JPH0576373A - 耐性遺伝子 - Google Patents
耐性遺伝子Info
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- JPH0576373A JPH0576373A JP3281936A JP28193691A JPH0576373A JP H0576373 A JPH0576373 A JP H0576373A JP 3281936 A JP3281936 A JP 3281936A JP 28193691 A JP28193691 A JP 28193691A JP H0576373 A JPH0576373 A JP H0576373A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は植物から単離した新規耐性遺伝子に
おいて、病原体により特異的に誘発することができ、以
下の配列のｃＤＮＡに対応するＤＮＡ配列を含むことを
特徴とする遺伝子に関する。 【表１】 【効果】 植物病原体に対する耐性の増加した植物を得
る方法を開発した。
おいて、病原体により特異的に誘発することができ、以
下の配列のｃＤＮＡに対応するＤＮＡ配列を含むことを
特徴とする遺伝子に関する。 【表１】 【効果】 植物病原体に対する耐性の増加した植物を得
る方法を開発した。
Description
【０００１】本発明は植物から単離した新規耐性遺伝
子、及びベクター、宿主生物、及び植物の形質転換、な
らびに有害生物（ｐｅｓｔ）に対する耐性が増加した植
物の製造へのその利用に関する。
子、及びベクター、宿主生物、及び植物の形質転換、な
らびに有害生物（ｐｅｓｔ）に対する耐性が増加した植
物の製造へのその利用に関する。
【０００２】多くの植物が有害生物（ｐｅｓｔ）に対す
る耐性の生来の可能性を備えている。これらの耐性の機
構は耐性遺伝子により調節される。それは生物的刺激
（例えば有害生物（ｐｅｓｔ）による攻撃）、又は非生
物的刺激（例えばＵＶ光）により活性化される。ほとん
どの場合これらの耐性の機構はまだ十分に知られていな
い。最初に有害生物（ｐｅｓｔ）により活性化され、植
物のゲノムに挿入して後者にすでに存在する有害生物
（ｐｅｓｔ）に対する耐性をさらに増加させることので
きる耐性遺伝子を得る要求がある。有害生物（ｐｅｓ
ｔ）により特異的に誘発されるそのような耐性遺伝子は
これまで知られていない。
る耐性の生来の可能性を備えている。これらの耐性の機
構は耐性遺伝子により調節される。それは生物的刺激
（例えば有害生物（ｐｅｓｔ）による攻撃）、又は非生
物的刺激（例えばＵＶ光）により活性化される。ほとん
どの場合これらの耐性の機構はまだ十分に知られていな
い。最初に有害生物（ｐｅｓｔ）により活性化され、植
物のゲノムに挿入して後者にすでに存在する有害生物
（ｐｅｓｔ）に対する耐性をさらに増加させることので
きる耐性遺伝子を得る要求がある。有害生物（ｐｅｓ
ｔ）により特異的に誘発されるそのような耐性遺伝子は
これまで知られていない。
【０００３】ここで植物から新規耐性遺伝子が単離さ
れ、これらの耐性遺伝子は忌避物質を全く、あるいは不
十分な量しか製造しない、又はその製造が遅すぎて間に
合わないような植物の遺伝物質（ゲノム）に挿入するこ
とができ、その方法でそのような植物の有害生物（ｐｅ
ｓｔ）（病原体）に対する耐性を増加させることができ
る。
れ、これらの耐性遺伝子は忌避物質を全く、あるいは不
十分な量しか製造しない、又はその製造が遅すぎて間に
合わないような植物の遺伝物質（ゲノム）に挿入するこ
とができ、その方法でそのような植物の有害生物（ｐｅ
ｓｔ）（病原体）に対する耐性を増加させることができ
る。
【０００４】新規耐性遺伝子は病原菌により特異的に誘
発することができ、以下の配列のｃＤＮＡに対応するＤ
ＮＡ配列を持つことを特徴とする：
発することができ、以下の配列のｃＤＮＡに対応するＤ
ＮＡ配列を持つことを特徴とする：
【０００５】
【表３】
【０００６】上記ｃＤＮＡに完全に、又は基本的に対応
する配列を含む新種の耐性遺伝子が発見できたことは驚
くべきことである。このｃＤＮＡ配列は新規配列であ
り、その存在を予想することはできなかった。
する配列を含む新種の耐性遺伝子が発見できたことは驚
くべきことである。このｃＤＮＡ配列は新規配列であ
り、その存在を予想することはできなかった。
【０００７】さらに新規耐性遺伝子が基本的に病原体
（有害生物（ｐｅｓｔ））、又は病原体の細胞壁フラグ
メント（エリシター）により活性化されるが、他の従来
の生物的、及び非生物的誘発物が実質的に効果がないこ
とは驚くべきことと言わねばならない。従って新規耐性
遺伝子はトランスジェニック植物における有害生物（ｐ
ｅｓｔ）に対する耐性の増加に非常に適している。
（有害生物（ｐｅｓｔ））、又は病原体の細胞壁フラグ
メント（エリシター）により活性化されるが、他の従来
の生物的、及び非生物的誘発物が実質的に効果がないこ
とは驚くべきことと言わねばならない。従って新規耐性
遺伝子はトランスジェニック植物における有害生物（ｐ
ｅｓｔ）に対する耐性の増加に非常に適している。
【０００８】上記ｃＤＮＡに対応するＤＮＡ配列を持つ
耐性遺伝子はｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ配列を含み、ｍ
ＲＮＡに転写され、このｍＲＮＡが鋳型として使用され
た後に上記ｃＤＮＡを製造することができる。本発明の
耐性遺伝子はその発現が病原体により特異的に誘発さ
れ、上記ｃＤＮＡとハイブリッド形成する遺伝子であ
る。
耐性遺伝子はｃＤＮＡに相補的なＤＮＡ配列を含み、ｍ
ＲＮＡに転写され、このｍＲＮＡが鋳型として使用され
た後に上記ｃＤＮＡを製造することができる。本発明の
耐性遺伝子はその発現が病原体により特異的に誘発さ
れ、上記ｃＤＮＡとハイブリッド形成する遺伝子であ
る。
【０００９】耐性遺伝子は植物を攻撃する有害生物（ｐ
ｅｓｔ）を撃退する、又は破壊するのに適した、又はそ
のような有害生物（ｐｅｓｔ）の蔓延を防ぐ物質の形成
を植物中に引き起こす核酸（ＤＮＡ）を意味するものと
理解される。そのような物質は酵素、特にヒドラーゼで
あることが好ましく、好ましいヒドラーゼはＮ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミン ポリマー、又はＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミンを含むポリマー（キチナーゼ）のβ
（１−４）結合を切断することができるヒドラーゼであ
る。
ｅｓｔ）を撃退する、又は破壊するのに適した、又はそ
のような有害生物（ｐｅｓｔ）の蔓延を防ぐ物質の形成
を植物中に引き起こす核酸（ＤＮＡ）を意味するものと
理解される。そのような物質は酵素、特にヒドラーゼで
あることが好ましく、好ましいヒドラーゼはＮ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミン ポリマー、又はＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミンを含むポリマー（キチナーゼ）のβ
（１−４）結合を切断することができるヒドラーゼであ
る。
【００１０】これらの核酸はその本来の環境（植物）か
ら単離した形態で、又はプラスミド、ファージ、あるい
はコスミドなどのベクター中に組み込まれた形態で存在
することができ、又は細菌ＤＮＡなどの原核ＤＮＡ、あ
るいは植物ＤＮＡなどの真核ＤＮＡ中に”外部”ＤＮ
Ａ、又は”付加”ＤＮＡとして含まれることもできる。
耐性遺伝子は又、さらにその発端、及び／又は末端に遺
伝子の機能と抵触しない、あるいはあまり抵触しないＤ
ＮＡ配列を含む耐性遺伝子を意味すると理解される。”
遺伝子ユニット”とも言われるこれらのＤＮＡ配列は、
アラチス ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａ
ｅａ）懸濁細胞系からの抽出などによりゲノムＤＮＡを
得た時にそれを、例えばＢａｍＨ１，ＸｂａＩ又はＨｉ
ｎｄＩＩＩなどの制限酵素を用いて切断することにより
切り出して形成する（Ｒｏｌｆｓ，Ｆｒｉｔｚｅｍｅｉ
ｅｒ，Ｋｉｎｄｌ（１９８１））。
ら単離した形態で、又はプラスミド、ファージ、あるい
はコスミドなどのベクター中に組み込まれた形態で存在
することができ、又は細菌ＤＮＡなどの原核ＤＮＡ、あ
るいは植物ＤＮＡなどの真核ＤＮＡ中に”外部”ＤＮ
Ａ、又は”付加”ＤＮＡとして含まれることもできる。
耐性遺伝子は又、さらにその発端、及び／又は末端に遺
伝子の機能と抵触しない、あるいはあまり抵触しないＤ
ＮＡ配列を含む耐性遺伝子を意味すると理解される。”
遺伝子ユニット”とも言われるこれらのＤＮＡ配列は、
アラチス ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａ
ｅａ）懸濁細胞系からの抽出などによりゲノムＤＮＡを
得た時にそれを、例えばＢａｍＨ１，ＸｂａＩ又はＨｉ
ｎｄＩＩＩなどの制限酵素を用いて切断することにより
切り出して形成する（Ｒｏｌｆｓ，Ｆｒｉｔｚｅｍｅｉ
ｅｒ，Ｋｉｎｄｌ（１９８１））。
【００１１】耐性遺伝子（又は遺伝子ユニット）は植物
のゲノム中に含まれる形態で（（イントロンなどの）非
コード配列を含む”ゲノム”形）、又は逆転写酵素／ポ
リメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得ることができるｃ
ＤＮＡ（”複写”ＤＮＡ）に対応する形態で（もはやイ
ントロンを含まない形態で）存在することができる。耐
性遺伝子は部分的に合成された、又は完全に合成された
形態で存在することもできる。
のゲノム中に含まれる形態で（（イントロンなどの）非
コード配列を含む”ゲノム”形）、又は逆転写酵素／ポ
リメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得ることができるｃ
ＤＮＡ（”複写”ＤＮＡ）に対応する形態で（もはやイ
ントロンを含まない形態で）存在することができる。耐
性遺伝子は部分的に合成された、又は完全に合成された
形態で存在することもできる。
【００１２】本発明の耐性遺伝子（又は遺伝子ユニッ
ト）において、それが基本的に機能する忌避物質の形成
に悪影響を与えない、又はそれを妨げない限り基本的に
同様の作用をするＤＮＡ配列、又はＤＮＡによりＤＮＡ
配列を置換することができる。又それは、それぞれの場
合に遺伝子（又は遺伝子ユニット）の取り扱いに適応し
たＤＮＡ配列（例えば”リンカー”）を末端に持つこと
もできる。
ト）において、それが基本的に機能する忌避物質の形成
に悪影響を与えない、又はそれを妨げない限り基本的に
同様の作用をするＤＮＡ配列、又はＤＮＡによりＤＮＡ
配列を置換することができる。又それは、それぞれの場
合に遺伝子（又は遺伝子ユニット）の取り扱いに適応し
たＤＮＡ配列（例えば”リンカー”）を末端に持つこと
もできる。
【００１３】本明細書に関して、”外部”ＤＮＡは、特
定の原核、又は真核ゲノムに自然には存在しないが人間
の操作の結果ゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味すると
理解される。”付加”ＤＮＡは実際に特定の原核、又は
真核ゲノムに自然に存在するが、人間の操作の結果さら
に追加してゲノム中に挿入されたＤＮＡである。１片又
はそれ以上の”外部”ＤＮＡ、又は”付加”ＤＮＡを、
問題の場合の必要性、及び性質に依存して挿入すること
ができる。
定の原核、又は真核ゲノムに自然には存在しないが人間
の操作の結果ゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味すると
理解される。”付加”ＤＮＡは実際に特定の原核、又は
真核ゲノムに自然に存在するが、人間の操作の結果さら
に追加してゲノム中に挿入されたＤＮＡである。１片又
はそれ以上の”外部”ＤＮＡ、又は”付加”ＤＮＡを、
問題の場合の必要性、及び性質に依存して挿入すること
ができる。
【００１４】すでに述べた通り、耐性遺伝子はヒドラー
ゼを形成する遺伝子を意味すると理解するのが好まし
く、シチナーゼ−型のヒドラーゼが特に好ましい。
ゼを形成する遺伝子を意味すると理解するのが好まし
く、シチナーゼ−型のヒドラーゼが特に好ましい。
【００１５】本発明の耐性遺伝子は単子葉、及び双子葉
植物から誘導する。本発明の好ましい耐性遺伝子は双子
葉植物、特にナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、及びマ
メ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、特に好ましくはピー
ナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）から単離
することができる耐性遺伝子である。上記のｃＤＮＡを
プローブとして使用し、通常の方法で植物を耐性遺伝子
の存在に関して調べることができる。
植物から誘導する。本発明の好ましい耐性遺伝子は双子
葉植物、特にナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、及びマ
メ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、特に好ましくはピー
ナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）から単離
することができる耐性遺伝子である。上記のｃＤＮＡを
プローブとして使用し、通常の方法で植物を耐性遺伝子
の存在に関して調べることができる。
【００１６】本発明の特に好ましい耐性遺伝子は上記ｃ
ＤＮＡに対応するＤＮＡ配列を含み、病原体（特に菌・
カビ、又は菌・カビの細胞壁のフラグメント）、好まし
くはフィトフトラ メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈ
ｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、又はその細胞壁フラ
グメントから誘導でき、中でも特にアラチス ヒポガエ
ア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）（ピーナッ
ツ）から単離することができる耐性遺伝子である。
ＤＮＡに対応するＤＮＡ配列を含み、病原体（特に菌・
カビ、又は菌・カビの細胞壁のフラグメント）、好まし
くはフィトフトラ メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈ
ｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、又はその細胞壁フラ
グメントから誘導でき、中でも特にアラチス ヒポガエ
ア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）（ピーナッ
ツ）から単離することができる耐性遺伝子である。
【００１７】これらの遺伝子、又はその必須部分は約２
−３ｋｂｐの３ＤＮＡフラグメント上（ＨｉｎｄＩＩＩ
を用いた切断の場合）、又は約５及び約２３ｋｂｐ間の
フラグメント上（ＸｂａＩ又はＢａｍＨＩを用いた切断
の場合）にある。
−３ｋｂｐの３ＤＮＡフラグメント上（ＨｉｎｄＩＩＩ
を用いた切断の場合）、又は約５及び約２３ｋｂｐ間の
フラグメント上（ＸｂａＩ又はＢａｍＨＩを用いた切断
の場合）にある。
【００１８】本発明の耐性遺伝子は、以下のｃＤＮＡ配
列をプローブとして用い、分子生物学において一般的に
周知の方法を用いて例えばピーナッツなどの植物中で探
索、単離、精製、及び検出することができる：
列をプローブとして用い、分子生物学において一般的に
周知の方法を用いて例えばピーナッツなどの植物中で探
索、単離、精製、及び検出することができる：
【００１９】
【表４】
【００２０】この目的のために、問題の植物のＤＮＡを
単離し、サザン法により有用な制限エンドヌクレアーゼ
を決定する（このＤＮＡが消化される場合のフラグメン
トの大きさが２ｋｂ以上で２８ｋｂ以下であり、均一な
大きさのフラグメントを与える制限ヌクレアーゼが好ま
しい）。得られたフラグメントをその大きさに従って分
離する。上記のｃＤＮＡとハイブリッド形成するフラグ
メントを、特定の植物の部分的遺伝子ライブラリとして
適したベクター中にクローニングする。プラークハイブ
リッド法を用いて対応するベクター中の耐性遺伝子をｃ
ＤＮＡにより単離する。単離物から得た核酸を用いて、
直接植物の形質転換を行う。通常の方法を用いて単離物
から所望の遺伝子を単離し、それを例えばアグロバクテ
リウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて他の形質転換法に
使用することもできる。
単離し、サザン法により有用な制限エンドヌクレアーゼ
を決定する（このＤＮＡが消化される場合のフラグメン
トの大きさが２ｋｂ以上で２８ｋｂ以下であり、均一な
大きさのフラグメントを与える制限ヌクレアーゼが好ま
しい）。得られたフラグメントをその大きさに従って分
離する。上記のｃＤＮＡとハイブリッド形成するフラグ
メントを、特定の植物の部分的遺伝子ライブラリとして
適したベクター中にクローニングする。プラークハイブ
リッド法を用いて対応するベクター中の耐性遺伝子をｃ
ＤＮＡにより単離する。単離物から得た核酸を用いて、
直接植物の形質転換を行う。通常の方法を用いて単離物
から所望の遺伝子を単離し、それを例えばアグロバクテ
リウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて他の形質転換法に
使用することもできる。
【００２１】一般に、上記ｃＤＮＡを用いて単離した耐
性遺伝子は病原体により特異的に誘発することができ
る。しかし植物の性質に依存して、誘発に必要なシグナ
ル鎖が機能しない、又は存在しない場合もあり得る。耐
性の徴候は植物、又は植物の一部を病原体、又はその細
胞壁フラグメントと共に培養することにより調べること
ができる。特異的誘発性は通常の方法で（例えばノザン
分析）上記のｃＤＮＡを用いて検出することができる。
性遺伝子は病原体により特異的に誘発することができ
る。しかし植物の性質に依存して、誘発に必要なシグナ
ル鎖が機能しない、又は存在しない場合もあり得る。耐
性の徴候は植物、又は植物の一部を病原体、又はその細
胞壁フラグメントと共に培養することにより調べること
ができる。特異的誘発性は通常の方法で（例えばノザン
分析）上記のｃＤＮＡを用いて検出することができる。
【００２２】例として本方法をピーナッツ耐性遺伝子の
場合につき、以下に説明する：アラチス ヒポガエア
（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）懸濁細胞系（Ｒ
ｏｌｆｓ等、１９８１）からデオキシリボ核酸ＤＮＡを
単離し、各場合につき１アリコートを制限エンドヌクレ
アーゼ、好ましくは酵素ＨｉｎｄＩＩＩ又はＭｂｏＩを
用いて切断する。その後ＤＮＡを沈降遠心を用いて、又
はゲル電気泳動を用いてフラグメントの大きさにより分
離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ
Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９）。約１０ｋｂまでの大き
さのフラグメント（ＨｉｎｄＩＩＩ）、又は約１０−２
０ｋｂ（ＭｂｏＩ）のフラグメントを含むフラクション
をラムダベクター（ラムダ ＺＡＰ ＩＩ、又はラムダ
ＦＩＸ ＩＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉ
ｄｅｌｂｅｒｇ）にクローニングする。
場合につき、以下に説明する：アラチス ヒポガエア
（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）懸濁細胞系（Ｒ
ｏｌｆｓ等、１９８１）からデオキシリボ核酸ＤＮＡを
単離し、各場合につき１アリコートを制限エンドヌクレ
アーゼ、好ましくは酵素ＨｉｎｄＩＩＩ又はＭｂｏＩを
用いて切断する。その後ＤＮＡを沈降遠心を用いて、又
はゲル電気泳動を用いてフラグメントの大きさにより分
離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ
Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９）。約１０ｋｂまでの大き
さのフラグメント（ＨｉｎｄＩＩＩ）、又は約１０−２
０ｋｂ（ＭｂｏＩ）のフラグメントを含むフラクション
をラムダベクター（ラムダ ＺＡＰ ＩＩ、又はラムダ
ＦＩＸ ＩＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉ
ｄｅｌｂｅｒｇ）にクローニングする。
【００２３】この方法により、本発明の意味の耐性遺伝
子を含むピーナッツの遺伝子ライブラリの一部が確立さ
れる。これらの耐性遺伝子を含むベクターはｐＲ３−７
にクローニングしたｃＤＮＡプローブを用いて明確に同
定し、さらに精製することができる。耐性遺伝子を含む
精製核酸を、直接ＤＮＡ形質転換、又は好ましくはアグ
ロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いた他の形質
転換法によりタバコ、又は他の植物に転換する。
子を含むピーナッツの遺伝子ライブラリの一部が確立さ
れる。これらの耐性遺伝子を含むベクターはｐＲ３−７
にクローニングしたｃＤＮＡプローブを用いて明確に同
定し、さらに精製することができる。耐性遺伝子を含む
精製核酸を、直接ＤＮＡ形質転換、又は好ましくはアグ
ロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いた他の形質
転換法によりタバコ、又は他の植物に転換する。
【００２４】他の植物からの耐性遺伝子の単離にも類似
の方法を適用することができる。
の方法を適用することができる。
【００２５】基本的に同様の方法で作用する（プローブ
としての適用性を保持している）ＤＮＡ配列を含み、上
記のｃＤＮＡ配列は本発明の一部である。それはＤＮＡ
合成において周知の方法を用いて得ることができる、又
はプラスミドｐＲ３−７から通常の方法により、Ｅｃｏ
ＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、その後約１７
０ｋｂのフラグメントを単離することにより得ることが
できる。このｃＤＮＡに対応する、すなわち例えばやは
り非コード配列（イントロン）を含み、基本的に同様の
方法で作用するＤＮＡ配列も本発明の他の一部である。
としての適用性を保持している）ＤＮＡ配列を含み、上
記のｃＤＮＡ配列は本発明の一部である。それはＤＮＡ
合成において周知の方法を用いて得ることができる、又
はプラスミドｐＲ３−７から通常の方法により、Ｅｃｏ
ＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、その後約１７
０ｋｂのフラグメントを単離することにより得ることが
できる。このｃＤＮＡに対応する、すなわち例えばやは
り非コード配列（イントロン）を含み、基本的に同様の
方法で作用するＤＮＡ配列も本発明の他の一部である。
【００２６】プラスミドｐＲ３−７は出発プラスミドｐ
ＵＣ１９を含み、その切断部位に上記ｃＤＮＡをスムー
ズ末端を経てクローニングしてある。ｃＤＮＡは例えば
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて完全に切り出す
ことができ、ｃＤＮＡには５’−末端（位置−１）、及
び３’−末端で以下に示す配列が側面を接している（小
文字中で側面への接触は終わる）：
ＵＣ１９を含み、その切断部位に上記ｃＤＮＡをスムー
ズ末端を経てクローニングしてある。ｃＤＮＡは例えば
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて完全に切り出す
ことができ、ｃＤＮＡには５’−末端（位置−１）、及
び３’−末端で以下に示す配列が側面を接している（小
文字中で側面への接触は終わる）：
【００２７】
【表５】
【００２８】このＤＮＡ配列は本発明の一部である。こ
れは本発明の遺伝子の位置探索のプローブとして（ｃＤ
ＮＡの場合）直接使用することができる。フランキング
配列のないｃＤＮＡ配列を得ることが必要な場合、ＰＣ
Ｒ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）及び合成オリゴヌクレ
オチド 5’ＡＴＣ ＴＣＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＴＣＧ
ＧＣＧＣＴ3’及び 5’ＣＣＧ ＣＡＧ ＴＣＣ Ａ
ＧＧ ＣＣＧ ＣＣＧＴＴ3’の両方を用いた合成によ
り、又は別法として完全に合成により製造することもで
きる。
れは本発明の遺伝子の位置探索のプローブとして（ｃＤ
ＮＡの場合）直接使用することができる。フランキング
配列のないｃＤＮＡ配列を得ることが必要な場合、ＰＣ
Ｒ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）及び合成オリゴヌクレ
オチド 5’ＡＴＣ ＴＣＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＴＣＧ
ＧＣＧＣＴ3’及び 5’ＣＣＧ ＣＡＧ ＴＣＣ Ａ
ＧＧ ＣＣＧ ＣＣＧＴＴ3’の両方を用いた合成によ
り、又は別法として完全に合成により製造することもで
きる。
【００２９】プラスミドｐＲ３−７を含む大腸菌株ＲＧ
−２は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈ
ｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉ
ｏｎｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ
ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓの規則と
一致し、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ［Ｇｅｒｍａｎ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｓ］（ＤＳＭ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ
１ｂ、Ｄ−３３００ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｇ，Ｆｅｄ
ｅｒａｌ ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＧｅｒｍａｎｙに預託
し（預託日：１９９０年８月２８日）、預託番号はＤＳ
Ｍ６１４９である。
−２は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈ
ｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉ
ｏｎｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ
ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓの規則と
一致し、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ［Ｇｅｒｍａｎ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｓ］（ＤＳＭ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ
１ｂ、Ｄ−３３００ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｇ，Ｆｅｄ
ｅｒａｌ ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＧｅｒｍａｎｙに預託
し（預託日：１９９０年８月２８日）、預託番号はＤＳ
Ｍ６１４９である。
【００３０】この株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２）及びプラ
スミドを含むその変異株も本発明の一部である。
スミドを含むその変異株も本発明の一部である。
【００３１】必要量のｃＤＮＡ（場合によってはフラン
キング配列と共に）は周知の方法による株の増殖、及び
単離により周知の方法で容易に得ることができる。
キング配列と共に）は周知の方法による株の増殖、及び
単離により周知の方法で容易に得ることができる。
【００３２】本発明による植物からの耐性遺伝子は病原
体により特異的に誘発することができ、上記で限定した
ｃＤＮＡに対応するＤＮＡ配列を含む。これはＤＮＡ配
列とｃＤＮＡの間に異なる程度の相同性があり、この相
同性は上記のｃＤＮＡをプローブとして耐性遺伝子を単
離するのに十分であることを意味する。
体により特異的に誘発することができ、上記で限定した
ｃＤＮＡに対応するＤＮＡ配列を含む。これはＤＮＡ配
列とｃＤＮＡの間に異なる程度の相同性があり、この相
同性は上記のｃＤＮＡをプローブとして耐性遺伝子を単
離するのに十分であることを意味する。
【００３３】従って本発明は病原体により特異的に誘発
され、上記ｃＤＮＡをプローブとして用いて単離するこ
とができる、植物からの耐性遺伝子に関する。
され、上記ｃＤＮＡをプローブとして用いて単離するこ
とができる、植物からの耐性遺伝子に関する。
【００３４】本発明の耐性遺伝子のように機能的に完全
な遺伝子は、制限部分（特にプロモーター）、及び問題
の蛋白質をコードする構造遺伝子から成る。
な遺伝子は、制限部分（特にプロモーター）、及び問題
の蛋白質をコードする構造遺伝子から成る。
【００３５】遺伝子の両部分は互いに独立して使用する
ことができる。例えば制限部分の下流に異なるＤＮＡ配
列（耐性遺伝子から逸脱する）を配置し、植物ゲノムに
挿入した後に発現するよう計画することができる。数種
の単離プロモーターしか知られておらず、病原体により
特異的に活性化することができ、植物中で活性になるこ
とができるプロモーターはこれまで得られていないの
で、やはり本発明の一部である本発明の耐性遺伝子のプ
ロモーターは、病原体に対する耐性の増加したトランス
ジェニック植物の製造の有用な道具となる。
ことができる。例えば制限部分の下流に異なるＤＮＡ配
列（耐性遺伝子から逸脱する）を配置し、植物ゲノムに
挿入した後に発現するよう計画することができる。数種
の単離プロモーターしか知られておらず、病原体により
特異的に活性化することができ、植物中で活性になるこ
とができるプロモーターはこれまで得られていないの
で、やはり本発明の一部である本発明の耐性遺伝子のプ
ロモーターは、病原体に対する耐性の増加したトランス
ジェニック植物の製造の有用な道具となる。
【００３６】同様に、構造耐性遺伝子の上流に”外部”
制限部分を配置することができる。これは、特定の植物
中である種の制限遺伝子（例えばオートロガス植物遺伝
子）のみが十分活性になることができる場合に有利であ
る。従って構造耐性遺伝子は上記配列のＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）と同様に独立して使用することができる有用な単位
を与え、すでに説明した通り、同様に本発明の一部であ
る。本発明の耐性遺伝子は通常の方法で制限部分と構造
遺伝子に分離することができる。本発明の完全な耐性遺
伝子（又は遺伝子ユニット）を使用するのが好ましい。
制限部分を配置することができる。これは、特定の植物
中である種の制限遺伝子（例えばオートロガス植物遺伝
子）のみが十分活性になることができる場合に有利であ
る。従って構造耐性遺伝子は上記配列のＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）と同様に独立して使用することができる有用な単位
を与え、すでに説明した通り、同様に本発明の一部であ
る。本発明の耐性遺伝子は通常の方法で制限部分と構造
遺伝子に分離することができる。本発明の完全な耐性遺
伝子（又は遺伝子ユニット）を使用するのが好ましい。
【００３７】通常の方法を用いて、耐性遺伝子（又は遺
伝子ユニット）、あるいはその部分を１個又はそれ以上
の複写（例えば直列）の状態で、好ましくは１個の複写
の状態で、”外部”又は”付加”ＤＮＡとして原核（好
ましくは細菌）、又は真核（好ましくは植物）ＤＮＡに
挿入することができる。このようにして”修正”し、例
えば植物又は植物細胞の形質転換に使用することがで
き、形質転換の後、植物又は植物細胞に含まれる組み替
えＤＮＡは本発明の一部である。
伝子ユニット）、あるいはその部分を１個又はそれ以上
の複写（例えば直列）の状態で、好ましくは１個の複写
の状態で、”外部”又は”付加”ＤＮＡとして原核（好
ましくは細菌）、又は真核（好ましくは植物）ＤＮＡに
挿入することができる。このようにして”修正”し、例
えば植物又は植物細胞の形質転換に使用することがで
き、形質転換の後、植物又は植物細胞に含まれる組み替
えＤＮＡは本発明の一部である。
【００３８】修正ＤＮＡと同様に、耐性遺伝子（又は遺
伝子ユニット）、及び／又はその一部、上記配列をもつ
ｃＤＮＡ、及びこのｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡ
は、トランスジェニック植物細胞、及び植物と同様にベ
クター（特にプラスミド、コスミド、又はファージ）、
形質転換微生物（好ましくは細菌、特に大腸菌のような
グラム陰性バクテリア）中に、又はＤＮＡそのものの中
に、”外部”又は”付加”ＤＮＡとして含むことができ
る。そのようなベクター、形質転換微生物（これもこれ
らのベクターを含むことができる）はトランスジェニッ
ク植物細胞及び植物ならびにＤＮＡそのものと同様に本
発明の一部である。
伝子ユニット）、及び／又はその一部、上記配列をもつ
ｃＤＮＡ、及びこのｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡ
は、トランスジェニック植物細胞、及び植物と同様にベ
クター（特にプラスミド、コスミド、又はファージ）、
形質転換微生物（好ましくは細菌、特に大腸菌のような
グラム陰性バクテリア）中に、又はＤＮＡそのものの中
に、”外部”又は”付加”ＤＮＡとして含むことができ
る。そのようなベクター、形質転換微生物（これもこれ
らのベクターを含むことができる）はトランスジェニッ
ク植物細胞及び植物ならびにＤＮＡそのものと同様に本
発明の一部である。
【００３９】本発明の耐性遺伝子を用いてそれに対する
耐性を得ることができる、又は耐性を増加することがで
きる有害生物（ｐｅｓｔ）は、ヒドラーゼ、特にシチナ
ーゼ型のヒドラーゼによりそれが植物に損傷を与えるの
を防ぐことができる有害生物（ｐｅｓｔ）であることが
好ましい。特に挙げることができる有害生物（ｐｅｓ
ｔ）は、昆虫及びダニなどの節足動物、線虫、ならびに
植物病原菌及びバクテリアなどの有害微生物である。有
害微生物、特に植物病原菌を特に強調する。
耐性を得ることができる、又は耐性を増加することがで
きる有害生物（ｐｅｓｔ）は、ヒドラーゼ、特にシチナ
ーゼ型のヒドラーゼによりそれが植物に損傷を与えるの
を防ぐことができる有害生物（ｐｅｓｔ）であることが
好ましい。特に挙げることができる有害生物（ｐｅｓ
ｔ）は、昆虫及びダニなどの節足動物、線虫、ならびに
植物病原菌及びバクテリアなどの有害微生物である。有
害微生物、特に植物病原菌を特に強調する。
【００４０】有害な昆虫には特に以下の目からの昆虫が
含まれる：直翅類、ハサミムシ類、シロアリ類、アザミ
ウマ類、異翅類、同翅類、鱗翅類、甲虫類、膜翅類、及
び双翅類。
含まれる：直翅類、ハサミムシ類、シロアリ類、アザミ
ウマ類、異翅類、同翅類、鱗翅類、甲虫類、膜翅類、及
び双翅類。
【００４１】有害なダニには特に：タルソネムス種（Ｔ
ａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｓｐｐ．）、パノニクス種（Ｐａ
ｎｏｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、及びテトラニクス種
（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．）が含まれる。
ａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｓｐｐ．）、パノニクス種（Ｐａ
ｎｏｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、及びテトラニクス種
（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．）が含まれる。
【００４２】有害な線虫には特に：プラチレンクス種
（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、ヘテロデラ
種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）、及びメロイド
ジン種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）が含まれ
る。
（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、ヘテロデラ
種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）、及びメロイド
ジン種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）が含まれ
る。
【００４３】有害微生物には特に以下の植物病原菌が含
まれる：ネコブカビ類（Plasmodiophoromycetes)、卵菌
類（Oomycetes）、ツボカビ類（Chytridiomycetes）、
接合菌類（Zygomycetes）、子嚢菌類（Ascomycetes）、
坦子菌類（Basidiomycetes）及び不完全菌類（Deuterom
ycetes)の防除に使用される。
まれる：ネコブカビ類（Plasmodiophoromycetes)、卵菌
類（Oomycetes）、ツボカビ類（Chytridiomycetes）、
接合菌類（Zygomycetes）、子嚢菌類（Ascomycetes）、
坦子菌類（Basidiomycetes）及び不完全菌類（Deuterom
ycetes)の防除に使用される。
【００４４】植物病原菌には特にシュードモナス科（Ps
eudomonadaceae)、リゾビウム科（Rhizobiaceae)、エン
テロバクテリア科（Enterobacteriaceae）、コリネバク
テリウム科（Corynabacteriaceae）、及びストレプトミ
セス科（Streptomycetaceae）が含まれる。
eudomonadaceae)、リゾビウム科（Rhizobiaceae)、エン
テロバクテリア科（Enterobacteriaceae）、コリネバク
テリウム科（Corynabacteriaceae）、及びストレプトミ
セス科（Streptomycetaceae）が含まれる。
【００４５】上記の属名に属する菌・カビ性の病気の原
因となるいくつかの微生物を例として挙げるが、これら
に限定するものではない：キサントモナス（Xanthomona
s）種、例えばキサントモナス カンペスツリス（Xanth
omonas campestris) pv. オリザエ（oryzae）；シュー
ドモナス（Pseudomonas）種、例えばシュードモナス
シリンガエ（Pseudomonas syringae）pv. ラクリマン
ス（lachrymans）；エルウィニア（Erwinia）種、例え
ばエルウィニア アミロボラ（Erwinia amylovora）；
ピチウム（Pythium)種、例えばピチウム ウルチマム
（Pythium ultimum)；フィトフトラ(Phytophthora）
種、例えばフィトフトラ インフェスタンス(Phytophto
ra infestans）；シュードペロノスポラ(Pseudoperonos
pora）種、例えばシュードペロノスポラヒュミリ(Pseud
operonospora humili)又はシュードペロノスポラ クベ
ンシス(Pseudoperonospora cubensis）；プラスモパラ
(Plasmopara）種、例えばプラスモパラ ヴィチコラ(Pl
asmopara viticola）；ペロノスポラ(Peronospora）
種、例えばペロノスポラ ピシ(Peronospora pisi）又
はＰ．ブラシカエ(P.brassicae）；エリシフェ(Erysiph
e）種、例えばエリシフェ グラミニス(Erysiphe grami
nis）；スフェロテカ(Sphaerotheca）種、例えばスフェ
ロテカ フリギネア(Sphaerotheca fuliginea）；ポド
スフェラ(Podosphaera）種、例えばポドスフェラ ロイ
コトリチャ(Podosphaera leucotricha）；ヴェンチュリ
ア(Venturia）、例えばヴェンチュリア インエクアリ
ス(Venturiainaequalis）；ピレノフォラ(Pyrenophor
a）種、例えばピレノフォラ テレス(Pyrenophora tere
s）又はＰ．グラミネア(P.graminea）（コニディア（Co
nidia)型：ドレチュスレラ(drechslera)、syn:ヘルミン
トスポリウム(Helminthosporium)）；ウロミセス(Uromy
ces）種、例えばウロミセス アペンディクラツス(Urom
yces appendiculatus）；プクシニア(Puccinia）種、例
えばプクシニア レコンディタ(Puccinia recondit
a）；チレチア(Tilletia）種、例えばチレチア カリエ
ス(Tilletia caries）；ウスチラゴ(Ustilago）種、例
えばウスチラゴ ヌダ(Ustilago nuda）又はウスチラゴ
アヴェナエ(Ustilago avenae）；ペリクラリア(Pelli
cularia）種、例えばペリクラリア ササキイ(Pellicul
ariasasakii）；ピリクラリア(Pyricularia）種、例え
ばピリクラリアオリザエ(Pyricularia oryzae）；フサ
リウム(Fusarium）種、例えばフサリウム クルモルム
(Fusarium culmorum）；ハイイロカビ(Botrytis）種、
例えばボツリチス シネレア(Botrytis cinerea）；セ
プトリア(Septoria）種、例えばセプトリア ノドルム(S
eptorianodorum）；レプトスフェリア(Leptosphaeria）
種、例えばレプトスフェリア ノドルム(Leptosphaeria
nodorum）；セルコスポラ(Cercospora）種、例えばセ
ルコスポラ カネッセンス(Cercosporacanescens）；ア
ルテルナリア(Alternaria）種、例えばアルテルナリア
ブラシカエ(Alternaria brassicae）及びシュードセ
ルコスポレラ(Pseudocercosporella）種、例えばシュー
ドセルコスポレラ ヘルポトリポイデス(Pseudocerco s
porellaherpotrichoides）。ヘルミントスポリウムカル
ボヌム（Helmithosporium carbonum）も挙げることがで
きる。
因となるいくつかの微生物を例として挙げるが、これら
に限定するものではない：キサントモナス（Xanthomona
s）種、例えばキサントモナス カンペスツリス（Xanth
omonas campestris) pv. オリザエ（oryzae）；シュー
ドモナス（Pseudomonas）種、例えばシュードモナス
シリンガエ（Pseudomonas syringae）pv. ラクリマン
ス（lachrymans）；エルウィニア（Erwinia）種、例え
ばエルウィニア アミロボラ（Erwinia amylovora）；
ピチウム（Pythium)種、例えばピチウム ウルチマム
（Pythium ultimum)；フィトフトラ(Phytophthora）
種、例えばフィトフトラ インフェスタンス(Phytophto
ra infestans）；シュードペロノスポラ(Pseudoperonos
pora）種、例えばシュードペロノスポラヒュミリ(Pseud
operonospora humili)又はシュードペロノスポラ クベ
ンシス(Pseudoperonospora cubensis）；プラスモパラ
(Plasmopara）種、例えばプラスモパラ ヴィチコラ(Pl
asmopara viticola）；ペロノスポラ(Peronospora）
種、例えばペロノスポラ ピシ(Peronospora pisi）又
はＰ．ブラシカエ(P.brassicae）；エリシフェ(Erysiph
e）種、例えばエリシフェ グラミニス(Erysiphe grami
nis）；スフェロテカ(Sphaerotheca）種、例えばスフェ
ロテカ フリギネア(Sphaerotheca fuliginea）；ポド
スフェラ(Podosphaera）種、例えばポドスフェラ ロイ
コトリチャ(Podosphaera leucotricha）；ヴェンチュリ
ア(Venturia）、例えばヴェンチュリア インエクアリ
ス(Venturiainaequalis）；ピレノフォラ(Pyrenophor
a）種、例えばピレノフォラ テレス(Pyrenophora tere
s）又はＰ．グラミネア(P.graminea）（コニディア（Co
nidia)型：ドレチュスレラ(drechslera)、syn:ヘルミン
トスポリウム(Helminthosporium)）；ウロミセス(Uromy
ces）種、例えばウロミセス アペンディクラツス(Urom
yces appendiculatus）；プクシニア(Puccinia）種、例
えばプクシニア レコンディタ(Puccinia recondit
a）；チレチア(Tilletia）種、例えばチレチア カリエ
ス(Tilletia caries）；ウスチラゴ(Ustilago）種、例
えばウスチラゴ ヌダ(Ustilago nuda）又はウスチラゴ
アヴェナエ(Ustilago avenae）；ペリクラリア(Pelli
cularia）種、例えばペリクラリア ササキイ(Pellicul
ariasasakii）；ピリクラリア(Pyricularia）種、例え
ばピリクラリアオリザエ(Pyricularia oryzae）；フサ
リウム(Fusarium）種、例えばフサリウム クルモルム
(Fusarium culmorum）；ハイイロカビ(Botrytis）種、
例えばボツリチス シネレア(Botrytis cinerea）；セ
プトリア(Septoria）種、例えばセプトリア ノドルム(S
eptorianodorum）；レプトスフェリア(Leptosphaeria）
種、例えばレプトスフェリア ノドルム(Leptosphaeria
nodorum）；セルコスポラ(Cercospora）種、例えばセ
ルコスポラ カネッセンス(Cercosporacanescens）；ア
ルテルナリア(Alternaria）種、例えばアルテルナリア
ブラシカエ(Alternaria brassicae）及びシュードセ
ルコスポレラ(Pseudocercosporella）種、例えばシュー
ドセルコスポレラ ヘルポトリポイデス(Pseudocerco s
porellaherpotrichoides）。ヘルミントスポリウムカル
ボヌム（Helmithosporium carbonum）も挙げることがで
きる。
【００４６】本発明の耐性遺伝子（又は遺伝子ユニッ
ト）を挿入する（形質転換）ことにより上記の有害生物
（ｐｅｓｔ）に対する耐性を与えることができる、又は
耐性を増加させることができる植物には、実際すべての
植物が含まれる。耐性を備える必要があるのは当然森林
植物などの作物植物、例えばもみ、とうひ、ドーグラス
もみ、松、からまつ、ぶな、及びオーク、ならびに食物
や材料を与える植物、例えば穀類（特に小麦、ライ麦、
大麦、からす麦、きび、米、及びとうもろこし）、じゃ
がいも、パルスなどのまめ類、及び特にアルファルフ
ァ、大豆、野菜（特にキャベツ、及びトマト）、果物
（特にりんご、なし、チェリー、ぶどう、柑橘類、パイ
ナップル、及びバナナ）、油やし、お茶の木、ココアの
木、及びコーヒーの木、タバコ、サイザル、及び綿、な
らびに薬用植物、例えばインドジャボク、及びジギタリ
スである。特に好ましいものとして挙げることができる
作物植物はじゃがいも、トマト、ぶどうの木、及び豆で
ある。本発明の耐性遺伝子を植物のゲノム中に”外部”
ＤＮＡの形態で挿入するのが好ましい。
ト）を挿入する（形質転換）ことにより上記の有害生物
（ｐｅｓｔ）に対する耐性を与えることができる、又は
耐性を増加させることができる植物には、実際すべての
植物が含まれる。耐性を備える必要があるのは当然森林
植物などの作物植物、例えばもみ、とうひ、ドーグラス
もみ、松、からまつ、ぶな、及びオーク、ならびに食物
や材料を与える植物、例えば穀類（特に小麦、ライ麦、
大麦、からす麦、きび、米、及びとうもろこし）、じゃ
がいも、パルスなどのまめ類、及び特にアルファルフ
ァ、大豆、野菜（特にキャベツ、及びトマト）、果物
（特にりんご、なし、チェリー、ぶどう、柑橘類、パイ
ナップル、及びバナナ）、油やし、お茶の木、ココアの
木、及びコーヒーの木、タバコ、サイザル、及び綿、な
らびに薬用植物、例えばインドジャボク、及びジギタリ
スである。特に好ましいものとして挙げることができる
作物植物はじゃがいも、トマト、ぶどうの木、及び豆で
ある。本発明の耐性遺伝子を植物のゲノム中に”外部”
ＤＮＡの形態で挿入するのが好ましい。
【００４７】すでに述べた通り、本発明の耐性遺伝子
（又は遺伝子ユニット）の１個又はそれ以上の複写を自
然の植物のゲノム中に、（ゲノムの同一、又は異なる部
位に）、好ましくは核ゲノム中に挿入する。異なる耐性
遺伝子を互いに組み合わせることもできる。
（又は遺伝子ユニット）の１個又はそれ以上の複写を自
然の植物のゲノム中に、（ゲノムの同一、又は異なる部
位に）、好ましくは核ゲノム中に挿入する。異なる耐性
遺伝子を互いに組み合わせることもできる。
【００４８】すでに本発明の耐性遺伝子を持つ植物の場
合、１個又はそれ以上の本発明の耐性遺伝子を挿入する
と、非常に耐性が増加した挙動を示す。場合によっては
本発明の構造遺伝子のみを使用し、それぞれの植物から
単離した制限ＤＮＡ要素の上流への挿入も可能である。
合、１個又はそれ以上の本発明の耐性遺伝子を挿入する
と、非常に耐性が増加した挙動を示す。場合によっては
本発明の構造遺伝子のみを使用し、それぞれの植物から
単離した制限ＤＮＡ要素の上流への挿入も可能である。
【００４９】本発明の形質転換植物細胞、及び植物の増
加した耐性は、農業及び森林経営、装飾用樹木及び薬用
植物の栽培、及び植物の繁殖に重要である。
加した耐性は、農業及び森林経営、装飾用樹木及び薬用
植物の栽培、及び植物の繁殖に重要である。
【００５０】従って本発明は有害生物（ｐｅｓｔ）に対
する耐性の増加したトランスジェニック植物細胞（原形
質体を含む）、及び植物（植物の一部、又は種子を含
む）の製造法において、（ａ）本発明の１種類かそれ以
上の耐性遺伝子（又は遺伝子ユニット）、及び／又は耐
性遺伝子（又は遺伝子ユニット）の一部、及び／又は本
発明に従って修正した組み替えＤＮＡを植物細胞（原形
質体を含む）のゲノムに挿入し、場合によっては（ｂ）
有害生物（ｐｅｓｔ）に対する耐性の増加した形質転換
植物細胞（原形質体を含む）から完全なトランスジェニ
ック植物を再生し、場合によっては（ｃ）得られる親世
代、又はそこから誘導した下位世代のトランスジェニッ
ク植物から、植物の所望の部分（種子を含む）を得るこ
とを特徴とする方法にも関する。
する耐性の増加したトランスジェニック植物細胞（原形
質体を含む）、及び植物（植物の一部、又は種子を含
む）の製造法において、（ａ）本発明の１種類かそれ以
上の耐性遺伝子（又は遺伝子ユニット）、及び／又は耐
性遺伝子（又は遺伝子ユニット）の一部、及び／又は本
発明に従って修正した組み替えＤＮＡを植物細胞（原形
質体を含む）のゲノムに挿入し、場合によっては（ｂ）
有害生物（ｐｅｓｔ）に対する耐性の増加した形質転換
植物細胞（原形質体を含む）から完全なトランスジェニ
ック植物を再生し、場合によっては（ｃ）得られる親世
代、又はそこから誘導した下位世代のトランスジェニッ
ク植物から、植物の所望の部分（種子を含む）を得るこ
とを特徴とする方法にも関する。
【００５１】段階（ａ），（ｂ）及び（ｃ）は周知の方
法により通常のやり方で行うことができる。
法により通常のやり方で行うことができる。
【００５２】本発明による１個又はそれ以上の耐性遺伝
子（又は遺伝子ユニット）、及び／又は耐性遺伝子（又
は遺伝子ユニット）の一部を、”外部”又は”付加”Ｄ
ＮＡとして含むトランスジェニック植物細胞（原形質体
を含む）、及び植物（植物の一部、及び種子を含む）、
ならびに上記方法により得ることができるこれらのトラ
ンスジェニック植物細胞、及び植物は同様に本発明の一
部である。
子（又は遺伝子ユニット）、及び／又は耐性遺伝子（又
は遺伝子ユニット）の一部を、”外部”又は”付加”Ｄ
ＮＡとして含むトランスジェニック植物細胞（原形質体
を含む）、及び植物（植物の一部、及び種子を含む）、
ならびに上記方法により得ることができるこれらのトラ
ンスジェニック植物細胞、及び植物は同様に本発明の一
部である。
【００５３】以下も本発明の一部である： （ａ）トランスジェニック植物細胞（原形質体を含
む）、及び植物（植物の一部、及び種子を含む）の製造
における、本発明の耐性遺伝子（遺伝子ユニット）、及
び／又はその一部、及び／又は本発明に従って修正した
ＤＮＡ、及び／又は本発明のベクター、及び／又は本発
明に従って形質転換した微生物の利用、ならびに（ｂ）
増殖物質の製造、及び新規トランスジェニック植物なら
びにその増殖物質の製造における本発明のトランスジェ
ニック植物細胞（原形質体を含む）、及び植物（植物の
一部、及び種子を含む）の利用、及び一般に（ｃ）有害
生物（ｐｅｓｔ）の防除における、トランスジェニック
植物中の本発明の耐性遺伝子（遺伝子ユニット）、及び
／又はその一部、及び／又は本発明に従って修正したＤ
ＮＡの利用。
む）、及び植物（植物の一部、及び種子を含む）の製造
における、本発明の耐性遺伝子（遺伝子ユニット）、及
び／又はその一部、及び／又は本発明に従って修正した
ＤＮＡ、及び／又は本発明のベクター、及び／又は本発
明に従って形質転換した微生物の利用、ならびに（ｂ）
増殖物質の製造、及び新規トランスジェニック植物なら
びにその増殖物質の製造における本発明のトランスジェ
ニック植物細胞（原形質体を含む）、及び植物（植物の
一部、及び種子を含む）の利用、及び一般に（ｃ）有害
生物（ｐｅｓｔ）の防除における、トランスジェニック
植物中の本発明の耐性遺伝子（遺伝子ユニット）、及び
／又はその一部、及び／又は本発明に従って修正したＤ
ＮＡの利用。
【００５４】耐性遺伝子、又は遺伝子ユニット、あるい
はその一部を”外部”又は”付加”ＤＮＡとして植物、
又は植物細胞の遺伝物質に挿入するための数多くの種々
の方法がある。遺伝子トランスファーは一般的に通常の
周知の方法で行うことができ、同業者にはそれぞれの場
合に適した方法を容易に決定することができる。
はその一部を”外部”又は”付加”ＤＮＡとして植物、
又は植物細胞の遺伝物質に挿入するための数多くの種々
の方法がある。遺伝子トランスファーは一般的に通常の
周知の方法で行うことができ、同業者にはそれぞれの場
合に適した方法を容易に決定することができる。
【００５５】多くの種で使用することができ、双子葉、
及び単子葉植物、好ましくは双子葉植物のゲノムに外部
ＤＮＡを移すために得られる特に好ましいベクターはア
グロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラス
ミドである。耐性遺伝子、又はその一部を適したＴｉプ
ラスミドのＴ−ＤＮＡに導入し（例えばＺａｍｂｒｙｓ
ｋｉ等、１９８３）、植物に感染させる、又は植物の一
部、あるいは葉、穂軸、胚軸、子葉、分裂組織、及びこ
れらから誘導した組織、例えば二次胚、及びカルスなど
の植物組織に感染させる、又はアグロバクテリウム ツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）を用いて原形質体を共培養することに
より転換する。 別法は、所望の遺伝子を含む精製ＤＮ
Ａの、ポリカチオン、又はカルシウム塩、及びポリエチ
レングリコールの存在下における植物原形質体中での培
養である（例えばＨａｉｎ等、１９８５；Ｋｒｅｎｓ
等、１９８２；、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ等、１９８
４）。
及び単子葉植物、好ましくは双子葉植物のゲノムに外部
ＤＮＡを移すために得られる特に好ましいベクターはア
グロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラス
ミドである。耐性遺伝子、又はその一部を適したＴｉプ
ラスミドのＴ−ＤＮＡに導入し（例えばＺａｍｂｒｙｓ
ｋｉ等、１９８３）、植物に感染させる、又は植物の一
部、あるいは葉、穂軸、胚軸、子葉、分裂組織、及びこ
れらから誘導した組織、例えば二次胚、及びカルスなど
の植物組織に感染させる、又はアグロバクテリウム ツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）を用いて原形質体を共培養することに
より転換する。 別法は、所望の遺伝子を含む精製ＤＮ
Ａの、ポリカチオン、又はカルシウム塩、及びポリエチ
レングリコールの存在下における植物原形質体中での培
養である（例えばＨａｉｎ等、１９８５；Ｋｒｅｎｓ
等、１９８２；、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ等、１９８
４）。
【００５６】ＤＮＡ吸収は電場によりさらに増加する
（エレクトロポレーション）（例えばＦｒｏｍｍ等、１
９８６）。
（エレクトロポレーション）（例えばＦｒｏｍｍ等、１
９８６）。
【００５７】ＤＮＡは又、植物の花粉を用いた周知の方
法で、ＤＮＡを持ち物理的に加速した粒子を用いて花粉
を”衝撃”することにより挿入することができる（ＥＰ
−Ａ０，２７０，３５６参照）。
法で、ＤＮＡを持ち物理的に加速した粒子を用いて花粉
を”衝撃”することにより挿入することができる（ＥＰ
−Ａ０，２７０，３５６参照）。
【００５８】植物は適した栄養培地を用いて周知の方法
で再生することができる（例えばＮａｇｙ及びＭａｌｉ
ｇａ、１９７６）。
で再生することができる（例えばＮａｇｙ及びＭａｌｉ
ｇａ、１９７６）。
【００５９】本発明の方法の好ましい具体化において
（ＥＰ−Ａ １１６，７１８に記載の方法に従い）、本
発明の遺伝子、又は遺伝子ユニットを適した大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）中間ベクター、例えばｐＧＶ７００、
又はｐＧＶ７１０（ＥＰ−Ａ−１１６，７１８；Ｄｅｂ
ｌａｅｒｅ等、１９８６参照）、あるいは好ましくはさ
らに例えばｎｐｔＩＩ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌ
ｌａ等、１９８３）、又はｈｐｔ（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅ
ｌｚｅｎ等、１９８６）などのリポーター遺伝子を含む
その誘導体にクローニングする。
（ＥＰ−Ａ １１６，７１８に記載の方法に従い）、本
発明の遺伝子、又は遺伝子ユニットを適した大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）中間ベクター、例えばｐＧＶ７００、
又はｐＧＶ７１０（ＥＰ−Ａ−１１６，７１８；Ｄｅｂ
ｌａｅｒｅ等、１９８６参照）、あるいは好ましくはさ
らに例えばｎｐｔＩＩ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌ
ｌａ等、１９８３）、又はｈｐｔ（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅ
ｌｚｅｎ等、１９８６）などのリポーター遺伝子を含む
その誘導体にクローニングする。
【００６０】容易に単離できる状態でベクターｐＧＶ７
１０を含む大腸菌株ＡＺ４はＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅ
ａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉ
ｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅｓの規則と一致し、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａ
ｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ
［Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］（ＤＳＭ）、Ｇｒｉｓｅｂａ
ｃｈｓｔｒａβｅ ８，Ｄ−３４００ Ｇｏｅｔｔｉｎ
ｇｅｎ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇ
ｅｒｍａｎｙに預託され、預託番号はＤＳＭ３１６４で
ある。上記構築物のプラスミドを、例えばｐＧＶ３８５
０を含むアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、又
はその誘導体（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ等、１９８３）に通
常の方法を用いて転換する（例えばＶａｎ Ｈａｕｔｅ
等、１９８３）。別法として耐性遺伝子ユニットをバイ
ナリーベクターにクローニングし（例えばＫｏｎｃｚ及
びＳｃｈｅｌｌ、１９８６）、それを上記の適したアグ
ロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に転換すること
もできる（Ｋｏｎｃｚ及びＳｃｈｅｌｌ、１９８６）。
植物に転換することができる状態で耐性遺伝子ユニット
を含む、得られたアグロバクテリウム株は続いて植物の
形質転換に使用する。
１０を含む大腸菌株ＡＺ４はＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅ
ａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉ
ｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅｓの規則と一致し、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａ
ｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ
［Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］（ＤＳＭ）、Ｇｒｉｓｅｂａ
ｃｈｓｔｒａβｅ ８，Ｄ−３４００ Ｇｏｅｔｔｉｎ
ｇｅｎ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇ
ｅｒｍａｎｙに預託され、預託番号はＤＳＭ３１６４で
ある。上記構築物のプラスミドを、例えばｐＧＶ３８５
０を含むアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、又
はその誘導体（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ等、１９８３）に通
常の方法を用いて転換する（例えばＶａｎ Ｈａｕｔｅ
等、１９８３）。別法として耐性遺伝子ユニットをバイ
ナリーベクターにクローニングし（例えばＫｏｎｃｚ及
びＳｃｈｅｌｌ、１９８６）、それを上記の適したアグ
ロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に転換すること
もできる（Ｋｏｎｃｚ及びＳｃｈｅｌｌ、１９８６）。
植物に転換することができる状態で耐性遺伝子ユニット
を含む、得られたアグロバクテリウム株は続いて植物の
形質転換に使用する。
【００６１】さらに好ましい具体化において、耐性遺伝
子をもつ適したプラスミドを、場合によっては植物細胞
のためのリポーター遺伝子、例えばカナマイシン耐性
（例えばＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ等、１９８
３）又はヒドロマイシン耐性（ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｚ
ｅｎ、１９８６）、好ましくはｐＬＧＶネオ２１０３
（Ｈａｉｎ等、１９８５）、ｐＬＧＶ２３ネオ（Ｈｅｒ
ｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、１９８３）、ｐＭＯＮ１
２９（Ｆｒｙｌｅｙ Ｒ．Ｔ．等、（１９８３））、ｐ
ＡＫ１００３、ｐＡＫ２００４（Ｖｅｌｔｅｎ Ｊ．
等、（１９８４））、又はｐＧＳＳＴネオ３（ｐＧＳＳ
Ｔ３）（ＥＰ−Ａ−１８９，７０７）を含む他のプラス
ミドと共に、直接遺伝子転換（例えばＨａｉｎ等、１９
８５）により通常の方法で植物原形質体に移す。この場
合プラスミドは環状で存在することができるが、直線状
であることが好ましい。リポーター遺伝子をもつプラス
ミドを使用する場合、耐性因子の発現に関してカナマイ
シン原形質体を調べる。他の場合（リポーター遺伝子の
ない場合）、得られたカルスを耐性遺伝子の発現に関し
て調べる（通常の方法によるスクリーニング）。
子をもつ適したプラスミドを、場合によっては植物細胞
のためのリポーター遺伝子、例えばカナマイシン耐性
（例えばＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ等、１９８
３）又はヒドロマイシン耐性（ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｚ
ｅｎ、１９８６）、好ましくはｐＬＧＶネオ２１０３
（Ｈａｉｎ等、１９８５）、ｐＬＧＶ２３ネオ（Ｈｅｒ
ｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、１９８３）、ｐＭＯＮ１
２９（Ｆｒｙｌｅｙ Ｒ．Ｔ．等、（１９８３））、ｐ
ＡＫ１００３、ｐＡＫ２００４（Ｖｅｌｔｅｎ Ｊ．
等、（１９８４））、又はｐＧＳＳＴネオ３（ｐＧＳＳ
Ｔ３）（ＥＰ−Ａ−１８９，７０７）を含む他のプラス
ミドと共に、直接遺伝子転換（例えばＨａｉｎ等、１９
８５）により通常の方法で植物原形質体に移す。この場
合プラスミドは環状で存在することができるが、直線状
であることが好ましい。リポーター遺伝子をもつプラス
ミドを使用する場合、耐性因子の発現に関してカナマイ
シン原形質体を調べる。他の場合（リポーター遺伝子の
ない場合）、得られたカルスを耐性遺伝子の発現に関し
て調べる（通常の方法によるスクリーニング）。
【００６２】形質転換（トランスジェニック）植物、又
は植物細胞は周知の方法、例えばリーフディスク形質転
換（例えばＨｏｒｓｃｈ等、１９８５）により、再生植
物原形質体、又は培養細胞の、アグロバクテリウム ツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）との共培養により（例えばＭａｒｔ
ｏｎ等、１９７９、Ｈａｉｎ等、１９８５）、又は直接
ＤＮＡトランスフェクションにより製造することができ
る。得られた形質転換植物はリポーター遺伝子発現に関
する選択、例えばカナマイシンサルフェートのインビト
ロ ホスホリル化により（Ｒｅｉｓ等、１９８４；Ｓｃ
ｈｒｅｉｅｒ等、１９８５）、又はノパリン シンター
ゼの発現により（Ａｅｒｔｓ等、１９８３の方法によ
り）検出することができる。
は植物細胞は周知の方法、例えばリーフディスク形質転
換（例えばＨｏｒｓｃｈ等、１９８５）により、再生植
物原形質体、又は培養細胞の、アグロバクテリウム ツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）との共培養により（例えばＭａｒｔ
ｏｎ等、１９７９、Ｈａｉｎ等、１９８５）、又は直接
ＤＮＡトランスフェクションにより製造することができ
る。得られた形質転換植物はリポーター遺伝子発現に関
する選択、例えばカナマイシンサルフェートのインビト
ロ ホスホリル化により（Ｒｅｉｓ等、１９８４；Ｓｃ
ｈｒｅｉｅｒ等、１９８５）、又はノパリン シンター
ゼの発現により（Ａｅｒｔｓ等、１９８３の方法によ
り）検出することができる。
【００６３】耐性因子、例えばキチナーゼは特定の抗体
を用いて周知の方法で形質転換植物中に検出することが
できる。
を用いて周知の方法で形質転換植物中に検出することが
できる。
【００６４】それぞれの場合に適した栄養培地を用い
て、一般的に通常の方法で形質転換植物細胞を培養し、
再生し、完全な植物とすることができる。
て、一般的に通常の方法で形質転換植物細胞を培養し、
再生し、完全な植物とすることができる。
【００６５】本発明の耐性遺伝子、又は遺伝子ユニット
を含み、本発明の一部であるトランスジェニック植物細
胞、ならびにトランスジェニック植物はすべて有害生物
（ｐｅｓｔ）、特に植物病原体に対して耐性が非常に増
加している。
を含み、本発明の一部であるトランスジェニック植物細
胞、ならびにトランスジェニック植物はすべて有害生物
（ｐｅｓｔ）、特に植物病原体に対して耐性が非常に増
加している。
【００６６】本発明に関して、”植物”という言葉は完
全な植物、ならびに植物の一部、例えば葉、種子、塊
茎、挿木などを表す。”植物細胞”は原形質体、細胞
系、植物カルスなどを含む。”増殖物質”はトランスジ
ェニック植物、及び植物細胞の増殖に使用することがで
きる（上記で定義した）植物、及び（上記で定義した）
植物細胞を示す。本発明によるトランスジェニック植物
の増殖物質も本発明の一部である。
全な植物、ならびに植物の一部、例えば葉、種子、塊
茎、挿木などを表す。”植物細胞”は原形質体、細胞
系、植物カルスなどを含む。”増殖物質”はトランスジ
ェニック植物、及び植物細胞の増殖に使用することがで
きる（上記で定義した）植物、及び（上記で定義した）
植物細胞を示す。本発明によるトランスジェニック植物
の増殖物質も本発明の一部である。
【００６７】本発明は”基本的に同様に作用するＤＮＡ
配列”を含む遺伝子、遺伝子の一部、ならびにＤＮＡ配
列も含む。遺伝子、遺伝子の一部、及びＤＮＡ配列はゲ
ノムの状態で存在することができ、例えばイントロンの
ような非コード部分も含むことができる。又完全に、あ
るいは一部化学的に合成した形態で存在することもでき
る。
配列”を含む遺伝子、遺伝子の一部、ならびにＤＮＡ配
列も含む。遺伝子、遺伝子の一部、及びＤＮＡ配列はゲ
ノムの状態で存在することができ、例えばイントロンの
ような非コード部分も含むことができる。又完全に、あ
るいは一部化学的に合成した形態で存在することもでき
る。
【００６８】本発明の場合”基本的に同様に作用するＤ
ＮＡ配列”という言葉は、耐性遺伝子、又はその一部の
機能が耐性因子が形成されない、又は制限遺伝子部分が
有効でないような制限を受けていなければ、その修正も
本発明が含むことを意味する。本発明のｃＤＮＡの場
合、”基本的に同様に作用するＤＮＡ配列”は、本発明
の遺伝子の位置探索のプローブとしてのｃＤＮＡの本発
明による使用を重要に損なわない修正を意味する。問題
の修正はＤＮＡの一部、又は個々のコドン、及び／又は
個々の核酸の置換、付加、及び／又は除去により行うこ
とができる。
ＮＡ配列”という言葉は、耐性遺伝子、又はその一部の
機能が耐性因子が形成されない、又は制限遺伝子部分が
有効でないような制限を受けていなければ、その修正も
本発明が含むことを意味する。本発明のｃＤＮＡの場
合、”基本的に同様に作用するＤＮＡ配列”は、本発明
の遺伝子の位置探索のプローブとしてのｃＤＮＡの本発
明による使用を重要に損なわない修正を意味する。問題
の修正はＤＮＡの一部、又は個々のコドン、及び／又は
個々の核酸の置換、付加、及び／又は除去により行うこ
とができる。
【００６９】本発明に従い使用することができる微生物
の場合、”変異株”は本発明を行うために重要な特徴を
まだ示す、特に問題のプラスミドを含む修正微生物を意
味する。
の場合、”変異株”は本発明を行うために重要な特徴を
まだ示す、特に問題のプラスミドを含む修正微生物を意
味する。
【００７０】以下の実施具体化例を用いて本発明をより
詳細に説明する：
詳細に説明する：
【００７１】
【実施例】１．アラキス ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏ
ｇａｅａ）からの耐性遺伝子の単離 アラキス ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａ
ｅａ）懸濁細胞系（Ｒｏｌｆｓ等、１９８１）からデオ
キシリボ核酸ＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアー
ゼ、好ましくは酵素ＨｉｎｄＩＩＩ又はＭｂｏＩを用い
て、それぞれの場合に１アリコートを切断する。ＤＮＡ
をそのフラグメントの大きさに従い、沈降遠心、又はゲ
ル電気泳動を用いて分離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，１９８９、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ＵＳ
Ａ）。遠心の場合、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ中で３０−
１０％に変化させてあらかじめ形成したｐＨ７．５の酢
酸カリウム溶液上でフラグメントを分離する。フラグメ
ントの拡散をできるだけ抑制するためにできる限り高速
の分取超遠心で行う。それぞれの場合、変化させた≦１
００μｌの容積（変化容積は約１３ｍｌ）中で１００μ
ｇ以下の分裂ＤＮＡが分離される。遠心の後に選ぶフラ
クションの大きさは分解能に依存して選ぶ（例えば２０
０μｌ）。最高約１０ｋｂ（ＨｉｎｄＩＩＩ）、又は１
０−２０ｋｂ（ＭｂｏＩ）の大きさのフラグメントを含
むフラクションをラムダ ベクター（ラムダ ＺＡＰ
ＩＩ、又はラムダ ＦＩＸ ＩＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）にクローニングす
る。
ｇａｅａ）からの耐性遺伝子の単離 アラキス ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａ
ｅａ）懸濁細胞系（Ｒｏｌｆｓ等、１９８１）からデオ
キシリボ核酸ＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアー
ゼ、好ましくは酵素ＨｉｎｄＩＩＩ又はＭｂｏＩを用い
て、それぞれの場合に１アリコートを切断する。ＤＮＡ
をそのフラグメントの大きさに従い、沈降遠心、又はゲ
ル電気泳動を用いて分離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，１９８９、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ＵＳ
Ａ）。遠心の場合、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ中で３０−
１０％に変化させてあらかじめ形成したｐＨ７．５の酢
酸カリウム溶液上でフラグメントを分離する。フラグメ
ントの拡散をできるだけ抑制するためにできる限り高速
の分取超遠心で行う。それぞれの場合、変化させた≦１
００μｌの容積（変化容積は約１３ｍｌ）中で１００μ
ｇ以下の分裂ＤＮＡが分離される。遠心の後に選ぶフラ
クションの大きさは分解能に依存して選ぶ（例えば２０
０μｌ）。最高約１０ｋｂ（ＨｉｎｄＩＩＩ）、又は１
０−２０ｋｂ（ＭｂｏＩ）の大きさのフラグメントを含
むフラクションをラムダ ベクター（ラムダ ＺＡＰ
ＩＩ、又はラムダ ＦＩＸ ＩＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）にクローニングす
る。
【００７２】ラムダ ＺＡＰ ＩＩ へのＨｉｎｄＩＩ
Ｉフラグメントのクローニングは部分的遺伝子ライブラ
リの確立を例として説明することができる。商業的に入
手できるベクターをＳｐｅＩを用いて消化し、その形
態： Ａ ＡＣＴ ＴＧＡＴＣ をＣ及びＴを用いた部分的フィリングイン
によりＴＧＡＴＣ に変換し、クローニングをするフラ
グメントのＨｉｎｄＩＩＩ末端に同様の処理を行い、す
なわち： Ａ ＡＡＧ ＴＴＣＧＡ をＡ及びＧを用いてＴＴＣＧＡに変換す
る。
Ｉフラグメントのクローニングは部分的遺伝子ライブラ
リの確立を例として説明することができる。商業的に入
手できるベクターをＳｐｅＩを用いて消化し、その形
態： Ａ ＡＣＴ ＴＧＡＴＣ をＣ及びＴを用いた部分的フィリングイン
によりＴＧＡＴＣ に変換し、クローニングをするフラ
グメントのＨｉｎｄＩＩＩ末端に同様の処理を行い、す
なわち： Ａ ＡＡＧ ＴＴＣＧＡ をＡ及びＧを用いてＴＴＣＧＡに変換す
る。
【００７３】このようにして起源が異なるにもかかわら
ず通常の方法で互いに結合することのできる末端が形成
される。ベクターラムダ ＺＡＰ ＩＩ にクローニン
グすることができるフラグメントは最高１０ｋｂｐのフ
ラグメントであることが好ましいので、大フラグメント
はここでも区別される。この方法で本発明の意味で耐性
遺伝子を含むピーナッツの遺伝子ライブラリの部分がそ
れぞれの場合に確立される。これらの耐性遺伝子を含む
ベクターをｃＤＮＡプローブを用いて正確に同定し、ｐ
Ｒ３−７にクローニングし、さらに精製することができ
る。耐性遺伝子を含む精製核酸を、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、又は粒子衝撃装置の作用を伴う直接Ｄ
ＮＡ形質転換により、あるいは例えばアグロバクテリア
を用いた他の形質転換法により、タバコ、又は他の植物
に転換する。
ず通常の方法で互いに結合することのできる末端が形成
される。ベクターラムダ ＺＡＰ ＩＩ にクローニン
グすることができるフラグメントは最高１０ｋｂｐのフ
ラグメントであることが好ましいので、大フラグメント
はここでも区別される。この方法で本発明の意味で耐性
遺伝子を含むピーナッツの遺伝子ライブラリの部分がそ
れぞれの場合に確立される。これらの耐性遺伝子を含む
ベクターをｃＤＮＡプローブを用いて正確に同定し、ｐ
Ｒ３−７にクローニングし、さらに精製することができ
る。耐性遺伝子を含む精製核酸を、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、又は粒子衝撃装置の作用を伴う直接Ｄ
ＮＡ形質転換により、あるいは例えばアグロバクテリア
を用いた他の形質転換法により、タバコ、又は他の植物
に転換する。
【００７４】２．タバコの形質転換 ａ）タバコのシュートの培養、及びタバコ原形質体の単
離：ニコチアナ タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａ
ｂａｃｕｍ）（ＰｅｔｉｔＨａｖａｎａ ＳＲ１）をホ
ルモンを含まないＬＳ培地中で無菌シュート培養物とし
て増殖する（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ及びＳｋｏｏｇ、１９
６５）。約６−８週間毎にシュート部分を新しいＬＳ培
地に移す。シュートの培養物は２４−２６℃、１２時間
光照射（１，０００−３，０００ルックス）にて成長室
中に保つ。葉の原形質体の単離のために約２ｇの葉（長
さが約３−５ｃｍ）を新しいかみそりの刃を用いて小片
（０．５ｃｍ ｘ １ｃｍ）に切断する。葉の材料をＫ
３培地（Ｎａｇｙ及びＭａｌｉｇａ １９７６）、０．
４モルのスクロース、ｐＨ５．６、２％のＺｅｌｌｕｌ
ａｓｅ Ｒ１０（Ｓｅｒｖａ）、０．５％のＭａｃｅｒ
ｏｚｙｍ Ｒ１０（Ｓｅｒｖａ）を含む酵素溶液２０ｍ
ｌ中で室温にて１４−１６時間培養する。その後０．３
０ｍｍ、及び０．１ｍｍの鋼のふるい上で濾過して原形
質体を細胞片から分離する。濾液を１００ｘｇにて１０
分間遠心する。この遠心の間、完全な原形質体が酵素溶
液の上端に帯状に浮遊し、集まる。細胞片、及び酵素溶
液から成るペレットをガラスキャピラリーを用いた吸引
により除去する。予備洗浄した原形質体を新しいＫ３培
地（浸透圧として０．４Ｍスクロース）を用いて１０ｍ
ｌとし、再浮遊させる。洗浄培地を吸引により除去し、
培養のために、又は続くアグロバクテリウムを用いた感
染（共培養）のために１−２ｘ１０5／ｍｌに希釈す
る。原形質体の濃度を計数室で決定する。
離：ニコチアナ タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａ
ｂａｃｕｍ）（ＰｅｔｉｔＨａｖａｎａ ＳＲ１）をホ
ルモンを含まないＬＳ培地中で無菌シュート培養物とし
て増殖する（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ及びＳｋｏｏｇ、１９
６５）。約６−８週間毎にシュート部分を新しいＬＳ培
地に移す。シュートの培養物は２４−２６℃、１２時間
光照射（１，０００−３，０００ルックス）にて成長室
中に保つ。葉の原形質体の単離のために約２ｇの葉（長
さが約３−５ｃｍ）を新しいかみそりの刃を用いて小片
（０．５ｃｍ ｘ １ｃｍ）に切断する。葉の材料をＫ
３培地（Ｎａｇｙ及びＭａｌｉｇａ １９７６）、０．
４モルのスクロース、ｐＨ５．６、２％のＺｅｌｌｕｌ
ａｓｅ Ｒ１０（Ｓｅｒｖａ）、０．５％のＭａｃｅｒ
ｏｚｙｍ Ｒ１０（Ｓｅｒｖａ）を含む酵素溶液２０ｍ
ｌ中で室温にて１４−１６時間培養する。その後０．３
０ｍｍ、及び０．１ｍｍの鋼のふるい上で濾過して原形
質体を細胞片から分離する。濾液を１００ｘｇにて１０
分間遠心する。この遠心の間、完全な原形質体が酵素溶
液の上端に帯状に浮遊し、集まる。細胞片、及び酵素溶
液から成るペレットをガラスキャピラリーを用いた吸引
により除去する。予備洗浄した原形質体を新しいＫ３培
地（浸透圧として０．４Ｍスクロース）を用いて１０ｍ
ｌとし、再浮遊させる。洗浄培地を吸引により除去し、
培養のために、又は続くアグロバクテリウムを用いた感
染（共培養）のために１−２ｘ１０5／ｍｌに希釈す
る。原形質体の濃度を計数室で決定する。
【００７５】ｂ）アグロバクテリウム ツメファシエン
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）との共培養による再生タバコ原形質体の形質転
換：以下では、Ｍａｒｔｏｎ等、１９７９の方法を少し
修正して用いる。原形質体を上記のようにして単離し、
Ｋ３培地（０．４モルのスクロース、０．１ｍｇ／ｌの
ＮＡＡ、０．２ｍｇのキネチン）中、２６℃、１−２ｘ
１０5／ｍｌの密度で、暗所で２日間、弱光下（５００
ルックス）で１−２日間培養する。第１の原形質分離が
起きたらすぐにミニマルＡ（Ａｍ）培地中のアグロバク
テリウム懸濁液（密度は約１０9アグロバクテリア／ｍ
ｌ）３０μｌを、３ｍｌの再生原形質体に加える。共培
養は暗所で２０℃にて３−４日間行う。その後タバコの
細胞を１２ｍｌの遠心管にデカンテーションにより入
れ、海水（６００ｍＯｓｍ／ｋｇ）で１０ｍｌに希釈
し、６０ｘｇで１０分間ペレット化する。ほとんどのア
グロバクテリアを除去するためにこの洗浄過程を１回又
は２回繰り返す。細胞懸濁液を１ｍｇ／ｌのＮＡＡ（ナ
フチル−１−酢酸）、０．２ｍｇ／ｌのキネチン、及び
５００ｍｇ／ｌのセファロスポリン−抗体、セフォタク
シムを含むＫ３培地（０．３モルスクロース）中で５Ｘ
１０4／ｍｌの密度で培養する。毎週新しいＫ３培地を
用いて細胞懸濁液を希釈し、１週間当たり０．０５モル
のスクロース（約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ）により培地の浸
透圧を徐々に下げる。アガロース ビーズ型培養におけ
る共培養の２−３週間後にカナマイシン（１００ｍｇ／
ｌのカナマイシンサルフェート（Ｓｉｇｍａ）、６６０
ｍｇ／ｇの活性ｋｍ）を用いた選択を開始する（Ｓｈｉ
ｌｌｉｔｏ等、１９８３）。選択の開始後３−４週間で
カナマイシン−耐性コロニーが発育の遅れたコロニーの
背景から際立ってくる。
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）との共培養による再生タバコ原形質体の形質転
換：以下では、Ｍａｒｔｏｎ等、１９７９の方法を少し
修正して用いる。原形質体を上記のようにして単離し、
Ｋ３培地（０．４モルのスクロース、０．１ｍｇ／ｌの
ＮＡＡ、０．２ｍｇのキネチン）中、２６℃、１−２ｘ
１０5／ｍｌの密度で、暗所で２日間、弱光下（５００
ルックス）で１−２日間培養する。第１の原形質分離が
起きたらすぐにミニマルＡ（Ａｍ）培地中のアグロバク
テリウム懸濁液（密度は約１０9アグロバクテリア／ｍ
ｌ）３０μｌを、３ｍｌの再生原形質体に加える。共培
養は暗所で２０℃にて３−４日間行う。その後タバコの
細胞を１２ｍｌの遠心管にデカンテーションにより入
れ、海水（６００ｍＯｓｍ／ｋｇ）で１０ｍｌに希釈
し、６０ｘｇで１０分間ペレット化する。ほとんどのア
グロバクテリアを除去するためにこの洗浄過程を１回又
は２回繰り返す。細胞懸濁液を１ｍｇ／ｌのＮＡＡ（ナ
フチル−１−酢酸）、０．２ｍｇ／ｌのキネチン、及び
５００ｍｇ／ｌのセファロスポリン−抗体、セフォタク
シムを含むＫ３培地（０．３モルスクロース）中で５Ｘ
１０4／ｍｌの密度で培養する。毎週新しいＫ３培地を
用いて細胞懸濁液を希釈し、１週間当たり０．０５モル
のスクロース（約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ）により培地の浸
透圧を徐々に下げる。アガロース ビーズ型培養におけ
る共培養の２−３週間後にカナマイシン（１００ｍｇ／
ｌのカナマイシンサルフェート（Ｓｉｇｍａ）、６６０
ｍｇ／ｇの活性ｋｍ）を用いた選択を開始する（Ｓｈｉ
ｌｌｉｔｏ等、１９８３）。選択の開始後３−４週間で
カナマイシン−耐性コロニーが発育の遅れたコロニーの
背景から際立ってくる。
【００７６】ｃ）ＤＮＡを用いたタバコ原形質体の直接
形質転換硝酸カルシウム／ＰＥＧ形質転換 ペトリ皿中で、１８０μｌのＫ３培地中の約１０6個の
原形質体を、耐性遺伝子を含むＤＮＡ０．５μｇ／μ
ｌ、及び０．５μｇ／μｌのｐＬＧＶネオ２１０３（Ｈ
ａｉｎ等、１９８５）を含む２０μｌのＤＮＡ水溶液と
注意深く混合する。続いて２００μｌの融合溶液（０．
１モルの硝酸ナトリウム、０．４５Ｍのマンニトール、
２５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００），ｐ
Ｈ９）を注意深く加える。１５分後、５ｍｌの洗浄溶液
（０．２７５Ｍの硝酸ナトリウム、ｐＨ６）を加え、５
分後に原形質体を遠心管に移し、６０ｘｇでペレット化
する。ペレットを少量のＫ３培地に取り上げ、下節に記
載する要領で培養する。別法として、原形質体をＨａｉ
ｎ等，１９８５に記載された要領で形質転換することも
できる。又、０．５μｌ／μｌのｐＬＧＶネオ２１０３
を添加せずに形質転換を行うこともできる。この場合、
リポーター遺伝子が用いられないので、得られたカルス
はドット−ブロットハイブリッド形成を用いて耐性遺伝
子の存在に関して調べることができる。使用することが
できるハイブリッド形成プローブはｐＲ３−７の上記ｃ
ＤＮＡである。もちろん抗体アッセイなどの他の検出法
も使用することができる。
形質転換硝酸カルシウム／ＰＥＧ形質転換 ペトリ皿中で、１８０μｌのＫ３培地中の約１０6個の
原形質体を、耐性遺伝子を含むＤＮＡ０．５μｇ／μ
ｌ、及び０．５μｇ／μｌのｐＬＧＶネオ２１０３（Ｈ
ａｉｎ等、１９８５）を含む２０μｌのＤＮＡ水溶液と
注意深く混合する。続いて２００μｌの融合溶液（０．
１モルの硝酸ナトリウム、０．４５Ｍのマンニトール、
２５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００），ｐ
Ｈ９）を注意深く加える。１５分後、５ｍｌの洗浄溶液
（０．２７５Ｍの硝酸ナトリウム、ｐＨ６）を加え、５
分後に原形質体を遠心管に移し、６０ｘｇでペレット化
する。ペレットを少量のＫ３培地に取り上げ、下節に記
載する要領で培養する。別法として、原形質体をＨａｉ
ｎ等，１９８５に記載された要領で形質転換することも
できる。又、０．５μｌ／μｌのｐＬＧＶネオ２１０３
を添加せずに形質転換を行うこともできる。この場合、
リポーター遺伝子が用いられないので、得られたカルス
はドット−ブロットハイブリッド形成を用いて耐性遺伝
子の存在に関して調べることができる。使用することが
できるハイブリッド形成プローブはｐＲ３−７の上記ｃ
ＤＮＡである。もちろん抗体アッセイなどの他の検出法
も使用することができる。
【００７７】ｄ）ＤＮＡと共に培養した原形質体の培
養、及びカナマイシン−耐性カリの選択 下記の培養、及びカナマイシン−耐性コロニーの選択の
ために、修正”ビーズ−型培養”法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ
等、１９８３）を使用する。原形質体をＤＮＡで処理し
た（ｃを参照）１週間後、３ｍｌの細胞懸濁液を５ｃｍ
のペトリ皿中で３ｍｌのＫ３培地（０．３Ｍのスクロー
ス＋ホルモン；１．２％の（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）ＬＭ
Ｔアガロース（低融点アガロース，Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏ
ｌｌｏｉｄｓ）と混合する。この目的のため、アガロー
スをオートクレーブにより乾燥し、Ｋ３培地を加え、混
合物をマイクロ波の炉中で短時間煮沸する。アガロース
が固化した後、さらに培養、選択のためにアガロース円
板（”ビーズ”）を埋め込んだタバコミクロカルスと共
に１０ｃｍのペトリ皿に移し、１０ｍｌのＫ３培地
（０．３Ｍのスクロース、１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．２
ｍｇ／ｌのキネチン）、及び１００ｍｇ／ｌのカナマイ
シンサルフェート（Ｓｉｇｍａ）のバッチを加える。液
体培地は毎週変える。この過程の間に培地の浸透圧値は
徐々に下げる。
養、及びカナマイシン−耐性カリの選択 下記の培養、及びカナマイシン−耐性コロニーの選択の
ために、修正”ビーズ−型培養”法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ
等、１９８３）を使用する。原形質体をＤＮＡで処理し
た（ｃを参照）１週間後、３ｍｌの細胞懸濁液を５ｃｍ
のペトリ皿中で３ｍｌのＫ３培地（０．３Ｍのスクロー
ス＋ホルモン；１．２％の（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）ＬＭ
Ｔアガロース（低融点アガロース，Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏ
ｌｌｏｉｄｓ）と混合する。この目的のため、アガロー
スをオートクレーブにより乾燥し、Ｋ３培地を加え、混
合物をマイクロ波の炉中で短時間煮沸する。アガロース
が固化した後、さらに培養、選択のためにアガロース円
板（”ビーズ”）を埋め込んだタバコミクロカルスと共
に１０ｃｍのペトリ皿に移し、１０ｍｌのＫ３培地
（０．３Ｍのスクロース、１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．２
ｍｇ／ｌのキネチン）、及び１００ｍｇ／ｌのカナマイ
シンサルフェート（Ｓｉｇｍａ）のバッチを加える。液
体培地は毎週変える。この過程の間に培地の浸透圧値は
徐々に下げる。
【００７８】交換培地（Ｋ３＋ｋｍ）のスクロースを毎
週０．０５モルづつ減少させる（約６０ｍＯｓｍ）。
週０．０５モルづつ減少させる（約６０ｍＯｓｍ）。
【００７９】 ＤＮＡ形質転換後のカナマイシン−耐性タバココロニーのための選択図： ０．４Ｍ ０．３Ｍ ０．２５Ｍ ０．２０Ｍ ０．１５Ｍ ０．１０Ｍ 液体 培地中 のスク ロース Ｕ ＥＳ Ｋ ─────────────────────────────────── １ ２ ３ ４ ５ ６週， ＤＮＡ取 り上げ後 （Ｋ３培地、１ｍｇのＮＡＡ、０．２ｍｇのキネチン） Ｕ＝ＤＮＡ取り上げ Ｅ＝アガロース中への埋め込み Ｓ＝カナマイシン（１００ｍｇ／ｌのカナマイシンサル
フェート）を用いた選択 Ｋ＝カナマイシン−耐性コロニーを背景から明白に見分
けることができる。
フェート）を用いた選択 Ｋ＝カナマイシン−耐性コロニーを背景から明白に見分
けることができる。
【００８０】ｅ）カナマイシン−耐性植物の再生 カナマイシン−耐性コロニーの直径が約０．５ｃｍに達
したらすぐにその半分を再生培地（ＬＳ培地、２％のス
クロース、０．５ｍｇ／ｌのベンズアミノプリンＢＡ
Ｐ）上に置き、培養物を２４℃、１２時間光照射（３，
０００−５，０００ルックス）にて成長室に保つ。他の
半分を１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌのキネチ
ン、０．１ｍｇ／ｌのＢＡＰ、及び１００ｍｇ／ｌのカ
ナマイシンサルフェートを含むＬＳ培地上でカルス培養
物として増殖する。再生シュートが約１ｃｍの大きさに
なった時それを切り取り、根付かせるために成長調節剤
を含まない１／２ＬＳ培地（１％スクロース、０．８％
寒天）上に置く。シュートを１００ｍｇ／ｌのカナマイ
シンサルフェートを含む１／２ＬＳ培地上に根付かせ、
後に土壌中に移植する。
したらすぐにその半分を再生培地（ＬＳ培地、２％のス
クロース、０．５ｍｇ／ｌのベンズアミノプリンＢＡ
Ｐ）上に置き、培養物を２４℃、１２時間光照射（３，
０００−５，０００ルックス）にて成長室に保つ。他の
半分を１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌのキネチ
ン、０．１ｍｇ／ｌのＢＡＰ、及び１００ｍｇ／ｌのカ
ナマイシンサルフェートを含むＬＳ培地上でカルス培養
物として増殖する。再生シュートが約１ｃｍの大きさに
なった時それを切り取り、根付かせるために成長調節剤
を含まない１／２ＬＳ培地（１％スクロース、０．８％
寒天）上に置く。シュートを１００ｍｇ／ｌのカナマイ
シンサルフェートを含む１／２ＬＳ培地上に根付かせ、
後に土壌中に移植する。
【００８１】ｆ）アグロバクテリウム ツメファシエン
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）によるリーフディスクの形質転換 リーフディスクの形質転換のために（Ｈｏｒｓｃｈ等，
１９８５）、無菌のシュート培養物の約２−３ｃｍの長
さの葉を直径が１ｃｍの円板中に穴をあけて差し込み、
適したＡｍ培地（下記参照）中の適したアグロバクテリ
アの懸濁液（約１０9／ｍｌ）（ｂ参照）を用いて円板
を５分間培養する。感染した葉の部分を２４℃にてホル
モンを含まないＭＳ培地（下記参照）上に３−４日間保
つ。この間にアグロバクテリアが成長して葉の部分を覆
う。その後葉の部分をＭＳ培地（０．５ｍｇ／ｌのＢＡ
Ｐ、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ）中で洗浄し、５００μｇ
／ｍｌのセフォタクシム、及び１００μｇ／ｍｌのカナ
マイシンサルフェート（Ｓｉｇｍａ）を含む同様の培地
（０．８％寒天）上に置く。培地は２週間後に新しくし
なければならない。さらに２−３週間後、形質転換シュ
ートが目に見えるようになる。平行して選択圧力なしに
シュートの再生も行わなければならない。その後再生シ
ュートを、例えばノパリン シンターゼ、又は耐性遺伝
子活性に関する生物学的試験により形質転換に関して試
験しなければならない。この方法で１−１０％の形質転
換シュートが得られる。
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）によるリーフディスクの形質転換 リーフディスクの形質転換のために（Ｈｏｒｓｃｈ等，
１９８５）、無菌のシュート培養物の約２−３ｃｍの長
さの葉を直径が１ｃｍの円板中に穴をあけて差し込み、
適したＡｍ培地（下記参照）中の適したアグロバクテリ
アの懸濁液（約１０9／ｍｌ）（ｂ参照）を用いて円板
を５分間培養する。感染した葉の部分を２４℃にてホル
モンを含まないＭＳ培地（下記参照）上に３−４日間保
つ。この間にアグロバクテリアが成長して葉の部分を覆
う。その後葉の部分をＭＳ培地（０．５ｍｇ／ｌのＢＡ
Ｐ、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ）中で洗浄し、５００μｇ
／ｍｌのセフォタクシム、及び１００μｇ／ｍｌのカナ
マイシンサルフェート（Ｓｉｇｍａ）を含む同様の培地
（０．８％寒天）上に置く。培地は２週間後に新しくし
なければならない。さらに２−３週間後、形質転換シュ
ートが目に見えるようになる。平行して選択圧力なしに
シュートの再生も行わなければならない。その後再生シ
ュートを、例えばノパリン シンターゼ、又は耐性遺伝
子活性に関する生物学的試験により形質転換に関して試
験しなければならない。この方法で１−１０％の形質転
換シュートが得られる。
【００８２】ｇ）形質転換の検出のための生化学的方法 植物組織におけるノパリンの検出：ノパリンはＯｔｔｅ
ｎ及びＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ（１９７８）、ならび
にＡｅｒｔｓ等（１９７９）に記載されている通り、以
下のようにして検出する。エッペンドルフ容器中で、５
０ｍｇの植物材料（カルス、又は葉の部分）を０．１Ｍ
のアルギニンを含むＬＳ培地中、室温にて終夜培養す
る。その後植物材料に吸収紙を軽く当て、ガラス棒を用
いて新しいエッペンドルフ遠心容器中で均質化し、ホモ
ジネートをエッペンドルフ遠心機で２分間遠心する。上
澄みの２μｌを電気泳動に適した紙（Ｗｈａｔｍａｎ
３ＭＭ紙）（２０ｘ４０ｃｍ）上に点状で置き、乾燥す
る。紙を可動層（５％蟻酸、１５％酢酸、８０％Ｈ
2Ｏ、ｐＨ１．８）で飽和し、４００Ｖにて電気泳動を
４５分間行う。ノパリンは陰極に移動する。紙を熱空気
流中で乾燥し、フェナントレンキノン染色液（同量のエ
タノール中０．０２％のフェナントレンキノン、及び６
０％エタノール中の１０％ＮａＯＨ）を通して移動の方
向に引く。乾燥した紙は長波長ＵＶ光下で見ることがで
き、写真を撮る。試薬がアルギニンを染色し、アルギニ
ン誘導体が黄色の蛍光を発する。
ｎ及びＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ（１９７８）、ならび
にＡｅｒｔｓ等（１９７９）に記載されている通り、以
下のようにして検出する。エッペンドルフ容器中で、５
０ｍｇの植物材料（カルス、又は葉の部分）を０．１Ｍ
のアルギニンを含むＬＳ培地中、室温にて終夜培養す
る。その後植物材料に吸収紙を軽く当て、ガラス棒を用
いて新しいエッペンドルフ遠心容器中で均質化し、ホモ
ジネートをエッペンドルフ遠心機で２分間遠心する。上
澄みの２μｌを電気泳動に適した紙（Ｗｈａｔｍａｎ
３ＭＭ紙）（２０ｘ４０ｃｍ）上に点状で置き、乾燥す
る。紙を可動層（５％蟻酸、１５％酢酸、８０％Ｈ
2Ｏ、ｐＨ１．８）で飽和し、４００Ｖにて電気泳動を
４５分間行う。ノパリンは陰極に移動する。紙を熱空気
流中で乾燥し、フェナントレンキノン染色液（同量のエ
タノール中０．０２％のフェナントレンキノン、及び６
０％エタノール中の１０％ＮａＯＨ）を通して移動の方
向に引く。乾燥した紙は長波長ＵＶ光下で見ることがで
き、写真を撮る。試薬がアルギニンを染色し、アルギニ
ン誘導体が黄色の蛍光を発する。
【００８３】ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
（ＮＰＴ ＩＩ）酵素分析：植物のＮＰＴ ＩＩ活性
は、Ｒｅｉβ等（１９８４）に記載され、Ｓｃｈｒｅｉ
ｅｒ等（１９８５）により修正された方法で、以下のよ
うにしてカナマイシンのその場ホスホリル化により検出
することができる。５０ｍｇの植物組織をガラス粉を加
えた５０μｌの抽出緩衝液（１０％のグリセロール、５
％の２−メルカプトエタノール、０．１％のＳＤＳ、
０．０２５％のブロモフェノールブルー、６２．５ｍＭ
のトリス、ｐＨ６．８）中、氷上で均質化し、ホモジネ
ートをエッペンドルフ遠心機中、４℃にて１０分間遠心
する。上澄みの５０μｌをポリアクリルアミド ゲル
（１４５ｘ１１０ｘ１．２ｍｍ；分離ゲル：１０％のア
クリルアミド、０．３３％のビスアクリルアミド、０．
３７５ＭのトリスｐＨ８．８、収集ゲル：５％のアクリ
ルアミド、０．１６５％のビスアクリルアミド、０．１
２５ＭのトリスｐＨ６．８）に適用し、ゲルを４℃、６
０Ｖにて終夜電気泳動を行う。ブロモフェノール マー
カーがゲルの外に移動したらすぐにゲルを蒸留水で１０
分間、２回、及び反応緩衝液（６７ｍＭのトリス マレ
ート、ｐＨ７．１、４２ｍＭのＭｇＣｌ2、４００ｍＭ
の塩化アンモニウム）で３０分間、１回洗浄する。ゲル
を同一の大きさのガラス板上に置き、基質カナマイシン
サルフェート（２０μｌ／ｍｌ）、及び２０−２００μ
Ｃｉの32ＰＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む反応緩衝
液中の濃度１％のアガロース４０ｍｌで覆う。サンドイ
ッチゲルを室温で３０分間培養し、１枚のホスホセルロ
ース紙Ｐ８１（Ｗｈａｔｍａｎ）をアガロース上に置
く。この最高部に４層の濾紙３ＭＭ（Ｗｈａｔｍａ
ｎ）、及びペーパータオルを数枚置く。３−４時間後に
その場ホスホリル化放射活性カナマイシンホスフェート
のＰ８１紙への移動を止める。Ｐ８１紙をプロテイナー
ゼＫ、及び１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の
溶液中、６０℃にて３０分間培養し、２５１ｍｌの１０
ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．５中、８０℃にて３−４回
洗浄し、乾燥し、−７０℃にて１−１２時間オートラジ
オグラフィーにかける（ＸＡＲ５ フィルム コダッ
ク）。
（ＮＰＴ ＩＩ）酵素分析：植物のＮＰＴ ＩＩ活性
は、Ｒｅｉβ等（１９８４）に記載され、Ｓｃｈｒｅｉ
ｅｒ等（１９８５）により修正された方法で、以下のよ
うにしてカナマイシンのその場ホスホリル化により検出
することができる。５０ｍｇの植物組織をガラス粉を加
えた５０μｌの抽出緩衝液（１０％のグリセロール、５
％の２−メルカプトエタノール、０．１％のＳＤＳ、
０．０２５％のブロモフェノールブルー、６２．５ｍＭ
のトリス、ｐＨ６．８）中、氷上で均質化し、ホモジネ
ートをエッペンドルフ遠心機中、４℃にて１０分間遠心
する。上澄みの５０μｌをポリアクリルアミド ゲル
（１４５ｘ１１０ｘ１．２ｍｍ；分離ゲル：１０％のア
クリルアミド、０．３３％のビスアクリルアミド、０．
３７５ＭのトリスｐＨ８．８、収集ゲル：５％のアクリ
ルアミド、０．１６５％のビスアクリルアミド、０．１
２５ＭのトリスｐＨ６．８）に適用し、ゲルを４℃、６
０Ｖにて終夜電気泳動を行う。ブロモフェノール マー
カーがゲルの外に移動したらすぐにゲルを蒸留水で１０
分間、２回、及び反応緩衝液（６７ｍＭのトリス マレ
ート、ｐＨ７．１、４２ｍＭのＭｇＣｌ2、４００ｍＭ
の塩化アンモニウム）で３０分間、１回洗浄する。ゲル
を同一の大きさのガラス板上に置き、基質カナマイシン
サルフェート（２０μｌ／ｍｌ）、及び２０−２００μ
Ｃｉの32ＰＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む反応緩衝
液中の濃度１％のアガロース４０ｍｌで覆う。サンドイ
ッチゲルを室温で３０分間培養し、１枚のホスホセルロ
ース紙Ｐ８１（Ｗｈａｔｍａｎ）をアガロース上に置
く。この最高部に４層の濾紙３ＭＭ（Ｗｈａｔｍａ
ｎ）、及びペーパータオルを数枚置く。３−４時間後に
その場ホスホリル化放射活性カナマイシンホスフェート
のＰ８１紙への移動を止める。Ｐ８１紙をプロテイナー
ゼＫ、及び１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の
溶液中、６０℃にて３０分間培養し、２５１ｍｌの１０
ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．５中、８０℃にて３−４回
洗浄し、乾燥し、−７０℃にて１−１２時間オートラジ
オグラフィーにかける（ＸＡＲ５ フィルム コダッ
ク）。
【００８４】３．メディカゴ サティバ（Ｍｅｄｉｃａ
ｇｏ ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）の形質転換 ａ）植物材料 植物メディカゴ サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔ
ｉｖａ）（ＲｅｇｅｎＳ．クローンＲＡ3 Ｗａｌｋｅ
ｒ等、１９７８）を長日条件下（１６時間明、８時間
暗）、２６±２℃にて、ＬＳ培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ
及びＳｋｏｏｇ、１９６５）上で無菌シュート培養物と
して培養する。
ｇｏ ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）の形質転換 ａ）植物材料 植物メディカゴ サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔ
ｉｖａ）（ＲｅｇｅｎＳ．クローンＲＡ3 Ｗａｌｋｅ
ｒ等、１９７８）を長日条件下（１６時間明、８時間
暗）、２６±２℃にて、ＬＳ培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ
及びＳｋｏｏｇ、１９６５）上で無菌シュート培養物と
して培養する。
【００８５】ｂ）培養条件 シュート培養のための培養容器としてガラスのふたでゆ
るく覆ったガラス容器（２５０ｍｌ−１．５ｌ）を使用
する。他のすべての植物（胚、カルス、原形質体）の培
養にはプラスチックのペトリ皿を使用する。
るく覆ったガラス容器（２５０ｍｌ−１．５ｌ）を使用
する。他のすべての植物（胚、カルス、原形質体）の培
養にはプラスチックのペトリ皿を使用する。
【００８６】原形質体を除き、植物、及び組織の培養物
は長日条件下（１６時間明、８時間暗）、２６±２℃に
て成長室内で培養する。蛍光管の光色はユニバーサル
ホワイト（Ｏｓｒａｍ Ｌ５８Ｗ／２５）である。管は
培養物から１０−３０ｃｍの距離に置き、それは１，５
００−４，５００ルックスの光度に相当する。大気湿度
は調整しない。原形質体は２６℃にて５００ルックス以
下で培養器中にて培養する。
は長日条件下（１６時間明、８時間暗）、２６±２℃に
て成長室内で培養する。蛍光管の光色はユニバーサル
ホワイト（Ｏｓｒａｍ Ｌ５８Ｗ／２５）である。管は
培養物から１０−３０ｃｍの距離に置き、それは１，５
００−４，５００ルックスの光度に相当する。大気湿度
は調整しない。原形質体は２６℃にて５００ルックス以
下で培養器中にて培養する。
【００８７】ｃ）カルス培養 温室の植物の葉柄からカルスを誘導する。温室の植物か
ら手術用かみそりを用いて長さが約５ｃｍの葉柄片を切
り取る。最初に葉柄片の表面を殺菌する： −７０％エタノール中で１分間 −濃度１０％の市販の消毒薬中で１０分間 −無菌水道水で３回。
ら手術用かみそりを用いて長さが約５ｃｍの葉柄片を切
り取る。最初に葉柄片の表面を殺菌する： −７０％エタノール中で１分間 −濃度１０％の市販の消毒薬中で１０分間 −無菌水道水で３回。
【００８８】殺菌の後、葉柄片を長さ１−１．５ｃｍの
片に切断し、これらをペトリ皿中の固体寒天培地上に置
く。カルスの誘導、及びその後の培養に３種類の培地を
使用する： １．Ｂ5ｈ（Ａｔａｎａｓｓｏｖ及びＢｒｏｗｎ、１９
８４） ２．ＳＨＲ：２５μＭ（４．６５５ｍｇ／ｌ）のＮＡ
Ａ、及び１０μＭ（２．１５ｍｇ／ｌ）のキネチン（Ｗ
ａｌｋｅｒ及びＳａｔｏ、１９８１）を含むＳＨ（Ｓｈ
ｅｎｋ及びＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ、１９７２） ３．Ｂ5Ｈ3：２．６μＭ（０．５ｍｇ／ｌ）のＮＡＡ、
２．２μＭ（０．５ｍｇ／ｌ）のＢＡＰ、２．２μＭ
（０．５ｍｇ／ｌ）の２．４Ｄ（Ｏｅｌｃｋ、論文１９
８４）を含むＢ5（Ｇａｍｂｏｒｇ等、１９６８）。
片に切断し、これらをペトリ皿中の固体寒天培地上に置
く。カルスの誘導、及びその後の培養に３種類の培地を
使用する： １．Ｂ5ｈ（Ａｔａｎａｓｓｏｖ及びＢｒｏｗｎ、１９
８４） ２．ＳＨＲ：２５μＭ（４．６５５ｍｇ／ｌ）のＮＡ
Ａ、及び１０μＭ（２．１５ｍｇ／ｌ）のキネチン（Ｗ
ａｌｋｅｒ及びＳａｔｏ、１９８１）を含むＳＨ（Ｓｈ
ｅｎｋ及びＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ、１９７２） ３．Ｂ5Ｈ3：２．６μＭ（０．５ｍｇ／ｌ）のＮＡＡ、
２．２μＭ（０．５ｍｇ／ｌ）のＢＡＰ、２．２μＭ
（０．５ｍｇ／ｌ）の２．４Ｄ（Ｏｅｌｃｋ、論文１９
８４）を含むＢ5（Ｇａｍｂｏｒｇ等、１９６８）。
【００８９】３週間後、各カルスの外側を手術用かみそ
りを用いて切り取り、新しい培地上で継代培養を行う。
りを用いて切り取り、新しい培地上で継代培養を行う。
【００９０】ｄ）カルスの再生 修正したＳｔｕａｒｔ及びＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ、１９
８４，ａ，ｂの原案に従い、カルスから植物を再生す
る。
８４，ａ，ｂの原案に従い、カルスから植物を再生す
る。
【００９１】５０μＭ（１１ｍｇ／ｌ）の２，４Ｄ、及
び５μＭ（１．０７ｍｇ／ｌ）のキネチンを含む液体Ｓ
Ｈ培地（Ｓｈｅｎｋ及びＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ、１９
７２）中でカルスを培養することにより体細胞胚形成を
誘導する。３角フラスコ中に（５００ｍｌのフラスコ中
１００ｍｌ）、培地１ｍｌ当たり３０ｍｇのカルス（新
鮮重量）を加える。植物成長室中、２６℃にてシェーカ
ー（１００ｒｐｍ）上で３−４日間誘導を行う。その後
カルス組織をふるい（８５０μｍ2）上で培地から分離
する。
び５μＭ（１．０７ｍｇ／ｌ）のキネチンを含む液体Ｓ
Ｈ培地（Ｓｈｅｎｋ及びＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ、１９
７２）中でカルスを培養することにより体細胞胚形成を
誘導する。３角フラスコ中に（５００ｍｌのフラスコ中
１００ｍｌ）、培地１ｍｌ当たり３０ｍｇのカルス（新
鮮重量）を加える。植物成長室中、２６℃にてシェーカ
ー（１００ｒｐｍ）上で３−４日間誘導を行う。その後
カルス組織をふるい（８５０μｍ2）上で培地から分離
する。
【００９２】スパチュラを用い、ふるいを通してそれを
圧縮し、細胞の小凝集物を最初のふるいの下に置いたメ
ッシュサイズ２５０μｍ2のふるい上に集める。誘導培
地１００ｍｌ当たりホルモン（ＳＨ）を含まないＳＨＪ
培地５００ｍｌを用いて細胞凝集物を洗浄する。できる
だけ多くの洗浄液を、流出させる（約５分間）ことによ
り除去する。新鮮重量を測定し、ＳＨ培地中に細胞凝集
物を再懸濁する。ピペット中で０．５ｍｌ中の７５ｍｇ
を約１０ｍｌの固体再生培地ＳＨＲに適用する。再生培
地ＳＨＲは２５ｍＭのＮＨ4 +、及び１００ｍＭのＬ−プ
ロリンを３％スクロース中に含むＳＨ培地から成る。
圧縮し、細胞の小凝集物を最初のふるいの下に置いたメ
ッシュサイズ２５０μｍ2のふるい上に集める。誘導培
地１００ｍｌ当たりホルモン（ＳＨ）を含まないＳＨＪ
培地５００ｍｌを用いて細胞凝集物を洗浄する。できる
だけ多くの洗浄液を、流出させる（約５分間）ことによ
り除去する。新鮮重量を測定し、ＳＨ培地中に細胞凝集
物を再懸濁する。ピペット中で０．５ｍｌ中の７５ｍｇ
を約１０ｍｌの固体再生培地ＳＨＲに適用する。再生培
地ＳＨＲは２５ｍＭのＮＨ4 +、及び１００ｍＭのＬ−プ
ロリンを３％スクロース中に含むＳＨ培地から成る。
【００９３】約４週間後、認知できる極性を持つ十分発
達した胚（子葉段階、Ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ等、１９８
３）を２５μＭ（８．６ｍｇ／ｌ）のジベレリン酸（Ｇ
Ａ3）、及び０．５μＭ（０．０４６ｍｇ）のＮＡＡを
含む固体１／２ＳＨ培地上に置く。根、及び葉を持った
シュートの発育の後、小植物をＬＳ培地に移す。
達した胚（子葉段階、Ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ等、１９８
３）を２５μＭ（８．６ｍｇ／ｌ）のジベレリン酸（Ｇ
Ａ3）、及び０．５μＭ（０．０４６ｍｇ）のＮＡＡを
含む固体１／２ＳＨ培地上に置く。根、及び葉を持った
シュートの発育の後、小植物をＬＳ培地に移す。
【００９４】表は培地、Ｂ5ｈ、ＳＨＪ、ＳＨＲ、１／
２ＳＨ、及びＬＳの組成を示す。液体培地ＳＨはホルモ
ン２，４Ｄ、及びキネチンを含まないＳＨＪ培地に対応
する。他に記載がなければ、量はｍｇ／ｌで示す。
２ＳＨ、及びＬＳの組成を示す。液体培地ＳＨはホルモ
ン２，４Ｄ、及びキネチンを含まないＳＨＪ培地に対応
する。他に記載がなければ、量はｍｇ／ｌで示す。
【００９５】
【表６】多量元素 Ｂ5ｈ ＳＨＪ ＳＨＲ 1/2ＳＨ ＬＳ ＮＨ4ＮＯ3 − − − １６５０ ＫＮＯ3 ３０００ ２５００ ２５００ １２５０ １９００ ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ ８９５ ２００ ２００ １００ １９００ ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ ５００ ４００ ４００ ２００ ３７０ （ＮＨ4）2ＳＯ4 １３４ − １６５１ − − ＮａＨ2ＰＯ4Ｈ2Ｏ １５６ − ４０７ − − ＫＨ2ＰＯ4Ｈ2Ｏ − − − − １７０ ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4 − ３００ − １５０ − ＺｎＳＯ4Ｈ2Ｏ １０ １０ １０ ５ ２２．３ Ｈ3ＢＯ3 ３ ５ ５ ２．５ ６．２ ＺｎＳＯ4７Ｈ2Ｏ １ １ １ ０．５ ８．６ Ｎａ2ＭｏＯ4２Ｈ2Ｏ ０．２５ ０．１ ０．１ ０．０５ ０．２５ ＣｕＳＯ4５Ｈ2Ｏ ０．０２５ ０．０２ ０．０２ ０．１ ０．０２５ ＣａＣｌ2６Ｈ2Ｏ ０．０２５ ０．１ ０．１ ０．０５ ０．０２５ ＫＪ ２８ １５ １５ ７．５ ２８ Ｎａ2ＥＤＴＡ ３７ ２０ ２０ １０ ３７ビタミン チアミンＨＣｌ １０ ５ ５ ２．５ ０．４ ピリドキシンＨＣｌ １ ０．５ ０．５ ０．２５ − ニコチン酸 １ ５ ５ ２．５ −アミノ酸 Ｌ−グルタミン ８００ − − − − Ｌ−セリン １００ − − − − Ｌ−プロリン − − ５７５５ − −他の成分 中でも植物ホルモン ミオ−イノシトール １００ １０００ １０００ ５００ １００ Ｌ−グルタチオン １０ − − − − アデニンサルフェート １ − − − − ２，４−Ｄ １ １１．５ − − − キネチン ０．２ １．０７５ − − − ＧＡ3 − − − ８．６ − ＮＡＡ − − − ０．０４６ − スクロース ３０ｇ ３０ｇ ３０ｇ １５ｇ １５ｇ ｐＨ ５．８ ５．９ ５．９ ５．９ ５．８ ｐＨは１ＮのＫＯＨを用いて調節する。
【００９６】培地はオートクレーブ中、１２１℃にて１
７分間加熱することにより殺菌する。キネチン、Ｌ−グ
ルタチオン、及びアミノ酸はフィルター殺菌して、オー
トクレーブ中で加熱した後、培地に加え、培地の温度は
６０℃である。
７分間加熱することにより殺菌する。キネチン、Ｌ−グ
ルタチオン、及びアミノ酸はフィルター殺菌して、オー
トクレーブ中で加熱した後、培地に加え、培地の温度は
６０℃である。
【００９７】ｅ）原形質体培養 原形質体の単離に使用する出発材料は２−３月令の無菌
シュート培養物の葉である。これらを光を点火した２−
３時間後に収穫する。
シュート培養物の葉である。これらを光を点火した２−
３時間後に収穫する。
【００９８】−ペトリ皿中で最初に葉をＥＭＩ（Ａｔａ
ｎａｓｓｏｖ及びＢｒｏｗｎ、１９８４）で湿らせた
後、新しいかみそりの刃を用いて分割する。
ｎａｓｓｏｖ及びＢｒｏｗｎ、１９８４）で湿らせた
後、新しいかみそりの刃を用いて分割する。
【００９９】−その後ペトリ皿（φ１０ｃｍ）中で１−
１．５ｇの葉を１０ｍｌの酵素溶液と共に３−４時間培
養する。培養は弱光を当てながら２６℃で行う。葉から
の原形質体の発芽を顕微鏡下で観察する。３０分毎に皿
を２−３回穏やかに振る。酵素溶液は０．２ｍｇ／ｌの
２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌのゼアチン、及び１ｍｇ／
ｌのＮＡＡのホルモンを含むＡｔａｎａｓｓｏｖ及びＢ
ｒｏｗｎ（１９８４）の原形質培養培地（ＡＰ）、及び
酵素溶液の１：１の混合物から成る。酵素溶液（Ｋａｏ
及びＭｉｃｈａｙｌｕｋ、１９７９；修正）は： −２００ｍｇのＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ１０ −８０ｍｇのＭａｃｅｒｏｚｙｍｅ Ｒ１０ Ｓｅｒｖａ −１０ｍｇのＰｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ−２３ Ｓｉｇｍａ −５４０ｍｇのソルビトールを含む。
１．５ｇの葉を１０ｍｌの酵素溶液と共に３−４時間培
養する。培養は弱光を当てながら２６℃で行う。葉から
の原形質体の発芽を顕微鏡下で観察する。３０分毎に皿
を２−３回穏やかに振る。酵素溶液は０．２ｍｇ／ｌの
２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌのゼアチン、及び１ｍｇ／
ｌのＮＡＡのホルモンを含むＡｔａｎａｓｓｏｖ及びＢ
ｒｏｗｎ（１９８４）の原形質培養培地（ＡＰ）、及び
酵素溶液の１：１の混合物から成る。酵素溶液（Ｋａｏ
及びＭｉｃｈａｙｌｕｋ、１９７９；修正）は： −２００ｍｇのＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ１０ −８０ｍｇのＭａｃｅｒｏｚｙｍｅ Ｒ１０ Ｓｅｒｖａ −１０ｍｇのＰｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ−２３ Ｓｉｇｍａ −５４０ｍｇのソルビトールを含む。
【０１００】ｆ）誘導カルスの形質転換 カルスの再生に記載した方法によりカルスの胚形成を誘
導する。
導する。
【０１０１】液体ＳＨＪ中で３−４日間培養した後、カ
ルス材料をふるい（メッシュサイズ１００μｍ）上で寒
天、及びＬ−プロリンを含まない液体ＳＨＲを用いて洗
浄する。カルス材料を液体ＳＨＲ中に取り上げる。約１
ｇのカルス材料に１０ｍｌの培地を加える。
ルス材料をふるい（メッシュサイズ１００μｍ）上で寒
天、及びＬ−プロリンを含まない液体ＳＨＲを用いて洗
浄する。カルス材料を液体ＳＨＲ中に取り上げる。約１
ｇのカルス材料に１０ｍｌの培地を加える。
【０１０２】耐性遺伝子を持つＴｉプラスミドを含むア
グロバクテリアを加えた後（最終濃度２ｘ１０7／ｍ
ｌ）、カルス材料をシェーカー上（９０ｒｐｍ）、２６
℃にて２−３日間培養する。
グロバクテリアを加えた後（最終濃度２ｘ１０7／ｍ
ｌ）、カルス材料をシェーカー上（９０ｒｐｍ）、２６
℃にて２−３日間培養する。
【０１０３】ふるい（メッシュサイズ１００μｍ2）上
で、材料を液体ＳＨＲを用いて洗浄する。
で、材料を液体ＳＨＲを用いて洗浄する。
【０１０４】正常な固体ＳＨＲ上で１００ｍＭのＬ−プ
ロリンを用いて平板化を行う（１０ｍｌの培地当たり７
５ｍｇのカルス）。選択的抗体の他に、プレート中の培
地は５００μｇ／ｍｌのクラフォランを含む。４週間後
に耐性構造を、新しい抗体含有培地に置き、さらに３週
間後にそれを分割し、半分を選択的抗体を含まない新し
い培地上に置き、他の半分を抗体含有培地上に置く。
ロリンを用いて平板化を行う（１０ｍｌの培地当たり７
５ｍｇのカルス）。選択的抗体の他に、プレート中の培
地は５００μｇ／ｍｌのクラフォランを含む。４週間後
に耐性構造を、新しい抗体含有培地に置き、さらに３週
間後にそれを分割し、半分を選択的抗体を含まない新し
い培地上に置き、他の半分を抗体含有培地上に置く。
【０１０５】ｇ）胚の形質転換 誘導カルスの形質転換と類似の方法で胚の形質転換を行
う。使用した出発材料は４−５週令の胚である。ペトリ
皿中で、それをかみそりの刃を用いて細かく分割し、ふ
るい（メッシュサイズ１００μｍ）上で液体ＳＨＲを用
いて洗浄する。約１ｇの分割した胚を１０ｍｌの液体Ｓ
ＨＲ中に取り上げる。アグロバクテリアを加えた後（最
終濃度２ｘ１０7／ｍｌ）、シェーカー（９０ｒｐｍ）
上で２６℃にて２−３日間培養する。この後、胚の部分
をふるい（１００μｍ2）上で液体ＳＨＲを用いて洗浄
する。スパチュラを用いて、１００ｍＭのＬ−プロリン
を含む標準固体ＳＨＲを入れたプレート上でそれを平坦
化する。１０ｍｌの培地を含むプレート当たり約５０−
１００ｍｇの胚の部分を分配する。選択的抗体の他にプ
レート中の培地は５００μｇ／ｍｌのクラフォランを含
む。平坦化の３週間後、新しいプレート上で２次胚を継
代培養する。十分発育した胚を抗体を含まない１／２Ｓ
Ｈ培地（Ｓｔｕａｒｔ及びＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ、１９
８４，ｂ）に移植し、さらに発育させて植物とする。根
付いた小植物をＬＳ培地に移植する。 ４．ソラヌム ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅ
ｒｏｓｕｍ）（じゃがいも）の形質転換 ＥＰ−Ａ−０，２４２，２４６の１４−１５頁に記載の
方法に正確に類似した方法で、耐性遺伝子を持つＴｉプ
ラスミドを含むアグロバクテリアを用いて形質転換を行
う。
う。使用した出発材料は４−５週令の胚である。ペトリ
皿中で、それをかみそりの刃を用いて細かく分割し、ふ
るい（メッシュサイズ１００μｍ）上で液体ＳＨＲを用
いて洗浄する。約１ｇの分割した胚を１０ｍｌの液体Ｓ
ＨＲ中に取り上げる。アグロバクテリアを加えた後（最
終濃度２ｘ１０7／ｍｌ）、シェーカー（９０ｒｐｍ）
上で２６℃にて２−３日間培養する。この後、胚の部分
をふるい（１００μｍ2）上で液体ＳＨＲを用いて洗浄
する。スパチュラを用いて、１００ｍＭのＬ−プロリン
を含む標準固体ＳＨＲを入れたプレート上でそれを平坦
化する。１０ｍｌの培地を含むプレート当たり約５０−
１００ｍｇの胚の部分を分配する。選択的抗体の他にプ
レート中の培地は５００μｇ／ｍｌのクラフォランを含
む。平坦化の３週間後、新しいプレート上で２次胚を継
代培養する。十分発育した胚を抗体を含まない１／２Ｓ
Ｈ培地（Ｓｔｕａｒｔ及びＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ、１９
８４，ｂ）に移植し、さらに発育させて植物とする。根
付いた小植物をＬＳ培地に移植する。 ４．ソラヌム ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅ
ｒｏｓｕｍ）（じゃがいも）の形質転換 ＥＰ−Ａ−０，２４２，２４６の１４−１５頁に記載の
方法に正確に類似した方法で、耐性遺伝子を持つＴｉプ
ラスミドを含むアグロバクテリアを用いて形質転換を行
う。
【０１０６】他の指示がなければ上記実施例のパーセン
トはすべて重量パーセントである。上記実施例により得
られたトランスジェニック植物細胞、及び植物におい
て、耐性遺伝子の転換、及び発現は２つの基準を用いて
一般的に通常の方法により明白に検出することができ
る。例えば遺伝子、及びその１次遺伝子生成物は上記試
験により明白に検出することができる。さらに１次遺伝
子生成物はトランスジェニック植物がフィトフトラ メ
ガスペルマ（Ｐｈｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅ
ｒｍａ）、又はその細胞壁などの病原体に感染した時に
選択的に発現する。有害な生物に対する耐性の増加とい
う意味の生物学的作用は病原体の成長の減少、及び植物
への損傷の減少により検出することができる。
トはすべて重量パーセントである。上記実施例により得
られたトランスジェニック植物細胞、及び植物におい
て、耐性遺伝子の転換、及び発現は２つの基準を用いて
一般的に通常の方法により明白に検出することができ
る。例えば遺伝子、及びその１次遺伝子生成物は上記試
験により明白に検出することができる。さらに１次遺伝
子生成物はトランスジェニック植物がフィトフトラ メ
ガスペルマ（Ｐｈｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅ
ｒｍａ）、又はその細胞壁などの病原体に感染した時に
選択的に発現する。有害な生物に対する耐性の増加とい
う意味の生物学的作用は病原体の成長の減少、及び植物
への損傷の減少により検出することができる。
【０１０７】以下において、植物、又は植物細胞の形質
転換に使用した培地のいくつかにつき記載する：Ａｍ培地 １ｌ中に ３．５ｇのＫ2ＨＰＯ4 １．５ｇのＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇのＮａ3クエン酸塩 ０．１ｇのＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ １ ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２ ｇのグルコースタバコの無菌シュート培養のための培地 多量元素 ＭＳ塩の濃度の１／２ Ｆｅ ＥＤＴＡ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（ＭＳ） ミオ−イノシトール １００ｍｇ／ｌ スクロース １０ｍｇ／ｌ 寒天 ８ｍｇ／ｌ ビタミン Ｃａ パントテネート １ｍｇ／ｌ ビオチン １０ｍｇ／ｌ ニコチン酸 １ｍｇ／ｌ ピリドキシン １ｍｇ／ｌ チアミン １ｍｇ／ｌ ｐＨ５．７としてオートクレーブにかける。
転換に使用した培地のいくつかにつき記載する：Ａｍ培地 １ｌ中に ３．５ｇのＫ2ＨＰＯ4 １．５ｇのＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇのＮａ3クエン酸塩 ０．１ｇのＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ １ ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２ ｇのグルコースタバコの無菌シュート培養のための培地 多量元素 ＭＳ塩の濃度の１／２ Ｆｅ ＥＤＴＡ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（ＭＳ） ミオ−イノシトール １００ｍｇ／ｌ スクロース １０ｍｇ／ｌ 寒天 ８ｍｇ／ｌ ビタミン Ｃａ パントテネート １ｍｇ／ｌ ビオチン １０ｍｇ／ｌ ニコチン酸 １ｍｇ／ｌ ピリドキシン １ｍｇ／ｌ チアミン １ｍｇ／ｌ ｐＨ５．７としてオートクレーブにかける。
【０１０８】Ｋ３培地 ニコチアナ タバクム ペチト ハバナ（Ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａ ｔａｂａｃｕｍｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ）Ｓ
Ｒ１、ニコチアナ タバクム ウィスコンシン（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）
３８、及びニコチアナ プルムバギニフォリア（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）原形
質体の培養用（Ｎａｇｙ及びＭａｌｉｇａ、１９７
６）。
ａｎａ ｔａｂａｃｕｍｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ）Ｓ
Ｒ１、ニコチアナ タバクム ウィスコンシン（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）
３８、及びニコチアナ プルムバギニフォリア（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）原形
質体の培養用（Ｎａｇｙ及びＭａｌｉｇａ、１９７
６）。
【０１０９】 多量元素 ＮＨ4ＮＯ3 ２５０ ｍｇ／ｌ ＫＮＯ3 ２，５００ ｍｇ／ｌ ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ ９００ ｍｇ／ｌ ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ ２５０ ｍｇ／ｌ ＮａＨ2ＰＯ4ｘ１Ｈ2Ｏ １５０ ｍｇ／ｌ （ＮＨ4）2ＳＯ4 １３４ ｍｇ／ｌ ＣａＨＰＯ4ｘ１Ｈ2Ｏ ５０ ｍｇ／ｌ 多量元素 Ｈ3ＢＯ3 ３ ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ4ｘ１Ｈ2Ｏ １０ ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ4ｘ４Ｈ2Ｏ ２ ｍｇ／ｌ ＫＩ ０．７５ ｍｇ／ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4ｘ２Ｈ2Ｏ ０．２５ ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ4ｘ５Ｈ2Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌ ＣｏＣｌ2ｘ６Ｈ2Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌ Ｆｅ ＥＤＴＡ Ｎａ2ＥＤＴＡ ３７．２ ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ ２７．８ ｍｇ／ｌ イノシトール １００ ｍｇ／ｌ スクロース １３７ ｇ／ｌ （＝０．４モル） キシロース ２５０ ｍｇ／ｌ ビタミン ニコチン酸 １ ｍｇ／ｌ ピロキシン １ ｍｇ／ｌ チアミン １０ ｍｇ／ｌ ホルモン ＮＡＡ １．０ ｍｇ／ｌ キネチン ０．２ ｍｇ／ｌ ｐＨ５．６ フィルター殺菌Ｌｉｎｓｅｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地 （Ｌｉ
ｎｓｅｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６５） 再生原形質体培養用、及びタバコ腫瘍ならびにカルスの
組織培養用。Ｌｉｎｓｅｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏ
ｇ（ＬＳ）培地は以下の修正を行ったＭｕｒａｓｈｉｇ
ｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ
Ｓｋｏｏｇ，１９６２）培地である： −量り込むチアミンを０．１ｍｇ／ｌではなく、０．４
ｍｇ／ｌの濃度とする。 −グリシン、ピリドキシン、及びニコチン酸を含まな
い。
ｎｓｅｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６５） 再生原形質体培養用、及びタバコ腫瘍ならびにカルスの
組織培養用。Ｌｉｎｓｅｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏ
ｇ（ＬＳ）培地は以下の修正を行ったＭｕｒａｓｈｉｇ
ｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ
Ｓｋｏｏｇ，１９６２）培地である： −量り込むチアミンを０．１ｍｇ／ｌではなく、０．４
ｍｇ／ｌの濃度とする。 −グリシン、ピリドキシン、及びニコチン酸を含まな
い。
【０１１０】 多量元素 ＮＨ4ＮＯ3 １，６５０ ｍｇ／ｌ ＫＮＯ3 １，９００ ｍｇ／ｌ ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ ４４０ ｍｇ／ｌ ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ ３７０ ｍｇ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4 １７０ ｍｇ／ｌ 多量元素 Ｈ3ＢＯ3 ６．２ ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ4ｘ１Ｈ2Ｏ ２２．３ ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ4ｘ４Ｈ2Ｏ ８．６ ｍｇ／ｌ ＫＩ ０．８３ ｍｇ／ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4ｘ２Ｈ2Ｏ ０．２５ ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ4ｘ５Ｈ2Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌ ＣｏＣｌ2ｘ６Ｈ2Ｏ ０．０２５ｍｇ／ｌ Ｆｅ ＥＤＴＡ Ｎａ2ＥＤＴＡ ３７．２ ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ ２７．８ ｍｇ／ｌ イノシトール １００ ｍｇ／ｌ スクロース ３０ ｇ／ｌ 寒天 ８ ｇ／ｌ ビタミン チアミン ０．４ ｍｇ／ｌ ホルモン： ＮＡＡ １ ｍｇ／ｌ キネチン ０．２ ｍｇ／ｌ ｐＨ５．７としてオートクレーブにかける。
【０１１１】使用した方法、及び技術をさらに説明する
ために植物、又は植物細胞の形質転換、ならびに耐性遺
伝子の問題に関する以下の文献を挙げることができる：
Ａｅｒｔｓ Ｍ，Ｊａｃｏｂｓ Ｍ，Ｈｅｒｎａｌｓｔ
ｅｅｎｓ Ｊｐ，ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ Ｍ，Ｓｃｈｅ
ｌｌ Ｊ（１９８３） アラビドプシス タリアナ（Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）クラウンガ
ール腫瘍の誘導、及びインビトロ培養。Ｐｌａｎｔ Ｓ
ｃｉ Ｌｅｔｔ．１７：４３−５０ Ａｔａｎａｓｏｖ Ａ，Ｂｒｏｗｎ ＤＣＷ（１９８
４） メジカゴ サチバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉ
ｖａ Ｌ．）の浮遊培養、及び葉肉原形質体からの植物
再生。Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ Ｏｒｇ．Ｃｕ
ｌｔ．３，１４９−１６２ Ｄａｖｅｙ ＭＲ，Ｃｏｃｋｉｎｇ ＥＣ，Ｆｒｅｅｍ
ａｎ Ｊ，ＰｅａｒｃｅＮ，Ｔｕｄｏｒ Ｉ（１９８
０） 単離アグロバクテリア プラスミドによるペチュ
ニア原形質体の形質転換。Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ Ｌｅｔ
ｔ：３０７−３１３ Ｄｅｂｌａｅｒｅ Ｒ．，Ｂｙｔｅｂｉｅｒ Ｂ．，Ｄ
ｅ Ｇｒｅｖｅ Ｈ，Ｄｅｂｏｅｃｋ Ｆ，Ｓｃｈｅｌ
ｌ Ｊ，ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ Ｍ，Ｌｅｅｍａｎｓ
Ｊ（１９８５） 植物へのアグロバクテリア媒介遺伝
子転換のための有効なオクトピンＴｉプラスミド−誘導
ベクター。
ために植物、又は植物細胞の形質転換、ならびに耐性遺
伝子の問題に関する以下の文献を挙げることができる：
Ａｅｒｔｓ Ｍ，Ｊａｃｏｂｓ Ｍ，Ｈｅｒｎａｌｓｔ
ｅｅｎｓ Ｊｐ，ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ Ｍ，Ｓｃｈｅ
ｌｌ Ｊ（１９８３） アラビドプシス タリアナ（Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）クラウンガ
ール腫瘍の誘導、及びインビトロ培養。Ｐｌａｎｔ Ｓ
ｃｉ Ｌｅｔｔ．１７：４３−５０ Ａｔａｎａｓｏｖ Ａ，Ｂｒｏｗｎ ＤＣＷ（１９８
４） メジカゴ サチバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉ
ｖａ Ｌ．）の浮遊培養、及び葉肉原形質体からの植物
再生。Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ Ｏｒｇ．Ｃｕ
ｌｔ．３，１４９−１６２ Ｄａｖｅｙ ＭＲ，Ｃｏｃｋｉｎｇ ＥＣ，Ｆｒｅｅｍ
ａｎ Ｊ，ＰｅａｒｃｅＮ，Ｔｕｄｏｒ Ｉ（１９８
０） 単離アグロバクテリア プラスミドによるペチュ
ニア原形質体の形質転換。Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ Ｌｅｔ
ｔ：３０７−３１３ Ｄｅｂｌａｅｒｅ Ｒ．，Ｂｙｔｅｂｉｅｒ Ｂ．，Ｄ
ｅ Ｇｒｅｖｅ Ｈ，Ｄｅｂｏｅｃｋ Ｆ，Ｓｃｈｅｌ
ｌ Ｊ，ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ Ｍ，Ｌｅｅｍａｎｓ
Ｊ（１９８５） 植物へのアグロバクテリア媒介遺伝
子転換のための有効なオクトピンＴｉプラスミド−誘導
ベクター。
【０１１２】Ｆｒａｌｅｙ Ｒ．Ｔ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ ８０，４８
０３（１９８３） Ｆｒｏｍｍ ＭＥ，Ｔａｙｌｏｒ ＬＰ，Ｗａｌｂｏｔ
Ｖ（１９８６） エレクトロポレートョンによる遺伝
子転換後のとうもろこしの安定な形質転換。Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１９：７９１−７９３ ｇａｍｂｏｒｇ Ｏ．Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ．Ａ．及
びＯｊｉｉｍａ Ｋ．（１９８６） 大豆の根の細胞の
浮遊培養の栄養要求。ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌ
ｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：１５１−１５８ Ｈａｉｎ，Ｒ．，Ｓｔａｂｅｌ，Ｐ．，Ｃｚｅｒｎｉｌ
ｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｐｐ．，Ｓｔｅｉｎｂｉβ，Ｈ．
Ｈ．，Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，Ｌ．，Ｓｃ
ｈｅｌｌ，Ｊ．（１９８５） 植物の原形質体による選
択可能なキメラ遺伝子の取り上げ、組み込み、発現、及
び遺伝子伝達。Ｍｏｌｅｃ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９
９：１６１−１６８ Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ Ｌ．，Ｄｅ Ｂｌ
ｏｃｋ Ｍ．，Ｍｅｓｓｅｎｓ．Ｅ．，Ｈｅｒｎａｌ−
ｓｔｅｅｎｓ ＪＰ．，ｖａｎ ＭｏｎｔａｇｕＭ．，
Ｓｃｈｅｌｌ Ｊ．（１９８３） ＥＭＢＯ Ｊ．２：
９８７−９９５Ｈｏｒｓｃｈ ＲＢ，Ｆｒｙ ＪＥ，Ｈ
ｏｆｆｍａｎｎ ＮＬ，Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ Ｄ，Ｒｏ
ｇｅｒｓ ＳＧ，Ｆｒａｌｅｙ ＲＴ（１９８５） 植
物への遺伝子の転換の単純で一般的な方法。Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７７：１２２９−１２３１ Ｋａｏ ＫＮ，Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ ＭＲ（１９８０）
アルファルファの葉肉の原形質からの植物再生。Ｚ
Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．９６，１３５−１４
１ Ｋｅｌｌｅｒ ＷＡ，Ｍｅｌｃｈｅｒｓ Ｇ（１９７
３） タバコの葉の原形質体融合への高いｐＨ及びカル
シウムイオンの影響。Ｚ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｇ
２８ｃ：７３７−７４１ Ｋｒｅｎｓ ＦＨ，Ｍｏｌｅｎｄｉｈｋ Ｌ，Ｗｕｌｌ
ｅｍｓ ＧＪ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ＲＡ（１９
８２） Ｔｉ−プラスミドＤＮＡを用いた植物原形質体
のインビトロ形質転換。Ｎａｔｕｒｅ ２９６：７２−
７４。ＫｏｎｃｚＣ，Ｓｃｈｅｌｌ Ｊ（１９８６）
ＴL−ＤＮＡ遺伝子５のプロモーターが新規種類のアグ
ロバクテリアの直線状ベクターにより運ばれるキメラ遺
伝子の組織特異的発現を制御する。Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．（１９８６）２０４：３３８−３９６ Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ＤＭ，Ｓｋｏｏｇ Ｆ（１９６
５） タバコ組織培養の有機成長因子要求。Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ Ｐｌａｎｔ １８：１００−１２７ Ｍａｒｔｏｎ Ｌ，Ｗｕｌｌｅｍｓ ＧＪ，Ｍｏｌｅｎ
ｄｉｊｋ Ｌ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ＰＲ（１９
７９） アグロバクテリウム ツメファシエンスによる
ニコチアナ タバクムからの培養細胞のインビトロ形質
転換。Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１２２９−１３１ Ｎａｇｙ ＪＩ，Ｍａｌｉｇａ Ｐ（１９７６） ニコ
チアナ シルベストリスの葉肉原形質体からのカルス誘
導、及び植物再生。Ｚ Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏ
ｌ ７８：４５３−４５５ Ｏｅｌｃｋ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍ．，論文，１９８４，
コロン大学、ドイツ連邦共和国， 組織−及び培養細胞
からの豆の再生。
ａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ ８０，４８
０３（１９８３） Ｆｒｏｍｍ ＭＥ，Ｔａｙｌｏｒ ＬＰ，Ｗａｌｂｏｔ
Ｖ（１９８６） エレクトロポレートョンによる遺伝
子転換後のとうもろこしの安定な形質転換。Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１９：７９１−７９３ ｇａｍｂｏｒｇ Ｏ．Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ．Ａ．及
びＯｊｉｉｍａ Ｋ．（１９８６） 大豆の根の細胞の
浮遊培養の栄養要求。ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌ
ｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：１５１−１５８ Ｈａｉｎ，Ｒ．，Ｓｔａｂｅｌ，Ｐ．，Ｃｚｅｒｎｉｌ
ｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｐｐ．，Ｓｔｅｉｎｂｉβ，Ｈ．
Ｈ．，Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，Ｌ．，Ｓｃ
ｈｅｌｌ，Ｊ．（１９８５） 植物の原形質体による選
択可能なキメラ遺伝子の取り上げ、組み込み、発現、及
び遺伝子伝達。Ｍｏｌｅｃ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９
９：１６１−１６８ Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ Ｌ．，Ｄｅ Ｂｌ
ｏｃｋ Ｍ．，Ｍｅｓｓｅｎｓ．Ｅ．，Ｈｅｒｎａｌ−
ｓｔｅｅｎｓ ＪＰ．，ｖａｎ ＭｏｎｔａｇｕＭ．，
Ｓｃｈｅｌｌ Ｊ．（１９８３） ＥＭＢＯ Ｊ．２：
９８７−９９５Ｈｏｒｓｃｈ ＲＢ，Ｆｒｙ ＪＥ，Ｈ
ｏｆｆｍａｎｎ ＮＬ，Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ Ｄ，Ｒｏ
ｇｅｒｓ ＳＧ，Ｆｒａｌｅｙ ＲＴ（１９８５） 植
物への遺伝子の転換の単純で一般的な方法。Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７７：１２２９−１２３１ Ｋａｏ ＫＮ，Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ ＭＲ（１９８０）
アルファルファの葉肉の原形質からの植物再生。Ｚ
Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．９６，１３５−１４
１ Ｋｅｌｌｅｒ ＷＡ，Ｍｅｌｃｈｅｒｓ Ｇ（１９７
３） タバコの葉の原形質体融合への高いｐＨ及びカル
シウムイオンの影響。Ｚ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｇ
２８ｃ：７３７−７４１ Ｋｒｅｎｓ ＦＨ，Ｍｏｌｅｎｄｉｈｋ Ｌ，Ｗｕｌｌ
ｅｍｓ ＧＪ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ＲＡ（１９
８２） Ｔｉ−プラスミドＤＮＡを用いた植物原形質体
のインビトロ形質転換。Ｎａｔｕｒｅ ２９６：７２−
７４。ＫｏｎｃｚＣ，Ｓｃｈｅｌｌ Ｊ（１９８６）
ＴL−ＤＮＡ遺伝子５のプロモーターが新規種類のアグ
ロバクテリアの直線状ベクターにより運ばれるキメラ遺
伝子の組織特異的発現を制御する。Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．（１９８６）２０４：３３８−３９６ Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ＤＭ，Ｓｋｏｏｇ Ｆ（１９６
５） タバコ組織培養の有機成長因子要求。Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ Ｐｌａｎｔ １８：１００−１２７ Ｍａｒｔｏｎ Ｌ，Ｗｕｌｌｅｍｓ ＧＪ，Ｍｏｌｅｎ
ｄｉｊｋ Ｌ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ＰＲ（１９
７９） アグロバクテリウム ツメファシエンスによる
ニコチアナ タバクムからの培養細胞のインビトロ形質
転換。Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１２２９−１３１ Ｎａｇｙ ＪＩ，Ｍａｌｉｇａ Ｐ（１９７６） ニコ
チアナ シルベストリスの葉肉原形質体からのカルス誘
導、及び植物再生。Ｚ Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏ
ｌ ７８：４５３−４５５ Ｏｅｌｃｋ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍ．，論文，１９８４，
コロン大学、ドイツ連邦共和国， 組織−及び培養細胞
からの豆の再生。
【０１１３】Ｏｔｔｅｎ ＬＡＢＭ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒ
ｏｏｒｔ ＲＡ（１９７８） リソピン、及びノパリン
デヒドロゲナーゼ活性の検出のための迅速で微小規模
の方法。Ｂｉｏｃｈｅｍ ｂｉｏｐｈｙｓ ａｃｔａ
５２７：４９７−５００ Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ Ｊ．Ｓｈｉｌｌｉｔｏ ＲＤ，
Ｓａｕｌ Ｍ，Ｍａｎｄａｋ Ｖ，Ｈｏｈｎ Ｔ，Ｈｏ
ｈｎ Ｂ，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ（１９８４）植物への
直接遺伝子転換。ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７１７−２７２
２ Ｒｏｌｆｓ，Ｆｒｉｔｚｅｍｅｉｅｒ，Ｋｉｎｄｌ（１
９８１）Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ １：８
３−８５ Ｒｅｉｓｓ Ｂｅｒｎｄ，Ｓｐｒｅｎｇｅｌ Ｒｏｌ
ｆ，Ｗｉｌｌ Ｈａｎｓ及びＳｃｈａｌｌｅｒ Ｈｅｉ
ｎｚ（１９８４） 粗細胞管におけるネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼの定性的、及び定量的分析のため
の新規高感応性方法。ＧＥＮＥ １０８１：２１１−２
１７ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉ
ｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ Ｓｃｈｒｅｉｅｒ Ｐｅｔｅｒ Ｈ．，Ｓｅｆｔｏｒ
Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ Ａ．，Ｓｃｈｅｌｌ Ｊｏｚｅｆ
及びＢｏｈｎｅｒｔ Ｈａｎｓ Ｊ．（１９８５） 光
制御合成の方向づけ、及び植物原形質体への外部蛋白質
の輸送のための核−コード配列の利用。ＥＭＢＯ Ｊ
４巻、Ｎｏ．１：２５−３２ Ｓｈｅｎｋ ＲＵ，Ｈｉｋｄｅｂｒａｎｄｔ ＡＣ（１
９７２） 単子葉、及び双子葉培養細胞の誘導、及び成
長のための培地と技術。Ｃａ．Ｊ．Ｂｏｔ．５０，１９
９−２０４ Ｓｈｉｌｌｉｔｏ ＲＤ，Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ Ｊ．
Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ（１９６３） 多数の植物種にお
ける原形質体−誘導コロニーの発育を可能にし、賦活す
るアガロース プラーク形成、及びビーズ型培養法。Ｐ
ｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２：２４４−２４７ Ｓｉｍｏｎｓ−Ｓｃｈｒｅｉｅｒ Ａ，コロン大学（１
９８８） メジカゴ サチバの形質転換、及びトランス
ジェニック植物における共生関係の間のレグヘモグロビ
ン遺伝子（１ｂｃ３）、及びキメラ１ｂ−ｃａｔ遺伝子
の発現に関する研究。
ｏｏｒｔ ＲＡ（１９７８） リソピン、及びノパリン
デヒドロゲナーゼ活性の検出のための迅速で微小規模
の方法。Ｂｉｏｃｈｅｍ ｂｉｏｐｈｙｓ ａｃｔａ
５２７：４９７−５００ Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ Ｊ．Ｓｈｉｌｌｉｔｏ ＲＤ，
Ｓａｕｌ Ｍ，Ｍａｎｄａｋ Ｖ，Ｈｏｈｎ Ｔ，Ｈｏ
ｈｎ Ｂ，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ（１９８４）植物への
直接遺伝子転換。ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７１７−２７２
２ Ｒｏｌｆｓ，Ｆｒｉｔｚｅｍｅｉｅｒ，Ｋｉｎｄｌ（１
９８１）Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ １：８
３−８５ Ｒｅｉｓｓ Ｂｅｒｎｄ，Ｓｐｒｅｎｇｅｌ Ｒｏｌ
ｆ，Ｗｉｌｌ Ｈａｎｓ及びＳｃｈａｌｌｅｒ Ｈｅｉ
ｎｚ（１９８４） 粗細胞管におけるネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼの定性的、及び定量的分析のため
の新規高感応性方法。ＧＥＮＥ １０８１：２１１−２
１７ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉ
ｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ Ｓｃｈｒｅｉｅｒ Ｐｅｔｅｒ Ｈ．，Ｓｅｆｔｏｒ
Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ Ａ．，Ｓｃｈｅｌｌ Ｊｏｚｅｆ
及びＢｏｈｎｅｒｔ Ｈａｎｓ Ｊ．（１９８５） 光
制御合成の方向づけ、及び植物原形質体への外部蛋白質
の輸送のための核−コード配列の利用。ＥＭＢＯ Ｊ
４巻、Ｎｏ．１：２５−３２ Ｓｈｅｎｋ ＲＵ，Ｈｉｋｄｅｂｒａｎｄｔ ＡＣ（１
９７２） 単子葉、及び双子葉培養細胞の誘導、及び成
長のための培地と技術。Ｃａ．Ｊ．Ｂｏｔ．５０，１９
９−２０４ Ｓｈｉｌｌｉｔｏ ＲＤ，Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ Ｊ．
Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ（１９６３） 多数の植物種にお
ける原形質体−誘導コロニーの発育を可能にし、賦活す
るアガロース プラーク形成、及びビーズ型培養法。Ｐ
ｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２：２４４−２４７ Ｓｉｍｏｎｓ−Ｓｃｈｒｅｉｅｒ Ａ，コロン大学（１
９８８） メジカゴ サチバの形質転換、及びトランス
ジェニック植物における共生関係の間のレグヘモグロビ
ン遺伝子（１ｂｃ３）、及びキメラ１ｂ−ｃａｔ遺伝子
の発現に関する研究。
【０１１４】Ｓｔｕａｒｔ ＤＡ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎ
ｄ ＳＧ（１９８４） メジカゴ サチバ Ｌ．Ｉ．の
培養細胞からの体細胞胚形成。再生培地へのアミノ酸添
加の役割。Ｐｌａｎｔ Ｌｅｔ．３４，１６５−１７４ Ｓｔｕａｒｔ ＤＡ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＳＧ（１
９８４） メジカゴ サチバ Ｌ．ＩＩ．の培養細胞か
らの体細胞胚形成。アミノ酸とアンモニウムの相互作
用。Ｐｌａｎｔ Ｌｅｔ．３４，１７５−１８１ Ｖｅｌｔｅｎ Ｊ，Ｖｅｌｔｅｎ Ｌ，Ｈａｉｎ Ｒ，
Ｓｃｈｅｌｌ Ｊ（１９８４） アグロバクテリウム
チメファシエンスのＴｉプラスミドからの２重植物プロ
モーターフラグメントの単離。ＥＭＢＯ Ｊ １２：２
７２３−２７３０ Ｗａｌｋｅｒ ＫＡ，Ｙｕ ＰＣ，Ｓａｔｏ ＳＪ，Ｊ
ａｗｏｒｓｋｉ ＥＧ（１９７８） インビトロで培養
したメジカゴ サチバ Ｌ．のカルスにおける組織形成
のホルモン制御。Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ．６５（６），
６５４−６５９ Ｗａｌｋｅｒ ＫＡ，Ｓａｔｏ ＳＪ（１９８１） メ
ジカゴ サチバのカルス組織における形態形成：体細胞
アンブリオ形成におけるアンモニウムイオンの役割。Ｐ
ｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．
１，１０９−１２１ Ｗｕｌｌｅｍｓ ＧＪ．Ｍｏｌｅｎｄｉｊｋ Ｌ，Ｏｏ
ｍｓ Ｇ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ＲＡ（１９８
１） ニコチアナ タバクムから誘導した細胞壁再生原
形質体のインビトロ アガロバクテリウム ツメファシ
エンス−誘導形質転換後に得られる形質転換物における
クラウンガール腫瘍の発現の差。ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ７８：４３４４−４３４８ Ｙａｎｉｓｃｈ−ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｃｉｒａ，
Ｊ及びＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎｅ ３
３，１０３−１１９ Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ Ｐ，Ｊｏｏｓ Ｈ，Ｇｅｎｅｔｅ
ｌｌｏ Ｃ，ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ Ｍ，Ｓｃｈｅｌ
ｌ Ｊ（１９８３） 正常な再生能力を変えることな
く、植物細胞にＤＮＡを導入するためのＴｉ−プラスミ
ドベクター。ＥＭＢＯ Ｊ １２：２１４３−２１５０ さらに以下の公開特許出願を挙げることができる： ＥＰ−Ａ １１６，７１８ ＥＰ−Ａ １５９，４１８ ＥＰ−Ａ １２０，５１５ ＥＰ−Ａ １２０，５１６ ＥＰ−Ａ １７２，１１２ ＥＰ−Ａ １４０，５５６ ＥＰ−Ａ １７４，１６６ ＥＰ−Ａ １２２，７９１ ＥＰ−Ａ １２６，５４６ ＥＰ−Ａ １６４，５９７ ＥＰ−Ａ １７５，９６６ ＥＰ−Ａ ２７０，８２２ ＷＯ ８４／０２９１３ ＷＯ ８４／０２９１９ ＷＯ ８４／０２９２０ ＷＯ ８３／０１１７６
ｄ ＳＧ（１９８４） メジカゴ サチバ Ｌ．Ｉ．の
培養細胞からの体細胞胚形成。再生培地へのアミノ酸添
加の役割。Ｐｌａｎｔ Ｌｅｔ．３４，１６５−１７４ Ｓｔｕａｒｔ ＤＡ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＳＧ（１
９８４） メジカゴ サチバ Ｌ．ＩＩ．の培養細胞か
らの体細胞胚形成。アミノ酸とアンモニウムの相互作
用。Ｐｌａｎｔ Ｌｅｔ．３４，１７５−１８１ Ｖｅｌｔｅｎ Ｊ，Ｖｅｌｔｅｎ Ｌ，Ｈａｉｎ Ｒ，
Ｓｃｈｅｌｌ Ｊ（１９８４） アグロバクテリウム
チメファシエンスのＴｉプラスミドからの２重植物プロ
モーターフラグメントの単離。ＥＭＢＯ Ｊ １２：２
７２３−２７３０ Ｗａｌｋｅｒ ＫＡ，Ｙｕ ＰＣ，Ｓａｔｏ ＳＪ，Ｊ
ａｗｏｒｓｋｉ ＥＧ（１９７８） インビトロで培養
したメジカゴ サチバ Ｌ．のカルスにおける組織形成
のホルモン制御。Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ．６５（６），
６５４−６５９ Ｗａｌｋｅｒ ＫＡ，Ｓａｔｏ ＳＪ（１９８１） メ
ジカゴ サチバのカルス組織における形態形成：体細胞
アンブリオ形成におけるアンモニウムイオンの役割。Ｐ
ｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．
１，１０９−１２１ Ｗｕｌｌｅｍｓ ＧＪ．Ｍｏｌｅｎｄｉｊｋ Ｌ，Ｏｏ
ｍｓ Ｇ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ＲＡ（１９８
１） ニコチアナ タバクムから誘導した細胞壁再生原
形質体のインビトロ アガロバクテリウム ツメファシ
エンス−誘導形質転換後に得られる形質転換物における
クラウンガール腫瘍の発現の差。ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ７８：４３４４−４３４８ Ｙａｎｉｓｃｈ−ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｃｉｒａ，
Ｊ及びＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎｅ ３
３，１０３−１１９ Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ Ｐ，Ｊｏｏｓ Ｈ，Ｇｅｎｅｔｅ
ｌｌｏ Ｃ，ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ Ｍ，Ｓｃｈｅｌ
ｌ Ｊ（１９８３） 正常な再生能力を変えることな
く、植物細胞にＤＮＡを導入するためのＴｉ−プラスミ
ドベクター。ＥＭＢＯ Ｊ １２：２１４３−２１５０ さらに以下の公開特許出願を挙げることができる： ＥＰ−Ａ １１６，７１８ ＥＰ−Ａ １５９，４１８ ＥＰ−Ａ １２０，５１５ ＥＰ−Ａ １２０，５１６ ＥＰ−Ａ １７２，１１２ ＥＰ−Ａ １４０，５５６ ＥＰ−Ａ １７４，１６６ ＥＰ−Ａ １２２，７９１ ＥＰ−Ａ １２６，５４６ ＥＰ−Ａ １６４，５９７ ＥＰ−Ａ １７５，９６６ ＥＰ−Ａ ２７０，８２２ ＷＯ ８４／０２９１３ ＷＯ ８４／０２９１９ ＷＯ ８４／０２９２０ ＷＯ ８３／０１１７６
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/11 15/70 15/82 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 8114−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ペーター・シユライアー ドイツ連邦共和国デー5000ケルン１・ダツ セルシユトラーセ16 (72)発明者 トーマス・ハーゲツト イギリス・ロンドン ダブリユーシーエイ ３ピーエツクス・リンカーンズインフイ ールズ・インペリアルキヤンサーリサーチ フアンド内 (72)発明者 ジエフ・シエル ドイツ連邦共和国デー5000ケルン30・カー ル−フオン−リン−ベーク12
Claims (15)
- 【請求項１】 植物からの耐性遺伝子において、病原体
により特異的に誘導することができ、以下の配列のｃＤ
ＮＡに対応するＤＮＡ配列を含むことを特徴とする遺伝
子： 【表１】 - 【請求項２】 請求項１に記載の耐性遺伝子の調節部
分。 - 【請求項３】 請求項１に記載の耐性遺伝子の構造遺伝
子。 - 【請求項４】 以下の配列のＤＮＡ。 【表２】
- 【請求項５】 組み替え原核、又は真核ＤＮＡにおい
て、”外部”ＤＮＡあるいは”付加”ＤＮＡとして１種
類かそれ以上の耐性遺伝子、又は遺伝子単位、及び／又
はその部分、及び／又は請求項１−４に記載のＤＮＡを
含むＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項１に記載の組み替えＤＮＡにおい
て、植物細胞（原形質体を含む）、又は植物（植物の一
部、又は種子を含む）に含まれることを特徴とするＤＮ
Ａ。 - 【請求項７】 １種類かそれ以上の耐性遺伝子、又は遺
伝子単位、あるいはその一部、及び／又は請求項１−４
に記載のＤＮＡ、及び／又は請求項５に記載の組み替え
ＤＮＡを含むベクター。 - 【請求項８】 プラスミド ｐＲ３−７。
- 【請求項９】 形質転換した微生物において、１種類か
それ以上の耐性遺伝子、又は遺伝子単位、あるいはその
一部、及び／又は請求項１−４に記載のＤＮＡ、及び／
又は請求項５に記載の組み替えＤＮＡを含むことを特徴
とする微生物。 - 【請求項１０】 大腸菌株ＲＧ−２（ＤＳＭ ６１４
９）、及びその変異株。 - 【請求項１１】 植物細胞（原形質体を含む）、及び植
物（植物の一部、又は種子を含む）の形質転換におけ
る、請求項１−１０に記載の耐性遺伝子、及び／又はそ
の一部、及び／又はＤＮＡ、及び／又はベクター、及び
／又は形質転換した微生物の利用。 - 【請求項１２】 ”外部”あるいは”付加”ＤＮＡとし
て１種類かそれ以上の耐性遺伝子、及び／又はその一
部、及び／又は請求項１−５に記載のＤＮＡを含むトラ
ンスジェニック植物細胞（原形質体を含む）、及び植物
（植物の一部、又は種子を含む）。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載のトランスジェニッ
ク植物細胞（原形質体を含む）、及び植物（植物の一
部、又は種子を含む）の製造法において、 （ａ）１種類かそれ以上の耐性遺伝子、及び／又はその
一部、及び／又は請求項１−５に記載のＤＮＡを植物細
胞（原形質体を含む）のゲノムに挿入し、場合によって
は （ｂ）形質転換植物細胞（原形質体を含む）から完全な
トランスジェニック植物を再生し、場合によっては （ｃ）得られる親世代、又はそこから誘導した下位世代
のトランスジェニック植物から、植物の所望の部分（種
子を含む）を得ることを特徴とする方法。 - 【請求項１４】 請求項１に記載の耐性遺伝子、及び／
又はその一部の探索、単離、精製、及び／又は検出にお
けるプローブとしての、請求項４に記載のＤＮＡの利
用。 - 【請求項１５】 病原体により特異的に誘導し、請求項
４に記載のｃＤＮＡをプローブとして用いて単離するこ
とができる、植物からの耐性遺伝子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4031758.7 | 1990-10-06 | ||
| DE4031758A DE4031758A1 (de) | 1990-10-06 | 1990-10-06 | Resistenz-gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576373A true JPH0576373A (ja) | 1993-03-30 |
Family
ID=6415782
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3281936A Pending JPH0576373A (ja) | 1990-10-06 | 1991-10-03 | 耐性遺伝子 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0480236A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0576373A (ja) |
| AU (1) | AU8553991A (ja) |
| DE (1) | DE4031758A1 (ja) |
| IL (1) | IL99642A0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021016369A (ja) * | 2019-07-23 | 2021-02-15 | 大成建設株式会社 | 還元剤の還元状態の持続性向上方法、持続性が向上した還元剤、この還元剤を含む培地、及び、この培地を用いる嫌気性微生物の培養方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2675946A1 (en) | 2007-01-19 | 2008-07-24 | Lionel Navarro | Methods and compositions for modulating the sirna and rna-directed-dna methylation pathways |
Family Cites Families (3)
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|---|---|---|---|---|
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| ES2199931T3 (es) * | 1989-03-24 | 2004-03-01 | Syngenta Participations Ag | Plantas transgenicas resistentes a enfermedades. |
-
1990
- 1990-10-06 DE DE4031758A patent/DE4031758A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-09-24 EP EP19910116249 patent/EP0480236A3/de not_active Withdrawn
- 1991-10-02 AU AU85539/91A patent/AU8553991A/en not_active Abandoned
- 1991-10-03 JP JP3281936A patent/JPH0576373A/ja active Pending
- 1991-10-03 IL IL99642A patent/IL99642A0/xx unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021016369A (ja) * | 2019-07-23 | 2021-02-15 | 大成建設株式会社 | 還元剤の還元状態の持続性向上方法、持続性が向上した還元剤、この還元剤を含む培地、及び、この培地を用いる嫌気性微生物の培養方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0480236A2 (de) | 1992-04-15 |
| EP0480236A3 (en) | 1992-11-19 |
| AU8553991A (en) | 1992-04-09 |
| DE4031758A1 (de) | 1992-04-09 |
| IL99642A0 (en) | 1992-08-18 |
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