ES2242180T3 - Metodos para la produccion de semillas hibridas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SUMINISTRA UN METODO DUAL PARA PRODUCIR PLANTAS MACHOS, ESTERILES. DOS PLANTAS GENETICAMENTE TRANSFORMADAS, PADRES 1 Y 2 SE CRUZAN PARA OBTENER LA PROGENIE MACHO, ESTERIL. EL PADRE 1 ESTA TRANSFORMADO CON UN CASSETTE DE EXPRESION QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA QUE CODIFICA UN PROMOTOR ESPECIFICO DE ANTERA QUE SE ENCUENTRA UNIDO A UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA QUE CODIFICA UN TRANSACTIVADOR. EL PADRE 2 ESTA TRANSFORMADO CON UNA CASSETTE DE EXPRESION QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA OBJETIVO, QUE ES CAPAZ DE SER ACTIVADA MEDIANTE EL TRANSACTIVADOR, OPERABLEMENTE UNIDA A UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA QUE CODIFICA RNA O UN POLIPEPTIDO QUE INTERRUMPIRA LA FORMACION DEL POLEN VIABLE. DE ESTA FORMA, CRUZANDO EL PADRE 1 Y EL PADRE 2 SE OBTENDRA UNA PROGENIE MACHO, ESTERIL. LAS PLANTAS MACHO, ESTERILES SON UTILES PARA PRODUCIR SEMILLAS HIBRIDAS. LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA COMPOSICIONES Y METODOS PARA LA EXPRESION DE ALTO NIVEL DE UNA REGION DE CODIFICACION DE INTERES EN UNA PLANTA.

Description

Métodos para la producción de semillas híbridas.

La presente invención corresponde al campo de la ingeniería genética de plantas. En concreto, se refiere a un método para la producción de plantas macho estériles y al uso de dichas plantas en la producción de semillas híbridas. Además, se refiere a plantas macho estériles transgénicas y a las semillas híbridas producidas por el método según la invención.

La heterosis en el maíz ha sido objeto de mucha atención debido a su efecto acusado en la mejora del rendimiento. Esta mejora de productividad se describió por primera vez hacia finales del siglo diecinueve al cruzar cepas diferentes de maíz y, a partir de entonces, se desarrolló según procedimientos genéticos sistemáticos.

El método habitual para el cultivo del maíz híbrido es establecer muchas líneas endogámicas, cruzarlas entre sí, y determinar cual de los híbridos son los más productivos en una zona dada.

El éxito del maíz híbrido ha impulsado a los criadores de plantas a investigar la existencia y magnitud del vigor híbrido en muchas otras especies de importancia económica. En general, los híbridos aumentan los rendimientos. Suelen utilizar los factores de crecimiento de forma más eficaz y dan mayor rendimiento por unidad para los factores de crecimiento tales como el agua y el fertilizante. En condiciones adversas, híbridos F1 suelen ser superiores a los cultivares no transgénicos, y su rendimiento es más estable en entornos muy variados. Con el uso de híbridos, existe uniformidad del producto y de la madurez que a menudo facilita la cosecha y aumenta el valor del producto en el mercado. El híbrido F1 puede combinar características que, de otra manera, son difíciles o imposibles de combinar. Esta afirmación es especialmente cierta para muchos híbridos interespecíficos e intergénicos. La conclusión general de la investigacin en el campo es que el vigor híbrido, un fenómeno común en las plantas, es de magnitud suficiente para propiciar una explotación comercial siempre que se puedan desarrollar las técnicas
apropiadas.

Durante muchos años, se ha reconocido el vigor híbrido como un fenómeno extendido entre las plantas y los animales. Ahora, los híbridos comerciales se usan de forma extendida en muchos cultivos, incluyendo los de maíz, sorgo, remolacha azucarera, y girasol. Se está investigando otros cultivos que puedan permitir el uso extendido de los híbridos comerciales en el futuro.

Los híbridos comerciales tienen mayor potencial para los cultivos en los que las semillas híbridas pueden producirse de forma fiable y económica. Tres requisitos biológicos para la producción exitosa de semillas híbridas incluyen la presencia de vigor híbrido, la eliminación de polen fértil en la planta hembra madre y una polinización adecuada por la planta padre.

Con tal de producir semillas híbridas no contaminadas por semillas autofertilizadas, se tienen que implementar métodos de control de polinización para asegurar una polinización cruzada y no una autopolinización. Los mecanismos conocidos de control de polinización son generalmente mecánicos, químicos, o genéticos.

Se puede conseguir la eliminación de polen fértil de la planta hembra madre mediante la emasculación manual en el caso de algunas especies tales como el maíz, una especie monoica. Para eliminar el polen fértil de esta forma, se tira o corta la inflorescencia masculina (la espiga) de las plantas en la población de las hembras madre. Este procedimiento sencillo evita la autofertilización por quitar las espigas de las plantas hembras mecánicamente antes de la liberación del polen para evitar semillas autofertilizadas. Sin embargo, la mayoría de las plantas de cultivo de interés tienen tanto órganos macho como órganos hembra en la misma flor. En este caso, la emasculación no es un procedimiento sencillo. De todas formas, esta forma de semilla híbrida exige un trabajo intensivo y por lo tanto, es cara.

Para evitar la eliminación laboriosa de espigas que es necesaria para evitar la autofertilización en los cruces híbridos, se han utilizado factores citoplásmicos que producen esterilidad macho en algunas especies en combinación con genes restauradores.

La esterilidad macho en la hembra madre se puede controlar mediante genes nucleares o de un sistema citoplásmico-genético. La esterilidad genética macho es controlada por los genes nucleares en los cuales los alelos para la esterilidad generalmente son recesivos frente a los alelos para la fertilidad. La esterilidad genética macho ocurre en muchas especies. Normalmente, lo controla un solo gen recesivo, que tiene que ser homocigoto para provocar la esterilidad macho. Los criadores que hacen uso de la esterilidad genética macho para la producción de semillas híbridas normalmente desarrollan una línea hembra fenotípicamente uniforme que segrega a una relación de 1:1 para individuos Msms y no Msms. Las semillas para estas líneas se aumentan en aislamiento cosechando las semillas de plantas Msms que son polinizadas de plantas Msms. Para producir semillas híbridas F1 con la esterilidad genética macho, el 50 por ciento de las plantas hembras Msms tienen que eliminarse del campo en cuanto se pueda identificar su fertilidad. El trabajo asociado con separar las plantas fértiles de las plantas hembras ha limitado notablemente el uso de la esterilidad genética macho en la producción de semillas híbridas. Existen varios problemas asociados con este sistema en la producción de semillas híbridas comerciales. En primer lugar, no es posible eliminar las plantas fértiles de las deseadas plantas macho estériles en la población hembra. Las plantas macho estériles genéticas tienen que mantenerse acoplándolas con individuos macho fértiles. De llevar a cabo este cruce, la mitad de las plantas F1 sería estéril, pero las demás plantas serían fértiles. Así, las plantas macho fértiles no deseadas en la población hembra pueden diseminar el polen y reducir la efectividad del deseado padre macho.

El uso exitoso de la esterilidad macho citoplásmica para la producción de semillas híbridas comerciales exige un citoplasma macho estéril estable, una fuente adecuada de polen, y un sistema efectivo de transferir el polen del padre macho a la hembra macho estéril. Además, el sistema citoplásmico-genético de esterilidad macho exige tres líneas para producir un solo híbrido cruzado: la línea A (macho estéril), la línea B (conservador macho fértil) y la línea R (macho fértil con genes restauradores). Los cruces tri-direccionales producidos con la esterilidad macho citoplásmica-genética involucraron la conservación y producción de cuatro líneas, una línea A y B de una planta endogámica y plantas endogámicas macho fértiles de los otros dos.

Adicionalmente, la Plaga de Maíz Sureña causada por Helminthosporium maydis, Cepa T, que atacó severamente todos los híbridos de maíz con citoplasma T macho estéril, demostró la vulnerabilidad de la industria de producción de semillas híbridas basadas en una sola fuente de citoplasma macho estéril. Para el maíz híbrido, la mayoría de los productores de semillas han vuelto a la emasculación manual o mecánica y la polinización por el viento.

También se pueden producir semillas híbridas mediante el uso de sustancias químicas que bloquean o paran la formación de polen viable. Estas sustancias, las gametocidas, se usan para proporcionar una esterilidad-macho transitoria. Sin embargo, el coste y la disponibilidad de las sustancias químicas y la fiabilidad de las aplicaciones limitan la producción de las semillas híbridas con las gametocidas.

Los métodos moleculares para la producción de semillas híbridas también se han descrito. Dichos métodos transforman las plantas con constructos de ADN antisentido y otros genes que son capaces de controlar la producción de polen fértil en plantas. Tales plantas regeneradas son funcionalmente macho estériles y se usan para la producción de semillas híbridas por el cruce con polen de plantas macho fértiles. Las principales desventajas de dichos planteamientos derivan del hecho de que el gen de esterilidad macho genéticamente manipulado, bien si es un gen antisentido o un ARNasa, solo puede mantenerse en un estado heterocigótico. Son esencialmente lo mismo que las plantas naturalmente macho estériles en el sentido de que tienen que conservarse mediante el cruce con líneas isogénicas macho fértiles. Esto representa el mayor problema en los campos de híbridos cruzados que son extensos y donde el rendimiento es crucial. Las hembras madre heterocigóticas, de las cuales sólo el 50% serán macho estériles, tienen que plantarse en filas contiguas con el padre macho donante de polen y el 50% de hembras madre fértiles se tienen que eliminar. Este trabajo resulta más fácil en plantas macho estériles genéticamente modificadas porque se puede asociar un gen de resistencia a herbicida con el gen de esterilidad macho, y se puede aplicar el rociado de herbicida para eliminar las plantas fértiles, pero aún así, significa que las filas de hembras madre tienen que plantarse a doble densidad con tal de conseguir el mismo rendimiento por hectárea en dicho sistema. Esto conllevará una pérdida de rendimiento debido a la competencia. El rociado de herbicida también significa una pérdida de rendimiento porque las plantas resistentes nunca llegan a ser el cien por cien inmunes a la herbicida, y los costes del rociado de la sustancia química son sustanciosos.

De acuerdo con lo anterior, el objeto principal de la presente invención fue proporcionar una técnica relativamente sencilla para la formación de semillas híbridas que no conlleve las desventajas de los métodos conocidos tal como se ha descrito anteriormente.

Para conseguir el objeto dentro del ámbito de la presente invención, fue posible proporcionar un método para la producción de plantas macho estériles. El método de acuerdo con la invención comprende el cruce de dos plantas genéticamente modificadas con un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido, un transactivador, capaz de regular una segunda secuencia de nucleótido, una secuencia diana de nucleótidos. La secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido está conectada funcionalmente a un promotor específico de anteras.

La planta madre 2 se transforma con un casete de expresión que comprende la secuencia diana de nucleótidos conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN o un polipéptido, y ambos son capaces de interferir en la formación de polen viable. Cuando se crucen la planta madre 1 y la planta madre 2, el polipéptido 1, el transactivador, regula la secuencia diana de nucleótidos e inicia la expresión del polipéptido 2. De esta forma, no se forma polen viable en la siguiente generación.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención se refiere principalmente a un método para la producción de plantas macho estériles, comprendiendo dicho método:

(i) transformar una primera célula vegetal madre con un casete de expresión, comprendiendo dicho casete una secuencia de nucleótidos que codifica una región reguladora 5' específica de anteras conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido transactivador; y regenerar una planta transformada, la planta madre 1, de dicha primera célula vegetal transformada;

(ii) transformar una segunda célula vegetal madre con un segundo casete de expresión que comprende una secuencia diana de nucleótidos que es susceptible de activación por dicho polipéptido transactivador conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica ARN antisentido o un polipéptido que, al expresarse, interfiere en la formación de polen viable; y regenerar una planta transformada, la planta madre 2, de dicha segunda célula vegetal transformada;

(iii) cruzar dicha planta madre 1 con dicha planta madre 2 para proporcionar descendientes macho estériles.

Por lo tanto, la invención se refiere adicionalmente a las plantas transgénicas y la progenie de las mismas, que comprenden un casete de expresión integrado de forma estable en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un promotor específico de anteras que está conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica un transactivador.

La invención también se refiere a plantas transgénicas y su progenie, que comprenden un casete de expresión integrado de forma estable en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia diana de nucleótidos, que es capaz de ser activada por un transactivador, conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica ARN antisentido o un polipéptido que interferirá en la formación de polen viable.

Además, la invención comprende las plantas macho estériles y su progenie, que comprende un primer casete de expresión integrado de forma estable que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un promotor específico de anteras que está conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica un transactivador y un segundo casete de expresión que comprende una secuencia diana de nucleótidos, que es activada por dicho polipéptido transactivador, conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica ARN antisentido o un polipéptido que interferirá en la formación de polen viable.

Una planta transgénica según la invención puede ser una planta dicotiledónea o monocotiledónea. Las plantas preferidas son las plantas monocotiledóneas de la familia Graminaceae del tipo Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzea, Avena, Hordeum, Secale y Setaria.

Plantas especialmente preferidas son el maíz, el trigo, y la cebada transgénicos.

Para la expresión "progenie", se entiende la progenie de plantas transgénicas generadas tanto "asexualmente" como "sexualmente". Se pretende que esta definición incluya todos los mutantes y variantes obtenibles mediante procedimientos conocidos, tales como por ejemplo la fusión de células o una selección de mutantes, y que todavía exhiban las propiedades características de la planta modificada inicial, junto con todos los productos del cruce y fusión de la materia modificada de la planta.

Otro objeto de la invención se refiere al material de proliferación de plantas transgénicas.

Con referencia a la invención, se define el material de proliferación de plantas transgénicas como cualquier material que puede propagarse sexualmente o asexualmente en vivo o en vitro. Especialmente preferidos dentro del ámbito de la presente invención son los protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, polen, células del huevo, zigotos, junto con cualquier otro material, capaz de propagar, obtenido de las plantas transgénicas.

Las partes vegetales, como por ejemplo las flores, los tallos, las frutas, las hojas, las raíces que tienen su origen en plantas transgénicas o su progenie previamente transformada con un proceso de la invención y que, por lo tanto, consiste, al menos parcialmente, en las células transgénicas, también son objeto de la presente invención.

Las plantas macho estériles según la invención son útiles para la producción de semillas híbridas, lo que constituye un objeto adicional de la invención.

De acuerdo con esto, la invención también se refiere a un método para la producción de semillas híbridas de plantas seleccionadas de las especies de plantas que producen polen y que son susceptibles a una modificación genética, comprendiendo dicho método:

(a) producir plantas macho estériles:

(i)

transformando una primera célula vegetal madre con un primer casete de expresión, comprendiendo dicho casete una secuencia de nucleótidos que codifica una región reguladora 5' específica de anteras conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido transactivador;

(ii)

regenerando una planta transformada, la planta madre 1, a partir de dicha primera célula vegetal transformada;

(iii)

transformando una segunda célula vegetal madre con un segundo casete de expresión que comprende una secuencia diana de nucleótidos que es susceptible de activación por dicho polipéptido transactivador conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica ARN antisentido o un polipéptido que, al expresarse, interfiere en la formación de polen viable;

(iv)

regenerando de una planta transformada, la planta madre 2, de dicha segunda célula vegetal transformada; y (v) el cruce de dicha planta madre 1 con dicha planta madre 2 para proporcionar descendientes macho estériles; y

(b) cruzar dichos descendientes macho estériles con una línea fértil seleccionada para obtener la semilla híbrida.

Por lo tanto, la invención también comprende las semillas híbridas producidas por un método tal como se ha descrito anteriormente.

Por lo tanto, adicionalmente, la invención comprende plantas transgénicas que han sido modificadas con los dos constructos descritos anteriormente. La planta transgénica según la invención puede ser una planta dicotiledónea o monocotiledónea. Las plantas preferidas son las plantas monocotiledóneas de la familia Graminaceae tipo Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzea, Avena, Hordeum, Secale y Setaria.

Plantas especialmente preferidas son el maíz, el trigo, y la cebada transgénicos.

En concreto, la presente invención proporciona un sistema dual para la producción de plantas macho estériles. El sistema comprende el cruce de dos plantas genéticamente modificadas, referidas de ahora en adelante como las plantas madre 1 y 2. La planta madre 1 se modifica con un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que dirige la expresión de un primer polipéptido en las anteras. Este primer polipéptido es capaz de regular la trascripción de una segunda secuencia de nucleótidos, el AND diana, que dirige la expresión de ARN o un segundo polipéptido capaz de interferir en la producción de polen viable. La planta madre 2 se modifica con un casete de expresión que comprende una secuencia diana de nucleótidos funcionalmente conectada a una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN o un polipéptido capaz de interferir en la formación de polen viable.

Como ya se ha apuntado, el ARN o el segundo polipéptido sólo pueden expresarse en la presencia del primer polipéptido, el transactivador. Como consecuencia, ambas plantas madre 1 y 2 son macho fértiles. Sin embargo, al cruzar la planta madre 1 con la planta madre 2, el transactivador regula la expresión del ARN o el polipéptido 2 mediante la secuencia diana de ADN. El resultado es que no se produce polen viable. La progenie que resulta y que contiene ambos casetes de expresión son macho estériles.

La esterilidad macho es el fracaso o la incapacidad de producir polen funcional o viable. La esterilidad macho puede resultar de defectos que conducen a la falta de formación de polen o a la falta de capacidad funcional en el polen cuando se forma. Por lo tanto, bien el polen no se forma o, si se forma, es o no viable o incapaz de una fertilización efectiva bajo condiciones normales.

Las plantas macho estériles de la invención son hembra fértiles. Es decir, las plantas no producen polen fértil, sin embargo, son capaces de aceptar el polen de la planta padre deseada, lo que resulta en fertilización y la producción de semillas.

Existen varios polipéptidos transactivadores que pueden usarse en el presente sistema dual de esterilidad. El aspecto importante es que el ARN o el segundo polipéptido que interfiere en la formación de polen no se expresa en ausencia del primer polipéptido o transactivador.

Los transactivadores de la invención son capaces de activar una secuencia diana de nucleótidos que está conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN o un segundo polipéptido en el que ambos son capaces de interferir en la producción de polen viable. Como consecuencia, la secuencia de nucleótidos funcionalmente conectada a la secuencia diana sólo se expresa en presencia del transactivador.

Los transactivadores de la invención incluyen, pero no se limitan a, las polimerasas, las proteínas de unión a ADN, activadores transcripcionales tanto naturales como sintéticos, activadores postranscripcionales, y parecidos. Un ejemplo del uso de tales polipéptidos transactivadores para dirigir la expresión de otra secuencia de nucleótidos es la ARN polimerasa T7. Véase, las patentes estadounidenses números 5,122,457, 5,126,251, y 5,135,855; Lassner et al., (1991) Plant Molecular Biology 17:229-234; Rodríguez et al., (1990) Journal of Virology 64:4851-4857; Vennema et al., (1991) Gene 108:201-210; Benton et al., Molecular and Cellular Biology (1990) Molecular and Cellular Biology 10:353-360; Elroy-Stein and Moss (1990) Proceedings, Proc. Natl. Acad. Sci.: USA 87:6743-6747: Moss et al., (1990) Nature 348:91-92; Elroy Stein et al. (1989) Proceedings, Proc. Natl. Acad. Sci.: USA 86:6126-6130; y Rosenberg et al., (1987) Gene 56: 125-135.

Los polipéptidos reguladores o transactivadores también incluyen las proteínas de unión a ADN que son necesarias para activación de trascripción de promotores específicos. Los dominios de unión de una proteína pueden fusionarse con los dominios de actividad de otra proteína para formar quimeras de dichas proteínas de unión a ADN, tales como GAL4/VP16 (Carey et al. (1989), J. Mol. Biol., 209:423-432; Cress et al. (1991) Science, 251:87-90; y Sadowski et al. (1988), Nature, 335:563-564). Asimismo, puede usarse el dominio de unión de otras proteínas, es decir, Lex A (Brent y Ptashne, (1985), Cell, 43:729-736, que describe un activador transcripcional Lex A/GAL4).

Un ejemplo de los activadores transcripcionales es el activador de traducción del virus del mosaico de coliflor (ATV). Véase por ejemplo Fuetterer y Hohn (1991) EMBO J 10:3887-3896. En este sistema, se produce un ARNm bicistrónico. Es decir, dos regiones codificadoras se transcriben en el mismo ARN, del mismo promotor. En la ausencia de ATV, los ribosomas sólo traducen el primer cistrón. Sin embargo, en las células que expresan ATV, se traducen ambos cistrones. La región codificadora de un polipéptido capaz de interferir en la formación de polen viable se coloca en la posición del segundo cistrón.

El casete de expresión, casete de expresión 1, utilizado para modificar la planta madre 1 comprende una región reguladora 5' específica de anteras funcionalmente conectada a el primer polipéptido, el transactivador. Las regiones reguladoras 5' de la invención incluyen las secuencias de nucleótidos necesarias para expresión, es decir, la región promotora. El constructo puede incluir también cualquier otro regulador necesario tal como terminadores (Guerineau et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 226:141-144; Proudfoot (1991), Cell 64:671-674; Sanfacon et al., (1991), Genes Dev., 5: 141-149; Mogen et al., (1990), Plant Cell, 2:1261-1272; Munroe et al., (1990), Gene, 91:151-158; Ballas et al., (1989), Nucleic Acid Res., 17:7891-7903; Joshi et al., (1987), Nucleic Acid Res., 15:9627-9639); señales de localización nucleares (Kalderon et al., (1984) Cell, 39:499-509; y Lassner et al., (1991) Plant Molecular Biology, 17:229-234); secuencias consenso vegetales de traducción (Joshi, C.P. (1987), Nucleic Acids Research, 15:6643-6653), intrones (Luehrsen y Walbot (1991) Mol. Gen. Genet. 225:81-93) y parecidos, conectados funcionalmente a la secuencia de nucleótidos del transactivador.

El casete de expresión, casete de expresión 2, utilizado para transformar la planta madre 2, comprende una secuencia de nucleótidos sobre la cual actúa el transactivador funcionalmente conectado a una región codificadora de interés. Pueden incluirse también regiones adicionales de regulación, tales como terminadores, promotores, secuencias líder y semejantes. Dichas regiones están funcionalmente conectadas a la región codificadora.

Puede ser beneficioso incluir secuencias líder 5' en el constructo del casete de expresión. Dichas secuencias líder pueden actuar para potenciar la traducción. Las secuencias líder de traducción son conocidas en el estado de la técnica e incluyen:

Secuencias líder del picornavirus como, por ejemplo, la secuencia líder EMCV (región no codificadora 5' del virus de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T.R., y Moss, B. (1989) PNAS USA 86:6126-6130); secuencias líder del potyvirus como, por ejemplo, la secuencia líder TEV (virus del grabado del tabaco) (Allison et al, (1986): la secuencia líder MDMV (virus del mosaico enanizante del maíz); Virology, 154:9-20), y la proteína de inmunoglobulina humana de cadena larga (BiP), (Macejak, D.G., y Sarnow, P., (1991), Nature, 353:90-94; la secuencia líder sin traducir de la proteína de la cubierta de RNAm del virus del mosaico del alfalfa (AMV RNA 4), (Jobling, S.A., y Gehrke, L., (1987), Nature, 325:622-625; la secuencia líder del mosaico del virus del tabaco (TMV), (Gallie, D.R. et al. (1989), Molecular Biology of RNA, páginas 237-256; y la secuencia líder del virus del moteado clorótico del maiz (MCMV) (Lommel, S.A. et al., (1991), Virology, 81:382-385. Véase también, Della-Cioppa et al., (1987), Plant Physiology, 84:965-968.

En el casete de expresión, puede utilizarse bien un terminador vegetal, un terminador T7, o ambos. Véase Rosenberg et al., (1987), Gene, 56:125; Guerineau et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 226:141-144; Proudfoot, (1991), Cell, 64:671-674; Sanfacon et al., (1991), Genes Dev., 5:141-149; Mogen et al., (1990), Plant Cell, 2:1261-1272; Munroe et al., (1990), Gene, 91:151-158; Ballas et al., (1989), Nucleic Acids Res., 17:7891-7903; Joshi et al., (1987), Nucleic Acid Res., 15: 9627-9639.

Más adelante, se describirán y se ejemplificarán con más detalle los casetes de expresión específicos para sistemas diferentes de transactivadores en la sección experimental.

En una realización de la invención, se utiliza un sistema de polimerasa T7. El bacteriofago T7 contiene un gen que codifica un ARN polimerasa que reconoce un promotor específico de fagos. La polimerasa y los promotores de fagos tienen propiedades únicas que evitan interferencias en la expresión de los genes del huésped.

La ARN polimerasa T7 es una enzima monomérica de 100 kD, mientras que la mayoría de otras polimerasas son más complejas. El promotor T7 contiene 23 pb que no se encuentran en otros promotores procarióticos o eucarióticos. Véase Dunn et al., (1983) J. Mol. Biol. 166:477-535; Davanloo et al., (1984) Proceedings Proc. Natl. Acad. Sci.: USA 81:2035-2079; y Moffatt et al., (1984) J. Mol. Biol. 173:265-269.

Para usar un sistema de polimerasa T7 para producir plantas macho estériles, la planta 1 madre se modifica con un casete de expresión que comprende una región reguladora 5' de anteras conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifican la polimerasa T7. Una señal de localización nuclear (SLN) tal como la señal de localización nuclear procedente del SV40 puede incorporarse también en el constructo. Véase por ejemplo Kalderón et al., (1984) Cell 39:499-509; Dunn et al., (1988) Gene 68:259-266; Hunt T. (1989) Cell 59:949-951; y Lassner et al., (1991) Plant Molecular Biology 17:229-234. Una secuencia consenso vegetal de traducción (Joshi, C.P. (1987) Nucleic Acids Research 15:6643-6653) puede incluirse también, además de señales vegetales de terminador e intrones.

Los promotores específicos de anteras son conocidos en el estado de la técnica. Si se utilizan promotores específicos de anteras, las plantas transgénicas resultantes expresarán la polimerasa T7 sólo en la antera de la planta. Los promotores específicos de anteras se exponen en la solicitud de patente europea número 93810455.1, presentada el 24 de junio, 1993.

Los clones genómicos específicos de anteras pueden obtenerse utilizando clones de ADNc específicos de anteras como sondas para extraer los correspondientes clones genómicos de ADN. Los correspondientes clones genómicos de ADN son los que se transcriben para formar el ARN mensajero que es el complemento de ADNc y que se transcribe a dicho ADNc.

La secuencia de ADNc específica de anteras puede obtenerse mediante la preparación de bibliotecas de ADNc de tejido de antera y de hoja. El ADN monocatenario de hoja se fotobiotinila y se hibrida con el ADN de antera. El ADN fotobiotinilado se elimina para dejar una biblioteca enriquecida de las secuencias de ADNc específicas de anteras. Los ADNc específicos de anteras se identifican con un cribado diferencial. Se realiza una hibridación cruzada con los ADNc específicos de anteras para identificar los ADNc únicos. La expresión específica de anteras se verifica por un análisis de hibridación de ARN con varios tejidos vegetales y de hibridación in situ. La expresión de desarrollo, las secuencias y el número de copias del gen de los clones de ADNc específicos de anteras pueden determinarse también.

Las secuencias de ADNc pueden usarse para aislar las secuencias genómicas de ADN. Si se ha obtenido ADNc parcial, dicho ADNc parcial se utiliza como sonda para cribar la biblioteca de ADNc de antera con tal de aislar un clon de ADNc completo. Los clones hibridantes se purifican, y la restricción se mapea y se secuencia. Un clon completo tendrá casi el tamaño de un mensajero y tendrá un marco de lectura abierto completo. Para aislar el clon genómico, el ADNc de antera completo se utiliza para cribar una biblioteca genómica. Si se restringe el mapeo y la hibridación a ADNc de antera, se identifica la región codificadora del clon genómico. La región aguas arriba del área codificadora del clon es otra región promotora de antera.

Se puede llevar a cabo un mapeo más preciso de la región promotora específica de anteras mediante el análisis de deleción. Deleciones 5' de un promotor de anteras se producen por la introducción de sitios de restricción mediante la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores de oligonucleótido con sitios de restricción en los extremos 5' y secuencias promotoras de anteras en los extremos 3'. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se digieren, se purifican y se clonan en un vector plasmídico apropiado tal como por ejemplo, pBI101 (Clontech). Los mutantes de deleción contienen la secuencia líder 5' sin traducir, fusionada con el sitio de inicio de traducción del gen GUS. Deleciones internas y deleciones 3' de promotores de anteras se producen por reacción en cadena de la polimerasa de forma similar. Los fragmentos de la reacción en cadena de la polimerasa se fusionan a un vector GUS que contiene el promotor mínimo CAMV 35S [-46 a +1; Benfey et al., 1990]. Plantas transgénicas pueden ahora ensayarse con el ensayo GUS fluorométrico e histoquímico.

En el caso de secuencias promotoras de ADN, el término "específicas de anteras" describe secuencias reguladoras que dirigen la trascripción de secuencias codificadoras asociadas tal que el ARN mensajero correspondiente esté presente en el tejido de antera en concentraciones de al menos aproximadamente 100 veces las observadas en otros tejidos.

El casete de expresión usado para transformar la planta madre 2 comprende un promotor T7 conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN o un polipéptido que interfiere en la formación de polen viable cuando se expresa. Dichos polipéptidos incluyen, pero no se limitan a los siguientes:

La cadena A de la toxina de difteria (DTA) que inhibe la síntesis de proteínas, Greenfield et al., (1983), Proc. Natl. Acad., Sci.:USA, 80: 6853; Palmiter et al., (1987), Cell, 50:435;

Pectato lisasa pelE de Erwinia chrysanthemi EC16, que degrada la pectina, provocando la lisis celular. Keen et al., (1986), J. Bacteriology, 168:595;

T-urf13 (TURF-13) de genomas mitocondriales del maíz cms-T; dicho gen codifica un polipéptido designado URF13 que interfiere en las membranas mitocondriales o plasmáticas. Braun et al., (1990), Plant Cell, 2:153; Dewey et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci.:USA, 84:5374; Dewey et al., (1986), Cell, 44:439;

Recombinasa Gin de un gen del fago Mu, que codifica una recombinasa específica de sitio de ADN que provocará transposiciones del genoma y la pérdida de viabilidad celular al expresarse en las células vegetales. Maeser et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 230:170-176;

La sintetasa de ácido indoleacético-lisina (iaaL) de Pseudomonas syringae, que codifica una enzima que conjuga la lisina al ácido indoleacético (IAA). Al expresarse en las células vegetales, provoca un desarrollo alterado debido a la eliminación de IAA de las células mediante la conjugación. Romano et al., (1991), Genes and Development, 5:438-446; Spena et al., Mol. Gen. Genet., (1991), 227:205-212; Roberto et al., Proc. Natl. Acad. Sci.:USA, 87:5795-5801; y

El gen de la toxina CytA de Bacillus thuringiensis Israeliensis que codifica una proteína que es mosquitocida y hemolítica. Al expresarse en células vegetales, provoca la muerte celular debido a la disrupción de la membrana celular. Malean et al., (1987), J. Bacteriology, 169:1017-1023; Ellar et al., (1990) patente estadounidense número 4,918,006.

Dichos polipéptidos también incluyen adenina fosforibosiltransferasa (APRT) (Moffatt y Smerville, (1988), Plant Physiol., 86:1150-1154); ADNasa, ARNasa; proteasa; salicilato hidroxilasa; etc.

Además, se reconoce que el promotor T7 podría conectarse funcionalmente a ARN que es capaz de interferir en la formación de polen viable. El ARN de la invención incluye el ARN antisentido y ribosomas. Puede utilizarse ARN antisentido que se hibridará con ARNm de un gen que es crucial para la formación o función de polen, es decir, APRT. De esta forma, el ARN antisentido evitará la expresión de los genes necesarios con el resultado de que no se forma el polen.

De forma alternativa, pueden utilizarse las ribozimas dirigidas contra el ARNm de un gen que es crucial para la formación o función de polen. Dichas ribozimas comprenden una región de hibridación de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, cuya secuencia de nucleótidos complementa al menos una parte del ARN diana y una región catalítica adaptada a segmentar el ARN diana. Las ribozimas se describen en la patente europea número 0 321 201 y WO88/04300. Véase también Haseloff y Gerlach, (1988), Nature, 334:585-591; Fedor y Uhlenbeck, (1990), Proc. Natl. Acad. Sci.: USA, 87:1668-1672; Cech y Bass, (1986), Ann. Rev. Biochem., 55:599-629; Cech, T.R. (1987), 236:1532-1539; Cech, T.R. (1988) Gene, 73:259-271; y Zang y Cech, (1986), Science, 231:470-475.

Al cruzarse la planta madre 1 con la planta madre 2, la progenie contiene ambos casetes de expresión. Por lo tanto, la polimerasa T7 dirige la expresión de la secuencia codificadora bajo el control del promotor T7. Se expresa un polipéptido o ARN que interfiere en la formación de polen viable, dando como resultado la esterilidad macho.

Después de haber descrito el sistema de polimerasa T7 en detalle, un experto en la técnica reconocerá que otros transactivadores pueden utilizarse para obtener el mismo efecto.

Otros transactivadores incluyen, pero no se limitan a, GAL4 (Carey et al., (1989), J. Mol. Biol., 209:423-432; Ginger et al., (1985), Cell, 40:767-774); VP16 (Cress y Triezenberg (1991), Science, 251:87-90); GAL4-VP16 (Sadowski et al., (1988), Nature, 335:563-564); etc. Véase también, Ma y Ptashne, (1987), Cell, 43:729-736; Hope y Struhl, (1986), Cell, 46:885-894; y Gill y Ptashne, (1987), Cell, 51:121-126. Dichos transactivadores activan la trascripción en células de levadura, células vegetales, células de insectos, y células de mamíferos. Típicamente, estas proteínas contienen dos partes. Una parte dirige la unión de ADN y la otra, la región activadora, presuntamente interacciona con algún componente de la maquinaria de trascripción. Así, pueden usarse fusiones tales como GAL4-VP16, GAL4-c1.

Los transactivadores GAL4/VP16 y GAL4/c1 pueden utilizarse para transactivar un promotor con al menos un sitio de unión a GAL4. En este sistema, la planta madre 1 se transforma con un casete de expresión que comprende una región reguladora 5' de antera conectada funcionalmente a GAL4/VP16 o GAL4/c1. La planta padre 2 se transforma con un casete de expresión que comprende, en la dirección de 5' a 3', un sitio de unión GAL4, un promotor mínimo o una región reguladora 5' y la región codificadora de interés. Con el uso de un promotor mínimo, se pretende que los elementos promotores basales sean inactivos o casi inactivos sin activación aguas arriba.

Los descendientes de un cruce de la planta madre 1 y la planta madre 2 serán macho estéril ya que el transactivador GAL4 dirigirá la expresión del polipéptido o el ARN antisentido, lo que interferirá en la formación de polen viable.

Tal como se ha descrito anteriormente, los activadores de la traducción pueden utilizarse también. En este sistema, la planta madre 1 se transforma con un casete de expresión que comprende una región reguladora 5' de antera conectada funcionalmente a el activador de traducción virus del mosaico de coliflor (ATV). La planta madre 2 se transforma con un casete de expresión que comprende un promotor específico de anteras conectado funcionalmente a un ARNm bicistrónico en el que el segundo cistrón codifica una toxina celular. El cruce de las plantas madre 1 y 2 resulta en descendientes macho estériles ya que ambos cistrones del ARNm bicistrónicos se traducirán en presencia de ATV. Véase Bonneivlle et al., (1987), Cell, 59:1135-1143; Fuetterer y Hohn, (1991), EMBO J., 10:3887-3896; Gowda et al., (1988), Proc. Natl Acad. Sci., USA, 86:9203-9207; Scholthof et al., (1992), J. Virology, 66:3131-3139; y EP 298 918, presentada el 10 de julio, 1987.

En algunos casos, podría ser útil combinar el uso de más de un transactivador en un sistema único. Por ejemplo, la activación de trascripción mediante la polimerasa T7 o GAL4/VP16 puede combinarse con la activación de la traducción. Esta combinación puede proporcionar un control más estrecho de la expresión no deseada del gen de la toxina en ausencia del transactivador.

Los métodos para la construcción de casetes de expresión vegetales así como la introducción de ADN extraño en plantas se describen de forma general en el estado de la técnica. Generalmente, para introducir ADN extraño en plantas, se han utilizado vectores plasmídicos Ti para hacer llegar el ADN extraño, así como la absorción directa de ADN, liposomas, la electroporación, la micro-inyección, y el uso de microproyectiles. Dichos métodos se han descrito en el estado de la técnica. Véase por ejemplo, Guerche et al., (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhaus et al (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30-36; Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al., (1980) Science 208:1265; Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach y Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988); y Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinksi, eds) Academic Press, Inc. (1989). Se entiende que el método de transformación dependerá de la célula vegetal a transformar.

Un posible método para la introducción de material genético en las células vegetales comprende, por ejemplo, exponiendo las células vegetales a un virus o Agrobacterium que comprende el ADN a introducir. Esto se puede llevar a cabo por la infección de células vegetales sensibles o por el co-cultivo de protoplastos derivados de células vegetales. Dentro del ámbito de la invención, el virus del mosaico de coliflor (CaMV) puede utilizarse también como un vector para le inserción de constructos de ADN según la invención en una planta.

Otro método aprovecha la infección de la célula vegetal con Agrobacterium tumefaciens y/o Agrobacterium rhizogenes, que ha sido transformada anteriormente con dicho constructo génico. A continuación, las células vegetales transgénicas se cultivan bajo condiciones de cultivo apropiadas conocidas para una persona experta en la técnica para que formen renuevos y raíces y, finalmente, se formen plantas enteras.

Otro posible método para transformar el material vegetal comprende la infección mezclada con tanto Agrobacterium rhizogenes como Agrobacterium tumefaciens transformada, tal como describió Petit et al., (1986), Mol Gen Genet. 2002: 388 para la transformación de zanahorias.

Por lo tanto, los casetes vegetales de expresión según la invención pueden transferirse a células vegetales apropiadas mediante, por ejemplo, el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o el plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes. El plásmido Ti o plásmido Ri se transfiere a la planta durante el transcurso de infección con Agrobacterium y se integra de forma estable en el genoma de la planta.

Cualquier vector que contenga ADN-T, que pueda transferirse a las células vegetales y que permita la selección de las células transformadas es apropiado para el uso dentro del ámbito de la invención tal como por ejemplo, un vector lanzadera que comprende los constructos de ADN según la invención clonados dentro de la secuencia izquierda de aislamiento (LB) y la secuencia derecha de aislamiento (RB) y que es capaz de replicación estable tanto en E. coli como en A. tumefaciens. Lo preferible es lo que se denomina un sistema de vector binario.

Con el uso de técnicas recientemente desarrolladas, ahora también es posible en un principio transformar especies de planta en vitro que no son plantas huéspedes naturales de Agrobacterium. Por ejemplo, las plantas monocotiledóneas, especialmente especies de cereales y gramas, no son huéspedes naturales de Agrobacterium.

Es cada vez más evidente que los monocotiledones también pueden transformarse con Agrobacterium, con que, con el uso de las nuevas formulaciones experimentales ya disponibles, las especies de cereales y gramas son susceptibles a la transformación (Grimsley et al., EP-A-0 267 159).

Uno de los métodos preferidos para la introducción de ADN en una célula vegetal con Agrobacterium es la llamada transformación de discos de hoja usando Agrobacterium (Horsh et al., (1985) Science 227: 1229-1231). Discos de hoja estériles de una planta diana apropiada se incuban con células de Agrobacterium que comprenden uno o más de los casetes de expresión según la invención, y a continuación, se transfieren en un medio de nutrientes apropiado. Los medios especialmente apropiados, y por lo tanto, los preferidos dentro del ámbito de la invención, son los medios LS que han sido solidificados por la adición de agar y enriquecidos con uno o más de los reguladores del crecimiento vegetal usados normalmente, especialmente los seleccionados del grupo de auxinas que consisten en un ácido a-naftilacético, picloram, ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido 3-indolebutírico, ácido 3-indoleláctico, ácido 3-indolesuccínico, ácido 3-indoleacético y ácido p-clorofenoxiacético, y del grupo de citoquininas que comprende cinetina, 6-benciladenina, 2-isopenteniladenina y ceatina. La concentración preferida de auxinas y citoquininas está en el intervalo de 0,1 mg/l hasta 10 mg/l.

Después de incubar durante varios días, pero preferiblemente después de incubar durante 2 a 3 días, a una temperatura de 20ºC a 40ºC, y preferiblemente a una temperatura de 23ºC a 35ºC y más concretamente a 25ºC y bajo una luz difusa, los discos de hoja se transfieren a un medio apropiado con el fin de inducir renuevos. Especialmente preferido para la selección de transformantes es un medio LS que no contiene la auxina sino citoquinina en su lugar, y al que se ha añadido una sustancia selectiva en función del marcador génico utilizado. Los cultivos se mantienen a la luz y se transfieren a medio fresco a intervalos apropiados, pero preferiblemente a intervalos de una semana. Los renuevos verdes en desarrollo se cortan y se cultivan adicionalmente en un medio que induce a los renuevos a formar raíces. Especialmente preferido dentro del ámbito de esta invención es un medio LS que no contiene la auxina sino citoquinina en su lugar, y al que se ha añadido una sustancia selectiva para la selección de transformantes.

Además de la transformación mediada por Agrobacterium, dentro del ámbito de esta invención, es posible utilizar métodos de transformación directa para la inserción de los constructos génicos según la invención en el material vegetal.

Posibles métodos para la transferencia directa del material genético a una célula vegetal comprenden, por ejemplo, el tratamiento de protoplastos utilizando procedimientos que modifican la membrana plasmática, por ejemplo, el tratamiento con polietileno glicol, el tratamiento de choque por calor o la electroporación, o una combinación de estos procedimientos, Shillito et al, (1985), Bio Technology, 3: 1099-1103.

En la técnica de electroporación, protoplastos vegetales juntos con los plásmidos que comprenden los casetes de expresión según la presente invención se someten a pulsos eléctricos de alto voltaje. Esto resulta en un aumento reversible de la permeabilidad de biomembranas y por lo tanto permite la inserción de los plásmidos. Los protoplastos vegetales electroporados renuevan su pared celular, dividen y forman tejido de callo. La selección de células vegetales transformadas puede llevarse a cabo con la ayuda de los marcadores fenotípicos anteriormente descritos.

Un método adicional para la introducción directa de material genético en células vegetales, que se basa exclusivamente en procedimientos químicos y que permite que la transformación se lleve a cabo rápida y eficazmente, se describe en Negrutiu et al, (1987) Mol Gen Genet 199:3003-337.

También es apropiada para la transformación de material vegetal la transferencia directa de genes con co-transformación (Schocher RJ et al., (1986), Bio/Technology, 4: 1093-1096).

La co-transformación es un método que se basa en la absorción e integración simultánea de varias moléculas de ADN (genes seleccionables y no seleccionables) en el genoma vegetal y que, por lo tanto, permite la detección de células que han sido transformadas con genes no seleccionables.

Otros métodos para insertar el material genético en un vector directamente en una célula vegetal comprenden el uso de procedimientos puramente físicos, por ejemplo, por microinyección con micropipetas de punta, Neuhaus et al., (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30-36 o por el bombardeo de las células con microproyectiles encubiertos del ADN transformador "Microprojectile Bombardment" (Wang Y-C, et al., (1988), Plant Mol. Biol. 11:433-439) a que se aceleran a través de una disolución de ADN en la dirección de las células a transformar con el impacto de presión, con lo que se atomizan finamente en una nube junto con la disolución como resultado del impacto de presión EP-A-434.616.

El bombardeo con microproyectiles se ha propuesto como una técnica efectiva de transformación para células, incluyendo las células vegetales. En Sanford et al., (1987), Particulate Science and Technology 5:27-37, se informó de que el bombardeo con microproyectiles hizo llegar con efectividad el ácido nucleico en el citoplasma de las células vegetales de Allium cepa (cebolla). Christou et al, (1988), Plant Physiol 87: 671-674 describieron la transformación estable de callo de soja con un gen de resistencia a la canamicina por el bombardeo con microproyectiles. Christou et al describieron una penetración de aproximadamente el 0,1% a 5% de las células. Además, Christou et al describieron niveles detectables de actividad de la enzima NPTII y resistencia en callos transformados de hasta 400 mg/l de canamicina. McCabe et al, (1988) Bio/Technology 6: 923-926 describen la transformación estable de Glycine max (soja) por bombardeo con microproyectiles. McCabe et al describen adicionalmente la recuperación de una planta transformada R_{1} de una planta R_{0} quimérica.

La transformación de plantas de maíz, incluyendo las plantas de maíz mejorado, por bombardeo con microproyectiles puede llevarse a cabo según el protocolo descrito por ejemplo en EP-A 478 502.

La lista de posibles métodos de transformación descrita anteriormente como ejemplo no pretende ser completa y no tiene la intención de limitar el objeto de la invención de ninguna forma.

Además se reconoce que los componentes del casete de expresión pueden modificarse para aumentar la expresión. Por ejemplo, pueden emplearse secuencias truncadas, sustituciones de nucleótidos u otras modificaciones.

También puede ser beneficioso eliminar los nucleótidos de la secuencia promotora T7 para evitar posibles estructuras de horquilla del ARN. Se pueden eliminar tales nucleótidos mediante la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa por ejemplo, tal como se describe más adelante en la sección experimental. De la misma forma, una cadena poli A puede incluirse en el casete de expresión junto al terminador. Por ejemplo, en el casete de expresión 2, de aproximadamente 25 hasta aproximadamente 90 nucleótidos A puede insertarse de forma 5' en el terminador
T7.

Otros métodos tales como trans-corte y empalme pueden emplearse también utilizando el donante del empalme y el recipiente del empalme de genes conocidos tales como el gen Adhl de maíz. Véase Dennos et al., (1984), Nucleic Acids Research, 12:3983-4000. Tal sistema implica tres casetes de expresión. Los siguientes son casetes típicos que podrían utilizarse en el sistema T7. El casete 1 comprende un promotor específico de anteras conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifican un transactivador, por ejemplo, una polimerasa T7.

El casete 2 comprende una secuencia diana de nucleótidos, un promotor T7, conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que comprende un sitio recipiente de corte y empalme. El sitio recipiente está conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que comprende la parte 3' de la región codificadora de un polipéptido o ARN capaz de interferir en la formación de polen viable.

El casete 3 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un promotor capaz de dirigir la expresión en tejido de antera, conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que comprende la región 5' codificadora del polipéptido o ARN capaz de interferir en la formación de polen viable que está conectado funcionalmente a un sitio donante de corte y empalme. Tal como se ha expuesto anteriormente, los casetes también pueden comprender secuencias líder, terminadores, etc. La planta madre 1 puede transformarse de forma estable con el casete 1, o alternativamente, con casetes 1 y 3 mientras que la planta madre 2 contendrá casetes 2 y 3, o alternativamente el casete 2, respectivamente. En ambas situaciones, el cruce de la planta madre 1 con la planta madre 2 resulta en una progenie macho estéril.

Las plantas transformadas se regeneran. La presencia del casete de expresión integrado de forma estable en las plantas madre transformadas puede confirmarse mediante técnicas southern de hibridación o análisis con reacción en cadena de la polimerasa, conocidas en el estado de la técnica. La expresión del transactivador puede determinarse con técnicas de transferencia northern.

Por lo tanto, el presente sistema puede utilizarse en cualquier planta que se puede transformar y regenerar. Esto incluye preferiblemente plantas de las clases dicotiledóneas y monocotiledóneas. Especialmente preferido dentro del ámbito de la invención es el uso de plantas monocotiledóneas de la familia Graminaceae que comprenden las siguientes plantas: Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromas, Oryzea, Avena, Hordeum, Secale y Setaria.

De acuerdo con esto, la presente invención se refiere preferiblemente al uso de plantas de la familia de Graminaceae, incluyendo su progenie sexual y asexual, que pueden regenerarse de material vegetal seleccionado del grupo que consiste en protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, polen, células del huevo, zigotos, etc. para la producción de plantas transgénicas macho estériles.

El método elimina la necesidad de manipular estructuras florales y evita la necesidad de emasculación y fertilización manual.

Las plantas madre que contienen los correspondientes casetes de expresión integrados de forma estable son ambas macho fértiles y pueden producirse como homocigotas y mantenerse de forma indefinida. Para obtener semillas macho estériles, las líneas homocigotas de la planta madre 1 y 2 se cruzan utilizando una técnica como, por ejemplo, la eliminación de la espiga de una de las líneas y utilizando la otra para polinización, de modo que no se produzca ninguna semilla autofertilizada. A continuación, los descendientes macho estériles pueden utilizarse como hembras madre en cualquier cruce para producir semillas híbridas. Aproximadamente el 75% de las semillas híbridas resultantes darán lugar a plantas macho fértiles. Por lo tanto, para el fin de producir semillas híbridas, se lleva a cabo un cruce estándar de líneas diferentes con plantas macho estériles seguido de un análisis subsiguiente de la progenie para seleccionar una línea con características agronómicas superiores. Véase, generalmente, la solicitud internacional de patente número WO 90/08828.

Mientras que el sistema de polimerasa T7 es útil en el sistema dual anteriormente descrito para la producción de plantas macho estériles, también se reconoce que el sistema de expresión T7 puede utilizarse para la expresión a alto nivel de secuencias de nucleótidos en plantas. El sistema también proporciona una expresión específica de tejidos u otra expresión selectiva de secuencias codificadoras en una planta.

De esta forma, una sola planta puede transformarse con dos casetes de expresión. Un primer casete comprende una polimerasa T7 conectada funcionalmente a un promotor capaz de dirigir la expresión en una célula vegetal. Cualquier promotor capaz de dirigir la expresión puede utilizarse y puede elegirse para una expresión específica; por ejemplo, un promotor específico de tejidos, un promotor específico de una etapa del desarrollo, un promotor inducible, etc. Promotores específicos incluyen, por ejemplo, promotores químicamente inducibles (EP-A 3332 104) y promotores específicos para semillas (Ellis et al., (1988), Plant Mol. Biol. 10:203-214).

Especialmente apropiadas son señales de expresión que se originan de genes o virus vegetales. Ejemplos de promotores apropiados y terminadores son aquellos de los genes del virus del mosaico de coliflor (CaMV) o secuencias de ADN homólogas que retienen sus propiedades características de las señales de expresión anteriormente descritas. También apropiadas son señales de expresión bacteriales, especialmente las señales de expresión de los genes de nopalina sintasa (nos) o los genes de opina sintasa (ocs) de los plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens. También cabe mencionar aquí como ejemplo los promotores de ubiquitina, los promotores de la actina, los promotores de la histona y los promotores de la tubulina. Otros promotores apropiados son un promotor de la amilasa (promotor de a-amilasa) y un promotor inducible del ácido abscísico (ABA).

Las señales de expresión pueden también comprender promotores preferenciales para tejidos o específicos de tejidos. El término promotor preferencial para tejidos se utiliza para indicar que una señal de expresión en concreto promoverá un nivel más alto de trascripción de un ADN expresable conectado, o de la expresión del producto de dicho ADN tal como se indica en cualquier ensayo de ARN o de proteína convencional, o que una secuencia en concreto de ADN demostrará algún efecto diferencial; es decir, que la trascripción de las secuencias de ADN conectadas o la expresión de un producto génico es mayor en algunos tejidos que en todos los demás tejidos de la planta. Por ejemplo, el promotor preferencial para tejidos puede dirigir una mayor expresión de un producto génico asociado en las hojas, los tallos, las raíces y/o el polen que en las semillas. Un ejemplo de un promotor preferencial para tejidos, que puede usarse de forma apropiada dentro del ámbito de la presente invención, es un promotor preferencial para la médula, aislado de un gen de maíz TrpA tal como se describe en WO 93/07278.

El término promotor específico de tejidos se utiliza para indicar que una secuencia reguladora de ADN en concreto promoverá la trascripción de una secuencia asociada de ADN expresable solamente en uno o más tejidos de una planta, o en un tipo de tejido, mientras que esencialmente no ocurrirá ninguna trascripción de la secuencia codificadora de ADN en todos los demás tejidos o tipos de tejido de la planta. Son conocidos en la técnica numerosos promotores cuya expresión varía de forma específica de tejidos. Un ejemplo es el maíz fosfoenolpiruvatocarboxilasa (PEPC) que es específico para el tejido verde. Otros promotores específicos para tejidos incluyen promotores proteicos de unión a clorofilo a/b y promotores de RUBISCO de pequeñas subunidades. Cabe mencionar aquí también, por ejemplo, promotores específicos de polen tales como los que se pueden obtener del gen de una fosfato quinasa vegetal dependiente de calcio (CDPK).

Un promotor regulado por el desarrollo puede usarse también. Por supuesto, en la presente invención, cualquier promotor que es funcional en la planta huésped deseada puede usarse para dirigir la expresión de un gen asociado.

Frecuentemente resulta ventajoso incorporar una secuencia líder entre la secuencia de promotor y la secuencia contigua codificadora de ADN, seleccionándose una longitud para dicha secuencia líder con tal de que la distancia entre el promotor y la secuencia de ADN según la invención esté a una distancia óptima para la expresión de un gen estructural asociado. Secuencias líder apropiadas incluyen las secuencias líder de distintas longitudes aisladas del gen 35S CaMV (Pierce et al., Plant Gene Systems and their Biology, (Alan R. Liss, Inc.) pp. 301-310). Las secuencias líder preferidas son las aisladas del gen 35S caMV, que tienen una longitud de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 130 nucleótidos. La identificación de otras secuencias líder se puede encontrar en la técnica. Véase Della-Cioppa et al., (1987) Plant Physiology 84:965-968.

Adicionales secuencias reguladoras de ADN que pueden usarse para la construcción de genes quiméricos incluyen, por ejemplo, secuencias que son capaces de regular la trascripción de una secuencia asociada de ADN en tejidos vegetales en el sentido de inducción o represión.

Se sabe, por ejemplo, que hay ciertos genes vegetales inducidos por varios factores internos y externos, tales como hormonas vegetales, el choque de calor, sustancias químicas, patógenos, la falta de oxígeno, la luz, el estrés, etc.

Otra clase de genes que son apropiados en plantas comprende los genes regulados por la luz, especialmente el gen codificado por el núcleo de la subunidad pequeña de ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa (RUBISCO). Morelli et al., (1985), Nature 315: 200-204 han demostrado que la secuencia 5' flanqueadora del gen RUBISCO del guisante es capaz de transferir la propiedad de fotoinducción a un gen indicador, siempre y cuando éste último esté asociado de forma quimérica a dicha secuencia. También ha sido posible extender esta observación a otros genes inducidos por la luz, por ejemplo, la proteína de unión al clorofilo a/b.

Un grupo adicional de secuencias regulables de ADN comprende las secuencias químicamente regulables que están presentes, por ejemplo, en los genes de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) de tabaco y que se inducen mediante reguladores químicos como los que se describen en EP-A-332,104.

Las secuencias regulables de ADN que se han mencionado anteriormente como ejemplo pueden ser de origen natural o sintético, o pueden comprender una mezcla de secuencias de ADN naturales y sintéticas.

Adicionalmente, las secuencias recombinantes de ADN de la presente invención pueden comprender una secuencia señal, que está conectada funcionalmente a una secuencia codificadora de ADN. La secuencia señal es responsable del transporte especializado del péptido asociado dentro de la célula vegetal.

La secuencia señal de la presente invención puede ser cualquier secuencia de ADN que es capaz de dirigir el transporte de un polipéptido asociado en uno o más de los compartimentos celulares. La secuencia señal es preferiblemente una secuencia que se traduce en un péptido señal, que se separa del péptido después de que el tránsito del péptido se haya completado. Las secuencias señal son útiles para dirigir el producto polipéptido de la secuencia codificadora de ADN hacia la localización deseada dentro de la célula, por ejemplo, hacia la mitocondria o el retículo endoplasmático, o para dirigir el transporte extracelular fuera de la célula.

Cabe mencionar aquí, por ejemplo, péptidos señal N-terminal, que están implicados en el transporte intracelular y que se pueden encontrar en el extremo N-terminal de las proteínas transportadas mediante el sistema de endomembrana. Estas secuencias señal aseguran que dichas proteínas pasen primero al retículo endoplasmático, donde se escinde el péptido señal proteolíticamente de la proteína precursora tan pronto como se haya cumplido su función. En virtud de su función específica, este tipo de secuencia de péptido señal ha sido altamente conservada durante la evolución de todas las células vivientes, independientemente de si son bacterias, levaduras, hongos, animales o plantas.

En el extremo C-terminal de las proteínas de la vacuola, en el otro lado, pueden encontrarse secuencias que están implicadas en dirigir la expresión de una parte codificadora asociada de la vacuola vegetal. Se describen ejemplos de estas secuencias denominadas "dirigidas contra la vacuola" en, por ejemplo, EP-A 462,065.

Además, la molécula de ADN puede comprender secciones adicionales de secuencia que codifican fragmentos de péptido que en general contribuyen a la mejora de la capacidad para entrar en la vacuola, por ejemplo, el fragmento propéptido descubierto por Matsuoka K y Nakamura K en la extensión del extremo N-terminal de esporamina. Matsuoka K y Nakamura K., (1991) Proc. Natl Acad Sci, USA, 88: 834-838.

Secuencias señal adicionales útiles para la presente invención son, por ejemplo, la secuencia señal del gen relacionado con la patogénesis (PR-1) del tabaco, que se describe en Cornellison et al, (1986) EMBO 5: 37-40; la presecuencia mitocondrial de levadura; Schmitz et al., (1989) Plant Cell 1:783-791; la secuencia señal de la ferrosulfoproteína vegetal de Rieske, Huang et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA, 88: 10716-10720; péptidos dirigidos contra la mitocondria y cloroplastos, von Heijne et al, (1989) Eur J Biochem, 180: 535-545.

Tal como se ha descrito anteriormente, el primer casete de expresión puede comprender adicionalmente señales de localización nuclear, secuencias de terminador, secuencias consenso vegetales de traducción, etc.

El segundo casete de expresión comprende una secuencia conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica el promotor T7. El segundo casete de expresión puede también comprender secuencias líder 5', secuencias terminadores, etc.

Cuando ambos casetes de expresión se hayan integrado de forma estable en una sola planta madre, la polimerasa T7 dirigirá la expresión de la secuencia codificadora conectada funcionalmente al promotor T7.

Se prevé que los dos casetes de expresión pueden formar parte de un solo vector o de una sola secuencia de ácidos nucleicos o pueden encontrarse en vectores distintos. Asimismo, mientras que en la mayoría de los casos se transformará una sola planta con los dos casetes, puede ser beneficioso a veces transformar una planta, la planta madre 1, con el casete de expresión 1 y otra planta, la planta madre 2, con el casete de expresión 2 y obtener una progenie con ambos casetes de expresión mediante el cruce de las plantas madre 1 y 2.

Dado que la trascripción de ARN polimerasa T7 es altamente activa, este sistema puede utilizarse para aumentar la producción de productos génicos específicos que se producen en cantidades bajas en plantas. El método también es útil para aumentar los productos específicos para tejidos u otros productos específicos génicos. Generalmente, se consigue aumento en la expresión de al menos desde dos veces hasta más de 100 veces, más específicamente desde aproximadamente 4 veces hasta aproximadamente 50 veces, con un sistema T7.

La ARN polimerasa T7 es muy selectiva para los promotores específicos que raramente se encuentran en el ADN no relacionado con el ADN T7. Señales de terminador eficaces también son poco frecuentes. Por lo tanto, el sistema de expresión de ARN polimerasa T7 puede hacer trascripciones completas de casi cualquier ADN que está bajo el control de un promotor T7. De acuerdo con esto, el sistema de expresión T7 puede utilizarse para expresar una gran variedad de productos tales como proteínas de reserva de semillas con una composición preferida de aminoácidos, proteínas farmacéuticas, proteínas implicadas en la síntesis de almidón, lípidos o proteínas, proteínas de resistencia a insecticidas o plagas, proteínas que aumentan la calidad nutricional de las plantas o semillas, proteínas antifúngicas, antibacterianas, o antivirales, proteínas que conducen a la producción de otras proteínas que hacen que la planta adquiera resistencia a insectos o enfermedades, proteínas ensambladoras o proteínas que se requieren para la producción de otras proteínas, y sustancias semejantes.

Especialmente apropiados para el uso en el sistema de expresión de ARN polimerasa T7 según la invención son todos aquellos genes estructurales que, al ser expresados, conducen a un efecto protector en las células vegetales transformadas, también en los tejidos que desarrollan del mismo y especialmente en las plantas regeneradas, por ejemplo, una resistencia aumentada a patógenos (por ejemplo, a hongos, bacterias, virases fitopatógenos, etc.), resistencia a sustancias químicas [por ejemplo a herbicidas (por ejemplo, triazinas, sulfonilureas, imidazolinonas, triazol pirimidinas, bialafos, glifosato, etc.), insecticidas u otras biocidas)]; resistencia a factores medioambientales adversos (por ejemplo, el calor, el frío, el viento, condiciones del suelo adversas, la humedad, la sequedad, etc.).

Dentro del ámbito de esta invención, se hace especial hincapié en los genes estructurales que se asocian con el control de los patógenos y parásitos vegetales.

Se puede proporcionar la resistencia a los insectos, por ejemplo, mediante un gen que codifica un polipéptido que es tóxico para los insectos y/o sus larvas, por ejemplo, la proteína cristalina de Bacillus thuringiensis [B.t.]. Especialmente apropiados son los genes sintéticos B.t. tales como los que se describen en, por ejemplo, Koziel MG et al, (1993) Bio/Technology 11: 194-200.

Una segunda clase de proteínas que median en la resistencia a los insectos comprende los inhibidores de proteasas. Los inhibidores de proteasas son un constituyente normal de las estructuras de reserva de plantas y por lo tanto normalmente se encuentran en las vacuolas o los cuerpos de las proteínas. Se ha demostrado que un inhibidor de proteasas tipo Bowman-Birk aislado de soja y purificado inhibe la proteasa intestinal de las larvas de Tenebrio. El gen que codifica el inhibidor de tripsina del cowpea se describe en Hilder et al (1987) Nature 330: 160-163.

La mayoría de insectos, por ejemplo, tiene un esqueleto cuticular en el que las micelas de quitina en capas lamelares se empotran en una sustancia base. Muchos hongos fitopatógenos también contienen quitina como una parte integral de sus estructuras de hifa y espora, por ejemplo, Basidiomycetes (hongos de tizón y roya), Ascomycetes y Fungi imperfecti (incluyendo Alternaria y Bipolaris, Exercophilum turcicum, Colletotricum, Gleocercospora y Cercospora). La quitinasa es capaz de inhibir el crecimiento micelial de ciertos patógenos tanto en vitro como en vivo. Un órgano o tejido vegetal que es capaz de expresar la quitinasa constitutivamente o como respuesta a la penetración de un patógeno puede por lo tanto protegerse de un ataque de muchos diferentes hongos.

Un gen adicional, que codifica una enzima que supuestamente desempeña un papel central en el mecanismo de la defensa de la planta contra los patógenos es el gen \beta-1,3-glucanasa, que puede por lo tanto usarse también para protegerse contra un ataque de hongos, solo o en combinación con un gen de quitinasa.

Una clase adicional de genes que puede usarse en el sistema de expresión de ARN polimerasa T7 corresponde a los genes que codifican lo que se denominan los péptidos líticos. Estos son péptidos naturales o sintéticos que tienen actividad antipatógena y que son capaces de penetrar, lisar o dañar de alguna otra forma la membrana celular del patógeno. Representantes de tales péptidos líticos que pueden usarse dentro del ámbito de la presente invención se conocen tanto de fuentes animales (incluyendo los insectos) como de fuentes vegetales y microbianos y incluyen, por ejemplo, las defensinas, cecropinas, tioninas, y melitinas de mamíferos, y las defensinas, magaininas, atacinas, dipterinas, sapecinas, caerulinas y xenopsinas de insectos, e híbridos de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de varios péptidos líticos se muestran en las siguientes publicaciones: WO 89/11291; WO 86/04356; WO 88/05826; US 4,810,777; WO 89/04371.

Se entiende que los péptidos líticos, en el sentido menos restrictivo del término, también son compuestos cuya capacidad para penetrar, lisar o dañar las membranas celulares se basa en la actividad enzimática, por ejemplo las lisozimas y las fosfolipasas.

Además, el uso recíproco de expresión y aplicación exógena también puede contemplarse, siendo los péptidos líticos especialmente apropiados para éste último uso, conjuntamente con los auxiliares y/o los aditivos normalmente usados para dicho fin.

Otra clase de gen que se puede usar en el ámbito de la presente invención comprende los que codifican las proteínas de transferencia de fosfolípidos que se describe, por ejemplo, en WO 92/20801.

Una clase adicional de genes que se puede usar dentro del ámbito de la presente invención comprende los genes que codifican proteínas relacionadas con los patógenos (PPRs) tales como PR-1A, PR-1B, PR-1C, PR-R mayor, PR-R menor, PR-P, PR-Q, PR-2, PR-2', PR-2'', PR-N, PR-O, PR-O', PR-4, SAR8.2a-e, quitinasa/lisozima de pepino, peroxidasa básica de pepino, glucanasa básica de tabaco y quitinasa/lisozima básica de tabaco, quitinasa/lisozima ácida de tabaco. Ejemplos de estos genes y estas proteínas que incluyen constructos genéticos quiméricos que contienen dichos genes se proporcionan en EP-A 392,225.

La secuencia de ADN según la invención también puede utilizarse en la producción de compuestos buscados y útiles en células vegetales tal cual o como parte de una unidad de organización superior, como por ejemplo, un tejido, un callo, un órgano, un embrión, o la planta entera.

Los genes que también pueden usarse dentro del sistema de expresión de ARN polimerasa T7 según la invención incluyen, por ejemplo, los que conllevan un aumento o descenso en la formación de sustancias de reserva o de almacenamiento en hojas, semillas, tuberos, raíces, tallos, etc., o en los cuerpos proteicos de semillas. Sustancias deseadas que las plantas transgénicas pueden producir incluyen, por ejemplo, las proteínas, los hidratos de carbono, los aminoácidos, las vitaminas, los alcaloides, las flavinas, los perfumes, los colorantes, las grasas, etc.

También pueden conectarse a la secuencia de ADN según la invención genes estructurales que codifican para sustancias activas farmacéuticamente aceptables, como por ejemplo las hormonas, los inmunomoduladores, y otras sustancias fisiológicamente activas.

Por lo tanto, los genes que pueden considerarse dentro del ámbito de esta invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, los genes específicos vegetales, como el gen zein de maíz, el gen avenina de avena, el gen glutelina de arroz, etc., genes específicos de mamíferos, tales como el gen de la insulina, el gen de la somatostatina, los genes de las interleuquinas, el gen t-PA, etc., o genes de origen microbiano, tales como el gen NPT II, etc., y genes sintéticos, tales como el gen de la insulina, etc.

Aparte de los genes estructurales de origen natural que codifican una propiedad útil y deseada, dentro del ámbito de esta invención también es posible usar genes que han sido previamente modificados de forma específica con métodos químicos o de ingeniería genética.

Además, el concepto amplio de la presente invención también incluye genes que se producen enteramente o parcialmente mediante la síntesis química. Por lo tanto, los genes o las secuencias de ADN que pueden usarse dentro del ámbito de la presente invención son los gen(es) o el ADN tanto homólogo(s) y heterólogo(s) y también los gen(es) o el ADN sintéticos según la definición dada dentro del ámbito de la presente invención. El gen de la insulina puede mencionarse aquí como un ejemplo de un gen sintético.

Tal como se ha descrito anteriormente, los métodos para la manipulación de secuencias del ácido nucleico y para la transformación y regeneración de plantas son conocidos en la técnica.

Después de haber descrito la invención en líneas generales, los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la misma y de ninguna manera son limitantes.

Ejemplos no limitantes Técnicas generales de recombinación de ADN

Dado que muchas de las técnicas de recombinación de ADN empleadas en esta invención son rutinarias para una persona experta en la técnica, es mejor dar una descripción corta aquí de estas técnicas generalmente usadas en vez de describirlas en detalle cada vez que ocurren. Salvo si hay una indicación específica al contrario, todos estos procedimientos se describen en la referencia de Maniatis et al (1982).

A. Segmentación con endonucleasas de restricción

Típicamente un lote de reacción contiene aproximadamente 50 a 500 \mug/ml de ADN en una solución de tampón recomendada por el fabricante, New England Biolabs, Beverly, MA. 2 a 5 unidades de endonucleasas de restricción se añaden por cada \mug de ADN y el lote de reacción se incuba durante desde una a tres horas a una temperatura recomendada por el fabricante. Para terminar la reacción, se calienta hasta 65ºC durante 10 minutos o se extrae con fenol, y a continuación se precipita el ADN con etanol. Esta técnica también se describe en las páginas 104 a 106 de la referencia de Maniatis et al. (1982).

B. Tratamiento del ADN con polimerasa para producir extremos romos

Se añaden de 50 a 500 \mug/ml de fragmentos de ADN al lote de reacción en el tampón recomendado por el fabricante, New England Biolabs. El lote de reacción contiene todos los cuatro desoxinucleósidos trifosfato a concentraciones de 0,2 mM. La reacción transcurre durante un periodo de 30 minutos a 15ºC y se termina calentando a 65ºC durante 10 minutos. Para los fragmentos obtenidos después de la segmentación con endonucleasas de restricción que producen extremos 5' sobresalientes, tales como EcoRI y BamHI, el fragmento grande, o el fragmento Klenow, se utiliza la polimerasa de ADN. Para los fragmentos obtenidos con endonucleasas que producen extremos 3' sobresalientes, tales como PstI y SacI, se utiliza la polimerasa T4 de ADN. El uso de estas dos enzimas se describe en las páginas 113 a 121 de la referencia de Maniatis et al. (1982).

C. Electroforesis en gel de agarosa y purificación de los fragmentos de ADN de los geles

La electroforesis en gel de agarosa se lleva a cabo en un dispositivo horizontal, tal como se describe en las páginas 150 a 163 de la referencia de Maniatis et al. El tampón usado es el tampón Tris borato descrito en la misma. Los fragmentos de ADN se tiñen con 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio que bien está presente en el gel o tampón del recipiente durante la electroforesis o bien se añade después de la electroforesis. El ADN se visualiza con iluminación con luz ultravioleta de longitud de honda larga. Si se precisa una separación de los fragmentos del gel, se utiliza una agarosa que forme un gel a temperatura baja y que se obtiene de Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Después de la electroforesis, el fragmento deseado se recorta, se pone en una probeta de plástico, se calienta hasta 65ºC durante 15 minutos, se extrae tres veces con fenol y se precipita dos veces con etanol. Este procedimiento difiere ligeramente del que se describe en Maniatis et al. (1982) en la página 170.

Como una alternativa, el ADN puede aislarse de la agarosa con la ayuda del kit Geneclean (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, EE.UU.).

D. Adición de fragmentos conectores sintéticos a los extremos de ADN.

Si se desea añadir un sitio nuevo de corte de endonucleasa al extremo de la molécula de ADN, la molécula primero se trata opcionalmente con polimerasa de ADN con tal de producir extremos romos, tal como se describe en la sección anterior. Se añade aproximadamente de 0,1 a 1,0 \mug de este fragmento a aproximadamente 10 ng de ADN fosforilado conector, obtenido de New England Biolabs, en un volumen de 20 a 30 \mul con 2 \mul de ADN ligasa T4 de New England Biolabs, y 1 mM de ATP en el tampón recomendado por el fabricante. Después de una incubación durante la noche a 15ºC, se termina la reacción calentando hasta 65ºC durante 10 minutos.

El lote de reacción se diluye hasta aproximadamente 100 \mul en un tampón apropiado para la endonucleasa de restricción que separa la secuencia sintética conectora. Se añaden aproximadamente de 50 a 200 unidades de esta endonucleasa. La mezcla se incuba durante 2 a 6 horas a una temperatura apropiada, a continuación, el fragmento se somete a una electroforesis en gel de agarosa y se purifica tal como se ha descrito anteriormente. El fragmento resultante tendrá extremos con terminaciones que se produjeron por el corte con la endonucleasa de restricción. Estos extremos normalmente son cohesivos, tal que el fragmento resultante puede conectarse fácilmente con otros fragmentos con los mismos extremos cohesivos.

E. Eliminación de fosfatos terminales 5' de los fragmentos de ADN

Durante los pasos de clonación de los plásmidos, el tratamiento del plásmido vector con fosfatasa reduce la recircularización del vector (descrito en la página 13 de la referencia Maniatis et al.). Después de la separación del ADN con la correcta endonucleasa de restricción, se añade una unidad de fosfatasa alcalina del intestino bovino obtenida de Boerhringer-Mannheim, Mannheim. El ADN se incuba a 37ºC durante una hora y luego se extrae dos veces con fenol y se precipita con etanol.

F. Conexión de fragmentos de ADN

Si fragmentos con extremos cohesivos complementarios se conectan el uno con el otro, aproximadamente 100 ng de cada fragmento se incuban en una mezcla de reacción de 20 a 40 \mul que contiene aproximadamente 0,2 unidades de ADN ligasa T4 de New England Biolabs en el tampón recomendado por el fabricante. La incubación se lleva a cabo durante 1 a 20 horas a 15ºC. Si se pretende conectar los fragmentos de ADN con los extremos romos, se incuban tal como se ha descrito anteriormente salvo que se aumente la cantidad de ADN ligasa T4 hasta 2 a 4 unidades.

G. Transformación de ADN en E. coli

La cepa de E. coli HB101 se utiliza para la mayoría de los experimentos. El ADN se introduce en la E. coli utilizando el método de cloruro de calcio, tal como se describe en Maniatas et al. (1982), páginas 250 y 251.

H. Cribado de E. coli para plásmidos

Después de la transformación, las colonias resultantes de E. coli se ensayan para la presencia del plásmido deseado mediante un procedimiento rápido de aislamiento del plásmido. Dos procesos habituales se describen en las páginas 366 a 369 de la referencia de Maniatis et al. (1982).

I. Aislamiento a gran escala del plásmido de ADN

Los procedimientos para el aislamiento de plásmidos de E. coli a gran escala se describen en las páginas 88 a 94 de la referencia de Maniatis et al. (1982).

J. Clonación en vectores fagos M13

En la siguiente descripción, se entiende que la forma replicativa de doble cadena de los derivados del fago M13 se usa para los procedimientos de rutina, tales como la separación utilizando la endonucleasa de restricción, la conexión, etc.

A no ser que haya una indicación específica al contrario, las enzimas pueden obtenerse de Boehringer, Biolabs (BRL). Se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante salvo una indicación al contrario.

K. Análisis de transferencia southern

El ADN extraído se trata primero con las enzimas de restricción, a continuación, se somete a una electroforesis en gel de agarosa del 0,8% a 1%, se transfiere a una membrana nitrocelulosa [Southern EM (1975)] y se hibrida con el ADN a detectar que previamente se ha sometido a una incisión ambulante (actividades específicas de ADN de 5x10^{8} a 10x10^{8} cpm/\mug). Los filtros se lavan tres veces durante una hora, cada vez con una disolución acuosa de 0,03M de citrato de sodio y 0,3M de cloruro de sodio a 65ºC. El ADN híbrido se visualiza ennegreciendo una película de rayos X durante un período de 24 a 48 horas.

Experimental Ejemplo 1 Adición de una secuencia consenso vegetal de traducción al gen de la ARN polimerasa T7

El sitio de inicio de traducción del gen de ARN polimerasa T7 [con la señal de localización nuclear (SLN) SV40] de pAR3283 (Dunn et al., Gene 68: 259-255 (1988) se modificó para incluir una secuencia consenso vegetal de traducción (Joshi C.P., NAR 15, 6643-6653 (1987)). El fragmento BgI11 a Nru1 de pAR3283 se sustituyó por un fragmento de BgI11 a NruI generado por reacción en cadena de la polimerasa en la cual la secuencia TAAACAATG, después del sitio Bg1II, sustituyó a la secuencia antes del sitio T7 de inicio de traducción. Los nucleótidos después del sitio de inicio no se modificaron para conformar la secuencia consenso vegetal (TAAACAATGGCT) porque conllevaría una sustitución de asparagina por alanina.

Ejemplo 2 Fusión del promotor 35S CaMV al gen de ARN polimerasa T7

El gen de ARN polimerasa T7 que contiene la señal de localización nuclear (SLN) SV40 y una secuencia consenso vegetal de traducción se separó como un fragmento BgI11 a BamHI y se clonó en un sitio de BamHI de pCIB710 (Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)). El plásmido resultante, pJS175, contiene el promotor 35S CaMV, el gen de ARN polimerasa T7 (SLN SV40, secuencia consenso vegetal de traducción) y el sitio 35S CaMV de adición poli A.

Ejemplo 3 Constructos del promotor/terminador T7 y fusiones al gen GUS

El promotor T7 y el terminador T7 del pET-3 (Rosenberg et al., Gene 56, 125 (1987)) se insertó como un fragmento BgI11 en el pUC19 separado por BamHI [New England Biolabs, Beverly, Maryland, EE.UU.] para producir pAT26 y en un BlueScript SK separado por BamHI [Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California, EE.UU.] para producir pAT10. El sitio 3' Sac I del gen GUS de pBI121 (Clontech) se adaptó a un sitio Bam HI y se clonó en el sitio Bam HI entre el promotor T7 y terminador de pAT10 para producir pAT11. En pAT27, los nucleótidos +9 a +26 del promotor T7 se eliminaron de pAT26 con reacción en cadena de la polimerasa con tal de eliminar una posible estructura de horquilla del ARN. Una señal de adición 35S CaMV poli A se insertó en el sitio BamHI del pAT27 añadiendo un sitio BgI11 con reacción en cadena de la polimerasa en el extremo 3' del fragmento, dando como resultado pAT28. El gen GUS del pAT11 se insertó en el sitio BamHI de pAT28 para proporcionar pAT30 y en el sitio BamHI de pAT27 para proporcionar pAT32. Se construyó pJS261 sustituyendo el terminador T7 de pAT26 con un fragmento de BamHI-EcoRI que contiene el terminador 35S y el terminador T7 de pAT28. Un fragmento BamHI que contiene el gen líder TEV GUS de pAT31 se insertó a continuación en el sitio BamHI.

Ejemplo 4 Constructos de traducción que utilizan el virus del grabado de tabaco como líder

El virus líder 5' del grabado de tabaco no traducido (nucleótidos +6 hasta +143 del ARN genómico, Allison et al., Virology 154:9-20 (1986)), con un sitio BamHI en el extremo 5' y un sitio NcoI en el extremo 3' se fusionó por traducción con un gen GUS (fragmento NcoI-SacI) en un BlueScript SK para proporcionar pAT29. El sitio SacI de pAT29 se adaptó a BamHI y el fragmento BamHI que contiene el gen líder TEV GUS se insertó en el sitio BamHI de pAT28 para proporcionar pAT31.

Ejemplo 5 Transformación de protoplasto y ensayos fluorométricos de GUS

Protoplastos de Nicotiana tabacum se transformaron tal como se describe en Negrutiu, I. et al., PMB 8:363-373 (1987) y ensayos fluorométricos de GUS se llevaron a cabo tal como se describe en Jefferson, R.A., PMB Reporter 5:387-405 (1987). Los métodos para la producción de protoplastos de maíz se describen, por ejemplo, en los ejemplos 6 y 43 de la solicitud PCT WO 93/07278, que se incorpora en este documento como referencia.

El aislamiento de protoplastos de maíz - Procedimiento de aislamiento de protoplastos:

1. El contenido de 10 cultivos de suspensión de maíz 2717 línea 6 de dos días de antigüedad se pipeteó en tubos estériles de 50 ml y se dejó sedimentar. Todo rastro de medio de cultivo se separó y se desechó.

2. Células (3-5 ml volumen celular aglomerado) se resuspendieron en 30 ml de disolución de enzima de protoplasto. Las proporciones fueron las siguientes:

3% celulasa RS

1% Macerozima R10 en tampón KMC (para un litro)

KCl	8,65 g
MgCl_{2}.6H_{2}O	16,47 g
CaCl_{2}.2H_{2}O	12,50 g
MES	5,0 g
pH 5,6, esterilizar por filtración.

3. Mezclar las células bien y alicuotar en placas Petri de 100x25 mm, aproximadamente 15 ml por placa. Agitar en una agitadora giratoria durante 4 horas para digerir.

4. Pipetear 10 ml de KMC a través de cada malla de 100 micros a usar. Filtrar el contenido de las placas por la malla. Lavar la malla con un volumen igual de KMC.

5. Pipetear los protoplastos pasados por la malla cuidadosamente a tubos de 50 ml y centrifugar en una centrífuga Beckman TJ-6 durante 10 minutos a 1000 rpm (500 x g).

6. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pelet cuidadosamente en 10 ml de KMC. Combinar el contenido de los 3 tubos en uno y enrasar a 50 ml con KMC.

7. Centrifugar y lavar de nuevo, repitiendo otra vez el paso anterior.

8. Resuspender todos los protoplastos lavados en 50 ml de KMC. Contar en una cámara de recuento. Centrifugar los protoplastos y resuspender a 8 x 106/ml en tampón de resuspensión (tampón RS).

Tampón RS (para 500 ml)

Manitol 27,33 g

CaCl_{2} (0,1 M stock) 75 ml

MES 0,5 g

pH 5,8, esterilizar por filtración

Ejemplo 6 Transcripción del promotor T7 en experimentos transitorios

Los protoplastos de maíz se co-transformaron con la ARN polimerasa T7 que dirige el promotor 35S (pJS175) y el promotor T7/gen GUS/terminador T7 (pAT11). Como un control negativo, los protoplastos también se co-transformaron con un promotor 35S/gen de luciferasa (pCIB1700) y con pAT11. Los protoplastos transformados con 35S/GUS (pCIB246) actuaron como un control positivo para GUS. El plásmido pCIB246 se construye como se indica a continuación.

El sitio de restricción DdeI se modifica en la posición de nucleótido 7482 del genoma CaMV [Franck et al., Cell 21:285-294 (1980)] insertando un oligonucleótido de 48 pb que contiene varios sitios enzimáticos de restricción que incluyen un sitio NcoI (CCATGG), un sitio Sa1I (GTCGAC), y un sitio SstI (GAGCTC). Este promotor CaMV 35S alterado se inserta en un vector pUC19 que ha sido modificado para destruir los sitios SstI y Sa1I del vector. De esta forma, el promotor CaMV 35S de pCIB1500 contiene sitios únicos SstI y Sa1I para la clonación. Se digiere pCIB1500 con SstI/NcoI y se liga con el gen GUS obtenido de pB1221 (Clontech Laboratorios, Inc., Palo Alto, CA). El sitio NcoI se fusiona con el gen GUS tal que el ATG del sitio NcoI funciona como el codón de inicio para la traducción del gen GUS. Las señales de poliadenilación y terminador CaMV 35S se utilizan para el extremo 3' del gen quimérico.

El ARN se aisló de los protoplastos según el método de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo descrito por Goodall et al., Methods in Enzymology 181:148-161 (1990). Duplicados de transferencia northern se sondearon con un ARN polimerasa T7 y un sondeo GUS, y sólo el ARN de los protoplastos transformados con pJS175 y pAT11 hibridados al sondeo de ARN polimerasa T7. El ARN de los protoplastos transformados con pJS175 solo y con pJS175/pAT11 hibridado al sondeo GUS, demostrando que la ARN polimerasa T7 está transcribiéndose del promotor T7 en las células vegetales. Los niveles de ARN GUS transcritos del promotor T7 fueron 10 veces más altos que el control pCIB246.

Ejemplo 7 Expresión de GUS con el virus líder del grabado del tabaco para la traducción de transcritos T7

Los protoplastos de tabaco se co-transformaron con la polimerasa que dirige el promotor 35S CaMV (pJS175) y las fusiones del promotor T7-GUS con y sin el líder TEV (pAT31, pJS261). Se llevaron a cabo ensayos fluorométricos GUS (Tabla 1).

Se observó una actividad enzimática GUS (4 veces más alta que con el control de 35S/GUS) en los constructos T7 sólo cuando el líder TEV estaba presente.

TABLA 1 Experimento de expresión transitoria con el líder TEV

pCIB 246	- 35/GUS
pJS 175	- 35S/ARN polimerasa T7
pJS 179	- 35S/luciferasa
pAT11	- promotor T7/GUS/terminador T7
pJS261	- promotor T7/líder TEV/GUS/terminador 35S/terminador T7
pAT31	- promotor T7 (con la horquilla eliminada)/líder TEV/GUS/terminador 35S/terminador T7.

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Ejemplo 8 Fusión de un promotor específico de anteras al gen de ARN polimerasa T7

El gen de ARN polimerasa T7 que contiene la señal de localización nuclear SV40 y una secuencia consenso vegetal de traducción se extrajo como un fragmento Bg1 II-Bam HI y se clonó en el sitio Bam HI de pLC250, cuya construcción se describe en el ejemplo 17 de la solicitud de patente europea número 93810455.1, presentada el 24 de junio de 1993. En pLC250, un promotor tapetal-específico de anteras de tabaco, ant32, se clonó en los sitios de Sal I-Xba I del vector binario plasmídico Agrobacterium (Clontech, Palo Alto, CA). El gen GUS se había eliminado previamente de pBI101 con Sma I y Sac I, y el sitio Sac I se había romado. El plásmido resultante, pAT20, contiene el promotor específico de anteras de tabaco ant32, el gen de ARN polimerasa T7 (SLN SV40, secuencia consenso vegetal de traducción) y un terminador nos.

El promotor ant32 puede obtenerse de la región de 2,0 kb 5' flanqueadora del clon ant32, cuya preparación se describe en la solicitud de patente europea número 93810455 presentada el 24 de junio de 1993. La secuencia de ADN del clon genómico ant32 se proporciona en SEC ID no.: 1.

Ejemplo 9 Construcción de vectores vegetales de transformación

La construcción de pCIB710 se describe en el ejemplo 4 de WO 93/07278. Los plásmidos CaMV 35S del casete promotor pCIB709 y pCIB710 se construyen tal como se indica en Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987). El pCIB710 contiene el promotor CaMV y las secuencias de terminador de trascripción para el trascrito ARN 35S [Covey et al., Nucl. Acids. Res., 9:6735-6747 (1981)]. Un fragmento de restricción de 1149 pb Bg1II del ADN CaMV [pb 6494-7643 en Hohn et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 96: 194-220 y Apéndices A a G (1982)] se aísla del ADN de CaMV mediante la electroforesis en gel de agarosa tal como se ha descrito anteriormente. El fragmento se mezcla con el ADN del plásmido pUC19 separado con BamHI, tratado con ADN ligasa T4, y transformado en E. coli. (Nota: el sitio de restricción BamHI en el plásmido resultante es destruido por la ligación de los extremos cohesivos Bg1II a los extremos cohesivos BamHI.)

A continuación, el plásmido resultante, denominado pUC19/35S, se utiliza en la mutagénesis en vitro dirigida por el oligonucleótido para insertar la secuencia de reconocimiento GGATCC inmediatamente después del nucleótido CaMV 7483 en la referencia de Hohn. El plásmido resultante, pCIB710, contiene la región promotora CaMV 35S y la región de terminación de trascripción separada por un sitio de restricción BamHI. Las secuencias de ADN insertadas en este sitio BamHI serán expresadas en plantas por estas secuencias reguladoras de trascripción CaMV. (Además, nótese que pCIB710 no contiene ningún codón de inicio de traducción ATG entre el inicio de trascripción y el sitio BamHI). PCIB710 también se modifica para producir pCIB709 con la inserción de un fragmento BamHI que contiene la secuencia codificadora para higromicina fosoftransferasa de pLG90 [Rothstein et al., Gene, 53: 153-161 (1987)] en el sitio BamHI.

Se modifica pCIB709 para producir pCIB996 eliminando el ATG justo aguas arriba del codón de iniciación del gen de higromicina fosoftransferasa con técnicas estándares de mutagénesis mientras que se inserta un sitio de restricción Bg1II en esta localización.

Construcción de vectores vegetales de transformación que contienen un promotor específico de anteras que dirige polimerasa T7 ARN y el promotor T7 que dirige el gen toxina de difteria

Se construyó un vector vegetal de transformación que contenía un promotor específico de anteras que dirigía polimerasa T7 ARN y un promotor T7 que dirigía la secuencia codificadora de la cadena A de la toxina de difteria (DTA) (Palmiter et al., Cell 50: 435-443). Un casete de promotor T7/líder TEV/secuencia codificadora de DTA/terminador 35S/terminador T7 se preparó por la extracción del gen GUS de pAT30 con BamHI y la inserción en un fragmento líder NcoI-Bgl II, dando como resultado pTG28. pTG32 es un vector vegetal de transformación que contiene ambos componentes y se preparó adaptando el sitio 3' Eco RI de pTG28 a Hind III e insertando el fragmento Hindi en pAT20. El promotor específico de anteras que dirige ARN polimerasa T7 y el promotor T7 que dirige DTA también pueden transferirse independientemente a plantas y luego cruzarse con tal de producir plantas macho estériles. pTG35 contiene sólo el promotor T7 que dirige DTA en un vector vegetal de transformación y se construyó adaptando el sitio Eco RI 3' de pAT28 a Sal I y clonando en el sitio Sal I del vector vegetal de transformación pCIB905. Para la construcción de pCIB905, el promotor 35S, el gen de resistencia a higromicina (Hy'), y el terminador 35S 3' se eliminaron de pCIB996 como un fragmento Kpn1 SalI y se insertaron en los sitios correspondientes de pCIB200, cuya construcción se describe en el ejemplo 14.1 de EP-A 0 462 065. Las plantas transformadas con pTG35 pueden cruzarse con transformantes pAT20.

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Ejemplo 10 Producción de plantas transgénicas

Los discos de hoja de tabaco se transformaron con pTG32, pAT20 y pTG35 tal como se describe en Horsh et al., Science 227: 1229-1231 (1985) y la presencia de ADN de transformación se confirmó con la reacción en cadena de la polimerasa.

Ejemplo 11 Análisis de plantas transformadas con un promotor específico de anteras dirigiendo la ARN polimerasa T7 y el promotor T7 dirigiendo DTA

Se observó la morfología floral de 13 plantas transformadas con pTG32. 11 de las plantas eran macho estériles y 9 de las 11 plantas mostraron ser hembra fértil mediante un retrocruce con tabaco natural.

Ejemplo 12 Vectores vegetales de transformación para la expresión de GUS del promotor T7

El promotor 35S CaMV que dirige la ARN polimerasa T7 y el promotor T7 que dirige el gen GUS se clonaron en un vector vegetal de transformación. Como control, el promotor 35S CaMV que dirige luciferasa y el promotor T7 que dirige el gen GUS se clonaron también. El promotor T7 (con la horquilla eliminada)/líder TEV/gen GUS/terminador 35S/terminador T7 se eliminaron de pAT31 con Xba I, Eco RI y se clonaron en el vector vegetal de transformación pCIB200 en pAT34. El sitio 5' Sac I del promotor 35S/ARN polimerasa T7 /fragmento de terminación nos se adaptó a Xba I (el sitio Sac I se destruyó) y se clonó en el sitio Xba I pAT34 para producir pAT35. Como control, el gen de luciferasa se clonó en el sitio BamHI de pCIB770 (Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)) en pAT36. En pAT37, el sitio EcoRI de pAT32 se adaptó a Sal I (Eco RI se destruyó) y el fragmento Sal I que contenía el promotor T7/líder TEV/gen GUS/terminador 35S/terminador T7 se clonó en el sitio Sal I de pT36. Tanto en pAT35 como en pAT37, se eligieron clones que tenían trascripción de ambos genes en orientaciones mutuamente opuestas.

Ejemplo 13 Inhibición antisentido con polimerasa T7 y promotores T7

En pCIB3217, el promotor T7 se insertó en una dirección antisentido después de un casete de promotor 35S/GUS/
terminador 35S en pUC 19. Este casete se clonó en un vector vegetal de transformación y se cruzó con una planta transformada con promotor 35S/ARN polimerasa T7 (pCIB3210). La actividad enzimática de GUS de la progenie que llevaba tanto la polimerasa T7 como el gen GUS/promotor antisentido T7 se compara con la progenie que lleva sólo el gen GUS/promotor antisentido T7.

Ejemplo 14 Construcción de vectores que contienen el sitio de unión a GAL4/promotor mínimo 35S CAMV fusionado a GUS y la toxina difteria

El sitio consenso de unión a GAL4 (Giniger et al., Cell 40: 767:774 (1985) se fusionó al promotor mínimo CAMV 35S (-46 a +1, Benfey et al., EMBO 9: 1677-1684 (1990)), incorporando el sitio de unión en un cebador de la reacción en cadena de la polimerasa. El cebador de la reacción en cadena de la polimerasa utilizado para la adición del sitio de unión a GAL4 aguas arriba del promotor mínimo -46 CaMV fue el siguiente:

5'-GCGAAGCTTCGGAAGACTCTCCTCCGCTCGAGGCAAGACCCTTCCTCTCTATATA 3'. Este cebador de 54 pb comprende un sitio HindiIII, un sitio de unión a GAL4 de 17 pb, un sitio Xhoi y 23 pb del promotor CaMV empezando en la posición -46. El otro cebador usado en la reacción fue:

5' GCGATCTAGAATGGTCGACTAAGGGTTTCTT 3'. Este cebador de 31 pb contiene 21 pb del líder 35S que termina a +130 seguido de un sitio XbaI. La adicción del sitio de unión a GAL4 a un promotor mínimo 35S (-46 a +130) se llevó a cabo realizando una reacción en cadena de la polimerasa en pCIB246 (utilizada como plantilla para el promotor mínimo 35S).

La banda generada en la reacción en cadena de la polimerasa que contenía el sitio de unión y el promotor mínimo contenía HindiIII, los extremos XbaI y se clonó en el vector plásmido pB1101. pLP3 contiene el sitio de unión a GAL4/el promotor mínimo 35S/el gen GUS/el terminador nos en el vector vegetal de transformación pB1101 (con el GUS eliminado). Este casete se extrajo de pLP3 con HindiIII, EcoRI y se clonó en BlueScript para formar pLP4. El sitio de unión a GAL4/promotor mínimo 35S se fusionó con la secuencia que codifica DTA. Primero, el gen GUS se eliminó de pBI101 por la eliminación con SmaI y SacI, el romado del sitio SacI, y la religación del plásmido. El sitio de unión a GAL4/promotor mínimo 35S se clonó en los sitios HindIII, XbaI y el gen DTA se clonó como un fragmento BgI11 en el sitio BamHI del vector plásmido pB1101. pLP1 contiene el sitio de unión a GAL4/promotor mínimo 35S/secuencia que codifica DTA/terminador nos en el vector vegetal de transformación pB1101 (con el GUS eliminado).

Ejemplo 15 Expresión de GUS con el transactivador GAL4/VP16

Los protoplastos de maíz se co-transformaron con un promotor 35S/GAL4/gen VP16 (pGAL4/VP1 - Goff et al., (1991). Genes and Development, 5:298-309) y un sitio de unión a GAL4/promotor mínimo 35S/gen GUS (pLP4). Los ensayos fluorométricos se realizaron (Tabla II). La actividad enzimática de GUS era 20 veces más que la del sitio de unión a GAL4/promotor mínimo 35S cuando el transactivador GAL4/VP16 estaba presente.

TABLA II Experimento de expresión transitoria con transactivación de GAL4/VP16

	PLP4	- Sitio de unión a GAL4/promotor mínimo 35S/GUS
	PGAL4/VP1	- promotor 35S/Adh1 intrón/GAL4/VP16

2

Ejemplo 16 Fusión de un promotor de anteras a GAL4/VP16

La fusión GAL4/VP16 se extrajo como un fragmento BamHI de pGAL4/VP1 y se insertó en el sitio BamHI de pLC250. El plásmido resultante, pLP2, contiene un promotor específico de anteras/GAL4/VP16/terminador nos en el vector vegetal de transformación pB1101 (con el GUS eliminado). Los transformantes que contenía pLP2 pueden cruzarse con plantas transformadas con pLP3 con tal de conseguir activación del gen GUS o a plantas transformadas con lPL1 con tal de producir plantas macho estériles.

Aunque la presente invención se ha descrito en cierto detalle con ejemplos ilustrativos para los fines de claridad y comprensión, es obvio que pueden hacerse ciertos cambios y modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones aquí anexadas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: CIBA-GEIGY AG

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(B)

CALLE: Klybeckstr. 141

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(C)

LOCALIDAD: Basel

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(E)

PAÍS: Suiza

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 4002

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: +41 61 69 11 11

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: +41 61 696 79 76

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

TELEX: 962 991

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos para la producción de semillas híbridas

\vskip0.500000\baselineskip

Secuencias y secuencias recombinantes de ADN

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 1

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(iv)

INFORMACIÓN INFORMÁTICA:

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(A)

SOPORTE INFORMÁTICO: disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

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(2) ESPECIFICACIONES DE LA SECUENCIA ID. Nº 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 3706 pares de base

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: linear

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genoma)

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(iii)

HIPOTÉTICO: NO

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(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A)

ORGANISMO: Nicotiana tabacum

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(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Ant32 clon genómico

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(vii)

FUENTE INMEDIATA

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(B) CLON: pCIB950

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: Señal TATA

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1971..1975

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(E)

LOCALIZACIÓN: 2076..3422

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: caract. misc

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(B)

LOCALIZACIÓN: 2009

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(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "sitio de inicio de trascripción putativo"

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 1:

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3

4

5

6

7

Claims (23)

1. Un método para la producción de plantas macho estériles, comprendiendo dicho método: transformar una primera célula vegetal madre con un primer casete de expresión, comprendiendo dicho casete una secuencia de nucleótidos que codifica una región reguladora 5' específica de anteras conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido transactivador; regenerar una planta transformada, la planta madre 1, de dicha primera célula vegetal transformada; transformar una segunda célula vegetal madre con un segundo casete de expresión que comprende una secuencia diana de nucleótidos que es susceptible de activación por dicho polipéptido transactivador conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica ARN antisentido o un polipéptido que, al expresarse, interfiere en la formación de polen viable; regenerar una planta transformada, la planta madre 2, de dicha segunda célula vegetal transformada; y cruzar dicha planta madre 1 con dicha planta madre 2 para proporcionar descendientes macho estériles.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido transactivador es una polimerasa T7.

3. El método según la reivindicación 2, en el que dicha secuencia diana de nucleótidos es una región reguladora 5' de T7.

4. El método según la reivindicación 2, en el que dicho casete de expresión utilizado para transformar dicha planta madre 1 comprende adicionalmente una secuencia señal de localización nuclear.

5. El método según la reivindicación 4, en el que dicha señal de localización nuclear es una señal viral de localización nuclear procedente del SV40.

6. El método según la reivindicación 1, en el que el polipéptido transactivador es una proteína de unión a ADN.

7. El método según la reivindicación 6, en el que la proteína de unión a ADN es GAL4/VP16 o GAL4/c1.

8. El método según la reivindicación 1, en el que dicho ARN antisentido es capaz de hibridarse a un mensaje procedente de una secuencia codificadora que es crucial para la formación o función de polen.

9. El método según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido que interfiere en la formación de polen viable al expresarse se selecciona de toxina A de la difteria, pectato liasa, T-urf13, gin-recombinasa, ácido indolacético lisina-sintesasa, toxina cytA, APRT, ARNasa, ADNasa, o proteasa.

10. El método según la reivindicación 9, en el que dicho polipéptido es la toxina A de la difteria.

11. El método según la reivindicación 6, en el que dicho casete de expresión de la planta madre 2 comprende adicionalmente un sitio de unión a GAL4 asociado a un promotor 35S mínimo conectado funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos que codifica ARN antisentido o un polipéptido que interferirá en la formación de polen viable.

12. El método según la reivindicación 2, en el que dicho casete de expresión de la planta madre 2 comprende adicionalmente una secuencia de terminador T7.

13. El método según la reivindicación 2, en el que dicho casete de expresión de la planta madre 2 comprende adicionalmente una secuencia vegetal de terminador.

14. El método según la reivindicación 12, en el que dicho casete de expresión de la planta madre 2 comprende adicionalmente una secuencia vegetal de terminador.

15. Un método para la producción de semillas híbridas a partir de plantas seleccionadas de aquellas especies de plantas productoras de polen que son susceptibles a la transformación genética, comprendiendo dicho método:

a)

producir plantas macho estériles:

(i)

transformando una primera célula vegetal madre con un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región reguladora 5' específica de anteras que está conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica un transactivador;

(ii)

regenerar una planta transformada, la planta madre 1, a partir de dicha primera célula vegetal transformada;

(iii)

transformar una segunda célula vegetal madre con un casete de expresión que comprende una secuencia diana de nucleótidos que es activada por dicho transactivador conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica ARN antisentido o un polipéptido que interferirá en la formación de polen viable;

(iv)

regenerar una planta transformada, la planta madre 2, de dicha segunda célula vegetal transformada; y

(v)

cruzar dicha planta madre 1 con dicha planta madre 2 para producir descendientes macho estériles; y

b)

cruzar de dichos descendientes macho estériles con una línea fértil seleccionada para obtener semillas híbridas.

16. Una planta transgénica y la progenie de la misma, que comprende un casete de expresión integrado de forma estable, en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un promotor específico de anteras que está conectado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica un transactivador capaz de regular una secuencia diana de nucleótidos.

17. Una planta transgénica y la progenie de la misma, que comprende un casete de expresión integrado de forma estable en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia diana de ácidos nucleicos, que puede ser activada por un transactivador, conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN antisentido o un polipéptido que interferirá en la formación de polen viable.

18. Una planta transgénica macho estéril y la progenie de la misma, que comprende un primer casete de expresión integrado de forma estable que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un promotor específico de anteras que está conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica un transactivador y un segundo casete de expresión que comprende una secuencia diana de nucleótidos, que es activada por dicho polipéptido transactivador, conectada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica ARN antisentido o un polipéptido que interferiría en la formación de polen viable.

19. Semillas híbridas producidas según el método de la reivindicación 15 y que comprenden dichos casetes de expresión.

20. Una planta macho estéril producida según el método de la reivindicación 1 y que comprende dichos casetes de expresión.

21. Una planta transgénica y la progenie de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, que es una planta de maíz.

22. Una planta transgénica y la progenie de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, que es una planta de trigo.

23. Una planta transgénica y la progenie de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, que es una planta de cebada.