia sasakii）、 ピリキュラリア属（Pyricularia）の種、例えば、ピ
リキュラリア・オリザエ（Pyricularia oryzae）、 フサリウム属（Fusarium）の種、例えば、フサリウム
・コルモルム（Fusarium colmorum）、 ボツリチス属（Botrytis）の種、例えば、ボツリチス
・シネレア（Botrytis cinerea）、 セプトリア属（Septoria）の種、例えば、セプトリア
・ノドルム（Septoria nodorum）、 レプトスファエリア属（Leptosphaeria）の種、例え
ば、レプトスファエリア・ノドルム（Leptosphaeria no
dorum）、 ケルコスポラ属（Cercospora）の種、例えば、ケルコ
スポラ・カネッセンス（Cercospora canescens）、 アルテルナリア属（Alternaria）の種、例えば、アル
テルナリア・ブラシカエ（Alternaria brassicae）、 シュードケルコスポレラ属（Pseudocercosporella）
の種、例えば、シュードケルコスポレラ・ヘルポトリコ
イデス（Pseudocercosporella herpotrichoides）。更
に、ヘルミントスポリウム・カルボヌム（Helminthospo
rium carbonum）を挙げることができる。
本発明に従うスチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子
単位の挿入（形質転換）によって前述の有害生物に対す
る抵抗又は増加した抵抗を導入することができる植物に
は実質的にすべての植物が包含される。当然、例えば森
林植物、例えばトウヒ（spruce）、モミ（fir）、ダグ
ラスモミ（douglasfir）、マツ（pine）、カラマツ（la
rch）、ブナノキ（beech）及びオーク（oak）及び食物
及び原料を提供する植物、例えば穀物（特に、コムギ、
ライムギ、オオムギ、カラスムギ、キビ（millet）、イ
ネ及びトウモロコシ）、ジャガイモ、マメ科の植物（le
gumes）、例えば豆類（pulses）、及び特にアルファル
ファ（alfalfa）、ダイズ、野菜（特にアブラナ属（bra
ssicas）及びトマト）、果実（特にリンゴ、セイヨウナ
シ（pears）、サクラ、ブドウ、柑橘類の果物、パイナ
ッル及びバナナ）、ギネアアブラヤシ（oil palm）、チ
ャ（tea plants）、ココア及びコーヒーノキ（coffee p
lants）、タバコ、サイザルアサ（sisal）及び綿及び薬
用植物、例えばインドジャボク（Rauwolfia）及びジギ
タリス、などの作物（crop plants）における抵抗の発
現についての特定の要求がある。特に好ましいものとし
ては、ジャガイモ、トマト、つる植物（vine）及びマメ
科植物を挙げることができる。
単位の挿入（形質転換）によって前述の有害生物に対す
る抵抗又は増加した抵抗を導入することができる植物に
は実質的にすべての植物が包含される。当然、例えば森
林植物、例えばトウヒ（spruce）、モミ（fir）、ダグ
ラスモミ（douglasfir）、マツ（pine）、カラマツ（la
rch）、ブナノキ（beech）及びオーク（oak）及び食物
及び原料を提供する植物、例えば穀物（特に、コムギ、
ライムギ、オオムギ、カラスムギ、キビ（millet）、イ
ネ及びトウモロコシ）、ジャガイモ、マメ科の植物（le
gumes）、例えば豆類（pulses）、及び特にアルファル
ファ（alfalfa）、ダイズ、野菜（特にアブラナ属（bra
ssicas）及びトマト）、果実（特にリンゴ、セイヨウナ
シ（pears）、サクラ、ブドウ、柑橘類の果物、パイナ
ッル及びバナナ）、ギネアアブラヤシ（oil palm）、チ
ャ（tea plants）、ココア及びコーヒーノキ（coffee p
lants）、タバコ、サイザルアサ（sisal）及び綿及び薬
用植物、例えばインドジャボク（Rauwolfia）及びジギ
タリス、などの作物（crop plants）における抵抗の発
現についての特定の要求がある。特に好ましいものとし
ては、ジャガイモ、トマト、つる植物（vine）及びマメ
科植物を挙げることができる。
既に述べた如く、本発明に従えば、スチルベンシンタ
ーゼ遺伝子又は遺伝子単位は、天然植物のゲノムに１コ
ピー又はいくつかのコピーで（ゲノムの同じ点又は異な
る点で）挿入することができる。既にスチルベンを合成
することができる植物においては、本発明に従う１つ又
はそれより多くのスチルベンシンターゼ遺伝子の挿入
は、相当改良された抵抗の挙動をもたらすことができ
る。場合により、問題の植物から単離することができる
調節遺伝子を上流に配列して、本発明に従う構造遺伝子
のみを使用する。
ーゼ遺伝子又は遺伝子単位は、天然植物のゲノムに１コ
ピー又はいくつかのコピーで（ゲノムの同じ点又は異な
る点で）挿入することができる。既にスチルベンを合成
することができる植物においては、本発明に従う１つ又
はそれより多くのスチルベンシンターゼ遺伝子の挿入
は、相当改良された抵抗の挙動をもたらすことができ
る。場合により、問題の植物から単離することができる
調節遺伝子を上流に配列して、本発明に従う構造遺伝子
のみを使用する。
本発明に従って形質転換された植物細胞及び植物の増
加した抵抗は、農業及び林業にとって、装飾用の植物の
栽培にとって、薬用植物の栽培及び植物の繁殖にとって
重要である。例えば製薬学的に有用な物質の製造のため
に植物細胞の培養において、有害微生物特に、菌類の攻
撃に対して増加した抵抗を示す植物細胞を入手可能とす
ることも又有利である。
加した抵抗は、農業及び林業にとって、装飾用の植物の
栽培にとって、薬用植物の栽培及び植物の繁殖にとって
重要である。例えば製薬学的に有用な物質の製造のため
に植物細胞の培養において、有害微生物特に、菌類の攻
撃に対して増加した抵抗を示す植物細胞を入手可能とす
ることも又有利である。
故に、本発明は、 （ａ）１種又は１種より多くのスチルベンシンターゼ遺
伝子又は遺伝子単位及び／又はそれらの一部及び／又は
本発明に従って修飾されたDNAを、植物細胞（プロトプ
ラストを包含する）のゲノムに導入し、そして場合によ
り、 （ｂ）形質転換された植物細胞（プロトプラストを包含
する）から完全な形質転換された植物を再生し、そして
場合により、 （ｃ）このようにして得られた形質転換された植物か
ら、植物の所望の一部（種子を包含する）を回収するこ
とを特徴とする、形質転換された植物細胞（プロトラス
トを包含する）及び植物（植物の一部及び種子を包含す
る）の製造方法にも関する。
伝子又は遺伝子単位及び／又はそれらの一部及び／又は
本発明に従って修飾されたDNAを、植物細胞（プロトプ
ラストを包含する）のゲノムに導入し、そして場合によ
り、 （ｂ）形質転換された植物細胞（プロトプラストを包含
する）から完全な形質転換された植物を再生し、そして
場合により、 （ｃ）このようにして得られた形質転換された植物か
ら、植物の所望の一部（種子を包含する）を回収するこ
とを特徴とする、形質転換された植物細胞（プロトラス
トを包含する）及び植物（植物の一部及び種子を包含す
る）の製造方法にも関する。
プロセス工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は公知のプロセ
ス及び方法により慣用の如くして行うことができる。
ス及び方法により慣用の如くして行うことができる。
１つ又はそれより多くのスチルベンシンターゼ遺伝子
又は遺伝子単位及び／又はスチルベンシンターゼ遺伝子
又は遺伝子単位の一部を“外来"DNA又は“追加の"DNAと
して含有する形質転換された植物細胞（プロトプラスト
を包含する）及び植物（植物の一部及び種子を包含す
る）並びに、上記の方法により得られる形質転換された
植物細胞及び植物も又、本発明の主題である。
又は遺伝子単位及び／又はスチルベンシンターゼ遺伝子
又は遺伝子単位の一部を“外来"DNA又は“追加の"DNAと
して含有する形質転換された植物細胞（プロトプラスト
を包含する）及び植物（植物の一部及び種子を包含す
る）並びに、上記の方法により得られる形質転換された
植物細胞及び植物も又、本発明の主題である。
下記のことも本発明の一部である。
（ａ）植物細胞（プロトプラストを包含する）及び植物
（植物の一部及び種子を包含する）の形質転換のため
の、スチルベンシンターゼ遺伝式又は遺伝子単位及び／
又はその一部及び／又は本発明に従って、修飾されたDN
A、及び／又は本発明に従うベクター、及び／又は本発
明に従って形質転換された微生物の使用及び （ｂ）増殖物質の製造のため及び新規な植物及びその増
殖物質の製造のための、本発明に従って形質転換された
植物細胞（プロトプラストを包含する）及び植物（植物
の一部及び種子を包含する）の使用、及び （ｃ）有害生物を駆除するための、本発明に従うスチル
ベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単位及び／又はその一
部及び／又は本発明に従って修飾されたDNAの使用。
（植物の一部及び種子を包含する）の形質転換のため
の、スチルベンシンターゼ遺伝式又は遺伝子単位及び／
又はその一部及び／又は本発明に従って、修飾されたDN
A、及び／又は本発明に従うベクター、及び／又は本発
明に従って形質転換された微生物の使用及び （ｂ）増殖物質の製造のため及び新規な植物及びその増
殖物質の製造のための、本発明に従って形質転換された
植物細胞（プロトプラストを包含する）及び植物（植物
の一部及び種子を包含する）の使用、及び （ｃ）有害生物を駆除するための、本発明に従うスチル
ベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単位及び／又はその一
部及び／又は本発明に従って修飾されたDNAの使用。
スチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単位又はそれ
らの一部を、植物又は植物細胞の遺伝物質に“外来"DNA
又は“追加の"DNAとして挿入するために、多数の異なる
方法が利用可能である。遺伝子導入は、一般に慣用の公
知方法により行うことができ、各場合に当業者が適当な
技術を困難なく選ぶことが可能である。
らの一部を、植物又は植物細胞の遺伝物質に“外来"DNA
又は“追加の"DNAとして挿入するために、多数の異なる
方法が利用可能である。遺伝子導入は、一般に慣用の公
知方法により行うことができ、各場合に当業者が適当な
技術を困難なく選ぶことが可能である。
双子葉植物及び単子葉植物のゲノムに“外来"DNAを導
入するために、広く使用することができる特に好ましい
ベクターして、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）が利用可能である。ス
チルベンシンターゼをコードする遺伝子物質は、適当な
TiプラスミドのＴ−DNAに挿入され［例えばザンブリス
キー等（Zambryski et al）、1983］そして植物の接
種、植物の一部の接種又は植物組織、例えば葉盤（leaf
discs）、葉柄（stalks）、胚軸（hypocotylus）、子
葉（cotyledons）、分裂組織（merisyems）及びそれら
由来の組織、例えば、二次胚（second embryos）及びカ
ルス（calli）の接種により、あるいはプロトプラスト
とアグロバクテリウム・ツムファシエンスとの共培養
（co−culture）によって導入される。別法として、所
望の遺伝子を含む精製したDNA及び植物プロトプラスト
をポリカチオン又はカルシウム塩及びポリエチレングリ
コールの存在下にインキュベーショすることができる
［例えば、デイビー等（Daby et al）、1980;ハイン等
（Hain et al）、1985:クレンス等（Krens et al）、19
82;パスツコフスキー等（Paszkowski et al）、198
4］。
入するために、広く使用することができる特に好ましい
ベクターして、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）が利用可能である。ス
チルベンシンターゼをコードする遺伝子物質は、適当な
TiプラスミドのＴ−DNAに挿入され［例えばザンブリス
キー等（Zambryski et al）、1983］そして植物の接
種、植物の一部の接種又は植物組織、例えば葉盤（leaf
discs）、葉柄（stalks）、胚軸（hypocotylus）、子
葉（cotyledons）、分裂組織（merisyems）及びそれら
由来の組織、例えば、二次胚（second embryos）及びカ
ルス（calli）の接種により、あるいはプロトプラスト
とアグロバクテリウム・ツムファシエンスとの共培養
（co−culture）によって導入される。別法として、所
望の遺伝子を含む精製したDNA及び植物プロトプラスト
をポリカチオン又はカルシウム塩及びポリエチレングリ
コールの存在下にインキュベーショすることができる
［例えば、デイビー等（Daby et al）、1980;ハイン等
（Hain et al）、1985:クレンス等（Krens et al）、19
82;パスツコフスキー等（Paszkowski et al）、198
4］。
更に、DNA取り込みには、電界により高めることもで
きる［エレクトロポレーション（electroporation）、
例えば、フォルム等（Formm et al）、1986］。
きる［エレクトロポレーション（electroporation）、
例えば、フォルム等（Formm et al）、1986］。
植物の再生は適当な普通培地（nutrientmedia）の使
用により行なわれる［例えば、ネイギー（Nagy）及びマ
リガ（Maliga）、1976］。
用により行なわれる［例えば、ネイギー（Nagy）及びマ
リガ（Maliga）、1976］。
本発明に従う方法（ヨーロッパ特許出願第116,718号
の方法に従う）好ましい態様においては、適当な内部Ec
oR I、Hind III又はPst I開裂部位（第１図参照）によ
り特徴付けられるpGS828.1からの（約）6.7kbから成るD
NA単位を、適当な中間大腸菌ベクター、例えばpGV700、
pGV710［ヨーロッパ特許出願第116,718号、デブラエレ
（Deblaere）等、1986参照］又は好ましくはその誘導
体、これらは更に例えばnpt II［ヘレラーエストレラ
（Herrera−Estrella）等、1983］又はhpt［バン・デン
・エルツェン（Van den Erzen）等、1986］の如きレポ
ーター遺伝子（reporter gene）を含んでいる、中にク
ローン化される。この目的で、Sst I及びPvu IIの使用
によりpGS828.1から得られるDNA区域も使用することが
できる。
の方法に従う）好ましい態様においては、適当な内部Ec
oR I、Hind III又はPst I開裂部位（第１図参照）によ
り特徴付けられるpGS828.1からの（約）6.7kbから成るD
NA単位を、適当な中間大腸菌ベクター、例えばpGV700、
pGV710［ヨーロッパ特許出願第116,718号、デブラエレ
（Deblaere）等、1986参照］又は好ましくはその誘導
体、これらは更に例えばnpt II［ヘレラーエストレラ
（Herrera−Estrella）等、1983］又はhpt［バン・デン
・エルツェン（Van den Erzen）等、1986］の如きレポ
ーター遺伝子（reporter gene）を含んでいる、中にク
ローン化される。この目的で、Sst I及びPvu IIの使用
によりpGS828.1から得られるDNA区域も使用することが
できる。
容易に単離できる形態でベクターpGV710を含む大腸菌
株AZ 4は、特許手続きの目的で微生物の寄託の国際的承
認に基づくブダペスト条約の条項に従って、ドイツ連邦
共和国、Ｄ−3300ブラウンシュバイヒ、マッシェロデル
ベーグ1b、ドイツ微生物収集機関（Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen（DSM）,Mascheroder wEG 1b、Ｄ
−3300 Brawnschweig,Federal Republic of Germany）
に寄託されておりそして寄託番号DSM3164を持ってい
る。
株AZ 4は、特許手続きの目的で微生物の寄託の国際的承
認に基づくブダペスト条約の条項に従って、ドイツ連邦
共和国、Ｄ−3300ブラウンシュバイヒ、マッシェロデル
ベーグ1b、ドイツ微生物収集機関（Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen（DSM）,Mascheroder wEG 1b、Ｄ
−3300 Brawnschweig,Federal Republic of Germany）
に寄託されておりそして寄託番号DSM3164を持ってい
る。
このようにして構成されたプラスミドは、例えば、pG
V3850又はその誘導体（ザムブリスキー等、1983）を含
むアグロバクテリウム・ツムファシエンスに慣用の方法
［例えば、バン・ハウテ（Van Haute）等、1983］によ
り導入される。別法として、スチルベンシンターゼ遺伝
子単位はバイナリーベクター（binary vector）［例え
ば、コンクツ（Koncz）及びシェル（Shell）、1986］に
おいてクローニングすることができそして上述の如くし
て適当なアグロバクテリウム菌株（コンクツ及びシェ
ル、1986）に導入することができる。植物に導入するこ
とができる形態でスチルベンシンターゼ遺伝子単位を含
む得られるアグロバクテリウム菌株はその後植物形成の
ために使用される。
V3850又はその誘導体（ザムブリスキー等、1983）を含
むアグロバクテリウム・ツムファシエンスに慣用の方法
［例えば、バン・ハウテ（Van Haute）等、1983］によ
り導入される。別法として、スチルベンシンターゼ遺伝
子単位はバイナリーベクター（binary vector）［例え
ば、コンクツ（Koncz）及びシェル（Shell）、1986］に
おいてクローニングすることができそして上述の如くし
て適当なアグロバクテリウム菌株（コンクツ及びシェ
ル、1986）に導入することができる。植物に導入するこ
とができる形態でスチルベンシンターゼ遺伝子単位を含
む得られるアグロバクテリウム菌株はその後植物形成の
ために使用される。
更に好ましい態様においては、単利されたプラスミド
pGS828.1は、場合により、例えばカナマイシン抵抗性
（例えば、ヘレラーエストレラ等1983）又はビクロマイ
シン（hygromycin）抵抗性（バン・デン・エルツェン、
1986）についての植物細胞のためのレポーター遺伝子を
含有する他のプラスミド、好ましくは、pLGV neo2103
（ハイン等、1985）、pLGV23neo（ヘレラーエストレ
ラ、1983、pMON129［フレーリー・アール・テイ等、プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエイ第80巻、
4803（1983）（Fraley R.T.et al.,Proc.National.Aca
d.Sci.USA 80,4803（1983）］、pAK1003、pAK2004［ベ
ルテン・ジェイ等、イーエムビーオー・ジャーナル、第
３巻、2723（1984）（Velten J.et al.,EMBO Journ.Vo
l.3,2723（1984）］、又はpGSSTneo3（pGSST3）（ヨー
ロッパ特許出願第189,707号）と共に、植物プロトプラ
ストに直接遺伝子導入（例えばハイン等、1985）により
慣用の方法で導入される。上記のプラスミド（１種又は
１種より多く）は、それらの環状形態で存在することが
できるが、好ましくはそれらの線状形態で存在すること
ができる。レポーター遺伝子を有するプラスミドを使用
する場合には、カナマイシン抵抗性プロトプラストをス
チルベンシンターゼの発現について検査する。他の場合
（レポーター遺伝子のない）には、得られるカルス（ca
lli）をスチルベンシンターゼ遺伝子の発現について検
査する（慣用の方法によるスクリーニング）。
pGS828.1は、場合により、例えばカナマイシン抵抗性
（例えば、ヘレラーエストレラ等1983）又はビクロマイ
シン（hygromycin）抵抗性（バン・デン・エルツェン、
1986）についての植物細胞のためのレポーター遺伝子を
含有する他のプラスミド、好ましくは、pLGV neo2103
（ハイン等、1985）、pLGV23neo（ヘレラーエストレ
ラ、1983、pMON129［フレーリー・アール・テイ等、プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエイ第80巻、
4803（1983）（Fraley R.T.et al.,Proc.National.Aca
d.Sci.USA 80,4803（1983）］、pAK1003、pAK2004［ベ
ルテン・ジェイ等、イーエムビーオー・ジャーナル、第
３巻、2723（1984）（Velten J.et al.,EMBO Journ.Vo
l.3,2723（1984）］、又はpGSSTneo3（pGSST3）（ヨー
ロッパ特許出願第189,707号）と共に、植物プロトプラ
ストに直接遺伝子導入（例えばハイン等、1985）により
慣用の方法で導入される。上記のプラスミド（１種又は
１種より多く）は、それらの環状形態で存在することが
できるが、好ましくはそれらの線状形態で存在すること
ができる。レポーター遺伝子を有するプラスミドを使用
する場合には、カナマイシン抵抗性プロトプラストをス
チルベンシンターゼの発現について検査する。他の場合
（レポーター遺伝子のない）には、得られるカルス（ca
lli）をスチルベンシンターゼ遺伝子の発現について検
査する（慣用の方法によるスクリーニング）。
形質転換された（トランスジェニック）植物又は植物
細胞は、例えば、葉盤の形質転換［例えば、ホーシュ
（Horsch）等、1985］、再生性植物プロトプラスト又は
細胞培養物とアグロバクテリウム・ツムファシエンスと
の共培養［例えば、モルトン（Morton）等、1979、ハイ
ン等、1985］、又は直接DNAトランスフェクションによ
って、公知方法により生産される。得られる形質転換さ
れた植物は、例えばカナマイシンサルフェートの試験管
内リン酸化［ライス（Reiss）等、1984;シュライエル
（Schreier）等、1985］によるレポーター遺伝子の発現
に基づく選択又はノザンブロット分析（Northern blot
analysis）及びウエスタンブロット分析（Western blot
anarysis］によるノパリンシンターゼ（nopaline synt
hase）の発現［アエルツ（Aerts）等、1983の方法によ
り）又はスチルベンシンターゼの発現により同定され
る。スチルベンシンターゼ及びスチルベンも又、形質転
換された植物において公知の方法で特異的抗体の使用に
より同定される。スチルベンシンターゼは、酵素活性ア
ッセイによって検出することもできる［ロスフス（Rolf
s）等、プラント・セル・レポーツ（Plant Cell Report
s）第１巻、83−85、1981］。
細胞は、例えば、葉盤の形質転換［例えば、ホーシュ
（Horsch）等、1985］、再生性植物プロトプラスト又は
細胞培養物とアグロバクテリウム・ツムファシエンスと
の共培養［例えば、モルトン（Morton）等、1979、ハイ
ン等、1985］、又は直接DNAトランスフェクションによ
って、公知方法により生産される。得られる形質転換さ
れた植物は、例えばカナマイシンサルフェートの試験管
内リン酸化［ライス（Reiss）等、1984;シュライエル
（Schreier）等、1985］によるレポーター遺伝子の発現
に基づく選択又はノザンブロット分析（Northern blot
analysis）及びウエスタンブロット分析（Western blot
anarysis］によるノパリンシンターゼ（nopaline synt
hase）の発現［アエルツ（Aerts）等、1983の方法によ
り）又はスチルベンシンターゼの発現により同定され
る。スチルベンシンターゼ及びスチルベンも又、形質転
換された植物において公知の方法で特異的抗体の使用に
より同定される。スチルベンシンターゼは、酵素活性ア
ッセイによって検出することもできる［ロスフス（Rolf
s）等、プラント・セル・レポーツ（Plant Cell Report
s）第１巻、83−85、1981］。
形質転換された植物細胞の培養及び完全な植物への再
生も又、各場合に適当な普通培地を使用して慣用の方法
により行なわれる。
生も又、各場合に適当な普通培地を使用して慣用の方法
により行なわれる。
本発明に従うスチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子
単位を含みそして本発明の構成部分である形質転換され
た植物細胞及び形質転換された植物の両方共、有害生
物、特に植物病原性菌類に対する相当高い抵抗性を示
す。
単位を含みそして本発明の構成部分である形質転換され
た植物細胞及び形質転換された植物の両方共、有害生
物、特に植物病原性菌類に対する相当高い抵抗性を示
す。
本発明に関連して、“植物”という用語は、安全な植
物及び植物の一部、例えば、葉、種子、塊茎（tuber
s）、挿木（cuttings）等を表す。“植物細胞”という
用語は、プロトプラスト、株化細胞（cell lines）、植
物（カルス（plant calli）等を包含する。“増殖物
質”（propagation material）は、形質転換された植物
及び植物細胞を増殖させるために使用することができる
植物及び植物細胞を表し、かくして本発明の一部でもあ
る。
物及び植物の一部、例えば、葉、種子、塊茎（tuber
s）、挿木（cuttings）等を表す。“植物細胞”という
用語は、プロトプラスト、株化細胞（cell lines）、植
物（カルス（plant calli）等を包含する。“増殖物
質”（propagation material）は、形質転換された植物
及び植物細胞を増殖させるために使用することができる
植物及び植物細胞を表し、かくして本発明の一部でもあ
る。
本発明に関連して、“本質的に同じように作用するDN
A配列”という用語は、本発明が、スチルベンシンター
ゼがもはや生産されなくなる程度又は遺伝子の調節部分
がもはや活性ではなくなる程度には、スチルベンシンタ
ーゼ遺伝子及びその一部の機能が損なわれない装飾も包
含することを示す。適当な装飾はDNA切片、個々のコド
ン及び／又は個々の核酸の置換、追加及び／又は除去に
より行うことができる。
A配列”という用語は、本発明が、スチルベンシンター
ゼがもはや生産されなくなる程度又は遺伝子の調節部分
がもはや活性ではなくなる程度には、スチルベンシンタ
ーゼ遺伝子及びその一部の機能が損なわれない装飾も包
含することを示す。適当な装飾はDNA切片、個々のコド
ン及び／又は個々の核酸の置換、追加及び／又は除去に
より行うことができる。
本発明に従って使用することができる微生物の場合
に、“突然変異体”及び“変異体”とは、本発明を遂行
するのに必須の特徴、特に直接関連した（relevant）プ
ラスミドを依然として含んでいる修飾された微生物を示
す。
に、“突然変異体”及び“変異体”とは、本発明を遂行
するのに必須の特徴、特に直接関連した（relevant）プ
ラスミドを依然として含んでいる修飾された微生物を示
す。
本発明を下記の例示的態様によって更に詳細に説明す
る。
る。
1.スチルベンシンターゼための遺伝子の単離 ナンキンマメ植物（groundnut plants）［アラキス・
ヒポガエア（Arachis hypogaea）の細胞培養物は、特に
レスベラトロールシンターゼ（このタンパク質の寸法4
3,000D、特異的抗血清との反応）の合成を行うスチルベ
ンシンターゼのための遺伝子を含む。
ヒポガエア（Arachis hypogaea）の細胞培養物は、特に
レスベラトロールシンターゼ（このタンパク質の寸法4
3,000D、特異的抗血清との反応）の合成を行うスチルベ
ンシンターゼのための遺伝子を含む。
ナンキンマメ細胞培養物、スチルベンシンターゼの調
節及び性質、そのタンパク質に対する抗血清及び酵素活
性の測定は記載されている［ロルフ・シー・エイチ、フ
リッエマイエル・ケイ・エイチ、キンドル・エイチ、プ
ラント・セル・レポート第１巻、83−85、1981;フリッ
エマイエル・ケイ・エイチ、ロルフス・シー・エイチ、
プファオ・ジエイ、キンドル・エイチ、プランタ第159
巻、25−29、1983;ショップナー・エイ、キンドル・エ
イチ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー・259、6806−6811、1984;アブストラクト：キンドル
・エイチ、：材料成分の生合成及び生劣化、編者、ヒグ
チ・テイ、アカデミック・プレス・インコーポレーテッ
ド、349−377頁、1985（Rolfs,C.H.,Fritzemier,K.H.,K
indl,H.,Plant Cell Reports １,83−85,1981;Fritzeme
ier,K.H.,Rolfs,C.H.,Pfau,J.,Kindl,H.,Planta159,25
−29,1983;Schoppner.A.,Kindl,H.,J.Biol.Chem.259,68
06−6811,1984;see also Abstract:Kindl,H.,in:Biosyn
thesis and Biodegradation of Wood Components,Ed.Hi
guchi,T.,Academic Press,Inc.,pp.349−377,1985）。
節及び性質、そのタンパク質に対する抗血清及び酵素活
性の測定は記載されている［ロルフ・シー・エイチ、フ
リッエマイエル・ケイ・エイチ、キンドル・エイチ、プ
ラント・セル・レポート第１巻、83−85、1981;フリッ
エマイエル・ケイ・エイチ、ロルフス・シー・エイチ、
プファオ・ジエイ、キンドル・エイチ、プランタ第159
巻、25−29、1983;ショップナー・エイ、キンドル・エ
イチ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー・259、6806−6811、1984;アブストラクト：キンドル
・エイチ、：材料成分の生合成及び生劣化、編者、ヒグ
チ・テイ、アカデミック・プレス・インコーポレーテッ
ド、349−377頁、1985（Rolfs,C.H.,Fritzemier,K.H.,K
indl,H.,Plant Cell Reports １,83−85,1981;Fritzeme
ier,K.H.,Rolfs,C.H.,Pfau,J.,Kindl,H.,Planta159,25
−29,1983;Schoppner.A.,Kindl,H.,J.Biol.Chem.259,68
06−6811,1984;see also Abstract:Kindl,H.,in:Biosyn
thesis and Biodegradation of Wood Components,Ed.Hi
guchi,T.,Academic Press,Inc.,pp.349−377,1985）。
下記の線図は、スチルベンシンターゼのための遺伝子
の発現及び単離を要約している。その方法については、
分子生物学の公知の方法及び技術が使用されている。そ
れらは下記のハンドブックに詳細に述べられている。マ
ニアチス・テイ、フリッツ・イー・エフ、サムブルック
・ジエイ：モレキュラー・クローニング：実験室マニュ
アル；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、1982（Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.:Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold spring Har
bor Laboratory,1982）。
の発現及び単離を要約している。その方法については、
分子生物学の公知の方法及び技術が使用されている。そ
れらは下記のハンドブックに詳細に述べられている。マ
ニアチス・テイ、フリッツ・イー・エフ、サムブルック
・ジエイ：モレキュラー・クローニング：実験室マニュ
アル；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、1982（Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.:Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold spring Har
bor Laboratory,1982）。
A.スチルベンシンターゼのための特定のcDNAクローンの
単離及び同定 先ず最初に、スチルベンシンターゼを合成するナンキ
ンマメ細胞培養物からのポリ（Ａ）含有RNAを単離す
る。次いでこのmRNAを逆転写酵素及び大腸菌DNAポリメ
ラーゼの助けによりDNAに転写し、このDNAをリンカーの
助けによりプラスミドベクターpIN II Aにおいてクロー
ニングしそして大腸菌株JA221において増殖させる［ナ
カムラ・ケイ、イノウエ・エム、イーエムビーオー・ジ
エイ第１巻、771−775、1982（Nakamura,K.,Inoue M.,E
MBO J.１,771−775,1982）］。このプロセスで“cDNAラ
イブラリー”が得られ、これは大腸菌プラスミドにおけ
るDNAとしてクローニングされたナンキンマメ細胞のmRN
A集団を表す。それはスチルベンシンターゼをコードす
る核酸を含んでおり、これは下記のプロセスにより同定
される。
単離及び同定 先ず最初に、スチルベンシンターゼを合成するナンキ
ンマメ細胞培養物からのポリ（Ａ）含有RNAを単離す
る。次いでこのmRNAを逆転写酵素及び大腸菌DNAポリメ
ラーゼの助けによりDNAに転写し、このDNAをリンカーの
助けによりプラスミドベクターpIN II Aにおいてクロー
ニングしそして大腸菌株JA221において増殖させる［ナ
カムラ・ケイ、イノウエ・エム、イーエムビーオー・ジ
エイ第１巻、771−775、1982（Nakamura,K.,Inoue M.,E
MBO J.１,771−775,1982）］。このプロセスで“cDNAラ
イブラリー”が得られ、これは大腸菌プラスミドにおけ
るDNAとしてクローニングされたナンキンマメ細胞のmRN
A集団を表す。それはスチルベンシンターゼをコードす
る核酸を含んでおり、これは下記のプロセスにより同定
される。
（ｉ）特定のcDNAはスチルベンシンターゼmRNAとハイブ
リダイゼーションする。
リダイゼーションする。
（ii）cDNAとのハイブリダイゼーションによりmRNAが単
離され、このmRNAは、試験管内翻訳で、スチルベンシン
ターゼと同一のタンパク質を生じる（タンパク質サイズ
43,000D;スチルベンシンターゼタンパク質と特異的に反
応する抗血清と上記タンパク質との反応）。
離され、このmRNAは、試験管内翻訳で、スチルベンシン
ターゼと同一のタンパク質を生じる（タンパク質サイズ
43,000D;スチルベンシンターゼタンパク質と特異的に反
応する抗血清と上記タンパク質との反応）。
cDNAレベルで、これらの基準はスチルベンシンターゼ
タンパク質をコードする核酸をはっきりと規定する。
タンパク質をコードする核酸をはっきりと規定する。
B.スチルベンシンターゼための電子の単離 先ず最初に、ナンキンマメ細胞の“遺伝子ライブラリ
ー”を確立し、富化された細胞核（enriched cell nucl
ei）からのゲノムDNA［ベドブルック・ジエイ、プラン
ト・モレキュラー・バイオロジ・レターズ第２巻、24、
1981（Bedbrook,J.,Plant Molecular Biology Newslett
er ２,24,1981）］を、10,000−25,000ヌクレオチド対
の平均長さを持ったDNA断片が形成されるような制限酵
素Sau III aにより開裂する。これらの断片をラムダフ
ァージEMBL3のBamH I部位にクローニングし［フリッシ
ャウフ等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー170、827−842、1983（Frischauf et al., J.Mol.B
iol.170,827−842,1983）］、そしてこのファージを大
腸菌中で増殖させる。ファージ集団の全体は断片におい
てクローニングされた状態でナンキンマメ細胞の完全な
ゲノムDNAを含み、従ってスチルベンシンターゼのため
の遺伝子も含む。
ー”を確立し、富化された細胞核（enriched cell nucl
ei）からのゲノムDNA［ベドブルック・ジエイ、プラン
ト・モレキュラー・バイオロジ・レターズ第２巻、24、
1981（Bedbrook,J.,Plant Molecular Biology Newslett
er ２,24,1981）］を、10,000−25,000ヌクレオチド対
の平均長さを持ったDNA断片が形成されるような制限酵
素Sau III aにより開裂する。これらの断片をラムダフ
ァージEMBL3のBamH I部位にクローニングし［フリッシ
ャウフ等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー170、827−842、1983（Frischauf et al., J.Mol.B
iol.170,827−842,1983）］、そしてこのファージを大
腸菌中で増殖させる。ファージ集団の全体は断片におい
てクローニングされた状態でナンキンマメ細胞の完全な
ゲノムDNAを含み、従ってスチルベンシンターゼのため
の遺伝子も含む。
スチルベンシンターゼのための遺伝子、そのmRNA及び
スチルベンシンターゼcDNAは、同じ核酸配列を含む。そ
の理由は、それらは互いに誘導される（遺伝子−→mRNA
−→cDNA）からである。これは、スチルベンシンターゼ
のための遺伝子はスチルベンシンターゼcDNA又はスチル
ベンシンターゼmRNAとのハイブリダイゼーションにより
同定されうることを意味する。遺伝子を含むファージ
を、ハイブリダイゼーションにより同定し、次いで単離
しそして増殖させる。このファージにおいてクローニン
グされたナンキンマメ細胞からのゲノムDNAは、種々の
制御酵素による分析により更にマッピングされそしてス
チルベンシンターゼ遺伝子の位置はcDNAとの更なるハイ
ブリダイゼーションにより突き止められる。最終的に、
その遺伝子単位はEcoR I及びHind IIIによる部分消化に
よりファージから開裂されそして対応して開裂されたプ
ラスミドベクターpSP65［西ドイツ、ブルンスウイック
のアメルシャム・バチュラー社（Amersham Buchler Gmb
H ＆ KG,Brunswick,Federal Republic of Germany）か
ら］においてクローニングされ、そして組換えプラスミ
ドとして増殖させる。このプラスミドをpGS828.1と呼
ぶ。
スチルベンシンターゼcDNAは、同じ核酸配列を含む。そ
の理由は、それらは互いに誘導される（遺伝子−→mRNA
−→cDNA）からである。これは、スチルベンシンターゼ
のための遺伝子はスチルベンシンターゼcDNA又はスチル
ベンシンターゼmRNAとのハイブリダイゼーションにより
同定されうることを意味する。遺伝子を含むファージ
を、ハイブリダイゼーションにより同定し、次いで単離
しそして増殖させる。このファージにおいてクローニン
グされたナンキンマメ細胞からのゲノムDNAは、種々の
制御酵素による分析により更にマッピングされそしてス
チルベンシンターゼ遺伝子の位置はcDNAとの更なるハイ
ブリダイゼーションにより突き止められる。最終的に、
その遺伝子単位はEcoR I及びHind IIIによる部分消化に
よりファージから開裂されそして対応して開裂されたプ
ラスミドベクターpSP65［西ドイツ、ブルンスウイック
のアメルシャム・バチュラー社（Amersham Buchler Gmb
H ＆ KG,Brunswick,Federal Republic of Germany）か
ら］においてクローニングされ、そして組換えプラスミ
ドとして増殖させる。このプラスミドをpGS828.1と呼
ぶ。
2.プラスミドpGS828.1の説明（第１図及び第２図参照） このプラスミドは２つの構成部分から成る。
（ｉ）遺伝子単位スチルベンシンターゼ：構造遺伝子と
調節部分（両方共ナンキンマメ細胞からの）から成る完
全な遺伝子は、制限酵素EcoR I及びHind IIIによる部分
開裂により（約）6700ヌクレオチド対のDNA断片として
プラスミドから開裂される核酸上にある。この遺伝子単
位は制限酵素EcoR I、Hind III及びPst Iの開裂部位を
含む。
調節部分（両方共ナンキンマメ細胞からの）から成る完
全な遺伝子は、制限酵素EcoR I及びHind IIIによる部分
開裂により（約）6700ヌクレオチド対のDNA断片として
プラスミドから開裂される核酸上にある。この遺伝子単
位は制限酵素EcoR I、Hind III及びPst Iの開裂部位を
含む。
（ii）ベクタープラスミド：遺伝行単位はベクターpSP6
5においてクローニングされる。このベクターのサイズ
は3,000ヌクレオチド対である。それは、アンピシリン
抵抗のための遺伝子を担っている。即ち、このプラスミ
ドを含む大腸菌は抗生物質アンシリンを含む普通培地中
で増殖する。Ori:大腸菌中のプラスミドの増殖にとって
必要な配列の名称。
5においてクローニングされる。このベクターのサイズ
は3,000ヌクレオチド対である。それは、アンピシリン
抵抗のための遺伝子を担っている。即ち、このプラスミ
ドを含む大腸菌は抗生物質アンシリンを含む普通培地中
で増殖する。Ori:大腸菌中のプラスミドの増殖にとって
必要な配列の名称。
上記プラスミドは、アンピシリン抵抗のための遺伝子
を担っておりそして9,350ヌクレオチド対（9.35kBp）を
含む。それは普通の方法でpGS828.1を含む大腸菌［大腸
菌Nurdug2010（E.coli.Nurdug 2010）］において増殖す
ることができる。
を担っておりそして9,350ヌクレオチド対（9.35kBp）を
含む。それは普通の方法でpGS828.1を含む大腸菌［大腸
菌Nurdug2010（E.coli.Nurdug 2010）］において増殖す
ることができる。
pGS828.1を含む大腸菌細胞（E.coli.Nurdug 2010）の
ための好ましい普通培地［例えば、JA221、ナカムラ・
ケイ、イノウエ・エム、イーエムビーオー・ジエイ第１
巻、771−775、1982（JA221,Nakamura,K.,Inoue,M.,EMB
O J.１,771−775、1982）］： バクトペプトン＊（Bacto peptone） 10g 酵母エキス 5g NaCl 5g 寒天 20g H2O １ pH7.5 発酵:37℃、好気的 ［＊バクト（Bacto）は、米国、デトロイトのディフコ
・ラボラトリー（DIFCO Lab）の商標である］。
ための好ましい普通培地［例えば、JA221、ナカムラ・
ケイ、イノウエ・エム、イーエムビーオー・ジエイ第１
巻、771−775、1982（JA221,Nakamura,K.,Inoue,M.,EMB
O J.１,771−775、1982）］： バクトペプトン＊（Bacto peptone） 10g 酵母エキス 5g NaCl 5g 寒天 20g H2O １ pH7.5 発酵:37℃、好気的 ［＊バクト（Bacto）は、米国、デトロイトのディフコ
・ラボラトリー（DIFCO Lab）の商標である］。
3.タバコの形質転換 ａ）タバコ苗条（shoots）の培養及びタバコプロトプラ
ストの単離 ニコチアナ・タバクム（ペチト・ハバンナSR1）［Nic
otiana tabacum（Petit Havanna SR1）］をホルモンを
含まないLS培地（リンズメイアー及びスクーグ、1965）
で無菌苗条培養として増殖させる。ほぼ６−８週間毎
に、苗条セグメントを新たなLS培地に移す。苗条培養物
を生育室において24−26℃で12時間光照射（1,000−3,0
00ルックス）に保つ。
ストの単離 ニコチアナ・タバクム（ペチト・ハバンナSR1）［Nic
otiana tabacum（Petit Havanna SR1）］をホルモンを
含まないLS培地（リンズメイアー及びスクーグ、1965）
で無菌苗条培養として増殖させる。ほぼ６−８週間毎
に、苗条セグメントを新たなLS培地に移す。苗条培養物
を生育室において24−26℃で12時間光照射（1,000−3,0
00ルックス）に保つ。
葉プロトプラストの単離のために、約2gの葉（約３−
5cm長さ）を、新しいかみそり刃を使用して小片（0.5cm
×1cm）に切る。この葉物質を、K3培地（ネイギー及び
マリガ1976）、0.4Mスクロース、pH5.6、２％セルラー
ゼR10（セルバ）及び0.5％マセロチム（Nacerozyme）R1
0（セルバ）から成る酵素溶液20ml中で室温で14−16時
間インキュベーションする。この後、0.3mm及び0.1mm鋼
製ふるいを使用して、ろ過により細胞砕片（cell debri
s）からプロトプラストを分離する。ろ液を100×ｇで10
分間遠心分離する。この遠心分離の間、無傷のプロトプ
ラストが浮上しそして酵素溶液の上部縁にバンド状に集
まる。細胞砕片のペレット及び酵素溶液をガラス毛細管
を使用する吸引により除去する。予備精製したプロトプ
ラストを新たなK3培地（浸透圧的に活性な成分として0.
4Mスクロース）により10mlに構成し、そして再び浮上さ
せる。洗浄培地を吸引により除去し、そしてプロトプラ
ストを、培養のため又は続くアグロバクテリアとの接種
［共培養（co−culture）］のために１−２×105/mlに
希釈する。プロトプラストの濃度は、計数細胞において
決定される。
5cm長さ）を、新しいかみそり刃を使用して小片（0.5cm
×1cm）に切る。この葉物質を、K3培地（ネイギー及び
マリガ1976）、0.4Mスクロース、pH5.6、２％セルラー
ゼR10（セルバ）及び0.5％マセロチム（Nacerozyme）R1
0（セルバ）から成る酵素溶液20ml中で室温で14−16時
間インキュベーションする。この後、0.3mm及び0.1mm鋼
製ふるいを使用して、ろ過により細胞砕片（cell debri
s）からプロトプラストを分離する。ろ液を100×ｇで10
分間遠心分離する。この遠心分離の間、無傷のプロトプ
ラストが浮上しそして酵素溶液の上部縁にバンド状に集
まる。細胞砕片のペレット及び酵素溶液をガラス毛細管
を使用する吸引により除去する。予備精製したプロトプ
ラストを新たなK3培地（浸透圧的に活性な成分として0.
4Mスクロース）により10mlに構成し、そして再び浮上さ
せる。洗浄培地を吸引により除去し、そしてプロトプラ
ストを、培養のため又は続くアグロバクテリアとの接種
［共培養（co−culture）］のために１−２×105/mlに
希釈する。プロトプラストの濃度は、計数細胞において
決定される。
ｂ）アグロバクテリウム・ツムファシエンスとの共培養
による再生タバコプロトプラストの形質転換 以下において、僅かな変更を加えたモートン（Norto
n）等、1979の方法を使用する。プロトプラストを述べ
られている如くして単離し、K3培地（0.4Mスクロース、
0.1mg/NAA、0.2mg/カイネチン）中で１−２×105/m
lの密度で暗で２日及び薄暗い光（500ルックス）１−２
日26℃でインキュベーションする。プロトプラストの最
初の分裂が見られるやいなや、最小Ａ（Am）培地中のア
グロバクテリウム懸濁液30μ（密度約109/ml）を再生
プロトプラスト3mlに加える。共培養の期間は暗で20℃
にて３−４日である。この後、タバコ細胞を12mlの遠心
管に移し、海水（600mOsm/kg）で希釈して10mlとし、60
×ｇで10分間ペレット化する。この洗浄工程を更に１−
２回繰り返してアグロバクテリウムの大部分を除去す
る。細胞懸濁液を、1mg/NAA（ナフチル−１−酢
酸）、0.2mg/カイネチン及び500mg/のセファロスポ
リン抗生物質セフォタキシム（cefotaxime）を含有する
K3培地（0.3Mスクロース）中で５×104/mlの密度で培養
する。各週、細胞懸濁液を新たなK3培地で希釈し、培地
の浸透値（osmotic value）を週当たり0.05Mスクロース
（約60m Osm/kg）徐々に減少させる。カナマイシン［10
0mg/カナマイシンサルフェート（シグマ）、660mg/
の活性km］による選択をアガロースビーズ型培養物にお
ける共培養の２−３週間後開始する［シリト（Shillit
o）等、1983］。カナマイシン抵抗性コロニーは遅延し
たコロニー（retarded colonies）のバックグラウンド
から選択の開始の３−４週間後識別することができる。
による再生タバコプロトプラストの形質転換 以下において、僅かな変更を加えたモートン（Norto
n）等、1979の方法を使用する。プロトプラストを述べ
られている如くして単離し、K3培地（0.4Mスクロース、
0.1mg/NAA、0.2mg/カイネチン）中で１−２×105/m
lの密度で暗で２日及び薄暗い光（500ルックス）１−２
日26℃でインキュベーションする。プロトプラストの最
初の分裂が見られるやいなや、最小Ａ（Am）培地中のア
グロバクテリウム懸濁液30μ（密度約109/ml）を再生
プロトプラスト3mlに加える。共培養の期間は暗で20℃
にて３−４日である。この後、タバコ細胞を12mlの遠心
管に移し、海水（600mOsm/kg）で希釈して10mlとし、60
×ｇで10分間ペレット化する。この洗浄工程を更に１−
２回繰り返してアグロバクテリウムの大部分を除去す
る。細胞懸濁液を、1mg/NAA（ナフチル−１−酢
酸）、0.2mg/カイネチン及び500mg/のセファロスポ
リン抗生物質セフォタキシム（cefotaxime）を含有する
K3培地（0.3Mスクロース）中で５×104/mlの密度で培養
する。各週、細胞懸濁液を新たなK3培地で希釈し、培地
の浸透値（osmotic value）を週当たり0.05Mスクロース
（約60m Osm/kg）徐々に減少させる。カナマイシン［10
0mg/カナマイシンサルフェート（シグマ）、660mg/
の活性km］による選択をアガロースビーズ型培養物にお
ける共培養の２−３週間後開始する［シリト（Shillit
o）等、1983］。カナマイシン抵抗性コロニーは遅延し
たコロニー（retarded colonies）のバックグラウンド
から選択の開始の３−４週間後識別することができる。
ｃ）DNA・硝酸カルシウム/PEG形質転換によるタバコプ
ロトプラストの直接形質転換 ペトリ皿において、K3培地180μ中の約106プロトプ
ラストを、0.5μg/μpGS828.1及び0.5μg/μpLGVne
o2103［ハイン（Hain）等、1985］を含む水性DNA溶液を
20μと注意深く混合する。次いで融合溶液［0.1M硝酸
カルシウム、0.45Mマンニトール、25％ポリエチレング
リコール（PEG6000）、pH9］200μを注意深く加え
る。15分の後、洗浄溶液（0.275M硝酸カルシウムpH6）5
mlを加え、更に５分の後プロトプラストを遠心管に移し
そして60×ｇでペレット化する。ペレットを少量のK3培
地に取り込み下記の如くして培養する。別法として、プ
ロトプラストをハイン等1985の如くして形質転換するこ
とができる。
ロトプラストの直接形質転換 ペトリ皿において、K3培地180μ中の約106プロトプ
ラストを、0.5μg/μpGS828.1及び0.5μg/μpLGVne
o2103［ハイン（Hain）等、1985］を含む水性DNA溶液を
20μと注意深く混合する。次いで融合溶液［0.1M硝酸
カルシウム、0.45Mマンニトール、25％ポリエチレング
リコール（PEG6000）、pH9］200μを注意深く加え
る。15分の後、洗浄溶液（0.275M硝酸カルシウムpH6）5
mlを加え、更に５分の後プロトプラストを遠心管に移し
そして60×ｇでペレット化する。ペレットを少量のK3培
地に取り込み下記の如くして培養する。別法として、プ
ロトプラストをハイン等1985の如くして形質転換するこ
とができる。
別法として、形質転換は、0.5μg/μpLGVneo2103を
添加しないで行うことができる。この場合にはレポータ
ー遺伝子は使用されないので、得られるカルスは、ドッ
トーブロットハイブリダイゼーション（dot−blot hybr
idization）の助けによりスチルベンシンターゼ遺伝子
の存在についてスクリーニングされる。ハイルイダイゼ
ーションローブとしてpGS828.1からの内部EcoR I−Hind
III断片を使用することができる。
添加しないで行うことができる。この場合にはレポータ
ー遺伝子は使用されないので、得られるカルスは、ドッ
トーブロットハイブリダイゼーション（dot−blot hybr
idization）の助けによりスチルベンシンターゼ遺伝子
の存在についてスクリーニングされる。ハイルイダイゼ
ーションローブとしてpGS828.1からの内部EcoR I−Hind
III断片を使用することができる。
抗体アッセイ又は殺菌剤抵抗の決定の如き他の同定方
法ももちろん使用することができる。
法ももちろん使用することができる。
ｄ）DNAとインキュベーションされたプロトプラストの
培養及びカナマイシン抵抗性カルスの選択 下記するカナマイシン抵抗性コロニーの培養及び選択
については、修正された“ビーズ型培養”（bead type
culture）技術（シリト等1983）を使用する。DNAによる
プロトプラストの処理（ｃ参照）の１週間の後、細胞懸
濁液3mlを、K3培地［0.3Mスクロール＋ホルモン:1.2％
［シープラーク（sea−plaque）］LMTアガロース（低融
点アガロース、マリンコロイド（Marine Colloids）］3
mlと5cmのペトリ皿で混合する。この目的でアガロース
を乾燥オートクレーブ処理し、K3培地を加えた後、しば
らくしてマイクロ波オーブンで沸騰させる。アガロース
が固化した後、埋め込まれたタバコ微少カルアを含むア
ガロースディスク（“ビーズ”）を更なる培養及び選択
のために10cmのペトリ皿に移し、各々にK3培地（0.3Mス
クロース、1mg/NAA、0.2mg/カイネチン）10ml及び1
00mg/カナマイシンサルフェート（シグマ）を加え
る。この過程で、培地の浸透値を段階的に減少させる。
代替培地（K3＋Km）は１週間当たり0.0Mスクロース（約
60mOsm）減少させられる。
培養及びカナマイシン抵抗性カルスの選択 下記するカナマイシン抵抗性コロニーの培養及び選択
については、修正された“ビーズ型培養”（bead type
culture）技術（シリト等1983）を使用する。DNAによる
プロトプラストの処理（ｃ参照）の１週間の後、細胞懸
濁液3mlを、K3培地［0.3Mスクロール＋ホルモン:1.2％
［シープラーク（sea−plaque）］LMTアガロース（低融
点アガロース、マリンコロイド（Marine Colloids）］3
mlと5cmのペトリ皿で混合する。この目的でアガロース
を乾燥オートクレーブ処理し、K3培地を加えた後、しば
らくしてマイクロ波オーブンで沸騰させる。アガロース
が固化した後、埋め込まれたタバコ微少カルアを含むア
ガロースディスク（“ビーズ”）を更なる培養及び選択
のために10cmのペトリ皿に移し、各々にK3培地（0.3Mス
クロース、1mg/NAA、0.2mg/カイネチン）10ml及び1
00mg/カナマイシンサルフェート（シグマ）を加え
る。この過程で、培地の浸透値を段階的に減少させる。
代替培地（K3＋Km）は１週間当たり0.0Mスクロース（約
60mOsm）減少させられる。
ｅ）カナマイシン抵抗性植物の再生 カナマイシン抵抗性コロニーが約0.5cmの直径になる
やいなや、それらの半分を再生培地（LS培地、２％スク
ロース、0.5mg/ベンジルアミノプリンBAP）上に置
き、そして生育室で24℃で12時間の光照射（3,000−5,0
00ルックス）に保つ。他の半分は、1mg/NAA、0.2mg/
カイネチン、0.1mg/BAP及び100mg/カナマイシン
サルフェートを含有するLS培地でのカルス培養として増
殖させる。再生された苗条（shoots）が約1cmの長さに
なるやいなゆ、それらを切り取りそして根付け（rootin
g）のために生長調節物質なしの1/2LS培地（１％スクロ
ース、0.8％寒天）上に置く。苗条は100kg/カナマイ
シンサルフェートを含む1/2MS培地で根付き、そして後
に土壌に移される。
やいなや、それらの半分を再生培地（LS培地、２％スク
ロース、0.5mg/ベンジルアミノプリンBAP）上に置
き、そして生育室で24℃で12時間の光照射（3,000−5,0
00ルックス）に保つ。他の半分は、1mg/NAA、0.2mg/
カイネチン、0.1mg/BAP及び100mg/カナマイシン
サルフェートを含有するLS培地でのカルス培養として増
殖させる。再生された苗条（shoots）が約1cmの長さに
なるやいなゆ、それらを切り取りそして根付け（rootin
g）のために生長調節物質なしの1/2LS培地（１％スクロ
ース、0.8％寒天）上に置く。苗条は100kg/カナマイ
シンサルフェートを含む1/2MS培地で根付き、そして後
に土壌に移される。
ｆ）アグロバクテリウム・ツムファシエンスによる葉盤
の形質転換 葉盤の形質転換［ホルシュ（Horsch）等、1985］のた
めに、無菌苗条培養物（sterile shoot cultures）の約
２−3cm長さの葉から1cm直径の盤を切り出しAm培地（下
記参照）中で上記のアグロバクテリア（約109/ml）（ｂ
参照）の懸濁液と約５分間インキュベーションする。感
染した葉盤をホルモンなしのMS培地（下記参照）に約24
℃で３−４日間保つ。この期間、アグロバクテリウムは
葉盤にはびこる。次いで葉盤をMS培地（0.5mg/mlBAP、
0.1mg/mlNAA）で洗浄しそして500μg/mlセフォタキシム
（cefotaxim）及び100μg/mlカナマイシンサルフェート
を含む同じ培地（0.8％寒天）（シグマ）上に置く。こ
の培地は２週間の後更新されるべきである。形質転換さ
れた苗条が更に２−３週間の後に見られる。選択圧力な
しの苗条の再生も平行して行うべきである。次いで再生
された苗条は、例えばノパリンシンターゼ又はスチルベ
ンシンターゼ活性についての生物学的アッセイにより形
質転換について試験されなければならない。このように
して、１−10％の形質転換された苗条が得られる。
の形質転換 葉盤の形質転換［ホルシュ（Horsch）等、1985］のた
めに、無菌苗条培養物（sterile shoot cultures）の約
２−3cm長さの葉から1cm直径の盤を切り出しAm培地（下
記参照）中で上記のアグロバクテリア（約109/ml）（ｂ
参照）の懸濁液と約５分間インキュベーションする。感
染した葉盤をホルモンなしのMS培地（下記参照）に約24
℃で３−４日間保つ。この期間、アグロバクテリウムは
葉盤にはびこる。次いで葉盤をMS培地（0.5mg/mlBAP、
0.1mg/mlNAA）で洗浄しそして500μg/mlセフォタキシム
（cefotaxim）及び100μg/mlカナマイシンサルフェート
を含む同じ培地（0.8％寒天）（シグマ）上に置く。こ
の培地は２週間の後更新されるべきである。形質転換さ
れた苗条が更に２−３週間の後に見られる。選択圧力な
しの苗条の再生も平行して行うべきである。次いで再生
された苗条は、例えばノパリンシンターゼ又はスチルベ
ンシンターゼ活性についての生物学的アッセイにより形
質転換について試験されなければならない。このように
して、１−10％の形質転換された苗条が得られる。
形質転換の検出のための生化学的方法 植物組織におけるノパリンの検出 ノパリンは、下記の如く、オッテン（Otten）及びシ
ルペルールト（Schilperoort）（1978）及びアエルツ
（Aerts）（1979）により述べられた如くして検出され
る。植物物質（カルス又は葉盤）50mgを、エッペンドル
フ管（Eppendorf tube）中で0.1Mアルギニンを含むLS培
地で室温にて一夜インキュベーションする。次いで上記
植物物質を吸収紙でかるくはたくことにより乾燥し、ガ
ラス棒を使用して新しいエッペンドルフ遠心分離管でホ
モジナイズしそしてエッペンドルフ遠心分離において２
分間遠心分離する。２μの上澄液を、電気泳動に適し
た紙（ホワットマン3MM紙）（20×40cm）に小さな点の
形態で加える。この紙を溶媒（５％ギ酸、15％酢酸、80
％H2O、pH1.8）で含浸させそして400Vで45分間電気泳動
を行う。ノパリンはカソードに向けて移動する。次いで
この紙をホットエアの流れの中で乾燥しそしてフェナン
トレンキノン染料（等容量のエタノール中の0.02％フェ
ナントレンキノンと60％エタノール中の10％NaOH）を通
して移動の方向に引っ張る。乾燥した紙を長波長紫外光
の下で検査しそして写真に取る。アルギニン及びアルギ
ニン誘導体は上記試薬で染色されて黄色の蛍光を与え
る。
ルペルールト（Schilperoort）（1978）及びアエルツ
（Aerts）（1979）により述べられた如くして検出され
る。植物物質（カルス又は葉盤）50mgを、エッペンドル
フ管（Eppendorf tube）中で0.1Mアルギニンを含むLS培
地で室温にて一夜インキュベーションする。次いで上記
植物物質を吸収紙でかるくはたくことにより乾燥し、ガ
ラス棒を使用して新しいエッペンドルフ遠心分離管でホ
モジナイズしそしてエッペンドルフ遠心分離において２
分間遠心分離する。２μの上澄液を、電気泳動に適し
た紙（ホワットマン3MM紙）（20×40cm）に小さな点の
形態で加える。この紙を溶媒（５％ギ酸、15％酢酸、80
％H2O、pH1.8）で含浸させそして400Vで45分間電気泳動
を行う。ノパリンはカソードに向けて移動する。次いで
この紙をホットエアの流れの中で乾燥しそしてフェナン
トレンキノン染料（等容量のエタノール中の0.02％フェ
ナントレンキノンと60％エタノール中の10％NaOH）を通
して移動の方向に引っ張る。乾燥した紙を長波長紫外光
の下で検査しそして写真に取る。アルギニン及びアルギ
ニン誘導体は上記試薬で染色されて黄色の蛍光を与え
る。
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPT II）酵
素アッセイ： 植物組織のNPT II活性は、下記の如くして、ライス
（Reiss）等（1984）により述べられそしてシュライエ
ル（Schreier）等（1985）により修正されたカナマイシ
ンのその場でのリン酸化により検出される。植物組織50
mgを抽出緩衝液（10％グリセロール、５％２−メルカプ
トエタノール、0.1％SDS、0.025％ブロモフェノールブ
ルー及び62.5mMトリスpH6.8）50μ中で粉砕ガラスを
加えてホモジナイズし、氷に浸漬しそしてエッペンドル
フ遠心分離器で４℃で10分間遠心分離する。上澄液50μ
を、非変性ポリアクリルアミドゲル（145×110×1.2m
m;分離ゲル:10％アクリルアミド、0.33％ビスアクリル
アミド及び0.375MトリスpH8.8、収集ゲル:5％アクリル
アミド、0.165％ビスアクリルアミド及び0.125Mトリスp
H6.9）に加え、そして４℃及び60Vで一夜電気泳動を行
う。ブロモフェノールブルーマーカーがゲルから流れ出
るやいなや、このゲルを蒸留水で10分間２回及び反応緩
衝液（67mMトリスマレエート、pH7.1、42mMMgCl2及び40
0mM塩化アンモニウム）で30分間１回洗浄する。ゲルを
同じ寸法のガラス板上に移し、そして基質カナマイシン
サルフェート（20μg/ml）及び20−200μCi32P ATP［ア
メルシャム（Amersham）］を含有する反応緩衝液中の１
％濃度アガロース40mlの層で覆う。このサンドイッチゲ
ルを30分間室温でインキュベーションし、次いでP81ホ
スホセルロース紙（ホワットマン）のシートをアガロー
スの上に置く。４層の3MMろ紙（ホワットマン）及び少
数の紙タオルをこの上に積み重ねる。その場でリン酸化
された放射性カナマイシンホスフェートのP81紙への移
動は３−４時間の後に停止する。P81紙をプロテイナー
ゼＫ及び１％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶液中
で60℃で30分間インキュベーションし、次いで80℃で25
0mlの10mMリン酸緩衝液pH7.5で３−４回洗浄し、乾燥し
そして−70℃で１−12時間オートラジオグラフィーにか
ける（XAR5コダックフィルム）。
素アッセイ： 植物組織のNPT II活性は、下記の如くして、ライス
（Reiss）等（1984）により述べられそしてシュライエ
ル（Schreier）等（1985）により修正されたカナマイシ
ンのその場でのリン酸化により検出される。植物組織50
mgを抽出緩衝液（10％グリセロール、５％２−メルカプ
トエタノール、0.1％SDS、0.025％ブロモフェノールブ
ルー及び62.5mMトリスpH6.8）50μ中で粉砕ガラスを
加えてホモジナイズし、氷に浸漬しそしてエッペンドル
フ遠心分離器で４℃で10分間遠心分離する。上澄液50μ
を、非変性ポリアクリルアミドゲル（145×110×1.2m
m;分離ゲル:10％アクリルアミド、0.33％ビスアクリル
アミド及び0.375MトリスpH8.8、収集ゲル:5％アクリル
アミド、0.165％ビスアクリルアミド及び0.125Mトリスp
H6.9）に加え、そして４℃及び60Vで一夜電気泳動を行
う。ブロモフェノールブルーマーカーがゲルから流れ出
るやいなや、このゲルを蒸留水で10分間２回及び反応緩
衝液（67mMトリスマレエート、pH7.1、42mMMgCl2及び40
0mM塩化アンモニウム）で30分間１回洗浄する。ゲルを
同じ寸法のガラス板上に移し、そして基質カナマイシン
サルフェート（20μg/ml）及び20−200μCi32P ATP［ア
メルシャム（Amersham）］を含有する反応緩衝液中の１
％濃度アガロース40mlの層で覆う。このサンドイッチゲ
ルを30分間室温でインキュベーションし、次いでP81ホ
スホセルロース紙（ホワットマン）のシートをアガロー
スの上に置く。４層の3MMろ紙（ホワットマン）及び少
数の紙タオルをこの上に積み重ねる。その場でリン酸化
された放射性カナマイシンホスフェートのP81紙への移
動は３−４時間の後に停止する。P81紙をプロテイナー
ゼＫ及び１％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶液中
で60℃で30分間インキュベーションし、次いで80℃で25
0mlの10mMリン酸緩衝液pH7.5で３−４回洗浄し、乾燥し
そして−70℃で１−12時間オートラジオグラフィーにか
ける（XAR5コダックフィルム）。
4.メディカゴ・サチバ（アルファルファ）の形質転換 ａ）植物物質 植物メディカゴ・サチバ）［レーゲンＳ（regen
S）、クローンRA3、ウオーカー（Walker）等、1978］
を、長日条件（16時間光照射、８時間闇）下に26±２℃
でLS培地［リンズメイアー（Linsemaier）及びスクーグ
（Skoog）、1965］での無菌苗条培養物（sterile shoot
culture）として培養した。
S）、クローンRA3、ウオーカー（Walker）等、1978］
を、長日条件（16時間光照射、８時間闇）下に26±２℃
でLS培地［リンズメイアー（Linsemaier）及びスクーグ
（Skoog）、1965］での無菌苗条培養物（sterile shoot
culture）として培養した。
ｂ）培養条件 ゆるいガラスの蓋を備えたガラス容器（250ml乃至1.5
）を培養容器として使用した。すべての他の植物培養
物（胚、カルス、プロトプラスト）についてはプラスチ
ックペトリ皿を使用した。
）を培養容器として使用した。すべての他の植物培養
物（胚、カルス、プロトプラスト）についてはプラスチ
ックペトリ皿を使用した。
プロトプラストを除いては、植物及び組織培養物は長
日条件（16時間光照射、８時間闇）で26±２℃で生育室
で培養した。蛍光管は、ライトカラーユニバーサルバイ
ス（Light colour Universal Weiss）［オスラム（Osra
m）L58W/25］を有していた。培養物に対する管の距離は
1500−4500ルックス光強度に相当する10−30cmであっ
た。空気湿度は調節しなかった。プロトプラストは500
ルックス以下で26℃でインキュベーターにて培養した。
日条件（16時間光照射、８時間闇）で26±２℃で生育室
で培養した。蛍光管は、ライトカラーユニバーサルバイ
ス（Light colour Universal Weiss）［オスラム（Osra
m）L58W/25］を有していた。培養物に対する管の距離は
1500−4500ルックス光強度に相当する10−30cmであっ
た。空気湿度は調節しなかった。プロトプラストは500
ルックス以下で26℃でインキュベーターにて培養した。
ｃ）カルス培養 カルスは温室植物の葉柄から誘発させた。約5cm長さ
の葉柄切片を小刀により温室植物から切り裂いた。最初
に、葉柄切片を表面無菌化した −70％濃度エタノール中で１分 −10％濃度の市販の入手可能な消毒剤［例えばダン・
クロリクス（Dan Klorix）］中で10分間 無菌水道水で３回洗浄。
の葉柄切片を小刀により温室植物から切り裂いた。最初
に、葉柄切片を表面無菌化した −70％濃度エタノール中で１分 −10％濃度の市販の入手可能な消毒剤［例えばダン・
クロリクス（Dan Klorix）］中で10分間 無菌水道水で３回洗浄。
無菌化の後に、葉柄切片を１−1.5cmの切片に切断し
そしてペトリ皿中で固体寒天培養上に置いた。３つの異
なる培地をカルス誘発及び更なる培養のために使用し
た。
そしてペトリ皿中で固体寒天培養上に置いた。３つの異
なる培地をカルス誘発及び更なる培養のために使用し
た。
1.B5h［アタナソフ（Atanassov）及びブラウン（Brow
n）、1984］ 2.SHG:25μＭ（4.655mg/）のNAA及び10μＭ（2.15mg/
）のカイネチン［ウオーカー（Walker）及びサトウ
（Sato）、1981］を含有するSH［シェンク（Shenk）及
びヒルデブラント（Hildebrandt）、1972］、 3.B5H3:2.6μＭ（0.5mg/）のNAA、2.2μＭ（0.5mg/
）のBAP、2.2μＭ（0.5mg/）の2,4D［オエルク（Oe
lck）、博士論文1984］を含有するB5［ガンボルグ（Gam
borg）等、1968］。
n）、1984］ 2.SHG:25μＭ（4.655mg/）のNAA及び10μＭ（2.15mg/
）のカイネチン［ウオーカー（Walker）及びサトウ
（Sato）、1981］を含有するSH［シェンク（Shenk）及
びヒルデブラント（Hildebrandt）、1972］、 3.B5H3:2.6μＭ（0.5mg/）のNAA、2.2μＭ（0.5mg/
）のBAP、2.2μＭ（0.5mg/）の2,4D［オエルク（Oe
lck）、博士論文1984］を含有するB5［ガンボルグ（Gam
borg）等、1968］。
３週間の後、カルスの外側の部分を、各場合に小刀に
より切り取りそして新たな培地で二次培養した。
より切り取りそして新たな培地で二次培養した。
ｄ）カルス再生 カルスからの植物の再生は、スチュアート（Stuart）
及びストリックランド（Strickland）、1984a,bにより
修正されたプロトコルに従って行った。
及びストリックランド（Strickland）、1984a,bにより
修正されたプロトコルに従って行った。
50μＭ（11mg/）の2,4Dと５μＭ（1.07mg/）のカ
イネチンを含有する液体SH培地（シェンク及びヒルデブ
ラント、1972）中でカルス組織をインキュベーションす
ることにより体細胞不定胚形成（somatic embryogenesi
s）を誘発させた。培地1ml当たり30mgのカルス（新しい
重量）を加え、コニカルフラスコに入れた（500mlフラ
スコ中100ml）。誘発は、26℃の植物生育室内の回転シ
ェーカー（100rpm）上に３−４日間培養物を置くことに
より行った。次いでカルス組織をふるい（850μｍ）上
で培地から分離した。
イネチンを含有する液体SH培地（シェンク及びヒルデブ
ラント、1972）中でカルス組織をインキュベーションす
ることにより体細胞不定胚形成（somatic embryogenesi
s）を誘発させた。培地1ml当たり30mgのカルス（新しい
重量）を加え、コニカルフラスコに入れた（500mlフラ
スコ中100ml）。誘発は、26℃の植物生育室内の回転シ
ェーカー（100rpm）上に３−４日間培養物を置くことに
より行った。次いでカルス組織をふるい（850μｍ）上
で培地から分離した。
組織をスパチュラによってふるいを通して圧搾し、そ
して小さな細胞塊をその下に配置されているメッシュサ
イズ250μm2のふるい上に集めた。細胞塊を誘発培地100
ml当たりホルモンなしのSHJ培地（SH）500mlで洗浄し
た。できる限り多くの洗浄溶液をしたたり落とす（約５
分間）ことにより除去した。新たな重量を決定し、そし
て細胞塊をSH培地に再懸濁させた。0.5ml中の75mgを約1
0mlの固体再生培地SHR上にピペツトで移した。再生培地
SHRは、25mMのNH4 +及び100mMのＬ−プロリン及び３％の
スクロースを含有するSH培地から成っていた。
して小さな細胞塊をその下に配置されているメッシュサ
イズ250μm2のふるい上に集めた。細胞塊を誘発培地100
ml当たりホルモンなしのSHJ培地（SH）500mlで洗浄し
た。できる限り多くの洗浄溶液をしたたり落とす（約５
分間）ことにより除去した。新たな重量を決定し、そし
て細胞塊をSH培地に再懸濁させた。0.5ml中の75mgを約1
0mlの固体再生培地SHR上にピペツトで移した。再生培地
SHRは、25mMのNH4 +及び100mMのＬ−プロリン及び３％の
スクロースを含有するSH培地から成っていた。
約４週間の後、明白な極性［子葉段階、ドス・サント
ス（Dos Santos）等、1983］を示す良く発達した胚を、
25μＭ（8.6mg/）のジベリレン酸と0.25μＭ（0.046m
g/）のNAAを含有する固体1/2SH培地上に置いた。根形
成及び葉を持った苗条の発達の後、この若苗（young pl
atlets）をLS培地に移した。
ス（Dos Santos）等、1983］を示す良く発達した胚を、
25μＭ（8.6mg/）のジベリレン酸と0.25μＭ（0.046m
g/）のNAAを含有する固体1/2SH培地上に置いた。根形
成及び葉を持った苗条の発達の後、この若苗（young pl
atlets）をLS培地に移した。
培地B5h、SHJ、SHR、1/2SH及びLSの組成は表に記載さ
れている。液体SH培地はホルモン2,4Dとカキネチンなし
のSHJ培地と同等である。特記しない限り、量はmg/で
与えられる。
れている。液体SH培地はホルモン2,4Dとカキネチンなし
のSHJ培地と同等である。特記しない限り、量はmg/で
与えられる。
培地は121℃で17分間オートクレーブ処理することに
より無菌化された。カイネチン、Ｌ−グルタチオン及び
アミノ酸はフィルタ無菌化し、オートクレーブ処理の後
60℃の温度の培地に加えた。
より無菌化された。カイネチン、Ｌ−グルタチオン及び
アミノ酸はフィルタ無菌化し、オートクレーブ処理の後
60℃の温度の培地に加えた。
ｅ）プロトプラスト培養 プロトプラストの単離のための出発物質として、２−
３箇月の年令の無菌苗条培養物の葉を使用した。光に切
り替えた後２−３時間後に葉を回収した。
３箇月の年令の無菌苗条培養物の葉を使用した。光に切
り替えた後２−３時間後に葉を回収した。
−先ず最初に、ペトリ皿に入れられた葉をENI（アタ
ナソフ及びブラウン、1984）で湿潤させ、そして新しい
かみそり刃を使用して小片に切断した。
ナソフ及びブラウン、1984）で湿潤させ、そして新しい
かみそり刃を使用して小片に切断した。
−次いで約１−1.5gの葉をペトリ皿（10cm直径）で酵
素溶液10mlと共に３−４時間インキュベーションした。
インキュベーションは26℃及び薄暗い光で行われた。葉
からのプロトプラストの放出は顕微鏡下に監視された。
皿を30分毎に２−３回振った。
素溶液10mlと共に３−４時間インキュベーションした。
インキュベーションは26℃及び薄暗い光で行われた。葉
からのプロトプラストの放出は顕微鏡下に監視された。
皿を30分毎に２−３回振った。
酵素溶液は、ホルモン2,4D（0.2mg/）、ゼアチン
（zeatin）（0.5mg/）及びNAA（1mg/）を含有する
アタナソフ及びブラウン（1984）によるプロトプラスト
培養培地と酵素溶液の1:1混合物から成っていた。酵素
溶液［カオ（Kao）及びミハイルク（Michayluk）、197
9;変性された］は： −200mgのセルラーゼオノズカ（cellulase Onozuka）
R10 −80mgのマセロチム（Macerozyme）R10 セルバ（Ser
va） −10mgのペクトリアーゼ（Pectolyase）Ｙ−23 シグ
マ（Sigma） −540mgのソルビトール から成っていた。
（zeatin）（0.5mg/）及びNAA（1mg/）を含有する
アタナソフ及びブラウン（1984）によるプロトプラスト
培養培地と酵素溶液の1:1混合物から成っていた。酵素
溶液［カオ（Kao）及びミハイルク（Michayluk）、197
9;変性された］は： −200mgのセルラーゼオノズカ（cellulase Onozuka）
R10 −80mgのマセロチム（Macerozyme）R10 セルバ（Ser
va） −10mgのペクトリアーゼ（Pectolyase）Ｙ−23 シグ
マ（Sigma） −540mgのソルビトール から成っていた。
ｆ）誘発されたカルスの形質転換 カルス再生の下に前記の方法によりカルスを不定胚形
成に誘導した。液体SHJ中での３−４日間のインキュベ
ーションに続いて、寒天又はＬ−プロリンを含まない液
体SHRでふるい（メッシュサイズ）上でカルス物質を洗
浄した。カルス物質を次いで液体SHR中に取り込んだ。
約1gのカルス物質を培地10mlに加えた。
成に誘導した。液体SHJ中での３−４日間のインキュベ
ーションに続いて、寒天又はＬ−プロリンを含まない液
体SHRでふるい（メッシュサイズ）上でカルス物質を洗
浄した。カルス物質を次いで液体SHR中に取り込んだ。
約1gのカルス物質を培地10mlに加えた。
スチルベンシンターゼ遺伝子を担うTiプラスミドを含
むアクロバクテリアを加え（２×107/ml最終濃度）、そ
して回転シェーカー（90rpm）で26℃にて２−３日間イ
ンキュベーションした。
むアクロバクテリアを加え（２×107/ml最終濃度）、そ
して回転シェーカー（90rpm）で26℃にて２−３日間イ
ンキュベーションした。
次いでこの物質をふるい（メッシュサイズ100μｍ）
上で液体SHRで洗浄した。
上で液体SHRで洗浄した。
プレーティング（培地10ml当たりカルス75mg）のため
に、100mML−プロリンを含有する慣用の固体SHRを使用
した。選択的抗生物質の他に、プレート中の培地は500
μg/mlのクラフォラン（claforan）を含んでいた。４週
間の後、抵抗性構造物を抗生物質を含む新たな培地に移
し、皿に３週間の後それらを分割し、そしてそれらの半
分を選択的抗生物質を含まない新たな培地に移しそして
残りの半分を抗生物質を含んだ培地に移した。
に、100mML−プロリンを含有する慣用の固体SHRを使用
した。選択的抗生物質の他に、プレート中の培地は500
μg/mlのクラフォラン（claforan）を含んでいた。４週
間の後、抵抗性構造物を抗生物質を含む新たな培地に移
し、皿に３週間の後それらを分割し、そしてそれらの半
分を選択的抗生物質を含まない新たな培地に移しそして
残りの半分を抗生物質を含んだ培地に移した。
ｇ）胚の形質転換 胚の形質転換は誘発されたカルスの形質転換と同様に
して行なわれた。４−５週間の年令の胚を出発物質とし
て使用した。かみそり刃によって、それらをペトリ皿で
小片に切断し、次いでふるい（メッシュサイズ100μ
m2）上で液体SHRにより洗浄した。約1gの切断した胚を1
0mlの液体SHR中に取り込んだ。アグロバクテリアを加え
（２×107/ml最終濃度）、培養物を回転シェーカー（90
rpm）上で26℃にて２−３日間インキュベーションし
た。胚片を次いでふるい（100μｍ）上で液体SHRにより
洗浄した。プレーティングは、慣用の固体SHR及び100mM
のＬ−プロリンを含有するプレートでスパチュラによっ
て行った。10ml培地プレート当たり約50−100mgの胚片
を分配した。選択的構成物質の他に、プレート内の培地
は、500μg/mlのクラフォランを含んでいた。プレーテ
ィングの３週間の後二次胚を新たなプレートで二次培養
した。良く発達した胚を抗生物質を含まない1/2SH培地
（スチュアト及びストリックランド、1984、ａ、ｂ）に
移して、植物への更なる発達を促進した。小さな根付き
の若苗（small rooted plantlets）を次いでLS培地に移
した。
して行なわれた。４−５週間の年令の胚を出発物質とし
て使用した。かみそり刃によって、それらをペトリ皿で
小片に切断し、次いでふるい（メッシュサイズ100μ
m2）上で液体SHRにより洗浄した。約1gの切断した胚を1
0mlの液体SHR中に取り込んだ。アグロバクテリアを加え
（２×107/ml最終濃度）、培養物を回転シェーカー（90
rpm）上で26℃にて２−３日間インキュベーションし
た。胚片を次いでふるい（100μｍ）上で液体SHRにより
洗浄した。プレーティングは、慣用の固体SHR及び100mM
のＬ−プロリンを含有するプレートでスパチュラによっ
て行った。10ml培地プレート当たり約50−100mgの胚片
を分配した。選択的構成物質の他に、プレート内の培地
は、500μg/mlのクラフォランを含んでいた。プレーテ
ィングの３週間の後二次胚を新たなプレートで二次培養
した。良く発達した胚を抗生物質を含まない1/2SH培地
（スチュアト及びストリックランド、1984、ａ、ｂ）に
移して、植物への更なる発達を促進した。小さな根付き
の若苗（small rooted plantlets）を次いでLS培地に移
した。
5.ソラヌム・チュベルスム（Solanum tubersum）（ジャ
ガイモ）の形質転換 形質転換は正確にヨーロッパ特許出願第0,242,246号
に指示されている如くして行い、アグロバクテリアはス
チルベンシンターゼ遺伝子を担っているTiプラスミドを
含有していた。
ガイモ）の形質転換 形質転換は正確にヨーロッパ特許出願第0,242,246号
に指示されている如くして行い、アグロバクテリアはス
チルベンシンターゼ遺伝子を担っているTiプラスミドを
含有していた。
特記しない限り、百分率で与えられた上述の実施例に
おけるすべてのデータは重量％を示す。
おけるすべてのデータは重量％を示す。
上記実施例に従って得られた植物細胞及び植物（タバ
コ）においては、スチルベンシンターゼ遺伝子の存在は
サザンブロット分析により確かめられた。スチルベンシ
ンターゼ遺伝子の発現はノザンプロット分析により検出
されそしてスチルベンシンターゼ及びスチルベンは特異
的抗体を使用して検出された。形質転換された植物及び
形質転換されていない植物（比較のため）をボツリチス
・シネラ（Botrytis cinera）の胞子懸濁液で噴霧し、
１週間の後、菌の攻撃を評価した。形質転換された植物
は（形質転換されていない比較植物と反対に）菌の攻撃
に体する増加した抵抗を示した。メディカゴ・サチバ及
びジャガイモについても対応して正の結果が得られた。
コ）においては、スチルベンシンターゼ遺伝子の存在は
サザンブロット分析により確かめられた。スチルベンシ
ンターゼ遺伝子の発現はノザンプロット分析により検出
されそしてスチルベンシンターゼ及びスチルベンは特異
的抗体を使用して検出された。形質転換された植物及び
形質転換されていない植物（比較のため）をボツリチス
・シネラ（Botrytis cinera）の胞子懸濁液で噴霧し、
１週間の後、菌の攻撃を評価した。形質転換された植物
は（形質転換されていない比較植物と反対に）菌の攻撃
に体する増加した抵抗を示した。メディカゴ・サチバ及
びジャガイモについても対応して正の結果が得られた。
プラスミドpGS828.1中に存在しているときの、或る割
合の５′−及び３′−非翻訳領域を含めたスチルベンシ
ンターゼ遺伝子のDNA配列（タンパク質暗号化領域及び
イントロン）を下記に示す。EcoR I、Pst I及びHind II
Iの制限開裂部位は示されている。対応するタンパク質
は一文字コードで示されている。
合の５′−及び３′−非翻訳領域を含めたスチルベンシ
ンターゼ遺伝子のDNA配列（タンパク質暗号化領域及び
イントロン）を下記に示す。EcoR I、Pst I及びHind II
Iの制限開裂部位は示されている。対応するタンパク質
は一文字コードで示されている。
以下において、植物又は植物細胞の形質転換に使用し
た培地のいくつかを説明する。
た培地のいくつかを説明する。
Am培地 3.5g K2HPO4 1.5g KH2PO4 0.5g Na3サイトレート 0.1g MgSO4×7H2O 1 g （NH4）2SO4 2 g グルコース １とするのに十分な量 タバコの無菌苗条培養のための培地 多量元素 MS塩の濃度の1/2 微量元素 MS塩の濃度の1/2 Fe−EDTA ムラシゲ（Murashige）及びスクーグ（Sko
og）（MS） Myo−イノシトール 100mg/ スクロース 10mg/ 寒天 8mg/ ビタミン パントテン酸Ca 1mg/ ビチオン 10mg/ ニコチン酸 1mg/ ピリドキシン 1mg/ サイアミン 1mg/ オートクレーブ処理前のpH5.7 K3培地 ニコチアナ・タバクム・ペチト・ハバナSR1（Nicotia
na tabacum petit Havana SR 1）、ニコチアナ・タバク
ム・ウィスコンシン38（Nicotiana tabacum Wisconsin
38）及びニコチアナ・プルマギニフォリア（Nicotiana
Plumaginifolia）のプロトプラストの培養のため［ネイ
ギー（Nagy）及びマリガ（Maliga）、1976］ 多量元素 NH4NO3 250mg/ KNO3 2,500mg/ CaCl2・2H2O 900mg/ MgSO4・7H2O 250mg/ NaH2PO4・1H2O 150mg/ （NH4）2SO4 134mg/ CaHPO4・1H2O 50mg/ 微量元素 H3BO3 3mg/ MnSO4・1H2O 10mg/ ZnSO4・4H2O 2mg/ KI 0.75mg/ Na2MoO4・2H2O 0.25mg/ CuSO4・5H2O 0.025mg/ CoCl2・6H2O 0.025mg/ Fe−EDTA Na2EDTA 37.2mg/ FeSO・7H2O 27.8mg/ イノシトール 100mg/ スクロール 137 g/ （＝0.4M） キシロース 250mg/ ビタミン ニコチン酸 1mg/ ピリドキシン 1mg/ サイアミン 10mg/ ホルモン NAA 1.0mg/ カイネチン 0.2mg/ pH5.6 フィルターで無菌化 リンズマイアー及びスクーグ培地（Linsemaier and Sko
og medium）（リンズマイアー及びスクーグ、1965） 再生プロトプラスト培養のため及びタバコ腫瘍及びカ
ルスの組織培養のため リンズマイアー及びスクーグ（LS）培地は、下記の変
性を伴ったムラシゲ及びスクーグ培地（ムラシゲ及びス
クーグ、1962）である： −0.1mg/の代わりに0.4mg/というより高い濃度の
サイアミンがある； −グリシン、ピリドキシン及びニコチン酸は欠けてい
る。
og）（MS） Myo−イノシトール 100mg/ スクロース 10mg/ 寒天 8mg/ ビタミン パントテン酸Ca 1mg/ ビチオン 10mg/ ニコチン酸 1mg/ ピリドキシン 1mg/ サイアミン 1mg/ オートクレーブ処理前のpH5.7 K3培地 ニコチアナ・タバクム・ペチト・ハバナSR1（Nicotia
na tabacum petit Havana SR 1）、ニコチアナ・タバク
ム・ウィスコンシン38（Nicotiana tabacum Wisconsin
38）及びニコチアナ・プルマギニフォリア（Nicotiana
Plumaginifolia）のプロトプラストの培養のため［ネイ
ギー（Nagy）及びマリガ（Maliga）、1976］ 多量元素 NH4NO3 250mg/ KNO3 2,500mg/ CaCl2・2H2O 900mg/ MgSO4・7H2O 250mg/ NaH2PO4・1H2O 150mg/ （NH4）2SO4 134mg/ CaHPO4・1H2O 50mg/ 微量元素 H3BO3 3mg/ MnSO4・1H2O 10mg/ ZnSO4・4H2O 2mg/ KI 0.75mg/ Na2MoO4・2H2O 0.25mg/ CuSO4・5H2O 0.025mg/ CoCl2・6H2O 0.025mg/ Fe−EDTA Na2EDTA 37.2mg/ FeSO・7H2O 27.8mg/ イノシトール 100mg/ スクロール 137 g/ （＝0.4M） キシロース 250mg/ ビタミン ニコチン酸 1mg/ ピリドキシン 1mg/ サイアミン 10mg/ ホルモン NAA 1.0mg/ カイネチン 0.2mg/ pH5.6 フィルターで無菌化 リンズマイアー及びスクーグ培地（Linsemaier and Sko
og medium）（リンズマイアー及びスクーグ、1965） 再生プロトプラスト培養のため及びタバコ腫瘍及びカ
ルスの組織培養のため リンズマイアー及びスクーグ（LS）培地は、下記の変
性を伴ったムラシゲ及びスクーグ培地（ムラシゲ及びス
クーグ、1962）である： −0.1mg/の代わりに0.4mg/というより高い濃度の
サイアミンがある； −グリシン、ピリドキシン及びニコチン酸は欠けてい
る。
多量元素 NH4NO3 1,650mg/ KNO3 1,900mg/ CaCl2・2H2O 440mg/ MgSO4・7H2O 370mg/ KH2PO4 170mg/ 微量元素 H3BO3 6.2mg/ MnSO4・1H2O 22.3mg/ ZnSO4・4H2O 8.6mg/ KI 0.83mg/ Na2MoO4・2H2O 0.25mg/ CuSO4・5H2O 0.025mg/ CoCl2・6H2O 0.025mg/ Fe−EDTA Na2EDTA 37.2mg/ FeSO4・7H2O 27.8mg/ イノシトール 100mg/ スクロース 30 g/ 寒天 8 g/ ビタミン サイアミン 0.4mg/ ホルモン NAA 1mg/ カイネチン 0.2mg/ オートクレーブ処理前のpH5.7 植物又は植物細胞の形質転換に関しては、下記の文献
を引用することができる。
を引用することができる。
アエルツ・エム、ヤコブス・エム、ヘルナルステーン
ス・ジェイピー、ファン・モンタギュ・エム、シェル・
ジェイ（1983）、アラビドプシス・サリアナ・クラウン
ゴール腫瘍の誘発及び試験管内培養、プラント・サイエ
ンス・レターズ、第17巻、43−50［Aerts M,Jacobs M,H
ernalsteens JP,Van Montagu M,Schell J（1983） Induction and in vitro culture of Arabidops is t
haliana crown gall tumours.Plant Sci Lett.17:43−5
0］。
ス・ジェイピー、ファン・モンタギュ・エム、シェル・
ジェイ（1983）、アラビドプシス・サリアナ・クラウン
ゴール腫瘍の誘発及び試験管内培養、プラント・サイエ
ンス・レターズ、第17巻、43−50［Aerts M,Jacobs M,H
ernalsteens JP,Van Montagu M,Schell J（1983） Induction and in vitro culture of Arabidops is t
haliana crown gall tumours.Plant Sci Lett.17:43−5
0］。
アタナソフ・エイ、ブラウン・デイシーダブリュ（19
84）、メデイカゴ・サチバ・エルの懸濁培養及び葉肉プ
ロトプラストからの植物再生、プラント・セル・ティッ
シュー・オルガン・カルチャー、第３巻、149−162［At
anassov A,Brown DCW（1984） Plant regeneration fro
m suspension culture and mesophill protoplasts of
Medicago sativa L.Plant Cell Tiss Org Cult3,149−1
62］。
84）、メデイカゴ・サチバ・エルの懸濁培養及び葉肉プ
ロトプラストからの植物再生、プラント・セル・ティッ
シュー・オルガン・カルチャー、第３巻、149−162［At
anassov A,Brown DCW（1984） Plant regeneration fro
m suspension culture and mesophill protoplasts of
Medicago sativa L.Plant Cell Tiss Org Cult3,149−1
62］。
ツェルニロフスキー等、（1986）ニコチアナ・タバク
ムのゲノムへの外来DNA組み込み体の構造及び機能的オ
ルガニゼーション、DNA、第５巻、第６号（1986）［Cze
rnilofsky et al.（1986）Studies of the Structure a
nd Functional Oraganization of Foreign DNA Integra
tes into the Genome of Nicotiana tabacum.DNA,Vol
5,No.6（1986）］。
ムのゲノムへの外来DNA組み込み体の構造及び機能的オ
ルガニゼーション、DNA、第５巻、第６号（1986）［Cze
rnilofsky et al.（1986）Studies of the Structure a
nd Functional Oraganization of Foreign DNA Integra
tes into the Genome of Nicotiana tabacum.DNA,Vol
5,No.6（1986）］。
デイビー・エムアール、コッキング・エイシー、フリ
ーマン・ジェー、ピアース・エヌ、テュドール・アイ
（1980） 単離されたアグロバクテリウムプラスミドに
よるペチュニアプロトプラストの形質転換、プラント・
サイエンス・レターズ、第18巻、307−313［Davy MR,Co
cking EC,Freeman J,Pearce N,Tudor I（1980）Transfo
rmation of Petunia protoplasts by isiolated Agroba
cterium plasmid.Plant Sci Lett 18:307−313］。
ーマン・ジェー、ピアース・エヌ、テュドール・アイ
（1980） 単離されたアグロバクテリウムプラスミドに
よるペチュニアプロトプラストの形質転換、プラント・
サイエンス・レターズ、第18巻、307−313［Davy MR,Co
cking EC,Freeman J,Pearce N,Tudor I（1980）Transfo
rmation of Petunia protoplasts by isiolated Agroba
cterium plasmid.Plant Sci Lett 18:307−313］。
デブレレ・アール、バイテビール・ビー、デ・グレー
ブ・エイチ、デベック・エフ、シェル・ジェイ、ファン
・モンタギュ・エム、リーマンス・ジェイ（1985）植物
へのアグロバクテリウム媒介の遺伝子導入のための効率
の良いオクトピンTiプラスミド由来のベクター、核酸研
究、第13巻、第13号、4777（1985）［Deblaere R.,Byte
bier B.,De Grave H,Deboeck F,Schell J,van Montagu
M,Leemans J（1985）Efficient octopine Ti plasmid−
derived vectors for Agrobacterium−mediated gene t
ransfer to plants.Nucleic Acid Research,Vol.13,No.
13,4777（1985）］。
ブ・エイチ、デベック・エフ、シェル・ジェイ、ファン
・モンタギュ・エム、リーマンス・ジェイ（1985）植物
へのアグロバクテリウム媒介の遺伝子導入のための効率
の良いオクトピンTiプラスミド由来のベクター、核酸研
究、第13巻、第13号、4777（1985）［Deblaere R.,Byte
bier B.,De Grave H,Deboeck F,Schell J,van Montagu
M,Leemans J（1985）Efficient octopine Ti plasmid−
derived vectors for Agrobacterium−mediated gene t
ransfer to plants.Nucleic Acid Research,Vol.13,No.
13,4777（1985）］。
フロム・エムイー、テイラー・エルピー、ウォルボッ
ト・ブイ（1986）エレクトロポレーションによる遺伝子
導入の後のトウモロコシの安定な形質転換、ネイチャ
ー、第319巻:791−793［Fromm ME,Taylor LP,Walbot V
（1986）Stable transformation of maize after gene
tranfer by electroporation.Nature 319:791−793］。
ト・ブイ（1986）エレクトロポレーションによる遺伝子
導入の後のトウモロコシの安定な形質転換、ネイチャ
ー、第319巻:791−793［Fromm ME,Taylor LP,Walbot V
（1986）Stable transformation of maize after gene
tranfer by electroporation.Nature 319:791−793］。
ハイン・アール、スタベル・ピー、クゼルニロフスキ
ー・エイピーピー、スタインビス・エム・エイチ、ヘレ
ラーエストレラ・エル、シェル・ジェイ（1985）植物プ
ロトプラストによる選択可能なキメラ遺伝子の取り込
み、組込み、発現及び遺伝的伝達、モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティックス、第199巻:161−168
［Hain,R.,Stabel,P.,Czernilofsky,A.Pp.,Steinbiss,
H.H.,Herrera−Estrella,L.,Schell,J.（1985）Uptake,
integration,expression and genetic transmission of
a selectable chimeric gene by plant protoplasts.M
olec Gen Genet 199:161−168］。
ー・エイピーピー、スタインビス・エム・エイチ、ヘレ
ラーエストレラ・エル、シェル・ジェイ（1985）植物プ
ロトプラストによる選択可能なキメラ遺伝子の取り込
み、組込み、発現及び遺伝的伝達、モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティックス、第199巻:161−168
［Hain,R.,Stabel,P.,Czernilofsky,A.Pp.,Steinbiss,
H.H.,Herrera−Estrella,L.,Schell,J.（1985）Uptake,
integration,expression and genetic transmission of
a selectable chimeric gene by plant protoplasts.M
olec Gen Genet 199:161−168］。
ヘルナルステーンス・ジエイピー、チアートング・エ
ル、シェル・ジェイ、ファン・モンタグ・エム（1984）
単子葉植物アスパラガス薬草からのアグロバクテリウム
形質転換細胞培養物、イーエムビーオー・ジェイ、第３
巻、3039−3041［Hernalsteens JP,Thia−Tong L,Schel
l J,Van M ontagu M（1984）An Agrobacterium−transc
ormed Cell culture from the monocot Aspagragas off
icinalis.EMBO J 3:3039−3041］。
ル、シェル・ジェイ、ファン・モンタグ・エム（1984）
単子葉植物アスパラガス薬草からのアグロバクテリウム
形質転換細胞培養物、イーエムビーオー・ジェイ、第３
巻、3039−3041［Hernalsteens JP,Thia−Tong L,Schel
l J,Van M ontagu M（1984）An Agrobacterium−transc
ormed Cell culture from the monocot Aspagragas off
icinalis.EMBO J 3:3039−3041］。
ヘレラーエストレラ・エル、デ・ブロック・エム、メ
ッセンス・イー、ヘルナルステーンス・ジエイピー、フ
ァン・モンタグ・エム、シェル・ジェイ（1983）イーエ
ムビーオー・ジェイ、第２巻:987−995（Herrera−Estr
ella,L,De Block M.,Messens E.,Hernalsteens LP.,Van
Montagu M.,Schell,J.（1983）EMBO J.２:987−99
5］。
ッセンス・イー、ヘルナルステーンス・ジエイピー、フ
ァン・モンタグ・エム、シェル・ジェイ（1983）イーエ
ムビーオー・ジェイ、第２巻:987−995（Herrera−Estr
ella,L,De Block M.,Messens E.,Hernalsteens LP.,Van
Montagu M.,Schell,J.（1983）EMBO J.２:987−99
5］。
ホーイカースファンスログテレン・ジーエムエス、ホ
ーイカース・ピージェイジェイ、シルペロールト・アー
ルエイ（1984）アグロバクテリウム・ツメファシエンス
で感染させた単子葉植物におけるTi−プラスミド遺伝子
の発現、ネイチャー、第311巻、763−764［Hooykaas−V
an Slogteren GMS、Hooykaas PJJ.Schilperoort RA（19
84）Expression of Ti−plasmidgenes in monocotyledo
nous plants infected with Agrobacterium tumefacien
s Nature 311;763−764］ ホーシュ・アールビー、フライ・ジェイイー、ホフマ
ン・エヌエル、アイヒホルツ・デイ、ロジャース・エス
ジー、フラレイ・アールテイ（1985）、植物に遺伝子を
導入するための簡単な且つ一般的な方法、サイエンス、
第277巻、1229−1231［Horsch RB、Fry JE.Hoffmann N
L.Eichholtz D.Rogers SG.Fraley RT（1985）A simple
and general method for transferring genes into pla
nts.Science 277:1229−1231］ カオ・ケイエヌ、ミハイルク・エムアール（1980）ア
ルファルファの中温プロトプラストからの植物再生、ザ
イツシュリフト・フュール・プフランツェンフィジオロ
ジー、第96巻、135−141［Kao KN、Michayluk MR（198
0）Plant regeneration from Mesophyll protoplasts o
f Alfalfa.Z.Pflanzenphysiol 96、135−141］ ケラー・ダブリュエイ、メルヘルス・ジー（1973）タ
バコの葉プロトプラスト融合に対する高いpH及びカルシ
ウムの効果、ザイツシュリフト・フュール・ナチュール
フォルシュング、28c:737−741［Keller WA,Melchers G
（1973）The effect of high pH and calcium on tobac
co leaf protoplast fusion.Z Naturforschg 28c:737−
741］ クレンス・エスエイチ、モレンジーク・エル、ブレム
ス・ジージェイ、シルペロールト・アールエイ（1982）
TiプラスミドDNAによる植物プロトプラストの試験管内
形質転換、ネイチャー、第296巻、72−74［Krens FH,Mo
lendijk L,Wullems GJ,Schilpeyroort RA（1982）in vi
tro transformation of plant protoplasts Ti−plasmi
d DNA.Nature 296:72−74］ コンクツ・シー、シェル・ジェイ（1986） TL−DNA遺伝子５のプロモーターは新規な型のアグロ
バクテリウム・リナリーベクターにより運ばれるキメラ
遺伝子の組織特異的発現を制御する。モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティックス（1986）206:338
−396［Koncz C,Schell J（1986）The promotor of TL
−DNA gene 5 controls the tissue−specific express
ion of chimaeric genes carried by a noval type of
Agrobacterium linary vector.Mol.Gen.Genet.（1986）
204:338−396］ リンセマイエル・デイエム、スクーグ・エフ（1985）
タバコ組織培養の有機増殖因子要求、フィジオル・プラ
ント第18巻:100−127［Linsemaier DM,Skoog F（1965）
Organic growth factor requirements of tobacco cult
ures.Physiol Plant 18:100−127］ マルトン・エム、ブレムス・ジージェイ、モレンジー
ク・エル、シルペロールト・ピーアール（1979）アグロ
バクテリウム・ツメファシエンスによるニコチアナ・タ
バクムからの培養された細胞の試験管内形質転換、ネイ
チャー第277巻:1229−131［Marton L,Wullems GJ,Molen
dijk L,Schilperoort PR（1979）In vitro transformat
ion of cultured cells from Nicotiana tabacum by Ag
robacterium tumefaciens.Nature 277:1229−131］ ナギー・ジエイアイ、マリガ・ピー（1976） ニコチアナ・シルベストリスの中温プロトプラストか
らのカルス誘発及び植物再生ザイツシュリフト・フュー
ル・フランツェンフィジオロジー第78巻:453−455［Nag
y JI,Maliga P（1976）Callus induction and plant re
generation from mesophyll protoplasts of Nicotiana
sylvestris.Z Pflanzenphysiol 78:453−455］ オッテン・エルエイビーエム、シルペロールト・アー
ルエイ（1978）リソピン及びノパリンデヒドロゲナーゼ
活性の検出のための迅速なマイクロスケールでの方法、
バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ 527:497
−500［Otten LABM,Schilperoort RA（1978）A rapid m
icroscale method for the detection of Lysopin and
Nopalin dehydrogenase activities.Biochim biophys a
cta 527:497−500］ パスツコフスキー・ジエイ、シリト・アールデイ、サ
ウス・エム、マンダク・ブイ、ホーン・テイ、ホーン・
ビー、ポツリクス・アイ（1984）植物への直接遺伝子導
入、イーエムビーオー・ジェイ3:2717−2722［Paszkows
ki J,Shillito RD,Saul M,Mandak V,Hohn T,Hohn B,Pot
rykus I（1984）Direct gene transfer to plants.EMBO
J 3:2717−2722］ ポツリクス・アイ、サウル・エムダブリュ、ペトルス
カ・ジエイ、パスツコフスキー・ジエイ、シリト・アー
ルデイ（1985）牧草単子葉植物の細胞への直接遺伝子導
入、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス199:183−188［Potrykus I Saul MW,Petruska J,Pa
szkowski J.Shillito RD（1985）Direct gene transfer
to cells of a gramineous msnocot.Molecgen genet19
9:183−188］ シェンク・アールユー、ヒルデブランツ・エイシー
（1972）単子葉植物及び双子葉植物細胞培養の誘発及び
増殖の培地及び技術、カナディアン・ジャーナル・オブ
・ボタニー第50巻:199−204［Schenk RU,Hidebrandt AC
（1972）Medium and techniques for induction and gr
owth of monocotyledon us and dicotyledonous cell c
ultures.Can J Bot 50,199−204］ シリト・アールディ、パスツコフスキー・ジエイ、ポ
ツリクス・アイ（1983）アガロースプレーティング及び
ビーズ型培養技術はいくらかの植物種におけるプロトプ
ラスト由来のコロニーの発現を可能としそして刺激す
る。ピーエル・セル・レポ第２巻:244−247［Shillito
RD,Pasazkowski J.Potrykus I（1983）Agarose plating
and Bead type culture technique enable and stimul
ate development of protoplast−derived colonies in
any number of plant species.PL Cell Rep 2:244−12
7］ サイモン−シュライエル・エイ、メディカゴ・サチバ
に関する形質転換の研究及びトランスジェニック植物に
おける共生中のレグヘモグラビン遺伝子（1bc3）及びキ
メラ1b−cat遺伝子の発現に関する研究、博士論文、コ
ログネ大学（1988）［Simons−Schreier A,Sudien zur
Ttransformation von Medicago Sativa und zur Expres
sion eines Leghemoglobingens（1bc3）und eines chim
aren 1b−cat−Gens wehrend der Symbiorein transgen
en Pflanzen［Transformation studies on Medicago Sa
tiva,and studies on the expression of a laghemoglo
bin gene （1bc3）and chimeric 1b−cat gene during
symbiosis in Transgenic plants］.Ph.D.thesis,Colog
ne University（1988）］ スチュアート・デイエイ、ストリックランド・エスジ
ー（1984）メディカゴ・サチバ・エル・Ｉの細胞培養物
からの体細胞不定胚形成．再生培地へのアミノ酸の役
割。プラント・サイエンス・レターズ第34巻、165−174
［Stuart DA,Strickland SG（1984）Somatic embryogen
esis from cell cultures of Medicago sativa L.I.The
role of amino acid additions to the regeneration
medium.Plant Scit Let 34,165−174］ スチュアート・デイエイ、ストリックランド・エスジ
ー（1984）メディカゴ・サチバ・エル・IIの細胞培養物
からの体細胞不定胚形成、アンモニウムとアミノ酸の相
互作用、プラント・サイエンス・レターズ第34巻、175
−181［Stuart DA,Strickland SG（1984）Somatic embr
yogenesis from cell cultures of Medicago sativa L,
II,The interaction of amino acids with ammonium.Pl
ant Sci Let 34,175−181］ バン・デン・エルツィン・ピージエイエム、タウンセ
ンド・ジェイ、リー・ケイワイ、ベトブルック・ジエイ
アール（1985）植物細胞における選択可能なマーカーと
してのキメラ抵抗遺伝子、プラント・モル・バイオル第
５巻、299−302［Van den Elzen PJM,Townsend J.Lee K
Y,Bedbrook JR（1985）A chimaeric resistance gene a
s a selectable marker in plant cells.Plant Mol Bio
l 5,299−302］ ベルテン・ジエイ、ベルテン・エル、ハイン・アール
・シェル・ジエイ（1984）アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスのTiプラスミドからの二重植物プロモーター
断片の単離、イーエムビーオー・ジエイ第12巻:2723−2
730［Velten J,Velten L,Hain R,Schell J（1984）Isol
ation of a dual plant promotor fragment the Plasim
d of Agrobacterium tumefaciens.EMBO J 12:2723−273
0］ ウオーカー・ケイエイ、ユー・ピーシー、サトー・エ
スジエイ、ジャウオルスキー・イージー（1978）試験管
内で培養されたメディカゴ・サチバ・エルのカルスにお
ける器官形成のホルモンによる制御、アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・ボタニー65（６）、654−659［Walker K
A,Yu PC,Sato SJ,Jaworski EG（1978）The hormonal co
ntrol of organ formation in callus of Medicago,,sa
tiba L.cultured in vitro.Amer J Bot 65（６）,654−
659］ ウオーカー・ケイエイ、サトー・エスジエイ（1981）
メディカゴ・サチバのカルス組織における形態形成、体
細胞不定胚形成におけるアンモニウムイオンの役割、プ
ラント・ティッシュウ・オルグ・カルト第１巻、109−1
21［Walker KA,Sato SJ（1981）Morphogenesis in call
us tissue of Medicagosatiba:the role of ammonium i
on insomatic embryogenesis.Plant Cell Tiss Org Cul
t 1,109−121］ ブレムス・ジーエル、モレンジーク・エル、オームス
・ジー、シルペルールト・アールエイ（1981）ニコチア
ナ・タバクム由来の細胞壁再生プロトプラストの試験管
内でのアグロバクテリウム・ツメファシエンス−誘発形
質転換の後に得られた形質転換体におけるクラウンゴー
ル腫瘍マーカーの分化発現、プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス第78
巻:4344−4348［Wullems GJ,Molendijk L,Ooms G,Schil
peroot RA（1981）Differential expression of crown
gall tumor markers in transformants.obtained after
in vitro Agrobacterium tumefaciens−induced teans
formation of cell wall regenerating protoplasts de
rived from Nicotiana tabacum.Proc Natl Acad Sci 7
8:4344−4348］ ザムブリスキー・ピー、シオース・エイチ、ジエネテ
ロ・シー、ブァン・モンターギュ・エムシーエル・ジェ
イ（1983）植物細胞にそれらの普通の再生能力を変えな
いでDNAを導入するためのTi−プラスミドベクター、イ
ーエムビーオー・ジエイ第12巻:2143−2150［Zambryski
P,Joos H,Genetello C,van Montagu M,Schell J（498
3）Ti−plasmid vector for the intoroduction of DNA
into plant cells without altering their normal re
generation capacity,EMBO J 12:2143−2150］ ベルンド・ライス、ロルフ・スプレンゲル、ハンス・
ウイール及びハインツ・シャラー（1984）粗製細胞トラ
クトにおけるネオマイシンホスホトランスフェラーゼの
定性的及び定量的アッセイのための新規な鋭敏な方法、
ジェネ、1081:211−217［Bernd Reiss,Rolf Sprengel,H
ans Will and Heinz Schaller（1984）A new sensitive
method for qualitative and guantitative assay of
neomycin phosphotransferase in crude cell tracts,G
ENE 1081:211−217］ ペータ・エイチ・シュライエル、エリザベート・エ
イ、ヨゼフ・シェル及びハンス・ジェイ・ボーンハート
（1985）外来タンバク質の光調節合成及び植物プロトプ
ラストへの外来タンバク質の運搬を指向する核の暗号化
配列の使用、イーエムビーオー・ジエイ第４巻、第１
号:25−32［Peter H.Schreier,Elisabeth A.Seftor,Joz
ef Schell and Hans J.Bohnert（1985）The use of nuc
lear−encoded sequences to direct the light−regul
ated synthesis and transport of a foreign protein
into plant chloroplasts,EMBO J Vol.4,No.1:25−32］ ガムボーグ・オー・エル、ミラー・アール・エイ及び
オジマ・ケイ（1968）大豆根細胞の懸濁培養の栄養要
求、エクスペリメンタル・セル・リサーチ第50巻:151−
158［Gamborg O.L.,Miller R.A.and Ojima K.（1968）N
utrient requirements of suspension cultures of soy
bean root cells,Experimental Cell Research50:151−
158］ ミハエル・エム・オエルク、博士論文、1984、コログ
ネ大学、西ドイツ、組織培養及び細胞培養からのマメ科
植物の再生［Michael M.Oelck,Phd thesis,1984,Univer
sity of Cologne,Federal Repubilc of Germany,Regene
ration von Leguminosen aus Gewebe−und Zellkulture
n］ 更に下記の公告特許出願を挙げることができる。
ーイカース・ピージェイジェイ、シルペロールト・アー
ルエイ（1984）アグロバクテリウム・ツメファシエンス
で感染させた単子葉植物におけるTi−プラスミド遺伝子
の発現、ネイチャー、第311巻、763−764［Hooykaas−V
an Slogteren GMS、Hooykaas PJJ.Schilperoort RA（19
84）Expression of Ti−plasmidgenes in monocotyledo
nous plants infected with Agrobacterium tumefacien
s Nature 311;763−764］ ホーシュ・アールビー、フライ・ジェイイー、ホフマ
ン・エヌエル、アイヒホルツ・デイ、ロジャース・エス
ジー、フラレイ・アールテイ（1985）、植物に遺伝子を
導入するための簡単な且つ一般的な方法、サイエンス、
第277巻、1229−1231［Horsch RB、Fry JE.Hoffmann N
L.Eichholtz D.Rogers SG.Fraley RT（1985）A simple
and general method for transferring genes into pla
nts.Science 277:1229−1231］ カオ・ケイエヌ、ミハイルク・エムアール（1980）ア
ルファルファの中温プロトプラストからの植物再生、ザ
イツシュリフト・フュール・プフランツェンフィジオロ
ジー、第96巻、135−141［Kao KN、Michayluk MR（198
0）Plant regeneration from Mesophyll protoplasts o
f Alfalfa.Z.Pflanzenphysiol 96、135−141］ ケラー・ダブリュエイ、メルヘルス・ジー（1973）タ
バコの葉プロトプラスト融合に対する高いpH及びカルシ
ウムの効果、ザイツシュリフト・フュール・ナチュール
フォルシュング、28c:737−741［Keller WA,Melchers G
（1973）The effect of high pH and calcium on tobac
co leaf protoplast fusion.Z Naturforschg 28c:737−
741］ クレンス・エスエイチ、モレンジーク・エル、ブレム
ス・ジージェイ、シルペロールト・アールエイ（1982）
TiプラスミドDNAによる植物プロトプラストの試験管内
形質転換、ネイチャー、第296巻、72−74［Krens FH,Mo
lendijk L,Wullems GJ,Schilpeyroort RA（1982）in vi
tro transformation of plant protoplasts Ti−plasmi
d DNA.Nature 296:72−74］ コンクツ・シー、シェル・ジェイ（1986） TL−DNA遺伝子５のプロモーターは新規な型のアグロ
バクテリウム・リナリーベクターにより運ばれるキメラ
遺伝子の組織特異的発現を制御する。モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティックス（1986）206:338
−396［Koncz C,Schell J（1986）The promotor of TL
−DNA gene 5 controls the tissue−specific express
ion of chimaeric genes carried by a noval type of
Agrobacterium linary vector.Mol.Gen.Genet.（1986）
204:338−396］ リンセマイエル・デイエム、スクーグ・エフ（1985）
タバコ組織培養の有機増殖因子要求、フィジオル・プラ
ント第18巻:100−127［Linsemaier DM,Skoog F（1965）
Organic growth factor requirements of tobacco cult
ures.Physiol Plant 18:100−127］ マルトン・エム、ブレムス・ジージェイ、モレンジー
ク・エル、シルペロールト・ピーアール（1979）アグロ
バクテリウム・ツメファシエンスによるニコチアナ・タ
バクムからの培養された細胞の試験管内形質転換、ネイ
チャー第277巻:1229−131［Marton L,Wullems GJ,Molen
dijk L,Schilperoort PR（1979）In vitro transformat
ion of cultured cells from Nicotiana tabacum by Ag
robacterium tumefaciens.Nature 277:1229−131］ ナギー・ジエイアイ、マリガ・ピー（1976） ニコチアナ・シルベストリスの中温プロトプラストか
らのカルス誘発及び植物再生ザイツシュリフト・フュー
ル・フランツェンフィジオロジー第78巻:453−455［Nag
y JI,Maliga P（1976）Callus induction and plant re
generation from mesophyll protoplasts of Nicotiana
sylvestris.Z Pflanzenphysiol 78:453−455］ オッテン・エルエイビーエム、シルペロールト・アー
ルエイ（1978）リソピン及びノパリンデヒドロゲナーゼ
活性の検出のための迅速なマイクロスケールでの方法、
バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ 527:497
−500［Otten LABM,Schilperoort RA（1978）A rapid m
icroscale method for the detection of Lysopin and
Nopalin dehydrogenase activities.Biochim biophys a
cta 527:497−500］ パスツコフスキー・ジエイ、シリト・アールデイ、サ
ウス・エム、マンダク・ブイ、ホーン・テイ、ホーン・
ビー、ポツリクス・アイ（1984）植物への直接遺伝子導
入、イーエムビーオー・ジェイ3:2717−2722［Paszkows
ki J,Shillito RD,Saul M,Mandak V,Hohn T,Hohn B,Pot
rykus I（1984）Direct gene transfer to plants.EMBO
J 3:2717−2722］ ポツリクス・アイ、サウル・エムダブリュ、ペトルス
カ・ジエイ、パスツコフスキー・ジエイ、シリト・アー
ルデイ（1985）牧草単子葉植物の細胞への直接遺伝子導
入、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス199:183−188［Potrykus I Saul MW,Petruska J,Pa
szkowski J.Shillito RD（1985）Direct gene transfer
to cells of a gramineous msnocot.Molecgen genet19
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（1972）単子葉植物及び双子葉植物細胞培養の誘発及び
増殖の培地及び技術、カナディアン・ジャーナル・オブ
・ボタニー第50巻:199−204［Schenk RU,Hidebrandt AC
（1972）Medium and techniques for induction and gr
owth of monocotyledon us and dicotyledonous cell c
ultures.Can J Bot 50,199−204］ シリト・アールディ、パスツコフスキー・ジエイ、ポ
ツリクス・アイ（1983）アガロースプレーティング及び
ビーズ型培養技術はいくらかの植物種におけるプロトプ
ラスト由来のコロニーの発現を可能としそして刺激す
る。ピーエル・セル・レポ第２巻:244−247［Shillito
RD,Pasazkowski J.Potrykus I（1983）Agarose plating
and Bead type culture technique enable and stimul
ate development of protoplast−derived colonies in
any number of plant species.PL Cell Rep 2:244−12
7］ サイモン−シュライエル・エイ、メディカゴ・サチバ
に関する形質転換の研究及びトランスジェニック植物に
おける共生中のレグヘモグラビン遺伝子（1bc3）及びキ
メラ1b−cat遺伝子の発現に関する研究、博士論文、コ
ログネ大学（1988）［Simons−Schreier A,Sudien zur
Ttransformation von Medicago Sativa und zur Expres
sion eines Leghemoglobingens（1bc3）und eines chim
aren 1b−cat−Gens wehrend der Symbiorein transgen
en Pflanzen［Transformation studies on Medicago Sa
tiva,and studies on the expression of a laghemoglo
bin gene （1bc3）and chimeric 1b−cat gene during
symbiosis in Transgenic plants］.Ph.D.thesis,Colog
ne University（1988）］ スチュアート・デイエイ、ストリックランド・エスジ
ー（1984）メディカゴ・サチバ・エル・Ｉの細胞培養物
からの体細胞不定胚形成．再生培地へのアミノ酸の役
割。プラント・サイエンス・レターズ第34巻、165−174
［Stuart DA,Strickland SG（1984）Somatic embryogen
esis from cell cultures of Medicago sativa L.I.The
role of amino acid additions to the regeneration
medium.Plant Scit Let 34,165−174］ スチュアート・デイエイ、ストリックランド・エスジ
ー（1984）メディカゴ・サチバ・エル・IIの細胞培養物
からの体細胞不定胚形成、アンモニウムとアミノ酸の相
互作用、プラント・サイエンス・レターズ第34巻、175
−181［Stuart DA,Strickland SG（1984）Somatic embr
yogenesis from cell cultures of Medicago sativa L,
II,The interaction of amino acids with ammonium.Pl
ant Sci Let 34,175−181］ バン・デン・エルツィン・ピージエイエム、タウンセ
ンド・ジェイ、リー・ケイワイ、ベトブルック・ジエイ
アール（1985）植物細胞における選択可能なマーカーと
してのキメラ抵抗遺伝子、プラント・モル・バイオル第
５巻、299−302［Van den Elzen PJM,Townsend J.Lee K
Y,Bedbrook JR（1985）A chimaeric resistance gene a
s a selectable marker in plant cells.Plant Mol Bio
l 5,299−302］ ベルテン・ジエイ、ベルテン・エル、ハイン・アール
・シェル・ジエイ（1984）アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスのTiプラスミドからの二重植物プロモーター
断片の単離、イーエムビーオー・ジエイ第12巻:2723−2
730［Velten J,Velten L,Hain R,Schell J（1984）Isol
ation of a dual plant promotor fragment the Plasim
d of Agrobacterium tumefaciens.EMBO J 12:2723−273
0］ ウオーカー・ケイエイ、ユー・ピーシー、サトー・エ
スジエイ、ジャウオルスキー・イージー（1978）試験管
内で培養されたメディカゴ・サチバ・エルのカルスにお
ける器官形成のホルモンによる制御、アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・ボタニー65（６）、654−659［Walker K
A,Yu PC,Sato SJ,Jaworski EG（1978）The hormonal co
ntrol of organ formation in callus of Medicago,,sa
tiba L.cultured in vitro.Amer J Bot 65（６）,654−
659］ ウオーカー・ケイエイ、サトー・エスジエイ（1981）
メディカゴ・サチバのカルス組織における形態形成、体
細胞不定胚形成におけるアンモニウムイオンの役割、プ
ラント・ティッシュウ・オルグ・カルト第１巻、109−1
21［Walker KA,Sato SJ（1981）Morphogenesis in call
us tissue of Medicagosatiba:the role of ammonium i
on insomatic embryogenesis.Plant Cell Tiss Org Cul
t 1,109−121］ ブレムス・ジーエル、モレンジーク・エル、オームス
・ジー、シルペルールト・アールエイ（1981）ニコチア
ナ・タバクム由来の細胞壁再生プロトプラストの試験管
内でのアグロバクテリウム・ツメファシエンス−誘発形
質転換の後に得られた形質転換体におけるクラウンゴー
ル腫瘍マーカーの分化発現、プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス第78
巻:4344−4348［Wullems GJ,Molendijk L,Ooms G,Schil
peroot RA（1981）Differential expression of crown
gall tumor markers in transformants.obtained after
in vitro Agrobacterium tumefaciens−induced teans
formation of cell wall regenerating protoplasts de
rived from Nicotiana tabacum.Proc Natl Acad Sci 7
8:4344−4348］ ザムブリスキー・ピー、シオース・エイチ、ジエネテ
ロ・シー、ブァン・モンターギュ・エムシーエル・ジェ
イ（1983）植物細胞にそれらの普通の再生能力を変えな
いでDNAを導入するためのTi−プラスミドベクター、イ
ーエムビーオー・ジエイ第12巻:2143−2150［Zambryski
P,Joos H,Genetello C,van Montagu M,Schell J（498
3）Ti−plasmid vector for the intoroduction of DNA
into plant cells without altering their normal re
generation capacity,EMBO J 12:2143−2150］ ベルンド・ライス、ロルフ・スプレンゲル、ハンス・
ウイール及びハインツ・シャラー（1984）粗製細胞トラ
クトにおけるネオマイシンホスホトランスフェラーゼの
定性的及び定量的アッセイのための新規な鋭敏な方法、
ジェネ、1081:211−217［Bernd Reiss,Rolf Sprengel,H
ans Will and Heinz Schaller（1984）A new sensitive
method for qualitative and guantitative assay of
neomycin phosphotransferase in crude cell tracts,G
ENE 1081:211−217］ ペータ・エイチ・シュライエル、エリザベート・エ
イ、ヨゼフ・シェル及びハンス・ジェイ・ボーンハート
（1985）外来タンバク質の光調節合成及び植物プロトプ
ラストへの外来タンバク質の運搬を指向する核の暗号化
配列の使用、イーエムビーオー・ジエイ第４巻、第１
号:25−32［Peter H.Schreier,Elisabeth A.Seftor,Joz
ef Schell and Hans J.Bohnert（1985）The use of nuc
lear−encoded sequences to direct the light−regul
ated synthesis and transport of a foreign protein
into plant chloroplasts,EMBO J Vol.4,No.1:25−32］ ガムボーグ・オー・エル、ミラー・アール・エイ及び
オジマ・ケイ（1968）大豆根細胞の懸濁培養の栄養要
求、エクスペリメンタル・セル・リサーチ第50巻:151−
158［Gamborg O.L.,Miller R.A.and Ojima K.（1968）N
utrient requirements of suspension cultures of soy
bean root cells,Experimental Cell Research50:151−
158］ ミハエル・エム・オエルク、博士論文、1984、コログ
ネ大学、西ドイツ、組織培養及び細胞培養からのマメ科
植物の再生［Michael M.Oelck,Phd thesis,1984,Univer
sity of Cologne,Federal Repubilc of Germany,Regene
ration von Leguminosen aus Gewebe−und Zellkulture
n］ 更に下記の公告特許出願を挙げることができる。
EP−A 116 718 EP−A 159 418 EP−A 120 515 EP−A 120 516 EP−A 172 112 EP−A 140 556 EP−A 174 166 EP−A 122 791 EP−A 126 546 EP−A 164 597 EP−A 175 966 WO 84/02913 WO 84/02919 WO 84/02920 WO 83/01176 なお、本発明の主たる特徴及び態様は以下のとおりで
ある。
ある。
1.スチルベンシンターゼ遺伝子。
2.スチルベンシンターゼがレスベラトロールシンターゼ
を意味する上記１に記載のスチルベンシンターゼ遺伝
子。
を意味する上記１に記載のスチルベンシンターゼ遺伝
子。
3.ナンキンマメ［アラキス・ヒポガエア（Arachis hypo
gaea）］から得ることができる上記１又は２に記載のス
チルベンシンターゼ遺伝子。
gaea）］から得ることができる上記１又は２に記載のス
チルベンシンターゼ遺伝子。
4.プラスミドpGS828.1に含まれているスチルベンシンタ
ーゼ遺伝子に相当するスチルベンシンターゼ遺伝子及び
本質的に同じように作用するDNA配列。
ーゼ遺伝子に相当するスチルベンシンターゼ遺伝子及び
本質的に同じように作用するDNA配列。
5.約6,700塩基対から成り、３つのEcoR I、３つのHind
III及び１つのPst I開裂部位を有し、EcoR I及びHind I
IIを使用してプラスミドpGS828.1の部分開裂により得る
ことができ、又はSst I及びPvu IIの助けによりプラス
ミドpGS828.1から得ることができるスチルベンシンター
ゼ遺伝子。
III及び１つのPst I開裂部位を有し、EcoR I及びHind I
IIを使用してプラスミドpGS828.1の部分開裂により得る
ことができ、又はSst I及びPvu IIの助けによりプラス
ミドpGS828.1から得ることができるスチルベンシンター
ゼ遺伝子。
6.上記１乃至５のいずれかに記載のスチルベンシンター
ゼ遺伝子の、調節活性を持った部分。
ゼ遺伝子の、調節活性を持った部分。
7.上記１乃至５のいずれかに記載のスチルベンシンター
ゼ遺伝子の構造遺伝子。
ゼ遺伝子の構造遺伝子。
8.イントロンを持ち又は持たないで存在することができ
る下記の配列を含むDNA及び本質的に同じように作用す
る配列 9.本質的に同じように作用する前記DNA配列を包含す
る、上記８に記載の暗号化DNA領域のDNA領域から成るか
又はこのDNA配列を含んで成るDNA。
る下記の配列を含むDNA及び本質的に同じように作用す
る配列 9.本質的に同じように作用する前記DNA配列を包含す
る、上記８に記載の暗号化DNA領域のDNA領域から成るか
又はこのDNA配列を含んで成るDNA。
10.上記８に記載のDNAを含有するスチルベンシンターゼ
遺伝子又は遺伝子単位。
遺伝子又は遺伝子単位。
11.“外来"DNA又は“追加の"DNAとしては、１つ又は１
つより多くの上記１乃至10のいずれかに記載のスチルベ
ンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単位及び／又はそれらの
一部及び／又はDNAを含む修飾された原核生物DNA又は真
核生物DNA。
つより多くの上記１乃至10のいずれかに記載のスチルベ
ンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単位及び／又はそれらの
一部及び／又はDNAを含む修飾された原核生物DNA又は真
核生物DNA。
12.植物細胞（プロトプラストを包含する）又は植物
（植物の一部及び種子を包含する）に含まれている上記
11に記載の修飾されたDNA。
（植物の一部及び種子を包含する）に含まれている上記
11に記載の修飾されたDNA。
13.1つ又は１つより多くの上記１乃至10のいずれかに記
載のスチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子又は遺伝子
単位及び／又はそれらの一部及び／又はDNA及び／又は
上記11に記載の修飾されたDNAを含むベクター。
載のスチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子又は遺伝子
単位及び／又はそれらの一部及び／又はDNA及び／又は
上記11に記載の修飾されたDNAを含むベクター。
14.ベクタープラスミドpGS828.1。
15.1つ又は１つより多くの上記１乃至10のいずれかに記
載のスチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単位及び／
又はそれらの一部及び／又はDNA及び／又は上記11に記
載の修飾されたDNAを含む形質転換された微生物。
載のスチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単位及び／
又はそれらの一部及び／又はDNA及び／又は上記11に記
載の修飾されたDNAを含む形質転換された微生物。
16.大腸菌株Nurdug2010及びその突然変異体及び変異
体。
体。
17.植物細胞（プロトプラストを包含する）及び植物
（植物の一部及び種子を包含する）の形質転換ための、
上記１乃至16のいずれかに記載のスチルベンシンターゼ
遺伝子又は遺伝子単位及び／又はその一部及び／又はDN
A及び／又は修飾されたDNA及び／又はベクター及び／又
は形質転換された微生物の使用。
（植物の一部及び種子を包含する）の形質転換ための、
上記１乃至16のいずれかに記載のスチルベンシンターゼ
遺伝子又は遺伝子単位及び／又はその一部及び／又はDN
A及び／又は修飾されたDNA及び／又はベクター及び／又
は形質転換された微生物の使用。
18.“外来"DNA又は“追加の"DNAとして、１つ又は１つ
より多くの上記１乃至11にいずかに記載のスチルベンシ
ンターゼ遺伝子又は遺伝子単位及び／又はそれらの一部
及び／又はDNA及び／又は修飾されたDNAを含む、形質転
換された植物細胞（プロトプラストを包含する）及び植
物（植物の一部及び種子を包含する）。
より多くの上記１乃至11にいずかに記載のスチルベンシ
ンターゼ遺伝子又は遺伝子単位及び／又はそれらの一部
及び／又はDNA及び／又は修飾されたDNAを含む、形質転
換された植物細胞（プロトプラストを包含する）及び植
物（植物の一部及び種子を包含する）。
19.（ａ）１種又は１種より多くの上記１乃至11のいず
れかに記載のスチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単
位及び／又はそれら一部及び／又はDNA及び／又は修飾
されたDNAを、植物細胞（プロトプラストを包含する）
のゲノムに導入し、そして場合により、 （ｂ）前記形成転換された植物細胞（プロトプラストを
包含する）から完全な形質転換された植物を再生し、そ
して場合により、 （ｃ）このようにして得られた形質転換された植物か
ら、植物の所望の一部（種子を包含する）を回収するこ
とを特徴とする、上記18に記載の形質転換された植物細
胞（プロトプラストを包含する）及び植物（植物の一部
及び種子を包含する）の製造方法。
れかに記載のスチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単
位及び／又はそれら一部及び／又はDNA及び／又は修飾
されたDNAを、植物細胞（プロトプラストを包含する）
のゲノムに導入し、そして場合により、 （ｂ）前記形成転換された植物細胞（プロトプラストを
包含する）から完全な形質転換された植物を再生し、そ
して場合により、 （ｃ）このようにして得られた形質転換された植物か
ら、植物の所望の一部（種子を包含する）を回収するこ
とを特徴とする、上記18に記載の形質転換された植物細
胞（プロトプラストを包含する）及び植物（植物の一部
及び種子を包含する）の製造方法。
20.増殖物質の製造のため及び新規な植物及びその増殖
物質の製造のための、上記18に記載の形質転換された植
物細胞（プロトプラストを包含する）及び植物（植物の
一部及び種子を包含する）の使用。
物質の製造のための、上記18に記載の形質転換された植
物細胞（プロトプラストを包含する）及び植物（植物の
一部及び種子を包含する）の使用。
21.上記18に記載の形質転換された植物細胞及び植物の
増殖により得ることができる増殖物質。
増殖により得ることができる増殖物質。
22.植物細胞及び植物がタバコ、アルファルファ又はジ
ャガイモ植物細胞、及びタバコ、アルファルファ又はジ
ャガイモ植物である、上記18に記載の形質転換された植
物細胞（プロトプラストを包含する）及び植物（植物の
一部及び種子を包含する）、上記19に記載のそれらの製
造方法、及び上記20に記載のそれらの使用、及び上記21
に記載の増殖物質。
ャガイモ植物細胞、及びタバコ、アルファルファ又はジ
ャガイモ植物である、上記18に記載の形質転換された植
物細胞（プロトプラストを包含する）及び植物（植物の
一部及び種子を包含する）、上記19に記載のそれらの製
造方法、及び上記20に記載のそれらの使用、及び上記21
に記載の増殖物質。
第１図は、EcoR I及びHind IIIによる部分開裂によりプ
ラスミドpGS828.1から得られ、6.700ヌクレオチド対を
有し、スチルベンシンターゼ遺伝子を含む核酸切片を表
わす。 （１）及び（２）は、構造遺伝子の始点（１）及び終点
（２）を示す。遺伝子の調節部分は左側（（１）の左）
に位置している。下記の制限酵素開裂部位が示されてい
る。 Ｅ……EcoR I Ｈ……Hind III Ｐ……Pst I Ｓ……Sst I 第２図は、ベクターpSP65における第１図に従う遺伝子
単位を示す。完全なプラスミドはpGS828.1という名称を
有する。 “ORI"は複製の起点（大腸菌中でのプラスミドの増殖に
とって重要なベクターpSP65中の配列）を示す。 “AMP"は、pSP65含有大腸菌のアンピシリンに対する抵
抗を引き起こす遺伝子を表す。第１図に示された開裂部
位の他に、Pvu II開裂部位（Pvとして示されている）も
示されている。
ラスミドpGS828.1から得られ、6.700ヌクレオチド対を
有し、スチルベンシンターゼ遺伝子を含む核酸切片を表
わす。 （１）及び（２）は、構造遺伝子の始点（１）及び終点
（２）を示す。遺伝子の調節部分は左側（（１）の左）
に位置している。下記の制限酵素開裂部位が示されてい
る。 Ｅ……EcoR I Ｈ……Hind III Ｐ……Pst I Ｓ……Sst I 第２図は、ベクターpSP65における第１図に従う遺伝子
単位を示す。完全なプラスミドはpGS828.1という名称を
有する。 “ORI"は複製の起点（大腸菌中でのプラスミドの増殖に
とって重要なベクターpSP65中の配列）を示す。 “AMP"は、pSP65含有大腸菌のアンピシリンに対する抵
抗を引き起こす遺伝子を表す。第１図に示された開裂部
位の他に、Pvu II開裂部位（Pvとして示されている）も
示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ペーター・ヘルムート・シユライアー ドイツ連邦共和国デー5000ケルン１・ダ ツセルシユトラーセ 16 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．259（11) ｐ．6806−6811（1984) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．14（13）ｐ5229−5239（1986) Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．202 ｐ．429−434（1986) ＥＭＢＯ Ｊ．２ ｐ．1801−1805 （1983) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/52 - 15/61 C12N 15/63 C12N 9/00 - 9/94 A01H 5/00 - 5/12 C12N 1/21 C12N 5/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ
Claims (13)
- 【請求項１】下記の一文字記号で形成されたアミノ酸配
列により表されるスチルベンシンターゼをコードするDN
Aを含んでなるスチルベンシンターゼ遺伝子。 - 【請求項２】約6,700塩基対から成り、３つのEcoR I、
３つのHind III及び１つのPst I開裂部位を有し、EcoR
I及びHind IIIを使用して下記構造で示されるプラスミ
ドpGS828.1の部分開裂により得ることができるか、又は
Sst I及びPvu IIを使用して該プラスミドpGS828.1から
得ることができる特許請求の範囲第１項に記載のスチル
ベンシンターゼ遺伝子。 （上記構造中、挿入断片中の略号はそれぞれ以下の制限
酵素認識部位を示し： E:EcoR I H:Hind III P:Pst I S:Sst I そして挿入断片は、約6,700ヌクレオチド対を有す
る。） - 【請求項３】下記の一文字記号で記載されたスチルベン
シンターゼをコードするDNA。 - 【請求項４】外来のDNA又は追加のDNAとして、特許請求
の範囲第３項記載のスチルベンシンターゼをコードする
DNAを１個以上担持する原核生物又は真核生物に由来す
る組換えDNA。 - 【請求項５】植物細胞に含まれている特許請求の範囲第
４項記載の組換えDNA。 - 【請求項６】特許請求の範囲第３項に記載のスチルベン
シンターゼをコードするDNAを１個以上担持するベクタ
ー。 - 【請求項７】特許請求の範囲第１項記載のスチルベンシ
ンターゼ遺伝子を１個以上含む形質転換された微生物。 - 【請求項８】特許請求の範囲第１項記載のスチルベンシ
ンターゼ遺伝子を１個以上含むトランスジエニツク植物
細胞。 - 【請求項９】特許請求の範囲第８項記載の植物細胞を含
み、有害生物に対して増加した抵抗性を有するトランス
ジエニツク双子葉植物。 - 【請求項１０】特許請求の範囲第１項に記載のスチルベ
ンシンターゼ遺伝子又は同第３項に記載のスチルベンシ
ンターゼをコードするDNAを１個以上植物細胞のゲノム
に導入することを特徴とする特許請求の範囲第８項記載
のトランスジエニツク植物細胞の作出方法。 - 【請求項１１】（ａ） 特許請求の範囲第１項に記載の
スチルベンシンターゼ遺伝子又は同第３項に記載のスチ
ルベンシンターゼをコードするDNAを１個以上植物細胞
のゲノムに導入する段階、及び （ｂ） 段階（ａ）で得られた植物細胞を再生する段
階、 を含んでなる特許請求の範囲第９項記載のトランスジエ
ニツク双子葉植物の作出方法。 - 【請求項１２】下記構造で示されるプラスミドpGS828.1
である特許請求の範囲第６項記載のベクター。 （上記構造中、挿入断片中の略号はそれぞれ以下の制限
酵素認識部位を示し： E:EcoR I H:Hind III P:Pst I S:Sst I そして挿入断片は、約6,700ヌクレオチド対を有す
る。） - 【請求項１３】請求項12に記載のプラスミドpGS828.1を
含む大腸菌（Escherichia coli）。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873733017 DE3733017A1 (de) | 1987-09-30 | 1987-09-30 | Stilbensynthase-gen |
| DE3733017.9 | 1987-09-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01101888A JPH01101888A (ja) | 1989-04-19 |
| JP2812685B2 true JP2812685B2 (ja) | 1998-10-22 |
Family
ID=6337281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63247269A Expired - Fee Related JP2812685B2 (ja) | 1987-09-30 | 1988-09-30 | スチルベンシンターゼ遺伝子 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5985647A (ja) |
| EP (1) | EP0309862B1 (ja) |
| JP (1) | JP2812685B2 (ja) |
| DE (2) | DE3733017A1 (ja) |
Families Citing this family (192)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3837752A1 (de) * | 1988-11-07 | 1990-05-10 | Max Planck Gesellschaft | Verwundungsstimulierte dna-sequenz aus solanum tuberosum und ihre verwendung |
| AU655186B2 (en) * | 1990-06-07 | 1994-12-08 | Syngenta Mogen Bv | New antifungal preparations, process for making such preparations, process for obtaining plants with decreased susceptibility to fungi |
| DE4107396A1 (de) * | 1990-06-29 | 1992-01-02 | Bayer Ag | Stilbensynthase-gene aus weinrebe |
| DE4031758A1 (de) * | 1990-10-06 | 1992-04-09 | Bayer Ag | Resistenz-gene |
| US6262338B1 (en) | 1990-10-06 | 2001-07-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Resistance genes |
| DE4130986A1 (de) * | 1991-09-18 | 1993-03-25 | Bayer Ag | Pinosylvinsynthase-gene |
| DE4334791A1 (de) * | 1993-10-13 | 1995-04-20 | Bayer Ag | Bibenzylsynthase-Gene |
| CA2360365A1 (en) * | 1999-01-29 | 2000-08-03 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Transgenic plants modified to contain resveratrol glucoside and uses thereof |
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