ES2199931T3 - Plantas transgenicas resistentes a enfermedades. - Google Patents
Plantas transgenicas resistentes a enfermedades.Info
- Publication number
- ES2199931T3 ES2199931T3 ES90105336T ES90105336T ES2199931T3 ES 2199931 T3 ES2199931 T3 ES 2199931T3 ES 90105336 T ES90105336 T ES 90105336T ES 90105336 T ES90105336 T ES 90105336T ES 2199931 T3 ES2199931 T3 ES 2199931T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sequence
- plant
- dna
- encoded
- cdna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01039—Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase (3.2.1.39)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
- C12N15/8239—Externally regulated expression systems pathogen inducible
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/244—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01006—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01058—Glucan 1,3-beta-glucosidase (3.2.1.58)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01073—Licheninase (3.2.1.73)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fertilizers (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Hydroponics (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
EL PRESENTE INVENTO SE REFIERE A LOS CONSTRUCTORES DEL ADN QUIMERICO, UTIL PARA LA PRODUCCION DE PLANTAS TRANSGENICAS RESISTENTES A LAS ENFERMEDADES Y A LA INGENIERIA GENETICA, QUE PRODUCE EL FENOTIPO DE LA RESISTENCIA A LAS ENFERMEDADES. EN PARTICULAS, SE REFIERE A LA EXPRESION CONSTITUTIVA DE LAS SECUENCIAS DE ADN EN LAS PLANTAS TRANSGENICAS, QUE CODIFICAN LAS PROTEINAS RELACIONADAS CON LA PATOGENESIS (PRPS). UN OBJETIVO POSTERIOR DEL PRESENTE INVENTO, SON LOS NIVELES INDUCIDOS DE PRPS DE LAS PLANTAS TRANSGENICAS O DE LAS PROTEINAS HOMOLOGAS QUE PROPORCIONAN UN FENOTIPO RESISTENTE A LAS ENFERMEDADES POTENCIADO, CON RESPECTO A LAS PLANTAS SILVESTRES. OTRO OBJETIVO ES PROPORCIONAR RAMAS DE MRNA, QUE TRANSCRIBEN A LAS PLANTAS TRANGENICAS, DE LAS SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN LAS PRPS DE LA PLANTA O RAMAS DE MRNA DE LAS SECUENCIAS DE ADN HOMOLOGAS A LAS SECUENCIAS DE CDNA O GENOMICAS QUE CODIFICAN A LAS PRPS DE LAS PLANTAS. LAS PLANTAS TRANGENICAS TIENEN, POR TANTO, UN FENOTIPO DE RESITENCIA A LAS ENFERMEDADES POTENCIADO, CON RESPECTO A LAS PLANTAS SILVESTRES.
Description
Plantas transgénicas resistentes a
enfermedades.
La presente invención se refiere a construcciones
de ADN quimérico útiles para producir plantas transgénicas
resistentes a enfermedades y para modificar plantas por ingeniería
genética para producir el fenotipo de resistencia a enfermedades. En
particular, se refiere a la expresión constitutiva en plantas
transgénicas de secuencias de ADN que codifican proteínas
relacionadas con la patogénesis (PRP). Las plantas de tipo
silvestre expresan PRP durante la resistencia sistémica adquirida
inducida por patógenos.
Los avances en la tecnología del ADN
recombinante, junto con los avances en la tecnología de la
transformación y la regeneración de plantas, han hecho posible
introducir un nuevo material genético en células vegetales, plantas
o tejidos vegetales, introduciendo de esta manera nuevos rasgos,
por ejemplo, fenotipos, que mejoran el valor de la planta o del
tejido vegetal. Las recientes demostraciones de plantas modificadas
por ingeniería genética resistentes a patógenos (documentos EP 0 240
322 y EP 0 223 452) o insectos (Vaeck et al., 1987) y la producción
de plantas tolerantes a herbicidas (de Block et al., 1987) subrayan
la posibilidad de mejorar los cultivos. Los cultivos diana pueden
variar de plantas leñosas tales como árboles y arbustos a plantas
ornamentales y a cultivos extensivos.
Cutt et al. (1988) J. Cell Biochem., Suppl. 12c,
Abstract Y210, investiga el estado de resistencia a patógenos de
plantas transgénicas transformadas con construcciones de proteínas
PR, pero no describe resultados ni datos sobre tales plantas.
Ahora puede conseguirse la producción de plantas
transgénicas que sean resistentes a enfermedades, por medio de la
presente invención que se refiere a, entre otras cosas,
construcciones de ADN quimérico útiles para producir plantas
transgénicas resistentes a enfermedades. Las construcciones de ADN
quimérico contienen una secuencia de ADN codificante que codifica
una PRP vegetal que normalmente se induce por patógenos en una
planta de tipo silvestre, y una secuencia de ADN promotora que
permite la expresión constitutiva de PRP o ARNm
anti-sentido para PRP en una planta transgénica que
contiene la construcción de ADN quimérico.
Las denominadas proteínas relacionadas con la
patogénesis (PRP) son proteínas vegetales inducidas después de la
infección por un patógeno. Se cree que estas proteínas pueden jugar
un papel para proporcionar resistencia sistémica adquirida a la
planta. Estas proteínas vegetales se inducen en grandes cantidades
en respuesta a la infección por diversos patógenos, incluyendo
virus, bacterias y hongos. Las PRP se descubrieron primero en
plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) que reaccionaban de
forma hipersensible a la infección por el virus del mosaico del
tabaco (TMV). Posteriormente, se han encontrado PRP en muchas
especies vegetales (como revisiones, véase Redolfi, 1983; van Loon,
1985) y se cree que son una respuesta defensiva común de las
plantas a la infección por patógenos.
Como se usa en este documento, las PRP son
proteínas expresadas en plantas que reaccionan de forma
hipersensible con patógenos. Este término incluye, pero sin
limitación, las proteínas SAR8.2a y SAR8.2b, las formas ácidas y
básicas de las proteínas PR-1a,
PR-1b, PR-1c,
PR-1', PR-2, PR-N,
PR-O, PR-O', PR-P,
PR-Q, PR-S y PR-R
del tabaco, la quitinasa, que es un homólogo básico de
PR-P o PR-Q, y la
\beta-1,3-glucanasa (glucan
endo-1,3-\beta-glucosidasa,
EC 3.2.1.39), que es un homólogo básico de PR-2,
PR-N o PR-O, y la quitinasa
inducible por patógenos del pepino. Una reacción hipersensible se
caracteriza por una necrosis local de los tejidos que rodean
inmediatamente al sitio de infección por el patógeno y la
localización posterior del patógeno. Esta reacción es diferente de
una reacción sensible, donde el patógeno se extiende a lo largo de
toda la planta. Son patógenos, por ejemplo, virus o viroides, por
ejemplo, el virus del mosaico del tabaco o del pepino, el virus de
manchas anulares o virus de necrosis, el virus del enrollamiento de
la hoja del pelargonio, el virus del moteado del trébol rojo, el
virus de la atrofia del tomate y virus similares, hongos, por
ejemplo, Phytophthora parasitica o Peronospora
tabacina, bacterias, por ejemplo, Pseudomonas syringae o
Pseudomonas tabaci, o áfidos, por ejemplo, Myzus
pericae. Esta lista no pretende ser limitante en ningún
aspecto.
En la técnica se conocen diversos métodos para
realizar la transformación genética de plantas y tejidos vegetales
(es decir, la introducción estable de ADN extraño en plantas).
Éstos incluyen la transformación por especies de
Agrobacterium y la transformación por transferencia génica
directa.
Agrobacterium tumefaciens es el agente
etiológico de las agallas de corona, un enfermedad de una amplia
serie de dicotiledóneas y gimnospermas, que ocasiona la formación de
tumores o agallas en el tejido vegetal en el sitio de la infección.
Agrobacterium, que normalmente infecta a la planta en sitios
de heridas, lleva un elemento extracromosómico grande denominado
plásmido Ti (inductor de tumores).
Los plásmidos Ti contienen dos regiones
requeridas para la tumorigenicidad. Una región es el
ADN-T (ADN transferido) que es la secuencia de ADN
que se encuentra finalmente transferida de forma estable en el ADN
genómico de la planta. La otra región requerida para la
tumorigenicidad es la región vir (virulencia), que se ha
implicado en el mecanismo de transferencia. Aunque la región
vir es absolutamente necesaria para una transformación
estable, el ADN de vir no se transfiere realmente a la
planta infectada. La transformación de células vegetales mediada por
la infección con A. tumefaciens y la transferencia posterior
del ADN-T solo están bien documentadas (Bevan y
Chilton, 1982).
Después de varios años de investigación intensa
en muchos laboratorios, el sistema de Agrobacterium se ha
desarrollado para permitir la transformación rutinaria de una
diversidad de tejidos vegetales. Los tejidos representativos
transformados de esta manera incluyen tabaco, tomate, girasol,
algodón, colza, patata, soja y álamos. Aunque se sabe que la serie
de hospedadores para la transformación con el plásmido Ti usando
A. tumefaciens como agente de infección es muy grande, el
tabaco ha sido el hospedador elegido debido a su fácil
manipulación.
También se ha usado Agrobacterium
rhizogenes como vector para la transformación de plantas. Esta
bacteria, que estimula la formación de raíces vellosas en muchas
especies de plantas dicotiledóneas, lleva un elemento
extracromosómico grande denominado plásmido Ri (inductor de raíces)
que funciona de una manera análoga al plásmido Ti de A.
tumefaciens. La transformación usando A. rhizogenes se
ha desarrollado de forma análoga a la de A. tumefaciens y se
ha utilizado satisfactoriamente para transformar, por ejemplo,
alfalfa, Solanum nigrum L. y álamos.
Se han creado varios procedimientos denominados
procedimientos de transferencia génica directa para transformar
plantas y tejidos vegetales sin el uso de un intermedio de
Agrobacterium. En la transformación directa de protoplastos,
la absorción de material genético exógeno en un protoplasto puede
potenciarse por medio del uso de un agente químico o campo
eléctrico. El material exógeno después puede integrarse en el
genoma nuclear. El primer trabajo se realizó en la planta
dicotiledónea tabaco, donde se demostró que el ADN extraño se
incorporaba y se transmitía a plantas de la progenie (Paszkowski et
al., 1984; Potrykus et al., 1985).
Por este procedimiento también se han
transformado protoplastos de monocotiledóneas en, por ejemplo,
Triticum monococcum, Lolium multiflorum (ballico
italiano), maíz y maíz dulce mejicano negro.
Como alternativa, el ADN exógeno puede
introducirse en células o protoplastos por microinyección. Una
solución de ADN plasmídico se inyecta mecánicamente de forma directa
en la célula, normalmente usando una aguja de vidrio fina. De esta
manera, se han transformado protoplastos de alfalfa por una
diversidad de plásmidos (Reich et al., 1986).
Un procedimiento desarrollado más recientemente
para la transferencia génica directa implica el bombardeo de
células por microproyectiles que llevan ADN (Klein et al., 1987).
En este procedimiento, se aceleran partículas de tungsteno
recubiertas con el ADN exógeno hacia las células diana,
obteniéndose la expresión al menos transitoria en el ejemplo
indicado (cebolla).
Al igual que existe una diversidad de métodos
para la transformación de tejidos vegetales, también existe una
diversidad de métodos para la regeneración de plantas a partir de
tejidos vegetales. El método particular de regeneración dependerá
del tejido vegetal de partida y de la especie vegetal particular a
regenerar. En los últimos años, ha sido posible regenerar muchas
especies de plantas a partir de tejidos de callo obtenidos a partir
de explantes vegetales. Las plantas que puede regenerarse a partir
de callos incluyen monocotiledóneas tales como maíz, arroz, cebada,
trigo y centeno, y dicotiledóneas tales como tomate, girasol, soja,
algodón, colza y tabaco.
Se ha demostrado la regeneración de plantas a
partir de tejidos transformados con A. tumefaciens para
varias especies de plantas. Éstas incluyen girasol, tomate, trébol
blanco, algodón, tabaco y álamos. También se ha demostrado la
regeneración de alfalfa a partir de un tejido transformado con
A. rhizogenes. La regeneración de plantas a partir de
protoplastos es una técnica particularmente útil (Evans y Bravo,
1983). Cuando una especie vegetal puede regenerarse a partir de
protoplastos, pueden utilizarse procedimientos de transferencia
génica directa, y la transformación no es dependiente del uso de
A. tumefaciens. Se ha demostrado la regeneración de plantas a
partir de protoplastos para el arroz, tabaco, colza, patata,
berenjena, pepino, álamos y maíz.
Para la transformación con ADN extraño pueden
utilizarse diversos tejidos vegetales. Por ejemplo, se han
utilizado cultivos de vástagos de cotiledón de tomate para la
transformación mediada por Agrobacterium y la regeneración de
plantas (documento EP 0 249 432). Otros ejemplos incluyen especies
de Brassica (documento WO 87/07299) y especies de plantas
leñosas, particularmente álamos (documento US 4.795.855).
Uno de los objetos de la presente invención es
proporcionar plantas transgénicas que expresen constitutivamente
niveles inducidos de PRP vegetales o proteínas substancialmente
homólogas. Otro objeto es proporcionar plantas transgénicas que
expresen constitutivamente tales proteínas, proporcionando un
fenotipo resistente a enfermedades con respecto a las plantas de
tipo silvestre. Otro objeto de la presente invención es
proporcionar plantas transgénicas que transcriban constitutivamente
cadenas de ARNm con sentido o anti-sentido de
secuencias de ADN que codifican PRP vegetales o que transcriban
cadenas de ARNm con sentido o anti-sentido de
secuencias de ADN substancialmente homólogas a secuencias genómicas
o de ADNc que codifican PRP vegetales, teniendo tales plantas
transgénicas de esta manera un mejor fenotipo resistente a
enfermedades con respecto a las plantas de tipo silvestre.
Por consiguiente, para cumplir estos objetivos y
otros, la presente invención descrita en este documento incluye
- (a)
- construcciones de ADN quimérico útiles para producir plantas transgénicas resistentes a enfermedades, que comprenden una primera secuencia de ADN que promueve en una planta la transcripción constitutiva de la segunda secuencia de ADN, y una segunda secuencia de ADN que es una secuencia codificante de una PRP vegetal inducible o una secuencia codificante que tiene una homología de secuencia substancial con una secuencia codificante de una PRP vegetal inducible;
- (b)
- vectores que contienen tales construcciones de ADN quimérico; y
- (c)
- plantas transgénicas, tejido vegetal transgénico, propágulos y semillas de plantas transgénicas que contienen las construcciones de ADN quimérico para producir plantas resistentes a enfermedades.
En particular, la presente invención describe una
secuencia de ADN quimérico que comprende:
- (a)
- una primera secuencia de ADN que promueve en una planta la transcripción constitutiva de una segunda secuencia de ADN; y
- (b)
- una segunda secuencia de ADN que comprende una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, o una secuencia codificante que tiene una homología de secuencia substancial con una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, estando dicha segunda secuencia de ADN en una orientación con sentido o anti-sentido con respecto a dicha primera secuencia de ADN.
Se prefiere una secuencia de ADN quimérico, donde
la primera secuencia de ADN es de origen heterólogo con respecto a
la segunda secuencia de ADN.
Se prefiere especialmente una secuencia de ADN
quimérico, donde la primera secuencia de ADN comprende el promotor
de la subunidad pequeña de la ribulosa bis-fosfato
carboxilasa (RUBISCO) de tabaco o un promotor doble 35S de CaMV.
La segunda secuencia del ADN quimérico
preferiblemente codifica una proteína relacionada con la
patogénesis de plantas que se selecciona entre el grupo compuesto
por PR-1A, PR-1B,
PR-1C, PR-R mayoritaria,
PR-R minoritaria, PR-P,
PR-Q, PR-2, PR-N,
PR-O, PR-O', SAR8.2a, SAR8.2b
quitinasa/lisozima de pepino, peroxidasa básica de pepino, glucanasa
básica de tabaco y quitinasa básica de tabaco.
También se prefiere una secuencia de ADN
quimérico, donde la segunda secuencia de ADN codifica una proteína
relacionada con la patogénesis de plantas seleccionada entre el
grupo compuesto por PR-1A, PR-1B,
PR-1C,
\hbox{PR-R}mayoritaria, PR-R minoritaria, PR-P, PR-Q, PR-O', SAR8.2a, SAR8.2b quitinasa/lisozima de pepino, glucanasa básica de tabaco y quitinasa básica de tabaco.
Se prefiere especialmente una secuencia de ADN
quimérico, donde la segunda secuencia de ADN codifica una proteína
relacionada con la patogénesis de plantas seleccionada entre el
grupo compuesto por PR-R mayoritaria,
\hbox{PR-R}minoritaria, PR-P, PR-Q, PR-2, PR-N, PR-O, PR-O', SAR8.2a, SAR8.2b quitinasa/lisozima de pepino, peroxidasa básica de pepino, glucanasa básica de tabaco y quitinasa básica de tabaco.
También se describen moléculas de ADN
recombinante que contienen una secuencia de ADN quimérico de
acuerdo con la presente invención.
Preferiblemente, una molécula de ADN recombinante
se caracteriza porque es una molécula de vector. Se prefiere
especialmente una molécula de vector que comprende pCGN1703.
Un método para producir las secuencias de ADN
quimérico anteriores, comprendiendo el método:
- (a)
- preparar a partir de una fuente adecuada tal como, por ejemplo, un gen RUBISCO vegetal o un genoma de CaMV, una primera secuencia de ADN que promueva en una planta la transcripción constitutiva de una segunda secuencia de ADN;
- (b)
- preparar una biblioteca de ADN a partir de un patógeno infectado o de un tejido vegetal infectado y no infectado, comprendiendo de esta manera dicha biblioteca de ADN poblaciones de ADN tanto inducidas como no inducidas, y aislar a partir de la misma una segunda secuencia de ADN que comprenda una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, o una secuencia codificante que tenga una homología de secuencia substancial con una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible; y
- (c)
- unir de forma operativa la primera secuencia de ADN de la etapa (a) con la segunda secuencia de ADN de la etapa (b) de tal forma que dicha primera secuencia de ADN promueva la transcripción de la segunda secuencia de ADN usando métodos conocidos en la técnica.
La unión de la primera y la segunda secuencias de
ADN preferiblemente se realiza de tal forma que la segunda
secuencia de ADN esté en una orientación con sentido o
anti-sentido con respecto a dicha primera secuencia
de ADN.
La presente invención también comprende plantas,
tejidos vegetales, propágulos de plantas o semillas vegetales que
contienen una cualquiera de las secuencias de ADN quimérico
descritas anteriormente, así como métodos para su producción.
Dentro de la presente invención se prefiere una
planta transgénica que expresa constitutivamente niveles inducidos
de proteínas relacionadas con la patogénesis de plantas, que
proporciona un fenotipo resistente a enfermedades.
También se prefiere una planta transgénica que
transcribe de forma constitutiva cadenas con sentido o
anti-sentido de secuencias de ADN que codifican una
proteína relacionada con la patogénesis de plantas, que proporciona
un fenotipo resistente a enfermedades.
Se prefiere especialmente una planta, tejido
vegetal, propágulos vegetales o semillas vegetales que contienen
una secuencia de ADN quimérico que comprende una primera secuencia
de ADN que comprende el promotor de la subunidad pequeña de la
ribulosa bis-fosfato carboxilasa (RUBISCO) de
tabaco y una segunda secuencia de ADN que comprende la secuencia
codificante de la proteína relacionada con la patogénesis
PR-1A, donde la segunda secuencia de ADN está
orientada con respecto a la primera secuencia de ADN de tal forma
que la primera secuencia de ADN promueve la transcripción de la
cadena anti-sentido de la segunda secuencia de
ADN.
En este documento también se proporciona un
método para producir una célula vegetal o tejido vegetal
transgénico con potencial para regenerar una planta entera que
presenta un fenotipo resistente a enfermedades, que comprende
transformar la célula o el tejido vegetal, que puede existir en
forma de un cultivo in vitro o como parte de un embrión o una
planta entera, con una secuencia de ADN quimérico que comprende una
primera secuencia de ADN que promueve en una planta la
transcripción constitutiva de una segunda secuencia de ADN, y una
segunda secuencia de ADN que comprende una secuencia codificante de
una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, o
una secuencia codificante que tiene una homología de secuencia
substancial con una secuencia codificante de una proteína
relacionada con la patogénesis de plantas inducible, uniéndose dicha
primera secuencia de ADN a la segunda secuencia de ADN de tal forma
que promueva la transcripción de la segunda secuencia de ADN.
La transformación de células vegetales o tejidos
vegetales puede realizarse por medio de los métodos de
transformación descritos anteriormente en este documento usando una
célula vegetal o un tejido vegetal aislado que forma parte de un
cultivo celular o tisular o una célula vegetal o tejido vegetal que
forma parte de un embrión vegetal o de una planta entera.
También se prefiere un método para producir una
célula vegetal o tejido vegetal transgénico, donde la segunda
secuencia de ADN está en una orientación con sentido o
anti-sentido con respecto a dicha primera secuencia
de ADN.
En este documento también se proporcionan nuevos
clones de ADNc que codifican para PRP vegetales. Dentro de la
presente invención, se prefieren las siguientes secuencias de ADNc
substancialmente puras:
- (1)
- una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica SAR8.2a, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica SAR8.2a, pero, en particular, el plásmido pCIB/SAR8.2a, con el número de acceso ATCC 40584, depositado el 22 de marzo de 1989.
- (2)
- Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica SAR8.2b, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica SAR8.2b, pero, en particular, el plásmido pCIB/SAR8.2b, con el número de acceso ATCC 40585, depositado el 22 de marzo de 1989.
- (3)
- Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica PR-P, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica PR-P, pero, en particular, el plásmido pBScht28, con el número de acceso ATCC 40588, depositado el 24 de marzo de 1989.
- (4)
- Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica PR-2, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica PR-2, pero, en particular, el plásmido pBSGL117, con el número de acceso ATCC 40691, depositado el 19 de octubre de 1989.
- (5)
- Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica PR-N, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica PR-N, pero, en particular, el plásmido pBSGL148, con el número de acceso ATCC 40689, depositado el 19 de octubre de 1989.
\newpage
- (6)
- Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica PR-O, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica PR-O, pero, en particular, el plásmido pBSGL134, con el número de acceso ATCC 40690, depositado el 19 de octubre de 1989.
- (7)
- Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica PR-2', o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica PR-2', pero, en particular, el plásmido pBSGL135, con el número de acceso ATCC 40685, depositado el 19 de octubre de 1989.
- (8)
- Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica la peroxidasa de pepino, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica la peroxidasa de pepino, pero, en particular, el plásmido pBPERI, con el número de acceso ATCC 40686, depositado el 19 de octubre de 1989, o el plásmido pBPERB24, con el número de acceso respectivo ATCC 40687, depositado el 19 de octubre de 1989.
- (9)
- Una secuencia de ADN substancialmente pura de la "secuencia 6" o que tiene una homología de secuencia substancial con la secuencia mostrada en la "secuencia 6".
- (10)
- Una secuencia de ADN substancialmente pura de la "secuencia 9" o que tiene una homología de secuencia substancial con la secuencia mostrada en la "secuencia 9".
- (11)
- Una secuencia de ADN substancialmente pura de la "secuencia 10" o que tiene una homología de secuencia substancial con la secuencia mostrada en la "secuencia 10".
También se proporciona un nuevo método para la
selección diferencial y enriquecimiento de poblaciones de ADNc, que
comprende
- (a)
- proporcionar un ADNc monocatenario a partir de poblaciones de ADNc inducidas y no inducidas, teniendo el ADNc monocatenario procedente de las poblaciones inducida y no inducida una polaridad opuesta de ADN, y teniendo el ADNc de la población no inducida una señal de afinidad de biotina;
- (b)
- hibridar las poblaciones de ADNc monocatenario de la etapa (a) entre sí; y
- (c)
- separar la mezclar hibridada de la etapa (b) por cromatografía de biotina-avidina para enriquecer la población inducida en ADNc monocatenarios que no se hibridan con el ADNc de la población no inducida.
También se proporciona un método para clonar
moléculas de ADNc que codifiquen proteínas de resistencia a
enfermedades, que comprende:
- (a)
- proporcionar un tejido en el que se ha inducido resistencia adquirida sistémica o resistencia adquirida localizada usando inductores biológicos, y
- (b)
- aislar clones de ADNc que codifiquen proteínas de resistencia a enfermedades. Aunque previamente se han producido ADNc a partir de ARN aislado de material infectado con patógenos, éste el primer ejemplo de la producción de ADNc a partir de ARN aislado de porciones no infectadas de la planta en la que se ha inducido resistencia por patógenos. Es decir, el tejido no se infecta por los patógenos, y demuestra resistencia adquirida.
Los genes quiméricos de los presentes ejemplos
que se describen más adelante comprenden secuencias de ADNc
vegetales que codifican PRP. Sin embargo, esta invención se aplica
igualmente a clones genómicos y secuencias homólogas sintéticas que
codifican PRP o proteínas que tienen una homología substancial con
las mismas. De esta manera, el alcance de las reivindicaciones de
la presente invención no pretende limitarse a las realizaciones
específicas descritas.
Se han realizado los siguientes depósitos en la
ATCC de acuerdo con el Tratado de Budapest:
Plásmido | Nº de Acceso ATCC | Fecha de Depósito |
CGN783 | 67868 | 23 de diciembre de 1988 |
pBS-Gluc 39.1 | 40526 | 29 de diciembre de 1988 |
pBScucchi/quitinasa (aka pBScuccht5) | 40528 | 29 de diciembre de 1988 |
pBSGL6e. | 40535 | 18 de enero de 1989 |
pCIB/SAR8.2a | 40584 | 22 de marzo de 1989 |
(Continuación)
Plásmido | Nº de Acceso ATCC | Fecha de Depósito |
pCIB/SAR8.2b | 40585 | 22 de marzo de 1989 |
pCGN1540 | 40586 | 22 de marzo de 1989 |
pCGN2113 | 40587 | 22 de marzo de 1989 |
pBScht28 | 40588 | 24 de marzo de 1989 |
pBSGL135 | 40685 | 19 de octubre de 1989 |
pBSPER1 | 40686 | 19 de octubre de 1989 |
pBSPERB24 | 40687 | 19 de octubre de 1989 |
pBSPERB25 | 40688 | 19 de octubre de 1989 |
pBSGL148 | 40689 | 19 de octubre de 1989 |
pBSGL134 | 40690 | 19 de octubre de 1989 |
pBSGL117 | 40691 | 19 de octubre de 1989 |
pBSGL125 | 40692 | 19 de octubre de 1989 |
\lambda tobcDNAGL 162* | 40693 | 19 de octubre de 1989 |
\lambda tobcDNAGL 153* | 40694 | 19 de octubre de 1989 |
\lambda tobcDNAGL 161* | 40695 | 19 de octubre de 1989 |
* en Escherichia coli |
Para proporcionar una comprensión clara y
consistente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones,
incluyendo el alcance proporcionado a tales términos, se
proporcionan las siguientes definiciones:
Secuencia o gen quimérico: Una secuencia
de ADN que contiene al menos dos partes heterólogas, por ejemplo,
partes derivadas de secuencias de ADN naturales que no están
asociadas en sus estados naturales, o que contiene al menos una
parte que es de origen sintético y no se encuentra en la
naturaleza.
Secuencia de ADN codificante: Una
secuencia de ADN que, cuando se transcribe y se traduce, ocasiona
la formación de un polipéptido celular.
Transcripción constitutiva: Transcripción
de cantidades substancialmente fijas de una secuencia de ADN,
independientemente de las condiciones ambientales.
Gen: Una región cromosómica discreta que
es responsable de un producto celular discreto.
Inductores: Moléculas que ocasionan la
producción de cantidades mayores de macromoléculas, en comparación
con las cantidades encontradas en ausencia del inductor.
Proteína inducible: Proteínas cuya
velocidad de producción puede aumentarse por la presencia de
inductores en el medio.
Secuencia de ADN no codificante: Una
secuencia de ADN que no se traduce dando como resultado la
formación de un polipéptido celular cuando se asocia con una
secuencia de ADN codificante particular. De esta manera, por
ejemplo, una secuencia que no es codificante cuando se asocia con
una secuencia codificante puede ser realmente codificante cuando se
asocia con otra secuencia codificante o no codificante.
Rasgo fenotípico: Una propiedad observable
resultante de la expresión de un gen.
Tejido vegetal: Cualquier tejido de una
planta en plantación o en cultivo. Esta expresión incluye, pero sin
limitación, plantas enteras, células vegetales, órganos vegetales,
semillas vegetales, protoplastos, callos, cultivos celulares y
cualquier grupo de células vegetales organizadas en unidades
estructurales y/o funcionales. El uso de esta expresión junto con o
en ausencia de cualquier tipo específico de tejido vegetal tal como
se indicado anteriormente o se incluye de otra forma por esta
definición, no pretende excluir ningún otro tipo de tejido
vegetal.
Secuencia de ADN substancialmente pura:
Una secuencia de ADN aislada en forma substancialmente pura a
partir de una fuente natural o no natural. Tal secuencia puede
existir en un sistema natural, por ejemplo, en bacterias, virus o en
células vegetales o animales, o puede proporcionarse, por ejemplo,
por medios sintéticos o como una secuencia de ADNc. Las secuencias
de ADN substancialmente puras normalmente se aíslan en forma de un
vector que comprende el ADN deseado. Substancialmente puro
significa que otras secuencias de ADN distintas de las deseadas
están presentes sólo en cantidades marginales, por ejemplo, menores
del 5%, menores del 1% o, preferiblemente, menores del 0,1%. Las
secuencias de ADN substancialmente puras y los vectores que las
contienen pueden proporcionarse, y típicamente se proporcionan, en
solución, por ejemplo en solución acuosa que contiene tampones o en
el medio de cultivo habitual.
Homología de secuencia substancial: La
homología de secuencia substancial significa una relación
estructural próxima entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos.
Por ejemplo, las secuencias de ADN substancialmente homólogas
pueden tener una homología del 60%, preferiblemente del 80 o el
90%, y las secuencias de aminoácidos substancialmente homólogas
típicamente pueden tener una homología del 50% o mayor. La
homología también incluye una relación en la que falta una o varias
subsecuencias de nucleótidos o aminoácidos, o están intercaladas
subsecuencias con nucleótidos o aminoácidos adicionales.
pb | pares de bases |
kb | kilopares de bases |
ATCC | American Type Culture Collection, Rockville, MD |
TMV | Virus del Mosaico del Tabaco |
TNV | Virus de la Necrosis del Tabaco |
HPLC | cromatografia líquida de alta presión |
Cvcpm | Cuentas de Cerenkov por minuto |
p/v | peso/volumen, excepto cuando se indique otra cosa |
ICF | fluido intracelular |
PAGE | electroforesis en gel de poliacrilamida |
PCR | Reacción en cadena catalizada por la polimerasa |
PCV | Volumen celular empaquetado: volumen de células sedimentadas en una pipeta |
MW | peso molecular |
LGT | baja temperatura de gelificación |
ATP | adenosina tri fosfato |
BSA | albúmina de suero bovino |
CETAB | bromuro de hexadeciltrimetilamonio |
2,4-D | ácido 2,4-diclorofenoxiacético |
DTT | ditiotreitol |
dicamba | ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico |
EDTA | ácido etilendiamina N,N,N',N'-tetraacético |
MES | ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico |
MU | 4-metil umbeliferil glucurónido |
PEG | polietilenglicol |
picloram | ácido 4-amino-3,5,6-ticloropicolínico |
SDS | dodecilsulfato sódico |
TFA | ácido trifluoroacético |
Tris-HCl | clorhidrato de tris(hidroximetil)metilamina |
PRP | proteínas relacionadas con la patogénesis |
CIAP | fosfatasa alcalina intestinal de ternero |
PTH | Feniltiohidantoína |
RUBISCO | ribulosa-1,5-bis-fosfato carboxilasa |
NAA | ácido \alpha-naftalenoacético |
BAP | 6-bencilaminopurina |
Las reacciones enzimáticas se realizan de acuerdo
con los procedimientos recomendados por el fabricante a menos que
se indique otra cosa. Los genes quiméricos y vectores de la
presente invención se construyen usando técnicas bien conocidas en
la técnica. Se han descrito técnicas adecuadas en Maniatis et al.
(1982); Methods in Enzymology, Volúmenes 68, 100, 101 y 118 (1979,
1983, 1938 y 1986); y Glover (1985). Se han descrito composiciones
de medio en Miller (1972), así como en las referencias
identificadas previamente.
Medio SH-0: medio de
Schenk y Hildebrandt (1972) sin hormonas. El medio SH puede ser
líquido o puede estar solidificado con agar al 0,8% o con GelRite®
al 0,5%. El medio normalmente se esteriliza por calor en un
autoclave a una temperatura de aproximadamente 125ºC durante un
período de 15 a 20 minutos.
Medio SH-30: medio
SH-0 que contiene Dicamba 30 \muM.
Medio de SH-45: medio
SH-0 que contiene Dicamba 45 \muM.
Medio OMS: Medio de Murashige y Skoog
(1962). El medio puede solidificarse con agar al 0,8% o agarosa o
con GelRite® al 0,5%.
Medio KM-8p y N6: Los macroelementos^{a}, microelementos^{a} y Fe-EDTA son como se proporcionan en la | ||
bibliografía: medio KM de acuerdo con Kao y Michayluk (1975); medio N6 de acuerdo con Chu et al., | ||
(1975) | ||
Medio: | KM-8p^{b,c,d} | N6 |
Ingredientes orgánicos y vitaminas^{e} [mg/l]: | ||
biotina | 0,01 | |
piridoxina-HCl | 1,00 | 0,5 |
tiamina-HCl | 10,00 | 0,1 |
nicotinamida | 1.00 | |
ácido nicotínico | 0,10 | 0,5 |
ácido fólico | 0,40 | |
D-Ca-pantotenato | 1,00 | |
ácido p-aminobenzoico | 0,02 | |
cloruro de colina | 1,00 | |
riboflavina | 0,20 | |
Vitamina B 12 | 0,02 | |
glicina | 0,10 | 2,0 |
Azúcares y alcoholes de azúcar [g/l]: | ||
sacarosa | 0,25 | 30,0 |
glucosa | 68,40 | |
manitol | 0,25 | |
sorbitol | 0,25 | |
celobiosa | 0,25 | |
fructosa | 0,25 | |
manosa | 0,25 | |
ramnosa | 0,25 | |
ribosa | 0,25 | |
xilosa | 0,25 | |
mio-inositol | 0,10 | |
pH final | 5,8 | 5,6 |
Esterilización | filtro | autoclave |
^{a} Los macroelementos normalmente
se obtienen como una solución madre concentrada 10 X, y los
microelementos como una solución madre concentrada 1000 X.
^{b} El ácido cítrico, fumárico y málico (cada uno a una
concentración final de 40 mg/l) y el piruvato sódico
(concentración final de 20 mg/l) se preparan como una solución madre
concentrada 100 X, ajustada a pH 6,5 con, NH_{4}OH y añadida a
este medio.
^{c} La adenina (concentración final de 0,1
mg/l) y la guanina, timidina, uracilo, hipoxantina y citosina
(cada una a una concentración final de 0,03 mg/l) se preparan como
una solución madre concentrada 1000 X, ajustada a pH 6,5 con
NH_{4}OH y añadida a este medio.
^{d} A este medio se
le añaden los siguientes aminoácidos usando una solución madre 10 X
(pH 6,5 con NH_{4}OH) para producir las concentraciones finales
dadas: glutamina (5,6 mg/l), alanina, ácido glutámico (cada uno a
0,6 mg/l), cisteína (0,2 mg/l), asparagina, ácido aspártico,
cistina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y
valina (cada uno a 0,1 mg/l).
^{e} La solución madre de
vitamina normalmente se prepara concentrada 100 X.
Agarosa: La preparación y purificación de
agarosa se describen por Guiseley y Renn (1975). La agarosa es uno
de los constituyentes del agar. El agar disponible en el mercado
normalmente consta de una mezcla de agarosa neutra y agaropectina
iónica con un gran número de grupos laterales. Normalmente
permanece intacto un cierto número de cadenas laterales y determina
las propiedades fisicoquímicas de la agarosa tal como la formación
de gel y la temperatura de fusión. Un agente de solidificación
preferido es la agarosa de bajo punto de fusión, especialmente la
agarosa SeaPlaque®.
Hidrolizado de caseína: Hidrolizado de
Caseína-Hidrolizado Enzimático de leche bovina,
Tipo 1, Sigma Co., PO. Box 14508, St. Louis, MO 63178, Estados
Unidos.
Celulasa RS: Celulasa RS, Yakult Honsha
Co. Ltd., 1.1.19 Higashi-Shinbashi,
Minato-Ku, Tokio, 105 Japón.
\underline{GelRite®}: GelRite Gellan Gum, Scott
Laboratories Inc., Fiskerville, R.I. 02823, Estados Unidos.
Kit de cebador aleatorio IBI: kit de
cebador aleatorio "Primer Time", International Biotechnologies
Inc., PO. Box 1565, New Haven, CT 07606, Estados Unidos.
\underline{Filtro Nalgene®}: Nalge Co.,
Division of Sybron Corp. Rochester, N.Y. 14602, Estados Unidos.
\underline{Parafilm®}: Película de laboratorio
Parafilm®-American Can Co. Greenwich, CT 06830, Estados Unidos.
ADN ligasa deT4: New England BioLabs
Gene-Screen Plus:
DuPont
Electroporador Dialog:
(DIA-LOG GmbH, D-4000 Düsseldorf 13,
República Federal de Alemania)
Sección
1
Este grupo de ejemplos describe manipulaciones
generales usadas para realizar los siguientes ejemplos
detallados.
Después de la digestión del ADN con endonucleasas
de restricción y la separación electroforética de los fragmentos en
un gel de agarosa TAE de bajo punto de fusión, se escinden las
bandas que contienen los fragmentos apropiados, se ponen en un tubo
de ensayo y éste se calienta a 65ºC para fundir la agarosa. Se
añaden de 2 a 5 \mul a 15 \mul de agua y la solución se deja a
65ºC durante 10 minutos. Esta solución se enfría a 37ºC y se deja
durante cinco minutos para equilibrar la temperatura. Se añaden 2
\mul de tampón ligasa 10 X (Tris 200 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 100
mM, DTT 100 mM, ATP 10 mM) junto con 1 \mul de ADN ligasa de T4,
y esta solución se deja solidificar e incubar a 15ºC durante una
noche.
La agarosa que contiene el ADN apropiado de funde
por incubación a 65ºC durante 10 minutos. Se añaden
\hbox{10 \mu l}de esta solución a 30 \mul de tampón TE (Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM), se mezclan y la mezcla se deja en reposo a temperatura ambiente. Se ponen células competentes congeladas (E. coli cepa DH5\alpha) en hielo húmedo para descongelarse. La solución de ADN diluida anterior se añade a 200 \mul de células y se deja en reposo en hielo durante 20 minutos. Las células más el ADN después se someten a un choque térmico durante 90 segundos a 41ºC. Las células después se dejan a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añaden 0,8 ml de medio SOC (Hanahan, 1983) y el cultivo se incuba a 37ºC durante una hora. Se cultivan 100 \mul del cultivo en placas LB (Miller, 1972) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina (L-amp) y las placas se incuban durante una noche a 37ºC. Se seleccionan las colonias supervivientes, se vuelven a cultivar en estrías en una segunda placa con antibiótico y las placas se incuban durante una noche a 37ºC.
El ADN se trata con las enzimas de restricción
apropiadas y los fragmentos se separan por electroforesis en un gel
de agarosa LGT. Se escinde una banda que contiene el fragmento de
interés y el ADN se purifica por técnicas convencionales. Se marcan
50 ng del fragmento de ADN usando el kit de cebador aleatorio IBI
de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Se digieren 3 \mug de ADN de tabaco con
diversas enzimas de restricción en las condiciones sugeridas por el
proveedor. El ADN se extrae con fenol, se precipita con etanol y
después se resuspende en tampón de carga de gel (15% de ficoll,
0,025% de azul de bromofenol, EDTA 10 mM, pH 8). Se introducen
muestras en el gel y se someten a electroforesis en un gel de
agarosa al 0,5% a 5 Vcm^{-1} hasta que el colorante de azul de
bromofenol alcanza el extremo del gel. Después de esto, el ADN se
transfiere a Gene-Screen Plus usando el
procedimiento de transferencia alcalino descrito por el proveedor.
Las etapas previas a la hibridación, la hibridación y el lavado se
realizan de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La
hibridación se detecta por autorradiografía.
Un adaptador molecular típico es la secuencia
5'GGATCCCTGCA-3'
para la conversión de un sito PstI en un sitio
BamHI. Esta molécula se sintetiza en un sintetizador Applied
Biosystems usando la química de
\beta-cianoetilfosforamidita y se purifica por
HPLC de fase inversa. Aproximadamente 2 \mug de este
oligonucleótido se fosforilan de acuerdo con Maniatis et al.,
(1982, p. 125). Después de esto, la solución de oligonucleótido se
calienta a 65ºC en un baño de agua y se deja enfriar a temperatura
ambiente durante un período de aproximadamente 30 minutos. Al ADN
digerido se le añade un exceso molar de aproximadamente 10 veces de
este adaptador templado junto con tampón ligasa 10 X, ADN ligasa de
T4 y una cantidad apropiada de agua. Una reacción típica
es:
- ADN a adaptar : 1,2 \mul (\sim1 pmol)
- Adaptador: 1 \mul (\sim 10 pmol)
- Tampón ligasa 10 X: 1 \mul
- ADN ligasa de T4: 1 \mul
- Agua: 5-6 \mul.
Esta solución se incuba a una temperatura de 12 a
15ºC durante 30 minutos y se calienta a 65ºC durante 30 minutos
para inactivar la ligasa. La concentración de sal y el volumen se
ajustan para la digestión con las enzimas de restricción apropiadas
y el ADN adaptado se digiere para exponer el "extremo
adherente" adaptado. Se retiran los adaptadores no incorporados
por electroforesis en un gel de agarosa o por precipitaciones
secuenciales con isopropanol.
A. Síntesis y marcaje del extremo 5' de
cebadores para la extensión de cebadores. Se sintetizan los
siguientes oligómeros cebadores usando un sintetizador Applied
Biosystems y la química de
\beta-cianoetil-fosforamidita.
PR-1:
5'-ATAGTCTTGTTGAGACTT-3'
Los oligonucleótidos que purifican por HPCL de
fase inversa. Se fosforilan 5 pmol de cada oligonucleótido
(Maniatis et al., 1982, p. 125) usando 200 \muCi de ^{32}
P-ATP (6000 Ci/mmol, 10 \muCi/\mul). Después de
la incubación a 37ºC durante 30 minutos, la reacción se diluye a
100 \mul, se extrae con fenol/cloroformo y después se precipita
tres veces con 50 \mug de ARN de soporte. El precipitado final se
resuspende en 1 X tampón de transcriptasa inversa
(Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, KCl 40 mM, MgCl_{2} 3mM)
a una concentración de 2 nM. Se determina una actividad específica
del oligonucleótido marcado de aproximadamente 3 C 10^{6}
Cvcpm/pmol.
B. Preparación del ARN total. El ARN total
se prepara esencialmente como se describe por Lagrimini et al.
(1987). El tejido se tritura con nitrógeno líquido en un mortero
con su mano. El tejido triturado se añade a tampón de trituración
(Lagrimini et al. 1987) usando 2,5 ml/g de tejido. Después se añade
un volumen igual de fenol y la emulsión se homogeneiza en un
politrón Brinkman. Se añade la mitad del volumen de cloroformo y la
emulsión se mezcla suavemente durante 15 minutos. Las fases se
separan por centrifugación y la fase acuosa se retira. El ARN se
precipita por adición de acetato sódico a 0,3 M y 2,5 volúmenes de
etanol. El precipitado se recoge por centrifugación y se resuspende
en 2 ml de agua estéril. Se añade cloruro de litio a una
concentración final de 3 M y se deja a 4ºC durante una noche. El
precipitado se recoge por centrifugación y el sedimento se lava con
etanol al 80% enfriado con hielo. El sedimento se seca y se
resuspende en 500 \mul de agua estéril. La concentración de esta
preparación de ARN total se determina espectrofotométricamente.
Como alternativa, se extrae ARN de callo como se
ha descrito anteriormente, con la excepción de que el tejido de
callo se corta en cubos con un tamaño de aproximadamente 3 mm, y se
añade a morteros pre-enfriados con sus manos para la
trituración en nitrógeno líquido antes de la etapa de politrón.
C. Extensión de cebadores. Se liofilizan
50 \mug de ARN total en un tubo Eppendorf de 500 \mul. El ARN
se resuspende en 30 \mul de solución de sonda radiomarcada y se
calienta a 70ºC durante 10 minutos. El tubo se enfría lentamente a
37ºC y se deja incubar durante una noche. Sin retirar el tubo del
baño de agua a 37ºC, se añaden 2 \mul de tampón transcriptasa
inversa 10 X (Tris-HCl 500 mM, pH 7,5, KCl 400 mM,
MgCl_{2} 30 mM), 1 \mul de BSA a 5 mg/ml, 5 \mul de DTT 10 mM,
5 \mul de dNTP 10 X (una concentración 10 mM de cada dNTP en
H_{2}O), 3 \mul de H_{2}O, 2 \mul de RNAsa (80 unidades) y
2 \mul de transcriptasa inversa (400 unidades), y la reacción se
incuba a 37ºC durante 30 minutos. Para detener la reacción, se
añaden 5 \mul de acetato sódico 3 M pH 5 y 150 \mul de etanol
absoluto. El tubo se deja a -20ºC durante 30 minutos, el precipitado
se recoge por centrifugación, se lava con etanol al 80% y se deja
secar al aire. El precipitado se resuspende en 10 a 20 \mul de
colorante de carga (90% de formamida, 0,05% de azul de bromofenol,
0,05% de xileno cianol, EDTA 1 mM) y los productos de extensión se
separan en un gel de secuenciación al 6% (Maniatis et al., 1982).
Los productos de extensión se visualizan por autorradiografía.
Sección
2
Se aíslan las PRP relevantes para estos ejemplos,
se purifican y se secuencian, por primera vez en algunos casos y de
acuerdo con los procedimientos bibliográficos en otros, para
permitir el aislamiento de los ADNc correspondientes y finalmente
para confirmar las identidades de los ADNc.
A. Reducción y alquilación. Se disuelve la
proteína liofilizada y purificada en guanidina-HCl
6 M que contiene Tris-HCl 1 M, pH 8,6, y EDTA 10 mM.
Se añade DTT a una concentración de 20 mM y se añade
4-vinilpiridina a una concentración final de 50 mM.
La muestra después se incuba durante 1,5 horas bajo una atmósfera
de nitrógeno. El material piridiletilado se desalifica en HPLC
usando una columna de Aquapore fenilo (2,1 x 10 cm, Brownlee). La
columna se eluye con un gradiente lineal del 5 al 80% de
acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1%.
B. Escisión con bromuro de cianógeno y
eliminación de piroglutamato. La escisión con bromuro de
cianógeno se realiza in situ de acuerdo con Simpson y Nice (1984).
La digestión de la proteína PR-1 con piroglutamato
aminopeptidasa (Boehringer Mannheim) se realiza de acuerdo con
Allen, G. (1981).
C. Digestión con LysC. La proteína se
digiere con la endoproteinasa Lys-C (Boehringer
Mannheim) en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5 durante 24 horas
a temperatura ambiente usando una relación de enzima:substrato de
1:10. Los péptidos resultantes se aíslan por HPLC usando una columna
Aquapore C-8 (1 x 22 cm, Brownlee) eluida con un
gradiente lineal de acetonitrilo:isopropanol (relación 1:1) (del 0
al 60%) en TFA al 0,1%.
D. Digestión con tripsina. La digestión
con tripsina (Cooper) se realiza en bicarbonato amónico 0,1 M, pH
8,2, que contiene cloruro cálcico 0,1 M durante cinco horas a 37ºC
usando una relación de enzima:substrato de 1:100. Los péptidos
generados se separan en HPLC usando las mismas condiciones que con
los péptidos Lys-C o se realiza en
Tris-HCl 0,1 M pH 8,5 durante 24 horas a 37ºC
usando una relación de enzima:substrato de 1:50. Los péptidos se
aíslan por HPLC usando una columna Vydac C-18 (2,1
x 150 mm) con un gradiente lineal del 0 al 60% de
acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1%.
E. Secuenciación. Se realizan
degradaciones de Edman automáticas con un secuenciador en fase
gaseosa Applied Biosystems 470A. Los PTH aminoácidos se identifican
usando un analizador Applied Biosystems 102A PTH.
Originalmente se realiza una correlación de las
secuencias de ADN de tres clones de ADNc con las proteínas
PR-1a, -1b y -1c por Cornelissen, B.J.C. et al.
(1986), basándose en una comparación de los datos de secuencia
proteica publicados de tres péptidos derivados de
PR-1a (Lucas et al., 1985) y la estructura primaria
de la proteína se deduce a partir de los clones de ADNc. Sin
embargo, el clon de ADNc denominado PR-1a está
truncado en el extremo 5' y puede compararse con sólo de los tres
péptidos con un desacoplamiento de un resto.
La secuencia de aminoácidos codificada deducida a
partir del ADNc, preparada y analizada en el ejemplo indicado más
adelante, y la secuencia de ADNc de PR-1a de
Pfitzer, U.M. et al., (1987), presentan desacoplamientos con la
secuencia proteica publicada en el resto de triptófano como se
indica. Tampoco corresponden en otras tres posiciones de la
secuencia proteica amino-terminal. Esta anomalía
cuestiona la identificación previa de los clones de
PR-1. Para confirmar la identidad de nuestros
clones de ADNc como PR-1a, PR-1b o
PR-1c, se determina una porción grande de la
estructura primaria de las proteínas PR-1a y
PR-1b purificada y de péptidos derivados de las
proteínas por secuenciación de aminoácidos. Estos datos después se
comparan con la secuencia de la proteína deducida a partir de la
secuencia de nucleótidos de los ADNc para identificar cuál de los
clones de ADNc corresponde a cada proteína.
Se cultivan plantas de N. tabacum cv.
Xanthi en un invernadero y cuando llegan a una edad de ocho semanas
se infectan frotando suavemente las hojas con una suspensión de una
cepa común (UI) de TMV (0,5 \mug/ml). Se recogen las hojas siete
días después de la infección y el ICF se retira de las hojas por
lavado y se recoge de acuerdo con Parent y Asselin (1984). 250 ml de
ICF se concentran a 50 ml por liofilización y se introducen en una
columna Ultragel ACA54 equilibrada con Tris-HCl pH
8,0 y EDTA 1 mM.
Los eluatos de esta columna se analizan por
electroforesis en geles de poliacrilamida nativos al 10%. Se reúnen
las fracciones que contienen las proteínas PR-1, se
liofilizan, se resuspenden en 3 ml de agua y después se dializan
durante una noche frente a agua. Esta preparación se purifica
adicionalmente por cromatografía de intercambio aniónico de HPLC en
una columna TSK-DEAE 5PN. La columna se eluye con
un gradiente de NaCl de 0 a 0,6 M en Tris-HCl 50 mM,
pH 8,0 EDTA 1 mM. Las fracciones se analizan por PAGE. Primero
eluye PR-1b de la columna a NaCl 0,18 M y
PR-1a eluye a NaCl 0,28 M. Las fracciones que
contienen cada proteína se reúnen, se dializan frente a agua y se
liofilizan.
La pureza de la preparación proteica
PR-1a y PR-1b se confirma por HPLC
de fase inversa usando una columna de Aquapore fenilo (2,1 x 100
mm, Brownlee) y eluyendo con un gradiente lineal de
acetonitrilo:isopropanol (1:1) (del 5 al 80%) en TFA al 0,1%.
La secuencia de la proteína se obtiene a partir
del extremo amino desbloqueado de la proteína intacta, a partir de
péptidos obtenidos por escisión con bromuro de cianógeno de las
proteínas, a partir de péptidos obtenidos por digestión con LysC de
las proteínas o a partir de péptidos obtenidos por digestión con
tripsina de la proteína usando técnicas detalladas anteriormente o
usando otros métodos conocidos en la técnica. Más adelante se
muestra un resumen de los datos resultantes de este análisis para
PR-1a y PR-1b.
PR-1a
PR-1b
Se cultivan plantas de N. tabacum cv
Xanthi en un invernadero cuando tienen ocho semanas de edad y se
infectan frotando suavemente las hojas con una suspensión de una
cepa común (U1) de TMV (0,5 \mug/ml). Se recogen las hojas siete
días después de la infección y el ICF se retira de las hojas por
lavado y se recoge de acuerdo con Parent y Asselin (1984). 250 ml de
ICF se concentran a 50 ml por liofilización y se introducen en una
columna Ultragel ACA54 equilibrada con Tris-HCl pH
8,0 y EDTA 1 mM. Los eluatos se analizan por electroforesis en
geles de poliacrilamida al 10%.
Se reúnen las fracciones que contienen la
proteína PR-R y varias proteínas contaminantes
minoritarias, se liofilizan, se resuspenden en 3 ml de agua y
después se dializan durante una noche frente a agua. Esta
preparación se purifica adicionalmente por cromatografía de HPLC de
fase inversa usando un columna de Aquapore fenilo (2,1 x 100 mm) de
Brownlee. La columna se eluye con un gradiente lineal del 20 al 80%
de acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1% usando un caudal de
50 \mul/minuto durante 80 minutos. Se descubre que las proteínas
principales presentes son isoformas de PR-R que
reciben los nombres de PR-R mayoritaria, para la
proteína más abundante que eluye a 46 minutos, y
PR-R minoritaria para la proteína menos abundante
que eluye a 47,5 minutos.
Los picos que contienen la PR-R
mayoritaria y la PR-R minoritaria se recogen y las
muestras se reducen a sequedad. Las proteínas después se resuspenden
en guanidina-HCl 6 M, Tris-HCl 1 M,
se reducen y se alquilan como se ha descrito anteriormente y se
someten a una secuenciación automática como se ha descrito
anteriormente.
Más adelante se presenta un resumen de los datos
obtenidos.
Se cultivan plantas de N. tabacum cv
Xanthi en un invernadero cuando tienen ocho semanas de edad y se
infectan frotando suavemente las hojas con una suspensión de una
cepa común (U1) de TMV (0,5 \mug/ml). Se recogen las hojas siete
días después de la infección y el ICF se retira de las hojas por
lavado y se recoge de acuerdo con Parent y Asselin (1984). 250 ml de
ICF se concentran a 50 ml por liofilización y se introducen en una
columna Ultragel ACA54 equilibrada con Tris-HCl pH
8,0 y EDTA 1 mM. Los eluatos se analizan por electroforesis en
geles de poliacrilamida al 10%. Se reúnen las fracciones de la
cromatografía Ultragel ACA54 que contienen PR-O,
PR-P, PR-Q y PR-R y
se concentran por liofilización. Las proteínas se purifican
adicionalmente por PAGE seguido de electrotransferencia en una
membrana de PVDF (Matsudaira, 1987). Las bandas proteicas
transferidas que contiene PR-P y
PR-Q se escinden y se tratan con
PVP-40 al 0,5% en ácido acético 100 mM de acuerdo
con el Boletín del Usuario nº 36 de Applied Biosystems, 21 de marzo
de 1988. El desbloqueo de la proteína se realiza con piroglutamato
aminopeptidasa como se describe y la proteína se secuencia a partir
del PVDF por degradación de Edman automática como se ha descrito
anteriormente.
Las secuencias del extremo amino de las proteínas
PR-P y PR-Q se describen más
adelante.
Para obtener la secuencia proteica a partir de
péptidos derivados de PR-P y PR-Q,
se reúnen las fracciones de la columna Ultragel que contienen
proteínas PR, se liofilizan, se disuelven en agua y después se
dializan frente a agua antes de la cromatografía en
DEAE-Shephacel. La columna de
DEAE-Shephacel se equilibra con
Tris-HCl 50 mM, (pH 8,0), EDTA 1 mM y se eluye con
un gradiente lineal de 0 a 0,4 M de cloruro sódico. La fracción 6,
que contiene una mezcla de PR-R mayoritaria,
PR-R minoritaria, PR-P,
PR-Q, PR-O y varios contaminantes
minoritarios se liofiliza y después se resuspende en agua
destilada.
Las proteínas de la fracción 6 se purifican
adicionalmente por HPLC usando una columna de fenilo de fase
inversa y se eluyen con un gradiente lineal del 20 al 80% de
acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1%. Las proteínas
PR-P y PR-Q
co-eluyen como un solo pico que se recoge y se
concentra casi hasta la sequedad al vacío, se resuspenden en acetato
amónico 10 mM pH 7,0 y se aplican a una columna de intercambio
iónico de HPLC de Brownlee Labs AX-300 (2,1 mm x 10
cm) equilibrada en acetato amónico 10 mM (pH 7,0). Las proteínas se
eluyen de esta columna usando un gradiente lineal de acetato
amónico de 10 a 250 mM (pH 7,0). PR-P y
PR-Q eluyen como un solo pico característico a
concentraciones aproximadas de acetato amónico 75 mM y 95 mM,
respectivamente.
Se generan péptidos por escisión con bromuro de
cianógeno, digestión con tripsina o digestión con LysC y se
purifican como se describe en el ejemplo 7. La secuencia de
aminoácidos se determina como se describe en el ejemplo 7 y como se
resume más adelante:
\newpage
PR-P
PR-Q
Se cultivan plantas de N. tabacum cv
Xanthi en un invernadero cuando tienen ocho semanas de edad y se
infectan frotando suavemente las hojas con una suspensión de una
cepa común (U1) de TMV (0,5 \mug/ml). Se recogen las hojas siete
días después de la infección y el ICF se retira de las hojas por
lavado y se recoge de acuerdo con Parent y Asselin (1984). 250 ml de
ICF se concentran a 50 ml por liofilización y se introducen en una
columna Ultragel ACA54 equilibrada con Tris-HCl pH
8,0 y EDTA 1 mM. Los eluatos se analizan por electroforesis en
geles de poliacrilamida al 10%. Se reúnen fracciones de la
cromatografía Ultragel ACA54 que contiene proteínas PR, como se
determina por electroforesis en gel, se liofilizan se disuelven en
agua y se dializan frente a agua antes de la cromatografía en
DEAE-Sephacel. La columna de
DEAE-Sephacel se equilibra con
Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y EDTA 1 mM y se eluye con
un gradiente lineal de 0 a 0,4 M de cloruro sódico. La fracción 6
que contiene una mezcla de PR-R mayoritaria,
PR-R minoritaria, PR-P,
PR-Q y varios contaminantes minoritarios se
liofiliza y después se resuspende en agua destilada. Las proteínas
individuales se purifican adicionalmente por cromatografía de HPLC
de fase inversa usando una columna de Vydac fenilo (4,6 x 250 mm).
Las proteínas se eluyen usando un gradiente lineal del 20 al 80% de
acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1%. Los resultados de
esta etapa de purificación revelan que la mezcla de proteínas
contiene al menos 9 proteínas individuales. Una de estas proteínas,
PR-O', que eluye a los 46 minutos, se recoge y se
concentra por liofilización. La proteína se resuspende en
guanidina-HCl 6 M, Tris-HCl 1 M y se
reduce y alquila como se ha descrito anteriormente. Se generan
péptidos por digestión por tripsina y se separan como se ha descrito
anteriormente. A continuación se presenta un resumen de las
secuencias de aminoácidos de estos péptidos.
Se cultivan plantas de N. tabacum cv
Xanthi en un invernadero cuando tienen ocho semanas de edad y se
infectan frotando suavemente las hojas con una suspensión de una
cepa común (U1) de TMV (0,5 \mug/ml). Se recogen las hojas siete
días después de la infección y el fluido intercelular (ICF) se
retira de las hojas por lavado y se recoge de acuerdo con Parent y
Asselin (1984). 250 ml de ICF se concentran a 50 ml por
liofilización y se introducen en una columna Ultragel ACA54
equilibrada con Tris-HCl pH 8,0 y EDTA 1 mM. Los
eluatos se analizan por electroforesis en geles de poliacrilamida
al 10%. Se reúnen las fracciones que contienen proteínas PR como se
determina por electroforesis en gel, se liofilizan, se disuelven en
agua y se dializan frente a agua antes de la cromatografía en
DEAE-Sephacel. La columna de
DEAE-Sephacel se equilibra con
Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM y se eluye con
un gradiente lineal de 0 a 0,4 M de cloruro sódico. La fracción 6,
que contiene una mezcla de PR-R mayoritaria,
PR-R minoritaria, PR-P,
PR-Q, PR-O y varios contaminantes
minoritarios, se liofiliza. La fracción 3, que contiene una mezcla
de PR-2, PR-N y varios contaminantes
minoritarios, también se recoge por separado y se concentra por
liofilización.
PR-O se purifica adicionalmente a
partir de otras proteínas de la fracción 6 resuspendiendo primero
la fracción 6 en 2 ml de agua y separando después las proteínas por
cromatografía de HPLC de fase inversa usando una columna Vydac
fenilo (4,6 X 250 mm). Las proteínas se eluyen usando un gradiente
lineal del 20 al 80% de acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al
0,1%. Los resultados de esta etapa de purificación revelan que la
mezcla contiene al menos nueve proteínas. Una de estas proteínas,
que eluye en un ensayo a 51 minutos, es PR-O, como
se determina por electroforesis en gel. El pico que contiene
PR-O se recoge y se concentra por liofilización. La
proteína se resuspende en guanidina-HCl 6 M,
Tris-HCl 1 mM y se reduce y alquila como se ha
descrito anteriormente. Se generan péptidos por digestión con
tripsina y LysC y se purifican como se ha descrito anteriormente. La
secuencia de la proteína se determina como se describe en el
ejemplo 7. Más adelante se proporciona un resumen de los datos de
secuenciación.
Las proteínas PR-2 y
PR-N se purifican a partir de la fracción 3 usando
una columna de intercambio aniónico Aquapore AX-300
(2,1 x 100 mm) de Brownlee. Las proteínas se eluyen de la columna
usando un gradiente lineal de acetato amónico de 10 mM a 350 mM pH
7,0. PR-N eluye a 37,5 minutos y
PR-2 eluye a 50,0 minutos como picos individuales y
uniformes. La identidad de las proteínas se confirma por
electroforesis en gel. Las proteínas se recogen, se concentran por
liofilización y después se reducen y se alquilan como se ha
descrito anteriormente. Se generan péptidos por digestión con
tripsina y se purifican como se describe en el ejemplo 7. Los datos
de secuenciación de la proteína se resumen más adelante.
PR-2
PR-N
\newpage
PR-O
Se aísla una proteína quitinasa inducible por
patógenos a partir de hojas de pepino infectadas como se ha
descrito (Métraux et al., 1988). Se generan péptidos a partir de
esta preparación de proteína homogénea esencialmente como se
describe en la técnica y como se ha descrito anteriormente. A
continuación se resume la secuencia de aminoácidos de estos
péptidos.
La proteína peroxidasa de pepino, ácida, inducida
por patógenos se purifica como se describe por Smith, J.A., PH.D.
Thesis, Department of Botany and Plant Pathology, Michigan State
University, Lansing, Michigan (1988), a partir de las hojas no
infectadas de plantas de pepino se que han infectado siete días
previamente con una suspensión de esporas de Colletotrichum
lagenarium.
La proteína purificada se reduce y se alquila y
la secuencia de aminoácidos del extremo amino y de péptidos
derivados de la digestión con LysC o tripsina se determina como se
describe en el ejemplo 7. Los resultados de la secuenciación de
aminoácidos se resumen a continuación.
Sección
3
Esta sección describe el aislamiento de nuevos
clones de ADNc. Se divide en tres secciones: la sección A incluye
la construcción de bibliotecas usadas en el aislamiento de clones.
La sección B incluye la identificación y purificación de los clones
aislados de esta manera. La sección C incluye el desarrollo de una
nueva tecnología de clonación de ADNc.
Sección
3A
Se infectan hojas de N. tabacum cv. Xanthi
con TMV y se recogen 5 días después de la infección. El ARN total
se prepara como se ha descrito anteriormente y se aísla el ARN poli
A+ usando técnicas convencionales. Se construye una biblioteca de
ADNc usando este ARN poli A+ en el vector de clonación Lambda ongC
(Stratagene) esencialmente como se describe (Gubler y Hoffman,
1983).
pCGN1703, un vector de clonación de ADNc
plasmídico del tipo de vector- cebador descrito por Okayama y Berg
(1982), se construye como un vector mejorado para simplificar el
proceso de clonación y facilitar el lanzamiento de bibliotecas en un
vector de fago, así como para proporcionar funciones adicionales
que están fuera del presente uso.
A. Construcción del vector de clonación
pCGN1703. Como plásmido de partida se usa Bluescribe M13-
(Stratagene, Inc.). El sitio BamHI se deleciona por digestión con
BamHI y tratamiento con nucleasa de Vigna radiata, seguido
de la unión con ADN ligasa de T4 para producir pCGN1700. Este
plásmido se digiere con EcoRI y SacI y después se une con un
poliengarce sintético bicatenario creado por hibridación de dos
oligonucleótidos de la secuencia
De esta manera, el plásmido resultante tiene
sitios de restricción adicionales para SmaI, ApaI, XbaI, PstI y
BamHI y se denomina pCGN1702. Obsérvese que no se reconstruye el
sitio EcoRI.
pCGN1702 se digiere completamente con HindIII y
sus extremos se hacen romos con la polimerasa de T4. El ADN
resultante se somete a digestión parcial con PvuII y después se une
con ADN ligasa de T4. Se selecciona un transformante que ha
delecionado el fragmento HindIII/PvuII de 214 pb que incluye la
región operador-promotor de lac; este plásmido se
denomina pCGN1703.
El uso de plásmidos de
vector-cebador tales como pCGN1703 se describió
previamente (Alexander, 1987). Como se describe en la sección de
ADENDDUM de este trabajo, el presente vector es un vector
monomérico. Los tractos T usados para cebar la síntesis de ADNc
están presentes en los dos extremos del vector durante las
reacciones de transcriptasa inversa y transferasa terminal (cola
G), y el ADN del engarce usado para circularizar los productos
finales de la clonación de ADNc con pCGN1703 tiene la estructura
generalizada siguiente: promotor de T7, un sitio de clonación
múltiple (SmaI, ApaI, XbaI, PstI, BamHI, NotI, EcoRI, SacI), tracto
homopolimérico C:G (de 10 a 15 restos), inserto de ADNc
(5'-3' de cadena con sentido de ARNm), tracto
homopolimérico A:T (de 40 a 100 restos), y otro sitio de clonación
múltiple (KpnI, SmaI, XbaI, Sail, PstI y SphI), todos contenidos
dentro del esqueleto plasmídico derivado de Bluescribe M13- como se
ha descrito anteriormente.
B. Construcción de la biblioteca de ADNc
usando pCGN1703. Se cultivan plantas de tabaco Xanthi.nc en un
fitotrón hasta que tienen una altura de aproximadamente 10 a 12
pulgadas. En dos hojas situadas cerca de la parte inferior de cada
planta se inocula una muestra simulada que consta sólo de tampón
(fosfato sódico 10 mM, pH 7,0) o una muestra de TMV (10 \mug/ml en
el mismo tampón). Once días después, se recogen de 3 a 4 hojas
superiores, que no se han inoculado, y se congelan en nitrógeno
líquido. El ARNm poli-A+ se aísla por métodos
descritos previamente (Hall et al., 1978, p.
3196-3200; Maniatis et al, 1982, p.
297-209). Se construye una biblioteca de ADNc usando
el ARN poli-A+ aislado a partir de hojas inducidas
con TMV, en el vector pCGN1703 por métodos descritos previamente
(Alexander, 1987). El ADN plasmídico de la biblioteca de ADNc
amplificada (Alexander, 1987) se digiere completamente con EcoRI y
se subclona en el sitio EcoRI de lgt-10 (Stratagene,
Inc.) Debe tenerse en cuenta que el vector plasmídico permanece
unido a los ADNc y también se clona en el vector del fago. Por lo
tanto, usando este proceso, se construyen dos bibliotecas de ADNc,
una en la que la biblioteca está contenida en un vector plasmídico
y la otra en la que la biblioteca de ADNc está contenida en un
vector de fago.
Se infectan hojas de pepino con virus de la
necrosis del tabaco (TNV) y el ARN se aísla 5 días después de la
infección como se ha descrito anteriormente. Se aísla ARN poli A+
por técnicas convencionales y se construye una biblioteca de ADNc en
el vector de clonación lambda Zap (Stratagene), esencialmente como
se describe (Gubler y Hoffman, 1983).
Sección
3B
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de
la biblioteca de ADNc preparada anteriormente con un
oligonucleótido de la secuencia:
Se purifican 25 placas positivas por técnicas
convencionales y se prepara ADN a partir del fago. Un fragmento del
fago recombinante que contiene el ADNc se subclona en el plásmido
bluescript. Se determina una secuencia de ADNc parcial de cada clon
por secuenciación del ADN. Se descubre que los 26 clones pueden
tipificarse en tres clases de ADNc. La clase 1 se representa por el
clon pBSPR1-207, la clase 2 se representa por el
clon pBSPR1-1023 y la clase 3 se representa por el
clon pBSPR1-132.
Para determinar la identidad de los tres clones
con respecto a las proteínas PR-1 conocidas, se
comparan los datos de las secuencias de aminoácidos para las
proteínas PR-1a y PR-1b
determinadas anteriormente con las secuencias de aminoácidos
deducidas a partir de los tres clones de ADNc representativos. La
comparación se resume más adelante.
La secuencia de aminoácidos determinada
experimentalmente a partir de lo anterior se muestra en la línea
superior, mostrando el primer aminoácido (deducido) entre
paréntesis. La secuencia deducida a partir de los clones
pBSPR1-207 (=a), pBSPR1-1023 (=b) y
pBSPR1-312 (=c) se muestra debajo de los datos de
los péptidos, indicándose las coincidencias con (-). Los restos que
no coinciden se denominan por su símbolo de aminoácidos.
PR-1a
PR-1b
Cuando la secuencia de la proteína para
PR-1a se compara con la secuencia de aminoácidos
deducida derivada de pBSPR1-20 existe coincidencia
en todos los restos. Sin embargo, cuando la secuencia de
aminoácidos deducida procedente de los péptidos
pBSPR1-1023 o pBSPR1-312 se compara
con la secuencia proteica para PR-1a hay siete y
seis desacoplamientos, respectivamente. De esta manera, la
evidencia demuestra claramente que el clon
pBSPR1-207 codifica la proteína
PR-1a.
\newpage
Cuando la secuencia de aminoácidos para la
proteína PR-1b se compara con la secuencia de
aminoácidos deducida derivada de la proteína
pBSPR1-1023, hay coincidencia en todos los restos.
Sin embargo, en comparaciones con la secuencia derivada de
pBSPR1-207 o pBSPR1-312 hay tres o
seis desacoplamientos, respectivamente. De esta manera, los datos
demuestran claramente que el clon pBSPR1-1023
codifica la proteína PR-1b. Además, por defecto, se
determina que el clon pBSPR1-312 codifica la
proteína PR-1c. Las secuencias de los ADNc que
codifican PR-1a, PR-1b y
PR-1c son las siguientes:
Secuencia
1
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\newpage
Secuencia
2
Secuencia
3
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de
la biblioteca construida anteriormente con una sonda
oligonucleotídica de la secuencia
Se purifican quince placas positivas por técnicas
convencionales y se prepara el ADN a partir del fago. Un fragmento
del fago recombinante que contiene el ADNc se subclona en el
plásmido bluescript. La secuencia de ADN parcial del inserto de ADNc
revela que los clones pueden tipificarse en dos clases. La
secuencia de uno de estos clones, pBSPRR-401, que
codifica la forma principal de PR-R (Pierpoint et
al., 1987; y supra) es la siguiente:
Secuencia
4
La identidad de este ADNc que codifica la forma
principal de PR-R mayoritaria se confirma por
comparación de la secuencia de la proteína codificada con la
secuencia amino terminal determinada experimentalmente antes y por
comparación con la secuencia presentada para la isoforma de
PR-R mayoritaria por Pierpoint et al (1987). Esta
proteína codificada tiene un homología muy fuerte con un inhibidor
de tripsina/\alpha-amilasa conocido aislado a
partir de maíz (Richardson et al., 1987). La PR-R
clonada puede ser un inhibidor de proteasas o
\alpha-amilasas y, como tal, conferirá actividad
insecticida, viricida o fungicida a las plantas cuando se exprese
transgénicamente.
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de
la biblioteca de ADNc preparada anteriormente usando una sonda de
ADNc marcada que codifica el gen de la quitinasa básica de tabaco
(Shinshi et al., 1987) y lavando los filtros a 50ºC en NaCl 0,125
mM, SDS al 1%, fosfato sódico 40 mM (pH 7,2), y EDTA 1 mM. Se
purifican 24 placas positivas y la secuencia de ADN de un clon
denominado pBScht15 es la siguiente:
\newpage
Secuencia
5
Se determina que la proteína codificada en el
clon de esta secuencia es PRP Q basándose en: (1) la homología
estructural limitada con la quitinasa básica de tabaco y (2) la
identidad con la secuencia proteica amino-terminal
de PR-Q y la identidad con la secuencia de varios
péptidos internos derivados de PR-Q, como se
determina por secuenciación de proteínas (véase anteriormente). El
clon aislado parece ser un ADNc truncado. Para aislar el extremo 5'
del ADNc, primero se determina el extremo del ARNm.
Se sintetiza un cebador oligonucleotídico de la
secuencia:
denominado oligo A, por la química de
\beta-cianoetilfosforamidita y se purifica por
técnicas convencionales. Este cebador se usa en un experimento de
extensión de cebadores como se ha indicado anteriormente usando ARN
aislado de hojas infectadas con TMV. Se visualizan dos productos de
extensión por autorradiografía correspondientes a los puntos
terminales de ARNm que son 43 pb y 53 pb mayores que el ADNc de
pBScht15.
Para aislar el extremo 5' del ADNc de
PR-Q, se desarrolla un nuevo método de clonación
basándose en la tecnología de PCR. Esencialmente, se usan dos
cebadores para la amplificación y después se clona el extremo 5'
del clon de ADNc a partir de la biblioteca de ADNc. En este
procedimiento se usará un cebador (oligo A) que es complementario a
la cadena con sentido del ADNc y localizado aproximadamente 160
bases dentro del ADNc de pBScht15 y un segundo cebador (oligo B u
oligo C, mostrados más adelante) que cebará el ADNc de cualquier
lado del vector de clonación \lambda.
El oligo A es complementario al ARNm de
PR-Q y contiene una secuencia reconocida por la
endonucleasa Nsil. Se sintetizan otros dos oligonucleótidos con la
secuencia
se purifican, y se denominan oligo B y oligo C.
El oligo B tiene la misma secuencia que parte del vector de
clonación \lambda OngC y el oligo C es complementario al
poliengarce del vector de clonación \lambda OngC. Para clonar el
extremo 5' del ADNc de PR-Q, se realizan dos PCR,
una usando los oligos A y B y la otra usando los oligos A y C. Como
plantilla para la reacción se usa una alícuota de la biblioteca de
ADNc. Se necesitan las dos reacciones para amplificar clones que se
han unido al vector \lambda OngC en cualquier dirección. Como
control, también se realizan reacciones en alícuotas del lisado del
fago purificado usando el aislado 15 de quitinasa. Después de la
amplificación, el ADN se purifica y se digiere con Nsil y EcoRI y
se procesa en un gel de agarosa LGT al 1,5%. Se escinden cortes de
gel que contienen fragmentos de ADN mayores que el control y se
unen a pBluescript que se digiere tanto con EcoRI como con PstI
como se ha descrito anteriormente. Después de la transformación, se
aíslan colonias positivas y el inserto de ADN se analiza por
secuenciación del ADN. Varios insertos contienen el extremo 5' del
ADNc de PR-Q y otros contienen el extremo 5' de
PR-P (determinado comparando la secuencia de
aminoácidos deducida a partir de los clones con la secuencia
proteica determinada
anteriormente).
El extremo 3' de PR-P después se
aísla a partir de la biblioteca de ADNc por selección de
aproximadamente 100.000 clones de la biblioteca de ADNc con una
sonda de uno de los aislados 5' de PR-P,
pBScht5'-5. Los fagos positivos se aíslan y se
purifican y el inserto se subclona en pBluescript. Se secuencian
varios insertos y se determina que uno, pBScht28 codifica
PR-P. La secuencia de ADN de PR-P
es la siguiente:
Secuencia
6
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de
la biblioteca de ADNc descrita anteriormente usando una sonda de
ADNc marcada que codifica la forma básica de la
\beta-1,3-glucanasa (Shinshi et
al., 1988) y lavando los filtros a 50ºC en NaCl 0,125 M, SDS al 1%,
fosfato sódico 40 mM (pH 7,2), y EDTA 1 mM. Se aíslan 15 placas
positivas y el inserto se subclona en el plásmido bluescript. La
secuenciación de ADN parcial revela que pBSGL5 y pBSGL6e codifican
ADNc idénticos que tienen una homología de aproximadamente un 55%
con la secuencia de ADN conocida de la forma básica de la
\beta-1,3-glucanasa. Se determina
la secuencia del ADNc en el clon 5 y 6 y se muestra como secuencia
7 para el ADNc en el plásmido pBSGL6e.
Secuencia
7
\newpage
Secuencia
7A
Este ADNc codifica la proteína
PR-O' (una forma ácida de la
\beta-1,3-glucanasa) basándose en
la comparación con la secuencia de aminoácidos de péptidos derivados
de la proteína PR-O'.
La comparación de la matriz de puntos con la
\beta-1,3-glucanasa básica
muestra que la secuencia 7 de ADNc probablemente carece de
aproximadamente 80 bases del extremo 5'. Para aislar la forma de
longitud completa del ADNc de PR-O', la biblioteca
se vuelve a seleccionar con un fragmento de restricción EcoRI
marcado procedente del plásmido pBSGL6e. Se aíslan seis clones
positivos, se purifican y se subclonan en el plásmido bluescript.
Las secuencias de los insertos en los plásmidos se determinan por
secuenciación del ADN. Un clon, pBSGL5B-12, tiene 87
pb más que el ADNc en pBSGL6e (secuencia 7A).
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de
la biblioteca de ADNc preparada como se describe a partir del ARN
aislado de hojas de tabaco infectadas con TMV, comprendiendo la
sonda una mezcla de oligonucleótidos marcados (JR138) de la
fórmula:
donde cada Y se selecciona independientemente
entre una pirimidina C o T y cada R se selecciona
independientemente entre una purina C o G. Esta sonda tiene una
longitud de 17 bases con una redundancia de 16 veces en la mezcla.
El diseño de la sonda se basa en un análisis de los datos de la
proteína en el ejemplo 11B. La sonda reconocerá clones que contienen
la PR-2, PR-N o la
\beta-1,3-glucanasa básica, pero
no PR-O' o PR-O. Se aíslan 30 placas
de hibridación positivas y se purifican, y sus insertos se
subclonan en el plásmido bluescript. La secuencia de los insertos se
determina por secuenciación del ADN y los resultados indican que se
han aislado al menos 3 ADNc distintos. Cuando se comparan con los
datos de la proteína del ejemplo 11B, está claro que un tipo de clon
contiene un ADNc de longitud completa que codifica la proteína
PR-2 (pBSGL117), otro tipo codifica la proteína
PR-O (pBSGL134), otro tipo codifica la proteína
PR-N (pBSGL125 y pBSGL148) y otro tipo codifica una
proteína muy relacionada que no es ni PR-2, ni
PR-N, ni PR-O. Hemos denominado a
este tipo de ADNc PR-2'
(pBSGL135).
Para aislar un clon de ADNc que codifica
PR-O y también para aislar más clones de ADNc de
longitud completa, la biblioteca se selecciona por segunda vez con
un fragmento de restricción PstI de pBSGL125. pBSGL125 es un clon
de 500 pb que codifica una PR-N, que está truncada
en el extremo 5'. Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de
la biblioteca y se aíslan 17 placas positivas, se purifican y los
insertos se subclonan en bluescript. Las secuencias de los insertos
se determinan por secuenciación del ADN.
Para asegurar que se aíslan clones de longitud
completa a partir de las cuatro glucanasas ácidas, se emplean dos
estrategias finales. En primer lugar, se realiza una vuelta final de
selección usando un fragmento de restricción
PVuII-TaqI de 210 pb, derivado de pBSGL117 como
sonda. En esta selección se aíslan 17 clones, se purifican, se
subclonan en bluescript y sus secuencias se determinan por
secuenciación del ADN.
La segunda estrategia es amplificar el extremo 5'
del ADNc de la biblioteca por una estrategia de PCR descrita en el
ejemplo 17. En este caso, se usan los dos oligonucleótidos B y C
junto con un tercer oligonucleótido JR209 que es complementario a
las posiciones 152 a 169 de la secuencia de ADNc de
PR-2. En este experimento, se realizan dos PCR;
conteniendo una de ellas una alícuota de la biblioteca de ADNc como
plantilla y los cebadores JR209 y DP01 (oligo B del ejemplo 17) y
usando la otra una alícuota de la biblioteca de ADNc como plantilla
y usando JR209 y GP38 (oligo C del ejemplo 17) como cebadores. La
secuencia de JR209 es la siguiente:
El control positivo en el experimento de
amplificación es una alícuota del clon GL117 purificado que
codifica el ADNc de PR-2 de longitud completa
amplificado con JR209 y DP01. El control negativo en el experimento
es una amplificación que usa JR209 y GP38. Las alícuotas de los
productos de la PCR se analizan por electroforesis en gel de agarosa
y se descubre una banda de aproximadamente el tamaño del control
positivo amplificado de la biblioteca para cada serie de cebadores.
Este resultado sugiere que el procedimiento es satisfactorio y, de
esta forma, el ADN restante se purifica y después se trata con el
fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I en presencia de los
cuatro dNTP, como se describe por Maniatis et al. (1982) para hacer
que los extremos de las moléculas de ADN sean "romos". La
enzima de Klenow se inactiva por calentamiento a 65ºC durante 5
minutos y el ADN después se restringe con EcoRI. El ADN se purifica
y después se somete a electroforesis en un gel de agarosa LGT al
1,5%. La banda de ADN del tamaño correcto se escinde del gel y se
usa para unirse al plásmido bluescript, que se ha sometido a
restricción tanto con EcoRI como con EcoRV. La unión se usa para
transformar bacterias, se seleccionan colonias positivas y se
analizan por secuenciación del ADN.
El resultado de los procedimientos anteriores es
el aislamiento de clones que comprenden los clones de ADNc de
longitud completa para PR-2, PR-N,
PR-O y un cuarto tipo de glucanasa ácida,
PR-2', que codifica una proteína desconocida. La
secuencia de PR-2 es la siguiente:
Secuencia
8
pBSGL134 es el plásmido aislado que contiene un
inserto de ADNc que codifica una proteína
PR-O.
Los fagos \lambdatobcDNAGL153 y
\lambdatobcDNAGL162 son clones que contienen el ADNc de
PR-O de longitud completa. El fago
\lambdatobcDNAGL161 es un clon que contiene el ADNc de
PR-2' de longitud completa.
La determinación de la proteína codificada en el
inserto de ADNc se basa en una comparación entre los datos de la
proteína en 11B y la secuencia proteica deducida codificada por el
inserto de ADNc.
Se seleccionan levantamientos de filtro de la
biblioteca subclonada preparada anteriormente con sondas de ADNc
marcadas en un método descrito previamente (St. John and Davis,
1979), con la excepción de que los mismos levantamientos de filtro
se seleccionan secuencialmente en lugar de por selección de los
levantamientos replicados. La primera sonda se sintetiza como se ha
descrito, usando transcriptasa inversa y
[\alpha^{32}P]-dCTP, a partir del ARNm de la
muestra de ARN inducida de forma simulada aislada anteriormente;
después del sondeo y de la exposición a una película de rayos X, se
vuelven a sondear los mismos filtros (sin purificación) usando la
sonda sintetizada como se ha indicado anteriormente pero a partir
de la muestra de ARN inducida por TMV aislada anteriormente. Después
de la exposición, las dos películas de rayos X se comparan usando
un sistema de análisis de imágenes digital informatizado
(Biological Vision, Inc., San Jose, California) de acuerdo con las
especificaciones del fabricante, y se seleccionan las placas que
producen una mayor señal cuando se tratan con la sonda inducida con
TMV. Las placas seleccionadas se purifican por una segunda vuelta
de sondeo a una densidad de placa seleccionada de aproximadamente
100/placa, y los insertos de ADNc se recuperan del fago como se
indica a continuación: una pequeña cantidad del ADN del fago
aislado se digiere con EcoRI seguido de inactivación de la enzima
de restricción, dilución, una segunda unión con ADN ligasa de T4 y
transformación de la cepa DH- 5\alpha de E. coli (Bethesda
Research Laboratories, Bethesda, Maryland) seguido de un crecimiento
selectivo en placas de cultivo que contienen ampicilina. Este
procedimiento permite la recuperación directa del ADNc contenido en
el vector plasmídico a partir del vector de fago. Las secuencias de
ADN de estos dos clones ligeramente diferentes se muestran como
secuencia 9 y secuencia 10 para el ADNc en los plásmidos
pCIB/SAR8.2 (por ejemplo, ADNc de SAR8.2a) y pCIB/SAR8.2b (por
ejemplo, ADNc de SAR8.2b).
\newpage
Secuencia
9
Secuencia
10
El análisis de ARN de hojas de tabaco inducidas
de forma simulada frente a hojas de tabaco inducidas con TMV,
usando análisis de Northern y el ensayo de extensión de cebadores,
confirma que los niveles de estado estacionario de los ARNm de la
familia pSAR8.2 se aumentan por la inducción por TMV.
Se seleccionan dos regiones de la secuencia
proteica determinada en el ejemplo 12 y se sintetizan sondas
oligonucleotídicas que son complementarias a todas las posibles
combinaciones de ARNm capaces de codificar los péptidos. Las
secuencias de las sondas son:
Se cultivan aproximadamente 300.000 placas de la
biblioteca construida anteriormente y se someten levantamientos de
placas por duplicado a una sonda de una mezcla 1 (sonda 1) o mezcla
2 (sonda 2) de oligonucleótidos marcados con ^{32}P. Se aíslan las
placas que muestran resultados positivos cuando se seleccionan con
cualquier sonda. El aislamiento de los fagos y la escisión
automática se realizan como se ha descrito en el manual de
laboratorio de Stratagene Lambda Zap, Stratagene, San Diego,
USA.
Una vez aislados los clones de ADNc de quitinasa
en el plásmido bluescript, se secuencian por secuenciación
didesoxi. La secuencia del ADNc de quitinasa contenido en el
plásmido pBScuccht5 (aka pBScucchi/quitinasa) es la siguiente:
Secuencia
11
Se diseña una sonda oligonucleotídica para aislar
ADNc que codifican la peroxidasa de pepino basándose en los datos
de la proteína presentados en el ejemplo 12B. La secuencia de la
mezcla de oligonucleótidos es la siguiente:
donde cada R se selecciona independientemente
entre una purina G o C. Esta mezcla de oligonucleótidos tiene una
longitud de 20 bases y contiene 64
especies.
Se prepara una biblioteca de ADNc a partir de ARN
aislado de hojas de plantas de pepino 5 días después de la
infección con el virus de la necrosis de tabaco como se describe en
el ejemplo 14B. Esta biblioteca se construye en el vector de
clonación Lambda ZAP.
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de
esta biblioteca de ADNc con la sonda oligonucleotídica y se aíslan
25 placas. Éstas se vuelven a seleccionar varias veces y se
purifican. Como resultado de este proceso, sólo permanecen positivas
6 placas después de muchas vueltas de purificación. Los insertos
contenidos en estos clones se escinden usando el protocolo de
escisión automático descrito en el manual de laboratorio de
Stratagene Lambda ZAP. Los insertos se secuencian por secuenciación
didesoxi de doble cadena y después las estructuras se analizan por
un análisis de matriz de puntos por comparación con la secuencia de
una peroxidasa que forma lignina, ácida, aislada a partir de tabaco
(Lagrimini et al., 1987). Dos de estos clones, Per1 y Per25,
muestran alguna homología limitada con el ADNc de tabaco y se
eligen para un análisis adicional. Tras completar la secuenciación
de los clones, se descubre que codifican la misma proteína.
Después se usa una sonda derivada de la
peroxidasa de pepino para volver a seleccionar la biblioteca de
pepino y se aíslan aproximadamente 30 placas. Después de la
purificación, los insertos se escinden del fago como plásmidos y
después la secuencia se determina por secuenciación del ADN.
Los resultados de este análisis son el
aislamiento de dos tipos de clones de ADNc de peroxidasa a partir
de pepino. Uno que codifica una proteína básica codificada por el
plásmido pBSER1, cuya secuencia de nucleótidos se presenta a
continuación, y el otro que codifica una peroxidasa relacionada
contenida en los plásmidos, pBSPER24 y pBSPER25.
Secuencia
12
Sección
3C
Se ha concebido y desarrollado un método que
permite el enriquecimiento eficaz de secuencias presentes en una
población de moléculas en mayores cantidades que en otra población.
La mayor utilidad del método es en situaciones en las que las
poblaciones son muy similares y las secuencias presentes
diferencialmente representan una proporción muy pequeña de la
población.
Si dos poblaciones de clones son similares y se
desea aislar los clones que están presentes en una población en
mayores cantidades (es decir "inducidos" o "regulados
diferencialmente"), las técnicas previas implicaban la selección
con sondas de las dos poblaciones (selección +/- (St. John y Davis,
1979), o el enriquecimiento de sondas de ARNm por hibridación y
cromatografía de hidroxi-apatita (HAP) (Davis et
al., 1984). El primer método tiene una limitación de sensibilidad
demostrada, ya que sólo se detectarán los clones presentes en
cantidades mayores de aproximadamente 1 en 2.000. El segundo método
es laborioso, técnicamente difícil y consigue enriquecimientos de 20
a 50 veces en el mejor de los casos.
El presente método implica la explotación de dos
desarrollos recientes en el campo de la tecnología molecular: PCR
(Saiki et al., 1988) y cromatografía de
biotina-avidina (Stahl et al., 1988). La PCR
permite la síntesis sencilla de grandes cantidades de ADN de
secuencia especificada. La cromatografía de
biotina-avidina permite la separación eficaz de
moléculas que llevan una señal de afinidad de biotina de las
moléculas que no llevan la señal.
En su forma general, la técnica consiste en
aislar cadenas sencillas de ADNc que representan dos poblaciones
diferentes ("inducidas" frente a "no inducidas"), pero de
polaridad de ADNc opuesta para las dos poblaciones, es decir, una
de polaridad "con sentido" con respecto a los ARNm, y la otra
su complementaria o de polaridad "anti-sentido"
con respecto a los ARNm. Las cadenas aisladas de la población
"inducida" no tendrían señal de afinidad, mientras que las
cadenas de polaridad opuesta de las poblaciones "no inducidas"
tendrían señales de afinidad estables. Cuando estas dos poblaciones
hibridan, se formarán híbridos entre cadenas complementarias
presentes en las dos poblaciones. Las cadenas de la población
"inducida" que no tengan homólogos, o muy pocos homólogos, en
la población "no inducida" permanecerán con una sola cadena.
Debido a la presencia de la señal de afinidad (en esencia, un asa)
en las cadenas de las moléculas de la población "no inducida",
esas cadenas, y lo que es más importante, cualquier molécula
híbrida pueden retirarse de la mezcla por cromatografía de afinidad.
Esto deja sólo las moléculas "inducidas" que no están
representadas significativamente en la población "no inducida".
Estas moléculas "inducidas" después pueden clonarse por medios
convencionales y servir como una población enriquecida a partir de
la cual se aíslan los clones "inducidos"; como alternativa, las
moléculas enriquecidas pueden amplificarse individualmente y
secuenciarse directamente.
Un esquema alternativo es el mismo que se ha
descrito anteriormente con la excepción de que implica la
incorporación de una señal de afinidad lábil sólo en las moléculas
de la población "inducida", mientras que la señal de afinidad
en la población "no inducida" es estable. En este caso,
"lábil" significa que la señal de afinidad puede retirarse en
el futuro o se alterará en el futuro de tal forma que ya no sirva
como una señal de afinidad. En este esquema, todas las moléculas de
la mezcla de hibridación podrían unirse a la matriz de afinidad,
pero sólo podrían recuperarse selectivamente de la matriz las
moléculas "inducidas" que no hibridan con un homólogo
complementario "no inducido", para una clonación
posterior.
A continuación se proporciona un ejemplo
específico del primer esquema descrito anteriormente, usando
poblaciones de ADNc en vectores de clonación de fagos. Las
poblaciones de ADNc "inducida" y "no inducida"
(construidas a partir de ARNm de hojas de tabaco inducidas con TMV o
inducidas de forma simulada en este caso) se clonan en dos fagos
diferentes de forma que los cebadores usados para amplificar los
insertos del clon sean diferentes (y de esta forma no hibriden en
etapas posteriores). El banco de ADNc "inducido" se construye
en \lambdaGEM-4 (Promega, Inc.) y el banco de ADN
"no inducido" o "inducido de forma simulada" se construye
en \lambdaZAP-II (Stratagene, Inc). Para cada
vector, se sintetizan cebadores oligonucleotídicos específicos de
tal forma que representen secuencias en el vector del fago
inmediatamente adyacentes al sitio de clonación del ADNc y que,
cuando se usen en la reacción en cadena de la polimerasa en
presencia del fago correspondiente, se amplifique el ADN clonado en
el sitio de clonación de ADNc. Conjuntamente se amplifica una
población de fagos que representan todos los miembros de cada
banco, produciendo una población de insertos de ADNc que representan
el banco. En cada caso, uno de los cebadores oligonucleotídicos
está biotinilado, de forma que una cadena específica de cada ADN
del banco amplificado puede seleccionarse positivamente por
cromatografía de afinidad de avidina y separación de la cadena,
seguido de la liberación y recuperación de la cadena seleccionada
con biotina; de forma importante, los cebadores usados para la
biotinilación se seleccionan de tal forma que se seleccionan
cadenas de polaridad opuesta a partir de los bancos de ADNc
"inducidos" frente "no inducidos".
La señal de biotina en el caso del ADN
"inducido" es lábil, ya que el brazo espaciador a través del
cual se une el resto de biotina contiene un enlace disulfuro, y la
señal en el ADN "no inducido" es estable. En este caso, la
cadena sencilla de la población "inducida" se libera por
tratamiento con DTT, perdiendo su señal de biotina, y la cadena
sencilla de la población "no inducida" se libera por
desnaturalización de la molécula de avidina, mientras que retiene su
señal de biotina. Cuando el ADN "diana" recuperado (cadena
sencilla de la biblioteca "inducida") se hibrida con el ADN
"director" recuperado (cadena sencilla de la biblioteca
"inducida de forma simulada" o "no inducida"), los
complejos que se forman y el exceso de ADN "director" pueden
retirarse por cromatografía de afinidad de avidina. El ADN
"diana" restante aún lleva las secuencias de cebador, haciendo
muy sencilla su recuperación por medio de la reparación posterior o
amplificación y clonación.
En el esquema alternativo, se recuperan tanto los
ADN monocatenarios "diana" como "director" por
desnaturalización de la avidina en la matriz de afinidad, reteniendo
ambos tipos sus señales de biotina. Después de la hibridación,
todas las moléculas se unen a la matriz de afinidad y, después del
lavado, el ADN "diana" no hibridado, que lleva la señal de
afinidad "susceptible", se eluye selectivamente de la matriz
por DTT.
Esta modificación permite una selección positiva
del ADN "diana" monocatenario, evitando problemas potenciales
con la unión menor que cuantitativa de la mezcla de hibridación a
la matriz de afinidad. La ventaja de esta técnica con respecto a las
descritas previamente es la capacidad de aislar los genes que se
activan sólo a bajos niveles, en circunstancias específicas, y que
pueden participar de forma causal en algunos fenómenos biológicos
importantes.
En las dos formas de la técnica descrita
anteriormente, el ADN monocatenario "diana" y "director"
se genera por cromatografía de afinidad de
biotina-avidina.
Un método alternativo para generar estas
poblaciones de una sola cadena es un método descrito como PCR
"asimétrica" (Gyllensten y Erlich, 1988). Este método consta de
múltiples ciclos de extensión de polimerasa y desnaturalización,
como en la PCR, pero en presencia de únicamente uno de los
cebadores. El cebador elegido determina la polaridad del ADN
resultante, permitiendo de esta manera la polaridad selectiva
crítica para la técnica como se ha descrito anteriormente. En este
caso, la PCR asimétrica se realiza más fácilmente usando como
plantilla una pequeña cantidad de productos de PCR bicatenarios de
la población relevante, a partir de la cual se ha retirado el exceso
de cebadores.
Sección
4
Esta sección describe combinaciones de secuencias
de ADNc con secuencias que promueven la transcripción de los ADNc y
con las que facilitan el procesamiento del extremo 3' del ARNm en
las células vegetales. La primera serie de ejemplos incluye la
construcción de plásmidos que contienen el cassette de expresión y
la segunda sección describe la subclonación de ADNc en los cassettes
tanto en la orientación con sentido como en la orientación
anti-sentido.
Sección
4A
pCGN1509 es un plásmido de cassette de expresión
que contiene la región reguladora 5' y el promotor de un gen de la
subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco, y la región 3' del gen de
la octopina sintasa (ocs) del plásmido Ti de A.
tumefaciens, con sitios de restricción únicos entre estas dos
partes. La región reguladora 5' finalmente se obtiene a partir de un
fragmento EcoRI de 3,4 kb que contiene el gen de la subunidad
pequeña de RUBISCO de tabaco TSSU3-8 (O'Neal et al.,
1988).
El fragmento EcoRI de 3,4 kb de
TSSU3-8 se clona en el sitio EcoRI de M13 mp18
(Yanisch-Perron et al., 1985) para producir un clon
de M13 8B. Como plantilla para extender el cebador
oligonucleotídico "Sonda 1" (O'Neal et al., 1987) se usa ADN
monocatenario usando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I.
Los productos de extensión se tratan con nucleasa de Vinca
radiata y después se digieren con HindIII para producir un
fragmento de 1450 pb que contiene la región promotora de la
subunidad pequeña; el fragmento se clona en pUC18 digerido con
HindIII-SmaII (Yanisch-Perron et
al., 1985) para producir pCGN625. El fragmento
BamHI-EcoRI de pCGN625 se clona en el fragmento
grande BamHI-EcoRI (esqueleto plasmídico) de
pCGN607 digerido con BamHI-EcoRI en el que el sitio
SmaI en la posición 11207 (Barker et al., 1983) de la región ocs 3'
se convierte en un sitio BglII por unión de un engarce BglII
sintético (Facciotti et al., 1985). Esto produce el plásmido
pCGN630. El sitio BamHI de pCGN630 se deleciona por digestión con
BamHI y por tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN
polimerasa I para crear pCGN1502. El sitio KpnI de pCGN1502 se
reemplaza por un sitio BamHI por digestión de pCGN1502 con KpnI,
tratamiento con la enzima de Klenow y unión de un engarce sintético
BamHI. La construcción resultante es pCGN1509.
pCGN1761 contiene un promotor doble 35S de CaMV y
la región tm-I 3' con un sitio EcoRI entre
ellos, contenidos en un esqueleto plasmídico derivado de pUC. El
cassette del sitio de procesamiento
promotor-EcoRI-3' está bordeado por
múltiples sititos de restricción para permitir una eliminación
fácil. El plásmido se obtiene por una serie de etapas (véase más
adelante) a partir de un plásmido inicial doble 35S, pCGN2113, que
procede de pCGN164 y pCGN638.
pCGN1431 también contiene el promotor doble 35S
de CaMV y la región tm-1 3' con un sitio de
clonación múltiple entre ellos. Este cassette de promotor/terminador
está contenido en un vector derivado de pUC que contiene un gen de
resistencia a cloranfenicol en lugar de un gen de resistencia a
ampicilina. El cassette está bordeado por múltiples sitios de
restricción para facilitar la eliminación.
A. Construcción de pCGN986. pCGN986
contiene un promotor 35S de CaMV y una región de
ADN-T tm-I 3' con múltiples
sitios de restricción entre ellos. pCGN986 procede de otro
plásmido, pCGN206, que contiene un promotor 35S de CaMV y una región
3' diferente, la región de extremo 3' VI de CaMV. El promotor 35S
de CaMV se clona como un fragmento AluI (pb
7144-7734) (Gardner et al., 1981) en el sitio
HincII de M13mp7 (Messing et al., 1981) para crear C614. Una
digestión con EcoRI de C614 produce el fragmento EcoRI de C614 que
contiene el promotor 35S que se clona en el sitio EcoRI de pUC8
(Vieira y Messing, 1982) para producir pCGN147.
El pCGN148a, que contiene una región promotora,
un marcador selectivo (kanamicina con 2 ATG) y una región 3', se
prepara por digestión de pCGN528 con BglII e inserción del
fragmento promotor BamHI-BglII procedente de
pCGN147. Este fragmento se clona en el sitio BglII de pCGN528 de
forma que el sitio BglII esté próximo al gen de kanamicina de
pCGN528.
El vector lanzadera, pCGN528, usado para esta
construcción se obtiene como se indica a continuación: pCGN525 se
obtiene por digestión de un plásmido que contiene Tn5 que lleva un
gen de kanamicina (Jorgensen et al., 1979) con
HindIII-BamHI e insertando el fragmento
HindIII-BamHI que contiene el gen de resistencia a
kanamicina en los sitios HindIII-BamHI en el gen de
tetraciclina de pACY184 (Chang y Cohen, 1978). pCGN526 se obtiene
por la inserción del fragmento BamHI 19 de pTiA6 (Thomashow et al.,
1980) modificado con engarces XhoI insertado en el sitio SmaI, en
el sitio BamHI de pCGN525. pCGN528 se obtiene delecionando el XhoI
pequeño y volviendo a realizar la unión.
pCGN149a se obtiene por clonación del fragmento
del gen de kanamicina BamHI desde pMB9kanXXI en el sito BamHI de
pCGN148a. pMB9KanXXI es una variante de pUC4K (Vieira y Messing,
1982) que carece del sitio XhoI pero contiene un gen de kanamicina
funcional de Tn903 para permitir una selección eficaz en
Agrobacterium.
pCGN149a se digiere con HindIII y BamHI y se une
a pUC8 digerido con HindIII y BamHI para producir pCGN169. Esto
retira el marcador de kanamicina Tn903. Tanto pCGN565 como pCGN169
se digieren con HindIII y PstI y se unen para formar pCGN203, un
plásmido que contiene el promotor 35S de CaMV y parte del extremo
5' del gen de kanamicina TN5 (hasta el sitio PstI, Jorgensen et
al., 1979). Se añade una región reguladora 3' a pCGN223 desde
pCGN204 (un fragmento EcoRI de CaMV (pb 408-6105)
que contiene la región 3' del gen VI subclonada en pUC18 (Gardner et
al.,1981) por digestión con HindIII y PstI y unión. El cassette
resultante, pCGN206, es la base para la construcción de
pCGN986.
Las secuencias de ADN-T
tm-I 3' de pTiA6 se subclonan desde el
fragmento Bam19 ADN-T (Thomashow et al., 1980) como
un fragmento BamHI-EcoRI (nucleótidos 9062 a 12,
823, numeración como en Barker et al., 1983) y se combinan con el
origen de replicación de pACYC184 (Chang y Cohen, 1978) como un
fragmento EcoRI-HindII y un marcador de resistencia
a gentamicina (del plásmido pLB41), [D. Figurski] como un fragmento
BamHI-HindII para producir pCGN417.
El único sitio SmaI de pCGN417 (nucleótido 11.207
del fragmento Bam19) se cambia a un sitio SacI usando engarces y el
fragmento BamHI-SacI se subclona en pCGN565 para dar
pCGN971. El sitio BamHI de pCGN971 se cambia a un sitio EcoRI
usando engarces para producir pCGN971E. El fragmento
EcoRI-SacI resultante de pCGN971, que contiene las
secuencias reguladoras tm-1 3', se une a
pCGN206 por digestión con EcoRI y SacI para dar pCGN975. La parte
pequeña del gen de resistencia a kanamicina Tn5 se deleciona del
extremo 3' del promotor 35S de CaMV por digestión con salI y BglII,
haciendo romos los extremos y por unión con engarces Sail. El
cassette de expresión final pCGN986 contiene el promotor 35S de
CaMV seguido de dos sitios Sail, un sitio XbaI, BamHI, SmaI KpnI y
la región 3' de tm-1 (nucleótidos
11207-9023 del ADN-T).
B. Construcción de pCGN164. El fragmento
AluI de CaMV (pb 7144-7735) (Gardner et al., 1981)
se obtiene por digestión con AluI y se clona en el sitio HincII de
M13mp7 (Vieira y Messing, 1982) para crear C614. Una digestión con
EcoRI de C614 produce el fragmento EcoRI de C614 que contiene el
promotor 35S, que se clona en el sitio EcoRI de pUC8 (Vieira y
Messing, 1982) para producir pCGN146. Para recortar la región
promotora, el sitio BglII (pb 7670) se trata con BglII y Bal31 y
posteriormente se une un engarce BglII al ADN tratado con Bal31 para
producir pCGN147. PCGN147 se digiere con EcoRI y HphI y el
fragmento EcoRI-HphI resultante que contiene el
promotor 35S se une a M13mp8 digerido con
EcoRI-SmaII (Vieira y Messing, 1982) para crear
pCGN164.
C. Construcción de pCGN638. La digestión
de CaMV10 (Gardner et al. 1981) con BglII produce un fragmento
BglII que contiene una región promotora 35S (pb
6493-7670) que se une al sitio BamHI de pUC19
(Norrander et al., 1983) para crear pCGN638.
D. Construcción de pCGN2113. pCGN164 se
digiere con EcoRV y BamHI para liberar un fragmento
EcoRV-BamHI que contiene una porción del promotor
35S (pb 7340-7433); pCGN638 se digiere con HindIII
y EcoRV para liberar un fragmento HindIII-EcoRV que
contiene una porción diferente del promotor 35S (pb
6493-7340). Estos dos fragmentos se unen en pCGN986
que se ha digerido con HindIII y BamHI para retirar el fragmento
KindIII-BamHI que contiene el promotor 35S; esta
unión produce pCGN639 que contiene el esqueleto y la región 3' de
tm-l de pCGN986 y los dos fragmentos
promotores 35S de pCGN164 y pCGN638. pCGN638 se digiere con EcoRV y
DdeI para liberar un fragmento del promotor 35S (pb
7070-7340); el fragmento se trata con el fragmento
de Klenow de la ADN polimerasa I para crear extremos romos, y se
une al sitio EcoRV de pCGN639 para producir pCGN2113, que tiene el
fragmento en la orientación apropiada.
E. Construcción de pCGNT1761. El pCGN2113
se digiere con EcoRI y el plásmido se une en presencia de un
adaptador de ADN sintético que contiene un sitio XbaI y un sitio
BamHI (el adaptador contiene extremos adherentes EcoRI en cualquiera
de los extremos, pero las bases adyacentes son tales que no se
reconstruye un sitio EcoRI en esta localización) para producir
pCGN2113M. pCGN2113M se digiere completamente con SacI y después se
somete a digestión parcial con BamHI. Este ADN después se trata con
la ADN polimerasa de T4 para crear extremos romos y un engarce EcoRI
se une al plásmido de extremos romos. Después de la transformación,
se selecciona un clon plasmídico que contiene un sitio EcoRI único
entre el promotor y la región 3' tm-l
intacta, y se denomina pCGN1761.
F. Construcción de pCGN1431. El fragmento
SalI-EcoRI de pCGN2113, que contiene el cassette
promotor-poliengarce-3' entero, se
retira por digestión con SalI-EcoRI y se clona en
pCGN565 digerido con salI-EcoRI para crear pCGN2120;
pCGN565 es un vector de clonación basado en pUC8-Cm
[K. Buckley, tesis doctoral, UC San Diego 1985] pero que contiene el
poliengarce de pUC18 (Yanisch-Perron et al, 1985].
pCGN2120 se digiere completamente con PstI y después se vuelve a
unir. Se selecciona un clon que tenga delecionado sólo el fragmento
PstI-PstI de 858 pb (9207-10065,
Barker et al., 1983) de la región 3' tm-l
para crear pCGN1431.
Sección
4B
El fragmento EcoRI de 807 pb de
pBSPR1-207 se subclona en pCGN1509 digerido con
EcoRI y se seleccionan los plásmidos que llevan el ADNc en cada una
de las dos orientaciones posibles; el plásmido en el que sería de
esperar que el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO de
tabaco generara un transcrito con la cadena con sentido de ARNm de
PR1a se denomina pCGN1752A, y el plásmido en el que sería de
esperar que el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco
generara un transcrito con la cadena anti-sentido
(es decir, la secuencia complementaria del ARNm) de PR1a se
denomina pCGN1752B.
El fragmento EcoRI de 717 pb de
pBSPR1-1023 se subclona en pCGN1509 digerido con
EcoRI y se seleccionan los plásmidos que llevan el ADNc en cada una
de las dos orientaciones posibles; el plásmido en el que sería de
esperar que el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO de
tabaco generara un transcrito con la cadena con sentido de ARNm de
PR-1b se denomina pCGN1753A, y el plásmido en el
que sería de esperar que el promotor de la subunidad pequeña de
RUBISCO de tabaco generara un transcrito con la cadena
anti-sentido (es decir, la secuencia complementaria
del ARNm) de PR-1b se denomina pCGN1753B.
Se libera un fragmento EcoRI de 807 pb que lleva
un ADNc de PR1a de tabaco a partir de pBSPR1-207
por digestión con EcoRI y se subclona en pCGN565 digerido con EcoRI
para producir pCGN1750. Se libera un fragmento EcoRI de 717 pb que
lleva la región codificante entera de un ADNc de
PR-1b de tabaco a partir de
pBSPR1-1023 por digestión con EcoRI y se subclona en
pCGN565 digerido con EcoRI para producir pCGN1751. Estos dos
plásmidos se construyen para facilitar los experimentos de
subclonación posteriores.
El fragmento EcoRI de 807 pb de pCGN1750 se
subclona en pCGN1761 digerido con EcoRI y se seleccionan los
plásmidos que llevan el ADNc en cada una de las dos orientaciones
posibles; el plásmido en el que sería de esperar que el promotor
doble 35S generara un transcrito con la cadena con sentido de ARNm
de PR-1a se denomina pCGN1762A, y el plásmido en el
que sería de esperar que el promotor doble 35S generara un
transcrito con la cadena anti-sentido (es decir, la
secuencia complementaria del ARNm) de PR-1a se
denomina pCGN1762B.
El fragmento EcoRI de 717 pb de pCGN1750 (véase
anteriormente) se subclona en pCGN1751 digerido con EcoRI y se
seleccionan los plásmidos que llevan el ADNc en cada una de las dos
orientaciones posibles; el plásmido en el que sería de esperar que
el promotor doble 35S generara un transcrito con la cadena con
sentido de ARNm de PR-1b se denomina pCGN1763A, y el
plásmido en el que sería de esperar que el promotor doble 35S
generara un transcrito con la cadena anti-sentido
(es decir, la secuencia complementaria del ARNm) de
PR-1b se denomina pCGN1763B.
El plásmido pBSPRR-401 se digiere
parcialmente con EcoRI y los fragmentos de ADN resultantes se
separan en un gel de agarosa LTG al 1,0%. Se escinde una banda de
aproximadamente 900 pb que contiene el inserto de ADNc de
PR-R de longitud completa y se une a pCGN1761 que
se ha dirigido completamente con EcoRI y se ha desfosforilado usando
fosfatasa alcalina de intestino de ternero. El ADN se une y se
utiliza para la transformación como se ha descrito anteriormente, se
seleccionan colonias positivas y se analizan sus plásmidos. Se
selecciona un plásmido que contiene el ADNc de PR-R
en una orientación con sentido con respecto al promotor doble 35S de
CAMV y se denomina pCIB1002. Se selecciona un segundo plásmido, en
el que el ADNc de PR-R está en una orientación
anti-sentido con respecto al promotor 35S de CaMV y
se denomina pCIB1003.
El plásmido pBScht28 (véase anteriormente) se
digiere con EcoRI y los fragmentos se separan en un gel de agarosa
LGT al 0,5%. La banda que contiene el ADNc de PR-P
se escinde y se mezcla con pCGN1761 (véase anteriormente) que se ha
digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de
agarosa LGT al 0,5%. La mezcla se une y se utiliza para la
transformación como se ha descrito. Se seleccionan plásmidos para
la inserción del ADNc de PR-P en cualquier
orientación. El plásmido en el que el ADNc de PR-P
se inserta en una orientación con sentido con respecto al promotor
doble 35S de CaMV se denomina pCIB1020. El plásmido en el que el
ADNc de PR-P se inserta en una orientación
anti-sentido con respecto al promotor doble 35S de
CaMV se denomina pCIB1021.
La secuencia de ADNc de longitud completa para
PR-Q está contenida en dos plásmidos diferentes,
pBScht15 contiene el extremo 3' del ADNc y
pBScht5'-4 contiene el extremo 5' del ADNc. Debido
a esta situación, los plásmidos pCIB1022 y pCIB1023 se construyen en
una unión de tres vías y difieren en su orientación en el vector
pCGN1761. pCGN1761 se digiere con EcoRI, se trata con CIAP y se
purifica en un gel de agarosa LGT al 0,5%. pBScht15 (véase
anteriormente) se digiere con NsiI y EcoRI y los fragmentos se
separan en un gel de agarosa LGT al 0,5%. Se realiza una PCR usando
pBScht5'- 4 (véase anteriormente) como plantilla y los
oligonucleótidos
como cebadores para amplificar el extremo 5' del
ADNc de PR-Q. El producto de PCR se purifica y
digiere con NsiI y EcoRI y el producto de 210 pb se purifica en un
gel de agarosa LGP al 1,0%. El vector pCGN1761 purificado, el
fragmento NsiI/EcoRI de 810 pb de pBScht15 y el fragmento de PCR
digerido con NsiI/EcoRI se unen y se utilizan para la transformación
como se ha descrito anteriormente. Se investigan y seleccionan los
transformantes que incluyen el ADNc entero en cualquier
orientación. El plásmido que tiene el ADNc de PR-Q
de longitud completa en una orientación con sentido con respecto al
promotor doble 35S de CaMV se denomina pCIB1022. El plásmido en el
que el ADNc de PR-Q de longitud completa se inserta
en la orientación anti-sentido con respecto al
promotor se denomina
pCIB1023.
El ADNc de PR-O' clonado en
pBSGL6e está truncado en el extremo 5' y carece de casi toda la
secuencia señal completa. Esta secuencia es necesaria para el
transporte extracelular de la proteína y debería reemplazarse para
obtener por ingeniería genética plantas transgénicas que secreten
la proteína. Este ejemplo describe la subclonación del ADNc de
PR-O' en el cassette de expresión de promotor doble
35S de CaMV de tal forma que se añade un péptido señal de
PR-1a a la proteína PR-O'.
Esta construcción se realiza como una unión
complicada de tres vías. Primero se realiza una fusión del líder de
PR-1a y el péptido señal y la secuencia codificante
de la PR-O' madura se obtiene por un método de
fusión génica por PCR. Después, esta pieza se une junto con el
extremo 3' del ADNc de PR-O' en el vector pCGN1761
y se seleccionan los transformantes con el inserto en cualquier
orientación con respecto al promotor.
Ho et al. (1989) ha creado una técnica de fusión
génica basada en la amplificación por PCR. En esta técnica, se
realiza una fusión génica creando dos fragmentos con extremos
solapantes por PCR. En una reacción posterior, estos dos fragmentos
después se fusionan también por PCR para generar una fusión
perfecta entre las dos moléculas. Esta estrategia se usa para
fusionar el péptido señal de PR-1a y el líder al
ADNc de PR-O'. Se sintetizan 4 oligonucleótidos con
las siguientes secuencias:
Los oligonucleótidos GP50 y GP51 son
complementarios entre sí y contienen la secuencia de ADN deseada
para la fusión entre el líder de PR-1a y la señal y
la secuencia codificante madura de PR-O'. Esto se
esquematiza a continuación:
El oligonucleótido GP52 tiene la misma secuencia
que el extremo 5' del ADNc de PR-1a y contiene en
el extremo 5' una secuencia que codifica un sitio EcoRI.
El oligonucleótido GP53 sirve como cebador y es
complementario a las posiciones 180 a 195 de la secuencia de
PR-O', secuencia 7.
Para fusionar las dos piezas de ADN se preparan
dos PCR. Una usa el plásmido pBSPR1-207 como
plantilla y los dos cebadores GP52 y GP50; la otra usa pBSGL6e como
plantilla y los cebadores GP51 y GP53. Los productos de PCR se
analizan por electroforesis en gel. Los productos de PCR después se
purifican y se usa una alícuota de cada uno en una PCR de segunda
fase. En esta reacción, las plantillas son los dos productos de las
dos primeras reacciones y los cebadores son GP52 y GP53. Se
establece una PCR modificada de tal forma que en la primera vuelta
de síntesis se añadan las plantillas de ADN sin los cebadores y las
plantillas se calientan y se dejan enfriar y después se extienden a
65ºC. Después se añaden los dos cebadores y la PCR se realiza
normalmente. Se analiza una alícuota de los productos de PCR por
electroforesis en gel. El ADN restante después se purifica y se
digiere con SacI y EcoRI y el producto de digestión se somete a
electroforesis en un gel de agarosa LGT al 1,5%. La banda
correspondiente al producto de PCR correcto se escinde y se usa para
la unión.
El plásmido pBSGL6e se digiere tanto con SacI
como con EcoRI y el producto de digestión se somete a
electroforesis en un gel de agarosa LGT al 0,5%. La banda de 1,0 kb
que contiene el fragmento PR-O' grande se escinde y
se une con el producto de PCR SacI-EcoI anterior y
el plásmido pCGN1761 que se ha digerido con EcoRI y CIAP y se
purifica en un gel de agarosa LGT al 0,5%.Los fragmentos se unen y
se utilizan para la transformación como se ha descrito
anteriormente. Los transformantes se seleccionan con respecto a la
construcción correcta. El plásmido en el que el líder y la señal de
PR-1a se han fusionado a la secuencia codificante
madura de PR-O' y está en la orientación con sentido
con respecto al promotor se denomina pCIB1024; esta construcción se
confirma por secuenciación del ADN. El plásmido con la fusión
correcta pero en la orientación opuesta con respecto al promotor se
denomina pCIB1025. Esta construcción también se verifica por
secuenciación del ADN.
El plásmido pBSGL5B-12, que
contiene un ADNc de longitud completa que codifica la proteína
PR-O', se digiere con EcoRI y los fragmentos se
separan en un gel de agarosa LGT al 0,5%. La banda de 1,2 kb se
escinde y se une con pCGN1761, que se digiere con EcoRI, se trata
con CIAP y se purifica en un gel de agarosa LGT al 0,5% como se ha
descrito anteriormente. La mezcla de unión se utiliza para la
transformación como se ha descrito y los transformantes se
seleccionan con respecto a un clon que contiene el ADNc de
PR-O' en cualquier orientación. El plásmido en el
que el ADNc se inserta en una orientación con sentido con respecto
al promotor doble 35S de CaMV se denomina pCIB1024. El plásmido en
el que el ADNc se inserta en una orientación
anti-sentido con respecto al promotor se denomina
pCIB1025A.
El plásmido pBSGL117 contiene un ADNc de longitud
completa que codifica la proteína PR-2. El ADNc de
PR-2 de pCGN117 se subclona en el plásmido de
expresión pCGN1761 en cualquier orientación para crear pCIB1032 y
pCIB1033. Sin embargo, el ADNc contiene un sitio EcoRI interno y,
de esta forma, el ADNc tiene que escindirse por digestión parcial
con EcoRI.
El plásmido pBSGL117 se digiere con EcoRI en
condiciones en las que se obtiene un producto de digestión parcial.
Los productos de digestión se separan en un gel de agarosa LGT al
0,5% y la banda de 1,2 kb que contiene el ADNc de longitud completa
para PR-2 se escinde y se une a pCGN1761, que se ha
digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de
agarosa LGT al 0,5%. La unión y la transformación se realizan como
se ha descrito previamente. Se aíslan transformantes positivos y se
seleccionan con respecto a la presencia del fragmento de ADNc de
PR-2 grande insertado en cualquier orientación. El
plásmido con el ADNc de PR-2 subclonado en una
orientación con sentido con respecto al sitio de inicio de la
transcripción se denomina pCIB1032 y el plásmido con el fragmento
en una orientación anti-sentido se denomina
pCIB1033. La estructura de estas construcciones puede verificarse
por secuenciación del ADN.
Un plásmido que contiene un ADNc de longitud
completa que codifica la proteína PR-N se usa como
fuente para subclonar el ADNc de PR-N en el plásmido
de expresión pCGN1761 en cualquier orientación. Los plásmidos
resultantes se denominan pCIB1034 y pCIB1035. Sin embargo, el ADNc
contiene un sitio EcoRI interno y, de esta forma, el ADNc tiene que
escindirse por digestión parcial.
El plásmido que contiene el ADNc de
PR-N de longitud completa se digiere con EcoRI en
condiciones en las que se obtiene un producto de digestión parcial.
Los productos de digestión se separan en un gel de agarosa LGT al
0,5% y la banda de 1,2 kb que contiene el ADNc de longitud completa
para PR-N se escinde y se une a pCGN1761, que se ha
digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de
agarosa LGT al 0,5%. La unión y la transformación se realizan como
se ha descrito previamente.
\newpage
Se aíslan transformantes positivos y se
seleccionan con respecto a la presencia del fragmento grande de
ADNc de PR-N insertado en cualquier orientación. El
plásmido con el ADNc de PR-N subclonado en una
orientación con sentido con respecto al sitio de inicio de la
transcripción se denomina pCIB1034 y el plásmido con el fragmento
en una orientación anti-sentido se denomina
pCIB1035. La estructura de estas construcciones se verifica por
secuenciación del ADN.
Un plásmido que contiene un ADNc de longitud
completa que codifica la proteína PR-O se usa como
fuente para subclonar el ADNc de PR-O en el plásmido
de expresión pCGN1761, en cualquier orientación. Los plásmidos
resultantes se denominan pCIB1036 y pCIB1037. Sin embargo, el ADNc
contiene un sitio EcoRI interno y, de esta forma, el ADNc tiene que
escindirse por digestión parcial con EcoRI.
El plásmido que contiene el ADNc de
PR-O de longitud completa se digiere con EcoRI en
condiciones en las que se obtiene un producto de digestión parcial.
Los productos de digestión se separan en un gel de agarosa LGT al
0,5% y la banda de 1,2 kb que contiene el ADNc de longitud completa
para PR-O se escinde y se une a pCGN1761 que se ha
digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de
agarosa LGT al 0,5%. La unión y la transformación se realizan como
se ha descrito previamente. Se aíslan los transformantes positivos
y se seleccionan con respecto a la presencia del fragmento grande
de ADNc de PR-O insertado en cualquier orientación.
El plásmido con el ADNc de PR-O subclonado en una
orientación sen sentido con respecto al sitio de inicio de la
transcripción se denomina pCIB1036 y el plásmido con el fragmento
en una orientación anti-sentido se denomina
pCIB1037. La estructura de estas construcciones se verifica por
secuenciación del ADN.
Un plásmido (pBSGL135 del ejemplo 18B) que
contiene un ADNc de longitud completa que codifica la proteína
PR-2' se usa como fuente para subclonar el ADNc de
PR-2' en el plásmido de expresión pCGN1761 en
cualquier orientación. Los plásmidos resultantes se denominan
pCIB1038 y pCIB1039. Sin embargo, el ADNc contiene un sitio EcoRI
interno y, de esta forma, el ADNc tiene que escindirse por una
digestión parcial con EcoRI.
El plásmido que contiene el ADNc de
PR-2' de longitud completa se digiere con EcoRI en
condiciones en las que se obtiene un producto de digestión parcial.
Los productos de digestión se separan en un gel de agarosa LGT al
0,5% y la banda de 1,2 kb que contiene el ADNc de longitud completa
para PR-2' se escinde y se une a pCGN1761 que se ha
digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de
agarosa LGT al 0,5%.
La unión y la transformación se realizan como se
ha descrito previamente. Se aíslan los transformantes positivos y
se seleccionan con respecto a la presencia del fragmento grande de
ADNc de PR-2' insertado en cualquier orientación. El
plásmido con el ADNc de PR-2' subclonado en una
orientación con sentido con respecto al sitio de inicio de la
transcripción se denomina pCIB1036 y el plásmido con el fragmento
en una orientación anti-sentido se denomina
pCIB1039. La estructura de estas construcciones se verifica por
secuenciación del ADN.
El plásmido pGLN17 es un ADNc híbrido que
codifica la \beta-1,3-glucanasa
básica a partir de N. tabacum (Shinshi et al., 1988) construido por
fusión del extremo 5' del clon pGL31 y el extremo 3' del clon
pGL36. La secuencia codificada en este ADN híbrido es la
siguiente:
\newpage
Secuencia
13
\newpage
Este ADNc está truncado en el extremo 5' y no
codifica el péptido señal entero. Para obtener plantas transgénicas
en las que esta proteína esté dirigida de manera apropiada (es
decir, la vacuola central), es necesario añadir esta secuencia de
nuevo al ADNc truncado. Por lo tanto, el cassette de expresión 35S
doble de CaMV se construye en un proceso de dos etapas. En la
primera etapa, el péptido señal del ADNc se reemplaza por un
péptido señal codificado por el clon genómico. En la segunda etapa,
este "ADNc reparado" se transfiere al vector de expresión.
El plásmido pSGL2 es un subclon del ADNc de
pGLN17. Este plásmido se digiere con ClaI y EcoRI y el fragmento de
1 kb que contiene el ADNc de glucanasa se aísla a partir de un gel
de agarosa LGT. El plásmido pBluescript se digiere con EcoRI, se
trata con CIAP y se purifica en un gel de agarosa LGT.
El plásmido pBS-Gluc 39.1
contiene un inserto de 4,4 kb que incluye la secuencia codificante
de glucanasa, aproximadamente 1,5 kb de la secuencia flanqueante 5',
un intrón de 600 pb y aproximadamente 1 kb de la secuencia
flanqueante 3'. Este plásmido se usa como plantilla en un
experimento de PCR que contiene los dos siguientes cebadores:
El resultado de esta amplificación es producir un
fragmento para reemplazar el extremo 5' truncado del ADNc de la
glucanasa. Se introduce una mutación de una sola base que crea un
sitio EcoRI para facilitar los experimentos de clonación. El
producto de PCR se digiere con EcoRI y ClaI y los fragmentos se
separan en un gel de agarosa LGT al 2,0%. Se escinde una banda de
120 pb, se mezcla con el fragmento ClaI-EcoRI de 1
kb procedente de pSGL2 y el vector bluescript digerido con EcoRI,
purificado, se une y se utiliza para la transformación como se ha
descrito anteriormente. Los transformantes se seleccionan con
respecto a la presencia del inserto y el plásmido con la estructura
apropiada se denomina pCIB 1009.
El plásmido pCIB1009 se digiere con EcoRI y el
fragmento de 1,2 kb se purifica en un gel de agarosa LGT. El
plásmido pCGN1761 se digiere con EcoRI, se trata con CIAP, se
purifica en un gel de agarosa LGT, se mezcla con el fragmento EcoRI
de 1,2 kb y después se une y se utiliza para la transformación. Los
transformantes se seleccionan con respecto a la presencia del
inserto. El plásmido en el que el ADNc de la glucanasa está en una
orientación con sentido con respecto al promotor de CaMV se
denomina pCIB1005B. Otro plásmido, con el inserto de ADNc en una
orientación anti-sentido se denomina pCIB1006B.
El plásmido pSCH10 contiene un inserto de ADNc de
la quitinasa básica de tabaco que es similar al inserto de pCHN50
(Shinshi, H. et al, 1987), pero con una extensión de 81 pb en el
extremo 5'. Las 80 pb extra son:
pSCH10 se digiere con BamHI y después se une con
un adaptador molecular a la secuencia 5'GATCCGGAATTCCG3' como se
describe en el ejemplo 5. El producto de unión después se purifica
y se digiere con EcoRI y el fragmento de 1,2 kb que contiene el ADNc
de la quitinasa adaptado se purifica a partir de un gel de agarosa
LGT.
Este fragmento se mezcla con pCGN1761 tratado con
CIAP y digerido con EcoRI que también se purifica a partir de un
gel de agarosa LGT y la mezcla se utiliza para la unión y
transformación.
Los transformantes se seleccionan con respecto al
inserto de ADNc de quitinasa y el plásmido que contiene el ADNc de
quitinasa en una orientación con sentido con respecto al promotor
de CaMV se denomina pCIB1007.
El plásmido con el ADNc de quitinasa en una
orientación anti-sentido con respecto al promotor
se denomina pCIB1008.
El ADNc de pSAR8.2 (véase anteriormente) se
subclona en el cassette promotor doble 35S de CaMV/terminador
3'tm-l pCGN1431 (véase anteriormente) usando
un método de amplificación por PCR. Se sintetizan cuatro
oligonucleótidos, dos para cada una de las construcciones con
sentido y anti-sentido, y cada uno de 33 nucleótidos
de longitud, para uso como cebadores para generar la secuencia de
ADNc de pSAR8.2a por PCR usando el plásmido pSAR8.2a como plantilla.
Los cebadores contienen secuencias adicionales en sus extremos 5'
que generan nuevos sitios de restricción tras completar la
amplificación por PCR.
Para la construcción con sentido, la secuencia
del oligonucleótido 1167 es
que genera un sitio SstI próximo al extremo 3' de
la secuencia de ADNc. La secuencia del oligonucleótido 1168
es
y genera un sitio BamHI próximo al extremo 5' del
ADNc. Para la construcción anti-sentido, la
secuencia del oligonucleótido 1224
es
que genera un sitio BamHI próximo al extremo 3'
del ADNc. La secuencia del oligonucleótido 1225
es
y genera un sitio SstI próximo al extremo 5' del
ADNc.
Los oligonucleótidos 1167 y 1168 se usan en una
PCR en la que el plásmido pSAR8.2 sirve como plantilla de ADN. El
producto de PCR purificado generado en esta reacción se digiere con
SstI y BamHI se clona en pCGN1431 que se digiere con SstI y BamHI.
EL ADN se utiliza para la transformación y los plásmidos se
seleccionan con respecto a la presencia del inserto de ADNc de
pSAR8.2 en una orientación con sentido con respecto al promotor
doble 35S de CaMV. Los supuestos plásmidos después se someten a
secuenciación del ADN y el que tiene la orientación apropiada y no
contiene mutaciones introducidas, se denomina pCGN1788A.
Para la construcción
anti-sentido, se usan los oligonucleótidos 1224 y
1225 en una PCR como se ha descrito anteriormente. Después de la
digestión con SstI y BamHI, el ADN se clona en pCGN1431 digerido
con SstI y BamHI. Los supuestos plásmidos positivos se seleccionan
con respecto a la inserción del ADNc en una orientación
anti-sentido con respecto al promotor y las
construcciones se verifican por secuenciación del ADNc entero. El
plásmido en el que el ADNc se inserta en la orientación correcta y
la secuencia de ADN es correcta, se denomina pCGN1788B.
El plásmido, pBScuccht5 (también denominado
pBScucchi/quitinasa) se digiere con EcoRI y los fragmentos se
separan en una gel de agarosa LGT al 0,5%. La banda de 1,2 kb se
escinde y se une con pCGN1761 que se ha digerido con EcoRI, tratado
con CIAP y purificado en un gel de agarosa LGT al 0,5% como se ha
descrito anteriormente. La mezcla de unión se utiliza para la
transformación como se ha descrito y se seleccionan los
transformantes que contienen el ADNc de quitinasa/lisozima en
cualquier orientación. El plásmido en el que el ADNc se inserta en
una orientación con sentido con respecto al promotor doble 35S de
CaMV se denomina pCIB1000. El plásmido en el que el ADNc se inserta
en una orientación anti-sentido con respecto al
promotor doble de CaMV se denomina pCIB1001.
\newpage
Sección
5
Esta sección detalla la construcción de vectores
binarios que contienen todos los genes quiméricos. La primera
sección explica el desarrollo de los vectores binarios a usar y la
segunda sección detalla la subclonación del cassette de expresión en
el vector binario.
Sección
5A
pCGN783 es un plásmido binario que contiene los
bordes de ADN-T izquierdo y derecho del plásmido Ti
de la octopina de A. tumefaciens pTiA6 (Currier y Nester,
1976), el gen de resistencia a gentamicina de pPh1JI (Hirsch y
Beringer, 1984), el promotor 35S de CaMV (Gardner et al., 1981), el
gen de resistencia a kanamicina de Tn5 (Jorgensen et al., 1979), y
la región 3' del transcrito 7 de pTiA6 (Currier y Nester, 1976). El
vector se construye en un proceso de múltiples etapas detallado a
continuación.
A. Construcción de pCGN739. Para obtener
el marcador de resistencia a gentamicina, el gen de resistencia se
aísla a partir de un fragmento EcoRI-PstI de 3,1 kb
de pPhIJI (Hirsch y Beringer, 1984) y se clona en pUC9 (Vieira y
Messing, 1982), produciendo pCGN549. El fragmento
HindIII-BamHI de pCGN549 que contiene el gen de
resistencia a gentamicina reemplaza al fragmento
HindIII-BglII de pCGN587 (anterior) construyendo
pCGN594. La región HindIII-BamHI de pCGN594 que
contiene un fragmento ocs-kanamicina-ocs se reemplaza
por la región de poliengarce HindIII-BamHI de pUC18
(Yanisch-Perron et al., 1985) para obtener
pCGN739.
B. Construcción de pCGN726C. pCGN566
contiene el engarce EcoRI-HindIII de pUC18
(Yanisch-Perron et al., 1985), insertado en los
sitios EcoRI-HindIII de pUC13-cm
[K. Buckley, tesis doctoral, UC San Diego 1985]. El fragmento
HindIII-BglII de
pNW31c-8,29-1 (Thomashow et al.,
1980) que contiene la ORF1 y 2 (Barker et al., 1983) se subclona en
los sitios HindIII-BamHI de pCGN566 produciendo
pCGN703. El fragmento Sau3A de pCGN703 que contiene la región 3' del
transcrito 7 de pTiA6 (que corresponde a las bases
2396-2920 de pTi5955 (Barker et al., 1983) se
subclona en el sitio BamHI de pUC18 (Yanisch-Perron
al., 1985) produciendo pCGN709. La región de poliengarce
EcoRI-SmaI de pCGN709 se reemplaza por el fragmento
EcoRI-SmaI de pCGN587 (para la producción, véase más
adelante) que contiene el gen de resistencia a kanamicina (APH3'II)
produciendo pCGN726. El fragmento EcoRI-SalI de
pCGN726 más el fragmento BglII-EcoRI de pCGN734 se
insertan en los sitios BamHI-SalI de pUC8-
pUC13-cm [resistente a cloranfenicol, K. Buckley,
tesis doctoral, UC San Diego 1985] produciendo pCGN738. Para
construir pCGN734, el fragmento HindIII-SphI de
pTiA6 correspondiente a las bases 3390- 3241 (Barker et al., 1983)
se clona en el sitio HindIII-SphI de M13mp19
(Yanisch-Perron et al., 1985: Norrander et al.,
1983). Usando un oligonucleótido correspondiente a las bases 3287 a
3300, la síntesis de ADN se ceba a partir esta plantilla. Después
de un tratamiento con la nucleasa S1 y digestión con HindIII, el
fragmento resultante se clona en el sitio
HindIII-SmaI de pUC19
(Yanisch-Perron et al., 1985). El fragmento
EcoRI-HindIII resultante correspondiente a las bases
3287-3390 (Barker et al., 1983), se clona con el
fragmento EcoRI-HindIII de pTiA6 (correspondiente a
las bases 3390-4494) en el sitio EcoRI de pUC8
(Vieira y Messing, 1982), obteniéndose pCGN374. pCGN726c procede de
pCGN738 por deleción del fragmento EcoRI-EcoRI de
900 pb.
C. Construcción de pCGN766C. EL fragmento
HindIII-BamHI de pCGN167 (véase infra) que contiene
el promotor 35S de CaMV, 1 ATG-gen de kanamicina y
el fragmento 19 BamHI de pTiA6 se clona en los sitios
BamHI-HindIII de pUC19 (Norrander et al., 1983;
Yanisch-Perron et al., 1985) construyendo pCGN976.
El promotor 35S y la región 3' del transcrito 7 se desarrollan
insertando un fragmento HindIII-EcoRI de 0,7 kb de
pCGN976 (promotor 35S) y el fragmento EcoRI-SalI de
0,5 kb de PCGN709 (transcrito 7:3') en los sitios
HindIII-SalI de pCGN566 construyendo pCGN766c. Para
construir pCGN167, se obtiene el fragmento AluI de CaMV (pb
7144-7735) (Gardner et al 1981) por digestión con
AluI y se clona en el sitio HincII de M13mp7 (Vieira y Messing,
1982) para crear C614. Un producto de digestión EcoRI de C614
produce el fragmento EcoRI de C614 que contiene el promotor 35S que
se clona en el sitio EcoRI de pIC8 (Vieira y Messing, 1982) para
producir pCGN146. Para cortar la región promotora, el sitio BglII
(pb 7670) se trata con BglII y Bal31 y posteriormente se une un
engarce BglII al ADN tratado con Bal31 para producir pCGN147. Se
prepara pCGN148a que contiene una región promotora, un marcador
selectivo (KAN con 2 ATG) y la región 3' por digestión de pCGN528
(véase más adelante) con BglII y la inserción del fragmento
promotor BamHI-BglII de pCGN147. Este fragmento se
clona en el sitio BglII de pCGN528, de forma que el sitio BglII
esté próximo al gen de kanamicina de pCGN528. El vector lanzadera
usado para esta construcción, pCGN528, se obtiene como se indica a
continuación. pCGN525 se obtiene por digestión de un plásmido que
contiene Tn5 que lleva un gen de kanamicina (Jorgenson et al.,
1979) con HindIII-BamHI e inserción del fragmento
HindIII-BamHI que contiene el gen de kanamicina en
los sitios HindIII-BamHI en el gen de tetraciclina
de pACYC184 (Chang y Cohen, 1978). pCGN526 se obtiene por inserción
del fragmento BamHI 19 de pTiA6 (Thomashow et al., 1980) en el sitio
BamHI de pCGN525. pCGN528 se obtiene delecionando el fragmento XhoI
pequeño de pCGN526 por digestión con XhoI y una segunda unión.
pCGN149a se obtiene por clonación del fragmento BamHI del gen de
kanamicina procedente de 9MB9KanXXI en el sitio BamHI de pCGN148a.
pMB9KanXXI es una variante de pUC4k (Vieira y Messing, 1982) que
carece del sitio XhoI pero contiene un gen de kanamicina funcional
procedente de Tn903 para permitir la selección eficaz de
Agrobacterium. pCGN149a se digiere con BglII y SphI. Este
fragmento BglII-SphI pequeño de pCGN149A se
reemplaza por el fragmento BamHI-SphI de MI (véase
más adelante) aislado por digestión con BamHI y SphI. Esto produce
pCGN167, una construcción que contiene un promotor de CaMV de
longitud completa, 1 ATG-gen de kanamicina, un
extremo 3' y el gen de kanamicina de tipo Tn903 bacteriano. MI es
un fragmento EcoRI procedente de pCGN550 (véase la construcción de
pCGN587) y se clona en el sitio de clonación EcoRI de M13mp9 de tal
forma que el sitio PstI en el 1 ATG-gen de
kanamicina esté cerca de la región de poliengarce de M13mp9.
D. Construcción de pCGN451. pCGN451
contiene el cassette ocs5'-ocs3' clonado en un
derivado de pUC8 (Vieira y Messing, 1982). El vector modificado se
obtiene por digestión de pUC8 con HincII y unión en presencia del
ADN de engarce sintético, creando pCGN416, y después delecionando
el sitio EcoRI de pCGN416 por digestión con EcoRI seguido de
tratamiento con enzima de Klenow y autounión para crear pCGN426. El
cassette ocs5'-ocs3' se construye por una serie de
etapas a partir de ADN derivado del plásmido Ti de octopina pTiA6
(Currier y Nester, 1976). Un fragmento EcoRI de pTiA6 (pb
13362-16202; la numeración es la de Barker et al.
(1983) para el plásmido Ti muy relacionado pTi 15955) se retira de
pVK232 (Knauf y Nester, 1982) por digestión con EcoRI y se clona en
pACYC184 digerido con EcoRI (Chang y Cohen, 1978) para generar
pCGN15. El fragmento BamHI-EcoRI de 2,4 kb (pb
13774-16202) de pCGN15 se clona en pBR322 digerido
con EcoRI-BamHI (Bolivar et al., 1977) para producir
pCGN429. El fragmento EcoRI-BamHI de 412 pb (pb
13362-13774) de pCGN15 se clona en pBR3322 digerido
con EcoRI-BamHI (Bolivar et al., 1977) para producir
pCGN407. El fragmento promotor cortado se obtiene digiriendo
pCGN407 con XmnI (pb 13512), seguido de resección con la exonucleasa
Bal31, unión de los engarces EcoRI sintéticos y digestión con
BamHI. Se purifican en gel los fragmentos resultantes de
aproximadamente 130 pb y se clonan en M13mp9 (Vieira y Messing,
1982) y se secuencian. Se identifica un clon, I-4,
en el que el engarce EcoRI se ha insertado en el pb 13642 entre el
punto de inicio de la transcripción y el codón de inicio de la
traducción, por comparación con la secuencia de Greve et al.
(1982); el sitio de escisión EcoRI está en la posición 13639, cadena
abajo del sitio de inicio del ARNm. El fragmento
EcoRI-BamHI de 141 pb de I-4, que
contiene el promotor cortado, se clona en pBR322 digerido con
EcoRI-BamHI (Bolivar et al., 1977) para crear
pCGN428. La pieza promotora de EcoRI-BamHI de 141 pb
de pCGN428, y la pieza ocs 5', EcoRI-BamHI
de 2,5 kb procedente de pCGN429 se clonan conjuntamente en pUC9
digerido con EcoRI (Vieira y Messing, 1982) para generar pCGN442,
reconstruyendo la región cadena arriba de ocs con una
sección de promotor cortado. El fragmento HindIII de pLB41 [D.
Figurski] que contiene el gen de resistencia a gentamicina se clona
en pACYC184 digerido con HindIII (Chang y Cohen, 1978) para crear
pcDNA413b. El fragmento BamHI de 4,7 kb de pTiA6 (Currier y Nester,
1976), que contiene la región ocs 3', se clona en pBR325
digerido con BamHI (Bolivar, 1978) para crear
33c-19. El sitio SmaI en la posición 11207 de
33c-19 se convierte en un sitio XhoI usando el ADN
de engarce sintético de XhoI, generando pCGN401.2. El fragmento
BamHI-EcoRI de 3,8 kb de pCGN401.2 se clona en
pCGN413b digerido con BamHI-EcoRI para crear
pCGN419. El cassette ocs5'-ocs3' se genera por
clonación del fragmento EcoRI de 2,64 kb de pCGN442, que contiene
la región 5', en pCGN419 digerido con EcoRI para crear pCGN446. El
fragmento XhoI de 3,1 kb de pCGN446, que tiene la región ocs
5' (pb 13639-15208) y la región ocs 3' (pb
11207-12823), se clona en el sitio XhoI de pCGN426
para crear pCGN451.
E. Construcción de pCGN587. El fragmento
HindIII-SmaI de Tn5 que contiene el gen estructural
entero para APH3'II (Jorgensen et al., 1979) se clona en pUC8
(Vieira y Messing, 1982), esto convierte el fragmento en un
fragmento HindIII-EcoRI, ya que hay un sitio EcoRI
inmediatamente adyacente al sitio SmaI. El fragmento
PstI-EcoRI de pCGN300, que contiene la porción 3' de
gen APH3'II, después se combina con un engarce
EcoRI-BamHI-SalI-PstI
en el sitio EcoRI de pUC7 para obtener pCGN546W. Un codón ATG está
cadena arriba y fuera de la fase de lectura con el codón de
iniciación ATG de APH3'II. El ATG indeseado se evita insertando un
fragmento Sau3A-PstI del extremo 5' de APH3'II,
careciendo dicho fragmento del ATG superfluo, en el sitio
BamHI-PstI de pCGN546W, para proporcionar el
plásmido pCGN550. El fragmento EcoRI de pCGN550 que contiene el gen
APH3'II después se clona el sitio EcoRI de
pUS8-pIC13-cm [K. Buckley (1985),
supra] para dar pCGN551. El plásmido pCGN451 (descrito
anteriormente) que tiene el ocs 5' y el ocs 3' en la orientación
apropiada, se digiere con EcoRI y el fragmento EcoRI de pCGN551 que
contiene el gen de resistencia a kanamicina intacto se inserta en
el sitio EcoRI para proporcionar pCGN552 que tiene el gen de
resistencia a kanamicina en la orientación apropiada. Este gel
ocs/KAN se usa para proporcionar un marcador selectivo para el
vector binario de tipo trans pCGN587. La porción 5' del cassette
del promotor de octopina sintasa modificado por ingeniería genética
consta de ADN de pTiA6 del XhoI en el pb 15208-13644
(Barker et al., 1983) que también contiene la secuencia del límite
del ADN-T (borde) implicada en la transferencia del
ADN-T. En el plásmido pCGN587, el gen ocs/KAN de
pCGN552 proporciona un marcador selectivo así como el borde derecho.
La región límite izquierda primero se clona en M13mp9 como una
pieza HindIII-SmaI (pCGN502) (pb
602-2212) y se vuelve a clonar como un fragmento
KpnI-EcoRI en pCGN565 para proporcionar pCGN580.
pCGN565 es un vector de clonación basado en
pUC-pUC13-Cm, [K. Buckley, tesis
doctoral, UC San Diego 1985] pero que contiene engarces pUC18
(Yanisch-Perron et al., 1985). pCGN580 se linealiza
con BamHI y se usa para reemplazar el fragmento BgII más pequeño de
pVCK102 (Knauf y Nester, 1982) creando pCGN585. Al reemplazar el
fragmento SalI más pequeño de pCGN585 por el fragmento XhoI de
pCGN552 que contiene el gen ocs/KAN, se obtiene pCGN587.
Construcción final de pCGN783. El fragmento
HindIII-EcoRI de 0,7 kb de pCGN766c (promotor
35S-CaMV) se une al fragmento
EcoRI-SalI de 1,5 kb de pCGN726c (región 2 ATG-
KAN-3') en los sitios HindIII-SalI
de pUC119 [Sambrook J. et al., 1989) para producir pCGN778. La
región de 2,2 kb de pCGN778, el fragmento
HindIII-SalI que contiene el promotor 35S de CaMV
(región
1-ATG-KAN-3')
reemplaza a la región de poliengarce HindIII-SalI de
pCGN739 para producir pCGN783.
pCGN1539 y pCGN1540 son vectores de
transformación de plantas binarios que contienen los bordes de
ADN-T izquierdo y derecho del plásmido Ti de
octopina de A. tumefaciens pTiA6 (Currier y Nester, 1976),
el gen de resistencia a gentamicina de pPHiJI (Hirsch y Beringer,
1984), un origen de replicación del plásmido Ri de A.
rhizogenes procedente de pLJB11 (Jouanin et al., 1985), la
región promotora mas y la región mas 3' de pTiA6 con
el gen de resistencia a kanamicina de Tn5 (Jorgensen et al.,
1979), un origen de replicación CoIEI de pBR322 (Bolivar et al.,
1977) y un gen marcador seleccionable lacZ' de pUC18
(Norander et al., 1983). El esqueleto de
pCGN1539-1540, que contiene el gen de resistencia a
gentamicina y los orígenes Ri y ColEI, procede de pCGN1532 (véase
más adelante). Los bordes Ti y el gen marcador selectivo de plantas
(mas 5'-kan-mas3'), proceden
de pCGN1537; el cassette marcador selectivo de plantas a su vez
procede de pCGN1536, mientras que el borde derecho y los fragmentos
lacZ' proceden de pCGN565RBx2X, y el borde izquierdo procede
de pCGN65.
A. Construcción de pCGN1532. El fragmento
EcoRI-PstI de 3,5 kb que contiene el gen de
resistencia a gentamicina se retira de pPhUI (Hirsch y Beringer,
1984) por digestión con EcoRI-PstI y se clona en
pUC digerido con EcoRI-PstI (Vieira y Messing, 1982)
para generar pCGN549. La digestión con HindIII-PstI
de pCGN549 produce un fragmento de 3,1 kb que lleva el gen de
resistencia a gentamicina, que se convierte en un fragmento de
extremos romos por el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I y
se clona en pBR322 digerido con PvuII (Bolivar et al., 1977) para
crear pBR322Gm. pBR322Gm se digiere con DraI y SphI, se trata con
enzima de Klenow para crear extremos romos, y el fragmento de 2,8
kb se clona en el origen Ri que contiene el plásmido pLJbB11
(Jouanin et al., 1985) que se ha digerido con ApaI y se ha hecho de
extremos romos con la enzima de Klenow, creando pLHbB11Gm. El origen
ColEI extra y el gen de resistencia a kanamicina se delecionan de
pLHbB11GM por digestión con BamHI seguido de autocierre para crear
pGMB11. El sitio HindII de pGmB11 se deleciona por digestión con
HindII seguido de tratamiento con enzima de Klenow y autocierre,
creando pGmB11-H. El sitio PstI de
pGmB11-H se deleciona por digestión con PstI seguido
de tratamiento con enzima de Klenow y autocierre, creando
pCGN1532.
B. Construcción de pCGN1536. El fragmento
EcoRI de 5,4 kb se retira de pVK232 (Knauf y Nester, 1982) por
digestión con EcoRI y se clona en pACYC184 (Chang y Cohen, 1978)
digerido con EcoRI para crear pCGN14. El fragmento
ClaI-SphI de 1434 pb de pCGN14, que contiene la
región mas 5' (pb 20128-21562 de acuerdo con
la numeración de Barker et al., 1983) se clona en pUC19 digerido
con AccI-SphI (Yanisch-Perron et
al., 1985) para generar pCGN50. Un fragmento
EcoRV-NaeI de 746 pb de la región mas 5' se
reemplaza por un sitio XhoI por digestión de pCGN40 con EcoRV y NaeI
seguido de unión en presencia de un ADN de engarce Xho I sintético
para crear pCGN1036. El fragmento SstI-HindIII de
765 pb (pb 18474-19239) de pCGN14, que contiene la
región mas 3', se clona en pUC18 digerido con
SstI-HindIII (Norander et al., 1983) para producir
pCGN43. El sitio HindIII de pCGN43 se reemplaza por un sitio EcoRI
por digestión con HindIII, creación de extremos romos con la enzima
de Klenow y unión del ADN de engarce EcoRI sintético para crear
pCGN1034. El fragmento EcoRI de 767 pb de pCGN 1034 se clona en
pCGN1036 digerido con EcoRI en la orientación que pone el pb 19239
de la región mas 3' próximo a la región mas 5' para
crear pCGN1040. pCGN1040 se somete a digestión parcial con SstI, se
trata con ADN polimerasa de T4 para crear extremos romos, y se une
en presencia de ADN de engarce XhoI sintético; se selecciona un
clon el que sólo se reemplaza el sitio SstI en la unión de pb 18474
y el ADN del vector (construido en pCGN43 y llevado a pCGN1040) por
un sitio XhoI para generar pCGN1047. pCGN565 [véase anteriormente]
se digiere con EcoRI y HindIII, se trata con enzima de Klenow para
crear extremos romos, y se une en presencia de ADN de engarce XhoI
sintético para crear pCGN1003; esto recrea el sitio EcoRI adyacente
al engarce XhoI. pCGN1003 se digiere con EcoRI, se trata con enzima
de Klenow para crear extremos romos y se une en presencia del ADN de
engarce PstI sintético para crear pCGN1007. El fragmento XhoI de
1,5 kb de pCGN1047, que contiene la región mas 5' y la
región mas 3' con un sitio de clonación múltiple entre ellos,
se clona en pCGN1007 digerido con XhoI para construir pCGN1052.
Una porción del sitio de clonación múltiple de
pCGN1052 se deleciona por digestión con XbaI y SstI, se trata con
enzima de Klenow para obtener extremos romos, y se une para generar
pCGN1052\deltaXS. El fragmento EcoRI-SmaI de 1 kb
de pCGN550 [descripción de pCGN783], que contiene 1
ATG-gen de resistencia a kanamicina, se clona en
Bluescript M13-KS (Stratagene, Inc.) digerido con
EcoRI-SmaI para crear pBSKm; este plásmido contiene
una región M13 que permite la generación de ADN monocatenario. El
ADN monocatenario se genera de acuerdo con las recomendaciones del
proveedor, y se realiza una mutagénesis in vitro (Adelman,
et al., 1983) usando un oligonucléotido sintético con la
secuencia
para alterar un sitio PstI dentro del gel de
resistencia a kanamicina y hacerlo indigerible, creando pCGN1534.
pCGN15
34 se digiere con SmaI y se une en presencia de ADN de engarce EcoRI sintético para generar pCGN1535. El fragmento EcoRI de 1 kb de pCGN1536 se clona en pCGN1052\deltaXS digerido con EcoRI para crear el cassette marcador selectivo de plantas mas5'-kan mas 3' pCGN1536.
34 se digiere con SmaI y se une en presencia de ADN de engarce EcoRI sintético para generar pCGN1535. El fragmento EcoRI de 1 kb de pCGN1536 se clona en pCGN1052\deltaXS digerido con EcoRI para crear el cassette marcador selectivo de plantas mas5'-kan mas 3' pCGN1536.
\newpage
C. Construcción de pCGN565RAx2X. pCGN451
[descripción de pCGN783] se digiere con HpaI y se une en presencia
de ADN de engarce SphI sintético para generar pCGN55. El fragmento
XhoI-SphI de pCGN55 (pb 13800-15208,
incluyendo el borde derecho, del ADN-T de A.
tumefaciens; Barker et al., 1977) se clona en pUC19 digerido con
SalI-SphI (Yanisch-Perron et al.,
1985) para crear pCGN60. El fragmento HindIII-BamHI
de 1,4 kb de pCGN60 se clona en pSP64 (Promega, Inc.) digerido con
HindIII-BamHI para generar pCGN1039. pCGN1039 se
digiere con SmaI y NruI (deleción de pb
14237-15203; Barker et al., 1977) y se une en
presencia del ADN de engarce BglII sintético creando
pCGN1039\deltaNS. El fragmento EcoRI-HindIII de
0,47 kb de pCGN1039\deltaNS se clona en pCGN565 digerido con
EcoRI-HindIII [descrito en la descripción de
pCFN783] para crear pCGN565RB. El sitio HindIII de pCGN565RB se
reemplaza por un sitio XhoI por digestión con HindIII, tratamiento
con enzima de Klenow y unión en presencia de ADN de engarce XhoI
sintético para crear pCGN565RB-H+X. pUC18 (Norrander
et al., 1983) se digiere con HaelI para liberar el fragmento
lacZ', se trata con enzima de Klenow para crear extremos
romos, y el fragmento que contiene lacZ' se une a
pCGN565RB-H+X, que se ha digerido con AccI y SphI y
se ha tratado con enzima de Klenow, en tal orientación que el
promotor lacZ' este próximo al fragmento de borde derecho;
esta construcción, pCGN565RBx2x es positiva para la expresión de
lacZ' cuando se cultiva en un hospedador apropiado y
contiene los pb 13990-14273 de los fragmentos de
borde derecho (Barker et al., 1983) que tienen delecionado el
fragmento AccI-SphI (pb
13800-13990).
D. Construcción de pCGN65. pCGN501 se
construye por clonación de un fragmento EcoRI-XhoI
de 1,85 kb de pTiA6 (Currier y Nester, 1976) que contiene las bases
13362-15208 (Barker et al., 1983) del
ADN-T (borde derecho), en M13mp9 digerido con
EcoRI-SalI (Vieira y Messing, 1982). pCGN502 se
construye por clonación de un fragmento HindIII-SmaI
de 1,6 kb de pTiA6, que contiene las bases 602-2212
del ADN-T (borde izquierdo), en M13mp9 digerido con
HindIII-SmaI. pCGN501 y pCGN502 se digieren con
EcoRI y HindIII y los dos fragmentos que contienen el
ADN-T se clonan juntos en pUC9 digerido con HindIII
(Vieira y Messing, 1982) para producir pCGN503, que contiene los dos
fragmentos de borde de ADN-T. pCGN503 se digiere
con HindIII y EcoRI y los dos fragmentos
HindIII-EcoRI resultantes (que contienen los bordes
de ADN-T) se clonan en pHC79 digerido con EcoRI
(Hohn y Collins, 1980) para generar pCGN518. El fragmento
KpnI-EcoRI de pCGN518, que contiene el borde de
ADN-T izquierdo, se clona en pCGN565 digerido con
KpnI-EcoRI para generar pCGN580. El fragmento
BamHI-BglII de pCGN580 se clona en el sitio BamHI de
pACYC184 (Chang y Cohen, 1978) para crear pCGN51. El fragmento
BamHI-SphI de 1,4 kb de pCGN60 (véase la sección
anterior de pCGN65x2X) que contiene el fragmento del borde derecho
de ADN-T, se clona en pCGN51 digerido con
BamHI-SphI para crear pCGN65.
E. Construcción de pCGN1537. pCGN65 se
digiere con KpnI y XbaI, se trata con enzima de Klenow para crear
extremos romos y se une en presencia de ADN de engarce BglII
sintético para crear pCGN65\deltaKX. pCGN65\deltaKX se digiere
con SalI, se trata con enzima de Klenow para crear extremos romos,
y se une en presencia de ADN de engarce XhoI sintético para crear
pCGN65\deltaKX-S+K. El fragmento
BglII-XhoI de 728 pb de pCGNRBx2X, que contiene la
pieza de borde derecho del ADN-T y el gen
lacZ', se clona en pCGN65\deltaKX-S+K
digerido con BglII-XhoI, reemplazando a pCGN65x2X.
El fragmento ClaI de pCGN65x2X se deleciona y se reemplaza con un
engarce XhoI por digestión con ClaI, se trata con la enzima de
Klenow para crear extremos romos y se une en presencia del ADN de
engarce XhoI sintético para crear pCGN65\delta2XX.
pCGN65\delta2XX se digiere con BglII y se fusiona con pCGN549
digerido con BglII (véase la sección de pCGN1532) para crear
pCGN1530 que contiene los dos esqueletos plasmídicos. pCGN1530 se
digiere con XhoI y se vuelve a unir, y después se elige un clon
sensible a cloranfenicol y resistente a gentamicina que haya
delecionado el esqueleto derivado de pACYC184, creando pCGN1530A.
El fragmento XhoI de 2,43 kb de pCGN1536, que contiene el cassette
mas5'-kan-mas3' se clona en pCGN1530A digerido con
XhoI para crear pCGN1537.
F. Montaje final de pCGN1540. El fragmento
BglII de pCGN1537, que contiene el gen marcador selectivo de
plantas y el gen marcador seleccionable lacZ' (con múltiples
sitios de clonación), entre los bordes de ADN-T, se
clona en pCGN1532 digerido con BamHI. El clon de la orientación que
lleva el borde derecho de ADN-T adyacente al origen
de replicación de pBR322 se denomina pCGN1539, y la orientación que
lleva el borde derecho de ADN-T adyacente al origen
de replicación del plásmido Ri se denomina pCGN1540. Estos vectores
binarios tienen varias características ventajosas, incluyendo una
cantidad mínima de ADN entre los bordes de ADN-T,
una alta estabilidad en hospedadores de Agrobacterium, un
alto número de copias en hospedadores de E. coli, y una
selección azul/blanco con múltiples sitios de restricción para
facilitar la clonación del ADN diana.
Sección
5B
En la sección previa, se detalla la construcción
de pCGN783 y pCGN1540. Éstos son vectores binarios que pueden
usarse en experimentos de transformación mediada por
Agrobacterium para transformar plantas. Los vectores están
diseñados para cotransformar un gen quimérico de interés en una
planta, sin embargo, el gen quimérico primero debe subclonarse en el
vector binario. La siguiente sección detalla la subclonación de los
genes quiméricos construidos en la Sección 4 en los vectores
binarios pCGN783 o pCGN1540. Los vectores resultantes son capaces de
transformar plantas con el gen quimérico.
El sitio BamHI de pCGN783 está cerca del borde
derecho del ADN-T, estando el gen marcador
selectivo de plantas entre el borde izquierdo del
ADN-T y el sitio BamHI. La clonación de una
construcción génica quimérica en el sitio BamHI coloca el gen
quimérico entre el gen marcador selectivo de plantas y el borde
derecho del ADN-T. El único sitio BglII de pCGN1509
está en la porción no esencial de la región ocs3'.
pCGN1509 se digiere con BglII y el vector entero
se clona en el sitio BamHI de pCGN783, y se recuperan las dos
orientaciones posibles. El plásmido en el que el promotor de la
subunidad pequeña de RUBISCO y las regiones ocs 3' están
próximos al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se
denomina pCGN1754, y el plásmido en el que el promotor de la
subunidad pequeña de RUBISCO y las regiones ocs 3' están
próximos al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina
pCGN1760.
pCGN1752A se digiere con BglII y el vector entero
se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos
orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones promotor
de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3'
están próximas al borde derecho del ADN-T de
pCGN783 se denomina pCGN1755C, y el plásmido en el que las regiones
promotor de la subunidad pequeña de
RUBISCO-PR1-ocs 3' están próximas al gen
marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1755A.
pCGN1752B se digiere con BglII y el vector entero
se clona en pCGN783 digerido con BamHI y se recuperan las dos
orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones promotor
de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs
3' están próximas al borde derecho del ADN-T de
pCGN783 se denomina pCGN1755B, y el plásmido en el que las regiones
promotor de la subunidad pequeña de
RUBISCO-PR1-ocs 3' están próximas al gen
marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1755B.
pCGN1753A se digiere con BglII y el vector entero
se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos
orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones promotor
de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3'
están próximas al borde derecho del ADN-T de
pCGN783 se denomina pCGN1756C, y el plásmido en el que las regiones
promotor de la subunidad pequeña de
RUBISCO-PR1-ocs 3' están próximas al gen
marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1756A.
pCTN1753B se digiere con BglII y se clona en
pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones
posibles. El plásmido en el que las regiones promotor de la
subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3' están
próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se
denomina pCGN1756D, y el plásmido en el que las regiones promotor de
la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3
están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se
denomina pCGN1756B.
pCGN1761 se digiere con BamHI y el vector entero
se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos
orientaciones posibles. El plásmido en el que el promotor doble 35S
de CaMV y las regiones tm-I 3' están próximos
al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina
pCGN1767 y el plásmido en el que el promotor doble 35S y las
regiones tm-I 3' están próximos al borde
derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina
pCGN1766.
pCGN1762A se digiere con BamHI y se clona en
pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones
posibles. El plásmido en el que las regiones 35S
doble-PR1-tm-I 3' están
próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina
pCGN1764A, y el clon en el que las regiones 35S
doble-PR1-tm-I 3' están
próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se
denomina pCGN1764C.
pCGN1762B se digiere con BamHI y se clona en
pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones
posibles. El plásmido en el que el promotor doble 35S está próximo
al gen marcador selectivo de plantas se denomina pCGN1764B. El
plásmido en la orientación opuesta se denomina pCGN1764D.
pCGN1763A se digiere con BamHI y se clona en
pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones
posibles. El plásmido en el que las regiones 35S
doble-PR1-tm-I 3' están
próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina
pCGN1765A, y el plásmido en el que las regiones 35S
doble-PR1-tm-I 3' están
próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se
denomina pCGN1765C.
pCGN1763B se digiere con BamHI y se clona en
pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones
posibles. El plásmido en el que las regiones 35S
doble-PR1-tm-I 3' están
próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina
pCGN1765B y el plásmido en el que las regiones 35S
doble-PR1-tm-I 3' están
próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se
denomina pCGN1765D.
pCIB1000 se digiere con BamHI y se clona en el
sitio BamHI en pCGN783, y se recuperan las dos orientaciones
posibles. El plásmido en el que las regiones 35S
doble-quitinasa-tm-I 3' están
próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina
pCGN1780A, y el plásmido en el que las regiones 35S
doble-quitinasa-tm-I 3' están
próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se
denomina pCGN1780C.
pCIB1001 se digiere con BamHI y se clona en
pCGN783 digerido con BamHI en cualquier orientación. El plásmido en
el que las regiones 35S
doble-quitinasa-tm-I 3'
están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se
denomina pCGN1780B y el plásmido en el que las regiones 35S
doble-quitinasa-tm-I 3' están
próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se
denomina pCGN1780D.
El fragmento XbaI-PstI de 2,36 kb
de pCGN1431 se subclona en pCGN1540 digerido con
XbaI-PstI para crear el plásmido pCGN1789. Este
plásmido tiene el inserto orientado en una dirección de forma que
el promotor doble 35S de CaMV está próximo al marcador selectivo de
plantas.
El fragmento XbaI de 4,2 kb de pCGN1762A se
subclona en pCGN1540 digerido con XbaI, y se recuperan las dos
orientaciones posibles. El plásmido en el que el fragmento promotor
doble 35S está próximo al borde derecho del ADN-T de
pCGN1540 se denomina pCGN1774A, y el plásmido en el que el
fragmento promotor doble 35S está próximo al gen marcador selectivo
de plantas de pCGN1540 se denomina pCGN1774C.
El fragmento XbaI de 4,2 kb de pCGN1762B se clona
en pCGN1540 digerido con XbaI y se recuperan las dos orientaciones
posibles. El plásmido en el que el fragmento promotor doble 35S
está próximo al borde derecho del ADN-T de pCGN1540
se denomina pCGN1774B y el plásmido en el que el fragmento promotor
doble 35S está próximo al gen marcador selectivo de plantas de
pCGN1540 se denomina pCGN1774D.
El fragmento XbaI de 4,1 kb de pCGN1763A se clona
en pCGN1540 digerido con XbaI, y se recuperan las dos orientaciones
posibles. El plásmido en el que el fragmento promotor doble 35S
está próximo al borde derecho del ADN-T de pCGN1540
se denomina pCGN1775A, y el plásmido en el que el fragmento
promotor doble 35S está próximo al gen marcador selectivo de plantas
de pCGN1540 se denomina pCGN1775C.
El fragmento XbaI de 4,1 kb de pCGN1763B se clona
en pCGN1540 digerido con XbaI y se recuperan las dos orientaciones
posibles. El plásmido en el que el fragmento promotor doble 35S
está próximo al borde derecho del ADN-T de pCGN1540
se denomina pCGN1775B, y el clon en el que el fragmento promotor
doble 35S está próximo al gen marcador selectivo de plantas de
pCGN1540 se denomina pCGN1775D.
El fragmento XbaI de 4,5 kb de pCIB1002 se
subclona en pCBN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el
promotor doble 35S esté próximo al gen marcador selectivo de
plantas de 1540. Este plásmido se denomina pCGN1783C.
El fragmento XbaI de 4,5 kb de pCIB1003 se
subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el
fragmento promotor doble 35S esté próximo al gen marcador selectivo
de plantas de pCGN1540 para crear pCGN1783D.
El fragmento XbaI de pCIB1020, que contiene el
gen PR-P quimérico, se subclona en
pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor esté próximo al gen marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina pCIB1026.
pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor esté próximo al gen marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina pCIB1026.
El fragmento XbaI de pCIB1021, que contiene el
gen anti-sentido PR-P quimérico, se
subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el
fragmento promotor esté próximo al gen marcador selectivo de
plantas. Este plásmido se denomina pCIB1027.
El fragmento XbaI de pCIB1022, que contiene el
gen PR-Q quimérico, se subclona en pCGN1540
digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor esté
próximo al gen marcador selectivo de plantas. Este plásmido se
denomina pCIB1028.
El fragmento XbaI de pCIB1023, que contiene el
gen PR-Q quimérico anti-sentido, se
subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el
fragmento promotor esté próximo al marcador selectivo de plantas.
El plásmido se denomina pCIB1029.
El fragmento XbaI de pCIB1024, que contiene el
gen PR-O' quimérico, se subclona en pCGN1540
digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al
marcador selectivo de plantas. El plásmido se denomina
pCIB1030.
El fragmento XbaI de pCIB1025, que contiene el
gen PR-O' quimérico anti-sentido, se
subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en una orientación similar a
pCIB1030. El nuevo plásmido se denomina pCIB 1031.
El fragmento XbaI de pCIB1024A, que contiene el
gen PR-O' quimérico, se subclona en pCGN1540
digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al
marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina
pCIB1030A.
\newpage
El fragmento XbaI de pCIB1025A, que contiene el
gen PR-O' quimérico en una orientación
anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con
XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador
selectivo de plantas. Este plásmido resultante se denomina
pCIB1031A.
El fragmento XbaI de pCIB1032, que contiene el
gen PR-O' quimérico, se subclona en pCGN1540
digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al
marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina
pCIB1042.
El fragmento XbaI de pCIB1033, que contiene el
gen PR-O' quimérico en una orientación
anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con
XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador
selectivo de plantas. El plásmido resultante se denomina
pCIB1043.
El fragmento XbaI de pCIB 1034, que contiene el
gen PR-O' quimérico se subclona en pCGN1540
digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al
marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina
pCIB1044.
El fragmento XbaI de pCIB1035A, que contiene el
gen PR-O' quimérico en una orientación
anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con
XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador
selectivo de plantas. Este plásmido resultante se denomina
pCIB1045.
El fragmento XbaI de pCIB1036, que contiene el
gen PR-O' quimérico, se subclona en pCGN1540
digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al
marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina
pCIB1046.
El fragmento XbaI de PCIB1037, que contiene el
gen PR-O' quimérico en una orientación
anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con
XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador
selectivo de plantas. El plásmido resultante se denomina
pCIB1047.
El fragmento XbaI de pCIB1038, que contiene el
gen PR-O' quimérico, se subclona en pCGN1540
digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al
marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina
pCIB1048.
El fragmento XbaI de PCIB1039, que contiene el
gen PR-O' quimérico en una orientación
anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con
XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador
selectivo de plantas. El plásmido resultante se denomina
pCIB1049.
El fragmento XbaI de 4,9 kb de pCIB1005B se
subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el
fragmento promotor doble 35S esté próximo al gen marcador selectivo
de plantas de pCGN1540 para crear pCGN1787C.
El fragmento XbaI de 4,5 kb de pCIB1006B se
subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el
fragmento promotor doble 35S esté próximo al gen selectivo de
plantas de pCGN1540 para crear pCGN1787D.
El fragmento XbaI de 4,8 kb de pCGN1007 se clona
en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento
promotor doble 35S está próximo al gen marcador selectivo de
plantas de pCGN1540 para crear pCGN1782C.
El fragmento de 4,8 kb de pCIB1008 se clona en
pCGN1540 digerido con XbaI, de forma similar, para crear
pCGN1782D.
El fragmento XbaI-PstI de 2,89 kb
de pCGN1788A se subclona en pCGN1540 digerido con
XbaI-PstI para crear pCGN1790C. La orientación del
promotor doble 35S en esta construcción es la misma que en las
otras construcciones de tipo C de los ejemplos anteriores.
El fragmento de 2,89 kb de pCGN1788B se subclona
en pCGN1540 digerido con XbaI-PstI para crear
pCGN1790
D. La orientación del promotor en la construcción es la misma que en pCGN1790C.
D. La orientación del promotor en la construcción es la misma que en pCGN1790C.
El fragmento XbaI de 4,6 kb de pCIB 1000 se clona
en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento
promotor doble 35S esté próximo al gen marcador selectivo de
plantas de pCGN1540 para crear pCGN1779C. El fragmento XbaI de 4,6
kb de pCIB1001 se clona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal
orientación que el fragmento promotor doble 35S esté próximo al gen
marcador selectivo de plantas de pCGN1540 para crear pCGN1779D.
Se han construido vectores de transformación de
plantas que tienen el gen de resistencia a higromicina en lugar del
gen de kanamicina como se ha usado anteriormente (Rothstein et al.,
1987). El vector pCIB743 es uno de tales vectores. El gen quimérico
para la expresión en la planta se corta de cualquiera de los
vectores descritos anteriormente usando una enzima de restricción
adecuada, por ejemplo XbaI, y se inserta en el poliengarce de
pCIB743. De esta manera se construye un gen o genes quiméricos para
la expresión en plantas en el vector de transformación de una amplia
serie de hospedadores que confiere resistencia a higromicina al
tejido vegetal transformado. Esto permite a un especialista en la
técnica utilizar resistencia a higromicina, resistencia a
kanamicina, o ambas, como selección del tejido vegetal
transformado.
Sección
6
Los vectores binarios descritos en la sección 5
se utilizan para transformar la cepa LB4404 de A.
tumefaciens por el siguiente método. La cepa de
Agrobacterium se cultiva a 30ºC durante una noche en 5 ml de
medio LBMG (50% de caldo L, 50% de caldo de
manitol-glutamato (Garfinkel y Nester, 1980). El
cultivo de 5 ml se añade a 250 ml de LBMG y la mezcla se agita
vigorosamente hasta que la densidad de cultivo alcanza una OD=0,6 a
una longitud de onda de 600 nm. Las células después de recogen por
centrifugación a 8000 X g y se resuspenden en 5 ml de LBMG. Se
añaden 200 \mul de células a 0,2-1 \mug de ADN
plasmídico binario en LBMG y la mezcla se congela inmediatamente en
un baño de hielo seco/etanol. Después de 5 minutos, el tubo se pone
en un baño de agua a 37ºC durante 5 minutos y después se añaden 2
ml de LBMG. La suspensión se mantiene en un baño de agua a 30ºC
durante 2 a 3 horas y después las células se recogen por
centrifugación. Las células se resuspenden en un volumen mínimo de
LBMG y después se cultivan en medio selectivo (placas de LBMG con
100 \mug/ml de gentamicina). Las colonias aparecen después de 2 a
3 días a 30ºC.
\newpage
Sección
7
Se cortan explantes de aproximadamente 5 a 10 mm
a partir de hojas jóvenes de 3 a 5 cm de longitud y de la tercera a
la sexta desde el ápice de N. tabacum cv "Xanthi nc"
cultivado en condiciones axénicas (Facciotti y Pilet, 1979) en
medio MS sólido (Murashige y Skoog, 1962), que contienen un 0,7% de
fitagar (Gibco-BRL), 1 mg/l de IAA, y 0,15 mg/l de
quinetina. Estos explantes se cultivan en medio MS sólido que
contiene un 0,6% de fitagar, 40 mg/l de sulfato de adenina, 2 mg/l
de IAA y 2 mg/l de quinetina, en cuya superficie se pone en un
filtro Whatman Nº 1, y se incuban durante 24 horas en la oscuridad
a 24ºC. Se cultivan cepas de Agrobacterium (que llevan las
construcciones génicas quiméricas preparadas en la Sección 5)
durante una noche en LBMG a 30ºC en un agitador a 180 rpm. Se
sumergen explantes en una suspensión bacteriana de 3,3 x 108
células/ml durante aproximadamente 5 minutos, se secan en toallas
de papel estériles y se vuelven a cultivar en las mismas placas.
Después de 48 horas, los explantes se ponen en medio de selección
que contiene el mismo medio de placa que se ha indicado
anteriormente más 350 mg/l de cefotaxima y 100 mg/l de kanamicina.
El tejido de control co-cultivado se pone en el
mismo medio pero sin kanamicina. Los explantes se transfieren a
medio nuevo cada dos semanas. Se recogen vástagos de 4 a 8 semanas
después del co-cultivo, se ponen en tubos de cultivo
de 50 ml con 25 ml de medio MS sólido que contiene un 0,6% de
fitagar, 1 mg/l de IBA, 350 mg/l de cefotaxima y 100 mg/l de
kanamicina. Todo el tejido se cultiva a una temperatura de 24º a
28ºC, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con una
intensidad de la luz de 6700 a 8400 1x. Los vástagos producen raíces
en 1 a 2 semanas y después se trasplantan a una mezcla de
plantación en tiestos de 4 pulgadas y se ponen en el "fitotrón de
plantas transgénicas".
Se cultivan cepas de Agrobacterium que contienen
los vectores binarios descritos anteriormente durante 18 a 24 horas
en medio de sales de glutamato ajustado a pH 5,6 y suplementado con
un 0,15% de manitol, 50 \mug/ml de kanamicina, 50 \mug/ml de
espectinomicina y 1 mg/ml de estreptomicina antes de diluirse a
una OD_{600} de 0,2 en el mismo medio sin los antibióticos. Las
bacterias después se cultivan durante 3 a 5 horas antes de la
dilución a una OD_{600} de 0,2 a 0,4 para la inoculación de
discos de 5 a 7 mm cortados a partir de hojas de N. tabacum cv.
xanthi que se han cultivado asépticamente recipientes GA7,
siguiendo una modificación del método de Horsch et al. (1985).
Los discos de hoja se mantienen en agar al 0,7%
que contiene sales mayoritarias y minoritarias de Murashige y
Skoogs (MS), 1 mg/l de benciladenina y 1 mg/ml de NAA durante 2 días
antes de la transferencia al mismo medio que contiene 50 \mug/ml
de kanamicina, 100 \mug/ml de carbenicilina y 100 \mug/ml de
mefoxin. Se escinden los vástagos que se forman en los discos y se
propagan hasta que se obtienen seis plántulas por subcultivo de las
puntas de los vástagos en medio MS que contiene 50 \mug/ml de
kanamicina en recipientes GA7.
Las plántulas forman raíces en medio que no
contiene hormonas y 50 \mug/ml de kanamicina, se transfieren al
substrato y se robustecen en un fitotrón antes de transferirse al
invernadero para inducir el tratamiento con reguladores químicos. En
el momento de la floración, se induce la autopolinización de las
flores. Las semillas se recogen después de la maduración.
Se usan cepas de Agrobacterium que
contienen los vectores binarios para transformar callos que se
forman a partir de los discos de hoja (ejemplo 34). Los callos que
se forman en medio de selección MSBN que contiene kanamicina se
mantienen en un medio de crecimiento de callos compuesto por MS
mayoritario, sales minoritarias y Fe-EDTA (Gibco Nº
500-1117; 4:3 g/l); vitaminas MS, 100 mg/l de
mioinositol, 20 g/l de sacarosa, 2 mg/l de NAA y 0,3 mg/l de
quinetina.
Los callos pueden usarse para regenerar plantas
transgénicas transfiriendo piezas de callos a medio MSBN y
siguiendo los métodos descritos.
Se cultivan cepas de Agrobacterium que
contienen los vectores binarios como se ha descrito en el ejemplo
59. Las bacterias, diluidas a una OD_{600} de 0,2 a 0,4, después
se usan para la inoculación de discos cortados de zanahorias
esterilizadas superficialmente.
Para esterilizar superficialmente las zanahorias,
se pelan y después se sumergen 20 minutos en una solución al 10% de
clorox. Las zanahorias se aclaran con agua estéril, se cortan en
piezas de 5 mm y se ponen con el lado basal hacia arriba sobre agar
con agua. Después se aplican de 20 a 50 \mul de bacterias a la
superficie superior de los discos. Después de 7 días, los discos se
transfieren a agar al 0,7% que contiene sales MS, sacarosa al 3%,
0,1 mg/l de 2,4-D, 50 \mug/ml de kanamicina, 100
\mug/ml de carbenicilina y 100 \mug/ml de mefoxin. Se escinde el
callo que se forma alrededor del anillo del cambium y se pone en
agar MS al 0,7% suplementado con sacarosa al 3%, 0,1 mg/l de
2,4-D, 50 \mug/ml de kanamicina, 100 \mug/ml de
carbenicilina y 100 \mug/ml de mefoxin. Después de haberse
cultivado el callo, se corta en piezas pequeñas y se distribuyen
aleatoriamente en cuatro placas del mismo medio.
Se cultivan cepas de Agrobacterium que
contienen los vectores binarios, como se ha descrito. Las
bacterias, diluidas a una OD_{600} de 0,2 a 0,4, después se usan
para la inoculación de tallos de plantas de girasol preparados como
se indica a continuación:
se sumergen semillas de girasol durante 10
minutos en captano al 10% seguido de 10 minutos en clorox al 10% y
se aclaran con agua estéril. Las cubiertas de las semillas se
retiran y las semillas se germinan en agar con agua al 0,7% en la
oscuridad durante 3 días, después de lo cual se ponen en un
incubador Labline a 23ºC con 12 horas de luz y de oscuridad. Las
plántulas se cultivan durante una semana antes de la decapitación y
la inoculación de las bacterias en la superficie de corte del
tallo. Después de una semana, los tallos inoculados se cortan y se
ponen en agar al 0,7% que contiene sales MS, sacarosa al 3%, 2
mg/ml de NAA, 1 mg/ml de BAP, 100 \mug/ml de carbenicilina, 100
\mug/m de mefoxin y 50 \mug/ml de kanamicina. El callo se
transfiere a medio nuevo cada dos semanas hasta que se obtiene una
cantidad suficiente para cuatro placas. La mitad de los callos que
crecen a partir de las cepas de Agrobacterium virulentas se
transfieren a medio sin hormonas que contiene 50 \mug/ml de
kanamicina.
Se cultivan cepas de Agrobacterium que
contienen los vectores binarios como se ha descrito en el ejemplo
59. Las bacterias, diluidas a una OD_{600} de 0,2 a 0,4, después
se usan para la inoculación de tallos de plántulas de tomates
preparadas como se indica a continuación:
se sumergen semillas de tomate durante 20 minutos
en clorox al 10% y se aclaran con agua estéril. Las semillas se
germinan en agar con agua al 0,7% en la oscuridad durante 3 días,
después de lo cual se ponen en un incubador Labline a 23ºC con 12
horas de luz y de oscuridad. Las plántulas se cultivan durante una
semana antes de la decapitación y la inoculación de las bacterias en
la superficie de corte del tallo.
Después de una semana, los tallos inoculados se
cortan y se ponen en agar al 0,7% que contiene sales MS, sacarosa
al 3%, 2 mg/ml de NAA, 1 mg/ml de BAP, 100 \mug/ml de
carbenicilina, 100 \mug/ml de mefoxin y 50 \mug/ml de
kanamicina. El callo se transfiere a medio nuevo cada dos semanas
hasta que se obtiene una cantidad suficiente para 4 placas.
Se cultivan cepas de Agrobacterium que
contienen los vectores binarios como se ha descrito. Las bacterias,
diluidas a una OD_{600} de 0,2 a 0,4 después se usan para la
inoculación de cotiledones de algodón preparados como se indica a
continuación:
las semillas de algodón se sumergen durante 20
minutos en clorox al 10% y se aclaran con agua estéril. Las
semillas se germinan en agar con agua al 0,7% en la oscuridad. Las
plántulas se cultivan durante una semana antes de la inoculación de
las bacterias en la superficie de los cotiledones.
Se deja que los cotiledones inoculados formen
callos antes de cortase y se ponen en agar al 0,7% que contiene
sales MS, sacarosa al 3%, 100 \mug/ml de carbenicilina y 100
\mug/ml de mefoxin. Los callos se transfieren a medio nuevo cada
tres semanas hasta que se obtiene una cantidad suficiente para 4
placas. La mitad de los callos que crecen a partir de las cepas de
Agrobacterium virulentas se transfieren a medio sin hormonas
que contiene 50 \mug /ml de kanamicina.
Se cultivan plantas de Zea mays de la
línea endogámica Funk 2717 hasta la floración en el invernadero, y
se autopolinizan. Se retiran espigas inmaduras que contienen
embriones de aproximadamente 2 a 2,5 mm de longitud de las plantas y
se esterilizan en solución de clorox al 10% durante 20 minutos. Se
retiran asépticamente los embriones de las semillas y se cultivan
con el eje del embrión hacia abajo en medio OMS que contiene 0,1
mg/l de 2,4-D, un 6% de sacarosa y
L-prolina 25 mM solidificada con Gelrite® al 0,24%
(medio de iniciación). Después de dos semanas de cultivo en la
oscuridad a 27ºC, el callo que se desarrolla en el escutelo se
retira del embrión y se cultiva en medio B5 (Gamborg et al., 1968)
que contiene 0,5 mg/l de 2,4-D y solidificado con
Gelrite® al 0,24%. El callo se subcultiva cada dos semanas en medio
nuevo. Después de un total de ocho semanas desde la colocación de
los embriones en el medio de iniciación, se identifica el tipo
especial de callo por su morfología característica. Este callo se
subcultiva adicionalmente en el mismo medio. Después de un período
adicional de dos meses, el callo se transfiere y se subcultiva en
serie en medio N6 que contiene 2 mg/l de 2,4-D y se
solidifica con Gelrite®.
El callo descrito anteriormente se subcultiva
durante un total de al menos seis meses. El tipo de callo elegido
para el subcultivo es relativamente no mucilaginoso, granular y muy
friable, de tal forma que se separa en pequeños agregados celulares
individuales cuando se pone en medio líquido. No se retienen
cultivos que contienen agregados con células expandidas grandes. Se
ponen alícuotas de aproximadamente 500 mg del callo especial de la
línea endogámica Elite de Zea mays Funk 2717 en 30 ml de
medio N6 que contiene 2 mg/l de 2,4-D en matraces
Delong de 125 ml. Después de una semana de cultivo a 26ºC en la
oscuridad en un agitador giratorio (130 rpm, desplazamiento vertical
de 2,5 cm), el medio se reemplaza por medio nuevo. Las suspensiones
se subcultivan de nuevo de esta manera después de otra semana. En
este momento, los cultivos se inspeccionan, y se retienen los que no
muestran grandes números de células expandidas. Se desechan los
cultivos en suspensión que contienen agregados con células
expandidas grandes. El tejido preferido consta de agregados
celulares de división citoplásmica densa que tienen una superficie
característicamente más lisa que el tipo habitual de agregados
celulares. Los cultivos retenidos tienen al menos un 50% de las
células representadas en estos agregados pequeños. Ésta es la
morfología deseada. Estas suspensiones también tienen una velocidad
de crecimiento rápida, con un tiempo de duplicación menor de una
semana. Los cultivos de suspensión se subcultivan semanalmente
transfiriendo 0,5 ml de PCV en 25 ml de medio nuevo. Después de 4 a
6 semanas de subcultivo de esta manera, los cultivos aumentan de
dos a tres veces por subcultivo semanal. Los cultivos en los que más
de un 75% de las células tienen la morfología deseada se retienen
para un subcultivo adicional. Las líneas se mantienen eligiendo
siempre para el subcultivo el matraz cuyo contenido presenta la
mejor morfología. En algunos casos se usa una filtración periódica
a través de tamices de acero inoxidable con un tamaño de poro de 630
\mum cada dos semanas para aumentar la dispersión de los
cultivos, pero no es necesario.
Se incuban de 1 a 1,5 ml de PCV de las células de
cultivo en suspensión anterior en 10 a 15 ml de una mezcla
esterilizada en filtro que consta de un 4% de celulasa RS con un 1%
de Rhozyme en solución salina KMC (8,65 g/l de KCl, 16,47 g/l de
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O y 12,5 g/l de CaCl_{2}\cdot2
H_{2}O, 5 g/l de MES, pH 5,6). La digestión se realiza a 30ºC en
una mesa de agitación lenta durante un período de 3 a 4 horas. Con
un microscopio invertido, se controla la liberación de protoplastos
en la preparación. Los protoplastos que se liberan se recogen como
se indica a continuación: La preparación se filtra a través de un
tamiz de malla de 100 \mum, seguido de un tamiz de malla de 50
\mum. Los protoplastos se lavan a través de los tamices con un
volumen de solución salina KMC igual al volumen original de solución
enzimática. Se ponen 10 ml de la preparación de protoplastos en
cada uno de varios tubos de centrífuga de plástico desechables, con
1,5 a 2 ml de solución de sacarosa 0,6 M (tamponada a pH 5,6 con MES
al 0,1% y KOH) depositados por debajo. El tubo se centrifuga a
60-100 x g durante 10 minutos, y los protoplastos
que forman bandas en la interfase se recogen usando una pipeta y se
ponen en un tubo limpio. La preparación de protoplastos se
resuspende en 10 ml de solución salina KMC nueva, y se centrifuga
durante 5 minutos a 60-100 x g. El sobrenadante se
retira y se desecha y los protoplastos se resuspenden suavemente en
el residuo que queda, y después se añaden gradualmente 10 ml de una
solución KMC de concentración 13/14. Después de centrifugar de
nuevo durante 5 minutos, el sobrenadante se retira de nuevo y los
protoplastos se resuspenden en una solución KMC de concentración
6/7. Se toma una alícuota para el recuento y los protoplastos se
sedimentan de nuevo por centrifugación. Los protoplastos se
resuspenden a 10^{7} por ml en medio KM-8p o en
manitol 0,5 M que contiene MgCl_{2} 6 mM u otro medio adecuado
para uso en la transformación como se describe en los siguientes
ejemplos. Esta suspensión de protoplastos se usa para la
transformación y se cultiva como se describe más adelante.
A. Todas las etapas excepto el choque térmico se
realizan a temperatura ambiente (de 22 a 28ºC). Los protoplastos se
resuspenden en la última etapa del procedimiento anterior en
manitol 0,5 M que contiene un 0,1% de MES y MgCl_{2} 6 mM. La
resistencia de esta suspensión se mide en la cámara de un
Electroporador Dialog y se ajusta a 1-1,2 k\Omega
usando una solución de MgCl_{2} 300mM. Los protoplastos se
someten a un choque térmico por inmersión del tubo que contiene la
muestra en un baño de agua a 45ºC durante 5 minutos, seguido de
refrigeración a temperatura ambiente en hielo. Se añaden 4 \mul
del plásmido linealizado que contiene un gel de resistencia a
higromicina selectivo en plantas tal como el descrito por Rothstein
et al. (1987) o construcciones de genes quiméricos como se han
descrito y se añaden 20 \mug de ADN de soporte de timo de ternero
a alícuotas de 0,25 ml de esta suspensión. A los protoplastos se
les añaden 0,125 ml de solución de PEG al 24% (MW 8000) en manitol
0,5 M que contiene MgCl_{2} 30 mM. La mezcla se mezcla bien pero
suavemente y se incuba durante 10 minutos. La muestra se transfiere
a la cámara del electroporador y las muestras se someten a pulsos
tres veces a intervalos de 10 segundos, con voltajes iniciales de
1500, 1800, 2300 o 2800 Vcm^{-1} y un tiempo de desintegración
exponencial de 10 mseg.
Los protoplastos se cultivan como se indica a
continuación. Las muestras se cultivan en placas petri de 6 cm a
temperatura ambiente. Después de un período adicional de 5 a 15
minutos, se añaden 3 ml de medio KM-8p que contiene
un 1,2% de agarosa SeaPlaque y 1 mg/l de 2,4-D. La
agarosa y los protoplastos se mezclan bien y el medio se deja
gelificar.
B. Esto se repite con una o más de las siguientes
modificaciones:
- (1)
- La resistencia de la preparación de protoplastos se ajusta a 0,5-0,7 k\Omega.
- (2)
- El PEG usado es PEG con una MW de 4000.
- (3)
- No se añade PEG, o se añade la mitad del volumen de PEG al 12%.
- (4)
- Los pulsos se aplican a intervalos de tres segundos.
- (5)
- Los protoplastos se cultivan después de la electroporación en placas puestas en una placa enfriada a una temperatura de 16ºC.
- (6)
- Los protoplastos se ponen en tubos después de la etapa de electroporación, se lavan con 10 ml de solución KMC con una concentración de 6/7 o con solución W5 (que comprende 380 mg/l de KCl, 18,375 g/l de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 9 g/l de NaCl; 9 g/l de glucosa, pH 6,0) y después se recogen por centrifugación a 60 x g durante 10 minutos, se resuspenden en 0,3 ml de medio KM y se cultivan como en A.
- (7)
- No se añade al ADN de soporte de timo de ternero.
A. Los protoplastos se resuspenden en la última
etapa del procedimiento anterior en solución de manitol 0,5 M que
contiene MgCl_{2} de 12 a 30 mM. Se aplica un choque térmico de
45ºC durante 5 minutos como se ha descrito. Los protoplastos se
distribuyen en alícuotas para la transformación en tubos de
centrífuga, suspendiéndose 0,3 ml de protoplastos por tubo. Durante
los siguientes 10 minutos, se añade lo siguiente: ADN y solución de
PEG (MW 6000, 40% que contiene Ca(NO_{3})_{2} 0,1
M y manitol 0,4 M; pH 8 a 9 con KOH) para proporcionar una
concentración final de PEG al 20%. Las alícuotas se incuban durante
30 minutos con agitación suave ocasional y después los protoplastos
se ponen en placas petri (0,3 ml de suspensión de protoplastos
original por placa de 6 cm de diámetro) y se cultivan como se ha
descrito.
B. Esto se repite y los protoplastos se lavan
después de 30 minutos de incubación en la solución de PEG anterior,
añadiendo 0,3 ml de solución W5 cinco veces a intervalos de 2 a 3
minutos. La suspensión de protoplastos se centrifuga, el
sobrenadante se retira y los protoplastos se cultivan como se ha
descrito.
C. Se repite lo anterior con la modificación de
que la concentración final de PEG está comprendida entre el 13 y
25%.
Las placas que contienen los protoplastos en
agarosa se ponen en la oscuridad a 26ºC. Después de 14 días, se
producen colonias a partir de los protoplastos. La agarosa que
contiene las colonias se transfiere a la superficie de una placa
petri de 9 cm de diámetro que contiene 30 ml de medio N6 que
contiene 2 mg/l de 2,4-D, solidificado con Gelrite®
al 0,24%. Este medio se denomina 2N6. El callo se cultiva
adicionalmente en la oscuridad a 26ºC y se subcultivan piezas de
callo cada dos semanas en medio 2N6 sólido reciente.
El ejemplo anterior se repite con la modificación
de que se añaden 100 mg/l o 200 mg/l de higromicina B al medio 2N6
para seleccionar las células transformadas.
A. Se pone un callo en medio 2N6 para
mantenimiento y en medio ON6 (que comprende medio N6 que carece de
2,4-D) y M61 (que comprende medio N6 que contiene
0,25 mg/l de 2,4-D y10 mg/l de quinetina) para
iniciar la regeneración. El callo que crece en medios ON6 y N61 se
cultiva en condiciones de luz (16 horas/día de luz de 840 a 8400 1x
a partir de lámparas fluorescentes blancas). El callo que crece en
medio N61 se transfiere a medio ON6 después de dos semanas, ya que
un tiempo prolongado en medio N61 es perjudicial. El callo se
subcultiva cada dos semanas aunque el callo se vaya a transferir de
nuevo a la misma formulación de medio. Aparecen plántulas en
aproximadamente cuatro a ocho semanas. Una vez que las plántulas
tienen una altura de al menos 2 cm, se transfieren a medio ON6 en
recipientes GA7. Se forman raíces en un período de dos a cuatro
semanas, y cuando las raíces parecen suficientemente bien formadas
como para soportar el crecimiento, las plántulas se transfieren al
substrato en tiestos con turba, bajo un sombreado durante los
primeros cuatro a siete días. A menudo es útil poner un recipiente
de plástico transparente invertido sobre los transplantes durante
dos a tres días para ayudar al robustecimiento. Una vez
establecidas las plantas, se tratan como plantas de maíz normales y
se cultivan hasta la madurez en el invernadero. Para obtener
plantas descendientes, se autopolinizan o se cruzan con un tipo
silvestre.
B. El ejemplo anterior se repite con la
modificación de que se añaden 100 mg/l o 200 mg/l de higromicina B
al medio usado para mantener los callos.
A. Se inicia un callo embriogénico a partir de
secciones basales de las hojas más jóvenes de plantas de dáctilo
aglomerado cultivadas en invernadero (Dactylis glomerata L.)
como se describe por Hanning y Conger (1982). Las hojas se
esterilizan superficialmente por inmersión en una dilución 1:10 de
solución de Clorox (hipoclorito sódico al 5,25%; The Clorox Company,
Oakland, Ca.) durante aproximadamente 10 minutos y después se
cortan asépticamente en pequeños segmentos de 1 a 5 mm de longitud
o de diámetro. Estos segmentos se cultivan en medio
SH-30 estéril que contiene agarosa al 0,8% como
agente de gelificación. Aparecen estructuras de callo y/o
embriogénicas en un período de 2 a 6 semanas después de cultivo en
placas, tras el cultivo a aproximadamente 25ºC. El callo
embriogénico se mantiene por subcultivo en medio
SH-30 nuevo cada 2 a 4 semanas y por cultivo en la
oscuridad a 25ºC.
B. Se inician cultivos de suspensión
embriogénicos poniendo aproximadamente 0,5 g de peso fresco de
callo embriogénico en 50 ml de medio líquido descrito por Gray y
Conger (1985) que contiene dicamba 45 \muM y 4 g/litro de
hidrolizado de caseína. Los cultivos en suspensión se cultivan a
27ºC bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz (3300 1x) y 8 horas de
oscuridad en un agitador giratorio a aproximadamente 130 rpm en
matraces Delong de 125 ml sellados con una tapa metálica y
parafilm®. Después de aproximadamente cuatro semanas, se dejan
sedimentar los cúmulos grandes durante aproximadamente 30 segundos,
se retiran alícuotas de 10 ml del medio sobrenadante que contiene
cúmulos celulares pequeños y se transfieren a 50 ml de medio nuevo.
Este proceso se repite cada tres a cuatro semanas usando los
cultivos más satisfactorios a juzgar por el pequeño tamaño de los
cúmulos y la mejor calidad basándose en la presencia de células
citoplásmicas pequeñas. Después de 5 a 8 transferencias, las
suspensiones carecen esencialmente de células no embriogénicas y la
mayoría de los cúmulos de células embriogénicas son bastante
pequeños (de 150 a 2000 \mum).
Se preparan protoplastos a partir de cultivos en
suspensión embriogénicos del ejemplo anterior filtrando
asépticamente las células en una unidad de filtro Nalgene®; de 0,2
\mum y añadiendo después 0,5 g de células, en peso fresco, a cada
12,5 ml de mezcla de enzimas de protoplastos en un placa petri. La
mezcla de enzimas consta de un 2% de celulasa RS, CaCl_{2} 7 mM x
H_{2}O, NaH_{2}PO_{4} 0,7 mM x H_{2}O, MES 3 mM (pH 5,6),
glucosa (550 mOs/kg de H_{2}O de pH 5,6), y se esteriliza por
filtración. La mezcla se agita en un agitador orbital
aproximadamente 50 rpm con una luz tenue (<420 1x) durante un
periodo de aproximadamente 4 a 5 horas. El producto de digestión
después se tamiza a través de tamiz de acero inoxidable (tamaño de
malla 100 \mum) y se distribuye en tubos de centrifuga de 12 ml
que se centrifugan a aproximadamente 60-100 x g
durante aproximadamente 5 minutos. Después, el sedimento que
contiene los protoplastos se lava tres veces con medio de cultivo de
protoplastos KM-8p ajustado a 550 mOs/kg de
H_{2}O con glucosa. En este momento, puede incluirse una etapa de
flotación para la purificación adicional de los protoplastos. En
este caso, los protoplastos lavados se depositan encima de 10 ml de
medio de cultivo KM-8p ajustado a 700 mOs/kg de
H_{2}O con sacarosa. Después de la centrifugación a
60-100 x g durante aproximadamente 10 minutos, los
protoplastos que forman bandas en la interfase se recogen usando
una pipeta fina. Finalmente, los protoplastos se resuspenden en 1 a
2 ml de medio de cultivo KM-8p y se tamizan a
través de un tamiz de malla inoxidable (tamaño de malla 20 \mum).
Los protoplastos liberados se recogen, y se lavan y se resuspenden
en medio KM-8p para el cultivo o en medio ajustado
osmóticamente adecuado para la transformación de acuerdo con los
siguientes ejemplos.
A. Los protoplastos purificados se cultivan a una
densidad de aproximadamente 5 x 10^{5} protoplastos por ml en
medio de cultivo KM-8p que contiene agarosa
SeaPlaque® al 1,3% (FMC Corp., Marine Colloids Division, Rockland,
Marine, USA) y de un 30 a un 40% de medio acondicionado (obtenido a
partir de cultivos en suspensión embriogénicos de Dactylis
glomerata L. de 3 a 4 semanas, filtrando el medio a través de
un filtro Nalgene® estéril de 0,2 \mum, haciendo el medio de 550
mOs/kg de H_{2}O por la adición de glucosa, y de nuevo
esterilizando por filtración). Las placas después se ponen en la
oscuridad a una temperatura constante de 28ºC. Después de 10 a 14
días, la agarosa se corta en cuñas y se pone en un "cultivo de
perlas" como se describe por Shillito et al. (1983) usando 20 ml
de medio de cultivo en suspensión SH-45 con un 3%
de sacarosa por 3 ml de cultivo impregnado en agarosa original. Las
placas se ponen en un agitador de plataforma y se agitan a
aproximadamente 50 rpm con luz a 670 1x. Se forman nuevos cultivos
de suspensión según crecen las colonias de la agarosa y se liberan
células en el medio de cultivo. Las células cultivadas en suspensión
resultantes se cultivan en medio SH-30 solidificado
con agar y se ponen en la oscuridad a 25ºC hasta que se forman
callos.
B. Se cultivan protoplastos como se ha descrito
anteriormente con la excepción de que el medio de cultivo no
contiene medio acondicionado.
A. Inmediatamente después de la purificación de
los protoplastos, se realiza una electroporación de acuerdo con
Shillito et al. (1985) usando un plásmido linealizado. Los
protoplastos se resuspenden después del último lavado a una densidad
de aproximadamente 7 x 10^{6} protoplastos por ml en el tampón de
electroporación (manitol 0,4 M, MgCl_{2} 6 mM). Los protoplastos
se ponen en alícuotas de 0,7 ml en tubos de centrífuga de plástico
de 10 ml. A los tubos se les añaden ADN plasmídico y ADN de timo de
ternero sonicado (Sigma) para proporcionar concentraciones finales
de 10 \mug/ml y 50 \mug/ml respectivamente. Después se añaden
0,38 ml de solución de PEG [PEG 6000 al 24% en manitol 0,4 M,
MgCl_{2} 30 mM, MES al 0,1% (pH 5,6)] y la solución se mezcla
suavemente. La suspensión de protoplastos se transfiere a la cámara
de un electroporador Dialog® y se aplican 10 pulsos de un voltaje
inicial de 3250 Vcm^{-1} y una constante de desintegración
exponencial de 10 mseg. a intervalos de 30 segundos. La muestra se
retira de la cámara y se pone en una placa petri de 10 cm de
diámetro. Se añaden 10 ml de medio KM-8p que
contiene agarosa SeaPlaque® al 1,2%, los protoplastos se distribuyen
uniformemente a lo largo del medio y la agarosa se deja
gelificar.
B. Se repite lo anterior, con la excepción de que
el voltaje inicial usado es 3500 Vcm^{-1}, 5000 Vcm^{-1}, 3000
Vcm^{-1} o 2500 Vcm^{-1}.
A. Se realiza una transferencia génica directa
mediada por PEG de acuerdo con Negrutiu, I. et al., (1987). El ADN
usado es el plásmido linealizado descrito.
Los protoplastos se suspenden después del último
lavado en manitol 0,5 M que contiene MgCl_{2} 15 mM a una
densidad de aproximadamente 2 x 10^{6} por ml. La suspensión de
protoplastos se distribuye como alícuotas de 1 ml en tubos de
centrífuga de plástico de 10 ml. El ADN se añade como se ha
descrito anteriormente y después se añaden 0,5 ml de la solución de
PEG (PEG 4000 al 40% en manitol 0,4 M,
Ca(NO_{3})_{2} 0,1 M, pH 7,0).
Las soluciones se mezclan suavemente y se incuban
durante 30 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 24ºC)
durante 30 minutos con agitación ocasional. Después se añaden 1,4
ml de la solución de lavado, y se mezcla suavemente el contenido del
tubo. La solución de lavado consta de manitol 87 mM, CaCl_{2} 115
mM, MgCl_{2} 27 mM, KCl 39 mM, Tris-HCl 7 mM y
mioinositol a 1,7 g/l, pH 9,0. Se añaden cuatro alícuotas de 1,4 ml
adicionales de solución de lavado a intervalos de 4 minutos, con
mezcla después de cada adición. El tubo después se centrifuga a
aproximadamente 60 x g durante aproximadamente 10 minutos, y el
sobrenadante se desecha. Se recogen los protoplastos sedimentados
en 1 ml de medio de cultivo KM-8p y se ponen en una
placa petri de 10 cm. Se añaden 10 ml de medio
KM-8p que contiene agarosa SeaPlaque® al 1,2%. Los
protoplastos se distribuyen uniformemente a lo largo de todo el
medio y la agarosa se deja gelificar.
B. Esto se repite con una o más de las siguientes
modificaciones:
- (1)
- El pH de la solución de lavado se ajusta a 5,6 o 7,0
- (2)
- El PEG usado es PEG de MW 6000, PEG de MW 2000 o PEG de MW 8000.
- (3)
- El medio de lavado consta de NaCl 154 mM, CaCl_{2} 125 mM, KCl 5 mM, glucosa 5 mM, pH a 6,0 con KOH, de CaCl_{2} 0,2 M, MES al 0,1%, pH 6,0 con KOH, o de CaCl_{2} 0,2 M, Tris/HCl 7 mM, pH 9,0 con KOH.
La transformación se realiza como se ha descrito
anteriormente con la excepción de que los protoplastos se tratan a
45ºC durante aproximadamente 5 minutos antes de la distribución de
las alícuotas en tubos para la transformación o después de la
distribución de las alícuotas, y antes de la adición del PEG.
A. Las placas de cultivo (placas petri) que
contienen los protoplastos se incuban durante 10 días en la
oscuridad a aproximadamente 25ºC y después se cortan en 5 cortes
iguales para obtener "cultivos de perlas" (Shillito el al.,
1983). Cuatro de los cortes se ponen en 20 ml de medio de cultivo
SH-45 con 4 g/l de hidrolizado de caseína y 20
\mug/ml de higromicina B. El quinto corte se pone en 20 ml del
mismo medio pero sin higromicina B como control no seleccionado.
Después de 4 a 5 semanas, se cortan de la agarosa las supuestas
colonias celulares derivadas de protoplastos que han crecido en
higromicina B y se ponen en una placa petri de 19 mm con 2 ml de
medio SH-45 líquido que contiene 20 \mug/ml de
higromicina B, que se agita a aproximadamente 50 rpm en un agitador
orbital. Después de otras 4 a 5 semanas, todas las colonias que
crecen para obtener nuevas suspensiones se transfieren a matraces
Erlenmeyer de 125 ml y se cultivan de una manera similar al cultivo
en suspensión parental, con la excepción de que en el medio se
incluyen 20 \mug/ml de higromicina B.
Las nuevas suspensiones se subcultivan cada
1-3 semanas usando medio SH-45 que
contiene 4 g/l de hidrolizado de caseína y 20 \mug/ml de
higromicina B. Las células de estas suspensiones también se
cultivan en medio SH-30 solidificado que contiene 20
\mug/ml de higromicina B y se incuban a aproximadamente 25ºC en
la oscuridad. Los callos desarrollados a partir de las células
cultivadas en placas se subcultivan cada dos semanas en medio nuevo.
Se supone que las células que crecen en presencia de higromicina B
son transformantes.
B. Se realiza una selección como se ha descrito,
con la excepción de que las colonias celulares derivadas de
protoplastos que crecen en medio que contiene higromicina B se
ponen en placas de agar de medio SH-30 que contiene
20 \mug/ml de higromicina B y se incuban a aproximadamente 25ºC
en la oscuridad.
A. Se cultivan callos de Dactylis glomerata
L. (obtenidos como se ha descrito) procedentes de protoplastos
en medio SH-30 solidificado, y se subcultivan cada
dos semanas. Cualquier embrión que se forme se retira y se cultiva
en medio de germinación (SH-0) y se pone a la luz
(de 3800 a 4600 1x). La germinación de estos embriones tiene lugar
en 1 a 4 semanas y las plántulas resultantes se ponen en medio
SH-0 en condiciones de luz para formar sistemas
radiculares. Se introducen en el invernadero en la etapa de 6 a 12
hojas y se robustecen gradualmente.
B. Se cultiva el callo (obtenido como se ha
descrito) procedente de protoplastos en medio SH-0
solidificado con Gelrite® al 0,24% en condiciones de luz (de 3800 a
4600 1x), y se subcultiva cada dos semanas. Las plántulas
resultantes se ponen en una mezcla 1:1 de SH-0 y
medio OMS solidificado con una combinación de Gelrite® al 0,12% y
agar al 0,4% en condiciones de luz para formar sistemas
radiculares. Se introducen en el invernadero en la etapa de 6 a 12
hojas y se robustecen gradualmente.
C. Se obtienen pequeñas plántulas como se
describe en los ejemplos 44A y 44B y se ponen en medio OMS
solidificado con agar al 0,8% en condiciones de luz para formar
sistemas radiculares. Se introducen en el invernadero en la fase de
6 a 12 hojas y se robustecen gradualmente.
D. Se obtienen pequeñas plántulas como se
describe en el ejemplo 44A anterior y se ponen en una mezcla 1:1 de
SH-O y medio OMS solidificado con una combinación de
Gelrite® al 0,12% y agar al 0,4% en condiciones de luz para formar
sistemas radiculares. Se introducen en el invernadero en la fase de
6 a 12 hojas y se robustecen gradualmente.
A. La preparación de protoplastos de N.
tabacum puede realizarse de acuerdo con Paszkowski et al,
(1984); documentos GB 2 159 173, EP 0 129 668; Shillito y Potrykus
(1987) o por otros métodos conocidos en la técnica.
B. Se introduce ADN en protoplastos por una
modificación del método de Negrutiu et al. (1987). Los protoplastos
preparados como se ha descrito se resuspenden después de la última
etapa de lavado en una solución que consta de manitol 0,4 M,
CaCl_{2} de 15 a 30 mM y MES al 0,1%, a una densidad de 1,6 a 2 x
10^{6} por ml. La suspensión de protoplastos se distribuye como
alícuotas de 0,5 ml en tubos de centrífuga de plástico de 10 ml. El
ADN se añade en 10 \mul de agua destilada estéril, se esteriliza
como se describe por Paszkowski et al. (1984), y después se añaden
0,5 ml de la solución de PEG (PEG MW 8000 al 40%, manitol 0,4 M,
Ca(NO_{3})_{2} 0,1 M, pH 7,0). Las soluciones se
mezclan suavemente y se incuban durante 30 minutos a temperatura
ambiente (aproximadamente 24ºC) con agitación ocasional. Después se
añade 1 ml de la solución de lavado y el contenido del tubo se
mezcla suavemente. La solución de lavado consta de NaCl 154 mM,
CaCl_{2} 125 mM, KCl 5 mM, glucosa 5 mM, pH 6,0 con KOH. Se añaden
secuencialmente alícuotas adicionales de 2 ml, 3 ml y 4 ml de
solución de lavado a intervalos de 5 minutos, con mezcla después de
cada adición. El tubo después se centrifuga a aproximadamente
10-100 x g durante aproximadamente 10 minutos, y el
sobrenadante se desecha. Los protoplastos sedimentados se recogen en
suficiente medio de cultivo K3 con glucosa 0,3 M como agente
osmótico, y sin sacarosa, para conseguir una densidad final de
10^{5} por ml y se cultivan en una placa petri de 10 cm.
C. Lo anterior se repite con una o más de las
siguientes modificaciones:
- (1)
- El pH de la solución de lavado se ajusta a 5,6 o 7,0.
- (2)
- El PEG usado es PEG con un MW de 4000.
- (3)
- El medio de lavado consta de CaCl_{2} 0,2 M, MES al 0,1%, pH 6,0 con KOH, o de CaCl_{2} 0,2 M, Tris/HCl 7 mM, pH 9,0 con KOH.
- (4)
- Se añaden 50 \mug de ADN de timo de ternero cortado en 25 \mul de agua estéril junto con el ADN plasmídico.
- (5)
- El ADN plasmídico se linealiza antes del uso por tratamiento con una enzima de restricción adecuada (por ejemplo, BamHI).
A. La introducción de ADN en protoplastos de
N. tabacum se realiza por tratamiento de los protoplastos
con un pulso eléctrico en presencia del ADN apropiado, en una
modificación de los métodos de Fromm et al. (1987); y Shillito y
Potrykus (1987).
Los protoplastos se aíslan como se ha descrito.
Los protoplastos se resuspenden después del último lavado en la
siguiente solución: manitol 0,2 M, MES al 0,1%, NaCl 72 mM,
CaCl_{2} 70 mM, KCl 2,5 mM, glucosa 2,5 mM, pH 5,8 con KOH, a una
densidad de 1,6 a 2 x 10^{6} por ml. La suspensión de
protoplastos se distribuye como alícuotas 10 ml en cubetas
desechables de plástico y se añaden 10 \mug de ADN como se ha
descrito. La resistencia de la solución en este punto, medida entre
los electrodos de la serie de electrodos 471 del aparato de
electroporación descrito más adelante, está en el intervalo de 6
\Omega.
El ADN se añade en 10 \mul de agua destilada
estéril, y se esteriliza como se describe por Paszkowski et al.
(1984). La solución se mezcla suavemente y después se somete a
temperatura ambiente (de 24 a 28ºC) a un pulso de 400 Vcm^{-1} con
una constante de desintegración exponencial de 10 ms desde un
aparato de electroporación BTX-Transfector 300
usando el conjunto de electrodos 471. Los protoplastos se dejan en
reposo durante 5 minutos y después se ponen en una placa petri y
medio K3 como se ha descrito y se añaden para llevar la densidad de
los protoplastos a 10^{5} por ml.
B. Lo anterior se repite con una o más de las
siguientes modificaciones:
- (1)
- El voltaje usado es 200 Vcm^{-1}, o está comprendido entre 100 Vcm^{-1} y 800 VCm^{-1}.
- (2)
- La constante de desintegración exponencial es de 5 ms, 15 ms o 20 ms.
- (3)
- Se añaden 50 \mug de ADN de timo de ternero cortado en 25 \mul de agua estéril junto con el ADN plasmídico.
- (4)
- El ADN plasmídico se linealiza antes del uso por tratamiento con una enzima de restricción adecuada (por ejemplo, BamHI).
Se preparan protoplastos de la línea endogámica
de maíz Funk 2717 como se describe en los ejemplos 67 a 69 y se
resuspenden en cualquiera de las soluciones descritas para la
resuspensión de los protoplastos de N. tabacum anteriores a
una densidad de 10^{7} por ml. La transformación se realiza
esencialmente como se ha descrito anteriormente. Los protoplastos se
cultivan después de la transformación a una densidad de 2 x
10^{6} por ml en medio KM-8p sin añadir agentes
de solidificación y conteniendo 1 mg/l de
2,4-D.
Se preparan protoplastos de suspensión de sorgo
FS 562 esencialmente como se ha descrito para Zea mays
anteriormente, y se resuspenden en cualquiera de las soluciones
descritas para la resuspensión de los protoplastos de N.
tabacum anteriores a una densidad de 10^{7} por ml. Se
realiza la transformación. Los protoplastos se cultivan después de
la transformación a una densidad de 2 x 10^{6} por ml en medio
KM-8p, sin añadir agente de solidificación.
Se preparan protoplastos de N.
plumbaginifolia, P. hybrida o L. multiflorum como se
describe en Shillito and Potrykus (1987) y se tratan como se ha
descrito anteriormente. Se cultivan en el medio descrito por
Shillito y Potrykus (1987) sin la adición de agarosa o ningún otro
agente de gelificación.
Se preparan protoplastos de Glycine max
por el método descrito por Tricoli et al. (1986) o Chowhury y
Widholm (1985), o Klein et al (1981). Se introduce ADN en estos
protoplastos esencialmente como se ha descrito anteriormente. Los
protoplastos se cultivan como se describe en Klein et al. (1981),
Chowhury y Widholm (1986) o Tricoli et al. (1986) sin la adición de
alginato para solidificar el medio.
Sección
8
En las secciones anteriores se ha descrito la
creación de plantas transgénicas que expresan genes quiméricos de
resistencia a enfermedades. En esta sección se explica el
desarrollo de líneas de semillas transgénicas y la caracterización
de esas líneas con respecto a la expresión de genes quiméricos.
Esencialmente, este proceso de caracterización comprende una
selección preliminar de las plantas transgénicas para la expresión
del gen quimérico, la segregación del gen quimérico en líneas
homocigotas estables y la caracterización adicional de la expresión
génica.
Aquí se usan las designaciones de genotipo para
las plantas transgénicas de acuerdo con la siguiente convención: la
planta inicial que resulta de un suceso de transformación y que se
ha desarrollado a partir de un cultivo de tejidos se denomina una
planta T1. Las plantas resultantes de una autopolinización de las
flores naturales de la planta T1 se denominan T2, habiendo adquirido
un nuevo genotipo durante el proceso meiótico normal. De forma
similar, las semillas procedentes de una autopolinización de las
flores naturales de plantas T2 (es decir, cultivadas a partir de
semillas T2) se denominan T3, etc.
Se cultivan plantas transgénicas (T1) hasta que
alcanzan la madurez. Se deja que las flores se autopolinicen y se
recogen vainas de semillas después de la desecación normal. Se
recogen semillas de cada planta individual y se almacenan por
separado. Cada lote de semillas se ensaya por un análisis de
segregación genética para determinar el número de loci mendelianos
que llevan el rasgo de resistencia a kanamicina. Las semillas T2 se
esterilizan superficialmente por un lavado múltiple en hipoclorito
al 2% que contiene Tween-20 al 0,02% (v/v), seguido
de aclarados en agua estéril. Aproximadamente 150 de las semillas
se ponen el papel de filtro saturado con 0,2 X sales MS (Murashige y
Skoog, 1962) que contiene 150 \mug/ml de kanamicina. Después de
la germinación y la expansión de los cotiledones hasta
aproximadamente 5 mm, se determina la relación de cotiledones de
color verde normal (kan-r) frente a
cotiledones blanqueados (kan-s). Sólo se
conservan los lotes de semillas T2 que presentan una relación de
aproximadamente 3:1
(kan-r:kan-s) para un
análisis adicional; esta relación de segregación es indicativa de un
solo locus mendeliano que lleva el gen marcador de kanamicina.
De cuatro a diez plantas se cultivan hasta la
madurez a partir de cada lote de semillas T2 (usando las mismas
condiciones descritas anteriormente), y se dejan autopolinizar. La
recolección de las semillas T3, la esterilización de las semillas y
la germinación de las semillas se realizan como se ha descrito
anteriormente para las semillas T2. Los lotes de semillas T3 en los
que el 100% de las semillas ensayadas (n = 150) presentan el
fenotipo kan-r se consideran homocigotos para el
rasgo (es decir, resultante de una planta parental T2 homocigota) y
se conservan para el análisis fenotípico.
La expresión de PR-1a en una
orientación con sentido o anti-sentido se ensaya en
material de planta transgénica usando un ensayo ELISA para la
proteína PR-1a o un ensayo de extensión de
cebadores para el ARNm de PR-1 como se ha
descrito.
A. ELISA para la proteína
PR-1. Se realizan ensayos en placas de
microtitulación Immunolon II (Dynatech) que se han aclarado con
etanol y se han dejado secar al aire. El material de hoja de tabaco
se tritura con un homogeneizador de tejidos de plástico (Kontes) en
un tampón que consta de Tris-HCl 50 mM, pH 8,5,
2-mercaptoetanol 200 mM, PMSF 2 mM (Sigma), BAM 2 mM
(Sigma), ACA 10 mM (Sigma), y leupeptina al 0,048% (sal
hemisulfato) (Sigma); se usan 3 ml de tampón de extracción por
gramo de tejido de hoja. Se obtiene una muestra suficiente del
extracto de hoja sano (tabaco no tratado) de forma que una dilución
1/10 de este extracto pueda servir como diluyente para todas las
demás muestras. Los extractos se centrifugan en una microcentrífuga
en tubos de polipropileno de 1,5 ml a 12.000 x g (máximo) durante
15 minutos para retirar el desecho celular. Los pocillos se recubren
con una solución de anticuerpo monoclonal específico para la
proteína PR1 (tabaco). Después del lavado, los pocillos se bloquean
durante 30 a 120 minutos con una solución de BSA al 1% y después se
lavan de nuevo. Las muestras desconocidas y las muestras de curva
patrón, diluidas hasta las concentraciones apropiadas en una
solución 1/10 de extracto vegetal sano, se añaden a los pocillos y
se incuban durante 1 hora a 37ºC. (Se realiza una curva patrón
usando proteína PR-1a muy purificada). Después del
lavado, se añade un antisuero policlonal de conejo (5 \mug/ml)
específico para PR1 a los pocillos y se incuba durante una hora más
a 37ºC, y después los pocillos se lavan de nuevo. Se añade un
anticuerpo IgG de cabra anti-conejo (113 ng/ml) con
el que está conjugada la enzima indicadora fosfatasa alcalina
(Promega) y la reacción del indicador se revela de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante. La reacción se detiene después de 30
minutos por la adición de NaOH y la absorbancia se lee a 405
nm.
B. Ensayo de extensión de cebadores para
PR1. Se extrae ARN a partir de tejido de hoja de tabaco por un
método descrito previamente (Ecker y Davis, 1987). Los ensayos de
extensión de cebadores se realizan como se describe en el ejemplo 6
usando oligonucleótidos sintéticos de la secuencia
5'GTAGGTGCATTGGTTGAC3'
El complemento de esta secuencia existe tanto en
el ARNm de PR-1a como en el ARNm de
PR-1b, obteniéndose el cebado de los dos tipos de
ARNm en el ensayo. Los productos de extensión de cebadores del
producto génico quimérico se distinguen de los productos de los
genes de PR-1 endógenos usando PAGE. El transcrito
de PR-1a quimérico generado a partir del promotor de
la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco de derivados de pCGN1509
da como resultado un producto de extensión de cebadores que tiene
90 pb más que el gen de PR-1a endógeno, mientras que
el transcrito de PR-1b quimérico generado a partir
del promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco de los
derivados de pCGN1509 produce un producto de extensión de cebadores
que tiene 95 pb más que el gen de PR-1b endógeno.
El transcrito de PR-1a quimérico generado a partir
del promotor doble 35S de derivados de pCGN1761 produce un producto
que tiene 4 pb más que el gen de PR-1a endógeno,
mientras que el transcrito de PR-1b quimérico
generado a partir del promotor doble 35S de derivados de pCGN1761
produce un producto que tiene 10 pb más que gen de
PR-1b endógeno.
Se toma una muestra de tejido de hoja a partir de
plantas T1 transformadas con: pCGN1754 o pCGN1760 (como controles
de cassette vacíos); una de las series de vectores binarios
pCGN1755 (promotor SSU/PR-1a en todas las
orientaciones); o una de las series de vectores binarios pCGN1756
(promotor SSU/PR-1b). La expresión de la proteína
PR-1 en este tejido se determina por ELISA para la
proteína PR-1 y en algunos casos el nivel de ARN se
controla por ensayos de extensión de cebadores.
Se prevé que el tejido transformado con los
plásmidos de control pCGN1754 y pCGN1760 (cassette vacío) producirá
un cierto nivel basal de proteína PR-1 que se
debería a la síntesis endógena. El tejido transformado con los
plásmidos pCGN1755A, pCGN1755C, pCGN1756A o pCGN1756C
(PR-1a o PR-1b en una orientación
con sentido) produciría plantas que expresan PR-1 a
un nivel significativamente superior que el nivel basal. El tejido
transformado con pCGN1755B, pCGN1755D, pCGN1756B o pCGN1756D
(PR-1a o PR-1b en una orientación
anti-sentido) produciría niveles significativamente
menores de proteína PR-1 con respecto al control.
Cuando el tejido T1 transformado se selecciona con respecto a la
proteína PR-1 por ELISA, las plantas que cumplen las
expectativas se promueven para el análisis de T2. En esta
investigación, se intenta eliminar los transformantes que no se
contransforman con el gen PR-1 quimérico junto con
el gen de resistencia a antibióticos. Muchas plantas de cada
transformación no cumplen las expectativas y el resultado de la
proteína se confirma por análisis de extensión de cebadores del ARN
para asegurarse de que el mayor nivel de expresión en las plantas
con sentido se debe a la expresión de genes quiméricos.
Los ensayos se repiten en la generación T2 y en
este punto se eligen varias líneas para una caracterización
adicional. Las líneas se eligen basándose en: (1) una segregación
3:1 de la resistencia a antibióticos, que indica un rasgo mendeliano
heredado (una sola inserción); (2) altos niveles de expresión de
PR-1 para la construcción con sentido, bajos niveles
para las construcciones anti-sentido y niveles
intermedios para las plantas de control. Las líneas elegidas para un
estudio adicional y los datos para la expresión de
PR-1 y la segregación se muestran más adelante.
Línea de semillas | Análisis de segregación T2 | ELISA de expresión de PR-1 |
(% Kan-R) | en T2 (ng/ml) | |
1754-12 | 77% | 300 |
1755A-4 | 75% | 175 (Av=515 en T3) |
1755B-2 | 83% | \leq2 |
1755B-3 | 76% | \leq2 |
1760-1 | 93% | 240 |
La nomenclatura de la línea de semillas es tal
que primero se designa el plásmido de transformación y en segundo
lugar se designa el transformante individual. Por ejemplo,
1755A-4 representa una planta transgénica
resultante de la transformación con el plásmido pCGN1755A, y éste es
el cuarto transformante individual seleccionado. En muchos de estos
experimentos, el nivel de control de la expresión de
PR-1 parece artificialmente alto (es decir el
1754-12 anterior está a un nivel de 300 ng/ml, que
es aproximadamente 30 veces mayor que el nivel normal). Este nivel
se reduce en el control, pero no en las plantas experimentales con
generaciones sucesivas.
Las líneas de semillas T2 anteriores son
genotipos mixtos con respecto al gen de PR-1
quimérico. Por ejemplo, algunas de las plantas de una línea de
semillas son homocigotas y otras son heterocigotas para el rasgo.
Para aislar las líneas de semillas homocigotas, se dejan
autopolinizar entre cuatro y diez plantas de cada línea y se
establecen las semillas. Estas semillas se recogen y la segregación
se determina como se ha explicado anteriormente. A continuación se
muestran estos datos de segregación para varias líneas.
Línea de semillas T3 | Segregación (% Kan-R) |
1754-12-10 | 100 |
1755A-4-2 | 100 |
1755B-2-1 | 100 |
1755B-3-1 | 100 |
1760-1 | ND |
Estas líneas de semillas homocigotas después se
analizan con respecto a la resistencia a enfermedades generalizadas
como se describe más adelante. La conclusión general de los
análisis de esta serie de plantas es que las construcciones con
sentido (tanto PR-1a como PR-1b)
producen de 6 a 150 veces la cantidad de PR-1 en
tejido de tabaco sano y las construcciones
anti-sentido normalmente producen mucho menos
PR-1 que en el tabaco sano.
El desarrollo de líneas de semillas en este
ejemplo incluye las transformaciones de tabaco con el promotor
doble 35S de CaMV unido a PR-1a (series pCGN1764 y
pCGN1774) en la orientación con sentido y
anti-sentido y el promotor doble 35S de CaMV unido a
PR-1b (series pCGN1765 y pCGN1775) en la
orientación con sentido y anti-sentido. La
diferencia entre las construcciones pCGN1764/pCGN1765 y
pCGN1774/pCGN1775 es que el vector binario es diferente (véanse los
ejemplos relevantes anteriores). Los controles de cassette vacíos
para pCGN1764 y pCGN1765 son pCGN1766 y pCGN1767. El control de
cassette vacío para pCGN1774 y pCGN1775 es pCGN1789.
La expresión de la proteína PR-1
en las plantas T1 "con sentido" (todos los acontecimientos)
varía desde niveles indetectables hasta aproximadamente 13.000 ng/ml
de extracto; este nivel máximo está dentro de dos veces los niveles
observados en una hoja primaria muy infectada que lleva muchas
lesiones. Los niveles observados en el tejido secundario, incluso en
condiciones óptimas, son varias veces inferiores a éste. El nivel
de expresión medio de todas las plantas T1 "con sentido" es de
aproximadamente 4.200 ng/ml, que más de 20 veces mayor que el
promedio para las plantas transgénicas PR-1 de
subunidad pequeña.
No se observan diferencias significativas en los
niveles de expresión del gen quimérico entre el vector binario
pCGN783 (series pCGN1764 y pCGN1765). Las dos series de plantas
tienen un amplio intervalo de niveles de expresión, como es común en
experimentos transgénicos de este tipo. La máxima expresión en los
dos tipos es similar, y el número de plantas que expresan a un bajo
nivel es aproximadamente igual. El promedio para las plantas
binarias pCGN783 es mayor que el promedio para las plantas
transgénicas de subunidad pequeña-PR1.
No se observan diferencias significativas en los
niveles de expresión del gen quimérico entre el vector binario
pCGN783 (series pCGN1764 y pCGN17065) y el vector binario pCGN1540
(series pCGN1774 y pCGN1775). El promedio para la plantas binarias
de pCGN783 es 3.955 ng/ml, y para las plantas binarias de pCGN1540
es de 4.415 ng/ml, pero considerando la variación, esta diferencia
no es significativa. De forma similar, la orientación de los genes
en el binario no tiene un efecto importante sobre la expresión. La
orientación "C" (cabeza a cola) proporciona tres de las cuatro
plantas de máxima expresión, pero también proporciona más plantas de
un nivel de expresión bajo. Las plantas con orientación "A"
(cabeza a cabeza) tienden a agruparse más en el intervalo de
expresión moderado, pero de nuevo, la variación y el pequeño tamaño
de la muestra impiden la asociación de cualquier significado
estadístico a estas diferencias. El análisis de extensión de
cebadores de un número limitado de muestras demuestra que el ARNm
del gel quimérico es el dominante del único ARNm de PR1
presente.
La conclusión de los datos de T1 es que el nivel
de proteína PR-1 en plantas transformadas con las
construcciones de promotor doble 35S de CaMV/PR-1a o
PR-1b es varios cientos de veces mayor que el nivel
de las plantas de control. El nivel de expresión de
PR-1 en plantas transformadas con la construcción
anti-sentido es muy bajo. El vector binario usado
para la transformación (pCGN783 o pCGN1540) no afecta
significativamente al nivel de expresión de PR-1 en
las plantas transgénicas. De forma similar, la orientación del
cassette de expresión dentro del vector no tiene ningún efecto
significativo sobre el nivel de expresión de PR-1.
Por lo tanto, se selecciona un línea que produzca altos niveles de
PR-1a debido a la expresión con sentido y se
selecciona una que produzca bajos niveles de PR-1a
debido a la expresión anti-sentido para un
desarrollo adicional. Se incluye una línea de control con un
cassette vacío. Los resultados de la expresión de
PR-1 y la segregación de anticuerpos para las líneas
seleccionadas se muestran a continuación.
Línea de semillas T2 | Análisis de segregación | ELISA de expresión de PR-1 |
(% Kan-R) | de T2 (ng/ml) | |
1774A-10 | 409/553 | 9000 |
1774B-3 | 109/142 | \leq2 |
1789-10 | 371/459 | 5,6 |
Se generan líneas de semillas T3 homocigotas a
partir de cada una de las líneas seleccionadas como se describe en
el ejemplo previo. Los resultados del análisis de segregación se
muestran a continuación.
Línea de semillas T3 | Segregación (% Kan-R) |
1774A-10-1 | 100 |
1774B-3-2 | 100 |
1789-10-3 | 100 |
Estas líneas de semillas homocigotas se evalúan
con respecto a la expresión de PR-1 y de
resistencia a enfermedades como se describe más adelante.
Se toma una muestra de tejido de hoja de plantas
T1 transformadas con cualquiera de los vectores binarios pCGN1779C
o pCGN1779D. El contenido de quitinasa/lisozima de pepino se
determina usando un ensayo ELISA esencialmente como se ha descrito
anteriormente con la excepción de que los anticuerpos monoclonales
y policlonales se dirigen contra la quitinasa/lisozima de
pepino.
Ocho de trece plantas T1 "con sentido"
producen cantidades muy altas (>10.000 ng/ml de extracto) del
producto génico extraño de quitinasa de pepino. De nuevo, se observa
un amplio intervalo, desde indetectable hasta 31.500 ng/ml de
extracto, con un promedio de 12.500 ng/ml de extracto.
La conclusión de los datos de T1 es que las
plantas T1 transformadas producen varios miles de veces más de la
proteína transgénica que la que está presente en las plantas de
control. Se obtienen líneas de semillas T3 a partir de las plantas
T1 de alta expresión como se describe en el ejemplo 87 y estas
líneas de semillas T3 mantienen sus altos niveles de expresión de
quitinasa/lisozima.
Se toma una muestra de tejido de hoja a partir de
plantas T1 transformadas con cualquiera de los vectores binarios
pCGN1782C o pCGN1782D. El contenido de proteína quitinasa básica de
tabaco se estima por una técnica de inmunotransferencia (Towbin et
al., 1979) modificada por Johnson et al. (1984), siguiendo
SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Los anticuerpos usados se
inducen contra la proteína quitinasa básica de tabaco por métodos
convencionales y son específicos para la proteína quitinasa básica
de tabaco. Se hacen avanzar plantas T1 con el plásmido pCGN1782C
(que contienen el cassette de expresión con sentido) que muestran
altos niveles de expresión con respecto al control y las plantas
anti-sentido, hasta las líneas de semillas T3 como
se describe en el ejemplo 87. Las plantas T2 homocigotas que
producen estas semillas T3 continúan expresando la proteína a altos
niveles. También se hacen avanzar plantas T1 transformadas por el
plásmido pCGN1782D (que contiene el cassette de expresión
anti-sentido) que proporciona bajos niveles de
expresión hasta semillas T3 como se describe en el ejemplo 87.
Se toma una muestra de tejido de hoja a partir de
plantas T1 transformadas con cualquiera de los vectores binarios
pCGN1781C o pCGN1781D. El contenido de proteína glucanasa básica de
tabaco se estima por una técnica de inmunotransferencia como se
describe en el ejemplo 91B. Los anticuerpos usados se inducen
contra la proteína glucanasa básica de tabaco por métodos
convencionales y son específicos para la proteína glucanasa básica
de tabaco. Las plantas T1 con el plásmido pCGN1781C (que contiene
el cassette de expresión con sentido) que muestran altos niveles de
expresión con respecto al control y las plantas
anti-sentido, se hacen avanzar hasta líneas de
semillas T3 como se describe en el ejemplo 87. Las plantas T2
homocigotas que producen estas semillas T3 continúan expresando la
proteína a altos niveles. Las plantas T1 transformadas con el
plásmido pCGN1781D (que contienen el cassette de expresión
anti-sentido) que proporcionan bajos niveles de
expresión también se hacen avanzar hasta las semillas T3 como se
describe en el ejemplo 87.
Sección
9
En las secciones 1 a 8 se explica el desarrollo
de líneas de semillas transgénicas estables de tabaco que expresan
genes PRP quiméricos en una orientación con sentido y
anti-sentido. Una vez desarrolladas las líneas de
semillas, se evalúan cuantitativamente con respecto a la resistencia
a diversas enfermedades.
Las líneas de semillas
1755A-4-2 y
1755B-2-1 se analizan con respecto a
la resistencia a TMV. El resultado de estos experimentos es que no
hay ninguna diferencia significativa en el tamaño de las lesiones o
en el número de lesiones debido a los niveles elevados o reducidos
de proteína PR-1.
La líneas seminales
1755A-4-2 y
1755B-2-1 se analizan con respecto a
la resistencia al patógeno fúngico Peronospora nicotiana
(mildíu velloso de moho azul) por pulverización de una suspensión
de esporas en las hojas de las plantas e incubación en condiciones
convencionales durante siete días. Las plantas después se evalúan
con respecto a la resistencia al moho azul basándose en el
porcentaje de área de superficie de la hoja infectada por el
patógeno. Seis plantas de la línea
1755A-4-2 que expresan un promedio
de 1454 ng/ml de proteína PR-1 muestran un 98 \pm
3% de área de superficie infectada. Seis plantas de la línea
1755B-2-1, que expresan un promedio
de 370 ng/ml de proteína PR-1, muestran un 45%
\pm 26% de área de superficie infectada. Seis plantas derivadas de
tabaco Xanthi.nc transformadas que producen 559 ng/ml de proteína
PR-1 muestran un 99% \pm 1% de área de superficie
infectada. Este resultado indica que la expresión
anti-sentido de PR-1a produce una
resistencia significativa y valiosa al mildíu velloso en plantas
transgénicas.
Adelman et al., DNA 2:
183-193 (1983)
Allen, G., "Sequencing of proteins and
peptides", in: Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology, Vol. 9, ed. T.S. Work and R.H. Bordon, Elsevier,
North-Holland Biomedical Press, Amsterdam
(1981)
Alexander, Methods in Enzymology
154:41-64 (1987)
Barker et al., Plant Mol. Biol. 2:
335-350 (1983)
Bevan, M.W. and Chilton, M.-D.,
Ann. Rev. Genet. 16, 357 (1982)
Bolivar et al., Gene 2:
95-113 (1977)
Bolivar, Gene 4:
121-136 (1978)
Buckley, PH.D. Thesis, UC San Diego
1985
Chang and Cohen,J.
Bacteriol. 134: 1141-1156 (1978)
Chowhury, V.K. and Widholm, J.M.,
Plant Cell Reports 4, 289-292
(1985)
Chu et al., Scientia Sinica 18, 659
(1975)
Cornelissen, B.J.C. et al., EMBO
J., Vol. 5(1), 37 (1986)
Currier and Nester, J. Bact.
126:157-165 (1976)
de Block, M. et al., EMBO J., 6,
2513 (1987)
de Greve et al., J. Mol. Appl.
Genet. 1: 499-512 (1982)
Ecker and Davis, Proc. Natl.
Acad. Sci., USA 84: 5203-5206 (1987)
Evans D.A. and Bravo et al., in:
Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1, MacMillan Publ. Co.,
1983, p. 124
Facciotti et al., Bio/Technology 3:
241-246 (1985)
Facciotti and Pilet, Plant
Science Letters, 15: 1-7 (1979)
Fromm, M.E. et al., In: Methods in
Enzymology, eds. Wu, R. and Grossman, L. Academic Press,
Orlando, Florida, Vol. 153, 307, (1987)
Gamborg, O.L. et al., Experimental Cell
Research 50, 151-158 (1968)
Gardner et al., Nucl. Acids Res. 9:
2871-2888 (1981)
Garfinkel and Nester, J.
Bact. 144: 732-743 (1980)
Gray, D.J. and Conger et al.,
Plant Tissue Organ Cult., 4, 123-133
(1985)
Gubler, U. and Hoffman, B.J.,
Gene 25, 263 (1983)
Glover, D.M., DNA Cloning, IRL
Press, Oxford (1985)
Guiseley and Renn, "The Agarose
Monograph", Marine Colloids Division FMC Corp.,
(1975)
Gyllensten, U. and Erlich, H.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, 7652-7656
(1988)
Hall et al., PNAS USA
75:3196-3200 (1978)
Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166,
557-580 (1983)
Hanning, G.E. and Conger et al.,
Theor. Appl. Genet., 63, 155-159
(1982)
Hirsch and Beringer, Plasmid
12: 139-141 (1984)
Ho, S. et al., Gene 77,
51-59 (1989)
Holsters et al., Mol. Gen. Genet.
163: 181-187 (1978)
Hohn and Collins, Gene 11:
291-298 (1980)
Horsch, R. et al., Science 227,
1229-1232 (1985)
Johnson, D. et al., Gene Anal.
Techn., Vol. 1: 3-8 (1984)
Jorgensen et al., Mol. Gen. Genet.
177: 65 (1979)
Jouanin et al., Mol. Gen. Genet.
201: 370-374 (1985)
Kao K.N. and Michayluk et al.,
Planta 126, 105-110 (1975)
Klein, T.M. et al., Nature 327, 70
(1987)
Klein, A.S. et al., Planta 152,
105-114 (1981)
Knauf and Nester, Plasmid 8:
45 (1982)
Lagrimini, L.M. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84, 7542 (1987)
Lucas, J. et al., EMBO J. 4, 2745
(1985)
Laemmli, E., Nature, Vol. 227:
680-685 (1970)
Maniatis, T. et al., Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York
(1982);
Matsudaira, P., J. Biol. Chem.,
vol. 261, 10035-10038 (1987)
Messing et al., Nucl Acids Res. 9:
309-321 (1981)
Methods in Enzymology, Volumes 68, 100,
101 and 118 (1979, 1983 and 1986);
Metraux, J.P. et al., Physiological and
Molecular Plant Pathology, 33, 1-9
(1988)
Miller, J.H., Experiments in Molecular
Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
(1972)
Murashige T. and Skoog, F., Physiologia
Plantarum 15, 473 (1962)
Negrutiu, I. et al., Plant Mol.
Biol. 8, 363 (1987)
Norrander et al., Gene 26:
101-106 (1983)
Okayama and Berg, Mol. and Cell
Biol. 2:161-170 (1982)
O'Neal et al., Nucl. Acids Res.
15:8661-8677 (1987)
Parent, J.G. and Asselin, Can.
J. Bot. 62, 564 (1984)
Paszkowski, J. et al., EMBO J. 3,
2717 (1984)
Pfitzner U.M. et al., Nucl. Acid.
Res., 15(11), 4449 (1987)
Pierpoint, W.S. et al., Physiol. Plant
Pathol. 31,291 (1987)
Potrykus, I. et al., Mol. Gen.
Genet. 199, 169 (1985)
Redolfi and Neth, J Plant
Pathol 89:245-254, (1983)
Reich, T.J. et al., Bio/Technology
4, 1001 (1986)
Richardson M et al., Nature 327:432
(1987)
Rothstein, et al., Gene 53:
153-161 (1987)
Saiki et al., Science
239:487-491 (1988)
Sambrook J. et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)
Schenk, R.U. et al., Can. J. Bot.,
50, 199-204 (1972)
Shinshi et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84, 89-93 (1987)
Shinshi, H. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85: 5541-5545, (1988)
Shillito, R.D. et al., Plant Cell
Reports, 2, 244-247 (1983)
Shillito, R.D. et al.,
Bio/Technology 3, 1099-1103 (1985)
Shillito, R.D. and Potrykus, I.,
In: Methods in Enzymology, eds. Wu, R. and Grossman, L.
Academic Press, Orlando, Florida, Vol. 153, 313-306,
(1987)
Simpson, R.J. and Nice,
Biochem, Intl. 8, 787 (1984)
Smith, J.A., PH.D. Thesis,
Department of Botany and Plant Pathology, Michigan State University
Lansing, Michigan (1988)
Stahl et al., Nuc. Acids Res. 16:
3026-3038 (1988)
St. John and Davis, Cell,
16: 443-452 (1979)
Stratagene Lambda Zap laboratory manual,
Stratagene, San Diego, USA
Thomashow et al., Cell 19:
729-739 (1980)
Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Vol. 76: 4350-4354 (1979)
Tricoli, D.M. et al., Plant Cell
Reports, 5, 334-337 (1986),
Vaeck, M. et al., Nature 328, 33
(1987)
Van-Loon, Plant Mol. Biol. 4:
111-116, (1985)
Vieira and Messing, Gene
19:259-268 (1982)
Yamada, Y. et al., Plant Cell
Reports, 5, 85-88 (1986)
Yanisch-Perron et al.,
Gene 33: 103-119 (1985)
Yuen, S.W. et al., "Microanalysis of
SDS-PAGE Electroblotted Proteinas", in:
Applied Biosystems User Bulletin No. 36, March 21,
1988
Bibliografía de patentes
EP-A 129 668;
EP-A 223 452
EP-A 240 332
EP-A 0249432
WO 87/07299
US P 4.795.855
GB 2 159 173
Claims (29)
1. Un método para producir una planta que tiene
un fenotipo resistente a enfermedades, que comprende:
- (a)
- transformar tejido o células vegetales con una secuencia de ADN quimérico que comprende una primera secuencia de ADN que comprende un promotor que promueve en una planta la transcripción constitutiva de una secuencia de ADN asociada, unida operativamente a una segunda secuencia de ADN que comprende una secuencia codificante que codifica una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, donde dicha proteína relacionada con la patogénesis no es un quitinasa;
- (b)
- expresar constitutivamente la proteína relacionada con la patogénesis a un nivel suficiente para proporcionar un fenotipo resistente a enfermedades en la planta transformada de acuerdo con la etapa (a); y
- (c)
- seleccionar las plantas que presentan un fenotipo resistente a enfermedades, donde dicha enfermedad se produce por hongos patógenos.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dichos hongos patógenos se seleccionan entre el grupo
compuesto por Phytophtora y Peronospora.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dicha primera secuencia de ADN es de origen heterólogo con
respecto a la segunda secuencia de ADN.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la primera secuencia de ADN se prepara a partir de un gen que
codifica la subunidad pequeña de la ribulosa
bis-fosfato carboxilasa de tabaco (RUBISCO).
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la primera secuencia de ADN, que se prepara a partir del
genoma de CaMV, comprende el promotor doble 35S de CaMV.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la segunda secuencia de ADN se puede obtener a partir de una
biblioteca de ADN preparada a partir de un tejido vegetal en el que
se ha inducido resistencia adquirida sistémica o resistencia
adquirida localizada usando inductores biológicos.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la segunda secuencia de ADN codifica una proteína relacionada
con la patogénesis de plantas seleccionada entre el grupo compuesto
por PR-1A codificada por la secuencia 1,
PR-1B codificada por la secuencia 2,
PR-1C codificada por la secuencia 3,
PR-R mayoritaria codificada por la secuencia 4,
PR-R minoritaria, PR-P codificada
por la secuencia 6, PR-Q codificada por secuencia 5,
PR-2 codificada por la secuencia 8,
PR-N, PR-O, PR-O'
codificadas por la secuencia 7A, SAR8.2a codificada por la secuencia
9, SAR8.2b codificada por la secuencia 10, peroxidasa básica de
pepino codificada por la secuencia 12, y glucanasa básica de
tabaco.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la unión de la primera y la segunda secuencia de ADN se ha
realizado de una forma en la que la segunda secuencia de ADN se
orienta con respecto a la primera secuencia de ADN de tal forma que
la primera secuencia de ADN promueve la transcripción de la cadena
con sentido de la segunda secuencia de ADN.
9. Un método de la reivindicación 1, donde la
secuencia de ADN quimérico comprende además una tercera secuencia
de ADN que es un gen marcador selectivo en plantas.
10. Una planta transgénica que incluye la
progenie de la misma, que se ha transformado con una molécula de
ADN quimérico que comprende un promotor que promueve en una planta
la transcripción constitutiva de una secuencia de ADN asociada,
unida operativamente a una secuencia codificante que codifica una
proteína relacionada con la patogénesis en plantas inducible, donde
dicha proteína relacionada con la patogénesis no es una quitinasa,
para expresar constitutivamente una proteína relacionada con la
patogénesis a un nivel suficiente para proporcionar un fenotipo
resistente a enfermedades, donde dicha progenie comprende dicha
molécula de ADN quimérico, donde dicha enfermedad se produce por
hongos patógenos.
11. Una planta transgénica de acuerdo con la
reivindicación 10, donde dichos hongos patógenos se seleccionan
entre el grupo compuesto por Phytophtora y
Peronospora.
12. Una planta transgénica de acuerdo con la
reivindicación 10, donde la proteína relacionada con la patogénesis
vegetal se selecciona entre el grupo compuesto por
PR-1A codificada por la secuencia 1,
PR-1B codificada por la secuencia 2,
PR-1C codificada por la secuencia 3,
PR-R mayoritaria codificada por la secuencia 4,
PR-R minoritaria, PR-P codificada
por la secuencia 6, PR-Q codificada por la
secuencia 5, PR-2 codificada por la secuencia 8,
PR-N, PR-O, PR-O'
codificadas por la secuencia 7A, SAR8.2a codifica por la secuencia
9, SAR8.2b codificada por la secuencia 10, peroxidasa básica de
pepino codificada por la secuencia 12 y glucanasa básica de
tabaco.
\newpage
13. Una planta transgénica de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, que es una planta
seleccionada entre el grupo compuesto por tabaco, zanahoria,
girasol, tomate, algodón, sorgo, Petunia y
Glycine.
14. Una planta transgénica de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, que es una planta
seleccionada entre el grupo compuesto por Zea mays,
Dactylis y Lolium.
15. Una planta transgénica de acuerdo con la
reivindicación 14, que es una planta de maíz.
16. Una semilla de una planta transgénica
obtenida a partir de una planta de una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 15, donde dicha semilla comprende dicha
molécula de ADN quimérico.
17. Una planta resistente a enfermedades
producida por un método de la reivindicación 1, donde dicha
enfermedad se produce por hongos patógenos.
18. Una planta resistente a enfermedades de
acuerdo con la reivindicación 17, donde dichos hongos patógenos se
seleccionan entre el grupo compuesto por Phytophtora y
Peronospora.
19. Una planta resistente a enfermedades
producida por un método de una cualquiera de las reivindicaciones 3
a 9, donde dicha enfermedad se produce por hongos patógenos.
20. Una planta resistente a enfermedades de
acuerdo con la reivindicación 19, donde dichos hongos patógenos se
seleccionan entre el grupo compuesto por Phytophtora y
Peronospora.
21. Un tejido vegetal que expresa
constitutivamente niveles inducidos de proteínas relacionadas con
la patogénesis de plantas o que expresa constitutivamente niveles de
proteínas relacionadas con la patogénesis, que proporcionan un
fenotipo resistente a enfermedades, con la condición de que las
proteínas relacionadas con la patogénesis sean de origen heterólogo
con respecto a la planta a transformar y no sean una quitinasa,
donde dicha enfermedad se produce por hongos patógenos.
22. Un tejido vegetal de acuerdo con la
reivindicación 21, donde dichos hongos patógenos se seleccionan
entre el grupo compuesto por Phytophtora y
Peronospora.
23. Un método para proteger una planta contra las
lesiones producidas por una enfermedad vegetal, que comprende
transformar tejido o células vegetales con una secuencia de ADN
quimérico que comprende una primera secuencia de ADN que promueve en
una planta la trascripción constitutiva de una segunda secuencia de
ADN, y comprendiendo la segunda secuencia de ADN una secuencia
codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de
plantas inducible o una secuencia codificante que tiene una
homología de secuencia substancial con una secuencia codificante de
una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible,
de tal forma que la planta transformada presente un fenotipo
resistente a enfermedades, y plantar dicha planta transformada en un
medio, donde puede producirse la enfermedad, donde dicha proteína
relacionada con la patogénesis no es una quitinasa, y donde dicha
enfermedad se produce por hongos patógenos.
24. Un método de acuerdo con la reivindicación
23, donde la segunda secuencia de ADN codifica una proteína
relacionada con la patogénesis de plantas del grupo compuesto por
PR-1A codificada por la secuencia 1,
PR-1B codificada por la secuencia 2,
PR-1C codificada por la secuencia 3,
PR-R mayoritaria codificada por la secuencia 4,
PR-R minoritaria, PR-P codificada
por la secuencia 6, PR-Q codificada por secuencia
5, PR-2 codificada por la secuencia 8,
PR-N, PR-O, PR-O'
codificadas por la secuencia 7A, SAR8.2a codifica por la secuencia
9, SAR8.2b codificada por la secuencia 10, peroxidasa básica de
pepino codificada por la secuencia 12 y glucanasa básica de
tabaco.
25. Un método de acuerdo con la reivindicación
23, donde los hongos patógenos son los seleccionados entre el grupo
compuesto por Phytophtora y Peronospora.
26. Un método de acuerdo con la reivindicación
23, donde la planta a proteger es una planta de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 20.
27. Un método de acuerdo con la reivindicación
26, donde la planta a proteger es una planta seleccionada entre el
grupo compuesto por tabaco, zanahoria, girasol, tomate, algodón,
sorgo, Petunia y Glycine.
\newpage
28. Un método de acuerdo con la reivindicación
27, donde la planta a proteger es una planta seleccionada entre el
grupo compuesto por Zea mays, Dactylis y
Lolium.
29. Un método de acuerdo con la reivindicación
28, donde la planta a proteger es una planta de maíz.
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US32901889A | 1989-03-24 | 1989-03-24 | |
US329018 | 1989-03-24 | ||
US36867289A | 1989-06-20 | 1989-06-20 | |
US368672 | 1989-06-20 | ||
US42550489A | 1989-10-20 | 1989-10-20 | |
US425504 | 1989-10-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2199931T3 true ES2199931T3 (es) | 2004-03-01 |
Family
ID=27406646
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES90105336T Expired - Lifetime ES2199931T3 (es) | 1989-03-24 | 1990-03-21 | Plantas transgenicas resistentes a enfermedades. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0392225B1 (es) |
JP (1) | JPH0335783A (es) |
KR (1) | KR100212691B1 (es) |
AT (1) | ATE241699T1 (es) |
AU (1) | AU642865B2 (es) |
CA (1) | CA2012778C (es) |
DE (1) | DE69034081T2 (es) |
DK (1) | DK0392225T3 (es) |
ES (1) | ES2199931T3 (es) |
HU (1) | HUT60770A (es) |
IL (1) | IL93844A (es) |
NZ (1) | NZ233053A (es) |
Families Citing this family (1055)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5521153A (en) * | 1987-10-02 | 1996-05-28 | Ciba-Geigy Corporation | Synergistic antifungal protein and compositions containing same |
US5614395A (en) * | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
US5034323A (en) * | 1989-03-30 | 1991-07-23 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
EP0418695A1 (de) * | 1989-09-13 | 1991-03-27 | Ciba-Geigy Ag | Regulatorische DNA-Sequenz |
IL97020A (en) * | 1990-01-30 | 2000-12-06 | Mogen Int | Recombinant polynucleotides comprising a chitinase gene and a glucanase gene |
EP0460753A3 (en) * | 1990-06-07 | 1992-04-15 | Mogen International N.V. | New antifungal preparations, process for making such preparations, process for obtaining plants with decreased susceptibility to fungi |
ES2235150T3 (es) * | 1990-06-15 | 2005-07-01 | Syngenta Participations Ag | Nuevas secuencias de señales. |
FR2665177B1 (fr) * | 1990-07-24 | 1994-09-02 | Sanofi Sa | Gene recombinant codant pour une proteine a activite endochitinase et/ou lysozyme. |
US6262338B1 (en) | 1990-10-06 | 2001-07-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Resistance genes |
DE4031758A1 (de) * | 1990-10-06 | 1992-04-09 | Bayer Ag | Resistenz-gene |
FR2674538B1 (fr) * | 1991-03-25 | 1994-11-18 | Sanofi Elf | Adn recombinant codant pour une nouvelle proteine a activite beta 1,3-glucanase bacteries contenant cet adn, cellules vegetales et plantes transformees. |
DK61691D0 (da) * | 1991-04-08 | 1991-04-08 | Danisco | Genetiske konstruktioner |
GB9110544D0 (en) * | 1991-05-15 | 1991-07-03 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
CA2083272A1 (en) * | 1991-05-24 | 1992-11-26 | Francisco Garcia-Olmedo | Novel antipathogenic peptides and compositions containing same |
GB9115909D0 (en) * | 1991-07-23 | 1991-09-04 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
AU5085993A (en) * | 1992-09-28 | 1994-04-26 | Monsanto Company | Method of controlling plant pathogenic fungi |
CA2152173A1 (en) * | 1993-01-08 | 1994-07-21 | John A. Ryals | Method for breeding disease resistance into plants |
US6232525B1 (en) | 1993-01-08 | 2001-05-15 | Novartis Finance Corporation | Mutant plants and uses therefor |
US6107544A (en) * | 1993-01-08 | 2000-08-22 | Novartis Finance Corporation | Method for breeding disease resistance into plants |
DE4442179C2 (de) * | 1994-11-26 | 1996-12-12 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Pathogenresistente Pflanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung |
US6100451A (en) * | 1995-05-18 | 2000-08-08 | Board Of Trustees Of The University Of Kentucky | Pathogen-inducible regulatory element |
US5981843A (en) | 1995-05-18 | 1999-11-09 | Board Of Trustee Of The University Of Kentucky | Elicitin-mediated plant resistance |
US5851766A (en) * | 1995-05-31 | 1998-12-22 | Novartis Finance Corporation | Process for isolating chemically regulatable DNA sequences |
US5773696A (en) * | 1996-03-29 | 1998-06-30 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
GB9607517D0 (en) | 1996-04-11 | 1996-06-12 | Gene Shears Pty Ltd | The use of DNA Sequences |
AUPN953296A0 (en) * | 1996-04-29 | 1996-05-23 | Cooperative Research Centre For Tropical Plant Pathology | Fungus resistant transgenic plants |
DE19621572A1 (de) * | 1996-05-29 | 1997-12-04 | Max Planck Gesellschaft | Lokalisierter Zelltod in Pflanzen |
US6121436A (en) | 1996-12-13 | 2000-09-19 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
WO1998055860A1 (en) * | 1997-06-04 | 1998-12-10 | Novartis Ag | Pesticide screening system |
US7087420B1 (en) | 1997-07-17 | 2006-08-08 | Cambia | Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof |
FR2767537B1 (fr) * | 1997-08-20 | 2001-07-13 | Rhone Poulenc Agrochimie | Gene codant pour l'androctonine, vecteur le contenant et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies |
PL343635A1 (en) * | 1998-03-31 | 2001-08-27 | Mogen Internat Nv | Salicylic acid pathway genes and their use for the induction of resistance in plants |
AR020078A1 (es) | 1998-05-26 | 2002-04-10 | Syngenta Participations Ag | Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta |
US6677503B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-01-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Sunflower anti-pathogene proteins and genes and their uses |
WO2001012801A2 (en) * | 1999-08-18 | 2001-02-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Defense-related signaling genes and methods of use |
US6667427B1 (en) | 1999-10-14 | 2003-12-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Sclerotinia-inducible promoters and their uses |
US20020144310A1 (en) | 2000-01-28 | 2002-10-03 | Lightfoot David A. | Isolated polynucleotides and polypeptides relating to loci underlying resistance to soybean cyst nematode and soybean sudden death syndrome and methods employing same |
AU2001288478B2 (en) | 2000-08-25 | 2006-11-02 | Basf Plant Science Gmbh | Plant polynucleotides encoding prenyl proteases |
DE10063986A1 (de) * | 2000-12-21 | 2002-06-27 | Max Planck Gesellschaft | Pflanzen mit verbesserter Widerstandskraft |
US20030017566A1 (en) * | 2001-01-18 | 2003-01-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize peroxidase genes and their use for improving plant disease resistance and stalk strength |
CA2448096A1 (en) | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes |
EP2261228B1 (en) | 2001-11-07 | 2011-12-28 | Syngenta Participations AG | Promoters for regulation of gene expression in plant roots |
KR100436750B1 (ko) * | 2002-05-03 | 2004-06-22 | 학교법인고려중앙학원 | 고추 한별 품종 유래의 casar 82a 단백질을코딩하는 유전자 염기서열 및 마커로의 이용 |
US20060253917A1 (en) | 2002-12-26 | 2006-11-09 | Bret Cooper | Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor |
DK1633876T3 (da) | 2003-06-17 | 2008-12-08 | Sembiosys Genetics Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af insulin i planter |
AR048669A1 (es) | 2004-03-03 | 2006-05-17 | Syngenta Ltd | Derivados biciclicos de bisamida |
BRPI0508518A (pt) | 2004-03-08 | 2007-08-14 | Syngenta Participations Ag | proteìna e promotor de semente de milho rica em glutamina |
CN101023175B (zh) | 2004-04-20 | 2012-02-29 | 辛根塔参与股份公司 | 用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列 |
GB0418047D0 (en) | 2004-08-12 | 2004-09-15 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
GB0422401D0 (en) | 2004-10-08 | 2004-11-10 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
PT1907550E (pt) | 2005-07-21 | 2013-01-23 | Virgilio Borges Loureiro | Proteína extraída de plantas do género lupinus ou produzida de forma recombinante, sequência de nucleótidos que a codifica e sua utilização em nutrição animal, como promotora do crescimento de plantas e na luta contra fungos patogénicos |
BRPI0613867A2 (pt) | 2005-07-21 | 2011-02-15 | Syngenta Participations Ag | combinações fungicidas |
EP1763998B1 (en) | 2005-09-16 | 2007-05-23 | Syngenta Participations AG | Fungicidal compositions |
ES2404814T3 (es) | 2005-09-29 | 2013-05-29 | Syngenta Participations Ag | Composiciones fungicidas |
ATE431077T1 (de) | 2005-09-29 | 2009-05-15 | Syngenta Participations Ag | Cyprodinilhaltige fungizide zusammensetzung |
EP1776864A1 (en) | 2005-10-20 | 2007-04-25 | Syngenta Participations AG | Fungicidal compositions |
AR059035A1 (es) | 2006-01-16 | 2008-03-12 | Syngenta Participations Ag | Insecticidas derivados de antranilamida |
ES2402655T3 (es) | 2006-02-09 | 2013-05-07 | Syngenta Participations Ag | Composiciones fungicidas |
ES2392104T3 (es) | 2006-06-16 | 2012-12-04 | Syngenta Participations Ag | Derivados de carboxamida etenílica útiles como microbiocidas |
ES2711418T3 (es) | 2006-09-18 | 2019-05-03 | Basf Se | Mezclas pesticidas que comprenden un insecticida antranilamida y un fungicida |
WO2008080014A2 (en) | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Donald Danforth Plant Science Center | Antifungal plant proteins and methods of their use |
DE102008059357A1 (de) | 2007-03-22 | 2009-04-23 | Sumitomo Chemical Co. Ltd. | Agrochemische Zusammensetzung zur Bekämpfung oder Prophylaxe von durch pflanzenpathogene Mikroben verursachten Pflanzenkrankheiten |
ES2325523B1 (es) | 2007-03-22 | 2010-06-24 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Composicion agricola para controlar o prevenir enfermedades de las plantas provocadas por microbios patogeos de las plantas. |
JP5256753B2 (ja) | 2007-03-29 | 2013-08-07 | 住友化学株式会社 | イソオキサゾリン化合物とその有害生物防除用途 |
CN104206402B (zh) | 2007-04-12 | 2018-04-24 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含氰基亚磺酰亚胺基化合物的农药混合物 |
CA2584934A1 (en) | 2007-04-17 | 2008-10-17 | University Of Guelph | Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof |
IN2009DN06368A (es) | 2007-04-25 | 2015-07-24 | Syngenta Participations Ag | |
JP2008291012A (ja) | 2007-04-27 | 2008-12-04 | Sumitomo Chemical Co Ltd | アミド化合物ならびにその植物病害防除用途 |
US20100069499A1 (en) | 2007-04-27 | 2010-03-18 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Amide compound and use thereof |
EP2143709A4 (en) | 2007-04-27 | 2010-04-28 | Sumitomo Chemical Co | AMIDE COMPOUND AND USE THEREOF |
JP2008291013A (ja) | 2007-04-27 | 2008-12-04 | Sumitomo Chemical Co Ltd | アミド化合物およびその植物病害防除用途 |
US20100137445A1 (en) | 2007-06-29 | 2010-06-03 | Sumitomo Chemical Company ,Limited | Plant disease control agent, and plant disease control method |
CN101743237A (zh) | 2007-07-16 | 2010-06-16 | 先正达参股股份有限公司 | 稠合的邻氨基苯甲酰胺杀虫剂 |
GB0716414D0 (en) | 2007-08-22 | 2007-10-03 | Syngenta Participations Ag | Novel insecticides |
JP2010539213A (ja) | 2007-09-20 | 2010-12-16 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 殺菌性株及び活性成分を含む組み合わせ |
JP2010540495A (ja) | 2007-09-26 | 2010-12-24 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | ボスカリド及びクロロタロニルを含む三成分殺菌組成物 |
EP2053046A1 (en) | 2007-10-26 | 2009-04-29 | Syngeta Participations AG | Novel imidazole derivatives |
EP2053044A1 (en) | 2007-10-26 | 2009-04-29 | Syngenta Participations AG | Novel imidazole derivatives |
EP2053045A1 (en) | 2007-10-26 | 2009-04-29 | Syngenta Participations AG | Novel imidazole derivatives |
BRPI0820400A2 (pt) | 2007-11-20 | 2015-05-19 | Sumitomo Chemical Co | Composto de piridina, composição pesticida e método de controle de pragas. |
CA2704271C (en) | 2007-12-03 | 2016-07-19 | Syngenta Participations Ag | Engineering enzymatically susceptible phytases |
JP5347463B2 (ja) | 2007-12-26 | 2013-11-20 | 住友化学株式会社 | 除草用組成物 |
GB0800762D0 (en) | 2008-01-16 | 2008-02-27 | Syngenta Participations Ag | Novel pyridazine derivatives |
FR2928070A1 (fr) | 2008-02-27 | 2009-09-04 | Sumitomo Chemical Co | Composition agricole, utilisation d'un compose pour sa production et procede pour matriser ou prevenir les maladies des plantes. |
EP2253206B1 (en) | 2008-03-21 | 2014-01-01 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Plant disease control composition |
JP5365041B2 (ja) | 2008-03-25 | 2013-12-11 | 住友化学株式会社 | 植物病害防除組成物および植物病害防除方法 |
JP5365047B2 (ja) | 2008-03-28 | 2013-12-11 | 住友化学株式会社 | 植物病害防除組成物および植物病害防除方法 |
JP5369854B2 (ja) | 2008-04-21 | 2013-12-18 | 住友化学株式会社 | 有害節足動物防除組成物および縮合複素環化合物 |
EP2315760B1 (de) | 2008-07-29 | 2013-03-06 | Basf Se | Piperazinverbindungen mit herbizider wirkung |
EP2183969A3 (en) | 2008-10-29 | 2011-01-05 | Basf Se | Method for increasing the number of seedlings per number of sowed grains of seed |
TWI526535B (zh) | 2008-09-12 | 2016-03-21 | 住友化學股份有限公司 | 噻唑菌胺對於基因轉殖植物在植物病害之防治方法的用途 |
TWI489941B (zh) | 2008-09-19 | 2015-07-01 | Sumitomo Chemical Co | 種子處理劑及保護植物的方法 |
JP5355053B2 (ja) | 2008-09-19 | 2013-11-27 | 住友化学株式会社 | 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法 |
WO2010032874A1 (ja) | 2008-09-19 | 2010-03-25 | 住友化学株式会社 | 農業用組成物 |
JP2010100611A (ja) | 2008-09-26 | 2010-05-06 | Sumitomo Chemical Co Ltd | ピリジン化合物及びその有害生物の防除用途 |
US20110183848A1 (en) | 2008-10-02 | 2011-07-28 | Basf Se | Piperazine Compounds With Herbicidal Effect |
JP2010090090A (ja) | 2008-10-10 | 2010-04-22 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法 |
JP2010090089A (ja) | 2008-10-10 | 2010-04-22 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法 |
WO2010046422A2 (en) | 2008-10-22 | 2010-04-29 | Basf Se | Use of auxin type herbicides on cultivated plants |
WO2010046423A2 (en) | 2008-10-22 | 2010-04-29 | Basf Se | Use of sulfonylurea herbicides on cultivated plants |
JP5365161B2 (ja) | 2008-11-25 | 2013-12-11 | 住友化学株式会社 | 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法 |
JP5365159B2 (ja) | 2008-11-25 | 2013-12-11 | 住友化学株式会社 | 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法 |
JP5359223B2 (ja) | 2008-11-25 | 2013-12-04 | 住友化学株式会社 | 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法 |
JP5365160B2 (ja) | 2008-11-25 | 2013-12-11 | 住友化学株式会社 | 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法 |
JP5417814B2 (ja) | 2008-11-25 | 2014-02-19 | 住友化学株式会社 | 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法 |
JP5365158B2 (ja) | 2008-11-25 | 2013-12-11 | 住友化学株式会社 | 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法 |
JP2010168362A (ja) | 2008-12-24 | 2010-08-05 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 含硫黄化合物およびその用途 |
JP5212350B2 (ja) | 2008-12-24 | 2013-06-19 | 住友化学株式会社 | 含ハロゲン有機硫黄化合物およびその用途 |
ES2619279T3 (es) | 2009-01-22 | 2017-06-26 | Syngenta Participations Ag. | Polipéptidos de Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa mutantes y métodos de uso |
US9347046B2 (en) | 2009-01-22 | 2016-05-24 | Syngenta Participations Ag | Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use |
ES2524819T3 (es) | 2009-01-27 | 2014-12-12 | Basf Se | Procedimiento de tratamiento de semillas |
AU2010209008B2 (en) | 2009-01-30 | 2014-07-17 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Coated seed |
WO2010089244A1 (en) | 2009-02-03 | 2010-08-12 | Basf Se | Method for dressing seeds |
CA2749356A1 (en) | 2009-02-06 | 2010-09-12 | Syngenta Participations Ag | Modification of multidomain enzyme for expression in plants |
AR075573A1 (es) | 2009-02-11 | 2011-04-20 | Basf Se | Dimethomorph como protector de plaguicidas con efectos fitotoxicos |
CN102307478A (zh) | 2009-02-11 | 2012-01-04 | 巴斯夫欧洲公司 | 农药混合物 |
BRPI1005355A2 (pt) | 2009-02-11 | 2016-02-10 | Basf Se | misturas, composição pesticida, método para o controle de pragas e/ou para aprimorar a saúde de plantas, método para a proteção do material de propagação de planta contra pragas e material de propagação de planta |
WO2010092014A2 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2010092031A2 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
JP2010222343A (ja) | 2009-02-26 | 2010-10-07 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 有害生物防除組成物 |
JP2010222342A (ja) | 2009-02-26 | 2010-10-07 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 有害生物防除組成物 |
AU2010220293B2 (en) | 2009-03-04 | 2014-09-11 | Basf Se | 3-arylquinazolin-4-one compounds for combating invertebrate pests |
GB0903955D0 (en) | 2009-03-06 | 2009-04-22 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
WO2010103065A1 (en) | 2009-03-11 | 2010-09-16 | Basf Se | Fungicidal compositions and their use |
GB0904315D0 (en) | 2009-03-12 | 2009-04-22 | Syngenta Participations Ag | Novel imidazole derivatives |
JP2010235603A (ja) | 2009-03-13 | 2010-10-21 | Sumitomo Chemical Co Ltd | ピリダジノン化合物及びその用途 |
WO2010106008A2 (en) | 2009-03-16 | 2010-09-23 | Basf Se | Fungicidal compositions comprising fluopyram and metrafenone |
KR20120014241A (ko) | 2009-03-20 | 2012-02-16 | 바스프 에스이 | 캡슐화된 농약으로 작물을 처리하는 방법 |
NZ594887A (en) | 2009-03-26 | 2013-11-29 | Basf Se | Use of synthetic and biological fungicides in combination for controlling harmful fungi |
CN102369199A (zh) | 2009-04-01 | 2012-03-07 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于防治无脊椎动物害虫的异*唑啉化合物 |
US9232785B2 (en) | 2009-04-02 | 2016-01-12 | Basf Se | Method for reducing sunburn damage in plants |
GB0906515D0 (en) | 2009-04-15 | 2009-05-20 | Syngenta Participations Ag | Fungical compositions |
MX2011013011A (es) | 2009-06-05 | 2012-02-28 | Univ Florida | Aislamiento y supresion dirigida de genes biosinteticos de lignina a partir de caña de azucar. |
US20120077676A1 (en) | 2009-06-12 | 2012-03-29 | Basf Se | Antifungal 1,2,4-Triazolyl Derivatives Having a 5-Sulfur Substituent |
WO2019106641A2 (en) | 2017-12-03 | 2019-06-06 | Seedx Technologies Inc. | Systems and methods for sorting of seeds |
WO2010146032A2 (de) | 2009-06-16 | 2010-12-23 | Basf Se | Fungizide mischungen |
KR20120062679A (ko) | 2009-06-18 | 2012-06-14 | 바스프 에스이 | 황 치환기를 보유하는 트리아졸 화합물 |
WO2010146115A1 (en) | 2009-06-18 | 2010-12-23 | Basf Se | Triazole compounds carrying a sulfur substituent |
EP2442653A2 (de) | 2009-06-18 | 2012-04-25 | Basf Se | Fungizide mischungen |
EP2443097A1 (en) | 2009-06-18 | 2012-04-25 | Basf Se | Antifungal 1, 2, 4-triazolyl derivatives |
EP2443098A1 (en) | 2009-06-18 | 2012-04-25 | Basf Se | Antifungal 1, 2, 4-triazolyl derivatives |
EP2443099A1 (en) | 2009-06-18 | 2012-04-25 | Basf Se | Antifungal 1, 2, 4-triazolyl derivatives having a 5- sulfur substituent |
WO2010146116A1 (en) | 2009-06-18 | 2010-12-23 | Basf Se | Triazole compounds carrying a sulfur substituent |
SI2443102T1 (sl) | 2009-06-19 | 2013-08-30 | Basf Se | Herbicidni benzoksazinoni |
AR077228A1 (es) | 2009-06-25 | 2011-08-10 | Basf Se | Uso de mezclas agroquimicas para aumentar la salud de plantas |
WO2010149758A1 (en) | 2009-06-25 | 2010-12-29 | Basf Se | Antifungal 1, 2, 4-triazolyl derivatives |
EP2451804B1 (en) | 2009-07-06 | 2014-04-30 | Basf Se | Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
WO2011003775A2 (de) | 2009-07-09 | 2011-01-13 | Basf Se | Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung |
WO2011003776A2 (de) | 2009-07-09 | 2011-01-13 | Basf Se | Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung |
BR112012001001A2 (pt) | 2009-07-14 | 2016-11-16 | Basf Se | compositos azol das formulas i e ii, compostos das formulas i e i, compostos de formula ix, composição agricola, uso de um composto farmaceutica, metodo para tratar infecções de câncer ou virus para combater fungos zoopatigênicos ou humanopatogenicos |
WO2011009804A2 (en) | 2009-07-24 | 2011-01-27 | Basf Se | Pyridine derivatives compounds for controlling invertebrate pests |
US20120129696A1 (en) | 2009-07-28 | 2012-05-24 | Basf Se | Method for increasing the level of free amino acids in storage tissues of perennial plants |
MX2012000421A (es) | 2009-07-28 | 2012-02-08 | Basf Se | Composiciones plaguicidas de suspo - emulsiones. |
WO2011014660A1 (en) | 2009-07-30 | 2011-02-03 | Merial Limited | Insecticidal 4-amino-thieno[2,3-d]-pyrimidine compounds and methods of their use |
GEP20146079B (en) | 2009-08-12 | 2014-04-25 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal heterocycles |
UA107938C2 (en) | 2009-08-12 | 2015-03-10 | Syngenta Participations Ag | Heterocycles with microbicidal properties |
UY32838A (es) | 2009-08-14 | 2011-01-31 | Basf Se | "composición activa herbicida que comprende benzoxazinonas |
EP2470507B1 (en) | 2009-08-25 | 2014-03-26 | Syngenta Participations AG | N-Alkoxycarboxamides and their use as microbiocides |
JP2013505909A (ja) | 2009-09-24 | 2013-02-21 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 無脊椎動物害虫を駆除するためのアミノキナゾリン化合物 |
US20120178625A1 (en) | 2009-09-25 | 2012-07-12 | Basf Se | Method for reducing pistillate flower abortion in plants |
AU2010303120A1 (en) | 2009-09-29 | 2012-04-19 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2011039105A2 (en) | 2009-09-29 | 2011-04-07 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
CA2773196C (en) | 2009-09-30 | 2017-10-24 | Basf Se | Low volatile amine salts of anionic pesticides |
WO2011042378A1 (de) | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Basf Se | Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung |
WO2011045355A1 (en) | 2009-10-16 | 2011-04-21 | Syngenta Participations Ag | Novel microbiocides |
WO2011048120A1 (en) | 2009-10-22 | 2011-04-28 | Syngenta Participations Ag | Synergistic fungicidal composition containing a n-2-(pyrazolyl) ethylphenylcarboxamide |
WO2011051212A1 (de) | 2009-10-28 | 2011-05-05 | Basf Se | Verwendung heteroaromatischer verbindungen als herbizide |
DE102010042867A1 (de) | 2009-10-28 | 2011-06-01 | Basf Se | Verwendung heterozyklischer Verbindungen als Herbizide |
DE102010042864A1 (de) | 2009-10-30 | 2011-06-01 | Basf Se | Substituierte Thioamide mit herbizider Wirkung |
WO2011051393A1 (en) | 2009-11-02 | 2011-05-05 | Basf Se | Herbicidal tetrahydrophthalimides |
US8329619B2 (en) | 2009-11-03 | 2012-12-11 | Basf Se | Substituted quinolinones having herbicidal action |
JP2013510113A (ja) | 2009-11-06 | 2013-03-21 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 4−ヒドロキシ安息香酸及び選択された殺有害生物剤の結晶複合体 |
WO2011057989A1 (en) | 2009-11-11 | 2011-05-19 | Basf Se | Heterocyclic compounds having herbicidal action |
WO2011057942A1 (en) | 2009-11-12 | 2011-05-19 | Basf Se | Insecticidal methods using pyridine compounds |
WO2011058036A1 (en) | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Basf Se | Tricyclic compounds having herbicidal action |
WO2011057935A1 (en) | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Basf Se | 3-(3,4-dihydro-2h-benzo [1,4]oxazin-6-yl)-1h-pyrimidin-2,4-dione compounds as herbicides |
US9023874B2 (en) | 2009-11-17 | 2015-05-05 | Merial, Inc. | Fluorinated oxa or thia heteroarylalkylsulfide derivatives for combating invertebrate pests |
GB0920893D0 (en) | 2009-11-27 | 2010-01-13 | Syngenta Participations Ag | Plant growth regulation |
EP2503886A2 (en) | 2009-11-27 | 2012-10-03 | Syngenta Participations AG | Plant growth regulation |
GB0920892D0 (en) | 2009-11-27 | 2010-01-13 | Syngenta Participations Ag | Plant growth regulation |
WO2011064188A1 (en) | 2009-11-27 | 2011-06-03 | Basf Se | Insecticidal methods using nitrogen-containing heteroaromatic compounds |
WO2011067184A1 (de) | 2009-12-01 | 2011-06-09 | Basf Se | 3- (4, 5 -dihydroisoxazol- 5 -yl) benzoylpyrazolverbindungen und ihre mischungen mit safenern |
JP2013512873A (ja) | 2009-12-02 | 2013-04-18 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | トリアザメートとストロビルリン類との駆除剤混合物 |
WO2011067209A2 (en) | 2009-12-02 | 2011-06-09 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
GB0921346D0 (en) | 2009-12-04 | 2010-01-20 | Syngenta Participations Ag | Chemical compounds |
GB0921343D0 (en) | 2009-12-04 | 2010-01-20 | Syngenta Participations Ag | Chemical compounds |
ES2546100T3 (es) | 2009-12-04 | 2015-09-18 | Merial, Inc. | Compuestos pesticidas bis-organosulfurados |
GB0921344D0 (en) | 2009-12-04 | 2010-01-20 | Syngenta Participations Ag | Chemical compounds |
WO2011069955A1 (en) | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Basf Se | Sulfonimidamide compounds for combating animal pests |
WO2011069912A1 (de) | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Basf Se | Triazolverbindungen, ihre verwendung sowie sie enthaltende mittel |
WO2011069916A1 (de) | 2009-12-08 | 2011-06-16 | Basf Se | Triazolverbindungen, ihre verwendung als fungizide sowie sie enthaltende mittel |
EA025427B1 (ru) | 2009-12-08 | 2016-12-30 | Басф Се | Пестицидные смеси |
CN102638989B (zh) | 2009-12-08 | 2015-01-28 | 巴斯夫欧洲公司 | 农药混合物 |
WO2011069894A1 (de) | 2009-12-08 | 2011-06-16 | Basf Se | Triazolverbindungen, ihre verwendung sowie sie enthaltende mittel |
EP2509419A2 (en) | 2009-12-10 | 2012-10-17 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2011069930A2 (en) | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2011073143A1 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Basf Se | Substituted cyanobutyrates having herbicidal action |
US20120291159A1 (en) | 2009-12-18 | 2012-11-15 | Basf Se | Azoline Compounds for Combating Invertebrate Pests |
AU2010333140A1 (en) | 2009-12-18 | 2012-06-14 | Syngenta Limited | 2 -aryl-3 -hydroxy-cyclopentenone derivatives as insecticides, acaricides, nematocides and molluscicides |
GB0922376D0 (en) | 2009-12-22 | 2010-02-03 | Syngenta Participations Ag | Novel compounds |
EP2516424B1 (en) | 2009-12-22 | 2013-12-18 | Syngenta Participations AG | Pyrazole derivatives |
WO2011082913A1 (en) | 2010-01-08 | 2011-07-14 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions containing isopyrazam, azoxystrobin and cyproconazole |
CN102711456B (zh) | 2010-01-18 | 2015-05-13 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含农药和2-丙基庚胺的烷氧基化物的组合物 |
JP2013518084A (ja) | 2010-02-01 | 2013-05-20 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 有害動物を駆除するための置換されたケトン性イソオキサゾリン化合物および誘導体 |
TW201201691A (en) | 2010-02-04 | 2012-01-16 | Syngenta Participations Ag | Novel compounds |
WO2011095459A1 (en) | 2010-02-04 | 2011-08-11 | Syngenta Participations Ag | Pyridazine derivatives, process for their preparation and their use as fungicides |
WO2011098417A1 (en) | 2010-02-10 | 2011-08-18 | Basf Se | Substituted cyanobutyrates having herbicidal action |
WO2011101303A2 (de) | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Basf Se | Zusammensetzung umfassend ein pestizid und ein alkoxylat von iso-heptadecylamin |
US8536215B2 (en) | 2010-02-18 | 2013-09-17 | Syngenta Crop Protection Llc | Pyrazole microbiocides |
US20120316184A1 (en) | 2010-02-24 | 2012-12-13 | Syngenta Crop Protection Llc | Novel microbicides |
MA34071B1 (fr) | 2010-02-25 | 2013-03-05 | Syngenta Participations Ag | Mélanges pesticides comprenant des dérivés d'isoxazoline et un agent biologique insecticide ou nématicide |
BR112012021238A2 (pt) | 2010-02-25 | 2016-06-21 | Syngenta Ltd | misturas pesticidas contendo derivados de isoxazolina e um fungicida |
EP2363023A1 (en) | 2010-03-04 | 2011-09-07 | Basf Se | Synergistic fungicidal and insecticidal mixtures |
WO2011110583A2 (en) | 2010-03-10 | 2011-09-15 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising triazole derivatives |
WO2011113786A2 (de) | 2010-03-17 | 2011-09-22 | Basf Se | Zusammensetzung umfassend ein pestizid und ein alkoxylat von verzweigtem nonylamin |
EP2550264B1 (en) | 2010-03-23 | 2016-06-08 | Basf Se | Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
CN102834391A (zh) | 2010-03-23 | 2012-12-19 | 巴斯夫欧洲公司 | 防治无脊椎动物害虫的哒嗪化合物 |
EP2550271A1 (en) | 2010-03-23 | 2013-01-30 | Basf Se | Substituted pyridines having herbicidal action |
CN102858780A (zh) | 2010-03-23 | 2013-01-02 | 巴斯夫欧洲公司 | 具有除草作用的取代哒嗪 |
JP2013522339A (ja) | 2010-03-23 | 2013-06-13 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 除草作用を有する置換されたピリジン |
JP2013522335A (ja) | 2010-03-23 | 2013-06-13 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 除草活性を有するピラジノチアジン |
AR081526A1 (es) | 2010-03-23 | 2012-10-03 | Basf Se | Piridazinas sustituidas que tienen accion herbicida |
CN102822178B (zh) | 2010-03-23 | 2015-10-21 | 巴斯夫欧洲公司 | 具有除草作用的吡啶并噻嗪 |
BR112012023757B1 (pt) | 2010-03-23 | 2020-10-20 | Basf Se | composto de piridazina, método para controlar pragas invertebradas e método para proteger material de propagação de plantas |
KR20130045254A (ko) | 2010-03-24 | 2013-05-03 | 신젠타 파티서페이션즈 아게 | 농약 혼합물 |
MX2012009416A (es) | 2010-03-26 | 2012-10-02 | Basf Se | Mezclas fungicidas basadas en azolopirimidinilaminas. |
EP2371219A1 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-05 | Basf Se | Herbicidal acylhydrazides |
JP2013525320A (ja) | 2010-04-20 | 2013-06-20 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | アメトクトラジンおよびテトラゾリルオキシム誘導体を含む殺菌混合物 |
WO2011134867A1 (en) | 2010-04-26 | 2011-11-03 | Basf Se | Herbicidal azolopyrimidines |
JP2011246436A (ja) | 2010-04-28 | 2011-12-08 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 有害生物防除組成物 |
WO2011134539A1 (en) | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Basf Se | Use of oxylipins as safeners and safening herbicidal compositions comprising oxylipins |
WO2011134876A1 (en) | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Syngenta Participations Ag | A method of reducing insect-vectored viral infections |
WO2011138345A2 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Basf Se | Fungicidal mixtures based on gallic acid esters |
WO2011144593A1 (en) | 2010-05-18 | 2011-11-24 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising insecticides and pyraclostrobin |
TWI584733B (zh) | 2010-05-28 | 2017-06-01 | 巴地斯顏料化工廠 | 包含阿巴汀之農藥混合物、其用途及使用該混合物之方法 |
CN102933555B (zh) | 2010-05-28 | 2014-07-23 | 先正达参股股份有限公司 | 吡唑羧酰胺衍生物以及它们作为杀微生物剂的用途 |
TWI501727B (zh) | 2010-05-28 | 2015-10-01 | Basf Se | 農藥混合物 |
JP6000242B2 (ja) | 2010-05-31 | 2016-09-28 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 農薬組成物 |
BR112012030473A2 (pt) | 2010-05-31 | 2015-09-29 | Syngenta Participations Ag | pesticidas baseados em derivados pirrolidina espiroheterocíclicos |
CA2800369C (en) | 2010-05-31 | 2018-07-10 | Basf Se | Method for increasing the health of a plant |
EP2576554A1 (en) | 2010-05-31 | 2013-04-10 | Syngenta Participations AG | 1, 8 -diazaspiro [4.5]decane- 2, 4 -dione derivatives useful as pesticides |
UY33412A (es) | 2010-05-31 | 2011-12-30 | Syngenta Participations Ag | Composiciones pesticidas con dionas cíclicas y de toxicidad reducida |
WO2011151146A1 (en) | 2010-05-31 | 2011-12-08 | Syngenta Participations Ag | Method of crop enhancement |
CN103003277A (zh) | 2010-05-31 | 2013-03-27 | 先正达参股股份有限公司 | 作为杀虫剂有用的1,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮衍生物 |
EP2392210A1 (en) | 2010-06-04 | 2011-12-07 | Syngenta Participations AG | Methods for increasing stress tolerance in plants |
WO2011154433A2 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures including isoxazoline derivatives |
EP2579725A2 (en) | 2010-06-09 | 2013-04-17 | Syngenta Participations AG | Pesticidal mixtures including isoxazoline derivatives |
US20130261069A1 (en) | 2010-06-09 | 2013-10-03 | Syngenta Crop Protection Llc | Pesticidal mixtures comprising isoxazoline derivatives |
EP2584896A2 (en) | 2010-06-24 | 2013-05-01 | Basf Se | Herbicidal compositions |
WO2011161132A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2011161131A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Basf Se | Herbicidal mixtures |
BR122015019540B1 (pt) | 2010-06-29 | 2017-12-12 | Kumiai Chemical Industry Co., Ltd. | Derivatives of triazin or a salt thereof, agrochemical composition, and method for controlling the growth of weeds in safras and useful plants |
EP2402340A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
EP2402345A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazole fused bicyclic compounds |
EP2401915A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
EP2402343A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazole-fused bicyclic compounds |
EP2402336A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
EP2409570A3 (en) | 2010-06-29 | 2013-11-13 | Basf Se | Fungicidal mixtures based on pyrazolopyridine compounds |
EP2402339A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
EP2402335A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
EP2402344A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazole fused bicyclic compounds |
EP2402338A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-04 | Basf Se | Pyrazolopyridine compounds |
BR112012033490A2 (pt) | 2010-07-02 | 2015-09-15 | Syngenta Participations Ag | derivados de éter dioxima microbicida |
WO2012007426A1 (en) | 2010-07-13 | 2012-01-19 | Basf Se | Azoline substituted isoxazoline benzamide compounds for combating animal pests |
CN103003265A (zh) | 2010-07-19 | 2013-03-27 | 先正达参股股份有限公司 | 杀微生物剂 |
CN103003268A (zh) | 2010-07-19 | 2013-03-27 | 先正达参股股份有限公司 | 作为杀微生物剂的异噁唑、异噻唑、呋喃以及噻吩化合物 |
ES2564017T3 (es) | 2010-07-22 | 2016-03-17 | Basf Se | Isoxazolo[5,4-b]piridinas herbicidas |
CA2804355A1 (en) | 2010-07-29 | 2012-02-02 | Syngenta Participations Ag | Novel microbiocidal dioxime ether derivatives |
KR20130101003A (ko) | 2010-08-03 | 2013-09-12 | 바스프 에스이 | 살진균 조성물 |
WO2012019981A1 (en) | 2010-08-09 | 2012-02-16 | Basf Se | Fungicidal mixtures |
DE102011080568A1 (de) | 2010-08-16 | 2012-02-16 | Basf Se | Substituierte Cyanobutyrate mit herbizider Wirkung |
WO2012022729A2 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | Basf Se | Method for improving the health of a plant |
CA2805770A1 (en) | 2010-08-24 | 2012-03-01 | Basf Se | Agrochemical mixtures for increasing the health of a plant |
BR112013005869A2 (pt) | 2010-09-13 | 2019-09-24 | Basf Se | ''método para controlar pragas invertebradas, uso de um composto, método, material de propagação vegetal e composição agrícola'' |
WO2012034960A1 (en) | 2010-09-13 | 2012-03-22 | Basf Se | Pyridine compounds for controlling invertebrate pests ii |
BR112013005382B1 (pt) | 2010-09-13 | 2020-02-18 | Basf Se | Uso de um composto 3-piridila, método para controlar pragas invertebradas, método para proteger o material de propagação vegetal e/ou plantas e composição agrícola |
CN103118537B (zh) | 2010-09-14 | 2015-08-12 | 巴斯夫欧洲公司 | 含有pyripyropene杀虫剂和碱的农药组合物 |
AU2011303970B2 (en) | 2010-09-14 | 2015-08-13 | Basf Se | Composition containing a pyripyropene insecticide and an adjuvant |
CN103124723A (zh) | 2010-09-23 | 2013-05-29 | 先正达参股股份有限公司 | 新颖的杀微生物剂 |
WO2012043372A1 (ja) | 2010-09-29 | 2012-04-05 | 東海ゴム工業株式会社 | 水系ホース用ゴム組成物およびそれを用いて得られる水系ホース |
US20130184320A1 (en) | 2010-10-01 | 2013-07-18 | Basf Se | Imine Compounds |
JP2013540113A (ja) | 2010-10-01 | 2013-10-31 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 除草性ベンゾオキサジノン |
AR083112A1 (es) | 2010-10-01 | 2013-01-30 | Syngenta Participations Ag | Metodo para controlar enfermedades fitopatogenas y composiciones fungicidas utiles para dicho control |
CN103228627A (zh) | 2010-10-01 | 2013-07-31 | 巴斯夫欧洲公司 | 作为杀虫剂的亚胺取代的2,4-二芳基吡咯啉衍生物 |
CN103237447A (zh) | 2010-10-07 | 2013-08-07 | 巴斯夫欧洲公司 | 嗜球果伞素用于增加冬季禾谷类中面筋强度的用途 |
EP2443923A1 (de) | 2010-10-25 | 2012-04-25 | Basf Se | Zusammensetzung umfassend ein Pestizid und ein Polycarboxylatether |
JP2013540765A (ja) | 2010-10-11 | 2013-11-07 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 殺有害生物剤及びポリカルボキシレートエーテルを含む組成物 |
ES2617563T3 (es) | 2010-10-21 | 2017-06-19 | Syngenta Participations Ag | Composiciones que comprenden ácido abscísico y un compuesto fungicidamente activo |
EP2447262A1 (en) | 2010-10-29 | 2012-05-02 | Basf Se | Pyrrole, furane and thiophene derivatives and their use as fungicides |
EP2447261A1 (en) | 2010-10-29 | 2012-05-02 | Basf Se | Pyrrole, furane and thiophene derivatives and their use as fungicides |
EP2460404A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Basf Se | Compositions containing identical polyamine salts of mixed anionic pesticides |
CA2815742A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | Syngenta Participations Ag | Novel microbiocides |
WO2012066122A1 (en) | 2010-11-18 | 2012-05-24 | Syngenta Participations Ag | 2 - (pyridin- 2 -yl) -quinazoline derivatives and their use as microbicides |
WO2012069601A1 (en) | 2010-11-25 | 2012-05-31 | Syngenta Participations Ag | Substituted quinazolines as fungicides |
CN103228645A (zh) | 2010-11-25 | 2013-07-31 | 先正达参股股份有限公司 | 杀微生物杂环 |
WO2012076563A1 (en) | 2010-12-08 | 2012-06-14 | Basf Se | Fungicidal mixtures |
WO2012077077A1 (en) | 2010-12-08 | 2012-06-14 | Basf Se | Fungicidal mixtures |
EP2462807A1 (en) | 2010-12-08 | 2012-06-13 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising pyraclostrobin |
WO2012076704A2 (en) | 2010-12-10 | 2012-06-14 | Basf Se | Pyrazole compounds for controlling invertebrate pests |
WO2012080419A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-21 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures |
BR112013014665A2 (pt) | 2010-12-15 | 2016-07-19 | Syngenta Participations Ag | misturas pesticidas |
AU2011344311B2 (en) | 2010-12-15 | 2015-05-14 | Basf Se | Herbicidal compositions |
EP2465350A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-20 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
AU2011347752A1 (en) | 2010-12-20 | 2013-07-11 | Basf Se | Pesticidal active mixtures comprising pyrazole compounds |
WO2012085081A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Basf Se | Sulfoximinamide compounds for combating invertebrate pests ii |
US20130274104A1 (en) | 2010-12-22 | 2013-10-17 | Basf Se | Agrochemical mixtures for increasing the health of a plant |
UA108681C2 (uk) | 2010-12-23 | 2015-05-25 | Басф Се | Заміщені піридини, що мають гербіцидну активність |
US20130296436A1 (en) | 2010-12-27 | 2013-11-07 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Amidine compounds and use thereof for plant disease control |
JP5842594B2 (ja) | 2010-12-27 | 2016-01-13 | 住友化学株式会社 | ピリダジノン化合物、それを含有する除草剤及び有害節足動物防除剤 |
US8653003B2 (en) | 2011-01-05 | 2014-02-18 | Syngenta Participations Ag | Pyrazol-4-yl carboxamide derivatives as microbiocides |
EP2474226A1 (en) | 2011-01-07 | 2012-07-11 | Basf Se | Herbicidally active composition comprising cyanobutyrates |
EP2476313A1 (en) | 2011-01-14 | 2012-07-18 | Basf Se | Synergistic pesticidal compositions comprising a dithiocarbamate and an insecticide |
EP2481284A3 (en) | 2011-01-27 | 2012-10-17 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP2484210A1 (en) | 2011-02-08 | 2012-08-08 | Basf Se | Pesticidal compositions |
BR112013020213A2 (pt) | 2011-02-09 | 2016-08-02 | Syngenta Participations Ag | compostos inseticidas |
US8748432B2 (en) | 2011-02-10 | 2014-06-10 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
WO2012107477A1 (en) | 2011-02-10 | 2012-08-16 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
PL2672826T3 (pl) | 2011-02-11 | 2015-10-30 | Basf Se | Kompozycje chwastobójcze zawierające topramezon, pinoksaden i klokwintocet |
WO2012110439A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-23 | Basf Se | Method for controlling phytopathogenic fungi |
US8822523B2 (en) | 2011-02-21 | 2014-09-02 | Syngenta Participations Ag | Carboxamide microbiocides |
EA022869B1 (ru) | 2011-02-28 | 2016-03-31 | Басф Се | Композиция, содержащая пестицид, сурфактант и алкоксилат 2-пропилгептиламина |
JP2011137030A (ja) | 2011-03-01 | 2011-07-14 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法。 |
WO2012117021A2 (en) | 2011-03-03 | 2012-09-07 | Syngenta Participations Ag | Novel microbiocidal oxime ethers |
KR20140021581A (ko) | 2011-03-07 | 2014-02-20 | 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 | 논벼 경작에서의 잡초들의 제어 방법 |
PL2688405T3 (pl) | 2011-03-23 | 2018-05-30 | Basf Se | Kompozycje zawierające polimerowe, jonowe związki zawierające grupy imidazoliowe |
WO2012130823A1 (en) | 2011-03-30 | 2012-10-04 | Basf Se | Suspension concentrates |
TWI634840B (zh) | 2011-03-31 | 2018-09-11 | 先正達合夥公司 | 植物生長調節組成物及使用其之方法 |
US9179680B2 (en) | 2011-04-06 | 2015-11-10 | Basf Se | Substituted pyrimidinium compounds for combating animal pests |
AR085872A1 (es) | 2011-04-08 | 2013-10-30 | Basf Se | Derivados heterobiciclicos n-sustituidos utiles para combatir parasitos en plantas y/o animales, composiciones que los contienen y metodos para combatir dichas plagas |
WO2012143395A1 (en) | 2011-04-20 | 2012-10-26 | Syngenta Participations Ag | 4,5-dihydro-isoxazole derivatives as fungicides |
CN103491775A (zh) | 2011-04-21 | 2014-01-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 3,4-二取代的吡咯-2,5-二酮及其作为杀真菌剂的用途 |
WO2012150162A1 (en) | 2011-05-02 | 2012-11-08 | Basf Se | A method for enhancing the performance of a pesticide with guanidines |
EP2524596A1 (en) | 2011-05-18 | 2012-11-21 | Basf Se | Seed treatment uses |
WO2012159891A1 (en) | 2011-05-20 | 2012-11-29 | Syngenta Participations Ag | Endosperm-specific plant promoters and uses therefor |
BR112013029907A2 (pt) | 2011-06-01 | 2016-08-09 | Basf Se | método de controle de vegetação indesejada e uso de uma base |
WO2012168210A1 (en) | 2011-06-06 | 2012-12-13 | Basf Se | Seed treatment formulation aid containing polymeric sticker and silicon oil |
BR112013030822A2 (pt) | 2011-06-09 | 2016-08-16 | Basf Se | composto de piridina substituída da fórmula i, composição e método para controlar a vegetação indesejada |
WO2012168241A1 (en) | 2011-06-09 | 2012-12-13 | Basf Se | Substituted pyrazines having herbicidal activity |
EP2532661A1 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-12 | Syngenta Participations AG | Novel insecticides |
MX2013013199A (es) | 2011-06-17 | 2014-02-20 | Basf Se | Metodo para combatir hongos fitopatogenos que comprende el tratamiento de plantas o semillas por proteger contra el ataque fungico con 2,3,5,6 - tetraciano - [1,4]ditiina. |
UY34136A (es) | 2011-06-17 | 2013-01-03 | Basf Se | Mezclas fungicidas sinérgicas que comprenden 2,3,5,6-tetraciano-[1,4]ditiína |
AR087008A1 (es) | 2011-06-22 | 2014-02-05 | Syngenta Participations Ag | Derivados de n-oxi-pirazolo-triazepina-diona |
EP2540718A1 (en) | 2011-06-29 | 2013-01-02 | Syngenta Participations AG. | Novel insecticides |
WO2013002299A1 (ja) | 2011-06-29 | 2013-01-03 | 日本農薬株式会社 | 農園芸用殺虫剤組成物及びその使用方法 |
MX359992B (es) | 2011-06-30 | 2018-10-18 | Syngenta Participations Ag | Heterociclos microbiocidas. |
WO2013000941A1 (en) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal heterocycles |
WO2013007550A1 (en) | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Syngenta Participations Ag | Fungicide mixtures |
EP2731935B1 (en) | 2011-07-13 | 2016-03-09 | BASF Agro B.V. | Fungicidal substituted 2-[2-halogenalkyl-4-(phenoxy)-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds |
KR20140057550A (ko) | 2011-07-15 | 2014-05-13 | 바스프 에스이 | 살진균성의 알킬-치환된 2-[2-클로로-4-(4-클로로-페녹시)-페닐]-1-[1,2,4]트리아졸-1-일-에탄올 화합물 |
US20140141974A1 (en) | 2011-07-15 | 2014-05-22 | Basf Se | Fungicidal phenylalkyl-substituted 2-[2-chloro-4-(4-chloro-phenoxy)-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds |
WO2013010885A1 (en) | 2011-07-15 | 2013-01-24 | Basf Se | Fungicidal alkyl- and aryl-substituted 2-[2-chloro-4-(dihalo-phenoxy)-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds |
WO2013010946A2 (en) | 2011-07-15 | 2013-01-24 | Basf Se | Pesticidal methods using substituted 3-pyridyl thiazole compounds and derivatives for combating animal pests i |
WO2013011010A1 (en) | 2011-07-19 | 2013-01-24 | Syngenta Participations Ag | Fungizide mixtures |
WO2013017402A1 (en) | 2011-08-02 | 2013-02-07 | Basf Se | Aqueous composition comprising a pesticide and a base selected from an alkali salt of hy-drogencarbonate |
EP2742037B1 (en) | 2011-08-12 | 2015-10-14 | Basf Se | N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides |
CA2843083A1 (en) | 2011-08-12 | 2013-02-21 | Basf Se | Anthranilamide compounds and their use as pesticides |
JP2014522876A (ja) | 2011-08-12 | 2014-09-08 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | N−チオ−アントラニルアミド化合物、及び殺有害生物剤としてのそれらの使用 |
EP2742021A1 (en) | 2011-08-12 | 2014-06-18 | Basf Se | Aniline type compounds |
WO2013024003A1 (en) | 2011-08-12 | 2013-02-21 | Basf Se | N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides |
IN2014CN01024A (es) | 2011-08-12 | 2015-04-10 | Basf Se | |
BR112014002970A2 (pt) | 2011-08-12 | 2017-02-21 | Basf Se | composto, método para preparar um composto, composição agrícola ou veterinária, método para combater ou controlar pragas invertebradas, método para proteger o cultivo de plantas, método para a proteção de sementes, semente, usos do composto e método para tratar |
EP2559688A1 (en) | 2011-08-15 | 2013-02-20 | Basf Se | Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-butoxy-ethyl}-1h [1,2,4]triazole compounds |
CN103827096A (zh) | 2011-08-15 | 2014-05-28 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀真菌的取代的1-{2-[2-卤代-4-(4-卤代苯氧基)苯基]-2-烷氧基己基}-1h-[1,2,4]三唑化合物 |
EP2744792B1 (en) | 2011-08-15 | 2016-10-12 | Basf Se | Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-alkynyloxy-ethyl}-1h-[1,2,4]triazole compounds |
CN103857662B (zh) | 2011-08-15 | 2017-02-15 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀真菌的取代的1‑{2‑[2‑卤代‑4‑(4‑卤代苯氧基)苯基]‑2‑烷氧基‑2‑炔基/链烯基乙基}‑1h‑[1,2,4]三唑化合物 |
US9247746B2 (en) | 2011-08-15 | 2016-02-02 | Basf Se | Fungicidal substituted 1-{2-cyclyloxy-2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-ethyl}-1H-[1,2,4]triazole compounds |
EP2744791B1 (en) | 2011-08-15 | 2015-10-28 | Basf Se | Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-alkoxy-3-methyl-butyl}-1h-[1,2,4]triazole compounds |
KR20140054235A (ko) | 2011-08-15 | 2014-05-08 | 바스프 에스이 | 살진균 치환된 1-{2-[2-할로-4-(4-할로겐-페녹시)-페닐]-2-알콕시-2-시클릴-에틸}-1h-[1,2,4]트리아졸 화합물 |
JP2014524430A (ja) | 2011-08-15 | 2014-09-22 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 殺菌性置換1−{2−[2−ハロ−4−(4−ハロゲン−フェノキシ)−フェニル]−2−エトキシ−エチル}−1h−[1,2,4]トリアゾール化合物 |
CN103889960A (zh) | 2011-08-18 | 2014-06-25 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于防治无脊椎动物害虫的氨基甲酰基甲氧基-和氨基甲酰基甲硫基-及氨基甲酰基甲基氨基苯甲酰胺 |
US20140243196A1 (en) | 2011-08-18 | 2014-08-28 | Basf Se | Carbamoylmethoxy- and Carbamoylmethylthio- and Carbamoylmethylamino Benzamides for Combating Invertebrate Pests |
JP2014524434A (ja) | 2011-08-18 | 2014-09-22 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 有害無脊椎動物を駆除するためのカルバモイルメトキシベンズアミドおよびカルバモイルメチルチオベンズアミドおよびカルバモイルメチルアミノベンズアミド |
UY34279A (es) | 2011-08-23 | 2013-04-05 | Syngenta Participations Ag | Compuestos heterocíclicos activos como microbiocidas, intermediarios, composiciones y usos |
UA112086C2 (uk) | 2011-08-25 | 2016-07-25 | Басф Се | Гербіцидні композиції, що включають хлорацетаміди |
CN104023535A (zh) | 2011-09-02 | 2014-09-03 | 巴斯夫欧洲公司 | 农药活性的3-芳基喹唑啉-4-酮衍生物在土壤施用方法中的用途 |
IN2014CN02367A (es) | 2011-09-02 | 2015-06-19 | Basf Se | |
JP2014525424A (ja) | 2011-09-02 | 2014-09-29 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | アリールキナゾリノン化合物を含む農業用混合物 |
MD4518C1 (ro) | 2011-09-13 | 2018-05-31 | Basf Agrochemical Products B.V. | Procedeu de combatere a buruienilor parazite cu amestecuri erbicide ce conţin inhibitori ai acetolactat sintazei şi regulatori de creştere a plantelor |
TW201325454A (zh) | 2011-09-16 | 2013-07-01 | Syngenta Participations Ag | 植物生長調控 |
WO2013037758A1 (en) | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Syngenta Participations Ag | Crop enhancement with cis-jasmone |
US10130096B2 (en) | 2011-10-07 | 2018-11-20 | Syngenta Participations Ag | Method for protecting useful plants or plant propagation material |
EP2768828A1 (en) | 2011-10-18 | 2014-08-27 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal pyrazole derivatives |
EP2768829A1 (en) | 2011-10-18 | 2014-08-27 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal pyrazole derivatives |
SI2776038T1 (en) | 2011-11-11 | 2018-06-29 | Gilead Apollo, Llc | ACC INHIBITORS AND THEIR USE |
US20140323306A1 (en) | 2011-11-14 | 2014-10-30 | Basf Se | Substituted 1,2,5-Oxadiazole Compounds and Their Use as Herbicides |
MX2014005607A (es) | 2011-11-16 | 2014-07-30 | Basf Se | Compuestos de 1,2,5-oxadiazol sustituido y su uso como herbicidas ii. |
CN104039780A (zh) | 2011-11-18 | 2014-09-10 | 巴斯夫欧洲公司 | 取代的1,2,5-噁二唑化合物及其作为除草剂的用途iii |
ES2575212T3 (es) | 2011-11-29 | 2016-06-27 | Syngenta Participations Ag | Derivados de triazinona insecticidas |
TWI572282B (zh) | 2011-11-30 | 2017-03-01 | 先正達合夥公司 | 含有螺雜環吡咯啶二酮的殺有害生物混合物 |
ES2647106T3 (es) | 2011-12-05 | 2017-12-19 | Basf Agrochemical Products B.V. | Métodos para controlar la vegetación indeseable con imazamox y adyuvantes en plantas de cultivo resistentes a herbicidas |
WO2013092460A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | Syngenta Participations Ag | Cyclic bisoxime microbicides |
WO2013092244A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | Basf Se | Herbicidal triazines |
CN104023724A (zh) | 2011-12-21 | 2014-09-03 | 巴斯夫欧洲公司 | N-硫代邻氨基苯甲酰胺化合物及其作为农药的用途 |
EP2794601B1 (en) | 2011-12-23 | 2019-02-20 | Basf Se | Isothiazoline compounds for combating invertebrate pests |
IN2014CN04204A (es) | 2012-01-12 | 2015-07-17 | Basf Se | |
EP2804482A2 (en) | 2012-01-17 | 2014-11-26 | Syngenta Participations AG | Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones |
WO2013107794A2 (en) | 2012-01-17 | 2013-07-25 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones |
IN2014DN05868A (es) | 2012-01-17 | 2015-05-22 | Syngenta Participations Ag | |
BR112014017562B1 (pt) | 2012-01-17 | 2020-11-03 | Syngenta Participations Ag. | mistura pesticida, método de controle de insetos, ácaros, nematódeos ou moluscos e método de proteção de uma semente contra o ataque de pragas |
WO2013113789A1 (en) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Basf Se | N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides |
WO2013113791A1 (en) | 2012-02-03 | 2013-08-08 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
BR112014018986A8 (pt) | 2012-02-13 | 2017-07-11 | Syngenta Participations Ag | Regulação do crescimento de plantas |
WO2013124250A2 (en) | 2012-02-20 | 2013-08-29 | Basf Se | Fungicidal substituted thiophenes |
WO2013127780A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Syngenta Participations Ag | Chemical compounds |
WO2013127860A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with herbicidal action in cereals |
BR112014021525A2 (pt) | 2012-03-01 | 2017-07-18 | Basf Se | usos de uma composição, método para controlar vegetação indesejada e método para dessecação e/ou desfolhação de plantas de soja |
WO2013127845A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in sunflowers |
WO2013127818A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in soybeans |
BR112014021199A2 (pt) | 2012-03-01 | 2018-05-08 | Basf Se | composição, método para preparação da composição, polímero, método para preparação do polímero, método para controlar fungos e semente |
WO2013127857A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in cereals |
EP2822387A1 (en) | 2012-03-01 | 2015-01-14 | Basf Se | Agrochemical compositions |
WO2013127846A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in corn |
WO2013127859A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in soybeans |
BR112014021520A2 (pt) | 2012-03-01 | 2017-07-11 | Basf Se | uso de uma composição agroquímica e método para controlar vegetação indesejada |
EP2863749A1 (en) | 2012-03-01 | 2015-04-29 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with herbicidal action in rapeseed |
WO2013127843A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in sunflowers |
WO2013127768A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Syngenta Participations Ag | Pyridine carboxamide pesticides |
WO2013127855A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in cereals |
WO2013127820A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in rapeseed |
WO2013127821A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in rapeseed |
WO2013127848A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in corn |
EP2820012A1 (en) | 2012-03-02 | 2015-01-07 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal pyrazole derivatives |
WO2013127789A1 (en) | 2012-03-02 | 2013-09-06 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
US20150031541A1 (en) | 2012-03-02 | 2015-01-29 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
KR102056608B1 (ko) | 2012-03-12 | 2019-12-17 | 바스프 에스이 | 피리피로펜 살곤충제의 수성 현탁액 농축물 제형의 제조 방법 |
MX360700B (es) | 2012-03-12 | 2018-11-14 | Basf Se | Formulacion concentrada liquida que contiene un insecticida de piripiropeno ii. |
US9596843B2 (en) | 2012-03-12 | 2017-03-21 | Basf Se | Liquid concentrate formulation containing a pyripyropene insecticide I |
US9462809B2 (en) | 2012-03-13 | 2016-10-11 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
US20150031535A1 (en) | 2012-03-13 | 2015-01-29 | Basf Se | Liquid concentrate formulation containing a pyripyropene insecticide III |
WO2013135672A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
CA2865359A1 (en) | 2012-03-21 | 2013-09-26 | Basf Se | Glyphosate tank mix adjuvant comprising a base selected from a carbonate and/or a phosphate |
EA026261B1 (ru) | 2012-03-21 | 2017-03-31 | Басф Се | Жидкий или твердочастичный адъювант для баковой смеси, содержащий основание, выбранное из смеси карбоната и гидрокарбоната |
US20150051076A1 (en) | 2012-03-21 | 2015-02-19 | Basf Se | Solid particulate tank mix adjuvant comprising a base selected from a carbonate and/or a phosphate |
JP2015512379A (ja) | 2012-03-21 | 2015-04-27 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | アルキルポリグルコシド及び塩基を含むタンクミックスアジュバント |
EP2641901A1 (en) | 2012-03-22 | 2013-09-25 | Syngenta Participations AG. | Novel microbiocides |
WO2013144228A1 (en) | 2012-03-29 | 2013-10-03 | Basf Se | Pesticidal methods using heterocyclic compounds and derivatives for combating animal pests |
WO2013143927A1 (en) | 2012-03-29 | 2013-10-03 | Basf Se | Co-crystals of dicamba and a co-crystal former b |
ES2626360T3 (es) | 2012-03-30 | 2017-07-24 | Basf Se | Compuestos de piridinilideno tiocarbonilo N-sustituidos y su uso para combatir plagas de animales |
WO2013144223A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Basf Se | N-substituted pyrimidinylidene compounds and derivatives for combating animal pests |
US20150065343A1 (en) | 2012-04-02 | 2015-03-05 | Basf Se | Acrylamide compounds for combating invertebrate pests |
EP2647626A1 (en) | 2012-04-03 | 2013-10-09 | Syngenta Participations AG. | 1-Aza-spiro[4.5]dec-3-ene and 1,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-ene derivatives as pesticides |
WO2013149903A1 (en) | 2012-04-03 | 2013-10-10 | Basf Se | N- substituted hetero - bicyclic furanone derivatives for combating animal |
AU2013245040B2 (en) | 2012-04-05 | 2016-09-29 | Basf Se | Soluble liquid formulations of quinclorac ammonium salts |
WO2013150115A1 (en) | 2012-04-05 | 2013-10-10 | Basf Se | N- substituted hetero - bicyclic compounds and derivatives for combating animal pests |
EP2649879A1 (en) | 2012-04-10 | 2013-10-16 | Basf Se | Pesticidal mixtures containing fluxapyroxad |
WO2013156431A1 (en) | 2012-04-17 | 2013-10-24 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole and thiadiazole derivatives |
WO2013156433A1 (en) | 2012-04-17 | 2013-10-24 | Syngenta Participations Ag | Insecticidally active thiazole derivatives |
IN2014MN02211A (es) | 2012-04-27 | 2015-07-10 | Basf Se | |
US20150291570A1 (en) | 2012-04-27 | 2015-10-15 | Basf Se | Substituted N-(tetrazol-5-yl)- and N-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides |
JP2015519316A (ja) | 2012-04-27 | 2015-07-09 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 置換型n−(テトラゾール−5−イル)−およびn−(トリアゾール−5−イル)ヘタリールカルボキサミド化合物ならびに除草剤としてのそれらの使用 |
BR112014026789B1 (pt) | 2012-04-27 | 2019-10-22 | Basf Se | compostos n-(tetrazol-5-il) e n-(triazol-5-il)aril carboxamidas, composição, uso de um composto e método para controlar vegetação indesejada |
EP2659777A1 (en) | 2012-05-04 | 2013-11-06 | Syngenta Participations AG. | New use of a pesticide |
EA201401213A1 (ru) | 2012-05-04 | 2015-04-30 | Басф Се | Замещенные пиразолсодержащие соединения и их применение в качестве пестицидов |
BR112014027133A2 (pt) | 2012-05-09 | 2017-06-27 | Basf Se | compostos, composição agrícola ou veterinária, método para o controle das pragas de invertebrados, material de propagação dos vegetais e método para o tratamento ou proteção de um animal. |
WO2013167651A1 (en) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Syngenta Participations Ag | Crop enhancement |
CN104487439B (zh) | 2012-05-24 | 2017-06-09 | 巴斯夫欧洲公司 | N‑硫代邻氨基苯甲酰胺化合物及其作为杀害虫剂的用途 |
WO2013178585A1 (en) | 2012-06-01 | 2013-12-05 | Basf Se | Substituted pyridine compounds having herbicidal activity |
US9480259B2 (en) | 2012-06-06 | 2016-11-01 | Basf Se | Pyrazolopyrans having herbicidal and pharmaceutical properties |
EP2671881A1 (en) | 2012-06-07 | 2013-12-11 | Syngenta Participations AG. | Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole derivatives |
GB201210398D0 (en) | 2012-06-11 | 2012-07-25 | Syngenta Participations Ag | Crop enhancement |
WO2013186089A2 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-19 | Basf Se | Pesticidal methods using substituted 3-pyridyl thiazole compounds and derivatives for combating animal pests |
EP3646731A1 (en) | 2012-06-20 | 2020-05-06 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising a pyrazole compound |
CN104394692A (zh) | 2012-06-21 | 2015-03-04 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含麦草畏和漂移控制剂的含水组合物 |
WO2013189777A1 (en) | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Basf Se | Adjuvant comprising a 2-propylheptylamine alkoxylate, sugar-based surfactant, and drift-control agent and/or humectant |
JP2015521989A (ja) | 2012-07-03 | 2015-08-03 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | アニオン性殺有害生物剤及び塩基を含む高濃度水性製剤 |
EP2684879A1 (en) | 2012-07-09 | 2014-01-15 | Basf Se | Substituted mesoionic compounds for combating animal pests |
CN104411172A (zh) | 2012-07-09 | 2015-03-11 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含聚丙二醇和三嵌段聚合物的防漂移剂 |
WO2014009137A1 (en) | 2012-07-13 | 2014-01-16 | Basf Se | Substituted thiadiazoles and their use as fungicides |
WO2014009293A1 (en) | 2012-07-13 | 2014-01-16 | Basf Se | New substituted thiadiazoles and their use as fungicides |
WO2014023531A1 (en) | 2012-08-07 | 2014-02-13 | Syngenta Participations Ag | Trifluoromethylpyridine carboxamides as pesticides |
EP2700634A1 (en) | 2012-08-20 | 2014-02-26 | Basf Se | 5-difluoromethylpyrazole amides having herbicidal activity |
EP2700635A1 (en) | 2012-08-20 | 2014-02-26 | Basf Se | 5-Trifluoromethylpyrazole amides having herbicidal activity |
WO2014033241A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in rice |
WO2014033242A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | Basf Se | Use of an agrochemical composition with herbicidal action in rice |
BR112015005389B1 (pt) | 2012-09-13 | 2022-10-18 | Indiana University Research And Technology Corporation | Molécula de ácido nucleico recombinante, proteína de substrato modificada de uma protease específica de patógeno de planta expressa através do patógeno de planta, vetor, e método para proteger uma planta da infecção por um patógeno de planta que secreta pelo menos uma protease específica |
BR112015006299A2 (pt) | 2012-09-21 | 2017-07-04 | Basf Se | ''composto, composição agrícola, método para a proteção dos vegetais de cultura, método para a proteção do material de propagação dos vegetais e material de propagação'' |
WO2014053403A1 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Basf Se | Method of controlling insecticide resistant insects |
MX2015003719A (es) | 2012-10-01 | 2015-06-24 | Basf Se | Mezclas plaguicidas. |
JP2015532274A (ja) | 2012-10-01 | 2015-11-09 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 栽培植物へのn−チオ−アントラニルアミド化合物の使用 |
WO2014053406A1 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Basf Se | Method of controlling ryanodine-modulator insecticide resistant insects |
WO2014053407A1 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Basf Se | N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides |
WO2014053401A2 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Basf Se | Method of improving plant health |
AR094139A1 (es) | 2012-10-01 | 2015-07-15 | Basf Se | Mezclas activas como plaguicidas, que comprenden compuestos de antranilamida |
CN104768377A (zh) | 2012-10-01 | 2015-07-08 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含邻氨基苯甲酰胺类化合物的农药活性混合物 |
US20150257383A1 (en) | 2012-10-12 | 2015-09-17 | Basf Se | Method for combating phytopathogenic harmful microbes on cultivated plants or plant propagation material |
WO2014060177A1 (en) | 2012-10-16 | 2014-04-24 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
WO2014060176A1 (en) | 2012-10-16 | 2014-04-24 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
WO2014079841A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079766A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079820A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections |
WO2014079770A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079772A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079774A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
US20150313241A1 (en) | 2012-11-22 | 2015-11-05 | Basf Corporation | Pesticidal Mixtures |
CN104902756B (zh) | 2012-11-22 | 2018-11-27 | 巴斯夫公司 | 农药混合物 |
WO2014079728A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP2922395B1 (en) | 2012-11-22 | 2019-06-05 | BASF Corporation | Pesticidal mixtures |
WO2014079804A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079752A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014079813A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2014082881A1 (en) | 2012-11-27 | 2014-06-05 | Basf Se | Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides |
CN104955813A (zh) | 2012-11-27 | 2015-09-30 | 巴斯夫欧洲公司 | 取代的[1,2,4]三唑化合物 |
WO2014082871A1 (en) | 2012-11-27 | 2014-06-05 | Basf Se | Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides |
WO2014082879A1 (en) | 2012-11-27 | 2014-06-05 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
EP2738171A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-04 | Syngenta Participations AG. | Pesticidally active tricyclic pyridyl derivatives |
KR20150093750A (ko) | 2012-12-04 | 2015-08-18 | 바스프 에스이 | 신규 치환된 1,4-디티인 유도체 및 살진균제로서의 이들의 용도 |
JP2016501264A (ja) | 2012-12-14 | 2016-01-18 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 動物有害生物を防除するためのマロノニトリル化合物 |
EP2746266A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
CN105164111B (zh) | 2012-12-19 | 2018-11-20 | 巴斯夫欧洲公司 | 取代[1,2,4]三唑及其作为杀真菌剂的用途 |
EP2746264A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746262A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds for combating phytopathogenic fungi |
WO2014095534A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2746255A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746276A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2746274A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
EP2746277A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
EP2935237A1 (en) | 2012-12-19 | 2015-10-28 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds and their use as fungicides |
EP2746256A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
WO2014095547A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2745691A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted imidazole compounds and their use as fungicides |
EP2746263A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Alpha-substituted triazoles and imidazoles |
EP2746275A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2746279A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
WO2014095555A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2746278A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
WO2014095381A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
EA030875B1 (ru) | 2012-12-20 | 2018-10-31 | Басф Агро Б.В. | Композиции, содержащие триазольное соединение |
EP2746258A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
JP2016505585A (ja) | 2012-12-21 | 2016-02-25 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 無脊椎有害生物を防除するためのシクロクラビン及びその誘導体 |
EP2746260A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746257A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746259A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
US20150368236A1 (en) | 2012-12-27 | 2015-12-24 | Basf Se | 2-(pyridin-3-yl)-5-hetaryl-thiazole compounds carrying an imine or imine-derived substituent for combating invertebrate pests |
KR20150103249A (ko) | 2012-12-31 | 2015-09-09 | 바스프 에스이 | 코르넥시스틴을 포함하는 제초제 조성물 |
WO2014118099A1 (en) | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Basf Se | Fungicidal naphthoquinones and derivatives |
WO2014118142A1 (en) | 2013-02-01 | 2014-08-07 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
WO2014118143A1 (en) | 2013-02-04 | 2014-08-07 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
WO2014124850A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
WO2014128136A1 (en) | 2013-02-20 | 2014-08-28 | Basf Se | Anthranilamide compounds and their use as pesticides |
EP2964033A1 (en) | 2013-03-07 | 2016-01-13 | Basf Se | Co-crystals of pyrimethanil and selected dithiine tetracarboximide |
WO2014154530A1 (en) | 2013-03-25 | 2014-10-02 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal pyrazole derivatives |
WO2014154488A1 (en) | 2013-03-28 | 2014-10-02 | Syngenta Participations Ag | Methods of controlling neonicotinoid resistant pests |
EP2783569A1 (en) | 2013-03-28 | 2014-10-01 | Basf Se | Compositions comprising a triazole compound |
US20160050923A1 (en) | 2013-04-19 | 2016-02-25 | Basf Se | N-substituted acyl-imino-pyridine compounds and derivatives for combating animal pests |
EP2999712B1 (en) | 2013-04-30 | 2018-11-21 | Donald Danforth Plant Science Center | Antifungal plant proteins, peptides, and methods of use |
AU2014262638A1 (en) | 2013-05-10 | 2015-11-26 | Gilead Apollo, Llc | ACC inhibitors and uses thereof |
CA2911818A1 (en) | 2013-05-10 | 2014-11-13 | Nimbus Apollo, Inc. | Acc inhibitors and uses thereof |
WO2014184019A1 (en) | 2013-05-15 | 2014-11-20 | Basf Se | N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides |
WO2014184058A1 (en) | 2013-05-15 | 2014-11-20 | Basf Se | Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides |
WO2014184014A1 (en) | 2013-05-15 | 2014-11-20 | Basf Se | N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides |
BR112015028597A2 (pt) | 2013-05-15 | 2017-07-25 | Basf Se | n-(tetrazol-5-il)- e n-(5-triazol-il)arilcarboxamidas, composição, utilização de um composto e método para o controle da vegetação |
EP2999333B1 (en) | 2013-05-23 | 2018-06-13 | Syngenta Participations AG | Tank-mix formulations |
BR112015021600A2 (pt) | 2013-05-24 | 2017-07-18 | Basf Se | composto de piridina, composição e método para o controle da vegetação indesejável |
EP2813499A1 (en) | 2013-06-12 | 2014-12-17 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2815649A1 (en) | 2013-06-18 | 2014-12-24 | Basf Se | Fungicidal mixtures II comprising strobilurin-type fungicides |
EP2815647A1 (en) | 2013-06-18 | 2014-12-24 | Basf Se | Novel strobilurin-type compounds for combating phytopathogenic fungi |
US20160143279A1 (en) | 2013-06-26 | 2016-05-26 | Basf Se | Methods for Improving the Efficacy of Anionic Herbicides under Hard Water Conditions and Suitable Compositions |
EP3778598A3 (en) | 2013-07-02 | 2021-08-04 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active bi- or tricyclic heterocycles with sulfur containing substituents |
WO2015007451A1 (en) | 2013-07-15 | 2015-01-22 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal heterobicyclic derivatives |
AR097138A1 (es) | 2013-07-15 | 2016-02-24 | Basf Se | Compuestos plaguicidas |
CN105377836B (zh) | 2013-07-18 | 2018-04-10 | 巴斯夫欧洲公司 | 取代的n‑(1,2,4‑三唑‑3‑基)芳基羧酰胺化合物及其作为除草剂的用途 |
EP2835052A1 (en) | 2013-08-07 | 2015-02-11 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising pyrimidine fungicides |
AR097362A1 (es) | 2013-08-16 | 2016-03-09 | Cheminova As | Combinación de 2-metilbifenil-3-ilmetil (z)-(1r)-cis-3-(2-cloro-3,3,3-trifluorprop-1-enil)-2, 2-dimetilciclopropanocarboxilato con por lo menos un insecticida, acaricida, nematicida y/o fungicida |
EP2839745A1 (en) | 2013-08-21 | 2015-02-25 | Basf Se | Agrochemical formulations comprising a 2-ethyl-hexanol alkoxylate |
WO2015036059A1 (en) | 2013-09-16 | 2015-03-19 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
CA2923101A1 (en) | 2013-09-16 | 2015-03-19 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
CA2922506A1 (en) | 2013-09-19 | 2015-03-26 | Basf Se | N-acylimino heterocyclic compounds |
EP4154714A3 (en) | 2013-10-03 | 2023-07-26 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
CN105636950A (zh) | 2013-10-10 | 2016-06-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 取代的n-(四唑-5-基)-和n-(三唑-5-基)芳基羧酰胺化合物及其作为除草剂的用途 |
WO2015052178A1 (en) | 2013-10-10 | 2015-04-16 | Basf Se | 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides |
WO2015052173A1 (en) | 2013-10-10 | 2015-04-16 | Basf Se | Tetrazole and triazole compounds and their use as herbicides |
AR097995A1 (es) | 2013-10-14 | 2016-04-27 | Syngenta Participations Ag | Método para sembrar filas de cultivos |
WO2015055757A1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Basf Se | Use of pesticidal active carboxamide derivative in soil and seed application and treatment methods |
WO2015055764A1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Syngenta Participations Ag | 3-methanimidamid-pyridine derivatives as fungicides |
EP2868197A1 (en) | 2013-11-05 | 2015-05-06 | Basf Se | Herbicidal compositions |
EP2868196A1 (en) | 2013-11-05 | 2015-05-06 | Basf Se | Herbicidal compositions |
EP2873668A1 (en) | 2013-11-13 | 2015-05-20 | Syngenta Participations AG. | Pesticidally active bicyclic heterocycles with sulphur containing substituents |
AU2014351394B2 (en) | 2013-11-20 | 2018-07-26 | Adama Celsius B.V., Amsterdam (Nl), Schaffhausen Branch | Ready mix microemulsion formulation |
EP2881387A1 (en) | 2013-12-09 | 2015-06-10 | Basf Se | Pyrazolone compounds having herbicidal activity |
EP2881388A1 (en) | 2013-12-09 | 2015-06-10 | Basf Se | Pyrazolone compounds having herbicidal activity |
EP3080092B1 (en) | 2013-12-12 | 2019-02-06 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
US20160318897A1 (en) | 2013-12-18 | 2016-11-03 | Basf Se | Azole compounds carrying an imine-derived substituent |
EP3083581A1 (en) | 2013-12-18 | 2016-10-26 | Basf Se | N-substituted imino heterocyclic compounds |
US9706776B2 (en) | 2013-12-20 | 2017-07-18 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active substituted 5,5-bicyclic heterocycles with sulphur containing substituents |
WO2015097237A1 (en) | 2013-12-23 | 2015-07-02 | Syngenta Participations Ag | Benzoxaborole fungicides |
WO2015104422A1 (en) | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Basf Se | Dihydrothiophene compounds for controlling invertebrate pests |
AR100304A1 (es) | 2014-02-05 | 2016-09-28 | Basf Corp | Formulación de recubrimiento de semillas |
EP2907807A1 (en) | 2014-02-18 | 2015-08-19 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
PL3122732T3 (pl) | 2014-03-26 | 2018-08-31 | Basf Se | Podstawione związki [1,2,4]triazolowe i imidazolowe jako fungicydy |
EP2924027A1 (en) | 2014-03-28 | 2015-09-30 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole fungicidal compounds |
WO2015150541A1 (en) | 2014-04-03 | 2015-10-08 | Basf Se | Diaminotriazine compound useful as herbicide |
EP2930174A1 (en) | 2014-04-07 | 2015-10-14 | Basf Se | Diaminotriazine derivatives as herbicides |
CA2955955C (en) | 2014-04-17 | 2024-04-30 | Basf Se | Combination of (thio)phosphoric acid triamides and herbicides |
EA201692129A1 (ru) | 2014-04-23 | 2017-03-31 | Басф Се | Диаминотриазины в качестве гербицидов |
JP6616785B2 (ja) | 2014-05-19 | 2019-12-04 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄置換フェニル基またはピリジン基を有する殺虫的に活性なアミド誘導体 |
EP2949649A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-02 | Basf Se | Fungicide substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2949216A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-02 | Basf Se | Fungicidal substituted alkynyl [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
AR100743A1 (es) | 2014-06-06 | 2016-10-26 | Basf Se | Compuestos de [1,2,4]triazol sustituido |
EP2952507A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-09 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
EP2952512A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-09 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
EP3151669B1 (en) | 2014-06-06 | 2020-10-28 | Basf Se | Use of substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
EP2952506A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-09 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EA036537B1 (ru) | 2014-06-25 | 2020-11-20 | Басф Агро Б.В. | Пестицидные композиции |
EP2962567A1 (en) | 2014-07-01 | 2016-01-06 | Basf Se | Ternary mixtures comprising biopesticides and at least two chemical insecticides |
UA120058C2 (uk) | 2014-07-14 | 2019-09-25 | Басф Се | Пестицидні композиції |
EP2979549A1 (en) | 2014-07-31 | 2016-02-03 | Basf Se | Method for improving the health of a plant |
CN106535636B (zh) | 2014-07-31 | 2019-10-01 | 先正达参股股份有限公司 | 杀真菌组合物 |
WO2016016131A1 (en) | 2014-07-31 | 2016-02-04 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active cyclic enaminones |
BR112017002598B1 (pt) | 2014-08-12 | 2022-03-03 | Syngenta Participations Ag | Derivados heterocíclicos ativos do ponto de vista pesticida com substituintes contendo enxofre |
WO2016034615A1 (en) | 2014-09-02 | 2016-03-10 | BASF Agro B.V. | Aqueous insecticide formulation containing hyperbranched polymer |
WO2016071331A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Basf Se | Agrochemical adjuvant containing 2-oxo-1,3-dioxolan-4 carboxylates |
WO2016071168A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
AU2015346281B2 (en) | 2014-11-12 | 2021-12-02 | Nmc, Inc. | Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same |
EP3029025A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-08 | Basf Se | Method for combating soybean rust comprising treating soybean with (2e)-2-methoxyimino-2 [2 [[(e)-[(2e)-2-alkoxyimino-1-methyl-alk-3-enylidene]amino]oxymethyl]phenyl]-n-methyl-acetamides |
EP3028573A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-08 | Basf Se | Use of a triazole fungicide on transgenic plants |
EP3031325A1 (en) | 2014-12-10 | 2016-06-15 | Basf Se | Method for combating soybean rust comprising treating soybean with (2E)-2-[2-[[1-(2,4-substi-tuted-phenyl)pyrazol-3-yl]oxymeth¬yl]-3-sub¬stituted-phenyl]-2-methoxyimino-n-methyl-acet-amides |
JP6695879B2 (ja) | 2014-12-11 | 2020-05-20 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な四環式誘導体 |
WO2016091674A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Basf Se | Use of cyclaniliprole on cultivated plants |
WO2016091675A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Basf Se | Method for improving the health of a plant |
EP3047731A1 (en) | 2015-01-21 | 2016-07-27 | Basf Se | Method for combating soybean rust comprising treating soybean with (2E)-2-[3-substituted-2 [[(E)-[(2E)-2-alkoxyimino-1-methyl-2-phenyl-ethylidene]amino]oxymethyl]phenyl]-2-methoxy-imino-N-methyl-acetamides |
CN107205390A (zh) | 2015-01-29 | 2017-09-26 | 巴斯夫欧洲公司 | 除草的苯基吡啶类 |
EP3250034B1 (en) | 2015-01-30 | 2020-03-11 | Basf Se | Herbicidal phenylpyrimidines |
WO2016120182A1 (en) | 2015-01-30 | 2016-08-04 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active amide heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents |
AU2016214305B2 (en) | 2015-02-06 | 2020-10-08 | Basf Se | Pyrazole compounds as nitrification inhibitors |
EP3070079A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-21 | Basf Se | Herbicidal fluoromethanesulfonamides |
EP3070080A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-21 | Basf Se | Herbicidal fluoromethanesulfonamides |
EA033690B1 (ru) | 2015-03-27 | 2019-11-18 | Syngenta Participations Ag | Микробиоцидные гетеробициклические производные |
AU2016239537B2 (en) | 2015-03-31 | 2020-02-06 | Basf Se | Composition comprising a pesticide and isononanoic acid N,N-dimethyl amide |
CA2980505A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Basf Agrochemical Products B.V. | Use of an insecticidal carboxamide compound against pests on cultivated plants |
EP3656770A3 (en) | 2015-04-24 | 2020-09-09 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur substituted five-membered ring heterocycles |
BR112017022919A2 (pt) | 2015-04-24 | 2018-07-24 | Syngenta Participations Ag | derivados policíclicos com heterociclos de anéis com cinco membros substituídos por enxofre ativos em termos pesticidas. |
WO2016174042A1 (en) | 2015-04-27 | 2016-11-03 | BASF Agro B.V. | Pesticidal compositions |
AU2016260805A1 (en) | 2015-05-12 | 2017-11-23 | Basf Se | Thioether compounds as nitrification inhibitors |
EP3103798A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-14 | Basf Se | Herbicidal fluoromethanesulfonamides |
UA125170C2 (uk) | 2015-06-16 | 2022-01-26 | Басф Агрокемікал Продактс Б.В. | Спосіб боротьби з блішками сімейства chrysomelidae в культурах brassica |
EP3317276B1 (en) | 2015-07-01 | 2020-12-16 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2017001311A1 (en) | 2015-07-01 | 2017-01-05 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active tetracyclic derivatives with sulfur containing substituents |
PL3316692T3 (pl) | 2015-07-02 | 2021-10-11 | BASF Agro B.V. | Kompozycje owadobójcze zawierające związek triazolowy |
EP3111763A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-04 | BASF Agro B.V. | Pesticidal compositions comprising a triazole compound |
SI3319433T1 (sl) | 2015-07-10 | 2020-02-28 | BASF Agro B.V. | Herbicidni sestavek, ki obsega cinmetilin in inhibitorje sinteze lipidov ne-accaza specifične |
WO2017009142A1 (en) | 2015-07-10 | 2017-01-19 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific pigment synthesis inhibitors |
HUE044213T2 (hu) | 2015-07-10 | 2019-10-28 | Basf Agro Bv | Cinmetilint és petoxamidot tartalmazó herbicid készítmény |
WO2017009145A1 (en) | 2015-07-10 | 2017-01-19 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific inhibitors of protoporphyrinogen oxidase |
WO2017009054A1 (en) | 2015-07-10 | 2017-01-19 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and metazachlor |
JP6875368B2 (ja) | 2015-07-10 | 2021-05-26 | ビーエーエスエフ アグロ ベー.ブイ. | シンメチリン及びアセトクロール又はプレチラクロールを含む除草剤組成物 |
US10813356B2 (en) | 2015-07-10 | 2020-10-27 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and dimethenamid |
EA201890266A1 (ru) | 2015-07-10 | 2018-07-31 | Басф Агро Б.В. | Гербицидная композиция, содержащая цинметилин и пендиметалин |
EP3162209A1 (en) | 2015-10-27 | 2017-05-03 | BASF Agro B.V. | Herbicidal composition comprising cinmethylin and imazamox |
EA201890267A1 (ru) | 2015-07-10 | 2018-07-31 | Басф Агро Б.В. | Гербицидная композиция, содержащая метазахлор и хинолинкарбоновые кислоты |
BR112018002709B1 (pt) | 2015-08-12 | 2022-07-05 | Syngenta Participations Ag | Compostos, composição e método de combate, prevenção ou controle de doenças fitopatogênicas compreendendo o referido composto |
EP3135113A1 (en) | 2015-08-31 | 2017-03-01 | Basf Se | Use of herbicidal compositions for controlling unwanted vegetation |
EP3353160B1 (en) | 2015-09-25 | 2020-03-04 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents |
US10736320B2 (en) | 2015-09-25 | 2020-08-11 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active polycyclic derivatives with 5-membered sulfur containing heterocyclic ring systems |
EP3356343B1 (en) | 2015-09-28 | 2020-03-18 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents |
US20180279615A1 (en) | 2015-10-05 | 2018-10-04 | Basf Se | Pyridine derivatives for combating phytopathogenic fungi |
WO2017067839A1 (en) | 2015-10-23 | 2017-04-27 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal phenylamidine derivatives |
WO2017067837A1 (en) | 2015-10-23 | 2017-04-27 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal phenylamidine derivatives |
EP3371177A1 (en) | 2015-11-02 | 2018-09-12 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
EP3165094A1 (en) | 2015-11-03 | 2017-05-10 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
BR112018008288A2 (pt) | 2015-11-04 | 2018-10-30 | Basf Se | uso de compostos de fórmula, compostos de fórmula, mistura, composição agroquímica e método para combater fungos |
EP3165093A1 (en) | 2015-11-05 | 2017-05-10 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
WO2017080870A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
EP3167716A1 (en) | 2015-11-10 | 2017-05-17 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
CA3003794A1 (en) | 2015-11-12 | 2017-05-18 | Basf Se | Herbicidal compositions comprising isoxazolo[5,4-b]pyridines |
EP3373732A1 (en) | 2015-11-13 | 2018-09-19 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
WO2017081312A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
WO2017085100A1 (en) | 2015-11-19 | 2017-05-26 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
CA3003946A1 (en) | 2015-11-19 | 2017-05-26 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
JP2018537460A (ja) | 2015-11-23 | 2018-12-20 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄およびシクロプロピル含有置換基を有する有害生物防除的に活性な複素環式誘導体 |
ES2939977T3 (es) | 2015-11-25 | 2023-04-28 | Gilead Apollo Llc | Inhibidores de triazol ACC y usos de los mismos |
HUE053175T2 (hu) | 2015-11-25 | 2021-06-28 | Gilead Apollo Llc | ACC-gátló észterek és azok alkalmazása |
EP3380480B1 (en) | 2015-11-25 | 2022-12-14 | Gilead Apollo, LLC | Pyrazole acc inhibitors and uses thereof |
BR112018010140A8 (pt) | 2015-12-01 | 2019-02-26 | Basf Se | compostos de fórmula, composição, utilização de um composto de fórmula, método para o combate de fungos fitopatogênicos e semente |
CN108290840A (zh) | 2015-12-01 | 2018-07-17 | 巴斯夫欧洲公司 | 作为杀真菌剂的吡啶化合物 |
EP3389379B1 (en) | 2015-12-15 | 2021-01-20 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal phenylamidine derivatives |
CR20180370A (es) | 2015-12-17 | 2018-10-18 | Basf Se | Compuestos de benzamida y sus usos como herbicidas |
MX2018007527A (es) | 2015-12-22 | 2018-09-07 | Syngenta Participations Ag | Derivados de pirazol activos como pesticidas. |
EP3405030B1 (en) | 2016-01-22 | 2020-11-04 | Basf Se | Biodegradable polyester capsules comprising an aqueous core and a pesticide |
WO2017134066A1 (en) | 2016-02-05 | 2017-08-10 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents |
EP3202267A1 (en) | 2016-02-05 | 2017-08-09 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP3205209A1 (en) | 2016-02-09 | 2017-08-16 | Basf Se | Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or metabolites thereof and other biopesticides |
EP3205208A1 (en) | 2016-02-09 | 2017-08-16 | Basf Se | Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or fusaricidins and chemical pesticides |
JP6850300B2 (ja) | 2016-02-18 | 2021-03-31 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 殺有害生物活性ピラゾール誘導体 |
UY37137A (es) | 2016-02-24 | 2017-09-29 | Merial Inc | Compuestos antiparasitarios de isoxazolina, formulaciones inyectables de acción prolongada que los comprenden, métodos y usos de los mismos |
US20190098899A1 (en) | 2016-03-10 | 2019-04-04 | Basf Se | Fungicidal mixtures iii comprising strobilurin-type fungicides |
GEP20207183B (en) | 2016-03-10 | 2020-11-25 | Participations Ag Syngenta | Microbiocidal quinoline (thio) carboxamide derivatives |
JP2019513739A (ja) | 2016-04-07 | 2019-05-30 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体 |
WO2017178408A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal silicon containing aryl derivatives |
EP3245872A1 (en) | 2016-05-20 | 2017-11-22 | BASF Agro B.V. | Pesticidal compositions |
NZ747499A (en) | 2016-05-24 | 2023-01-27 | Basf Se | Herbicidal uracilpyridines |
WO2017207368A1 (en) | 2016-06-02 | 2017-12-07 | BASF Agro B.V. | Fungicidal compositions |
EP3462878B1 (en) | 2016-06-03 | 2020-05-13 | Basf Se | Benzoxaborole compounds |
EP3269246A1 (en) | 2016-07-13 | 2018-01-17 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
US20190246640A1 (en) | 2016-07-15 | 2019-08-15 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising a carboxamide |
AU2017298874A1 (en) | 2016-07-20 | 2019-01-03 | Basf Se | Herbicidal compositions comprising phenylpyrimidines |
CN109561685A (zh) | 2016-07-25 | 2019-04-02 | 巴斯夫欧洲公司 | 除草的嘧啶化合物 |
WO2018019552A1 (en) | 2016-07-25 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
WO2018019758A1 (en) | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
WO2018019755A1 (en) | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
BR112018077111A2 (pt) | 2016-07-26 | 2019-04-02 | Basf Se | uso de compostos de pirimidina, compostos de pirimidina, mistura herbicida, composições herbicidas, método para controlar vegetação indesejada e uso das composições |
WO2018019721A1 (en) | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
WO2018019767A1 (en) | 2016-07-27 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
WO2018019765A1 (en) | 2016-07-27 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
EP3275877A1 (en) | 2016-07-28 | 2018-01-31 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
EA201990342A1 (ru) | 2016-07-28 | 2019-08-30 | Басф Се | Гербицидные пиримидиновые соединения |
WO2018019770A1 (en) | 2016-07-28 | 2018-02-01 | Basf Se | Herbicidal pyridine compounds |
WO2018041729A2 (en) | 2016-09-01 | 2018-03-08 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents |
US20190208783A1 (en) | 2016-09-01 | 2019-07-11 | Basf Se | Fungicidal Mixtures Comprising a Formamidine |
WO2018050508A1 (en) | 2016-09-13 | 2018-03-22 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2018054711A1 (en) | 2016-09-26 | 2018-03-29 | Basf Se | Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi |
WO2018054721A1 (en) | 2016-09-26 | 2018-03-29 | Basf Se | Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi |
WO2018059997A1 (en) | 2016-09-27 | 2018-04-05 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2018065182A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Basf Se | Reduced quinoline compounds as antifuni agents |
US20190307127A1 (en) | 2016-10-10 | 2019-10-10 | Basf Se | Pesticidal Mixtures |
WO2018069110A1 (en) | 2016-10-10 | 2018-04-19 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2018069109A1 (en) | 2016-10-10 | 2018-04-19 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP3522709A1 (en) | 2016-10-10 | 2019-08-14 | Basf Se | Pesticidal mixture |
WO2018073110A1 (en) | 2016-10-20 | 2018-04-26 | Basf Se | Quinoline compounds as fungicides |
JP7077314B2 (ja) | 2016-10-27 | 2022-05-30 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄およびヒドロキシルアミン置換基を有する有害生物防除的に活性な複素環式誘導体 |
EP3541779B1 (en) | 2016-11-15 | 2020-12-23 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal phenylamidine derivatives |
WO2018091389A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents |
WO2018095795A1 (en) | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur containing substituents |
EP3544962B1 (en) | 2016-11-28 | 2021-07-28 | Basf Se | Diaminotriazine compounds |
EP3329777A1 (en) | 2016-11-30 | 2018-06-06 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
WO2018101824A1 (en) | 2016-11-30 | 2018-06-07 | Universiteit Van Amsterdam | Plants comprising pathogen effector constructs |
JP7282031B2 (ja) | 2016-12-01 | 2023-05-26 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体 |
WO2018108612A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Basf Se | Herbicidal compositions comprising isoxazolo[5,4-b]pyridines |
BR112019012127A2 (pt) | 2016-12-15 | 2019-11-05 | Syngenta Participations Ag | derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre |
EP3555050A1 (en) | 2016-12-16 | 2019-10-23 | Basf Se | Pesticidal compounds |
WO2018108695A1 (en) | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Basf Se | Herbicidal phenyltriazolinones |
WO2018116072A1 (en) | 2016-12-20 | 2018-06-28 | Pi Industries Ltd. | Heterocyclic compounds |
EP3339297A1 (en) | 2016-12-20 | 2018-06-27 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
EP3338552A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-27 | Basf Se | Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants |
EP3571190A1 (en) | 2017-01-23 | 2019-11-27 | Basf Se | Fungicidal pyridine compounds |
WO2018141575A1 (en) | 2017-02-01 | 2018-08-09 | Basf Se | Emulsifiable concentrate |
US20190380332A1 (en) | 2017-02-02 | 2019-12-19 | Basf Se | Enhancement of soil herbicide activity with anionic alkoxylated phenols |
WO2018149754A1 (en) | 2017-02-16 | 2018-08-23 | Basf Se | Pyridine compounds |
TWI793104B (zh) | 2017-02-21 | 2023-02-21 | 瑞士商先正達合夥公司 | 具有含硫取代基的殺有害生物活性雜環衍生物 |
US11388901B2 (en) | 2017-03-14 | 2022-07-19 | Basf Se | Herbicidal azines |
JP2020514380A (ja) | 2017-03-20 | 2020-05-21 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 殺微生物性キノリン(チオ)カルボキサミド誘導体 |
KR102596592B1 (ko) | 2017-03-28 | 2023-10-31 | 바스프 에스이 | 살충 화합물 |
BR112019020393A2 (pt) | 2017-03-31 | 2020-04-22 | Syngenta Participations Ag | derivados de fenilamidina microbicidas com propriedades melhoradas de proteção das plantas |
WO2018185191A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
US11472797B2 (en) | 2017-04-05 | 2022-10-18 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
EP3606917A1 (en) | 2017-04-05 | 2020-02-12 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active pyrazole derivatives |
US20200187500A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-06-18 | Basf Se | Pyridine compounds |
WO2018189001A1 (en) | 2017-04-13 | 2018-10-18 | Basf Se | Fungicide mixtures for use in rice |
US11109591B2 (en) | 2017-04-24 | 2021-09-07 | Taminco Bvba | Single phase liquids of alkanolamine salts of dicamba |
US20200216441A1 (en) | 2017-04-25 | 2020-07-09 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
JP7309615B2 (ja) | 2017-05-02 | 2023-07-18 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄含有置換基を有する有害生物防除に活性な複素環式誘導体 |
ES2914616T3 (es) | 2017-05-08 | 2022-06-14 | Syngenta Participations Ag | Derivados de imidazopirimidina con sustituyentes fenilo y piridilo que contienen azufre |
WO2018206419A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal heterobicyclic derivatives |
WO2018215304A1 (en) | 2017-05-22 | 2018-11-29 | Syngenta Participations Ag | Tetracyclic pyridazine sulphur containing compounds and their use as pesticides |
EP3412150A1 (en) | 2017-06-06 | 2018-12-12 | Basf Se | Mixtures of meptyldinocap with sdhi fungicides |
WO2018229041A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
JP7202371B2 (ja) | 2017-06-19 | 2023-01-11 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 殺有害生物的に活性なピラゾール誘導体 |
AR112112A1 (es) | 2017-06-20 | 2019-09-18 | Basf Se | Compuestos de benzamida y su uso como herbicidas |
AU2018287131B2 (en) | 2017-06-23 | 2023-10-12 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising a pyrazole compound |
BR112019027320B1 (pt) | 2017-07-05 | 2024-01-23 | BASF Agro B.V. | Misturas fungicidas, composição fungicida, métodos para controlar fungos fitopatogênicos prejudiciais, para melhorar a saúde de plantas, para a proteção de material de propagação de planta e semente revestida |
WO2019008072A1 (en) | 2017-07-05 | 2019-01-10 | Syngenta Participations Ag | HETEROCYCLIC DERIVATIVES HAVING PESTICIDE ACTIVITY HAVING SUBSTITUENTS CONTAINING SULFUR |
WO2019007717A1 (en) | 2017-07-06 | 2019-01-10 | Basf Se | PESTICIDE MIXTURES |
WO2019007719A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Basf Se | PESTICIDE MIXTURES |
EP3649128A1 (en) | 2017-07-07 | 2020-05-13 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
EP3427587A1 (en) | 2017-07-10 | 2019-01-16 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
CN110891923A (zh) | 2017-07-10 | 2020-03-17 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含脲酶抑制剂(ui)和硝化抑制剂如2-(3,4-二甲基-1h-吡唑-1-基)琥珀酸(dmpsa)或3,4-二甲基吡唑鎓乙醇酸盐(dmpg)的混合物 |
WO2019016385A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Basf Se | BENZAMIDE COMPOUNDS AND THEIR USE AS HERBICIDES |
WO2019020540A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Basf Se | PESTICIDE MIXTURES |
US20200288713A1 (en) | 2017-08-11 | 2020-09-17 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
AR112672A1 (es) | 2017-08-11 | 2019-11-27 | Syngenta Participations Ag | Derivados de tiofeno activos como plaguicidas |
US11252963B2 (en) | 2017-08-11 | 2022-02-22 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
AR112673A1 (es) | 2017-08-11 | 2019-11-27 | Syngenta Participations Ag | Derivados de pirazol activos como plaguicidas |
EP3447048A1 (en) | 2017-08-23 | 2019-02-27 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives |
EP3915379A1 (en) | 2017-08-29 | 2021-12-01 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
JP7150009B2 (ja) | 2017-09-13 | 2022-10-07 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 殺微生物性キノリン(チオ)カルボキサミド誘導体 |
BR112020004754A2 (pt) | 2017-09-13 | 2020-09-15 | Syngenta Participations Ag | derivados de (tio)carboxamida de quinolina microbiocidas |
BR112020004926A2 (pt) | 2017-09-13 | 2020-09-15 | Syngenta Participations Ag | derivados de quinolino(tio)carboxamida microbiocidas |
CN111164076A (zh) | 2017-09-13 | 2020-05-15 | 先正达参股股份有限公司 | 杀微生物的喹啉(硫代)甲酰胺衍生物 |
EP3681867B1 (en) | 2017-09-13 | 2021-08-11 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives |
ES2894762T3 (es) | 2017-09-13 | 2022-02-15 | Syngenta Participations Ag | Derivados de quinolina (tio)carboxamida microbiocidas |
JP7202367B2 (ja) | 2017-09-13 | 2023-01-11 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 殺微生物性キノリン(チオ)カルボキサミド誘導体 |
CN111108107B (zh) | 2017-09-18 | 2023-09-29 | 先正达参股股份有限公司 | 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物 |
WO2019057660A1 (en) | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Basf Se | INDOLE AND AZAINDOLE COMPOUNDS HAVING 6-CHANNEL SUBSTITUTED ARYL AND HETEROARYL CYCLES AS AGROCHEMICAL FUNGICIDES |
EP3692038A1 (en) | 2017-10-06 | 2020-08-12 | Syngenta Participations AG | Pesticidally active pyrrole derivatives |
WO2019068819A1 (en) | 2017-10-06 | 2019-04-11 | Syngenta Participations Ag | PYRROLE DERIVATIVES ACTIVE ON THE PESTICIDE PLAN |
WO2019076778A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Syngenta Participations Ag | HETEROCYCLIC DERIVATIVES HAVING PESTICIDAL ACTIVITY HAVING SUBSTITUENTS CONTAINING SULFUR AND SULFONIMIDAMIDES |
WO2019086474A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active mesoionics heterocyclic compounds |
CN111246738A (zh) | 2017-11-15 | 2020-06-05 | 巴斯夫欧洲公司 | 桶混物 |
EA202091234A1 (ru) | 2017-11-21 | 2020-10-05 | Зингента Партисипейшнс Аг | Фунгицидные композиции |
EP3713418B1 (en) | 2017-11-22 | 2021-08-04 | Basf Se | Benzoxaborole compounds |
CA3080292A1 (en) | 2017-11-23 | 2019-05-31 | Basf Se | Herbicidal phenylethers |
AU2018373436C1 (en) | 2017-11-23 | 2023-10-19 | Basf Se | Herbicidal pyridylethers |
WO2019105995A1 (en) | 2017-11-29 | 2019-06-06 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
WO2019106638A1 (en) | 2017-12-03 | 2019-06-06 | Seedx Technologies Inc. | Systems and methods for sorting of seeds |
EP3707640A1 (en) | 2017-12-03 | 2020-09-16 | Seedx Technologies Inc. | Systems and methods for sorting of seeds |
MX2020005759A (es) | 2017-12-04 | 2020-08-20 | Syngenta Participations Ag | Derivados de fenilamidina microbicidas. |
CN111511721A (zh) | 2017-12-13 | 2020-08-07 | 先正达参股股份有限公司 | 杀有害生物活性的介离子杂环化合物 |
WO2019121408A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
WO2019121352A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
WO2019121374A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
WO2019121373A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Herbicidal pyrimidine compounds |
CA3086453A1 (en) | 2017-12-20 | 2018-03-08 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for controlling harmful organisms in crops |
UA127604C2 (uk) | 2017-12-21 | 2023-11-01 | Басф Се | Пестицидні сполуки |
WO2019122345A1 (en) | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
WO2019122347A1 (en) | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Basf Se | N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)-benzamide compounds and their use as herbicides |
EP3508480A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-10 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
BR112020012706A2 (pt) | 2018-01-09 | 2020-11-24 | Basf Se | uso de um composto de silietinil hetarila, composição para uso na redução de nitrificação, mistura agroquímica, métodos para reduzir a nitrificação e para tratamento de um fertilizante ou de uma composição |
JP7337810B2 (ja) | 2018-01-15 | 2023-09-04 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体 |
WO2019141552A1 (en) | 2018-01-18 | 2019-07-25 | Basf Se | Herbicidal triazine compounds |
EP3746439A2 (en) | 2018-01-30 | 2020-12-09 | PI Industries Ltd. | Oxadiazoles for use in controlling phytopathogenic fungi |
WO2019162308A1 (en) | 2018-02-21 | 2019-08-29 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
WO2019162309A1 (en) | 2018-02-21 | 2019-08-29 | Basf Se | Benzamide compounds and their use as herbicides |
EP3530118A1 (en) | 2018-02-26 | 2019-08-28 | Basf Se | Fungicidal mixtures |
EP3530116A1 (en) | 2018-02-27 | 2019-08-28 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising xemium |
IL276745B2 (en) | 2018-02-28 | 2023-10-01 | Basf Se | Use of N-functional alkoxy pyrazole compounds as nitrification inhibitors |
WO2019166561A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Basf Se | Use of alkoxypyrazoles as nitrification inhibitors |
EP3758491A1 (en) | 2018-02-28 | 2021-01-06 | Basf Se | Use of pyrazole propargyl ethers as nitrification inhibitors |
WO2019166252A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising fenpropidin |
EP3533333A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-04 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising pydiflumetofen |
EP3533331A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-04 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising pydiflumetofen |
EP3536150A1 (en) | 2018-03-06 | 2019-09-11 | Basf Se | Fungicidal mixtures comprising fluxapyroxad |
WO2019171234A1 (en) | 2018-03-09 | 2019-09-12 | Pi Industries Ltd. | Heterocyclic compounds as fungicides |
EP3539384A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-18 | Basf Se | 3-components mixtures comprising fluxapyroxad |
CN112087951A (zh) | 2018-05-08 | 2020-12-15 | 先正达农作物保护股份公司 | 施用某一种或多种杂芳基-1,2,4-三唑和杂芳基-四唑化合物来控制对植物、其繁殖材料和植物衍生产品的损害的方法 |
EP3793360A4 (en) | 2018-05-16 | 2022-02-16 | University of Florida Research Foundation | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SUBSTITUTED 2,5-DICETOPIPERAZINE ANALOGS |
WO2019219689A1 (en) | 2018-05-18 | 2019-11-21 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents |
WO2019229088A1 (en) | 2018-05-30 | 2019-12-05 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2019229089A1 (en) | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
AR115495A1 (es) | 2018-06-06 | 2021-01-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos con sustituyentes que contienen azufre activos como plaguicidas |
CN112262140B (zh) | 2018-06-06 | 2024-05-28 | 先正达农作物保护股份公司 | 具有含亚砜亚胺取代基的杀有害生物活性杂环衍生物 |
WO2020002472A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Basf Se | Use of alkynylthiophenes as nitrification inhibitors |
UY38281A (es) | 2018-06-29 | 2020-01-31 | Syngenta Participations Ag | Compuestos de azol-amida pesticidamente activos |
WO2020007646A1 (en) | 2018-07-02 | 2020-01-09 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
PL3817553T3 (pl) | 2018-07-02 | 2022-12-19 | Basf Se | Mieszaniny szkodnikobójcze |
WO2020011808A1 (en) | 2018-07-13 | 2020-01-16 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds |
ES2969872T3 (es) | 2018-07-23 | 2024-05-23 | Basf Se | Uso de un compuesto de tiazolidina sustituida como inhibidor de la nitrificación |
WO2020020777A1 (en) | 2018-07-23 | 2020-01-30 | Basf Se | Use of substituted 2-thiazolines as nitrification inhibitors |
WO2020025658A1 (en) | 2018-08-03 | 2020-02-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds |
US20210238176A1 (en) | 2018-08-07 | 2021-08-05 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds |
US20210251232A1 (en) | 2018-08-08 | 2021-08-19 | Basf Se | Use of fungicidal active compound i derivative and mixtures thereof in seed application and treatment methods |
WO2020030754A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds |
WO2020035565A1 (en) | 2018-08-17 | 2020-02-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds |
EP3843548A1 (en) | 2018-08-27 | 2021-07-07 | Basf Se | Aqueous compositions of topramezone |
TW202019901A (zh) | 2018-09-13 | 2020-06-01 | 瑞士商先正達合夥公司 | 殺有害生物活性唑-醯胺化合物 |
TW202023386A (zh) | 2018-09-13 | 2020-07-01 | 瑞士商先正達合夥公司 | 殺有害生物活性唑-醯胺化合物 |
EA202190805A1 (ru) | 2018-09-18 | 2021-06-23 | Басф Се | Диаминотриазиновые соединения |
EP3853207B1 (en) | 2018-09-19 | 2022-10-19 | Syngenta Crop Protection AG | Microbiocidal quinoline carboxamide derivatives |
WO2020058010A1 (en) | 2018-09-19 | 2020-03-26 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising a mesoionic compound |
CA3112042A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Basf Se | Method of controlling pests by seed treatment application of a mesoionic compound or mixture thereof |
EP3860992A1 (en) | 2018-10-01 | 2021-08-11 | PI Industries Ltd. | Novel oxadiazoles |
WO2020070611A1 (en) | 2018-10-01 | 2020-04-09 | Pi Industries Ltd | Oxadiazoles as fungicides |
ES2958917T3 (es) | 2018-10-02 | 2024-02-16 | Syngenta Participations Ag | Compuestos de benceno-amida y azina-amida con actividad plaguicida |
JP7459073B2 (ja) | 2018-10-03 | 2024-04-01 | ベーアーエスエフ・エスエー | トプラメゾンのマイクロエマルション組成物 |
WO2020070132A1 (en) | 2018-10-06 | 2020-04-09 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives |
WO2020070131A1 (en) | 2018-10-06 | 2020-04-09 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives |
BR112021006011A2 (pt) | 2018-10-19 | 2021-06-29 | Basf Se | misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para controlar pragas fitopatogênicas |
WO2020078794A1 (en) | 2018-10-19 | 2020-04-23 | Basf Se | Ternary mixtures containing fenpropimorph, azoles and a multiside fungicide |
WO2020078797A1 (en) | 2018-10-19 | 2020-04-23 | Basf Se | Ternary mixtures containing fenpropimorph, succinate dehydrogenase inhibitors and one other compound |
JP2022505376A (ja) | 2018-10-19 | 2022-01-14 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | 殺有害生物活性アゾール-アミド化合物 |
EP3643705A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Pesticidal compounds |
TW202035404A (zh) | 2018-10-24 | 2020-10-01 | 瑞士商先正達農作物保護公司 | 具有含亞碸亞胺的取代基之殺有害生物活性雜環衍生物 |
EP3643175A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Ternary pesticidal mixtures containing metyltetraprole and fenpropimorph |
CA3117465A1 (en) | 2018-11-02 | 2020-05-07 | Nihon Nohyaku Co., Ltd. | Harmful organism control composition and method for using the same |
EP3877380A1 (en) | 2018-11-05 | 2021-09-15 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active azole-amide compounds |
EP3887357A1 (en) | 2018-11-28 | 2021-10-06 | Basf Se | Pesticidal compounds |
AR117291A1 (es) | 2018-12-14 | 2021-07-28 | Syngenta Crop Protection Ag | Compuestos heterocíclicos de cianamida con actividad pesticida |
WO2020120694A1 (en) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds |
EA202191654A1 (ru) | 2018-12-18 | 2021-11-01 | Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. | Гербицидные комбинации |
EP3897138A1 (en) | 2018-12-18 | 2021-10-27 | BASF Agrochemical Products B.V. | Herbicidal combinations |
EA202191652A1 (ru) | 2018-12-18 | 2022-03-11 | Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. | Гербицидные комбинации |
WO2020126578A1 (en) | 2018-12-18 | 2020-06-25 | Basf Agrochemical Products B.V. | Herbicidal combinations |
EP3897151A1 (en) | 2018-12-18 | 2021-10-27 | BASF Agrochemical Products B.V. | Herbicidal composition |
EA202191655A1 (ru) | 2018-12-18 | 2021-11-01 | Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. | Гербицидные комбинации |
GB201821036D0 (en) | 2018-12-21 | 2019-02-06 | Syngenta Participations Ag | Nematicidal compositions |
WO2020127345A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Syngenta Participations Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
WO2020141135A1 (en) | 2018-12-31 | 2020-07-09 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
BR112021012991A2 (pt) | 2018-12-31 | 2021-09-14 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos pesticidamente ativos com substituintes contendo enxofre |
EP3680223A1 (en) | 2019-01-10 | 2020-07-15 | Basf Se | Mixture comprising an urease inhibitor (ui) and a nitrification inhibitor (ni) such as an ni mixture comprising 2-(3,4-dimethyl-1h-pyrazol-1-yl)succinic acid (dmpsa) and dicyandiamide (dcd) |
WO2020164994A1 (en) | 2019-02-13 | 2020-08-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
WO2020164993A1 (en) | 2019-02-13 | 2020-08-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active pyrazole derivatives |
WO2020169526A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-08-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active cyanamide heterocyclic compounds |
EP3696175A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-08-19 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active azole-amide compounds |
EP3698632A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-26 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP3698634A1 (en) | 2019-02-25 | 2020-08-26 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP3698633A1 (en) | 2019-02-25 | 2020-08-26 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
TW202100015A (zh) | 2019-02-28 | 2021-01-01 | 瑞士商先正達農作物保護公司 | 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物 |
TW202045011A (zh) | 2019-02-28 | 2020-12-16 | 瑞士商先正達農作物保護公司 | 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物 |
WO2020182577A1 (en) | 2019-03-08 | 2020-09-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
BR112021017646A2 (pt) | 2019-03-08 | 2021-11-16 | Syngenta Crop Protection Ag | Compostos de azol-amida ativos em termos pesticidas |
BR112021018501A2 (pt) | 2019-03-20 | 2021-11-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Compostos de azolamida ativos em termos pesticidas |
US20220306599A1 (en) | 2019-03-20 | 2022-09-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active azole amide compounds |
US20220213063A1 (en) | 2019-03-22 | 2022-07-07 | Syngenta Crop Protection Ag | N-[l-(5-BROMO-2-PYRIMIDIN-2-YL-1,2,4-TRIAZOL-3-YL)ETHYL]-2-CYCLOPROPYL-6-(TRIFLUOROMETHYL)PYRIDINE-4-CARBOXAMIDE DERIVATIVES AND RELATED COMPOUNDS AS INSECTICIDES |
TW202102489A (zh) | 2019-03-29 | 2021-01-16 | 瑞士商先正達農作物保護公司 | 殺有害生物活性之二𠯤-醯胺化合物 |
KR20210145788A (ko) | 2019-04-01 | 2021-12-02 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 피리다지논 화합물 및 제초제 |
MA55500A (fr) | 2019-04-05 | 2022-02-09 | Syngenta Crop Protection Ag | Composés de diazine-amide à action pesticide |
BR112021020231A2 (pt) | 2019-04-08 | 2021-12-07 | Pi Industries Ltd | Compostos de oxadiazol inovadores para controlar ou prevenir fungos fitopatogênicos |
WO2020208509A1 (en) | 2019-04-08 | 2020-10-15 | Pi Industries Limited | Novel oxadiazole compounds for controlling or preventing phytopathogenic fungi |
CN113784958B (zh) | 2019-04-08 | 2024-04-30 | Pi工业有限公司 | 用于控制或预防植物病原性真菌的噁二唑化合物 |
JP2022528181A (ja) | 2019-04-11 | 2022-06-08 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物的に有効なジアジン-アミド化合物 |
EP3730489A1 (en) | 2019-04-25 | 2020-10-28 | Basf Se | Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides |
EP3744174A1 (en) | 2019-05-27 | 2020-12-02 | Basf Se | Use of metyltetraprol and mixtures of metyltetraprol for combating phytopathogenic fungi on cotton |
WO2020254530A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Syngenta Crop Protection Ag | 7-sulfonyl-n-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)-quinoxaline-6-carboxamide derivatives and the respective -benzimidazole-5-, -imidazo[4,5-b]pyridine-5-, -3h-furo[3,2b]pyridine-5-, -quinoline-2-, and -naphthalene-2-carboxamide derivatives as pesticides |
WO2021009311A1 (en) | 2019-07-17 | 2021-01-21 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
EP3766879A1 (en) | 2019-07-19 | 2021-01-20 | Basf Se | Pesticidal pyrazole derivatives |
AR119774A1 (es) | 2019-08-19 | 2022-01-12 | Pi Industries Ltd | Compuestos de oxadiazol que contienen un anillo heteroaromático de 5 miembros para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos |
JP2022545266A (ja) | 2019-08-23 | 2022-10-26 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物的に活性なピラジン-アミド化合物 |
WO2021043642A1 (en) | 2019-09-03 | 2021-03-11 | Basf Se | Polymers for spray drift control of pesticide spray |
UY38885A (es) | 2019-09-20 | 2021-04-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Compuestos de azetidinil-, pirrolidinil-,piperdinil- o piperazinil-piridinil carbonilo pesticidamente activos |
CN114450280A (zh) | 2019-09-20 | 2022-05-06 | 先正达农作物保护股份公司 | 具有含硫和亚砜亚胺取代基的杀有害生物活性杂环衍生物 |
WO2021083936A1 (en) | 2019-11-01 | 2021-05-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds |
AR120374A1 (es) | 2019-11-08 | 2022-02-09 | Pi Industries Ltd | Compuestos de oxadiazol que contienen anillos de heterociclilo fusionados para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos |
CA3152433A1 (en) | 2019-11-15 | 2021-05-20 | Claude Taranta | Methods of using a composition comprising an anionic pesticide and a buffer |
WO2021110891A1 (en) | 2019-12-04 | 2021-06-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic amino compounds |
WO2021122645A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active azole-amide compounds |
CA3162521A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-07-01 | Basf Se | Enzyme enhanced root uptake of agrochemical active compound |
BR112022012873A2 (pt) | 2019-12-31 | 2022-09-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre |
TW202132300A (zh) | 2020-01-06 | 2021-09-01 | 瑞士商先正達農作物保護公司 | 具有含硫取代基的殺有害生物活性雜環衍生物 |
WO2021144354A1 (en) | 2020-01-15 | 2021-07-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds |
US20230063109A1 (en) | 2020-01-16 | 2023-03-02 | Basf Se | Mixtures comprising nitrification inhibitors and carriers |
CA3164114A1 (en) | 2020-01-16 | 2021-07-22 | Gregor Pasda | Mixtures comprising a solid carrier comprising an urease inhibitor and a further solid carrier comprising a nitrification inhibitor |
WO2021148330A1 (en) | 2020-01-20 | 2021-07-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Method for reducing insect-vectored virus infections in grass plants |
GB202000994D0 (en) | 2020-01-23 | 2020-03-11 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
JP2023511201A (ja) | 2020-01-24 | 2023-03-16 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物的に活性な縮合二環式芳香族複素環式化合物 |
WO2021151926A1 (en) | 2020-01-30 | 2021-08-05 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic amino compounds |
JP2023513575A (ja) | 2020-02-11 | 2023-03-31 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物的に活性な環状アミン化合物 |
EP4110766A1 (en) | 2020-02-27 | 2023-01-04 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active diazine-bisamide compounds |
BR112022017236A2 (pt) | 2020-02-27 | 2022-10-11 | Syngenta Crop Protection Ag | Composições fungicidas |
WO2021175822A1 (en) | 2020-03-02 | 2021-09-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally amidine-substituted benzoic acid amide compounds |
EP4117435A1 (en) | 2020-03-13 | 2023-01-18 | Syngenta Crop Protection AG | Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola |
US20230112306A1 (en) | 2020-03-13 | 2023-04-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Methods of controlling or preventing infestation of soybean plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola |
CN115334885A (zh) | 2020-03-13 | 2022-11-11 | 先正达农作物保护股份公司 | 控制或预防植物被植物病原性微生物多主棒孢菌、大豆灰斑病菌和/或大豆紫斑病菌侵染的方法 |
BR112022018269A2 (pt) | 2020-03-13 | 2022-12-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Métodos de controle ou prevenção de infestação de plantas pelo microrganismo fitopatogênico corynespora cassiicola |
US20230111656A1 (en) | 2020-03-13 | 2023-04-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Methods of controlling or preventing infestation of soybean plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola |
EP4117438A1 (en) | 2020-03-13 | 2023-01-18 | Syngenta Crop Protection AG | Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola |
BR112022019582A2 (pt) | 2020-04-01 | 2022-11-16 | Basf Se | Misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para controlar pragas fitopatogênicas |
WO2021197884A1 (en) | 2020-04-01 | 2021-10-07 | Basf Se | Ternary mixtures containing fenpropimorph, succinate dehydrogenase inhibitors and strobilurins |
US20230157284A1 (en) | 2020-04-06 | 2023-05-25 | Basf Se | High-load solution concentrates of dicamba |
BR112022020239A2 (pt) | 2020-04-08 | 2022-11-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de quinolina di-hidro-(tiazina)oxazina microbiocidas |
AR121734A1 (es) | 2020-04-08 | 2022-07-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados microbicidas de tipo dihidropirrolopirazina de quinolina |
AR121733A1 (es) | 2020-04-08 | 2022-07-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados microbiocidas de tipo dihidro-(tiazina)oxazina de quinolina |
WO2021213929A1 (en) | 2020-04-20 | 2021-10-28 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active substituted 1,3-dihydro-2h-imidazo[4,5-c]pyridin-2-one derivatives with sulfur containing substituents |
EP4143167B1 (en) | 2020-04-28 | 2024-05-15 | Basf Se | Pesticidal compounds |
CN115702149A (zh) | 2020-04-30 | 2023-02-14 | 先正达农作物保护股份公司 | 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物 |
CN115484823A (zh) | 2020-05-04 | 2022-12-16 | 先正达农作物保护股份公司 | 杀真菌组合物 |
WO2021224409A1 (en) | 2020-05-06 | 2021-11-11 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
AR122484A1 (es) | 2020-06-04 | 2022-09-14 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
AR122189A1 (es) | 2020-06-04 | 2022-08-24 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
AR122485A1 (es) | 2020-06-04 | 2022-09-14 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
AR122199A1 (es) | 2020-06-04 | 2022-08-24 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
AR122187A1 (es) | 2020-06-04 | 2022-08-24 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
CN115697055A (zh) | 2020-06-04 | 2023-02-03 | 先正达农作物保护股份公司 | 杀真菌组合物 |
WO2021254875A1 (en) | 2020-06-15 | 2021-12-23 | Basf Se | A stable, solvent-free, self-emulsifiable concentrate |
CN116234444A (zh) | 2020-07-06 | 2023-06-06 | 皮埃企业有限公司 | 包含硫杂环丁烷氧基化合物、其氧化物或其盐的具有杀虫活性的混合物 |
WO2022013417A1 (en) | 2020-07-17 | 2022-01-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2022017975A1 (en) | 2020-07-18 | 2022-01-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
TW202220557A (zh) | 2020-07-27 | 2022-06-01 | 印度商皮埃企業有限公司 | 包含吡唑並吡啶鄰氨基苯甲酰胺化合物、其氧化物或鹽的農藥活性混合物 |
AR123264A1 (es) | 2020-08-18 | 2022-11-16 | Pi Industries Ltd | Nuevos compuestos heterocíclicos para combatir los hongos fitopatógenos |
CA3189161A1 (en) | 2020-08-31 | 2022-03-03 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
BR112023003835A2 (pt) | 2020-09-01 | 2023-04-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados heterocíclicos com substituintes contendo enxofre ativos em termos pesticidas |
EP4208447A1 (en) | 2020-09-02 | 2023-07-12 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
US20230303565A1 (en) | 2020-09-02 | 2023-09-28 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
UY39411A (es) | 2020-09-09 | 2022-04-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de indazolil pirazolo[3,4-c] piridina pesticídicamente activos con sustituyentes que contienen azufre |
UY39424A (es) | 2020-09-15 | 2022-03-31 | Pi Industries Ltd | Nuevos compuestos de picolinamida para combatir hongos fitopatógenos |
AR123501A1 (es) | 2020-09-15 | 2022-12-07 | Pi Industries Ltd | Nuevos compuestos de picolinamida para combatir hongos fitopatógenos |
BR112023006280A2 (pt) | 2020-10-05 | 2023-05-09 | Syngenta Crop Protection Ag | Composições fungicidas |
EP4225034A1 (en) | 2020-10-08 | 2023-08-16 | Basf Se | Mixtures containing cyclobutrifluram |
UY39505A (es) | 2020-11-09 | 2022-06-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones de mezcla fungicida que comprenden un compuesto derivado de la picolinamida como ingrediente activo |
WO2022101265A1 (en) | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds |
US20240016150A1 (en) | 2020-12-01 | 2024-01-18 | Basf Se | Mixtures containing metarylpicoxamid |
WO2022128554A1 (en) | 2020-12-15 | 2022-06-23 | Basf Se | Mixtures containing n-methoxy-n-[[4-[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]phenyl]methyl]cyclopropanecarboxamide |
EP4263579A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-10-25 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidal hexatoxin polypeptides and methods of use thereof |
MX2023007406A (es) | 2020-12-21 | 2023-06-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones que comprenden ciclotidos y otros peptidos insecticidas y usos de las mismas. |
EP4018830A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-29 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
EP4281450A1 (en) | 2021-01-21 | 2023-11-29 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
JP2024506253A (ja) | 2021-01-23 | 2024-02-13 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物的に有効な芳香族複素環式化合物 |
KR20230137954A (ko) | 2021-01-27 | 2023-10-05 | 바스프 에스이 | 디아미노트리아진 화합물 |
MX2023008792A (es) | 2021-01-27 | 2023-10-06 | Basf Se | Compuestos de diaminotriazina. |
AR124796A1 (es) | 2021-02-02 | 2023-05-03 | Basf Se | Acción sinérgica de dcd y alcoxipirazoles como inhibidores de la nitrificación |
WO2022171709A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-18 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
JP2024507216A (ja) | 2021-02-19 | 2024-02-16 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 昆虫及びダニ目有害生物の防除 |
US20240138409A1 (en) | 2021-02-19 | 2024-05-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect and acarina pest control |
CN114958832B (zh) * | 2021-02-25 | 2024-05-24 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种同步改良棉花纤维长度和强度性状的分子育种方法 |
WO2022180096A1 (en) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidal compositions |
AR124935A1 (es) | 2021-03-01 | 2023-05-24 | Syngenta Crop Protection Ag | Formulaciones plaguicidas |
WO2022200364A1 (en) | 2021-03-25 | 2022-09-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
JP2024512694A (ja) | 2021-03-30 | 2024-03-19 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物的に活性な環状アミン化合物 |
EP4066643A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-05 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
UY39696A (es) | 2021-03-31 | 2022-10-31 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados microbiocidas de quinolin/quinoxalin-benzotiazina como agentes fungicidas, en particular c |
AR125342A1 (es) | 2021-04-16 | 2023-07-05 | Syngenta Crop Protection Ag | Compuestos de amina cíclica activos como plaguicidas |
AU2022260028A1 (en) | 2021-04-20 | 2023-10-12 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal quinoline/quinoxaline isoquinoline derivatives |
TW202309047A (zh) | 2021-05-05 | 2023-03-01 | 印度商皮埃企業有限公司 | 用以防治植物病原真菌的新穎稠合雜環化合物 |
WO2022238575A1 (en) | 2021-05-14 | 2022-11-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
CN117320551A (zh) | 2021-05-14 | 2023-12-29 | 先正达农作物保护股份公司 | 种子处理组合物 |
AR125955A1 (es) | 2021-05-21 | 2023-08-30 | Basf Se | Uso de un compuesto de alcoxi pirazol n-funcionalizado como inhibidor de nitrificación |
WO2022243521A1 (en) | 2021-05-21 | 2022-11-24 | Basf Se | Use of ethynylpyridine compounds as nitrification inhibitors |
EP4094579A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-11-30 | Basf Se | Pesticidal mixtures comprising metyltetraprole |
CA3221102A1 (en) | 2021-06-02 | 2022-12-08 | Michel Muehlebach | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents |
EP4352050A1 (en) | 2021-06-09 | 2024-04-17 | Syngenta Crop Protection AG | Pesticidally active diazine-amide compounds |
WO2022268810A1 (en) | 2021-06-21 | 2022-12-29 | Basf Se | Metal-organic frameworks with pyrazole-based building blocks |
WO2022268815A1 (en) | 2021-06-24 | 2022-12-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2022268648A1 (en) | 2021-06-24 | 2022-12-29 | Syngenta Crop Protection Ag | 2-[3-[1 [(quinazolin-4-yl)amino]ethyl]pyrazin-2-yl]thiazole-5-carbonitrile derivatives and similar compounds as pesticides |
WO2022268813A1 (en) | 2021-06-24 | 2022-12-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023280999A1 (en) | 2021-07-07 | 2023-01-12 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
EP4376616A1 (en) | 2021-07-27 | 2024-06-05 | Syngenta Crop Protection AG | Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor |
AU2022318251A1 (en) | 2021-07-29 | 2024-01-25 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds |
EP4380363A1 (en) | 2021-08-05 | 2024-06-12 | Syngenta Crop Protection AG | Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor |
CN117836301A (zh) | 2021-08-10 | 2024-04-05 | 先正达农作物保护股份公司 | 作为杀有害生物剂的2,2-二氟-5h-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-f]异吲哚-7-酮衍生物 |
WO2023017155A1 (en) | 2021-08-13 | 2023-02-16 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
EP4387449A1 (en) | 2021-08-19 | 2024-06-26 | Syngenta Crop Protection AG | Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor |
AR127103A1 (es) | 2021-09-22 | 2023-12-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
WO2023046853A1 (en) | 2021-09-23 | 2023-03-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
IL312020A (en) | 2021-10-14 | 2024-06-01 | Syngenta Crop Protection Ag | IMIDAZO[1,2-A]PYRIDINE DERIVATIVES |
WO2023072945A1 (en) | 2021-10-25 | 2023-05-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2023072849A1 (en) | 2021-10-27 | 2023-05-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active pyridazinone compounds |
AR127682A1 (es) | 2021-11-19 | 2024-02-21 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas de aureobasidina |
AR127767A1 (es) | 2021-11-26 | 2024-02-28 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas |
WO2023105064A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023105065A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023104714A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active pyridazinone compounds |
WO2023110710A1 (en) | 2021-12-13 | 2023-06-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor |
EP4197333A1 (en) | 2021-12-15 | 2023-06-21 | Syngenta Crop Protection AG | Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor |
EP4198023A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-21 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
AR127972A1 (es) | 2021-12-17 | 2024-03-13 | Pi Industries Ltd | Novedosos compuestos de piridina carboxamida bicíclica sustituida fusionada para combatir hongos fitopatogénicos |
WO2023111215A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal pyridine-substituted benzothiazine derivatives |
WO2023148037A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests in vegetables |
WO2023148343A1 (en) | 2022-02-04 | 2023-08-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
WO2023148368A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2023148369A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2023152340A1 (en) | 2022-02-10 | 2023-08-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023156402A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
WO2023187191A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2023203038A1 (en) | 2022-04-19 | 2023-10-26 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
WO2023203066A1 (en) | 2022-04-21 | 2023-10-26 | Basf Se | Synergistic action as nitrification inhibitors of dcd oligomers with alkoxypyrazole and its oligomers |
WO2023209045A1 (en) | 2022-04-26 | 2023-11-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Enantiomerically enriched fungicides for the control of resistant phytopathogenic fungi |
WO2023217989A1 (en) | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Syngenta Crop Protection Ag | Alkoxy heteroaryl- carboxamide or thioamide compounds |
WO2023247360A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds |
WO2024013106A1 (en) | 2022-07-11 | 2024-01-18 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
WO2024022910A1 (en) | 2022-07-26 | 2024-02-01 | Syngenta Crop Protection Ag | 1-[1-[2-(pyrimidin-4-yl)-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-3-[2,4-dichloro-5-phenyl]urea derivatives and similar compounds as pesticides |
WO2024028243A1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Basf Se | Pyrazolo pesticidal compounds |
WO2024033374A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds |
WO2024038054A1 (en) | 2022-08-16 | 2024-02-22 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
WO2024056732A1 (en) | 2022-09-16 | 2024-03-21 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active cyclic amine compounds |
WO2024069011A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
WO2024089023A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2024089216A1 (en) | 2022-10-27 | 2024-05-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Novel sulfur-containing heteroaryl carboxamide compounds |
WO2024094575A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2024110554A1 (en) | 2022-11-23 | 2024-05-30 | Syngenta Crop Protection Ag | N-[(1 -[2-[6-(pyridazin-3-yl]-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-quinazolin-4-amine and n-[1-[3-(6-(pyridazin-3-yl)pyrazin-2-yl]ethyl]-8-quinazolin-4-amine derivatives as pesticides |
WO2024110215A1 (en) | 2022-11-24 | 2024-05-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active cyclic amine compounds |
WO2024121261A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Insecticidal compound based on pyrazole derivatives |
WO2024121262A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Insecticidal compound based on pyrazole derivatives |
WO2024121264A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Insecticidal compound based on pyrazole derivatives |
WO2024121263A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Insecticidal compound based on pyrazole derivatives |
WO2024126388A1 (en) | 2022-12-12 | 2024-06-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents |
WO2024126404A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives |
WO2024126650A1 (en) | 2022-12-15 | 2024-06-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Novel bicyclic-carboxamide compounds useful as pesticides |
WO2024126407A1 (en) | 2022-12-16 | 2024-06-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Benzimidazole derivatives |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE123528T1 (de) * | 1986-07-25 | 1995-06-15 | Univ Louisiana State | Verfahren zum verleihen bei pflanzen eines widerstands gegen krankheiten und pest sowie neue gene in pflanzen die hierfür kodieren. |
WO1988007585A1 (en) * | 1987-04-02 | 1988-10-06 | Genelabs, Incorporated | Equal-abundance transcript composition and method |
ES2074999T3 (es) * | 1987-05-20 | 1995-10-01 | Ciba Geigy Ag | Plantas de zea mays y plantas de zea mays transgenicas regeneradas de protoplastos o celulas derivadas de protoplastos. |
ZA885916B (en) * | 1987-09-15 | 1989-04-26 | Gen Hospital Corp | Pathogenesis-related proteins in plants |
EP0332104A3 (en) * | 1988-03-08 | 1991-03-20 | Ciba-Geigy Ag | Chemically regulatable dna sequences and genes and uses thereof |
WO1990007001A1 (en) * | 1988-12-16 | 1990-06-28 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Overexpression of chitinase in transgenic plants |
EP0418695A1 (de) * | 1989-09-13 | 1991-03-27 | Ciba-Geigy Ag | Regulatorische DNA-Sequenz |
-
1990
- 1990-03-21 ES ES90105336T patent/ES2199931T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-21 EP EP90105336A patent/EP0392225B1/en not_active Revoked
- 1990-03-21 DE DE69034081T patent/DE69034081T2/de not_active Revoked
- 1990-03-21 DK DK90105336T patent/DK0392225T3/da active
- 1990-03-21 AT AT90105336T patent/ATE241699T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-22 CA CA002012778A patent/CA2012778C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-22 IL IL9384490A patent/IL93844A/en active IP Right Grant
- 1990-03-22 NZ NZ233053A patent/NZ233053A/xx unknown
- 1990-03-23 AU AU52183/90A patent/AU642865B2/en not_active Ceased
- 1990-03-23 HU HU901820A patent/HUT60770A/hu unknown
- 1990-03-24 KR KR1019900003975A patent/KR100212691B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-03-26 JP JP2076564A patent/JPH0335783A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2012778A1 (en) | 1990-09-24 |
EP0392225A3 (en) | 1991-09-25 |
IL93844A0 (en) | 1990-12-23 |
IL93844A (en) | 2004-05-12 |
HU901820D0 (en) | 1990-07-28 |
DK0392225T3 (da) | 2003-09-22 |
HUT60770A (en) | 1992-10-28 |
DE69034081T2 (de) | 2004-02-12 |
AU5218390A (en) | 1990-09-27 |
JPH0335783A (ja) | 1991-02-15 |
CA2012778C (en) | 2005-08-09 |
ATE241699T1 (de) | 2003-06-15 |
AU642865B2 (en) | 1993-11-04 |
EP0392225A2 (en) | 1990-10-17 |
DE69034081D1 (de) | 2003-07-03 |
KR900014597A (ko) | 1990-10-24 |
KR100212691B1 (ko) | 1999-08-02 |
NZ233053A (en) | 1993-10-26 |
EP0392225B1 (en) | 2003-05-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2199931T3 (es) | Plantas transgenicas resistentes a enfermedades. | |
RU2130491C1 (ru) | Фрагмент днк (варианты), слитый фрагмент днк для экспрессии в растениях и способ получения трансгенного растения и его потомков | |
US5847258A (en) | DNA encoding β-1,3-glucanases | |
US5789214A (en) | Method of inducing gene transcription in a plant | |
EP0388186A1 (en) | External regulation of gene expression | |
CA2037806A1 (en) | Anti-pathogenically effective compositions comprising lytic peptides and hydrolytic enzymes | |
ES2235150T3 (es) | Nuevas secuencias de señales. | |
ES2211864T3 (es) | Secuencias de adnc especificas de antera, secuencias de adn genomico y secuencias de adn recombinante. | |
AU645990B2 (en) | Regulatory DNA sequence | |
ES2198401T3 (es) | Procedimiento para la produccion de plantas resistentes a agentes patogenos. | |
Spiral et al. | Transgenic coffee (Coffea species) | |
AU656907B2 (en) | Recombinant gene coding for a protein having an endochitinase activity | |
US5851766A (en) | Process for isolating chemically regulatable DNA sequences | |
de Jong | Characterization of an endochitinase able to rescue the carrot somatic embryo variant ts11 | |
PL162317B1 (en) | Method for controlling transcription of a chemically controlled gene in plant material |