ES2235150T3 - Nuevas secuencias de señales. - Google Patents

Nuevas secuencias de señales.

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ES2235150T3
ES2235150T3 ES91810430T ES91810430T ES2235150T3 ES 2235150 T3 ES2235150 T3 ES 2235150T3 ES 91810430 T ES91810430 T ES 91810430T ES 91810430 T ES91810430 T ES 91810430T ES 2235150 T3 ES2235150 T3 ES 2235150T3
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vacuole
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Thomas Prof.Dr. Boller
Jean-Marc Dr. Neuhaus
John Dr. Ryals
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE FRAGMENTOS DE PEPTIDOS (SEÑAL "TARGETING") OBTENIBLES DE LA REGION TERMINAL C (C-TERMINALE EXTENSION) DE PROTEINAS DE VACUOLENO VEGETAL Y QUE ASEGURAN EN UNA UNION OPERANTE CON CUALQUIER MOLECULA PROTEINICA INTRODUCCION DIRIGIDA DE LAS PROTEINAS ASOCIADAS A ESTOS FRAGMENTOS DE PEPTIDOS EL VACUOLO VEGETAL, AL IGUAL QUE LAS MOLECULAS DNA CODIFICADORAS DE LOS MENCIONADOS FRAGMENTOS DE PEPTIDOS. OTRO ASPECTO DE LA PRESENTE INVENCION TRATA DE LAS MOLECULAS DNA RECOMBINANTES QUE CONTIENEN LA SECUENCIA DNA DE LA QUE TRATA LA INVENCION EN UNION OPERANTE CON UN DNA EXPRIMIBLE, ASI COMO LOS VECTORES DE AQUI DERIVADOS. ASI MISMO COMPRENDE CELULAS NODRIZAS Y/U ORGANISMOS NODRIZA, INCLUYENDO PLANTAS TRANSGENETICAS, QUE CONTENGAN DNA RECOMBINANTE O LOS VECTORES DE ELLO DERIVADOS.

Description

Nuevas secuencias de señales.
La presente invención se refiere a nuevos fragmentos de péptido [señal de "direccionamiento"] que se obtienen a partir de la región C-terminal [extensión C-terminal] de quitinasas vegetales y que proporcionan en unión operable con una molécula de proteína discrecional de origen heterólogo una reclusión pretendida de las proteínas asociadas con estos fragmentos de péptido en la vacuola vegetal.
La presente invención se refiere además a secuencias de ADN, que codifican los fragmentos de péptido caracterizados en detalle previamente y conducen en unión operable con un ADN exprimible, discrecional a un producto génico, que llega a recluirse en la vacuola vegetal, así como a mutantes y variantes del mismo.
Otro objeto de la presente invención se refiere a moléculas de ADN recombinante en las que una secuencia de ADN, que se obtiene a partir de la región terminal 3' de un gen, que codifica una molécula de proteína presente en la vacuola de forma natural y en donde dicha secuencia de ADN codifica un péptido C-terminal [extensión C-terminal], que es responsable de la reclusión pretendida ["direccionamiento"] de un producto génico asociado de origen heterólogo en la vacuola vegetal y donde dicha secuencia de ADN no codifica los aproximadamente 20 aminoácidos C-terminales del producto de translación primario de la osmotina de tipo salvaje, está unida de forma operable con un gen heterólogo, así como con los vectores derivados del mismo. Igualmente están comprendidas las células huésped y/o organismos huéspedes, incluyendo plantas transgénicas que contienen dichas moléculas de ADN recombinante.
Los procedimientos para la preparación de las moléculas de ADN recombinante según la invención forman un componente más de la presente invención. Igualmente están comprendidas las plantas transgénicas que contienen las moléculas de ADN recombinante según la invención.
En el marco de la ingeniería genética hay en los últimos tiempos un interés creciente en hallar la expresión pura del gen extraño recluido respecto a secuencias de ADN que codifican las denominadas secuencias de señal, lo que permite al producto génico asociado, en correspondencia a su función llegar a su lugar de destino específico, donde luego puede desarrollar su actividad óptima o bien ubicarse de forma adecuada. En lo referente a la planta completa esto significa que, por ejemplo, se busca identificar o desarrollar promotores que hagan posible una expresión específica de tejido y/o del desarrollo del gen extraño recluido.
La clasificación atendiendo al fin o destino de genes extraños recluidos o de sus productos de expresión no es, sin embargo, sólo de relevancia a nivel de la planta, sino que puede ser también de gran significancia ya sobre la superficie celular, especialmente en lo que se refiere a la efectividad de la transformación.
De esta forma se sabe, por ejemplo, que en células vegetales como también en otras células eucarióticas la mayoría de las proteínas se sintetizan en ribosomas cicloplasmáticos, pero que una gran parte de estas proteínas es necesaria en compartimentos subcelulares muy diferentes. Una excepción de esto la forman únicamente algunas proteínas de mitocondrias y cloroplastos, que se producen directamente en el lugar de su uso. Las proteínas producidas citoplasmáticamente, por el contrario, son transportadas bien a lo largo del sistema de la endomembrana que cruza la célula al compartimento lítico [vacuola, liposomas] de la célula y al espacio extracelular, o bien son captadas directamente de su respectivo compartimento [vacuola, cloroplastos, peroxisomas].
Para el mantenimiento de esta compartimentación conseguida sobre la superficie subcelular deben estar presentes dentro de la célula sistemas de transporte y de clasificación específicos, que aseguren una distribución acorde a la función de las proteínas producidas citoplasmáticamente. Estas proteínas deben, por tanto, contener una o bien varias informaciones adicionales, que permita a los sistemas de transporte y clasificación mencionados de la célula reconocer su respectivo sustrato y dirigir este a su lugar de destino específico. De esta forma, por ejemplo, se podría detectar un péptido transitorio en los numerosos precursores citoplasmáticos de proteínas de mitocondrias y cloroplastos en el extremo N-terminal, que asegure la captación de estas proteínas en su compartimento respectivo. Las proteínas nucleares poseen correspondientemente una secuencia específica del núcleo celular.
Es de especial significancia para el transporte de proteínas intracelular el sistema de endomembrana de la célula. Este sistema de membrana que cruza la célula, que se compone del retículo endoplasmático y del aparato de Golgi, sirve en esencia al transporte de proteínas, especialmente de proteínas producidas citoplasmáticamente, hasta el compartimento lítico [vacuola, lisosomas] y hasta el espacio extracelular.
Las proteínas, que son transportadas por el sistema de endomembrana, alcanzan en primer lugar el retículo endoplasmático. La señal de transporte necesaria para esta etapa se representa mediante una secuencia de señal en el extremo N-terminal de la molécula, el denominado péptido señal. Este péptido señal se escinde proteolíticamente de la proteína precursora, en tanto haya cumplido su función. En lo referente a su función específica se conservó en gran medida este tipo de secuencia del péptido señal en el transcurso de la evolución en todas las células vivas, independientemente de si se trata de bacterias, levaduras, hongos, animales o plantas.
Tiene lugar una etapa de clasificación más dentro del aparato de Golgi, donde tiene lugar la separación de las proteínas destinadas al compartimento lítico [vacuola, lisosomas] y a la secreción en el espacio extracelular.
En los estudios en levaduras y animales se ha encontrado que las proteínas que no contienen señal adicional alguna se segregan de forma manifiestamente automática en el espacio extracelular, mientras que las proteínas, que contienen una señal de clasificación adicional de este tipo, se recluyen en el compartimento lítico.
A este respecto esta señal de clasificación puede ser de naturaleza muy distinta. En los animales estudiados hasta ahora, por ejemplo, se trata por lo general de una modificación específica dentro de la cadena de glicano de glicoproteínas, y de un grupo manosa-6-fosfato. Este grupo es reconocido por un receptor de la manosa-6-fosfato específico, que conduce a que las proteínas correspondientes se liberen en vesículas específicas desde el aparato de Golgi y se transporten a los lisosomas. No obstante, a este respecto, no se ha acertado hasta la fecha a determinar aquella secuencia de polipéptido que dé el impulso para la fosforilación de un grupo manosa en la cadena lateral de glicano.
En levaduras la señal de clasificación correspondiente para el compartimento lítico no se trata de una cadena de glicano, sino e una secuencia de aminoácido que forma tras escisión del péptido señal el término N de la proteína. Esta señal de "direccionamiento" N-terminal para la vacuola se escinde por lo general en la vacuola misma con ayuda de la proteinasa A. Frecuentemente la proteína transportada a la vacuola llega a ser primero una enzima activa catalíticamente mediante esta escisión de la señal de "direccionamiento".
En cuanto a plantas es por tanto especialmente interesante la cuestión de la señal de "direccionamiento" responsable de la reclusión de proteínas en la vacuola, -en especial desde el punto de vista orientado a la aplicación-, debido a que la vacuola no sólo representa el compartimento lítico de la célula vegetal sino que también forma el mayor compartimento de reserva para sustancias reserva, productos de descontaminación y sustancias protectoras [Boller y Wiemken (1986)].
Sería por tanto muy ventajoso si se dirigiesen proteínas, que tengan relación con una mejora del contenido de sustancias alimenticias de la planta, a la vacuola y almacenarlas ahí, ya que este se trata, con diferencia, del compartimento más espacioso de la célula vegetal para sustancias disueltas. Las proteínas para almacenamiento más importantes de tubérculos, bulbos, raíces y tallos, por ejemplo, se encuentran en las vacuolas de las células que constituyen estos órganos [Boller y Wiemke (1986)]. Además las proteínas para almacenamiento de la mayoría de las semillas están localizadas en los denominados "cuerpos proteicos", vacuolas especializadas, para las que podrían ser válidas las mismas señales de "direccionamiento" que para las vacuolas de órganos vegetativos.
Son válidas también consideraciones similares para sustancias que se puede usar en la lucha contra daños o enfermedades, especialmente si estas sustancias se muestran como tóxicas para las plantas por sí mismas. Por tanto, también es ventajoso depositar estas sustancias en la vacuola vegetal.
Finalmente la vacuola sirve en determinados casos también como órgano dexintoxicante, de modo que por ejemplo almacena productos de dexintoxicación sintetizados por la planta [Boller y Wiemke (1986)]. Por tanto, se persigue recluir asimismo enzimas de dexintoxicación en la vacuola.
El problema justamente inverso se da por contra, por ejemplo, en la invasión de plantas de cultivo por parte de determinados hongos patógenos. Estos infectan su planta huésped de modo que avivan su micela por los espacios intercelulares de la planta. Debido a que para la lucha contra estos patógenos se presentan en la vacuola muy frecuentemente quitinasas y glucanasas de utilidad, su biodisponibilidad es baja de forma natural en el espacio intercelular. En estos casos sería, por tanto, deseable si se estuviese en la situación de recluir estas proteínas en el compartimento extracelular para aumentar así la biodisponibilidad de estas sustancias en el espacio intercelular y de esta forma posibilitar una lucha efectiva contra el hongo patógeno.
Es también ventajosa una secreción en el espacio extracelular si se pretende producir sustancias determinadas con uso de cultivos celulares. En este caso se pueden aislar las proteínas extrañas recluidas muy fácilmente del medio rodeante ya que se segregan en el espacio extracelular. Puede interrumpirse la ruptura necesaria en la producción intracelular de las células.
Sin embargo hasta ahora no se ha conseguido identificar o incluso aislar una señal de "direccionamiento" de este tipo para la vacuola de las plantas.
Tague y Chrispeels (1987) han unido, partiendo de la suposición de que en las plantas se podría conseguir una señal de "direccionamiento" N-terminal comparable para la reclusión de proteínas en la vacuola como en las levaduras, distintas partes de la molécula de fitohemaglutinina de guisantes con un gen reportero y ensayado en levaduras. De esto se evidenció que en el huésped de levadura también en el caso de la fitohemaglutinina de la parte N-terminal de la molécula actúa como señal de "direccionamiento" para la vacuola.
Otra proteína de la vacuola, la \beta-1,3-glucanasa básica, se sintetiza con una extensión C-terminal, que se pierde en el transcurso de la maduración de la molécula. Es válido esto mismo también para la lectina del arroz, cebada y trigo (aglutininta del germen de trigo). La función de esta extensión era desconocida hasta ahora.
Van den Bulcke y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, vol. 86, páginas 2673 - 2677, 1989) compararon las secuencias de aminoácidos de fragmentos típicos de una \beta-1,3-glucanasa de la vacuola del tabaco con la secuencia de aminoácidos deducida del ADNc de una \beta-1,3-glucanasa procesada (Shinshi y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, volumen 85, páginas 5541 - 5545) y comprobaron en esto que la \beta-1,3-glucanasa de la vacuola presenta el mismo fragmento C-terminal como los fragmentos trípticos igualmente estudiados de \beta-1,3-glucanasas secretadas, y que la secuencia de aminoácidos deducida de la \beta-1,3-glucanasas procesada poseen también una extensión C-terminal de 22 aminoácidos.
En el documento EP 460753A2 se describe que la proteína osmotina que está presente de forma natural en la vacuola se segrega en el espacio extracelular mediante deleción del extremo C-terminal. El documento EP 460753A2 tiene una fecha de prioridad que es previa a la fecha de prioridad de la presente invención, pero se publicó tras la presentación de la presente invención.
También una comparación de los términos C de distintas proteínas de la vacuola deja ver homologías no manifestadas hasta ahora en este campo. Por ello se favoreció hasta ahora la hipótesis que, de forma similar a las levaduras, también en las plantas la actividad de señal impartida por el término N parte de estas proteínas de la vacuola.
Uno de los objetivos esenciales que se ha de resolver en el marco de esta invención, consistió por tanto en proporcionar fragmentos de péptido [secuencias de "direccionamiento"], los cuales se pueden usar para la reclusión pretendida de una molécula de proteína asociada de origen heterólogo en la vacuola vegetal, para producir moléculas de ADN recombinante que, si se exprimen en una planta transgénica, conduzcan a la reclusión pretendida del producto de expresión en la vacuola.
Este objetivo se podría conseguir ahora de forma sorprendente ahora en el marco de la presente invención con uso, por ejemplo, de operaciones de procedimiento conocidas.
En particular la presente invención se refiere a un fragmento de péptido corto, el cual es responsable de la reclusión pretendida ["direccionamiento"] de una molécula de proteína asociada discrecional en la vacuola vegetal, así como el ADN que codifica el fragmento de péptido mencionado. En cuanto a la molécula de proteína asociada mencionada se trata de una proteína de origen heterólogo, en relación a la secuencia de "direccionamiento" usada.
El fragmento de péptido según la invención se obtiene a partir de la región C-terminal de una molécula de quitinasa presente en la vacuola de forma natural. El ADN que codifica el fragmento de péptido mencionado se obtiene correspondientemente a partir de la región terminal 3' de un gen de quitinasa vegetal.
Muy especialmente se prefiere un fragmento de péptido que actúa como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal y que presenta la siguiente secuencia de aminoácidos reproducida en SEQ ID Nº 1 y 2:
Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met
así como las secuencias de ADN que codifican el fragmento de péptido mencionado que se reproducen en la SEQ ID Nº: 1, fórmula general
CGN/AGR TCN/AGW TTY GGN AAY GGN CTN/TTR TTR/CTN GTN GAY ACN ATG TAA
en la que significan
N
A ó G ó C ó T/U;
R
G ó A;
W
A ó T/U; y
Y
T/U ó C.
A este respecto son preferidas aquellas secuencias de ADN que presentan en la mayor parte de los casos los codones usados preferiblemente por la planta.
Es especialmente preferida una secuencia de ADN que está presente en forma esencialmente pura y que, por ejemplo, se obtiene a partir del extremo terminal 3' [extensión C-terminal] de un gen de quitinasa básico de plantas de Nicotiana tabacum L. c.v. Havana 425 y presenta esencialmente la siguiente secuencia de ADN reproducida en la SEQ ID Nº 2:
ACG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA
Además es preferida una secuencia de ADN que esté presente en forma esencialmente pura y que, por ejemplo, se obtiene a partir del extremo terminal 3' [extensión C-terminal] de un gen de glucanasa básico de plantas de Nicotiana tabacum L. c.v. Havana 425 y presenta esencialmente la siguiente secuencia de ADN reproducida en la SEQ ID Nº 12:
GTC TCT GGT GGA GTT TGG GAC AGT TCA GTT GAA ACT AAT GCT ACT GCT TCT CTC GTA AGT GAG ATG TGA
El fragmento de péptido codificado por la secuencia de ADN mencionada, que actúa como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal y presenta la siguiente secuencia de aminoácidos reproducida en la SEQ ID Nº 12, forma igualmente un componente de la presente invención:
Val Ser Gly Gly Val Trp Asp Ser Ser Val Glu Thr Asn Ala Thr Ala Ser Leu Val Ser Glu Met
Asimismo se describen derivados de las secuencias de ADN indicadas con detalle anteriormente, que son esencialmente homólogas a estas y que presentan propiedades según la invención, es decir, que codifican un péptido C-terminal, que actúa como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal.
Una secuencia de ADN es en esencia homóloga a una segunda secuencia de ADN si al menos el 60%, preferiblemente al menos el 80% y muy especialmente preferiblemente al menos el 90% de los segmentos activos de las secuencias de ADN son homólogos entre ellos.
En cuanto a los derivados mencionados de las secuencias de ADN según la invención se puede tratar de variantes o mutantes de procedencia natural o también especialmente de aquellos que son producidos intencionadamente con ayuda de procedimientos de mutación conocidos.
Bajo una mutación se deben entender tanto la deleción o inserción de una o varias bases como también un intercambio de una o varias bases o bien una combinación de estas acciones. Esto es válido especialmente cuando la sustitución de bases mencionada progresa con una mutación sosegada que no presenta en consecuencia intercambio alguno de aminoácidos.
Ejemplos de tales mutantes que son igualmente un componente de la presente invención, se representan por las secuencias de ADN listadas a continuación y reproducidas por las SEQ ID Nº 3 a 7. Estos mutantes están preparados mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos a partir de las secuencias principales reproducidas por las SEQ ID Nº 1 y 2 y codifican fragmentos de péptido que presentan las mismas propiedades de "direccionamiento" que los fragmentos codificados por las secuencias principales mencionadas:
1
Los huecos de las secuencias (a) a (c) conciernen a aquellas zonas de la secuencia de "direccionamiento" mutada, que no presentan diferencia alguna frente a la secuencia de partida.
Igualmente se describen fragmentos de péptido que se codifican de las secuencias de ADN mencionadas anteriormente y presentan también las mismas propiedades de "direccionamiento" como los fragmentos de péptido no modificados, presentes de forma natural, que se codifican mediante secuencias principales mencionadas según la SEQ ID Nº 1 y 2.
Se prefieren especialmente en el marco de la invención los fragmentos de péptido que actúan como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal y que presentan las secuencias de aminoácidos reproducidas en la SEQ ID Nº: 3 y 7:
2
Los huecos de las secuencias (a) a (c) conciernen a aquellas zonas de la secuencia de "direccionamiento" mutada, que no presenta diferencia alguna frente a la secuencia de partida.
Esta enumeración ejemplo no es limitante en modo alguno, sino que sirve para demostrar únicamente que las variantes de las secuencias mencionadas anteriormente como preferidas se pueden preparar muy fácilmente por parte del especialista en la técnica, sin que se pierda con ello la propiedad esencial de la invención de estas secuencias.
Igualmente se describen fragmentos o secuencias parciales que se obtienen a partir de las secuencias de ADN indicadas con detalle anteriormente o a partir de derivados de estas secuencias de ADN y que presentan las propiedades específicas de las secuencias de partida.
Son especialmente preferidos en el marco de la invención los fragmentos de ADN que se obtienen a partir de la secuencia de ADN según la invención conforme a la SEQ ID Nº: 2 y presentan esencialmente las siguientes secuencias de nucleótidos reproducidas en las SEQ ID Nº: 8 y 9:
CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA {}\hskip-0,8cm GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA
Las secuencias de ADN anteriormente reproducidas codifican fragmentos de péptido que actúan como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal y presentan la siguiente secuencia de aminoácidos reproducida en las SEQ ID Nº: 8 y 9:
Leu Leu Val Asp Thr Met End {}\hskip-0,7cm Gly Leu Leu Val Asp Thr Met End
Los fragmentos de péptido mencionados son por tanto igualmente un componente de la presente invención.
Un objeto más de la presente invención lo forman moléculas de ADN recombinante en las que la secuencia de ADN, que se obtiene a partir de la región terminal 3' de un gen, que codifica una molécula de proteína presente en la vacuola de forma natural y en las que la secuencia de ADN mencionada codifica un péptido C-terminal [extensión C-terminal], que es responsable de la reclusión pretendida ["direccionamiento"] de un producto génico asociado de origen heterólogo en la vacuola vegetal, y en donde la secuencia de ADN mencionada no codifica los aproximadamente 20 aminoácidos C-terminales del producto de translación primario de la osmotina de tipo salvaje, está unida de forma operable con un gen heterólogo. Las moléculas de ADN recombinantes según la invención pueden estar unidas de forma operable con señales de expresión activas en células vegetales y, dado el caso, con otras secuencias de codificación y/o de no codificación de la región 3' y/o 5', en tanto en la transformación en un huésped vegetal tiene lugar una reclusión pretendida del producto de expresión en la vacuola vegetal.
A este respecto es ventajoso si el ADN exprimible contiene en la región terminal 5' una secuencia o bien se une con una secuencia del tipo que codifica un péptido señal de N-terminal capaz de actuar en las células vegetales. Además de esto se pueden presentar otros segmentos de secuencia en la molécula de ADN, que codifican para fragmentos de péptido que contribuyen en conjunto a mejorar la competencia para una captación en la vacuola como, por ejemplo, el fragmento de propéptido encontrado en la extensión N-terminal de la esporamina por parte de Matsuoka K y Nakamura K [Matsuoka K y Nakamura K (1991)].
Además están comprendidos por la presente invención los vectores de clonación, transformación y expresión que contienen la molécula de ADN recombinante según la invención mencionada así como los organismos huésped transformados con los vectores mencionados.
Un objeto más de esta invención lo forman los denominados vectores de "transbordo" o vectores binarios, que contienen la molécula de ADN recombinante según la invención mencionada y que están en la situación de replicarse tanto en E. coli como también en A. Tumefaciens.
Bajo organismos huésped se seleccionan especialmente huéspedes vegetales del grupo constituido por protoplastos vegetales, células, callos, tejidos, órganos, cigotos, embriones, polen y/o semillas preferiblemente así como especialmente también plantas completas, preferiblemente fértiles, que están transformadas con el ADN recombinante mencionado. A este respecto las plantas completas se pueden transformar bien directamente como tales con la molécula de ADN recombinante según la invención o bien conseguirse a partir de protoplastos, células y/o tejidos transformados previamente vía regeneración.
Son muy especialmente preferidas las plantas transgénicas, pero especialmente plantas fértiles transgénicas, que contienen una de las construcciones según la invención y en las que está presente el producto génico exprimido, como se desea, en la vacuola.
Igualmente está comprendido por la presente invención aquel producto de multiplicación de una planta transgénica, en donde la planta transgénica mencionada se puede generar bien por transformación directa con una de las moléculas de ADN recombinante según la invención o bien se consigue a partir de protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, cigotos, embriones, polen y/o semillas vía regeneración, sin estar no obstante limitados a estos, y en donde el producto de multiplicación contiene una molécula de ADN recombinante según la invención. Bajo producto de multiplicación se debe entender en el marco de esta invención aquel material vegetal que se puede multiplicar sexual o asexualmente o bien in vitro o in vivo, en donde son preferidos los protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, células huevo, cigotos, embriones, polen o semillas, que se pueden obtener de una planta transgénica según la invención. Un objeto más de esta invención lo forman la descendencia de plantas mencionadas, así como mutantes y variantes de los mismos, incluyendo aquellos que se derivan de plantas que se obtienen mediante fusión celular somática, modificación genética o selección de mutantes.
Otros objetos de la presente invención conciernen a procedimientos:
(a) para la preparación de una de las secuencias de ADN según la invención;
(b) para la preparación de moléculas de ADN recombinantes según la invención, que contienen la secuencia de ADN según la invención anterior en unión operable con una secuencia de ADN exprimible discrecional de origen heterólogo, en donde la secuencia de ADN se genera preferiblemente bajo los controles regulatorios de señales de expresión vegetal;
(c) para la preparación de vectores de clonación, transformación y/o expresión, que contienen la molécula de ADN recombinante según la invención mencionada;
(d) para la preparación de organismos huésped transformados, en especial huéspedes vegetales seleccionados del grupo constituido por protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, cigotos, embriones, polen y/o semillas vegetales así como especialmente también plantas completas, preferiblemente fértiles;
(e) para la preparación de producto de multiplicación partiendo de material vegetal transformado, pero especialmente para la preparación de descendencia sexual o asexualmente.
Igualmente se describe un procedimiento para la reclusión intencionada de productos de expresión en la vacuola vegetal que se caracteriza esencialmente porque
(a) en primer lugar la secuencia de ADN responsable de una reclusión pretendida en la vacuola se aísla a partir de una fuente adecuada o esta se sintetiza con ayuda de procedimientos conocidos
(b) la secuencia de ADN mencionada se inserta de forma operable en el extremo terminal 3' de una secuencia de ADN exprimible discrecional;
(c) la construcción acabada se clona en un vector de expresión vegetal con los controles de señales de expresión activas en plantas; y
(d) el vector de expresión mencionado se transforma en un huésped vegetal y se exprime ahí.
A este respecto es ventajoso si el ADN exprimible en la región terminal 5' contiene una secuencia o bien se une de forma operable con una secuencia del tipo que codifica un péptido señal N-terminal capaz de actuar en las células vegetales. Además de esto pueden estar presentes otros segmentos de secuencia en la molécula de ADN, que codifican para fragmentos de péptido, que contribuyen en su conjunto a mejorar la competencia de una captación en la vacuola como, por ejemplo, el fragmento de propéptido encontrado en la extensión N-terminal de la esporamina por parte de Matsuoka K y Nakamura K [Matsuoka K y Nakamura K (1991)].
En el transcurso de los estudios llevados a cabo en el marco de esta invención se ha mostrado que las proteínas, que contienen de forma natural una de las secuencias de "direccionamiento" según la invención y que por tanto son recluídas normalmente en la vacuola, con la pérdida de la secuencia de señal según la invención se segregan al espacio extracelular.
Un objeto más de la revelación se refiere, por tanto, a un procedimiento para la huída de proteínas que contienen de forma natural una secuencia de "direccionamiento" y, por tanto, se recluyen normalmente en uno de los compartimentos celulares, especialmente en la vacuola, al espacio extracelular de la planta, que se caracteriza esencialmente porque
(a) se aísla una secuencia de ADN que codifica una proteína de este tipo, pero especialmente para una proteína de las vacuolas;
(b) se separa la secuencia de "direccionamiento" responsable de la reclusión en el compartimento celular respectivo en el extremo C-terminal del marco de lectura abierto, por ejemplo, mediante inserción de un codón de terminación directamente antes de la extensión C-terminal o mediante separación de la extensión C-terminal;
(c) se entrelaza la secuencia de ADN mutada mencionada en un vector de expresión vegetal adecuado; y
(d) la construcción acabada se transforma en un huésped vegetal.
Definiciones
En la siguiente descripción se usa un conjunto de expresiones que son usuales en la tecnología de ADN recombinante, así como en la genética vegetal. Para asegurar una comprensión clara y homogénea de la descripción y de las reivindicaciones así como del contexto, que aprovecha de las expresiones mencionadas, se disponen las siguientes definiciones.
Material vegetal: partes vegetales con vida en cultivo o como tales, como protoplastos, células, callo, tejido, embriones, órganos vegetales, brotes, semillas entre otros, así como plantas completas.
Célula vegetal: unidad estructural y fisiológica de la planta, compuesta por un protoplasto y una pared celular.
Protoplasto: célula vegetal "desnuda" sin pared celular aislada a partir de células o tejidos vegetales con la potencia de regenerarse en un clon celular o en una planta completa.
Tejido vegetal: grupo de células vegetales que están organizadas en forma de una unidad estructural y funcional.
Órgano vegetal: unidad estructural y funcional de varios tejidos como, por ejemplo, raíces, tronco, hoja o embrión.
Gen(es) o ADN heterólogo(s): una secuencia de ADN que codifica un producto o productos específicos o cumple una función biológica y que proviene de una especie distinta a esta, en la que el gen mencionado se recluye; la secuencia de ADN mencionada se designa también como gen extraño o ADN extraño.
Gen(es) o ADN homólogo(s): una secuencia de ADN que codifica un producto o productos específicos o cumple una función biológica y que proviene de la misma especie, en la cual se recluye el gen mencionado.
Gen(es) o ADN sintetizado(s): una secuencia de ADN que codifica un producto o productos específicos o cumple una función biológica y se preparan por vías sintéticas.
Promotor vegetal: una secuencia de control de la expresión de ADN que asegura la transcripción de cada secuencia de gen de ADN homólogo o heterólogo discrecional en una planta, en tanto la secuencia de gen mencionada esté unida de forma operable con un promotor de este tipo.
Secuencia de terminación: secuencia de ADN en el extremo de una unidad de transcripción que signaliza el final del proceso de transcripción.
Promotor de plantas sobreproductoras (OPP): promotor de plantas que está en la situación de provocar en una célula vegetal transgénica la expresión de una secuencia(s) de gen funcional unida de forma operable en una extensión (medido en forma de ARN o de la cantidad de polipéptido) que se observa que es claramente superior al natural en células huésped, que no están transformadas con el OPP mencionado.
Región no trasladada 3'/5': segmentos de ADN dispuestos aguas arriba o aguas abajo de la región de codificación, que se transcriben en el ARNm, pero que no se traducen en un polipéptido. Esta región contiene secuencias regulatorias como, por ejemplo, los sitios de unión de ribosomas (5') o la señal de poliadenilación (3').
Vector de clonación de ADN: vehículo de clonación como, por ejemplo, un plásmido o un bacteriófago, que contiene todas las secuencias de señal que son necesarias para la clonación de un ADN insertado en una célula huésped adecuada.
Vector de expresión de ADN: vehículo de clonación como, por ejemplo, un plásmido o un bacteriófago, que contiene todas las secuencias de señal que son necesarias para la expresión de un ADN insertado en un célula huésped adecuada.
Vector de transferencia de ADN: vehículo de transferencia como, por ejemplo, un plásmido Ti o un virus que hace posible la reclusión de material genético en una célula huésped adecuada.
Mutantes, variantes de plantas transgénicas: derivado generado de forma espontánea o también artificial, con uso de operaciones de procedimiento conocidas como, por ejemplo, tratamiento con radiación UV, tratamiento con agentes mutágenos etc., de una planta transgénica que presentan también las características esenciales según la invención y propiedades de la planta de partida.
Secuencia de ADN esencialmente pura: una secuencia de ADN que se aísla en forma esencialmente pura a partir de una fuente natural o no natural. Una secuencia de este tipo se puede presentar en un sistema natural como, por ejemplo, en bacterias, virus o en células vegetales o animales o se puede proporcionar para esto en forma de ADN sintético o de ADNc.
El ADN en forma esencialmente pura se aísla por lo general en forma de un vector, el cual contiene como inserción el ADN en cuestión. En forma esencialmente pura significa que están presentes otras secuencias de ADN sólo en una extensión despreciable y, por ejemplo, inferior al 5%, preferiblemente inferior al 1% y muy especialmente preferiblemente inferior al 0,1%. Tales secuencias y los vectores que contienen estas secuencias se encuentran por lo general en solución acuosa y en una solución tampón o en uno de los medios de cultivo usados normalmente.
En el marco de la presente revelación se podría identificar y aislar en primer lugar una secuencia de ADN concreta, que codifica un fragmento de péptido corto, que es responsable de la reclusión pretendida de un producto génico asociado discrecional en la vacuola vegetal. Como material de partida para el aislamiento de secuencias de ADN de "direccionamiento" mencionadas son especialmente adecuados los clones de ADNc y/o ADN genómicos de proteínas presentas en la vacuola de forma natural como, por ejemplo, un clon de quitinasa o glucanasa vegetal.
La presente revelación se refiere, por tanto, en primer lugar a una secuencia de ADN nueva, esencialmente pura, que se obtiene a partir de la región terminal 3' de un gen, que codifica una proteína presente en la vacuola de forma natural, y que en unión operable con un ADN exprimible, discrecional conduce a un producto génico, que se recluye de forma pretendida en la vacuola vegetal, así como a mutantes y variantes de la misma.
A este respecto es especialmente preferido en el marco de esta invención una secuencia de ADN que se obtiene a partir de la región terminal 3' de un gen de quitinasa vegetal. Igualmente se describe una secuencia de ADN que se obtiene a partir de la región terminal 3' de un gen de glucanasa vegetal.
En el aislamiento de un gen adecuado, pero especialmente un gen de quitinasa o glucanasa adecuado se parte preferiblemente de bibliotecas de genes genómicas o de ADNc que se pueden preparar según procedimientos rutinarios mejor conocidos por los especialistas en este campo. Los procedimientos fundamentales para la preparación de bibliotecas de genes genómicas o de ADNc se describen con detalle, por ejemplo, por parte de Maniatis y col. (1982), mientras que se pueden obtener datos para la reacción y uso de estos procedimientos sobre sistemas vegetales, por ejemplo, de la referencia de Mohnen (1985).
El ADN genómico así como el ADNc se puede conseguir de forma diferente, El ADN genómico se puede extraer y purificar, por ejemplo, con ayuda de procedimientos conocidos a partir de células adecuadas.
En una forma de realización específica de la presente revelación se parte en la preparación de ADNc por lo general de ARNm, que se puede aislar de células o tejidos seleccionados, pero especialmente de células o tejidos que presentan concentraciones conocidas elevadas en proteínas presentes en la vacuola de forma natural, pero especialmente altas concentraciones de quitinasa o glucanasa. El ARNm aislado se puede usar entonces en el marco de una transcripción inversa como colchón para la preparación de un ADNc que se corresponda.
Se prefieren especialmente según la invención como material de partida para la preparación de ADNc células o tejidos vegetales o material vegetal adecuado de este tipo, que se estimula previamente con ayuda de medidas adecuadas para la producción de mayores niveles de quitinasa. Esto se consigue, por ejemplo, de modo que se sobreinoculan células o tejidos cultivados o material vegetal adecuado de este tipo a un medio libre de hormonas y ahí se cultiva en un periodo de tiempo adecuado que es suficiente para la inducción de mayor nivel de quitinasa.
Es especialmente preferido en el marco de esta invención un medio base quepresente la concentración de sal clorhidrato y clorhidrato de tiamina propuesta por Linsmaier y Skoog (1965) (medio LS).
Los procedimientos para el aislamiento de poli(A^{+})ARN y para la preparación de ADNc son conocidos por el especialista en la técnica y se describen con detalle a continuación en el marco de los ejemplos de realización.
Las preparaciones de ADN extraídas y purificadas se descomponen a continuación para la clonación subsiguiente en fragmentos. La fragmentación del ADN genómico o del ADNc que se va a clonar puede tener lugar en una extensión adecuada para la inserción en un vector de clonación mediante tijeras mecánicas o bien preferiblemente mediante corte con enzimas de restricción adecuados. Los vectores de clonación adecuados que se usan ya de forma rutinaria para la preparación de bibliotecas de genes genómicas y/o de ADNc comprenden, por ejemplo, fagovectores como los fagos \lambda-Charon o bien vectores bacterianos como el plásmido E. coli pBR322. Se conocen otros vectores de clonación adecuados por parte del especialista en la técnica.
A partir de las bibliotecas de genes preparadas de esta forma se pueden localizar entonces en el marco de un programa de cribado clones adecuados, que contienen el gen deseado como, por ejemplo, un gen de quitinasa o de glucanasa, o partes de este, por ejemplo, con ayuda de sondas de oligonucleótidos adecuadas (moléculas sonda) y a continuación ser aislados. Para la localización de clones adecuados se encuentran disponibles distintos procedimientos como, por ejemplo, la hibridación de colonias diferencial o la hibridación de placas. Asimismo son de uso procedimientos de detección inmunológicos que se basan en una identificación de los productos de translación específicos.
Como molécula sonda se puede usar, por ejemplo, un fragmento de ADN ya aislado previamente a partir del mismo o bien de un gen relacionado estructuralmente, que está en la situación de hibridizarse con el segmento de secuencia de correspondencia dentro del gen deseado que se va a identificar.
En tanto la secuencia de aminoácidos de gen que se va a aislar o bien al menos las partes de esta secuencia sean conocidas, se puede proyectar en base a esta información de secuencia una secuencia de ADN de correspondencia. Debido a que el código genético está degenerado de forma conocida, se pueden usar en la mayoría de los casos codones distintos para uno y el mismo aminoácido. Esto conduce a que, sin tener en cuenta algunos casos excepcionales, por lo general se puede codificar una secuencia de aminoácidos determinada de un conjunto completo de oligonucleótidos similares unos a otros. A este respecto se ha de observar no obstante que coincida un integrante de este conjunto de oligonucleótidos realmente con la secuencia correspondiente dentro del gen buscado. Para poder limitar de antemano el número de oligonucleótidos posibles se recurre, por ejemplo, a las reglas establecidas por Lathe R y col. (1985) para el uso de codones, las cuales contemplan la frecuencia con la que un codón determinado se usa realmente en células eucarióticas.
En base a estas informaciones se pueden proyectar por tanto moléculas de oligonucleótidos que se pueden usar como moléculas sonda para la identificación y aislamiento de clones adecuados, de modo que las moléculas sonda mencionadas se hibridan en uno de los procedimientos previamente descritos con ADN genómico o ADNc.
Para facilitar la determinabilidad del gen deseado como, por ejemplo, un gen que codifica la quitinasa o glucanasa, se puede marcar la molécula sonda de ADN previamente descrita con un grupo fácilmente comprobable adecuado. Bajo un grupo comprobable se debe entender en el marco de esta descripción cualquier material que presente una propiedad determinada, fácilmente identificable, física o química.
Tales materiales son ya de amplio uso especialmente en el campo de los ensayos inmunológicos y son de utilidad en la mayoría de los casos también en la presente solicitud. Son de mencionar especialmente a este respecto agrupaciones enzimáticamente activas como, por ejemplo, enzimas, sustratos enzimáticos, coenzimas e inhibidores de enzimas, además de agentes de fluorescencia y luminiscencia, cromóforos así como radioisótopos como, por ejemplo, ^{3}H, ^{35}S, ^{32}P, ^{125}I y ^{14}C. La fácil determinabilidad de estos marcadores se basa por un lado en sus propiedades físicas inherentes (por ejemplo, marcador por fluorescencia, cromóforos, radioisótopos), por otra lado en sus propiedades de reacción y unión (por ejemplo, enzimas, sustratos, coenzimas, inhibidores).
Además es adecuada como molécula sonda un ADNc de cadena única que se derive de un ARN poli(A)+, la cual se aísla por su parte de un tejido o de una célula inducida para la producción de altos niveles de quitinasa o glucanasa.
Se describen procedimientos generales referentes a la hibridación, por ejemplo, por parte de Maniatis T y col. (1982) y por parte de Haymes BT y col. (1985).
Aquellos clones dentro de las bibliotecas de genes previamente descritas, que están en la situación de hibridizarse con una molécula sonda y que se identifican con ayuda de uno de los procedimientos de comprobación anteriormente mencionados, se pueden analizar además para determinar en particular la medida y naturaleza de la secuencia de codificación.
Un procedimiento alternativo para la clonación de genes, especialmente de genes de quitinasa y glucanasa, se basa en la construcción de una biblioteca de genes, que se constituye a partir de vectores de expresión. A este respecto se aísla primeramente en analogía a los procedimientos ya descritos previamente ADN genómico, preferiblemente ADNc, a partir de una célula o de un tejido, que esté en la situación de exprimir un producto génico deseado -en el caso que nos ocupa quitinasa o glucanasa- y a continuación entrelazarse en un vector de expresión adecuado. Las bibliotecas de genes preparadas de esta forma pueden cribar luego con ayuda de operaciones adecuadas, preferiblemente con uso de anticuerpos como, por ejemplo, anticuerpos antiquitinasa o antiglucanasa, y se pueden leer aquellos clones que contienen el gen deseado o bien al menos una parte de este gen como inserción.
Con ayuda de los procedimientos previamente descritos es posible, por tanto, aislar un gen que codifica un producto génico presente en la vacuola de forma natural como, por ejemplo, un gen de quitinasa o glucanasa vegetal, pero especialmente un gen de quitinasa o glucanasa básico de plantas de tabaco, que posee una secuencia de ADN en su extensión C-terminal, que conduce en unión operable con un gen de estructura heterólogo discrecional a una reclusión pretendida del producto génico en la vacuola del material vegetal transformado.
Se someten a caracterización adicional de un análisis de secuencia las secuencias de ADN purificadas y aisladas en la forma previamente descrita. A este respecto se descompone en primer lugar el ADN aislado previamente con ayuda de enzimas de restricción adecuados en fragmentos y a continuación se clonan en vectores de clonación adecuados como, por ejemplo, los vectores M13 mp18 y mp19. La secuenciación se lleva a cabo en la dirección 5' \rightarrow 3', en donde preferiblemente es de uso el procedimiento de terminación de cadenas de dideoxinucleótido según Sanger [Sanger y col., 1977] o el procedimiento según Maxam y Glibert [Maxam y Gilbert, 1980]. Para evitar errores en la secuenciación es ventajoso si se secuencian ambas cadenas de ADN en paralelo. El análisis de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de correspondencia se lleva a cabo preferiblemente informáticamente, con uso de un software informático adquirido comercialmente, adecuado [por ejemplo, software GCG de la Universidad de Wisconsin].
A partir de los clones de ADN preparados en la forma previamente descrita, pero especialmente a partir de clones de quitinasa o glucanasa, se pueden aislar muy fácilmente secuencias de ADN con uso de operaciones de procedimiento conocidas en general, que codifican un péptido que es responsable de la reclusión pretendida de un producto génico asociado de origen heterólogo en la vacuola vegetal.
Es especialmente preferido en el marco de esta invención una secuencia de ADN que esté presente en forma esencialmente pura y que se obtenga, por ejemplo, del extremo terminal 3' [extensión C-terminal] de un gen de quitinasa básico de plantas de Nicotiana Tabacum L. c.v. Havana 425, y presenta esencialmente la siguiente secuencias de ADN reproducida en la SEQ ID Nº: 2
AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA
La secuencia de ADN reproducida anteriormente codifica un fragmento de péptido que actúa en unión operable con una molécula de proteína como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal y que presenta la siguiente secuencia de aminoácido reproducida en SEQ ID Nº: 2
Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met
El fragmento de péptido mencionado es igualmente un componente de la presente invención.
Además se describe una secuencia de ADN que está presente en una forma esencialmente pura y, por ejemplo, se obtiene a partir del extremo terminal 3' [extensión C-terminal] de un gen de glucanasa básico de plantas de Nicotiana Tabacum L. c.v. Havana 425, y presenta esencialmente las siguientes secuencias de ADN reproducidas por la SEQ ID Nº: 12
GTC TCT GGT GGA GTT TGG GAC AGT TCA GTT GAA ACT AAT GCT ACT GCT TCT CTC GTA AGT GAG ATG TGA
El fragmento de péptido codificado mediante la secuencia de ADN mencionada que actúa en unión operable con un ADN exprimible como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal, presenta la siguiente secuencia de aminoácidos reproducida en la SEQ ID Nº: 12
Val Ser Gly Gly Val Trp Asp Ser Ser Val Glu Thr Asn Ala Thr Ala Ser Leu Val Ser Glu Met
Se entiende por si mismo que estas secuencias de ADN conocidas en adelante por su sucesión de bases no se deben aislar de nuevo de un gen de quitinasa o glucanasa adecuado, sino que por supuesto estas se pueden preparar de forma sintética en todo momento de forma muy sencilla con ayuda de procedimientos químicos conocidos. Los procedimientos adecuados para la síntesis de oligonucleótidos de ADN cortos como, por ejemplo, el procedimiento del fosfotriéster o de la fosfita son conocidos por el especialista en la técnica. Hoy en día las síntesis de olignucleótidos están mecanizadas y automatizadas en su mayor parte, de modo que se pueden preparar fragmentos de ADN cortos en periodos de tiempo cortos.
También es válido esto mismo para las secuencias de aminoácidos que se derivan directamente de la secuencia de bases del péptido de "direccionamiento" de correspondencia.
Mediante deleción, inserción o intercambio de uno o varios pares de bases en las secuencias de ADN anteriormente mencionadas se pueden preparar muy fácilmente variantes o mutantes de estas secuencias y evaluarlas en cuanto a su aptitud como secuencia de "direccionamiento".
En el marco de la presente descripción se da a conocer una multiplicidad de secuencias que son pueden preparar muy fácilmente a partir de la secuencia de partida existente de forma natural mediante mutagénesis.
En particular se puede proceder a este respecto de modo que en primer lugar se identifique y se aísle un gen que contenga una de las secuencias de ADN anteriormente mencionadas. Este gen, especialmente la secuencia de "direccionamiento" terminal 3', puede ser modificado mediante entrelazado en un vector de clonación adecuado con ayuda de operaciones de procedimiento conocidas. Es especialmente adecuado para la preparación de mutantes específicos la denominada mutagénesis mediada por oligonucleótidos. A este respecto se sintetizan fragmentos de oligonucleótidos cortos que son esencialmente homólogos a la secuencia de tipo salvaje, diferenciándose no obstante de estas en nucleótidos determinados. En cuanto a dichas diferencias se puede tratar de inserciones, deleciones, inversiones o un intercambio de uno o varios nucleótidos o bien de una combinación de las operaciones de procedimiento previamente indicadas. Estos fragmentos mutados se intercambian luego en el marco de procedimiento generalmente conocidos frente a piezas opuestas homólogas del gen de tipo salvaje. La construcción acabada puede entonces, como se describe previamente, clonarse en un vector de expresión vegetal adecuado y transformarse en una planta.
Sin embargo la mutagenización de determinados fragmentos de ADN se puede llevar a cabo también preferiblemente con uso de la reacción en cadena de la polimerasa ("polymerase chain reaction", PCR]. En cuanto a este procedimiento in vitro se considera el uso de oligonucleótidos sintetizados químicamente que provienen por lo general de las zonas periféricas del fragmento de ADN que va a mutar y son específicos de la cadena. Con condiciones adecuadas se hace referencia a una hibridación de los oligonucleótidos con las zonas complementarias sobre las cadenas simples de ADN producidas mediante desnaturalización. Las zonas de cadena doble generadas de esta forma sirven como cebador para la reacción de la polimerasa subsiguiente.
A este respecto se pueden usar además de las polimerasas de ADN de E. coli especialmente polimerasas estables al calor de bacterias termófilas como, por ejemplo, Thermus aquaticus.
La presente descripción no se limita, por tanto, a la sucesión de bases especificada anteriormente en detalle, sino que da a conocer además también todos los mutantes y/o variantes de estas secuencias de ADN, que se pueden preparar mediante deleción o inserción de una o varias bases o bien especialmente mediante intercambio de una o varias bases y que presentan también propiedades según la invención específicas de las secuencias de partida.
Son especialmente preferidas en el marco de esta invención las siguientes variantes, que se pueden preparar a partir de las secuencias de partida reproducidas en las SEQ ID Nº. 1 y 2 mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos y que codifican los péptidos, los cuales presentan también las mismas propiedades de "direccionamiento" como los péptidos codificados mediante dichas secuencias de partida [SEQ ID Nº: 3 a 7]:
3
Los huecos de las secuencias (a) a (c) conciernen a aquellas zonas de la secuencia de "direccionamiento" mutadas que no presentan diferencia alguna frente a la secuencia de partida.
Las secuencias de ADN que se pueden aislar o preparar en la forma previamente descrita se pueden usar ahora para localizar secuencias de ADN homólogas de igual función, de modo que se prepara, por ejemplo, en primer lugar bibliotecas de genes genómicas o de ADNc y estas se estudian en la forma previamente descrita con uso de las secuencias de ADN anteriormente mencionadas como moléculas sonda, en presencia de secuencias de ADN homólogas, que están en la situación de hibridizarse con estas moléculas sonda.
Estos procedimientos para la consecución de secuencias de ADN homólogas de igual función constituyen igualmente un componente de la presente revelación.
Asimismo se describen fragmentos de péptido que se codifican de las secuencias de ADN anteriormente mencionadas y que presentan las mismas propiedades de "direccionamiento" que los fragmentos de péptido presentes de forma natural, no modificados que son codificadas mediante dichas secuencias principales reproducidas en las SEQ ID Nº: 1 y 2.
Son especialmente preferidos los fragmentos de péptido que actúan como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal y que presentan las siguientes secuencias de aminoácidos [SEQ ID Nº: 3 a 7]:
\vskip1.000000\baselineskip
4
Los huecos de las secuencias (a) a (c) conciernen a aquellas zonas de la secuencia de "direccionamiento" mutada que no presenta diferencia alguna frente a la secuencia de partida.
Asimismo se describen fragmentos o secuencias parciales que se obtienen a partir de las secuencias de ADN designadas previamente en detalle o a partir de derivados de estas secuencias de ADN y que presentan las propiedades específicas de las secuencias de partida.
Son especialmente preferidas en el marco de esta invención los fragmentos de ADN que se obtienen a partir de la secuencia de ADN según la invención y presentan esencialmente las siguientes secuencias de nucleótidos reproducidas en las SEQ ID Nº: 8 y 9:
CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA {}\hskip-0,8cmGGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA
Las secuencias de ADN reproducidas anteriormente codifican fragmentos de péptido que actúan como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal y presentan la siguiente secuencia de aminoácidos reproducida en las SEQ ID Nº: 8 y 9:
Leu Leu Val Asp Thr Met {}\hskip-0,5cmGly Leu Leu Val Asp Thr Met
Los fragmentos de péptido mencionados son, por tanto, igualmente un componente de la presente invención.
En el marco de la presente invención se podría mostrar en lo sucesivo que las secuencias de ADN caracterizadas en detalle anteriormente, que codifican un fragmento de péptido C-terminal corto, el cual es responsable de la reclusión pretendida del gen de estructura asociado consiguientemente de forma natural, están en la situación también de cumplir en unión con genes heterólogos además su función de "direccionamiento".
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En una forma de realización específica de la presente invención se use de forma operable a este respecto la secuencia de ADN de "direccionamiento" mencionada con ayuda de los procedimientos descritos previamente con un gen heterólogo, preferiblemente con un gen de quitinasa heterólogo, que no presenta secuencia terminal 3' correspondiente, y se transforma en un huésped vegetal. Dentro de esta planta huésped transformada se exprime un producto génico que se recluye de forma pretendida en la vacuola vegetal.
En particular se puede proceder a este respecto de modo que se prepara en primer lugar una biblioteca de genes a partir de material vegetal adecuado y se aísla a partir de dicha biblioteca de genes con ayuda de moléculas sonda un clon de ADNc de quitinasa que se adapte, que no presente extensión terminal 3'. Tras entrelazado de este clon de ADNc en un vector de clonación adecuado se puede modificar dicho clon mediante inserción o deleción de sitios de corte de restricción, de modo que pueda tener lugar una unión operable de la secuencia de "direccionamiento" de ADN según la invención con el gen de quitinasa heterólogo. La construcción acabada se puede clonar luego en un vector de expresión vegetal adecuado, en donde esto se consigue bajo controles regulatorios de las señales de expresión activas en plantas. Por ejemplo, se menciona en referencia a esto el vector de expresión vegetal pGY1, el cual contiene al promotor 35S del virus CaMV así como sus secuencias de terminación, sin limitar no obstante el objeto de la presente invención en modo alguno. Por supuesto se puede usar también cualquier otro vector adecuado y cualquiera de estos sitios.
De este modo es posible, por ejemplo, recluir de forma pretendida una quitinasa ácida de pepino que no posea "péptido señal" C-terminal alguno y que por tanto es segregada normalmente al espacio extracelular, mediante unión con una de las secuencias de "direccionamiento" descritas en la vacuola vegetal.
Un objeto más de la presente invención se refiere, por tanto, a la construcción de moléculas de ADN recombinantes, híbridas, las cuales contienen un ADN exprimible, pero en especial un gen de estructura, preferiblemente un gen de estructura heterólogo, en unión operable con la secuencia de ADN según la invención y con señales de expresión activas en células vegetales, como secuencias promotoras y de terminación, así como dado el caso con otras secuencias de codificación y/o de no codificación de la región 5' y/o 3'.
A este respecto es frecuentemente ventajoso incorporar entre la secuencia promotora y la secuencia de ADN que codifica a continuación una secuencia "líder", en donde la longitud de la secuencia "líder" se selecciona de modo que la distancia entre el promotor y la secuencia de ADN de "direccionamiento" sea óptima para la expresión del respectivo gen de estructura asociado.
Es además ventajoso si la molécula de ADN que se va a recluir contiene una secuencia o bien que se una en la región terminal 5' con una secuencia del tipo que codifique para un péptido señal N-terminal, capaz de actuar en la célula vegetal. Además de esto se puede presentar otros segmentos de secuencia en la molécula de ADN, los cuales codifican para fragmentos de péptido, que contribuyen en conjunto a mejorar la competencia para la captación en la vacuola como, por ejemplo, el fragmento de propéptido encontrado en la extensión N-terminal de la esporamina por parte de Matsuoka K y Nakamura K [Matsuoka K y Nakamura K (1991)].
Para el uso en el procedimiento según la invención son adecuados en primer lugar todos aquellos genes de estructura que conducen en las células vegetales transformadas así como en los tejidos desarrollados a partir de estas y especialmente en las plantas a un efecto protector como, por ejemplo, a una resistencia mayor frente a patógenos (por ejemplo frente a hongos fitopatógenos, bacterias, virus etc.); a una resistencia frente a productos químicos [por ejemplo, frente a herbicidas (como, por ejemplo, triazinas, sulfonilureas, imidazolinonas, triazolpirimidinas, bialafos, glifosato etc.), insecticidas u otros biocidas]; a una resistencia frente a inclemencias metereológicas adversas (por ejemplo frente a calor, frío, viento, condiciones del terreno desfavorables, humedad, sequía etc.).
Se resaltan especialmente en el marco de esta invención los genes de estructura que están relacionados con la lucha de patógenos y parásitos de plantas.
Se puede transmitir una resistencia frente a insectos por ejemplo mediante un gen que codifique un polipéptido, el cual es tóxico para insectos y/o sus larvas como, por ejemplo, la proteína cristalina de Bacillus thuringiensis.
Una segunda clase de proteínas que median en una resistencia frente a insectos son los inhibidores de la proteasa. Los inhibidores de la proteasa forman un constituyente habitual de estructuras de almacenamiento vegetales y están localizados, por tanto, normalmente en las vacuolas o bien en "cuerpos proteicos", Se podría demostrar que un inhibidor de la proteasa Bowman-Birk aislado de las habas de la soja y purificado inhibe la proteasis intestinal de larvas de Tenebrio [Birk y col. (1963)]. El gen, que codifica el inhibidor de la tripsina del guisante, está descrito por parte de Hilder y col. (1987).
En el marco de la presente invención se pueden usar a partir de ahora inhibidores de la proteasa discrecionales, independientemente de su origen [por ejemplo, inhibidores de la proteasa de fuentes no vegetales o sintéticas puras], de modo que estas se unan de forma operable con un péptido señal N-terminal, capaz de actuar en las células vegetales y con una secuencia de "direccionamiento" C-terminal. Esto lleva a que se recluyan los inhibidores de proteasa así modificados de forma pretendida en la vacuola, donde se pueden almacenar de forma óptima.
Un gen que codifica un inhibidor de proteasa puede llevarse a un vector adecuado con los controles de un promotor vegetal, especialmente de un promotor constitutivo como, por ejemplo, del promotor 35S del CaMV. Se puede obtener el gen, por ejemplo, la secuencia de codificación del inhibidor de proteasa de Bowman-Birk a partir de haba de la soja, con ayuda del procedimiento de clonación de ADNc. Otra posibilidad para la preparación de un inhibidor de proteasa consiste en su preparación sintética, en tanto este presente menos de 100 aminoácidos como, por ejemplo, el inhibidor de la tripsina de haba de lima. La secuencia de codificación se puede predecir mediante retraducción de la secuencia de aminoácidos. De forma adicional se incorporan en ambos extremos sitios de corte de restricción que son adecuados para el respectivo vector deseado. El gen sintetizado se prepara mediante síntesis de fragmentos de oligonucleótidos que se solapan de 30 a 60 pares de bases, de modo que en primer lugar sufre una reacción con quinasa, luego se une unos con otros [Maniatis y col. (1982)] y finalmente se clona en un vector adaptado. Con ayuda de la secuenciación de ADN se puede identificar un clon que presente la inserción en una orientación correcta. Para la reclusión en los protoplastos se puede usar ADN plásmido aislado.
Asimismo son de mencionar a este respecto enzimas hidrolíticos que están en la situación de efectuar la descomposición de las paredes celulares de patógenos vegetales por sí mismos o bien al menos colaborar a esto en combinación con otras sustancias en sentido de una sinergia.
La mayoría de los insectos poseen, por ejemplo, un esqueleto cuticular en el que están embebidas en una sustancia soporte micelas en capas de citita en forma de lamelas. También numerosos hongos patógenos para las plantas contienen quitina como constituyente integral de sus estructuras del micelio y esporas, de modo que, por ejemplo, los basidiomicetenos (ustilagináceas y uredíneas), ascomicetenos y Fungi Imperfecti (incluyendo Alternaria y Bipolaris, Exerophilum turcicum, Colletotricum, Gleocercospora y Cercospora). La quitinasa está en la situación de inhibir el crecimiento micelar de determinados patógenos in vitro. Un órgano o tejido vegetal que esté en la situación de exprimir la quitinasa constitutivamente o bien como respuesta a la penetración de un patógeno, podría por consiguiente protegerse frente al ataque de un gran número de distintos hongos.
Las quitinasas endógenas que se encuentran de forma natural en las plantas se presentan bien extracelularmente (quitinasas ácidas) o dentro de la vacuola (quitinasas básicas), de modo que en el marco de la presente invención son concebibles dos formas de proceder alternativas.
Por un lado es posible modificar con uso de una de las secuencias de ADN descritas, los genes de quitinasa ácidos, a los que les falta la secuencia responsable de la reclusión en la vacuola en el extremo C-terminal, de modo que el producto génico alcance de forma pretendida la vacuola, en donde las quitinasas básicas, endógenas disponibles de forma natural pueden proteger con su actividad frente a patógenos penetrantes.
Las dos variantes consisten en separar, a partir de un gen de quitinasa básico presente en la vacuola de forma natural, con ayuda de procedimientos genéticos la extensión C-terminal del marco de lectura abierto o bien inactivar al menos esta, por ejemplo, mediante inclusión de un codón de terminación directamente antes de la extensión C-terminal. Esto conduce a que el producto génico se segregue en el espacio intercelular donde puede entrar en contacto directo con el patógeno penetrante.
Un aspecto más de la presente revelación se refiere por consiguiente a moléculas de ADN recombinante que contienen un gen de estructura presente en la vacuola de forma natural en unión operable con señales de expresión activas en células vegetales, cuya secuencia de "direccionamiento" terminal 3' presente en el gen de forma natural deleciona o bien es inactivada de otra forma. Esta construcción da lugar en la transformación en un huésped vegetal a un producto de expresión que no contiene ya secuencia de señal terminal 3' funcional alguna y por tanto se segrega en el espacio extracelular de la planta.
De este modo se da a conocer, por ejemplo, una molécula de ADN recombinante que contiene un gen de quitinasa básico en unión operable con señales de expresión activas en células vegetales, cuya secuencia de "direccionamiento" terminal 3' presente de forma natural en el gen deleciona o bien es inactivada de otra forma y que, por tanto, da lugar en la transformación en un huésped vegetal a un producto de expresión que no contiene ya secuencia de señal C-terminal funcional alguna y por tanto se segrega en el espacio extracelular de la planta.
Otra enzima que juega presumiblemente un papel central en el mecanismo de defensa de la planta frente a patógenos, es la \beta-1,3-glucanasa, cuyo uso en combinación con una secuencia de ADN "diana" se describe asimismo.
Además se describe, por tanto, una molécula de ADN recombinante que contienen un gen de glucanasa básico en unión operable con señales de expresión activas en células vegetales, cuya secuencia de "direccionamiento" terminal 3' presente en el gen de forma natural deleciona o bien es inactivada de otra forma y que, por tanto, da lugar en la transformación en un huésped vegetal a un producto de expresión que no contiene ya secuencia de señal terminal 3' funcional alguna y por tanto se segrega en el espacio extracelular de la planta.
Un objeto más de esta invención se refiere a la unión de las secuencias de "direccionamiento" descritas con los denominados péptidos líticos ["lytic peptids"]. A este respecto se trata de péptidos naturales o sintéticos con actividad antipatógena que están en la situación de cruzar la membrana celular de patógenos, para lisar o dañar de alguna otra forma. Representantes de tales péptidos líticos, que pueden ser de uso en el marco de la presente invención, son conocidos tanto de fuentes animales [incluyendo insectos] como también de fuentes animales y microbianas y comprenden, por ejemplo, la defensina, cercopina, tionina, melitina de mamíferos, la defensina, magainina, atacina, dipterina, sapecina, caerulina, xenopsina o insectos así como híbridos de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de distintos péptidos líticos se dan en las siguientes publicaciones: WO 98/11291; WO 86/04356; WO 88/05826; US 4.810.777; WO 89/04371 así como por parte de Bohlmann y col. (1988), Selsted y Harwig (1987) y Terry y col. (1988).
Bajo péptidos líticos se entiende en el sentido más amplio también compuestos cuya capacidad de penetración, lisis o daño de la membrana celular se base en una actividad enzimática como, por ejemplo, lisozimas y fosfolipasas.
Además se describe una expresión combinada de péptidos hidrolíticos y líticos con reclusión intencionada subsiguiente en la vacuola o dado el caso en el espacio extracelular. Además de esto también se concibe un uso recíproco de la expresión y aplicación exógena, en donde se tienen en cuenta especialmente los péptidos líticos para estos últimos fines de uso, en combinación con los coadyuvantes y/o aditivos usados normalmente para este fin.
También para una producción de compuestos deseados y usuales en las células vegetales como tales o como constituyente de una unidad orgánica superior como, por ejemplo, un tejido, callo, órgano, embrión o una planta completa, se pueden usar las secuencias de ADN de "direccionamiento" de forma ideal.
Los genes que pueden ser de uso igualmente en el marco de la presente invención comprenden aquellos que conducen, por ejemplo, a una formación mayor de sustancias reserva o de almacenamiento en hojas, semillas, brotes, raíces, troncos etc. o en los "cuerpos proteicos" de semillas. En lo referente a las sustancias deseadas que se pueden producir por parte de plantas transgénicas se tienen en cuenta, por ejemplo, proteínas, hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, alcaloides, flavinas, sustancias olorosas y colorantes, grasas etc.
Igualmente se pueden asociar genes de estructura con la secuencia de ADN según la invención que codifican las sustancias huésped farmacéuticamente aceptables como, por ejemplo, hormonas, moduladores inmunológicos y otras sustancias fisiológicamente activas.
A los genes que se pueden considerar en el marco de esta invención pertenecen, por tanto, genes conocidos, sin estar limitados no obstante a estos, por ejemplo, genes específicos de plantas como el gen de la ceína del maíz, el gen de la avenina de la avena, el gen de la glutelina del arroz, etc., genes específicos de mamíferos como el gen de la insulina, el gen de la somatostatina, el gen de la interleucina, el gen t-PA etc., o bien genes de origen microbiano como el gen NPT II etc., así como genes sintéticos como el gen de la insulina etc.
Además de genes de estructura de procedencia natural que codifican una propiedad usual y deseada, se pueden usar en el marco de esta invención también genes que se modificaron previamente con ayuda de procedimientos químicos o de ingeniería genética.
Además están comprendidos por el amplio concepto de la presente invención también aquellos genes que se preparan completamente mediante síntesis química. Como genes o secuencias de ADN que pueden ser de uso en el marco de la presente invención, se consideran gen(es) o ADN tanto homólogos como también heterólogos así como gen(es) o ADN sintéticos según la definición hecha en el marco de la presente invención. Como ejemplo de un gen sintético es de mencionar a este respecto el gen de la insulina.
Las secuencias de ADN de utilidad en el marco de la presente invención se pueden construir exclusivamente por ADNc o ADN sintético genómico. Otra posibilidad consiste en la construcción de una secuencia de ADN híbrida que consiste tanto en ADNc como también en ADN genómico y/o ADN sintético.
En este caso el ADNc puede provenir del mismo gen como el ADN genómico o bien, tanto el ADNc como también el ADN genómico pueden provenir de distintos genes. En cada caso pueden estar preparados tanto el ADN genómico y/o el ADNc, cada uno de por sí, a partir de genes idénticos o distintos.
Si la proporción de secuencia de ADN contiene más de un gen, estos genes pueden provenir de uno y del mismo organismo, de varios organismos, que pertenecen a distintas cepas o variedades del mismo tipo o distintas especies del mismo género, o bien de organismos que pertenecen a más de un género de la misma o de otra unidad taxonométrica (riqueza).
Para asegurar la expresión de dichos genes de estructura en las células vegetales es ventajoso si las secuencias de gen de codificación se unen en primer lugar de forma operable con las secuencias de expresión capaces de actuar en las células vegetales.
Las construcciones de gen híbrido en el marco de la presente invención contienen por consiguiente además de la secuencia de ADN de "direccionamiento" uno o varios gen(es) de estructura así como señales de expresión en unión operable, que entrelazan conjuntamente tanto las secuencias promotoras y de terminación como también otras secuencias regulatorias de las regiones no trasladadas 3' y 5'.
Cada promotor y cada terminador que esté en la situación de provocar una inducción de la expresión de una secuencia de ADN de codificación (gen de estructura), se puede usar como constituyente o secuencia de gen híbrido. Son especialmente adecuadas las señales de expresión que provienen de genes de plantas o de virus de plantas. Son ejemplos de promotores y terminadores adecuados, por ejemplo, aquellos genes del virus Cauliflower Mosaik (CaMV) o bien secuencias de ADN homólogas que presentan también las propiedades características de las señales de expresión mencionadas. Asimismo son adecuadas señales de expresión bacterianas, pero en especial las señales de expresión de genes de nopalina-sintasa (nos) o de genes de octopina-sintasa (ocs) a partir de plásticos Ti de Agrobacterium tumefaciens.
Son preferidas en el marco de esta invención las señales de expresión 35S y 19S del genoma del CaMV o sus homólogos que se pueden aislar de dicho genoma con ayuda de procedimientos molecularbiológicos como describen, por ejemplo, Maniatis y col. (1982), y se pueden unir con la secuencia de ADN de codificación.
Bajo homólogos de las señales de expresión 35S y 19S se entienden en el marco de esta invención secuencias que son a pesar de la pequeña diferencia de secuencia esencialmente homólogas a las secuencias de partida y que cumplen como estas con la misma función.
Como material de partida para las secuencias de control de transcripción 35S se puede usar según la invención, por ejemplo, el fragmento ScaI de la cepa "S" del CaMV, que comprende los nucleótidos 6808 - 7632 de la carta de genes [Frank G y col. (1980)].
La región del promotor 19S y no trasladada 5' se encuentra sobre un fragmento del genoma entre el sitio de PstI (posición 5386) y el sitio de HindIII (posición 5850) de la carta de genes del CaMV [Hohn y col. (1982)]. La región del terminador correspondiente y no trasladada 3' se encuentra sobre un fragmento EcoRV/BgIII entre la posición 7342 y 7643 del genoma del CaMV.
Además son preferidos en el marco de esta invención las señales de expresión de la cepa CM1841 del CaMV, cuya secuencia de nucleótidos completa está descrita por parte de Gardner RC y col. (1981).
Un representan efectivo adicional de un promotor vegetal, que puede se de uso, es un promotor vegetal de sobreproducción. Este tipo de promotores debería, en tanto esté unido de modo operable con la secuencia de gen, que codifica un producto génico deseado, estar en la situación de mediar la expresión de dicha secuencia de gen.
Los promotores de plantas de sobreproducción, que pueden considerarse de uso en el marco de la presente invención, incluyen el promotor de la pequeña subunidad (small subunit; ss) de la ribulosa-1,5-bisfosfato-carboxilasa de las habas de soja así como el promotor de la proteína de unión clorofila-a/b. Estos dos promotores son conocidos porque son inducidos en células vegetales eucarióticas mediante luz [véase, por ejemplo, Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspectiva, Cashmore A (1983)].
Un objeto más de la presente invención se refiere por consiguiente a moléculas de ADN recombinante que contienen una construcción genética híbrida, en la que una secuencia de ADN está unida de forma operable con un ADN exprimible y con señales de expresión activas en las células vegetales así como, dado el caso, con otras secuencias transcritas y/o no transcritas de la región 5' y/o 3', de modo que en la transformación en un huésped vegetal se llega a una reclusión pretendida de los productos de expresión en la vacuola vegetal.
Son especialmente preferidas las moléculas de ADN recombinante que contienen una construcción genética híbrida, en la que una secuencia de ADN "diana" está asociada de forma operable con un gen de estructura, que confiere a las células vegetales transformadas así como a los tejidos desarrollados a partir de las mismas y especialmente a las plantas, un efecto protector frente a patógenoss, productos químicos así como inclemencias metereológicas adversas.
Son muy especialmente preferidos en el marco de esta invención las moléculas de ADN recombinante que contienen una construcción genética híbrida, en la que la secuencia de ADN de "direccionamiento" está asociada de forma operable con un gen de estructura que exprime la quitinasa, pero especialmente la quitinasa ácida, o glucanasa, pero especialmente la glucanasa ácida en células vegetales.
Asimismo están comprendidas por la presente invención las moléculas de ADN recombinante que contienen una construcción genética híbrida, en la que la secuencia de ADN de "direccionamiento" está asociada de forma operable con un gen de estructura que en la expresión en las células vegetales transformadas como tales o como constituyente de una unidad orgánica superior seleccionada del grupo constituido por un tejido, órgano, callo, embrión o una planta completa, conduce a una reclusión de compuestos deseados y usuales en la vacuola vegetal.
Además se describen moléculas de ADN recombinante que contienen una construcción genética híbrida, en la que un gen, que codifica una molécula de proteína presente en la vacuola de forma natural, pero preferiblemente un gen de quitinasa básico, y muy en especial preferiblemente un gen de quitinasa básico de plantas de tabaco o de pepino, está modificado de modo que se segrega en el espacio extracelular. En particular se puede conseguir de este modo que la extensión C-terminal presente de forma natural en dichos genes, pero especialmente en genes de quitinasa, que contiene las secuencias de ADN responsables de la reclusión en la vacuola, se separe o inactive con ayuda de procedimientos de ingeniería genética, por ejemplo mediante inclusión de un codón de terminación inmediatamente antes de la extensión C-terminal.
Otras secuencias de ADN regulatorias que se pueden usar para la construcción de genes híbridos comprenden, por ejemplo, secuencias, que están en la situación de regular la transcripción de una secuencia de ADN asociada en tejidos vegetales en el sentido de una inducción o represión.
De este modo hay, por ejemplo, determinados genes vegetales, de los cuales es conocido que se inducen mediante distintos factores internos y externos como hormonas vegetales, choque térmico, productos químicos, patógenos, déficit de oxígeno, luz, estrés etc.
Como un ejemplo de una regulación del gen mediante una hormona vegetal se ha de mencionar aquí el ácido abscisínico (ABS), del que se sabe que induce el exceso que tiene lugar durante la fase embrional posterior en ARNm en el algodón. Otro ejemplo proporciona el ácido gibberélico (GA3), que induce la transcripción de la malatsintasa en semillas de ricino así como en las capas de aleurona de isocencimas de la a-amilasa de la cebada.
La actividad de la glucanasa y quitinasa en hojas de habas se puede aumentar de forma destacada mediante el tratamiento con el etileno de la hormona del estrés. Para la quitinasa se controla este efecto de inducción sobre el promotor del gen de quitinasa, lo que se podría mostrar mediante estudios de gen reportero con uso de un promotor del gen de la quitinasa de habas (Phaseolus vulgaris).
La regulación de genes de proteína sensibles a choque térmico del haba de la soja se estudió con detalle. Un tratamiento de varias horas de las plantas a una temperatura de 40ºC da lugar a la síntesis de novo de las denominadas proteínas de choque térmico. Se aislaron entre tanto varios de estos genes y se analizó su regulación individualmente. La expresión de estos genes se controla en primer lugar en la plenitud de la transcripción. Se fusiona, por ejemplo, el promotor del gen hps70 con el gen de la neomicinfosfotransferasa II (NPT II), de modo que de esta forma se puede inducir el gen híbrido generado mediante un choque térmico [Spena y col., 1985)].
Otra clase de genes inducibles en plantas contiene los genes regulados por luz, especialmente el gen codificado nuclear de la subunidad pequeña de la ribulosa- 1,5-bisfofatocarboxilasa (RUBISCO). Morelli y col. (1985) han demostrado que la secuencia de flanqueo 5' de un gen RUBISCO del guisante está en la situación de transmitir la inducibilidad por luz a un gen reportero, en tanto este está unido en forma híbrida con esta secuencia. Esta observación se podría extender también a otros genes inducidos por luz como, por ejemplo, la proteína de unión clorofila-a/b.
Los genes del alcoholdeshidrogenada (genes adh) del maíz fueron objeto de estudios intensivos. El gen adh1-s del maíz se aisló y se comprobó que una parte del ADN de flanqueo 5' está en la situación de inducir la expresión de un gen reportero híbrido (por ejemplo, cloramfenicolacetiltransferasa, CAT), cuando se interrumpieron las condiciones anaerobias en tejidos temporalmente transformados [Howard y col (1987)].
Un grupo más de secuencias de ADN regulables se refiere a secuencias químicamente regulables que están presentes, por ejemplo, en los genes de proteínas relacionadas con la patogénesis PR ("pathogenesis related proteine") del tabaco y son inducibles con ayuda de reguladores químicos.
Las secuencias de ADN regulables mencionadas a modo de ejemplo pueden ser tanto de origen natural como también sintético o bien estar constituidas por una mezcla de secuencias de ADN naturales y sintéticas.
Es además ventajoso si el ADN exprimible, pero especialmente el gen de estructura que se va a recluir, contiene una secuencia o bien se una en la región terminal 5' con una secuencia del tipo que codifique para un péptido señal N-terminal capaz de actuar en la célula vegetal. A este respecto se trata de una señal de transporte que se ha de encontrar en el extremo N-terminal de proteínas, que se transporta por el sistema de endomembrana. Esta secuencia de señal proporciona que dichas proteínas alcancen en primer lugar el retículo endoplasmático, donde el péptido señal se escinde proteolíticamente de la proteína precursora, en tanto haya cumplido su función. Correspondientemente a su función específica se conservó en gran medida este tipo de secuencia del péptido señal en el transcurso de la evolución en todas las células vivas, independientemente de si se trata de bacterias, levaduras, hongos, animales o plantas.
Además de esto se pueden presentar otros segmentos de secuencia en la molécula de ADN, los cuales codifican para fragmentos de péptidos, que contribuyen a mejorar en conjunto la competencia por una captación en la vacuola como, por ejemplo, el fragmento de propéptido encontrado en la extensión N-terminal de la esporamina por parte de Matsuoka K y Nakamura K [Matsuoka K y NakamuraK (1991)].
Además se describen por consiguiente construcciones genéticas híbridas que contienen junto con la secuencia de "direccionamiento", que están presentes en unión operable con un gen de estructura o secuencias de ADN de tipo similar, otros segmentos de secuencia de ADN regulatorios, que hacen posible, por ejemplo, una inducción o represión pretendida de la expresión del gen.
Los distintos segmentos de secuencia se pueden unir con ayuda de procedimientos conocidos unos con otros para dar una secuencia de ADN de codificación completa. Los procedimientos adecuados incluyen, por ejemplo, la recombinación in vivo de secuencias de ADN que presentan segmentos homólogos así como la unión in vitro de fragmentos de restricción.
Como vectores de clonación se usa en general vectores de plásmido o de virus (bacteriófagos) con secuencias de replicación y control que provienen de especies que son compatibles con las células huésped.
El vector de clonación porta por lo general un origen de replicación, especialmente un origen de replicación que está capacitado para actuar en E. coli, en Agrobacterium o en ambos, además los genes específicos, que conducen a características de selección fenotípicas en las células huésped transformadas, especialmente a resistencias frente a antibióticos o frente a determinados herbicidas. Los vectores transformados se pueden seleccionar en función de este marcador fenotípico según una transformación en una célula huésped.
Los marcadores fenotípicos seleccionables, que puede ser de uso en el marco de esta invención, comprenden por ejemplo resistencias frente a ampicilina, tetraciclina, higromicina, canamicina, metotrexato, G418 y neomicina, sin que represente esta enumeración ejemplo una limitación del objeto de la invención.
Como células huésped se consideran en el marco de esta invención las procariotas, incluyendo huéspedes bacterianos como, por ejemplo, A. Tumefaciens, E. coli, S. Typhimurium y Serratia marcescens, así como cianobacterias. Se pueden usar además también huéspedes eucarióticos como levaduras, hongos formadores de micelas y células vegetales en el marco de esta invención.
El entrelazado de la construcción de gen híbrido según la invención en un vector de clonación adecuado tiene lugar con ayuda de procedimientos convencionales como describen, por ejemplo, Maniatis y col. (1982).
A este respecto se recorta por lo general el vector y la secuencia de ADN que se va a entrelazar en primer lugar con enzimas de restricción adecuados. Enzimas de restricción adecuados son, por ejemplo, aquellos que dan fragmentos con extremos lisos como, por ejemplo, SmaI, HpaI y EcoRV o también en enzimas que forman extremos cohesivos como, por ejemplo, EcoRI, SacI y BamHI.
Tanto los fragmentos con extremos lisos como también aquellos con extremos cohesivos que son complementarios unos con otros, se pueden unir con ayuda de ligasas de ADN adecuadas de nuevo en una molécula de ADN propiamente ininterrumpida.
Los extremos lisos se pueden preparar también mediante tratamiento de fragmentos de ADN, que presentan extremos cohesivos que penden, con el fragmento de Klenow de la polimerasa de ADN de E. coli mediante relleno de los huecos con los nucleótidos complementarios correspondientes.
Por otra parte los extremos cohesivos se preparan también artificialmente, por ejemplo, mediante añadidura de colas homopoliméricas complementarias en los extremos de una secuencia de ADN deseada así como de la molécula del vector recortado con uso de una desoxinucleotidil-transferasa terminal o bien mediante añadidura de secuencias de oligonucleótidos sintéticas (engarces), que portan un sitio de corte de restricción y cortes consiguiente con el enzima correspondiente.
En el marco de la presente invención se unen en la construcción de los mutantes de quinasa distintas partes del clon de la quitinasa usadas respectivamente unas con otras. Para poder conseguir este fin estas partes deben ser compatibles, es decir, se deben incorporar sitios de corte de restricción adecuados en las distintas secuencias. En una forma de realización específica de esta invención se usan, por tanto, preferiblemente los sitios de corte de restricción enumerados a continuación, que conducen todos a los mismos extremos cohesivos:
BamHI [G/GATCC]
BcII [T/GATCA]
BgIII [A/GATCT]
El marco de lectura se selecciona preferiblemente de modo que GAT actúa como codón para el aspartato.
Los vectores de clonación y la célula huésped transformada con estos vectores se usan por lo general para aumentar el número de copias de las construcciones ahí clonadas. Con un número de copias mayor es posible aislar el vector que porta la construcción de gen híbrido y, por ejemplo, para preparar la reclusión de la secuencia de gen híbrido en la célula vegetal.
En una etapa más de procedimiento más se usan estos plásmidos para recluir el gen de estructura que codifica un producto génico deseado o bien secuencias de ADN que no codifican con función regulatoria en las células vegetales y, dado el caso, integrar en el genoma de la planta.
Además se describe la preparación de células receptoras vegetales, que contienen dicho gen de estructura o genes o fragmentos de genes deseados de este tipo o secuencias de ADN usuales de este tipo incluidas en su genoma.
La reclusión de la construcción genética híbrida tiene lugar preferiblemente en protoplastos vegetales con ayuda de procedimientos de transferencia de gen conocidos.
Existen entre tanto un conjunto de procedimientos muy eficientes para la introducción de ADN en células vegetales, basados en el uso de vectores de transferencia de gen o en procedimientos de transferencia de gen directos.
Una posibilidad consiste, por ejemplo, en que se ponen en contacto células vegetales con virus o con Agrobacterium. Esto se puede realizar mediante infección de células vegetales sensibles o mediante co-cultivo de protoplastos que se derivan de células vegetales. Asimismo el virus Cauliflower Mosaik (CaMV) se puede usar en el marco de esta invención como vector para la reclusión de la construcción genética híbrida en la planta. Todo el genoma de ADN viral del CaMV se integra en un plásmido maduro bacteriano con formación de una molécula de ADN recombinante que se puede multiplicar en bacterias. Tras la clonación consiguiente el plásmido recombinante se puede escindir con ayuda de enzimas de restricción bien de forma ocasional o en sitios completamente específicos no esenciales dentro de la parte viral del plásmido recombinante, por ejemplo, dentro del gen, que codifica la transmitabilidad del virus mediante pulgones, y se clona la construcción de gen híbrido en este sitio de corte.
Un pequeño oligonucleótido, un denominado engarce, que posee algunos sitios de reconocimiento de restricción específicos, se puede integrar igualmente. El plásmido recombinante así modificado se clona de nuevo y mediante entrelazado de la construcción de gen híbrido se modifica de nuevo en un sitio de restricción una sola vez.
La proporción viral modificada del plásmido recombinante se puede recortar del plásmido padre bacteriano y se usa para la inolución de las células vegetales o de las plantas completas.
Otro procedimiento para la reclusión de la construcción de gen híbrido en la célula se sirve de la infección de la célula vegetal con Agrobacterium tumefaciens y/o Agrobacterium rhizogenes, que está transformada con dicha construcción de gen. Las células vegetales transgénicas se cultivan a continuación en condiciones de cultivo adecuadas, conocidas por el especialista en la técnica, de modo que forman retoños y raíces y finalmente dan lugar a plantas completas.
Una posibilidad más para la transformación de materiales vegetales consiste en una infección mixta con uso tanto de Agrobacterium rhizogenes como también de Agrobacterium tumefaciens transformada como se describe por parte de Petit y col. (1986) para la transformación de zanahorias. La relación de mezcla debe determinarse a este respecto una después de otra de modo que las colonias de raicillas formadas en base a la transformación con A. Rhizogenes contienen también una alta proporción en plásmidos Ti de A. tumefaciens. Esto se puede conseguir, por ejemplo, de modo que se aplica A. rhizogenes y A. Tumefaciens en una relación de mezcla de 1:1 a 1:100, pero preferiblemente en una relación de mezcla de 1:10 de forma conocida junto al material vegetal. Las plantas transgénicas se cultivan a continuación en condiciones de cultivo adecuadas, conocidas por el especialista en la técnica, de modo que forman retoños y raíces y finalmente dan lugar a plantas completas.
La mezcla de ambas especies de Agrobacterium tiene lugar de forma ventajosa poco antes de la inoculación propia del material vegetal que se va a transformar.
La construcción de gen híbrido según la invención se transfiere consiguientemente, por ejemplo, con ayuda del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o del plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes en células vegetales adecuadas. El plásmido Ti o el plásmido Ri se transmite en el transcurso de la infección por Agrobacterium a la planta y se integra de forma estable en el genoma de la planta.
Tanto los plásmidos Ti como también los plásmidos Ti poseen dos regiones que son esenciales para la preparación de células transformadas. Una des estas, la región ADN de transferencia (ADN-T), se transmite a la planta y conduce a la inducción de tumores. La otra, la región que facilita la virulencia (vir), no es sólo esencial para la formación, sino para el mantenimiento de los tumores.
La región de ADN de transferencia se puede agrandar en cuanto a sus dimensiones mediante la incorporación de la construcción de gen híbrido, sin que se vea perjudicada la capacidad de transferencia. Mediante la separación del gen que provoca el tumor y mediante la incorporación de un marcador seleccionable se puede usar el plásmido Ti o Ri modificado como vector para la transferencia de la construcción de gen según la invención en una célula vegetal adecuada.
La región vir realiza la transferencia de la región ADN-T de Agrobacterium sobre el genoma de la célula vegetal, independientemente de si la región ADN-T y la región vir se presentan sobre el mismo vector o sobre vectores distintos dentro de la misma célula de Agrobacterium. Una región vir induce sobre un cromosoma igualmente la transferencia del ADN-T de un vector en una célula vegetal.
Por tanto, en el marco de esta invención se usa preferiblemente un sistema para la transferencia de una región ADN-T de Agrobacterium en células vegetales, en el que la región vir y la región ADN-T se encuentran sobre distintos vectores. Un sistema de este tipo es conocido con el término "sistema vector binario" y el vector que contiene el ADN-T se designa correspondientemente como un "vector binario".
Cada vector que contiene ADN-T que es transferible a las células vegetales y que permite la selección de células transformadas, es adecuado para el uso en el marco de esta invención.
Es especialmente preferido en el marco de esta invención un vector "de transbordo", que contiene la construcción genética híbrida según la invención clonada entre el engarce (LB) y la secuencia límite derecha y está en la situación de replicarse de forma estable tanto en E. coli como también en A. tumefaciens.
Mediante uso de técnicas de transformación de nuevo desarrollo se transforman entretanto in vitro en principio también aquellas especies de plantas que no son plantas huésped para Agrobacterium. De esta forma las plantas monocotíleas, especialmente las de tipo cereal así como distintas hierbas, no son huéspedes naturales para Agrobacterium.
A saber, hay múltiples indicios de que también las monocotiledóneas se pueden transformar con Agrobacterium, de modo que con uso de nuevos preparados experimentales que ya están disponibles, tiene lugar también una transformación en especies cereales y hierbas [Grimsley NH y col. (1987)].
Es preferido en el marco de esta invención la denominada transformación de discos de hoja ("Leaf Disk Transformation") con uso de Agrobacterium [Horsch y col (1985)]. Los discos de hojas estériles de una planta objetivo adecuada se incuban con células de Agrobacterium, que contienen una de las construcciones de gen híbridos según la invención, y a continuación se llevan a o sobre un medio de alimentación adecuado. Son especialmente adecuados y, por tanto, preferidos en el marco de esta invención los medios LS, que se inmovilizan con adición de ágar y los que están enriquecidos con uno o varios de los reguladores de crecimiento vegetal normalmente usados, pero especialmente aquellos seleccionados del grupo de las auxinas constituido por ácido a-naftilacético, picloram, ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido indol-3-butírico, ácido indol-3-láctico, ácido indol-3-succínico, ácido indol-3-acético, ácido p-clorofenoxiacético así como del grupo de las citoquininas constituido por quinetina, 6-benciladenina, 2-isopenteniladenina y zeatina. La concentración preferida de auxinas y citoquinas se encuentra en el intervalo de 0,1 mg/l y 10 mg/l.
Después de incubación de varios días, preferiblemente tras incubación de 2 a 3 días a una temperatura de 20ºC a 40ºC, preferiblemente de 23ºC a 35ºC y muy especialmente preferida de 25ºC y luz difusa se transfieren los discos de hoja para inducción de brotes a un medio adecuado. Es especialmente preferido para la selección de los transformados un medio LS que no contenga auxina pero si una citoquinina, y se adiciona una sustancia selectiva. Los cultivos se mantienen en luz y se transfieren a medio fresco en espacios de tiempo adecuados, pero preferiblemente en periodos de una semana. Los brotes verdes que se desarrollan se cortan y se cultivan de nuevo en un medio que induzca el prendimiento de los brotes. Es especialmente preferido en el marco de esta invención un medio LS que no contenga auxina alguna ni citoquinina alguna para la selección de los transformantes pero con adición de una sustancia
selectiva.
Además de la transformación mediada por Agrobacterium son de utilidad en el marco de esta invención para la reclusión de las construcciones de gen según la invención en material vegetal también los procedimientos de transformación directos.
De esta forma el material genético, que está contenido en un vector, se puede recluir, por ejemplo, con ayuda de operaciones físicamente puras directamente en la célula vegetal como, por ejemplo, mediante microinyección con uso de micropipetas de extracción finas [Neuhaus y col. (1987)] o mediante bombardeo de las células con microproyectiles que están recubiertos con el ADN de transformación ["Microprojectile Bombardment"; Wang Y-C y col. (1985)].
Otras posibilidades para la transferencia directa de material genético en la célula vegetal consisten en el tratamiento de protoplastos con operaciones de procedimiento de modificación de la membrana plasmática como, por ejemplo, el tratamiento con polietilenglicol, el tratamiento por choque térmico o la electroporación así como una combinación de estas operaciones de procedimiento [Shillito y col. (1985)].
En la técnica de electroporación en los protoplastos vegetales junto con plásmidos, que contienen la construcción de gen híbrido, se interrumpen los impulsos eléctricos de campo fuerte. Esto conduce a un aumento de la permeabilidad reversible de las biomembranas y hace posible con ello la reclusión de los plásmidos. Los protoplastos vegetales electroporizados renuevan su pared celular, se dividen y forman tejido de callo. La selección de las células vegetales transformadas puede tener lugar con ayuda de los marcadores fenotípicos previamente descritos.
Un procedimiento más para la introducción directa de material genético en células vegetales, que se base en operaciones de procedimiento químicamente puras y haga posible una realización muy eficiente y rápida de la transformación se describe por parte de Negrutiu I y col. (1987) así como por parte de Goodall y col.
Asimismo es adecuado para la transformación de material vegetal la transferencia del gen directa con uso de co-transformación (Schocher RJ y col. 1986).
En cuanto a la co-transformación se trata de un procedimiento que se basa en la captación e integración simultánea de distintas moléculas de ADN (gen no seleccionable y seleccionable) en el genoma vegetal, y de ahí hacer posible el hallazgo de células, que estén transformadas con genes no seleccionables.
La enumeración previamente dada a modo de ejemplo de posibles procedimientos de transformación no constituye en totalidad reivindicación alguna y no ha de limitar en modo alguno el objeto de la invención.
Aquellos clones de célula que contienen incorporada en su genoma la construcción de gen híbrido se seleccionan con ayuda de procedimientos de selección, cribado y comprobación usuales y se usan para la regeneración de plantas transgénicas.
La regeneración de protoplastos mantenidos en cultivo para dar plantas completas se describe, por ejemplo, por parte de Potrykus I y Shillito RD (1986).
Los procedimientos de regeneración se diferencian de unas especies de plantas a otras especies de plantas. Pero por lo general se estimulan los protoplastos en un medio de cultivo conocido para la división y formación de pared celular. Se generan finalmente cultivos de callos, que se pueden inducir mediante tratamiento con sustancias activas determinadas como, por ejemplo, auxinas y citoquininas para la formación de raíces o brotes.
Las plantas así obtenidas se pueden transplantar a continuación a tierra y se cultivan de nuevo en la misma forma que los arbolitos normales.
Una regeneración eficiente depende en primer lugar del medio, del genotipo y del precedente del cultivo. Controlando suficientemente estas tres variables la regeneración es entonces completamente reproducible y repetible.
Las plantas transgénicas regeneradas que contienen como constituyente integral del genoma vegetal un gen de estructura exprimible en la célula vegetal de la construcción de gen híbrido previamente descrita, puede multiplicarse vegetativamente, preferiblemente en forma de cultivos de brotes estériles.
La integración estable de un gen exprimible capaz de actuar en el genoma vegetal de plantas transgénicas regeneradas se verifica en función de la estabilidad mitótica del gen integrado así como en base al comportamiento como rasgo de Mendel durante la meiosis y con uso del análisis "Southern blot" (Southern EM, 1975).
Igualmente está comprendido por el amplio concepto de esta invención por consiguiente el material vegetal transgénico, seleccionado del grupo constituido por protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, polen, células huevo, cigotos etc. así como especialmente también plantas completas, fértiles, que se han transformado con ayuda de procedimientos previamente descritos y contiene el ADN recombinante según la invención en forma exprimible. Asimismo se describen procedimientos para la preparación de dicho material vegetal transgénico.
El procedimiento para la preparación de material vegetal transformado que contiene un producto génico, que se recluye de forma pretendida en la vacuola vegetal, se caracteriza esencialmente porque:
(a) se aísla en primer lugar la secuencia de ADN responsable de la reclusión pretendida en la vacuola a partir de una fuente adecuada ose sintetiza esta con ayuda de procedimientos conocidos;
(b) se inserta dicha secuencia de ADN de forma operable en el extremo terminal 3' de una secuencia de ADN exprimible discrecional;
(c) se clona la construcción acabada en un vector de expresión vegetal con los controles de las señales de expresión activas en plantas; y
(d) se transforma el vector de expresión con ayuda de procedimientos conocidos en material vegetal y ahí se exprime.
En cuanto al ADN que se va a exprimir no se trata de un gen de estructura que codifica ya de forma natural un péptido señal N-terminal, de modo que es ventajoso insertar adicionalmente una secuencia de ADN que codifica un péptido señal de este tipo, operable en la región terminal 5' del ADN que se va a exprimir.
Asimismo se describe un procedimiento un procedimiento para la preparación de material vegetal transformado, que contiene un producto génico, que se segrega de forma pretendida al espacio extracelular, que se caracteriza esencialmente porque:
(a) se aísla una secuencia de ADN que codifica un producto génico de este tipo;
(b) se separa la secuencia de "direccionamiento" responsable de la reclusión en el respectivo compartimento celular del extremo C-terminal;
(c) se entrelaza dicha secuencia de ADN mencionada en un vector de expresión vegetal adecuado; y
(d) se transforma la construcción acabada en material vegetal.
Son preferidos en el marco de esta invención las plantas transgénicas, incluyendo su descendencia sexual y asexual, que son regenerables a partir de material vegetal seleccionado del grupo constituido por protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, polen, células huevo, cigotos etc. y que contienen una de las moléculas de ADN recombinante según la invención.
Asimismo son preferidas plantas transgénicas incluyendo su descendencia sexual y asexual que presentan frente al tipo salvaje un contenido en proteína significativamente elevado en la vacuola vegetal y/o en el espacio extracelular.
Son especialmente preferidas plantas transgénicas incluyendo su descendencia sexual y asexual que presentan frente al tipo salvaje un contenido en quitinasa significativamente elevado en la vacuola vegetal.
Asimismo son especialmente preferidas plantas transgénicas incluyendo su descendencia sexual y asexual que presentan frente al tipo salvaje un contenido en quitinasa significativamente elevado en el espacio extracelular.
Bajo el término de descendencia sexual y/o asexual de plantas transgénicas se encuentran según la definición en el marco de esta invención también todos los mutantes y variantes que se pueden conseguir con ayuda de procedimientos conocidos como, por ejemplo, mediante fusiones celulares o selección de mutantes, y los cuales presentan las propiedades características de la planta de partida transformada, así como productos cruzados y de fusión completos con el material vegetal transformado.
Un objeto más de esta invención se refiere al producto de multiplicación de plantas transgénicas.
Con producto de multiplicación de plantas transgénicas se debe entender en el marco de esta invención cada material vegetal discrecional que se multiplica de forma sexual o asexual o in-vivo o in-vitro. Como especialmente preferidos se contemplan en el marco de esta invención en primer lugar protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, polen, células huevo, cigotos, así como cualquier otro producto de multiplicación discrecional que se pueda obtener de plantas transgénicas.
Son igualmente objeto de esta invención partes de plantas, como por ejemplo flores, tronco, frutas, hojas, raíces que provienen de plantas transgénicas o de su descendencia, que se han transformado previamente con ayuda del procedimiento descrito y que por consiguiente están constituidas al menos en parte de células transgénicas.
El procedimiento según la invención es adecuado para la transformación de todas las plantas, especialmente aquellas del grupo sistemático Angiospermae y Gymnospermae.
En las Gymnospermae son de especial interés las plantas de la clase Coniferae.
En las Angiospermae son además de los árboles de fronda y los arbustos de especial interés plantas de la familia Solanaceae, Cruciferae, Compositae, Liliaceae, Vitaceae, Chenopodiaceae, Rutaceae, Alliaceae, Amaryllidaceae, Asparagaceae, Orchidaceae, Palmae, Bromeliaceae, Rubiaceae, Theaceae, Musaceae, Malvaceae o Gramineae y el orden de Leuminosae y en esta invención sobre todo la familia Papilionaceae. Son preferidos los representantes de las familias Solanaceae, Cruciferae y Gramineae.
En los cultivos objetivo en el marco de la presente invención se consideran, por ejemplo, también aquellos seleccionados del grupo: Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Gossypium, Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Ipomoea, Passiflora, Cyclamen, Malus, Prunas, Rosa, Rubus, Populus, Santalum, Allium, Lilium, Narcissus, Ananas, Arachis, Phaseolus y Pisum.
En base a nuevos desarrollos en el campo del cultivo in vitro de plantas, particularmente en el campo de la regeneración de plantas, es entre tanto posible, también en los representantes de la familia de las Gramineae, partiendo de protoplastos vegetales, regenerar plantas completas. Ejemplos de experimentos de regeneración llevados a cabo de forma exitosa en Gramineae se describen, entre otros, por parte de Yamada Y. y col (1986) para protoplastos del arroz, por parte de Rhodes y col. (1988) y Shillito RD y col. (1989) para protoplastos de maíz así como por parte de Horn y col. (1988) para protoplastos de Dacrylis glomerata.
Se pueden usar en el marco de la presente invención por tanto también las siguientes plantas: Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale y Setaria.
Un objeto preferido más de esta invención se refiere, por consiguiente, a plantas transgénicas del grupo de las Graminaceae incluyendo su descendencia sexual o asexual, que son regenerables a partir de material vegetal, seleccionado del grupo constituido por protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, polen, células huevo, cigotos etc. y contienen una de las moléculas de ADN recombinantes de acuerdo con la invención.
Las plantas maduras que se generaron a partir de células vegetales transformadas se cruzan consigo mismas para la producción de semillas. Algunas de las semillas contienen los genes que codifican para una propiedad de utilidad y deseada en una relación que contempla exactamente las leyes hereditarias establecidas. Estas semillas se pueden usar para la producción de plantas transgénicas.
Se pueden conseguir líneas homocigóticas mediante autoespolvoreado y preparación de líneas consanguíneas. Estas líneas de consanguíneas se pueden usar de nuevo para el desarrollo de híbridos. En cuanto a este procedimiento se cruza una línea consanguínea, que contiene dicho gen extraño, con una de las otras líneas consanguíneas para la producción.
Según la descripción general de la presente invención los ejemplos de realización específicos se recogen a fines ilustrativos de la descripción para el mejor entendimiento y no presentan carácter limitativo alguno, en tanto no se indique especialmente de otra forma.
En la forma de realización específica descrita con detalle a continuación de la presente invención se exprime una quitinasa básica así como una quitinasa clase III no similar [quitinasa de pepino], que se segrega de forma natural en el espacio extracelular y que no presenta homología alguna con las quitinasas de clase I o II, con y sin secuencia de "direccionamiento" en plantas Nicotiana sylvestris y se determina su localización dentro de la célula vegetal.
La prueba de la necesidad de la extensión C-terminal de las proteínas presentes de forma natural en la vacuola para una localización intencionada en la vacuola, así como de la posibilidad principal para la reclusión pretendida de dichas proteínas en el espacio extracelular, se da en función de una quitinasa básica así como una glucanasa básica del tabaco. A este respecto se separan o inactivan los 7 a 22 aminoácidos C-terminales que configuran la extensión C-terminal de estas proteínas presentes de forma natural en la vacuola, de modo que mediante la mutagénesis por oligonucleótidos se coloca un codón de terminación adecuado en el sitio correspondiente dentro de la secuencia de codificación. Esto lleva a continuación a una expulsión de la quitinasa o glucanasa mutadas al espacio extracelular.
Para demostrar por el contrario que dicha secuencia de "direccionamiento" está además en la situación de dirigir de forma pretendida una molécula de proteína asociada a la vacuola, se une la secuencia C-terminal de una quitinasa básica del tabaco con una quitinasa ácida de hojas de pepino. A este respecto se procede de modo que en primer lugar la secuencia de no codificación en 5' se une a partir de una quitinasa de tabaco básica así como la secuencia de codificación para un péptido señal localizada asimismo en esta zona con la secuencia de codificación de la quitinasa de pepino madura. A continuación se agrega en el extremo 3' de esta construcción mediante un fragmento de engarce una secuencia de codificación de 9 aminoácidos de la extensión C-terminal del gen de quitinasa del tabaco.
Las construcciones previamente descritas se recogen luego con los controles de un promotor 35 S del CaMV fuerte y se recluyen mediante transformación por Agrobacterium en plantas de Nicotiana sysvestris.
Tras la transformación consiguiente se seleccionan plantas transgénicas, que muestran una expresión de la quitinasa fuerte, y se usan para el análisis de la localización de la quitinasa. Se preparan protoplastos y se comparan las actividades específicas de la quitinasa en homogenatos y protoplastos.
Para la determinación de la localización subcelular de la quitinasa intracelular se aíslan vacuolas de los protoplastos.
Ejemplos de realización no limitativos Técnicas con ADN recombinante generales
Debido a que muchas de las técnicas con ADN recombinante usadas en esta invención son de rutina para el especialista en la técnica, previamente en esta invención está contenida, en cada caso donde corresponda, una breve descripción de estas técnicas usuales generales. A menos que se indique de forma extraordinaria, todos estos procedimientos se describen en la referencia de Maniatis y col (1982).
A. Corte con endonucleasas de restricción
De forma típica están contenidos aproximadamente de 50 a 500 \mug/ml de ADN en la mezcla de reacción, en la solución tampón recommendada por el fabricante, Nw England Biolabs, Berverly, MA. Se incorporan de 2 a 5 unidades de endonucleasas de restricción por cada \mug de ADN y la mezcla de reacción se incuba a la temperatura recomendada por el fabricante durante una a tres horas. La reacción finaliza mediante calentamiento a 65ºC durante 10 minutos o mediante extracción con fenol, seguido de precipitación del ADN con etanol. Esta técnica se describe también en las páginas 104 a 106 de la referencia de Maniatis y col. (1982).
B. Tratamiento de ADN con polimerasa para producir extremos lisos
Se incorporan de 50 a 500 \mug/ml de fragmentos de ADN a una mezcla de reacción, en el tampón recomendado por el fabricante, New England Biolabs. La mezcla de reacción contiene los cuatro trifosfatos de desoxinucleótido en concentraciones de 0,2 mM. La reacción tiene lugar durante 30 minutos a 15ºC y finaliza luego mediante calentamiento de 10 minutos a 65ºC. Para los fragmentos que se obtienen mediante corte con endonucleasas de restricción, que producen extremos que sobresalen por 5', como EcoR1 y BamH1, se usa el fragmento grande o el fragmento Klenow, de la polimerada de ADN. Para fragmentos que se obtienen mediante endonucleasas que producen extremos que sobresalen por 3', como Pst1 y Sac1, se usa la polimerasa de ADN T4. El uso de estos dos enzimas se describe en las páginas 113 a 121 de la referencia de Maniatis y col. (1982).
C. Electroforesis en gel de la agarosa y purificación de fragmentos de ADN de geles
La electroforesis en gel de la agarosa se lleva a cabo en un aparato horizontal como se describe en las páginas 150 a 163 de la referencia de Maniatis y col. El tampón usado es el tampón Tris-borato que se describe ahí. Los fragmentos de ADN se colorean mediante 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio que está disponible bien en el tampón de gel o de tanque durante la electroforesis o se incorpora tras la electroforesis. El ADN se hace visible mediante irradiación con luz ultravioleta de longitud de onda larga. Cuando se deben separar los fragmentos del gel se usa una agarosa que gelifica a temperatura baja y se puede adquirir a Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Tras la electroforesis se recorta el fragmento deseado, se agrega a un tubo de plástico, se calienta aproximadamente 15 minutos a 65ºC, se extrae tres veces con fenol y se precipita dos veces con etanol. Este procedimiento se modifica ligeramente respecto al que describe Maniatis y col. (1982) en la página 170.
Como alternativa se puede aislar el ADN de la agarosa con ayuda del kit Geneclean (Bio 101, Inc., La Jolla, CA, EEUU).
D. Adición de fragmentos de engarce sintéticos en extremos de ADN
Cuando se desee añadir un nuevo sitio de corte de endonucleasa al extremo de una molécula de ADN, se trata la molécula dado el caso en primer lugar con polimerasa de ADN para producir extremos lisos, como se describe en el párrafo anterior. Se añade aproximadamente de 0,1 a 1,0 \mug de este fragmento a aproximadamente 10 ng de ADN de engarce fosforilado que se adquirió a New England Biolabs, en un volumen de 20 a 30 \mul con 2 \mul de ligasa de ADN T4 de New England Biolabs, y 1 mM de ATP en el tampón recomendado por el fabricante. Tras una incubación durante la noche a 15ºC finaliza la reacción mediante calentamiento de 10 minutos a 65ºC.
La mezcla de reacción se diluye en aproximadamente 100 \mul en un tampón, que es válido para la endonucleasa de restricción, que corta la secuencia de engarce sintética. Se incorporan de aproximadamente de 50 a 200 unidades de esta endonucleasa. La mezcla se incuba durante 2 a 6 horas a la temperatura medida, luego se somete el fragmento a una electroforesis en gel con agarosa y se purifica como se describió anteriormente. Finalmente el fragmento resultante presenta terminaciones que se producen mediante corte con la endonucleasa de restricción. Estos extremos son habitualmente cohesivos de modo que el fragmento resultante sólo se puede unir fácilmente al otro fragmento con los extremos igualmente cohesivos.
E. Separación de fosfatos terminales 5' de fragmentos de ADN
Durante las etapas de clonación del plásmido el tratamiento del plásmido vector con fosfatasa reduce la recirculación del vector (discutido en la página 13 de la referencia Maniatis y col.). Tras los cortes del ADN con la endonucleasa de restricción correcta se añade una unidad de fosfatasa alcalina del intestino de terneros que se compró a Boehringer-Mannheim, Mannheim. El ADN se incuba una hora a 37ºC y a continuación se extrae dos veces con fenol y se precipita con etanol.
F. Unión del fragmento de ADN
Cuando se deben unir unos con otros fragmentos con extremos cohesivos, se incuban aproximadamente 100 ng de cada fragmento en una mezcla de reacción de 20 a 40 \mul con aproximadamente 0,2 unidades de ligasa de ADN T4 de New England Biolabas en el tampón recomendado por el fabricante. La incubación se lleva a cabo de 1 a 20 horas de duración a 15ºC. Cuando se deben unir fragmentos de ADN con extremos lisos se incuban como anteriormente, hasta que la cantidad de ligasa de ADN T4 aumente hasta 2 a 4 unidades.
G. La transformación de ADN en E. coli
Se usa cepa de E. coli HB101 para la mayoría de los experimentos. Se introdujo ADN con el procedimiento del cloruro de calcio, como se describió por parte de Maniatis y col. (1982), páginas 250 a 251.
H. Cribado de E. coli sobre plásmidos
Tras la transformación se prueban las colonias resultantes de E. coli en la presencia del plásmido deseado mediante un procedimiento de aislamiento de plásmido rápido. Se describen dos procedimientos habituales en las páginas 366 a 369 de la referencia de Maniatis y col (1982).
I. Aislamiento de ADN plásmido a gran escala
Se describen procedimientos para el aislamiento de plásmidos de E. coli a gran escala en las páginas 88 a 94 de la referencia de Maniatis y col (1982).
J. Clonación en fagovectores M13
La siguiente descripción se ha de entender de modo que la forma replicativa de cadena doble de los descendientes del fago M13 se usa para el procedimiento rutinario, como corte con endonucleasa de restricción, unión etc.
Los enzimas se pueden adquirir, si no se indica de otra forma, a Boehringer, Biolabs (BRL). Se usan correspondientemente a las indicaciones del fabricante, en tanto estas hagan indicaciones diferenciadas.
K. Análisis Southern blot
El ADN extraído se trata a este respecto en primer lugar con enzimas de restricción, a continuación se somete a una electroforesis en un gel de agarosa del 0,8% al 1%, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa [Southern EM (1975)] y se hibridiza con el ADN que se va a comprobar, el cual sufrió previamente una translación Nick (actividades específicas de ADN de 5 x 10^{8} a 10 x 10^{8} cpm/\mug). Los filtros se lavan tres veces cada hora con una solución acuosa de citrato de sodio 0,03 M y cloruro de sodio 0,3 M a 65ºC. El ADN hibridizado se hace visible mediante oscurecimiento de una película de rayos X durante 24 a 48 horas.
L. Análisis Western Blot
Tras una electroforesis en gel con poliacrilamida SDS se transfieren las proteínas electroforéticamente a un filtro de nitrocelulosa y nylon. Este filtro se pre-trata luego en primer lugar con un agente de bloqueo (por ejemplo, polvo de leche desnatada al 5% en PBS: leche-PBS). A continuación se incuba el filtro varias horas con un antisuero que reacciona con el compuesto que se va a comprobar respectivamente (en el caso presente: quitinasa). El filtro pre-tratado de esta forma se lava varias veces con leche - PBS y luego se incuba con un anticuerpo secundario que se adquiere comercialmente que está acoplado con un enzima [por ejemplo, anticuerpos de anti-cabra - anticonejo acoplados con peroxidasa (BIORAD), diluído 1:2000 en leche-PBS]. Se lava el filtro nuevamente en PBS y a continuación se tinta según las indicaciones del fabricante [BIORAD] con cloronaftol y peróxido de hidrógeno. Se dan más detalles en Sambrook y col. (1989).
Técnicas M. Generelle para la generación, purificación y secuenciación automática de péptidos.
Reducción y alquilación: Se disuelve proteína purificada, liofilizada en clorhidrato de guanidina 6 M que contiene Tris-HCl 1 M (pH 8,6) y EDTA 10 mM. Se añade ditiotreitol (DDT) hasta una concentración final de 4-vinilpiridina de 20 mM hasta una concentración final de 50 mM. Este preparado se incuba a continuación en nitrógeno durante 1,5 horas. El material piridiletilado se desala luego mediante HPLC [columna fenílica de Aquapore (2,1 x 10 cm, Brownlee)]. La columna se eluye con un gradiente lineal que alcanza del 5% al 80% de una mezcla de acetonitrilo:isopropanol (1:1) en ácido trilfuoroacético al 0,1% (TFA).
Escisión de bromuro de cianógeno y digestión con pigroglutamataminopeptidasa: la escisión de bromuro de cianógeno se lleva a cabo in situ según Simpson y Nice (1984). Se puede llevar a cabo una digestión con piroglutamataminopeptidasa [Boehringer Mannheim] según Allen (1981).
Digestión de LysC: la proteína se digiere con endoproteinasa Lys-C [Boehringer Mannheim] en Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) durante un periodo de tiempo de 24 horas a temperatura ambiente, con uso de una relación de enzima:sustrato de 1:10. Los péptidos resultantes se aíslan con ayuda de un HPLC [columna Aquapore C-8 (1 x 22 cm, Browlee)]. Como agente de elución sirve un gradiente de acetonitrilo:isopropanol (1:1) lineal (de 0% al 60%) en TFA al 0,1%.
Digestión de la tripsina: la digestión de la proteína con tripsina [Cooper] se lleva a cabo en hidroganocarbonato de amonio 0,1 M (pH 8,2) que contiene cloruro de calcio 0,1 M a una temperatura de 37ºC y una relación de enzima:sustrato de 1:100. La duración de la incubación alcanza las 5 horas. Los péptidos resultantes se separan mediante HPLC [véase capítulo C, anterior].
De forma alternativa a esto se puede llevar a cabo la digestión también en una relación de enzima:sustrato de 1:50 en Tris-HCl (pH 8,5) a una temperatura de 37ºC. La duración de la incubación alcanza en este caso las 24 horas. Los péptidos resultantes se separan mediante HPLC [columna Vydac C-18 (2,1 x 150 mm)] con uso de un gradiente lineal (de 0% al 60%) de acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1%.
Secuenciación: Se lleva a cabo la descomposición Edman automatizada con ayuda de un secuenciador Applied Biosystems 470A Gasphasen. La identificación de los aminoácidos de feniltiohidantoína (PTH) tiene lugar con uso de un analizador Applied Biosystems 129A PTH.
Para la ilustración de la descripción general anterior así como para el mejor entendimiento de la presente invención se dan en adelante ejemplos de realización específicos, que no presentan carácter limitativo alguno, en tanto no se haga especial indicación al respecto. Lo mismo es válido para todos los valores numéricos ejemplo que están contenidos en la descripción previa.
I. Preparación de bibliotecas de genes de ADNc y genómicas de tabaco Ejemplo 1 Material vegetal
Se crían plantas Nicotiana tabacum L. c.v. Havana 425 bien en invernadero o bien partiendo de semillas esterilizadas en superficie. La esterilización en superficie de las semillas se lleva a cabo como sigue:
Se aportan de 20 a 30 semillas en un tamiz con un tamaño de poros de aproximadamente 200 \mum y se incuban en 10 ml de una solución de blanqueo (NaOCl) al 10% adquirida en el mercado. Las semillas se lavan a continuación varias veces con agua destilada estéril.
En los siguientes ejemplos de realización se usan prioritariamente una línea clonada de tejidos marcados parenquimáticamente (N) que se puede aislar según Eichholz y col. (1983) de plantas de Nicotiana tabacum L. c.v. Havana 425.
Ejemplo 2 Cultivo de tejido
Se cultiva el tejido de tabaco sobre un medio base que presenta una concentración de sal clorhidrato y de clorhidrato de tiamina según Linsmeier y Skoog (1965) (LS) y se inmoviliza mediante adición de 10 g/l de ágar. Como aditivo adicional este medio base contiene un indicador de pH como, por ejemplo, 5 mg/l de rojo de clorofenol. Otros medios, que se constituyen sobre este medio base LS y se consideran para uso en los ejemplos de realización subsiguientes, contienen como otros aditivos, por ejemplo, quinetina (1,4 \muM) [medio de citoquinina] o ácido a- naftilacético (10,7 \muM) [medio de auxina] o bien una mezcla de quinetina y ácido a- naftilacético [medio de auxina/citoquinina (medio A)].
Los medios selectivos B y C no contienen ácido a-naftilacético, sino en cambio una sustancia selectiva, con cuya ayuda se pueden seleccionar los transformantes del gran número de células y tejido no transformados. La composición exacta de este medio selectivo se reproduce en la sección VII (medios).
La línea de cepa (275N) aislada a partir de plantas de Nicotiana tabacum L. c.v. Havana 425 se subcultiva en intervalos de 21 días sobre un medio auxina/citoquinina (10 ml), es decir, se inocula respectiva sobre medio nuevo (10 ml) y se cultiva a 25ºC en luz.
Para la inducción de mayores niveles de quitinasa en los tejidos cultivados se inoculan estos desde el medio de auxina/citoquinina sobre un medio base libre de hormonas. Se describen más particularidades para el cultivo de tejidos vegetales y para la inducción de quitinasa por parte de Felix y Meins (1985).
Ejemplo 3 Preparación de protoplastos de tabaco
Se mezclan 100 ml de una suspensión de células de tabaco de hace 2 días según el ejemplo 1 con un mismo volumen de una solución de enzima doblemente concentrada. La solución de enzima contiene los siguientes componentes:
Celulasa R-10 Onozuka® (Yakult Honsha, Tokyo, Japón) 10,0 g/l
Mecerasa (Pectinasa de Rhizopus sp., Behring Diagnostics, La Jolla, CA)  2,5 g/l
Pectoliasa Y-23® (Sishin Pharm. Co., Tokyo, Japón) 1,0 g/l
CaNO_{3} \cdot 4H_{2}O 1,45 g/l
MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O 0,5 g/l
NH_{4}H_{2}PO_{4} 0,23 g/l
KNO_{3} 1,2 g/l
D-manitsa (pH 5,70) 73,0 g/l
Se centrifuga la solución de enzima anterior y se esteriliza mediante un filtro de 0,2 mm.
El resultante compuesto por cultivo en suspensión de tabaco y solución de enzima se agita durante 5 horas cuidadosamente a temperatura ambiente en una máquina de agitación (40 rpm). A espacios de tiempo determinados se toman muestras de este resultante y se analizan microscópicamente. La digestión enzimática se continúa hasta que aproximadamente el 80% de las células se transformen en protoplastos esféricos. Los recipientes de incubación se equipan luego con la máquina de agitación. Se deja sedimentar la suspensión de células/protoplastos y se separa la mitad superior del medio, que no contiene célula o protoplasto alguno mediante succión con una pipeta y se deshecha. El resto se transfiere a un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrifuga en una centrífuga clínica a 500 rpm durante 10 minutos (modelo HN-SII, IEC). Los agregados que contienen protoplastos se resuspenden en una solución de lavado I [véase sección VIII] y a continuación se centrifuga de nuevo durante 10 minutos a 1000 rpm.
Las bandas con los protoplastos se encuentran en el borde superior del tubo de centrífuga. La fracción de protoplastos se reúne y se lava de nuevo a continuación en solución de lavado I. Se devuelven de nuevo los protoplastos a un tubo de centrífuga y se conservan en hielo hasta un uso posterior.
Ejemplo 4 Construcción de una biblioteca de genes de ADNc
Se prepara la biblioteca de genes de ADNc partiendo de ARN poli(A)+, el cual se obtiene a partir de una línea clonada de tejido marcado parenquimáticamente de Nicotiana tabacum L. c.v. Havana 425 (véase ejemplo 1). Se estimula previamente según el ejemplo 2 el tejido de tabaco para la producción de mayores niveles de quitinasa, de modo que este se cultiva sobre un medio base LS libre de hormonas.
4.1. Aislamiento de ARN completo
El procesamiento de ARN completo tiene lugar en esencia según el procedimiento descrito por parte de Lagrimini LM y col. (1987).
En nitrógeno líquido se tritura primeramente tejido de tabaco congelado en un mortero grueso y luego se añade a un tampón de homogenización adecuado [(1) clorhidrato de guanidina 7,56 M, mercaptoetanol 0,73 M, acetato de sodio 18,9 mM pH 5,0; o (2) SDS al 4% (p/v), Tris-HCl 0,1 M pH 7,8 (1 parte en volumen) + fenol al 80% (v/v), hidroxiquinolina al 0,1% (p/v), Tris-HCl 0,1 M pH 7,8 (1 parte en volumen); o (3) según Lagrimini LM y col., (1987)] (2,5 ml de tampón por gramo de tejido). Después de la adición de una porción de volumen igual de fenol se homogeniza el resultante, por ejemplo, en un homogenizador Polytron. A continuación se añade medio volumen de cloroformo y se mezcla la emulsión con cuidado durante aproximadamente unos 15 minutos. Las distintas fases se separan unas de otras mediante centrifugación (10,400 g durante 10 minutos); se deshecha la fase acuosa. En este punto se pueden incorporar a elección otras etapas de extracción, por ejemplo, en forma de una extracción adicional con fenol-cloroformo o una extracción en dos fases con una mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1). A la extracción sigue la etapa de precipitación. Esta tiene lugar mediante adición de acetato de sodio 0,3 M y 2,5 partes en volumen de etanol. El precipitado se reúne mediante centrifugación (10.400 g durante aproximadamente 15 minutos) y se resuspende en 2 ml de agua estéril. Después de la adición de cloruro de litio en una concentración final de 3 M se incuba el resultante completo a 4ºC durante la noche. El precipitado se reúne de nuevo mediante centrifugación y se lava el agregado formado con etanol enfriado. El agregado se seca a continuación y se resuspende en 500 \mul de agua estéril. La concentración del RNA completo en esta preparación se determina espectroscópicamente.
De forma alternativa al procedimiento descrito anteriormente se puede también aislar el RNA completo a partir de tejido de callo. También en este caso se considera usar las etapas de procedimiento descritas anteriormente, en las cuales como material de partida se usa tejido de callo cortado en cubos (aproximadamente 3 mm), que en primer lugar se congela en nitrógeno líquido antes de la etapa de homogenización y a continuación se tritura hasta un polvo fino en un mortero preenfriado.
4.2. Aislamiento de RNA poliadenlinado
Se aísla ARN poli(A)+ con ayuda de una cromatografía en oligo-d(T) celulosa (Collaborative Research, Lexington, MA, EEUU) según procedimientos conocidos [véase, por ejemplo, Mohnen (1979)].
La oligo-d(T) celulosa se lava en primer lugar durante 15 minutos en 20 partes en volumen de NaCl 2,0 M, a continuación se suspende en agua estéril y se empaqueta en una columna (1,5 cm diámetro y 20 cm longitud). La columna se lava con solución tampón (NaCl 440 mM, EDTA 0,9 mM, Tris-HCl 9 mM, pH 7,5, ó NaCl 0,5 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) hasta que el eluíto presente un valor de pH entre 7,0 y 7,6. A continuación se ajustan las soluciones de ARN a pH 7,5 con una porción de ARN entre 0,6 mg y 6,0 mg de ARN en un volumen de 4,0 ml hasta una concentración final de EDTA 1 mM y ácido piperazin-1,4-bis(2-etanosulfónico). El ARN se desnaturaliza por medio de calentamiento durante 5 minutos a 70ºC y subsiguiente enfriamiento sobre hielo. La disolución completa se ajusta entonces con 0,1 parte en volumen de NaCl 4 M a un valor de Na Cl 0,36 M. La solución de ARN se introduce en la columna y el ARN no poliadenilado [ARN poli (A)] se eluye con la disolución tampón mencionada anteriormente. La absorción del eluíto se determina con ayuda de un espectrofotómetro (Hitachi modelo 100-40, Hitachi, Tokyo, Japón) así como de un registrador W+W (Scientific Instruments, Basilea, Suiza). Tan pronto como la absorción haya alcanzado la línea base se eluye con el ARN poli(A)+ unido en la columna con EDTA 1 mM y Tris-HCl 10 mM pH 7,5. El elído se añade en una solución de EDTA 0,5 mM y acetato de sodio 0,3 M pH 5,0 y se precipita mediante adición de 2,5 partes en volumen de etanol. El ARN se recoge a continuación mediante centrifugación a 83,000 x g (30 hasta 45 minutos), se seca en nitrógeno y se resuspende en EDTA 1 mM, Tris 10 mM, pH 7,5, o en agua.
4.3. Construcción y selección de clones de ADNc
El ARN poli(A)+ se descompone con ayuda de una ultracentrifugación preparativa (17 horas a 57.000 g) sobre un gradiente de sacarosa al 5-25% (p/v) (EDTA1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) en fracciones individuales. Las fracciones, que contienen la información para la quitinasa, se pueden identificar por medio de traslación in vitro con uso de anticuerpos anti-quinitasa. Estas son después reunidas y usadas para posterior procesamiento.
El procedimiento para la preparación de anticuerpos de anti-quinasa es conocido para el especialista en la técnica y se puede llevar a cabo, por ejemplo, según el procedimiento descrito por Shinshi y col. (1985) o bien por Mohnen (1985). En ellos se inyectan a conejos hembra de tres meses de edad (conejo blanco de Nueva Zelanda) esencialmente emulsiones con preparados depurados de quitinasa purificados en adyuvante de Freund completo. Siguen más inyecciones al cabo de una o dos semanas así como, a continuación, en intervalos mensuales. La toma de sangre tiene lugar respectivamente a los 7 a 10 días después de la inyección, en donde las muestras de suero se conservan a -20ºC. La inmunoglobulina G se purifica mediante cromatografía de afinidad en una columna de proteína A-Sefarosa C1 4B (Pharmacia), y a continuación se liofiliza y se recoge a -20ºC.
La síntesis de ADN de cadena doble a partir del colchón de ARN poli(A)+, la clonación de este ADN de cadena doble en pBR322, la hibridación de colonia diferencial y el aislamiento de plásmido se realizan esencialmente según las prescripciones y la descripción de Maniatis y col. (1982).
Para la síntesis de aproximadamente 0,8 \mug de ADN de cadena doble se incuban 3 \mug del ARN poli(A)+ aislado anteriormente y con ARN poli(A)+ enriquecido con ARNm de quitinasa, con transpirastasa inversa (Life Sciences, St. Petersburg, FL) así como polimerasa de ADN I (New England Biolabs, Beverly, MA). El ADNc así formado se entrelaza en el sitio de corte PstI de pBR322 con ayuda del procedimiento "Homopolimeric dC-dG Training", que permite dotar al cADN y al ADN vecto con extremos cohesivos complementarios y que ha descrito particularmente Maniatis y col. (1982) [páginas 217 - 219]. El vector pBR322 linearizado con Pstl y dotado de extremos oligo-dC se adquiere comercialmente.
El plásmido recombinante resultante se usa entonces para la transformación de células DH1 competentes de E.coli. La clonación en plásmidos está descrita en detalle por Maniatis y col. (1982), en las páginas 242 - 246 y 391.
La biblioteca de ADNc construida de esta forma, que se presenta en forma de colonias de bacterias sobre placas de ágar se criba primero con ayuda de hibridización de colonia con uso de ADNc marcado radioactivamente.
En el marco de la hibridación de colonia diferencial se preparan duplicados de las colonias de bacterias sobre filtros de nitrocelulosa, de modo que se coloca el filtro sobre la placa de ágar y después se retira con cuidado. La placa de ágar original se conserva para la identificación posterior de colonias positivas. Los filtros cubiertos de colonias de bacterias son depositados a continuación sobre el medio de alimentación y se le deja hasta que crecen colonias de hasta clones de aproximadamente 2 mm de tamaño. Los filtros se tratan luego con sosa, lo que conduce a una lisis de laas células bacterianas y a la desnaturalización y fijación del ADN bacteriano sobre el filtro. Tras la neutralización del pH se lavan los filtros varias veces, se secan y finalmente se "cuecen" a una temperatura de 80ºC, con lo cual el ADN queda covalentemente unido al filtro.
Los filtros son hibridizados 2 veces seguidas con sondas de ADNc marcadas radiactivamente (no clonadas). En cuanto a estas sondas de ADNc se trata de ARN poli(A)+ de tejido de tabaco, que se indujo previamente para la producción de quinitasa (incubación de siete días sobre medio base sin adición de hormonas) así como de ARN poli(a)+ de tejido de tabaco no inducido (incubación de siete días sobre medio de auxina-citoquinina). Además se analizan clones de ADNc muy prometedores, que reaccionan más fuertemente con el ADNc de tejidos inducidos que con el ADN de control de tejidos no inducidos, con ayuda de procedimientos de translación "Hybrid-select" según la descripción de Mohnen y col. (1985) y Mohnen (1985). El ADN plásmidoo se desnaturaliza después por medio de hervido de un minuto en NaOH 0,2 M a 0,3 M, NaCl 3 M y a continuación se enfría en hielo. La reacción de hibridización se lleva a cabo sobre filtros de nitrocelulosa cuadráticos BA/85 (Schleicher und Schüll, Dassel, RFA), con 200 \mug a 250 \mug de ARN completo por filtro. El ARN hibridizado sobre los filtros se eluye, precipita con etanol y se disuelve en 10 \mul de agua y se analiza con ayuda de traslación in vitro (con ayuda de un extracto de germen de trigo que se adquiere comercialmente). Los productos marcados radioactivamente se precipitan con anticuerpos frente a la proteína deseada y analizados por medio de electroforesis de gel con poliacrilamida SDS.
4.4. Clon de ADNc pCHN48
La biblioteca de genes de ADNc se criba según Maniatis y col. (1982) con ayuda de la hibridización de colonia o de placa. La sonda de ADN sirve el clon de ADNc pCHN50 descrito por Shinshi y col. (1987), que contiene la secuencia de ADN completa que codifica la proteína madura, pero al que le falta la secuencia de péptido señal N-terminal completa. De esta forma se obtiene diferentes clones de distintas longitudes. Los más largos de estos clones son seleccionados y sometidos a un análisis de secuencias de nucleótidos. Este clon con la designación pCHN48 tiene una inserción que comprende 1,14 Kb con 7 adenosinas en el extremo poli(A), un único gran marco de lectura ("open reading frame") de 987 nucleótidos de longitud, correspondiente a un polipéptido de 329 aminoácidos así como un nucleótido de la región de no trasladada 5'. La secuencia de aminoácidos derivable de la secuencia de ADN de la región de codificación coincide con la secuencia para los 20 aminoácidos N-terminales de quinastasas conocidas del tabaco.
Ejemplo 5 Construcción de una biblioteca de genes genómica 5.1. Aislamiento de ADN de tabaco cromosomal
Para la lisis de los protoplastos se mezclan 100 ml de suspensión de protoplastos enfriada con hielo con 400 ml de un tampón-TENP enfriado con hielo (véase apartado VII). Los núcleos se separan de este lisato con ayuda de una centrifugación de 10 minutos en una centrífuga clínica IEC a 2.000 rpm. El agregado así obtenido se resuspende en 500 ml de tampón TENP enfriado con hielo y, como se describe anteriormente, se agrega de nuevo. A continuación se preparan 8 tubos de gradiente de CsCl, en donde se añade en cada uno de los tubos un agregado celular de una suspensión de protoplastos de aproximadamente 12,5 ml hasta 26 ml de tampón TE concentrado 10 veces (véase apartado VII). Para la lisis del núcleo celular se añaden a este resultante 5 ml de una solución de laurilsarcosina de sodio así como 32,2 g de CsCl y 2,89 ml de solución de bromuro de etido (EtBr, 10 mg/ml). El resultante total se mezcla ligeramente para disolver el CsCl.
Los lisatos así obtenidos son trasladados a tubos de polialómeros (Beckman Vti50), tubos de 39 ml) y se centrifugan a 45.000 rpm y a una temperatura de 20ºC durante 16 horas en un rotor Vti50 (Beckman). Son extraídos de los gradientes y reunidos en bandas de fluorescencia con luz UV con ayuda de inyecciones de 3 ml con agujas de calibre 16. El posterior procesamiento del ADN tiene lugar por medio de la repetición de la centrifugación equilibrada por CsCl/EtBr descrita anteriormente. Las bandas de fluorescencia se reúnen de nuevo y se separa el EtBr adherido en 6 etapas de extracción consecutivas con uso de isopropanol, que está saturado con 20 x SSC (véase apartado VII) (igual volumen). De estas soluciones gradiente purificadas de la forma descrita anteriormente se precipita el ADN, de modo que se añade sucesivamente 2 partes en volumen de agua destilada, 0,1 partes en volumen de acetato de sodio 3,0 M, pH 5,4 y dos partes en volumen de etanol. El ADN en forma de hilos se bobina fuera de la solución con ayuda de una pipeta Pasteur, se lava en etanol al 70% y se extrae con un volumen igual de cloroformo. El ADN se precipita por medio de adición de 0,1 partes en volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5,4 y 2,0 partes en volumen de etanol. Los hilos de ADN son bobinados de nuevo, lavados en etanol al 70% y secados al aire durante 5 minutos. A continuación se disuelven en un volumen total de 7 ml de tampón TE (véase el apartado VII) y se conserva para uso posterior a 4ºC.
5.2. Construcción de una biblioteca de genes \lambda genómicos
El ADN de tabaco aislado anteriormente se digiere con el enzima de restricción Sau3A y se separa a las 20 horas sobre un gradiente de sacarosa al 10% - 40% en un rotor SW41 (Beckman) a 20.000 rpm. Las fracciones obtenidas a partir de este gradiente se analizan con ayuda de la electroforesis en gel (gel de agarosa al 0,5% en tampón TBE). Aquellas fracciones que presentan fragmentos del tamaño correcto son reunidas. El ADN se precipita con 1/10 parte de volumen de acetato de sodio 3 M (pH 4,8) y 2 partes en volumen de etanol y se engarzan con ADN EMBL3 \lambda tratado con fosfatasa, digerido por BamHI (Strategen: La Jolla, CA). La reacción de unión se lleva a cabo según las indicaciones del fabricante, en las que se usan respectivamente preparados de reacción de 5 \mul, que contienen 1 \mug de ADN vector \lambda así como 0,1 \mug de ADN de tabaco que se va a incorporar. La incorporación del ADN resultante de esta reacción de unión en la cabeza de fagos \lambda se lleva a cabo según las indicaciones del fabricante con ayuda del kit Gigapack Plus de Stratagene. El rendimiento fagocítico tras infección de CES201 de E.coli (Glover DM,) alcanza aproximadamente 2 x 10^{6} fagos por \mug de ADN insertado.
5.3. Cribado de bibliotecas de genes y aislamiento de clones genómicos
La biblioteca de genes genómicos se criba según Maniatis y col. (1982) con ayudade hibridación de colonia o de placa. Como sonda de ADN sirve el clon de ADNc pCHN50 descrito por Shishi y col. (1987) pCHN50 así como el clon pCHN48 aislado en el apartado 4.4.
Los recombinantes obtenidos de esta forma se purifican y se caracterizan parcialmente con ayuda del análisis Blot Southern. Uno de estos clones, que permite reconocer una señal de hibridización muy fuerte con las moléculas sonda de ADNc pCHN50 y pCHN48 y que contiene según el análisis Blot Southern el gen de quitinasa completo se seleccionan para posteriores estudios y recibe la denominación \lambdaCHN17.
Ejemplo 6 Los clones \lambdaCHN17 de quitinasa de tabaco genómicos 6.1. Secuenciación y análisis de secuencia de ADN
Después de la digestión con el enzima de restricción HindIII se obtiene un fragmento de ADN que comprende de 5,4 Kb, que contiene el gen de quitinasa completo y se correlaciona con un fragmento del mismo tamaño del ADN de tabaco. Una parte de este fragmento que comprende 3850 Bp e incluye la secuencia completa de codificación se secuencia a continuación.
Los fragmentos de restricción se clonan en vectores de clonación adecuados como, por ejemplo, M13mp18 o M13mp19 [Yanish-Perron y col. (1985)] y se secuencian en ambas direcciones con ayuda del procedimiento del dideoxinucleótido ("Dideoxinucleotide chain-termination method"; Sanger y col. (1977)]. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos obtenidas son analizadas después con ayuda del ordenador y uso de un software de Genetics Computer Group (Devereux y col. (1984).
La secuencia completa de ADN del gen de quitinasa básica de tabaco, que recibe la designación Gen 48, está reproducida por la SEQ ID Nº: 10. Una comparación de esta secuencia con los clones de ADNc pCHN48 y pCHN50 deja ver que dentro de la región de codificación del gen 48 se interconexionan dos segmentos de secuencia intervinientes (intrón). El primero de estos intrones comprende 274 Bp y se encuentra entre el primer y segundo nucleótidos del codón 148 de codificación de la glicina. El segundo intrón es 269 Bp de largo y se encuentra entre el segundo y tercer nucleótidos del codón 199 de codificación de la histidina. Ambos intrones poseen en coincidencia con otros intrones vegetales y animales conocidos, empalmes de consenso, que presentan una secuencia donante y una secuencia aceptora (GTAAGTC y ADAG). Además, ambos intrones poseen la secuencia CT(G/A)A(C/T), separada 33 nucleótidos del extremo 3', que presenta semejanzas con secuencias de consenso animales (PyTPuAPy). Estas secuencias de consenso son parte de la formación de los productos intermedios con forma de lazo en el marco de la escisión.
La secuencia de nucleótidos del exón del gen 48 es idéntica a la secuencia de ADN de la región de codificación del clon pCHN48.
Ejemplo 7 Preparación de una biblioteca de genes de ADNc a partir de hojas de pepino 7.1. Purificación y secuencia de proteína de la quitinasa de pepino
Se aísla una proteína de quitinasa inducible mediante patógeno a partir de hojas de pepino infectadas según el procedimiento descrito por parte de Métraux (1988). A partir de esta preparación de proteínas homogénea se generan luego los fragmentos de péptido según procedimientos generalmente conocidos. Las secuencias de aminoácidos de estos fragmentos de péptido se reproducen a continuación de forma resumida:
45 
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
6
7
7.2. Preparación de una biblioteca de ADNc a partir de hojas de pepino infectadas con TNV
Se infectaron hojas de pepino con virus de necrosis del tabaco (TNV). 5 días tras la infección se aisló el ARN según la descripción anterior [véase ejemplo 4.1].
Se aisló el ARN poliadenilado [ARN poli(A)+] con ayuda de procedimientos convencionales [véase apartado 4.2] y se usa para la preparación de una biblioteca de genes de ADNc. Esta se prepara esencialmente según el procedimiento descrito por parte de Gubler y Hoffman (1983) en un vector de clonación \lambda Zap [STRATAGEN].
7.3. Aislamiento de clones de ADNc que codifican una quitinasa de pepino
Se seleccionan dos regiones de las secuencias de proteína determinadas previamente para la preparación de sondas de oligonucleótido. Las sondas de oligonucleótido sintetizadas cubren todas las combinaciones posibles de ARNm que están en la situación de codificar los péptidos seleccionados:
8 
\vskip1.000000\baselineskip
Se siembran en placa aproximadamente 300.000 placas de la biblioteca de ADNc construida previamente. Se ensayan copias duplicadas de estas placas con una mezcla de oligonucleótido marcado con ^{32}P 1 (sonda 1) o 2 (sonda 2). Se aíslan las placas que dan resultados positivos con ambas sondas. El aislamiento de las placas así como la escisión automática se llevan a cabo según las indicaciones del fabricante [Stratagene Lambda Zap Laboratory Manual, Stratagen, San Diego, EEUU].
Se entrelaza un clon positivo adecuado en el plásmido Bluescript' y se obtiene la designación pBSCucCht5. La secuencia de este clon de ADNc se puede determinar mediante secuenciación por dideoxi [véase SEQ ID Nº 11].
II. Construcción de mutantes de quitinasa y glucanasa II.1. Mutantes de quitinasa Ejemplo 8 Inclusión de nuevos sitios de corte de restricción
En la construcción de mutantes de quitinasa se unen unas con otras distintas partes de los clones de quitinasa usados respectivamente. Para poder alcanzar esta meta estas partes deben ser compatibles, es decir, deben incluirse en sitios de corte de restricción adecuados en las distintas secuencias. En lo sucesivo se usan los siguientes sitios de corte de restricción enumerados, que conducen todos ellos a extremos igualmente cohesivos:
BamHI [G/GATCC]
BcII [T/GATCA]
BgIII [A/GATCT]
El marco de lectura se selecciona respectivamente de modo que GAT actúa como codón para el aspartato.
Ejemplo 9 Construcción de mutantes del gen quitinasa del tabaco
Mediante entrelazado de la inserción EcoRI/HindIII del pCHN87, de un fragmento subclonado del clon de la quitinasa genómico CHN17 [para la preparación véase el apartado 12.2] en el plásmido pTZ18R se obtiene pTRCH1. El plásmido pTZ18R se pueden adquirir comercialmente a la compañía PHARMACIA.
La inserción del clon pCHN48 del ADNc [véase apartado 4,4], que contiene la secuencia de ADNc completa, se aísla mediante digestión parcial con PstI y se clona en el plásmido pUC8. El clon así generado recibe la designación pCHN6.
El fragmento PstI de gran tamaño de pCHN6 se clona en el plásmido pUC18, en donde se generan dos clones distintos [pUCH2 y pUCH3] que se diferencian en la orientación de la inserción entrelazada en el poliengarce.
El fragmento EcoRI/HindIII del pUCH2 se aísla a continuación y se entrelaza en el plásmido pTZ18U. Se obtiene de esta forma el plásmido pTUCH2. El plásmido pTZ18U se puede adquirir asimismo comercialmente en la compañía PHARMACIA.
El fragmento EcoRI/HindIII del pUCH3 se aísla asimismo y se clona en el plásmido pTZ18R. El clon así formado recibe la designación pTRCH3.
Ejemplo 10 Mutagénesis mediada por oligonucleótido
Para la mutagénesis mediada por oligonucleótido se sintetizan los oligonucleótidos siguientes con ayuda de procedimientos habituales conocidos por el especialista en la técnica:
9
Los nucleótidos modificados frente al tipo salvaje están subrayados y en negrita.
Los sitios de corte de restricción están resaltados por un vacío.
La deleción en el oligonucleótido #8 se reproduce mediante \Delta.
La inserción en los oligonucleótidos #3 y #8 se reproduce en cursiva.
10.1. Mutagénesis del clon de la quitinasa del tabaco
Para la preparación de plásmidos de cadena simple se incorporan los plásmidos de partida en una cepa dam de E. coli, mediante infección de un cultivo durante la noche de estas bacterias con los fagos de ayuda M13KO7 [PHARMACIA]. Estos plásmidos se pueden precipitar a continuación muy fácilmente con ayuda de acetato de amonio y polietilenglicol (PEG 6000) a partir del sobrenadante del cultivo y extraer con fenol/cloroformo y cloroformo. Tras nueva precipitación con etanol se usa el ADN aislado para la mutagénesis propia [ADN de aproximadamente 5 ml de cultivo por mutagénesis].
Se fosforilan 200 pmol de cada uno de los oligonucleótidos en 30 \mul de Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5), MgCl_{2} 10 mM, dinitrotreitol 6 mM (DTT), ATP 2 mM y 5 unidades de polinucleótidoquinasa T4 durante un periodo de tiempo de 45 minutos a una temperatura de 37ºC. Se desactiva la reacción mediante incubación subsiguiente de 10 minutos a 60ºC.
El ADN de cadena simple se mezcla con 2,5 \mul de oligonucleótido fosforilado y 1 \mul de solución A [Tris-HCl 0,2 M (pH 7,5), MgCl_{2} 0,1 M, NaCl 0,5 M, DTT 10 mM] en un volumen final de 30 \mul y se incuba primero durante 5 minutos a 80ºC y a continuación 20 minutos a temperatura ambiente.
A cada uno de los tubos se añade entonces 13 \mul de la siguiente mezcla:
18,5 \mul
H_{2}O
2,0 \mul
de solución B [Tris-HCl 0,2 M (pH 7,5), MgCl_{2} 0,1 M, DTT 0,1]
2,0 \mul
ATP 10 mM
2,0 \mul
de mezcla dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP cada uno 10 mM)
1,0 \mul
fragmento Klenow
0,5 \mul
ligasa de ADN T4
Esta mezcla se incuba durante 30 minutos a una temperatura de 32ºC y a continuación otras 2 a 16 horas a temperatura ambiente.
Una cuarta parte de este preparado se transforma en células mutS de E. coli competentes (cepa deficiente de reparación). Estas células se agitan durante 3 a 6 horas en medio L 2 veces o medio TY 2 veces a 37ºC. A continuación se aísla el ADN plásmido con ayuda de un procedimiento minipreparativo que es habitual para el especialista en este campo. El ADN aislado se transforma luego en células DH5a de E. coli competentes que se siembran en placa sobre un medio que contiene ampicilina. Los mutantes se pueden identificar luego muy fácilmente mediante hibridación de colonias con uso del oligonucleótido mutagénico marcado radiactivamente. De forma adicional se puede llevar a cabo un análisis de restricción, ya que todos los mutantes basados en la mutación han ganado un sitio de restricción o bien lo han perdido.
10.1.2 pTRCH4
El plásmido pTRCH1 se mutageniza con ayuda del oligonucleótido #1. El nuevo plásmido generado se designa con pTRCH4. En el marco de esta mutación se incluye un sitio de corte de restricción en el primer codón de la secuencia de ADN que codifica la quitinasa madura, en donde el aminoácido codificado del ácido glutámico cambia a ácido aspárgico [Glu1 \rightarrow Asp1].
10.1.3 pTRCH6
El plásmido pTRCH3 se mutageniza con ayuda del oligonucleótido #2. El nuevo plásmido generado se designa con pTRCH6. En el marco de esta mutación se cambia el codón 300 de la secuencia de ADN de glicina que codifica la quitinasa madura por un codón de terminación (Gly300 \rightarrow Stop300), simultáneamente se incluye un sitio de corte de restricción HindI.
10.1.4 pTUCH6
El fragmento HindIII/PvuII de pTRCH3 y el fragmento PvuII/HindIII de pTRCH6, que contienen la anterior mutación se entrelazan en el vector pTZ18U previamente cortado con HindIII/EcoRI. De esta forma se obtiene el plásmido pTUCH6.
10.1.5 pTUCH7
El fragmento pTUCH2 se mutageniza con ayuda del oligonucleótido #3. El nuevo plásmido generado se designa con pTUCH7. En el marco de esta mutación se incluye en la zona del codón 295/296 de la secuencia de ADN que codifica la quitinasa madura un sitio de corte de restricción BgIII. Debido a que estos sitios de corte de restricción se encuentran en otro marco de lectura como tales en los otros mutantes descritos hasta ahora se da el caso que se inserta un G en el codón 297. Se obtiene de esta forma de nuevo un marco de lectura compatible.
10.1.6 pTUCH8
El plásmido pTUCH2 se mutageniza con ayuda del oligonucleótido #4. El nuevo plásmido generado se designa con pTUCH8. En el marco de esta mutación se cambia el codón 304 de la secuencia de ADN que codifica la quitinasa madura del ácido aspárgico por aspargina [Asp304 \rightarrow Asn304]. Esto lleva a la pérdida de un sitio de corte TaqI.
10.1.7 pTUCH9
El plásmido pTUCH2 se mutageniza con ayuda del oligonucleótido #5. El nuevo plásmido generado se designa con pTUCH9. En el marco de esta mutación se cambia el codón 304 del ácido aspárgico por arginina [Asp304 \rightarrow Asg304], lo que lleva igualmente a la pérdida de un sitio de corte TaqI.
10.1.8 pTUCH10
El plásmido pTUCH2 se mutageniza con ayuda del oligonucleótido #6. El nuevo plásmido generado se designa con pTUCH10. En el marco de esta mutación se cambia el codón 299 de la asparagina por lisina [Asn299 \rightarrow Lys299] y el codón 300 de glicina por ácido aspárgico [Gly300 \rightarrow Asp 300]. Al mismo tiempo se incluye un sitio de corte BgIII.
10.2 Mutagénesis del clon de la quitinasa del pepino
La mutagénesis del clon de la quitinasa del pepino se lleva a cabo de forma análoga al procedimiento descrito en el ejemplo 11.1.
La inserción EcoRI del clon de ADNc de la quitinasa del pepino pBSCucCht5 [véase apartado 7] se clona en el plásmido pTZ18U. El plásmido construido de esta forma recibe la designación pTUCU2.
10.2.1. pTUCU4
El plásmido pTUCU2 se mutageniza con ayuda del oligonucleótido #7. El nuevo plásmido generado se designa con pTUCU4. En el marco de esta mutación se incluye un sitio de corte de restricción BamHI en el último codón de la secuencia de ADN que codifica el péptido señal, por lo que el codón subsiguiente se cambia de modo que en adelante codifica el aminoácido prolina en lugar de alanina [Ala-1 \rightarrow Pro-1].
10.2.2. pTUCU5
El plásmido pTUCU2 se mutageniza con ayuda del oligonucleótido #8. El nuevo plásmido generado se designa con pTUCU5. En el marco de esta mutación se incluye un sitio de corte de restricción BcII en la zona del codón de terminación de la quitinasa del pepino. Con lo cual se transforma el codón de terminación en un codón de ácido aspárgico [terminación268 \rightarrow Asp268].
10.2.3. pTUCU6
El plásmido pTUCU2 se mutageniza con ayuda del oligonucleótido #9. El nuevo plásmido generado se designa con pTUCU6. En el marco de esta mutación se incluye un sitio de corte de restricción XbaI en la zona de la secuencia que no codifica en 3' de la secuencia de ADN [en la zona de los nucleótidos 981 - 986 del clon pBSCucCht5], con lo que una se hace posible una clonación en el vector pGY1.
II.2. Mutante de glucanasa Ejemplo 11 Mutagénesis mediada por PCR
El triplete de bases que codifica el primer aminoácido de la extensión C- terminal [GTC = valina] se transforma con uso del procedimiento PCR en el codón de terminación TGA.
Los procedimientos para llevar a cabo una mutagénesis por PCR son conocidos por el especialista en este campo. Se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias: Wang y col. (1989); Innis y col. (1990) y Erlich (1989).
Además de esto se puede adquirir comercialmente un kit PCR de PERKIN-ELMER CETUS [Norwalk, Conn., EEUU] o de otro fabricante y llevarlo a cabo en correspondencia a las instrucciones ahí contenidas.
11.1. Construcción de pCIB1005B\DeltaVTP
Esta construcción se puede preparar partiendo del plásmido pCIB1005B, que está registrada en la "American Type Cultura Collection" [ATCC] en Rockville, Maryland, EEUU con el número ATCC 40770 y cuya construcción se describe en el documento EP-A 0.392.225 con detalle.
El plásmido pCIBI005B codifica una prepro-\beta-glucanasa completa, híbrida, básica de tabaco con secuencia de señal N-terminal completa y una extensión C-terminal que comprende 22 aminoácidos, en un vector de expresión 35S de CaMV.
El plásmido pCIB100B\DeltaVTR, cuya preparación se describe a continuación codifica la misma glucanasa, en la que no obstante la extensión C-terminal comprende los 22 aminoácidos está delecionada funcionalmente mediante inclusión de un codón de terminación en el extremo de la secuencia que codifica la proteína madura.
En el marco de la amplificación por PCR se usan los siguientes oligonucleótidos:
10
El oligonucleótido 1 [Oligo 1] corresponde a una secuencia en la región de codificación del ADN de glucanasa que está localizada aguas arriba ["upstream"] del sitio de corte XhoI que se encuentra ahí.
El oligonucleótido 3 [Oligo 3] comprende la región en la zona del extremo 3' de la secuencia que codifica la proteína glucanasa madura seguido del codón de terminación que se va a incorporar así como una parte de la secuencia de codificación para la extensión C-terminal.
El oligonucleótido 2 [Oligo 2] muestra una secuencia que corresponde al Oligo3, no obstante en orientación contraria.
El oligonucleótido 4 [Oligo 4] comprende una secuencia que está localizada en la región tml 3' de pCIB1005B, aguas abajo ["downstream"] del sitio de corte SacI que se encuentra ahí.
Se llevan a cabo tres reacciones PCR:
(1) PCR1 con Oligo1 y Oligo2 como cebadores y pCIB005B como molde;
(2) PCR2 con Oligo2 y Oligo4 como cebadores y pCIB1005B como molde;
(3) PCR3 con Oligo1 y Oligo4 como cebadores y los productos de la reacción PCR1 y PCR2 como moldes. Los primeros dos ciclos de la reacción PCR3 se llevan a cabo sólo con los moldes, añadiendo a continuación el cebador.
El producto de la reacción PCR3 se digiere con SacI y XhoI y se separa mediante un gel de agarosa. Las bandas correspondientes de 725 Bp se recortan del gel y se purifican.
A continuación se digiere el plásmido pCIBI005B igualmente con XhoI y SacI y se une durante la noche con el fragmento PCR3 digerido y purificado en una reacción con ligasa. La mezcla de ligadura se usa para transformar células DH5a de E. coli competentes. La selección de los transformantes tiene lugar mediante ampicilina. Los plásmidos pCIBI005B y pCIBI005B\DeltaVTP se pueden aislar de las células transformadas en cultivos durante la noche y se usan para la transfección subsiguiente de protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia. La corrección de las construcciones obtenidas de esta forma se confirma mediante análisis de secuencia.
III. Incorporación de los mutantes de quitinasa en un plásmido de expresión en plantas Ejemplo 12 Construcción del plásmido pSCH10
El plásmido pSCH10 contiene la secuencia que codifica la quitinasa del tabaco a partir del clon genómico CHN17 así como del clon de ADNc CHN48, entrelazada en el plásmido vector pGY1. Esta secuencia es flanqueada por el promotor 35S del virus CaMV así como por sus secuencias de terminación. En cuanto a esta construcción se trata por consiguiente de la construcción de quitinasa de tipo salvaje. Esta se describe a continuación con detalle.
12.1 Construcción del plásmido pGY1
El plásmido pGY1 está derivado del vector de expresión vegetal pDH51 descrito por parte de Pietrzak y col. (1986). En el plásmido pGY1 está reemplazado el sitio de corte NcoI del plásmido de partida pDH51 por un sitio de corte XhoI.
El plásmido pDH51 se corta con NcoI y los extremos que lo soportan se reponen con polimerasa Klenow. En adelante los extremos lisos se ligan luego con un engarce (CCTCGAGG).
12.2. Construcción de plásmido pSCH10
El plásmido pSCH10 contiene la secuencia que codifica la quitinasa, que entrelaza la secuencia de no codificación transcrita en 5' así como 21 pares de bases dispuestas aguas arriba del sitio de comienzo de la transcripción así como una secuencia de no codificación que comprende 31 Bp, en el sitio de clonación BamH1/PstI del vector de expresión vegetal pGY1 del 35S de CaMV.
Las etapas de procedimiento necesarias para la preparación de pSCH10 se describen con detalle a continuación:
(1) El clon genómico \lambdaCHN17, que contiene el gen de quitinasa 48, se corta con HindIII. El fragmento de HindIII que comprende 5,6 Kb resultante se aísla y se entrelaza en el sitio de clonación de HindIII del plásmido pUC8, con formación del plásmido pCHN65.
(2) El plásmido pCHN65 se corta con EcoRI y el fragmento que comprende 2,5 Kb resultante, que contiene el extremo 5' de la región que codifica la quitinasa, se clona asimismo en pUC8. El plásmido generado recibe la designación pCHN68.
(3) El plásmido pCHN68 se digiere con PstI y se religa con pérdida de un fragmento PstI/EcoRI que comprende 0,5 Kb (se une consigo mismo). El plásmido resultante se designa con pCHN74.
(4) Para clonar la región de no codificación en 5' de la transcripción del gen 48 tras un sitio de corte BamHI, se digiere el plásmido pCHN74 en primer lugar con HphI, a continuación se provee con extremos lisos mediante acción de polimerasa de ADN T4 y finalmente se corta con PstI. El fragmento HphI/PstI se aísla y entrelaza en el plásmido pUC8 digerido con HincII/PstI [Vieira & Messing (1982)], con formación de pCHN87.
Tras secuenciación se muestra en función de la secuencia de ADN que durante la última etapa de procedimiento se pierde una base del sitio de corte 1/2 HincII.
(5) Se digiere pCHN87 con EcoRI y HindIII y se entrelaza en el vector de clonación pUC9 [Vieira & Messing (1982)]. El plásmido resultante recibe la designación pCHN88.
(6) El fragmento PstI que comprende 1 Kb del clon 48 del ADNc del tabaco (pCHN48) se entrelaza en el sitio de clonación PstI del plásmido pUC8 con formación de pCHN78.
(7) La inserción PstI del plásmido pCHN78 se libera mediante corte del plásmido con el enzima de restricción y se entrelaza en el sitio PstI de pCHN88, con lo que se prepara nuevamente la secuencia de ADN completa que codifica quitinasa. El plásmido resultante recibe la designación pCHN89.
(8) El plásmido pCHN89 se digiere a continuación completamente con BamHI y parcialmente con PstI. El fragmento que comprende 1,5 Kb resultante se clonó en el vector de expresión pGY1, que asimismo se cortó previamente con BamHI y PstI, con formación de pSCH10. Mediante esta etapa de clonación se coloca la secuencia de ADN de codificación de quitinasa entre el promotor del CaMV y la secuencia de terminación del CaMV.
Ejemplo 13 Incorporación de los mutantes de quitinasa en el plásmido de expresión vegetal pSCH10 13.1 Incorporación de los mutantes de quitinasa del tabaco
El fragmento PstI del plásmido pSCH10 se reemplaza por el siguiente fragmento PstI:
Fragmento PstI de pTUCH6 \rightarrow pSCM3
Fragmento PstI de pTUCH7 \rightarrow pSCM25
Fragmento PstI de pTUCH8 \rightarrow pSCM22
Fragmento PstI de pTUCH9 \rightarrow pSCM23
Fragmento PstI de pTUCH10 \rightarrow pSCM24
Estos plásmidos conservan en lo sucesivo las secuencias de "direccionamiento" terminales 3' mutadas, las cuales presentan las siguientes secuencias de nucleótidos:
11
Los nucleótidos modificados (mutados) respecto al plásmido de tipo salvaje [pSCH10] están en negrita y subrayados.
13.2. Incorporación de los mutantes de la quitinasa del pepino 13.2.1. Plásmido pSCU1
El fragmento EcoRI/BcII del plásmido pSCM1 y el fragmento BamHI/EcoRI del pTUCU4 se clonan en el plásmido pTZ18U cortado previamente con EcoRI. Se genera el plásmido pTUCU7.
\newpage
El fragmento EcoRI/NsiI del plásmido pTUCU7 y el fragmento NsiI/EcoRI del pTUCU6 se clonan en el plásmido pTZ18U previamente cortado con EcoRI. Se genera el plásmido pTUCU11.
El plásmido pTUCU11 se digiere luego con BamHI y XbaI y se aísla el fragmento BamHI/XbaI. Este se entrelaza a continuación en el plásmido pGYI cortado previamente con BamHI/XbaI, en donde se genera el plásmido pSCU1.
13.2.2. Plásmido pSCU3
El fragmento EcoRI/NsiI del plásmido pTUCU7 y el fragmento NsiII/EcoRI del pTUCU5 se clonan a continuación en el plásmido pTZ18U cortado previamente con EcoRI. Se obtiene de esta forma el plásmido pTUCU10.
El plásmido pSCU3 se genera mediante clonación del fragmento XhoI/BcII del plásmido pTUCU10 y del fragmento BgIII/PstI del plásmido pTUCU7 en el plásmido pGY1 cortado previamente con XhoI/PstI.
13.2.3. Plásmido pSCU6
Mediante clonación del fragmento XhoI/BcII del pTUCU10 y del fragmento BgIII/PstI del pTUCH10 en el plásmido pGY1 cortado previamente con XhoI/PstI se llega al plásmido pSCU6.
Los plásmidos pSCU3 y pSCU6 contienen en adelante en contraposición al plásmido de control pSCU1 secuencias de "direccionamiento" terminales 3', que muestran las siguientes secuencias de nucleótidos [5' \rightarrow 3']:
12
Los nucleótidos modificados (mutados) respecto al tipo salvaje están en negrita y subrayados.
Los nucleótidos incorporados nuevos mediante inserción están indicados con cursiva.
Ejemplo 14 Entrelazado de las construcciones pSCM y pSCU en un vector vegetal binario 14.1. Construcción del plásmido pCIB200
La construcción de este vector binario parte del plásmido pTJS75 descrito por Schmidhauser y Helinski (1985), de un derivado de RK2 (An G. y col, 1985), que comprende otra zona huésped y presenta un gen de resistencia a la tetraciclina. Este plásmido se corta con el enzima de restricción NarI y a continuación se une con el fragmento AccI de pUC4K [Vierra y Messing (1982)], el cual porta el gen NptI. El plásmido pTJS75kan formado de esta forma, que contiene junto con el gen de resistencia de la tetraciclina también el gen NptI, se digiere luego con el enzima de restricción SaII.
Simultáneamente el plásmido pCIB7, que describe SJ y col. (1987), se corta con EcoRV y el fragmento EcoRV resultante, que contiene la secuencia límite de ADN-T izquierda y derecha del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens así como un gen Nos/NptII químero y la región de poliengarce pUC, se une con engarces XhoI.
La construcción resultante se digiere luego con XhoI y se clona en el sitio de corte SaII del plásmido pTJS75kan. El plásmido resultante, cuya carta de genes se reproduce en la figura 1, recibe la designación pCIB200.
14.2. Clonación de los fragmentos EcoRI en pCIB200
El plásmido pCIB200 se corta en primer lugar con EcoRI. A continuación se clonan los siguientes fragmentos EcoRI en el pCIB200 cortado:
Fragmento EcoRI del plásmido pSCH10 \rightarrow pSCH12
Fragmento EcoRI del plásmido pSCM3 \rightarrow pSCM13
Fragmento EcoRI del plásmido pSCU1 \rightarrow pSCU11
Fragmento EcoRI del plásmido pSC3 \rightarrow pSC13
IV. Transformación en protoplastos del tabaco
Los plásmidos anteriormente descritos se ensayan in vitro con uso de un "Transient Expression Systems" (sistemas de expresión transitorios) en protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia.
Ejemplo 15 Preparación y cultivo de protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia
La preparación y cultivo de protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia tiene lugar con ayuda de procedimientos generalmente conocidos, análogos a la forma de proceder descrita para el tabaco [véase apartado 3]. Se encuentra una descripción detallada por parte de Shillito y Potrykus (1987) o por parte de Negrutiu y col., 1987.
Ejemplo 16 Transformación de los protoplastos
La transformación de protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia se lleva a cabo según el procedimientos descrito por Negrutiu y col. (1987).
Los protoplastos preparados según el procedimiento anterior se suspenden tras la última etapa de purificación en una solución, que presenta la siguiente composición:
Manita
0,4 M
CaCl_{2}
15-30 mM
MES
0,1% (en relación peso/volumen)
La densidad de protoplastos se encuentra en 1,6 - 2 x 10^{6} /ml.
Se mezclan 3 ml de esta suspensión de protoplastos en primer lugar en tubos de centrífuga de 15 ml con 5 \mug de ADN plásmido que se presenta en forma de una suspensión estéril acuosa [Paszkowski y col. (1984)]. Pocos minutos después se aporta a esta mezcla 0,3 ml de una solución de polietilenglicol [40% (en relación peso/volumen) PEG 6000 en manita 0,4 M, Ca(NO_{3})_{2} 0,1 M), pH 7,0] y se mezcla cuidadosamente este preparado. Unos minutos después se agregan 4 ml de medio K3 [Z. Pflanzenphysiol, 78: 453 - 455 (1976); Shillito y col., (1981)] y se incuban los tubos durante 24 horas en la oscuridad a una temperatura de 25ºC a 27ºC.
Para mejorar las propiedades de agregación de los protoplastos se puede añadir a continuación una solución salina W5 [Negrutiu y col., 1987] [5,4 ml]. Se centrifugan los protoplastos luego a velocidad reducida [aproximadamente 60 - 100 x g]. Se toma una alícuota del sobrenadante para el análisis posterior de la actividad de la quitinasa, el resto se deshecha. Los protoplastos separados se resuspenden en el medio restante y se transfiere a tubos Eppendorf, donde se determina de forma aproximada el volumen. Se usan alícuotas de esta suspensión para el análisis de la actividad de la quitinasa así como para el ensayo Western Blotting.
La transformación de los protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia con plásmido pCIB1005B y pCIB1005B\DeltaVTP se puede llevar a cabo según el procedimiento de "Negrutiu" modificado por Goodall y col. (1990).
V. Transformación y preparación de plantas transgénicas
Ejemplo 17.1.
Transformación de Agrobacterium tumefaciens con vectores binarios
Los vectores binarios descritos previamente en el ejemplo 14 se transforman con uso del siguiente procedimiento en la cepa LB4404 de Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens LB4 4404 contiene un plásmido Ti delecionado, al que le falta la región ADN-T, que presenta tanto posteriormente como anteriormente una región vir intacta [Hoekema y col. (1983)].
La cepa LB4404 de Agrobacterium tumefaciens se obtiene a una temperatura de 30ºC en un cultivo durante la noche en 5 ml de medio MG/L [véase apartado VIII]. A estos 5 ml de cultivo durante la noche se agregan luego 250 ml de medio MG/L y se entremezcla todo el resultante hasta que se consigue una densidad óptica de OD = 0,6 (a 600 nm). Las células se reúnen luego con una centrifugación a 8000g y se resuspenden en 5 ml de medio MG/L. Se incuban 200 \mul de esta suspensión celular con 0,2 \mug a 1 \mug de plásmido de ADN binario en medio MG/L, en donde este resultante se congela inmediatamente tras entremezcla simple en un baño de hielo seco / etanol. Después de 5 minutos se llevan los tubos a un baño de agua a 37ºC y ahí se dejan durante 5 minutos. Después de esto se añaden 2 ml de medio MG/L. Se incuba luego esta suspensión durante 2 a 3 horas en un baño de agua a 30ºC. A continuación se reúnen las células mediante una centrifugación. Se resuspenden las células en un pequeño volumen de medio MG/L y luego se siembran en placa sobre medio selectivo (placas MG/L con 100 \mug/ml de gentamicina). Tras 2 a 3 días a 30ºC aparecen las primeras colonias.
Ejemplo 17.2.
Transformación de Agrobacterium tumefaciens con vectores binarios
En una forma de realización alternativa se transfieren los vectores binarios descritos previamente en el ejemplo 14 mediante un cruce triparental [Rogers SG y col. (1986)], con uso de una cepa de ayuda de E. coli, que posee un plásmido con una función tra, a la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Como cepa de ayuda de E. coli se puede usar, por ejemplo, BHB1011 de E. coli, que contiene el plásmido pRK2013, que posee las funciones tra necesarias para la transferencia de los vectores binarios.
Se obtiene la LBA4404 de A. tumefaciens durante la noche a 28ºC en medio LB con 20 mg/l de rifampicina y 500 mg/l de estreptomicina.
Se obtienen BHB1011 de E. coli y cepas de E. coli con los vectores binarios durante la noche a 37ºC en medio LB con 25 mg/l de canamicina.
Se separa por centrifugación cada 1 ml de estos cultivos a 8000g, se lava en 1 ml de agua estéril o MgSO_{4} 10 mM, se separa de nuevo por centrifugación y se resuspende en 100 \mul de agua o una solución de MgSO_{4}. Se subdivide una placa con un medio sólido LB en cuatro sectores. En estos sectores se aplican gotas de tres cultivos bacterianos unos sobre otros y de esta forma se mezclan en tres de los cuatro sectores las tres posibles combinaciones de dos cultivos. Estos sirven como controles. En el cuarto sector por el contrario se mezclan los tres cultivos. Tras el secado de las gotas se incuban estas placas durante la noche a 28ºC. Después de esto se toma de cada sector una muestra y se suspende en agua o solución de MgSO_{4}. De estas suspensiones se preparan diluciones y se siembran sobre placas LB con 20 mg/l de rifampicina, 500 mg/l de estreptomicina y 25 mg/l de canamicina y se incuba durante dos a tres días a aproximadamente 28ºC. Se liberan colonias, que crecen a alta dilución del cruce triparenteral [en similar dilución de los cruces de control no pueden crecer] mediante siembra repetida de colonias individuales de bacterias padre eventualmente disponibles.
Ejemplo 18 Transformación de discos de hojas ("Leaf-disk") de N. sylvestris y N. tabacum
La transformación de discos de hojas se lleva a cabo esencialmente según el procedimiento descrito por Horsch y col. (1985).
Se obtiene LBA 4404 de A. tumefaciens (pCIB200; pSCH12; pSM13; pSCY11; pSCU13) durante la noche a una temperatura de 28ºC en un medio de sal de glutamato que está enriquecido con 20 mg/l de rifampicina, 500 mg/l de estreptomicina y 25 mg/l de canamicina y está regulado a un valor del pH de 5,6. En este cultivo durante la noche que contiene aproximadamente 3,3 x 10^{8} células, se incuban discos de hojas estériles (5 mm a 10 mm de diámetro) de N. sylvestris y N. tabacum cv. Havana 425 durante 5 minutos. Se extraen luego del cultivo y se secan sobre toallitas de papel estériles, antes de que se transfieran a cápsulas de Petri con un diámetro de 100 mm, que contienen un cultivo de alimentación.
Este cultivo de alimentación se compone de un medio base inmovilizado con ágar al 1% (DIFCO) (30 ml) según Linsmeier y Skoog (1965), que contiene como otros aditivos un indicador de pH (rojo de clorofenol, 5 mg/l) así como las sustancias de crecimiento vegetal quinetina (0,3 mg/l) y ácido a-naftilacético (2 mg/l). Este medio de ágar (medio A) se recubre con 1 a 2 ml de un cultivo en suspensión de 2 semanas de células S275N, que se deriva de tejido marcado de N. tabacum cv. Havana 425 (Eichholz y col., 1993), y se cubre con un papel de filtro (papel de filtro #1 de Whatman). Sobre este papel de filtro se colocan luego los discos de hojas.
Después de 48 horas se agregan los explanados para la inducción de germinación sobre un medio selectivo de igual composición, que además contiene 350 mg/l de cefotaxima así como 100 mg/l de canamicina (medio B) y se incuba a 25ºC y luz difusa (80 a 100 \muEinstein). El tejido de control co-cultivado se inocula al mismo medio sin canamicina. Los explanados se transfieren semanalmente a medio B fresco.
Se recogen 4 a 8 semanas tras el co-cultivo las germinaciones verdes desarrollados a partir de los explanados y se transfieren a recipientes de 50 ml sobre 25 ml de medio C (medio sólido con fitoágar al 0,6%). El tejido completo se cultiva a una temperatura de 24ºC a 28ºC a una intensidad de iluminación de 80 a 100 \muEinstein. Tras 1 a 2 semanas las germinaciones hechan raíces.
VI. Análisis del material vegetal transgénico (A) Comprobación indirecta de la localización de las vacuolas Ejemplo 19 Análisis de los protoplastos transformados
El análisis de los protoplastos transformados se lleva a cabo según los procedimientos descritos con detalle en los apartados 17 y 20.3.
19.1. Actividad de la quitinasa
Como es manifiesto a partir de la tabla 1, los protoplastos de control poseen una actividad de la quitinasa endógena. En el sobrenadante se comprueba por contra sólo una pequeña actividad.
Por el contrario a esto todas las construcciones de quitinasa del tabaco muestran una actividad total claramente mayor tanto en el agregado como también en el sobrenadante. La actividad de la quitinasa mayor total en todas las muestras de sobrenadante ensayadas se atribuye presumiblemente a una sobrecarga del sistema de clasificación celular. No obstante se reconocen claras diferencias:
En las construcciones pSCH10, pSCM22, pSCM23 y pSCM24 se encuentra la actividad de la quitinasa en el agregado 3 a 4 veces superior que las actividades medidas en los controles. En la construcción pSCM3 ha aumentado por el contrario la actividad de la quitinasa en el agregado únicamente en un 35%.
En las construcciones de la quitinasa de pepino pSCU1, pSCU3 y pSCU6 se encuentra en el agregado únicamente una actividad de la quitinasa mayor en un 10 - 20%, mientras que la actividad en el sobrenadante es superior en un factor de 7 a 8 (o bien de 4 para pSCU3) en comparación con los controles.
Los resultados de la tabla 1 se confirman mediante los resultados de Western Blott. Los datos de Western Blott para la construcción de la quitinasa de pepino muestran, por ejemplo, claramente que en el caso de pSCU1 (tipo salvaje) sólo está disponible muy poca quitinasa en los protoplastos transformados, mientras que en los protoplastos transformados con pSCU3 y pSCU6 se presentan concentraciones de quitinasa muy elevadas.
19.2. Actividad de la glucanasa
Los resultados conseguidos con los protoplastos de control [véase tabla 10] muestran que se retiene la \beta-1,3-glucanasa de la Nicotiana plumbaginifolia en las células.
Se consigue un resultado comparable con el uso de la construcción intacta [pC1B1005B], en donde en este caso únicamente se ha de observar una señal más fuerte en los extractos de protoplastos. Esto muestra que también la glucanasa del tabaco se mantiene en los protoplastos y por tanto se dirige correctamente al compartimento celular.
En el uso de la construcción con extensión C-terminal delecionado o inactivado [pC1B1005B\DeltaVTP] se segrega por el contrario la \beta-1,3-glucanasa en el medio de cultivo.
Ejemplo 20 Análisis de las plantas transformadas
Las plantas transformadas según el ejemplo 18 se analizan con ayuda del procedimiento descrito a continuación.
20.1. Extracción de líquido intercelular (ICF)
La extracción de líquido intercelular de tejido vegetal se puede llevar a cabo según los procedimientos descritos por parte de Parent y Asselin (1984).
A este respecto se reúnen en primer lugar hojas de plantas transgénicas regeneradas y se trituran en trozos de 4 a 5 cm^{2}. Estos se infiltran luego a presión reducida respectivamente durante 30 segundos con agitación suave con un gran exceso de tampón frío (aproximadamente 4ºC). Dicho tampón presenta de forma ventajosa las siguiente composición:
Tris-HCl [pH 7,8] con sacarosa 0,5 M
25,0 mM
MgCl_{2}
10,0 mM
CaCl_{2}
10,0 mM
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)
0,5 mM
2-Mercaptoetanol
5,0 mM
De forma alternativa a esto se puede usar también un tampón de citrato 50 mM (pH 5,5). También es posible operar a temperatura ambiente.
En la retirada de la presión reducida el tampón penetra en las hojas. Los trozos de hoja se secan a continuación cuidadosamente y se transfiere a una jeringuilla de 20 ml. Esto se suspende en un tubo de centrífuga y se centrifuga durante 10 minutos a bajas velocidades (aproximadamente 1000 x g) y a baja temperatura (4ºC).
20.2. Extracción de la fracción de proteína intracelular
Los trocillos de hoja tratados según el apartado 20.1 se homogeneizan a continuación en el mismo tampón. Las partículas gruesas se separan mediante centrifugación.
20.3. Determinar la actividad de la quinasa
La concentración de proteína se determina en ambos extractos con el ensayo de proteína Hilfedes BIORAD, que se basa en el procedimiento de Bradford. Este se basa en el cambio de color de un colorante en dependencia de la concentración de proteína.
La actividad de la quitinasa se puede determinar con ayuda de un ensayo radiométrico con uso de quitina marcada radiactivamente [tritiada] [Boller y col., (1983)]. Los resultados están transformantes de quitinasa del tabaco se reproducen en la tabla 2, para los transformantes de quitinasa del pepino en la tabla 3.
A partir de los resultados del experimento de transformación llevado a cabo aquí con protoplastos y plantas completas se comprueba resumidamente que el fragmento de péptido según la invención en el extremo C-terminal de la quitinasa básica del tabaco es responsable de la reclusión pretendida de la quitinasa en la vacuola de la planta. Además de esto los resultados con pSCM22, pSCM23 y pSCM24 hacen claramente que esté permitida una variación dentro de la secuencia de aminoácidos en el extremo C-terminal, sin que por ello se pierda la función de direccionamiento de esta secuencia. Si falta la secuencia de "direccionamiento" terminal 3' [pSCM3; pSCM13] una parte mayoritaria de la quitinasa presente en la vacuola se segrega en el espacio extracelular.
Además se puede mostrar en función de los presentes resultados que la secuencia de ADN según la invención también actúa en unión operable con un gen heterólogo [genes de quitinasa del pepino; pSCU3; pSCU6; pSCU13] como señal de "direccionamiento" de modo que se mantiene la proteína quinasa segregada de forma natural en la célula vegetal y con mucha probabilidad dentro de la vacuola.
(B) Comprobación directa de la localización de las vacuolas
Ejemplo 21.1
Asilamiento de los protoplastos
(adaptado según Muller y col., 1983)
Se cortan hojas de plantas transgénicas N. sylvestris de 1 - 1,5 g y se colocan en cápsulas de Petri en un osmótico K3M. El K3M contiene la mitad de la concentración del macroelemento K3 (por tanto sobre un litro 75 mg de NaH_{2}PO_{4} \cdot H_{2}O, 450 mg de CaCl_{2} \cdot 2 H_{2}O, 1250 mg de KNO_{3}, 125 mg de NH_{4}NO_{3}, 67 mg de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 125 mg de MgSO_{4}\cdot 7 H_{2}O) y 84 g de manita, pH 5,6; la osmoralidad se regula a 500 mOsm. Se cortan las hojas a continuación en tiras delgadas y se incuban durante una hora en el mismo osmótico. Se escurren luego las tiras de hoja y se colocan en una solución de digestión en 10 ml/cápsula. La solución de digestión contiene macerozima R10 al 0,4% (Serva) y celulisina al 0,6% (Calbiochem) en K3M (que contiene 75,6 g de manita, con lo que la osmoralidad alcanza con los enzimas de nuevo 500 mOsm). Las cápsulas de Petri se cierran con película de parafina y se incuban durante la noche sin agitación a 26ºC en la oscuridad. Para la rápida digestión se pueden filtrar a presión reducida las tiras de hoja también con la concentración de enzima doble y luego se incuban con agitación lenta (30 - 40 rpm) durante 2 a 3 horas.
Se filtran los protoplastos mediante un filtro de 100 \mum que se lava luego con la mitad de volumen de sacarosa 0,6 M. La suspensión se transfiere luego a tubos de centrífuga de 15 ml, se recubre con 2 ml de K3M y se centrifuga durante 10 minutos a 1000 g. Los protoplastos se succionan de la interfase, se diluyen con K3M y se separan por centrifugación durante 10 minutos a 700 g. A continuación se resuspenden los protoplastos centrifugados en medio K3M.
\newpage
Ejemplo 21.2
Aislamiento de las vacuolas (adaptado según Boudet y Alibert, 1987)
Se resuspenden los protoplastos en un medio K3M (pH 6,5) que contiene Ficoll al 20%. Se transfieren 2,5 ml de esto a tubos de centrífuga y luego se recubren sucesivamente con las siguientes soluciones: 2 ml de Ficoll al 15%, 7 mg de DEAE-dextrán (pH 6,5); 2 ml de Ficoll al 10%, 3 mg de sulfato de dextrán (pH 8,0); 2 ml de Ficoll al 6%, 3 mg de sulfato de dextrán (pH 8,0); y aproximadamente 4 ml de Ficoll al 0% (pH 8,0) (lleno hasta el borde). Estos tubos se centrifugan primeramente en un rotor de amortiguación (SW 41.14, Kontron) durante 15 minutos a 3500 rpm, luego 105 minutos a 40000 rpm. Se succionan las vacuolas de la interfase de Ficoll 0-6%.
Los marcadores se miden según Boller y Kende (1979). Para la medida de la hexosafosfato-isomerasa se debe precipitar primeramente el sulfato de dextrán con DEAE-dextrán, antes de que sea posible la medida. No es posible una determinación de la proteína según Bradford ya que ambas polibases trastornan esta determinación. Los resultados en la tabla 5 se normalizaron a la enzima marcadora de la vacuola \alpha-mannosidasa al 100%.
La comparación de las actividades de la quitinasa específicas en la tabla 4 confirma los resultados de la tabla 2:
En cuanto a las plantas M13.4 y U11.4.2 transformadas con plásmido pSCU13 o pSCU11, se encuentra una secreción de las quitinasas, mientras que en las plantas M10.4 y U13.15 transformadas con plásmido pSCH12 y pSCH13, es claramente demostrable una localización intracelular. Un análisis Westernblot confirma que la quitinasa de N. sylvestris se presenta intracelularmente y es responsable en los protoplastos M13.4 de gran parte de la actividad residual.
A partir de las plantas M10.7.4 y U13.15 se podrían aislar protoplastos. La medida de distintos marcadores (tabla 5) confirma la localización el avacuola de las quitinasas, que portan una secuencia C-terminal. También aquí un ensayo Westernblot confirma esta localización. La quitinasa endógena está igualmente en la vacuola.
De todas las series se podría obtener semillas de una o varias plantas autofecundables. Se podría demostrar a este respecto que se hereda la sobreproducción de quitinasa y la localización correspondiente en las generaciones siguientes.
Registro
Las siguientes cepas están registradas por parte de "American Type Culture Collection" en Rockville, Maryland, EEUU según las estipulaciones del contrato con Budapester:
13
Medios y soluciones tampón
Medio A
NH_{4}NO_{3} 1650 mg/l
KNO_{3} 1900 mg/l
CaCl_{2} x 2H_{2}O 440 mg/l
MgSO_{4} x 7 H_{2}O 370 mg/l
KH_{2}PO_{4} 170 mg/l
Na_{2}EDTA 37,3 mg/l
FeSO_{4} x 7 H_{2}O 27,8 mg/l
H_{3}BO_{3} 6,2 mg/l
MnSO_{4} x 7 H_{2}O 22,3 mg/l
ZnSO_{4}x 5 H_{2}O 8,6 mg/l
KI 0,83 mg/l
Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O 0,25 mg/l
CuSO_{4} x 5 H_{2}O 0,025 mg/l
(Continuación)
CoCl_{2} x 6 H_{2}O 0,025 mg/l
Sacarosa 30,0 g/l
Clorhidrato de tiamina 0,400 mg/l
Mio-inosita 100,0 mg/l
Quinetina 0,3 mg/l
Ácido a-naftilacético 2,0 mg/l
Rojo de clorofenol 5,0 mg/l
Ágar 10,0 g/l 
\vskip1.000000\baselineskip
Medio B
Misma composición que el medio A, pero sin ácido a-naftilacético así como con los siguientes aditivos:
Cefataxima 500 mg/l
Canamicina 75 mg/l 
\vskip1.000000\baselineskip
Medio C
Misma composición que el medio B, pero sin quinetina
\vskip1.000000\baselineskip
Medio MG/L para Agrobacterium
L-Broth 50%
Medio de manita-glutamato (Holsters y col. 1978) 50% 
\vskip1.000000\baselineskip
Osmótico K3M [500 mOsm; pH 5,6]
KH_{2}PO_{4} \cdot H_{2}O 75 mg/l
CaCl_{2} x 2H_{2}O 450 mg/l
KNO_{3} 1250 mg/l
KH_{4}NO_{3} 125 mg/l
(NH_{4})_{2}SO_{4} 67 mg/l
MgSO_{4} \cdot 7 H_{2}O 125 mg/l
Manita 84 mg/l 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución salina W5
NaCl 154 mM
CaCl_{2} x 2H_{2}O 125 mM
KCl 5 mM
Glucosa 5 mM
pH 5,6 - 6,0 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de lavado I
Sacarosa 154,0 g/l
MES 0,59 g/l
KNO_{3} 250,0 mg/l
NH_{4}NO_{3} 25,0 mg/l
NaH_{2}PO_{4} \cdot H_{2}O 15,0 mg/l
CaCl_{2} x 2H_{2}O 90,0 mg/l
MgSO_{4} \cdot 7 H_{2}O 25,0 mg/l
(NH_{4})_{2}SO_{4} 13,4 mg/l
Tampón TENP
Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM
EDTA 10 mM
NP-40 (Sigma Chem.) 1% (v/v) 
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón TBE
Tris-borato 89 mM
Ácido bórico 89 mM
EDTA 2 mM 
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón TE
Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM
EDTA 1 mM 
\vskip1.000000\baselineskip
SSC
NaCl 1,54 mM
Citrato de sodio 0,154 mM
(pH 7,0)
Tablas TABLA 1 Actividad de la quitinasa según expresión transitoria en protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia
14
TABLA 2 Actividad de la quitinasa del tabaco en plantas transgénicas
15 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Actividad de la quitinasa del pepino en plantas transgénicas
16 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Actividad de la quitinasa en protoplastos de plantas transgénicas
17
TABLA 5 Localización de marcador intracelular en preparaciones de vacuolas de plantas sobreproductoras de quitinasas
18 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6 Segregación de la resistencia a la canamicina en la primera generación descendiente de plantas transgénicas (se espera 3 KanR: 1 KanS)
20
TABLA 7 Análisis de las plantas transgénicas descendientes (sólo se ensayaron plantas KanR)
Concentración en hojas homogeneizadas
21 
\newpage
TABLA 8 Análisis de la descendencia de plantas transgénicas (sólo se ensayaron plantas KanR)
Concentración en hojas homogeneizadas
22
La actividad de la quitinasa se midió en presencia de inmunoglobulina frente a la quinasa del tabaco. 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 9 Actividad de la quitinasa de pepino en plantas F1 transgénicas
23 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 10 Actividad de la \beta-1,3-glucanasa madura, marcada con ^{35}S en protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia
24 
\newpage
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WO 88/0 5826
WO 88/0 4371
US-P 4.810.777
SEQ ID Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 39 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: Secuencia de ADN hipotética construida en base a la degeneración del código genético.
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: Péptido señal codificado, que es responsable de la localización en la vacuola de las moléculas de proteína asociadas.
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 39 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc de ARNm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: pCHN48
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: péptido señal codificado, que es responsable de la localización en la vacuola de las moléculas de proteína asociadas.
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 39 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc de ARNm (mutado mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: pCHN48
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: péptido señal codificado, que es responsable de la localización en la vacuola de las moléculas de proteína asociadas.
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 39 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc de ARNm (mutado mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: pCHN48
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: péptido señal codificado, que es responsable de la localización en la vacuola de las moléculas de proteína asociadas.
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 39 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc de ARNm (mutado mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: pCHN48
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: péptido señal codificado, que es responsable de la localización en la vacuola de las moléculas de proteína asociadas.
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 40 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc de ARNm (mutado mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: pCHN48
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: péptido señal codificado, que es responsable de la localización en la vacuola de las moléculas de proteína asociadas.
\vskip1.000000\baselineskip
30 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 30 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc de ARNm (mutado mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: Nicotiana tabacum/pepino
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: pCHN48 / pBSCucCht5
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: péptido señal codificado, que es responsable de la localización en la vacuola de las moléculas de proteína asociadas.
\vskip1.000000\baselineskip
31 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 21 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc de ARNm (fragmento de la secuencia reproducida en la SEQ ID Nº 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: pCHN48
\newpage
PROPIEDADES: péptido señal codificado, que es responsable de la localización en la vacuola de las moléculas de proteína asociadas.
\vskip1.000000\baselineskip
32 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 24 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc de ARNm (fragmento de la secuencia reproducida en la SEQ ID Nº 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: pCHN48
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: péptido señal codificado, que es responsable de la localización en la vacuola de las moléculas de proteína asociadas.
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 3850 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
FORMA DE LA CADENA: cadena doble
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: Genoma-ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: Nicotiana tabacum L. cv. Havana 425
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: \lambdaCHN17 [fago \lambda]
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: gen de quitinasa básico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAATTCAATC AAAATGTGTT TTGTATATAG GGTGTCAACT ACTAATATAT 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
34
35
36
37
SEQ ID Nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1103 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
FORMA DE LA CADENA: cadena doble
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: hojas de pepino infectadas con TNV
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: pBSCucCht5 [ATCC 40528]
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: gen de quitinasa ácido.
\vskip1.000000\baselineskip
38 
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con péptido correspondiente
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 69 pares de bases
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc de ARNm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA NATURAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
PROCEDENCIA EXPERIMENTAL DIRECTA
\vskip1.000000\baselineskip
NOMBRE DEL CLON: pBS-Gluc39.1 [ATCC 40526; descrito en el documento EP-A 0.332.104]
\vskip1.000000\baselineskip
PROPIEDADES: péptido señal codificado, que es responsable de la localización en la vacuola de las moléculas de proteína asociadas.
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39 
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Claims (40)

1. Secuencia de ADN, que codifica un péptido, caracterizada porque dicha secuencia proviene de la región terminal 3' de un gen, que codifica una molécula de proteína presente de forma natural en la vacuola y porque dicha secuencia de ADN codifica un péptido C-terminal [extensión C-terminal], que es responsable de una reclusión pretendida ["direccionamiento"] de un producto génico asociado de origen heterólogo en la vacuola vegetal, en la que dicha secuencia de ADN proviene de la región terminal 3' de un gen de quitinasa vegetal.
2. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha secuencia presenta la siguiente secuencia de nucleótidos general reproducida en SEQ ID Nº: 1: CGN/ARG TCN/AGW TTY GGN AAY GGN CTN/TTR TTR/CTN GTN GAY ACN ATG TAA en la que significan
N, A o g o C o T/U;
R, G o A;
W, A o T/U; y
Y, T/U o C.
3. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha secuencia proviene de la región terminal 3' de un gen de quitinasa básico de plantas de Nicotiana tabacum L. c.v. Havana 425 y presenta la siguiente secuencia de nucleótidos reproducida en la SEQ ID Nº: 2:
3' - AGG TCT TTT GGA AAT GGA CTT TTA GTC GAT ACT ATG TAA - 5'
4. Secuencia de ADN, que es esencialmente homóloga a las secuencias de ADN reproducidas en una de las reivindicaciones 1 a 3 y presenta también las propiedades esenciales según la invención de estas secuencias, es decir, codifica un péptido C-terminal, que actúa como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal, caracterizada porque dicha secuencia presenta una de las secuencias de nucleótidos reproducidas en las SEQ ID Nº: 3 a 7:
40
41
5. Secuencia de ADN según la reivindicación 4, caracterizada porque se trata de una secuencia de ADN de origen natural.
6. Secuencia de ADN según la reivindicación 4, caracterizada porque se trata de una secuencia preparada con ayuda de procedimientos de mutación conocidos.
7. Secuencia de ADN según la reivindicación 6, caracterizada porque en cuanto a dicho procedimiento de mutación se trata de una mutagénesis mediada por oligonucleótidos.
8. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADN representa una secuencia parcial de la secuencia de ADN reproducida en la SEQ ID Nº: 2 y codifica un péptido que es responsable de la reclusión (direccionamiento) de un producto génico asociado de origen heterólogo en la vacuola vegetal.
9. Secuencia de ADN según la reivindicación 8, que presenta secuencias de nucleótidos reproducidas en la SEQ ID Nº: 8 y 9:
42
10. Péptido, caracterizado porque proviene de la región C-terminal de un gen, que codifica una molécula de proteína presente de forma natural en la vacuola y que es responsable de la reclusión pretendida ["direccionamiento"] de la molécula de proteína asociada en la vacuola vegetal, en donde dicho péptido proviene de la externsión C-terminal de una quitinasa vegetal y se codifica de una secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Péptido según la reivindicación 10, que actúa como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal y que presenta la siguiente secuencia de aminoácidos reproducida en las SEQ ID Nº: 1 y 2:
Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met
12. Péptido según la reivindicación 10, que actúa en asociación con una molécula de proteína como señal de "direccionamiento" para la vacuola vegetal y que presenta una de las secuencias de aminoácidos reproducidas en SEQ ID Nº: 3 a 7:
43
13. Péptido según la reivindicación 10, que se codifica mediante una de las secuencias de ADN según la reivindicación 9 y presenta una de las secuencias de aminoácidos reproducidas en la SEQ ID Nº: 8 y 9:
Leu Leu Val Asp Thr Met End {}\hskip-0,7cm Gly Leu Leu Val Asp Thr Met End
14. Molécula de ADN recombinate, caracterizada porque contiene una construcción genética híbrida, en la que una secuencia de ADN, que se obtiene a partir de la región terminal 3' de un gen, que codifica una molécula de proteína presente en la vacuola de forma natural y en la que dicha secuencia de ADN codifica un péptido C-terminal [extensión C-terminal], que es responsable de la reclusión pretendida ["direccionamiento"] de un producto génico asociado de origen heterólogo en la vacuola vegetal, en donde dicha secuencia de ADN no codifica los aproximadamente 20 aminoácidos C-terminales del producto de traslación primario de la osmotina de tipo salvaje, está unida de forma operable con un gen heterólogo.
15. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 14, caracterizada porque contiene una construcción genética híbrida, en la que una secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 1 a 9 está unida de forma operable con un gen heterólogo.
16. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque la construcción genética híbrida está unida de forma operable con señales de expresión activas en células vegetales y, dado el caso, con otras secuencias de codificación y/o de no codificación de la región 3' y/o 5', de modo que en la transformación en un huésped vegetal tiene lugar una reclusión pretendida del producto de expresión en la vacuola vegetal.
17. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 16, caracterizada porque se trata de señales de expresión que provienen de genes de plantas o virus de plantas o bien de señales de expresión bacterianas.
18. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 17, caracterizada porque se trata de señales de promotor y/o terminación de genes del virus Caulflower Mosaik (CaMV).
19. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 17, caracterizada porque se trata de señales de expresión de genes de la nopalina-sintasa (nos) y/o de genes de la octopina-sintasa (ocs) de plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens.
20. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 16, caracterizada porque dicha molécula de ADN recombinante contiene adicionalmente secuencias de ADN regulatorias de no codificación de la región 3' y/o 5', que están en la situación de regular la transcripción de una secuencia de ADN asociada en tejidos vegetales en el sentido de una inducción o represión.
21. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 16, caracterizada porque dicho gen heterólogo contiene en su región terminal 5' una secuencia o bien está unido de forma operable con una secuencia del tipo que codifica un péptido señal N-terminal.
22. Molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizada porque dicho gen heterólogo se trata de un gen de estructura, que está en la situación de facilitar a las células vegetales transformadas así como a los tejidos desarrollados a partir de estas y especialmente a las plantas mismas un efecto protector frente a patógenos, productos químicos así como inclemencias metereológicas adversas.
23. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 22, caracterizada porque dicho gen se trata de un gen que exprime la quitinasa en células vegetales.
24. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 22, caracterizada porque dicho gen heterólogo se trata de un gen que exprime la glucanasa en células vegetales.
25. Molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizada porque dicha construcción genética híbrida en la expresión en la célula vegetal transformada se selecciona como tal o como componente de una unidad organizada superior del grupo constituido por un tejido, órgano, callo, embrión o una planta completa, conduce a un producto de expresión que se recluye en la vacuola vegetal.
26. Molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizada porque contiene adicionalmente una secuencia de ADN que codifica un marcador fenotípico seleccionable.
27. Molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizada porque contiene adicionalmente un origen de replicación, que permite una replicación en uno o varios microorganismos.
28. Vector de clonación que comprende una molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 27.
29. Vector de transformación y/o vector de expresión que comprende una molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 27.
30. Vector de transbordo que comprende una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 27, que está en la situación tanto de replicarse de forma estable en E. coli como en A. tumefaciens.
31. Organismo huésped no humano que comprende una molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 27 o un vector según una de las reivindicaciones 28 a 30.
32. Organismo huésped según la reivindicación 31, caracterizado porque dicho organismo huésped se trata de una bacteria o bien de una planta.
33. Material vegetal, seleccionado del grupo constituido por protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, polen, células huevo, cigotos que contiene una molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 27 o un vector según una de las reivindicaciones 28 a 30.
34. Planta transgénica incluyendo su descendencia sexual o asexual que comprende una molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 27 y/o un vector según una de las reivindicaciones 28 a 30.
35. Planta transgénica regenerada a partir de material vegetal según la reivindicación 33, que contiene una molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 27 o un vector según una de las reivindicaciones 28 a 30.
36. Planta transgénica según una de las reivindicaciones 34 a 35, caracterizada porque se trata de una planta fértil.
37. Producto de multiplicación de una planta transgénica según una de las reivindicaciones 34 a 36, caracterizado porque el producto de multiplicación contiene una molécula de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 14 a 27 y/o un vector según una de las reivindicaciones 28 a 30.
38. Partes de una planta transgénica según una de las reivindicaciones 34 a 36, caracterizadas porque estas partes son flores, tallos, frutas, hojas o raíces.
39. Procedimiento para la preparación de una molécula de ADN recombinante para la reclusión pretendida de productos de expresión en la vacuola vegetal, que se caracterizan esencialmente porque
(a)
se aísla en primer lugar la región 3' de un gen, que codifica una molécula de proteína presente de forma natural en la vacuola, o esta se sintetiza con ayuda de procedimientos conocidos;
(b)
se inserta de forma operable la secuencia de ADN mencionada en el extremo terminal 3' de un gen de estructura discrecional, que es heterólogo respecto de la secuencia de "direccionamiento" asociada definida en (a).
40. Procedimiento según la reivindicación 39, caracterizado porque dicho gen de estructura contiene en su región terminal 5' una secuencia o bien se une de forma operable con una secuencia del tipo que codifica un péptido señal N-terminal.
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