JPH06507065A - アブラナ亜種のタペータムに特異的なプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アブラナ亜種のタペータムに特異的なプロモータ一本発明は、特に雄性不稔を得 ることを目的とする、植物への組換ＤＮＡ技術の適用に関するものである。

遺伝的な背景の異なる親株の存性雑種形成によるハイブリッドの生産は現代農業 において重要な営みである。ヘテロシス（ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ）若しくは雑種強 勢（ｈｙｂｒｉｄ　ｖｉｇｏｕｒ）の存在によって、子孫は収率や病気に対する 耐性等の鍵となる耕種学的な特性において親株に優る。さらに、親株が非常に同 型接合である際には、このようにして得られた子孫は遺伝的に非常に均質であり 、したがって、作物は、穀物の管理の効率を非常に向上する、発芽時期、生育す る高さ、病気のなり易さ、開花時期、種の成熟する時期等の重要な特性において 等しく均質な仕方で挙動する。これらの理由によって、ハイブリッド形成した種 は農家にとって魅力的であり、したがって、非常に高価で売られる。

自然界では、多くの植物種の生殖体は、自家受精およびその結果ハイブリッドを 形成しない子孫の生産が非常にしやすいように並べられている。したがって、自 家受粉した種の混入しないハイブリッド形成した種を生産するために、自家受粉 を防ぐ様々な物理的、化学的および遺伝的な方法を用いて、異花受精が行われて いる。

ハイブリッド形成した種を生産するための重要な物理的な方法がイネ科インドト ウモロコシ（ｚｅａ　ｍ１ｓ）で用いられている。この種では、雄性および雌性 の生殖体が同じ植物体の異なる部分に位置しており、このため雄穂の除去（ｄｅ ｊａｓｓｅｌｉｎｇ）　、ｆｊの除去（ｒｅｍｏｖａｌ）等の既知の方法による 不稔化が容易である。しかしながら、はとんどの他の多くの穀物の生殖体は、上 記はどはうまく並んでいないので不稔化にかなりの労力、および繁雑な作業がい る；その結果、この方法によって生産されたハイブリッド形成した種は非常に高 価なものである。

化学的な方法は、生育できる花粉の生産を殺すまたは遮断する、エーテル類等の 殺配偶子剤を用いるものである。

しかしながら、このような化学物質は一般的に高価でさら１、：１１、漠然とし た開化の習性を有する穀物に対しては特に投与するのが難しい。

自家受粉を防止する２つの一般的に用いられる遺伝的な方法は、自家不和合性（ ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐａｊｉｂｉｌｉｆ７）および雄性不稔である。自家不和 合性（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌＮ７）システムにおいては、生育で きる花粉を生産するが、生化学的な遮断が花粉の発芽または花粉管の生育を邪魔 し、これによって自家受粉はできない。しかしながら、このようなシステムは、 自家不和合性（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｃ）の雌性植物の系統の不 足、繁殖の難しさおよび頻繁な自家不和合性（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐａ目ｂｉ ｌｉｔｙ）の不安定性によって複雑である。場合によっては、繁殖の問題は、自 家不和合性（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐＮｉｂｉｌｉｔ７）の化学的な抑制によっ てまたは自家受粉に対する生化学的遮断を行う前の未成熟な芽の手による受粉（ ［芽の受粉（ｂｕｄ　ｐｏｌｉｉｎａｊｉｏｎ）　Ｊ　）によって容易にするこ とができる。しかしながら、抑制できる自家不和合性（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐ ａｔｉｂｉｌｉｔｙ）は、しばしば、システムの効果を減する気候によるストレ スを受けやすい。重要な穀物であるアブラナ属（ｇｅｎｕｓ　Ｂｒａｓｓｉｃａ ）は、ハイブリッド形成した種の生産に関する自家不和合性（ｓｅｌｆ−ｉｎｃ ｏｍｐａｔｉｂｉｌＮｙ）システムに関連した難しさを示すよい例である。自家 不和合性（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐｉｔｉｂｉｌｉｊｙ）がアブラナ亜種（Ｂｒ ａｓｓｉｃａ　ｓｐｐ、）では普及してるが、このシステムは複雑であり、雌性 植物の系統は繁殖するのが非常に難しく、さらに、自家不和合性（ｓｅｌｌ−ｉ ｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）は気候によるストレスのある条件下では破壊さ れやすい。

農業においては、自家受粉を防止するために用いられる最も重要な自然のメカニ ズムはいわゆる雄性不稔である。

雄性不稔は、通常、裂開（花粉の放出）の前に朽または花粉の変質を起こすよう な核若しくはオルガネラ（葉緑体およびミトコンドリア）のゲノムにおけるある 種の突然変異が起こることによって生じる。したがって、雄性不稔を発現する植 物は雌性植物のみであり、さらに、このような植物によって生産された種は、繁 殖能力のある雄性植物からの異花受粉の生成物でなければならない。一般的に、 ハイブリッド形成した種の広い利用能に対する最も大きい障害は、効果的な雄性 不稔がないことである。

自然発生した雄性不稔化システムは、様々な穀物：トウモロコシ、テンサイ、セ イヨウアブラナの脂肪種子（ｏｉｌｓｅｅｄ　ｒａｐｅ）及びヒマワリにおいて 有用である。多くは、不稔性の破壊及び気候によるストレスのある条件下での花 粉の生産等の欠点を有する。遺伝的に制御された雄性不稔は、従来、はとんど育 種集団内から雄性不稔性植物を偶然発見することによっていた。効果的な雄性不 稔化システムを発達させることによって、予期できないような事項に依存せず、 さらに、栽培植物をより制御できる。本発明はこのような発達に関するものであ る。

プロモーターは、例えば、発現の時期または位置を特定することによって、発現 を調節する遺伝子領域である。プロモーターは、遺伝子のコーディング領域（ｃ ｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）と離れてもよく、さらに、異なるコーディング領域 （ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）を誘導するために用いられ、このため、異なる 生成物を発現できる。プロモーターは、雄性の配偶子の生産に含まれる細胞／組 織に特異的である際には、原則的に雄性不稔を得るために用いることができる。

タペータムは、小胞子の発育のための栄養分の供給において重要な役割を果たす 朽内の分化した細胞層である。タペータムの機能不全は多くのタイプの自然発生 した雄性不稔の原因である。

ＥＰ−Ａ−０３２９３０８号（バラディン　ハイブリッド　インク（Ｐａｌａｄ ｉｎ　Ｈｙｂｒｉｄｓ　Ｉｎｃ、））によると、自然発生したものを基礎とした 雄性不稔化および有性の自家不和合性（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐａｊｉｂｉｌｉ ＋７）システムに関する多くの困難は、報告された「人工の」雄性不稔化システ ムによって解決できる。ＥＰ−Ａ−０３２９３０８号は、システムの様々な可能 な変異型を記載している。１つのタイプとしては、中心となる要素（ｃｅｎｔｒ ａｌ　ｅｌｅｍｅｎｔ）は、小胞子に特異的なプロモーターおよび雄性不稔ＤＮ Ａからなるキメラ遺伝子である。小胞子は未成熟な花粉粒である。雄性不稔ＤＮ Ａの重要な性質は、その発現が小胞子の発育に独特であるあるいは必須であるプ ロセスを妨害することによって、小胞子の発育を終わらせるように設計されてい ることである。このプロモーターは小胞子に特異的であるため、雄性不稔ＤＮＡ は小胞子内でのみＲＮＡに転写される。上記出願は、様々なタイプの雄性不稔Ｄ ＮＡについて記載している：詳しくは、小胞子に特異的な遺伝子に対するおよび 通常、しかし必須の、細胞機能（例えば、アクチニジン及びチューブリン）を有 するタンパク質；および細胞毒性のあるタンパク質であるリシンＡ及びジフテリ アトキシンに対するアンチセンスＲＮＡ０ しかしながら、上記システムは、ＥＰ−Ａ−０３２９３０８号は必ずしも雄性不 稔性植物である植物を生産しない点において、重大な欠点があると考えられる。

上記発明において記載されている小胞子に特異的なプロモーターの作用が減数分 裂後に起こるため、因子に対して異型接合である植物の小胞子母細胞においては 雄性不稔ＤＮＡが分離することによって、花粉粒の半分にしかこの因子を受容し ない。

分離の問題を回避できる方法は、不稔性因子に対して同型接合である植物を生産 することである。しかしながら、このような植物の繁殖は、受粉によって子孫は 異種接合性に再度戻ってしまうため、無性のプロセスを経て行われなければなら ない。これによって、上記発明の適用は繁殖が商業的に生育しうる植物種に限ら れてしまう。したがって、雄性不稔ＤＮＡが母組織において発現でき、これによ ってすへての花粉粒に作用できることが望ましい。

ＥＰ−Ａ−０３４４０２９号（プラント　ジエネティック　システムズ（Ｐｌａ ｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｊｅｍｓ）　（ＰＧＳ）　）もまた、ハイブリッ ド形成した種を生産するのに使用する人工の雄性不稔化システムについて記載し ている。これは、ニコチアナ　タバカム（Ｎｉｃｏｊｉａｎａ　ｔｏｂａｃｕｍ ）から単離した朽に特異的なプロモーター（ＴＡ２９を設計した遺伝子からのも の）および雄性不稔ＤＮＡからなるキメラ遺伝子を基礎をしている。この場合、 プロモーターは、パラディン（Ｐａｌａｄｉｎ）のシステムにおけるような小胞 子に特異的な遺伝子由来ではなく、タペータム内で非常に発現する遺伝子由来で ある。このため、このキメラ遺伝子は、小胞子の発育を阻害し、タペータムを分 裂または破壊することによって雄性不稔が生じるように設計されている。

Ｌ２方法とＥＰ−Ａ−０３２９３０８号のものとの最も重要な違いは、減数分裂 を受けない細胞のタイプで活性のあるプロモーターの選択によって遺伝的な分離 に関する問題が回避される点である。タペータムの破壊によって、遺伝的に組み 立てているにもかかわらずすべての小胞子の成熟を阻害する。

植物遺伝学者が商業上重要な穀物及び他の植物において雄性不稔を誘導するのに 有用である方法を改善する弛みない努力の一環として、さらに有用な遺伝子及び それに関連したプロモーターの同定が盛んに行われている。それらのうち、今日 世界中で商業上最も重要な穀物としては、アブラナ科（ｌａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓ ｓｉｃａｃｅａｅ）のもの、特にセイヨウアブラナの脂肪種子（ｏｉｌｓｅｅｄ 　ｒａｐｅ）として一般的に知られているブラツシカ　ナブス（Ｂｒａｓｓｉｃ ａ　ｎａｐｕｓ）が挙げられる。アブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃｅａｅ）のもののタペータムに特異的な遺伝子及びプロモーターが明らかにな れば、植物を栽培する人々は、雄性不稔のブラッシカ　ナブス（Ｂ、　ｎａｐｕ Ｓ）及びアブラナ科（ｆａｍｉ１７　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のものの 発育について強力な道具として任意に使用できる。予想できない効果を減少させ るまたは最小限にすることができため、科若しくはさらに細かい分類学上の分類 における異種のＤＮＡを保存することが可能であることは魅力である。さらに、 同じ科の他のものの異種ＤＮＡを導入したアブラナ科（ｆａｍｉ１７　Ｂｒａｓ ｓｉｃａｃｅａｅ）の形質転換したものは、調節の観点からより遠い源からのＤ ＮＡを導入したアブラナ科（ｆａｎｉ１７　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）のもの より良好に用いられる。

本発明は、アブラナ科（ｆａｍｉ１７　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅｉｅ）由来の新規 でかつ有用な遺伝子およびプロモーターの発見に基づくものであり、さらに上記 発見を利用した方法、遺伝子構築物および形質転換植物に関するものである。

本発明の第一の概念によると、アラビドプシス　タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ ｉｓ　ｊｈａｌｉａｎａ）の１１．６若しくは１２．９ｋＤａのタペータムのタ ンパク質またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のも のの同様のタンパク質をエンコードする遺伝子の発現を自然に誘導するプロモー ターからなる組換えまたは単離ＤＮＡ分子を提供するものである。

本明細書において、アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）の１２ ．９ｋＤａのタンパク質をエンコードする遺伝子およびアブラナ科（ｌａｍｉｌ ｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のものにおける同様の遺伝子はＡ３遺伝子 と称する；アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｔ；ａｎａ）の１１．６ｋＤ ａのタンノくり質をエンコードする遺伝子およびアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂ ｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のものにおける同様の遺伝子はＡ９遺伝子と称す る。Ａ９及びＡ３は、ＥＰ−Ａ−０３４４０２９号に記載されているタペータム に特異的なプロモーターとは配列および発現のパターンが異なる。ＥＰ−Ａ−０ ３２９３０８号の一実施態様で記載されているような、熱ショック若しくは除草 剤の適用等の外来因子による誘導は、本発明では機能させる必要はないため、例 えば、不明確な開花の習性に付随した問題を抱える必要がない。

八３の時間的な発現（４ｅｍｐｏｒａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、小胞子母 細胞が減数分裂をする時から初期の小胞子の開期にかけての朽の発育期間中に起 こる。Ａ９遺伝子は、タペータム細胞において発現する。Ａ９の発現は、減数分 裂をする細胞を有する朽内で開始し、初期の第−間期における小胞子を有する朽 にまで続く。

上記で引用された分子量は推定されたものであり、ＤＮＡ配列から引き出した、 存在すると考えられるアミノ酸の数から算定している。アラビドプシス　タリア ナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ３遺伝子によってエンコードされる１２．９ｋ Ｄａのタンパク質は１１８アミノ酸を有する；アラビドプシス　タリアナ（Ａ、 Ｉｈａｌｉａｎａ）のＡ９遺伝子によってエンコードされる１１．６ｋＤａのタ ンパク質は１０７アミノ酸を有する。したがって、この分子量は配糖化されてい ないタンパク質に関するものであることが考えられる。さらに、部分的なタンパ ク質分解等の他の翻訳後プロセッシングに関する効果は割引いて考えられる。

上記で示された図式はアラビドプシス　タリアナ（Ａ、Ｉｈａｌｉａｎａ）のタ ンパク質に関するもののみであるが、当業者はアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒ ａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のものの同様なタンパク質を容易に同定することが できる。例えば、ブラッシカ　ナブス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）の同様 のＡ９遺伝子は、ＩＱ、３ｋＤａの算定された分子量を有する９６アミノ酸長の 推定タンパク質をエンコードする。このような同様な遺伝子は、ハイブリッド形 成に関する研究、制限断片長条型（ｒｅｓ＋ｒｉｃ＋ｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ 　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）　（ＲＦＬＰ）及び他の既知の方 法によって同定される。はとんど等価のタンパク質をエンコードする遺伝子は、 例えば、厳しい条件下（約０．９モル濃度の食塩水中で約３５℃から６５℃等） でアラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）のＡ３及びＡ９遺伝子、 またはこれらの断片、例えば１０．２０．５０若しくは１００ヌクレオチドに対 してハイブリ・ノドを形成する。１５〜２０ヌクレオチドのプローブが多くの環 境下で好ましい。

本明細書において記載されている好ましいＡ３及びＡ９プロモーターは、アラビ ドプシス　タリアナｆＡｒａｂｉｄｏｐｓ口＋ｈａ　ｌ　１ａｎａ）からのもの であり、例えば、（ａ）ブラ・ノシカナブスＩＢｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ） の植物の雄ず０から単離されｔ二ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、（ｂ）このｃ ＤＮＡを単離し、（Ｃ）このｃＤＮＡをプローブとして用いて雄ずし）に特異的 なｍＲＮＡをエンコードするアラビドプシス　タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓ　Ｉｈａｌｉａｎａ）の植物のゲノム領域を同定し、さらに、（ｄ）このＤＮ Ａのプロモーターを含む（５′）上流の調節領域を同定することによる等、既知 の方法によって単離できる。また、この方法は、植物の一種の雄ずいに特異的な りＮＡのコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）を基礎とする、また はこれ由来のプローブを用いて他の種の雄ずいに特異的なｍ　ＲＮ　Ａをエンコ ードするＤＮＡ配列を単離できることをも示している。アブラナ科（ｌａｍｉ１ ７Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のもの、例えばブラツシカ　ナブス（Ｂ、　 ｎａｐｕｓ）自身のＡ３及びＡ９プロモーターもまた、本発明の概念に含まれ、 同様に天然の配列の非必須の変形（ｖａｒｉａｊｉｏｎ）　をも含まれる。

特に好ましいプロモーターは、以下の実施例において記載されているように、図 ４（アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）　Ａ　３遺伝子に関す る）および図７（アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）　Ａ　９ 遺伝子に関する）に示される配列のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉ ｏｎ）の上流部分にある。当業者は、コーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇ ｉｏｎ）を誘導するプロモーターを十分正確に同定し、さらにこれらを含むＤＮ Ａを単離するおよび／または組換えることが可能である。

本発明によるプロモーターを含むＤＮＡを用いて、植物、特にアブラナ科（ｆａ ｍｉｌｙ　Ｂｔａｓｓｉｃａｃｅａｓ）に属するものに以下に示す様々な方法で 雄性不稔化することができる。したがって、本発明の重要な実施態様では、上記 プロモーターを発現すると雄性不稔になるＤＮＡに操作して連結する。

効果的な不稔化システムが完成したため、種親の繁殖は、無性の方法によってま たは雄性稔性の同質遺伝子系統による雄性不稔の受粉を経て、さらに、子孫のう ちから雄性不稔性植物を同定若しくは選択することによって行われなければなら ない。栄養成長による繁殖が行われれば、本発明はハイブリッドを生産するのに 完璧なシステムを形成する。

種子穀物を生産するために稔性の回復が必要である際には、本発明は新たな雄性 不稔化システムの基礎を形成する。異花受粉レベルが高い種子穀物によっては、 種子を混合することによって回復を回避できる。雄性不稔は、稔性の回復が必要 でない作物、例えば、アブラナ亜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｓｐｐ。

）の野菜等、及びレタス、はうれんそうやたまねぎ等の他の食用の植物等におい て特に有用である。

本発明によるＡ３および／またはＡ９プロモーターを導入したＤＮＡは、雄性不 稔ＤＮＡを誘導できるので、ハイブリッド生産において使用できる雄性不稔性植 物を生産できる。このプロモーターは、非常にタペータムに特異的であるため、 不稔ＤＮＡはタペータム内でのみ発現する。発現の制御は非常に強力であり、こ のＤＮＡは植物の他の細胞では発現しない。このシステムは生育できる花粉粒の 生産を阻害する。すべての形質転換植物およびそれらの子孫は雄性不稔性である ；減数分裂による分離に関する問題は生じない。

雄性不稔ＤＮＡに操作して連結されたプロモーターからなる構築物を、よく知ら れている方法によって植物（特にアブラナ属（ｇｅｎｕｓ　Ｂｒａｓｓｉｃａ） 、さらにはニコチアナ（Ｎ　ｉ　ｃ　ｏ　ｔｉａｎａ）及びホルデウム（Ｈｏｒ ｄｅｕｍ）等の他の属のもの）に形質転換できる。この形質転換によって、植物 、プロモーター及び雄性不稔ＤＮＡからなる外来のキメラＤＮＡを有する細胞が 生産できる。雄性不稔ＤＮＡは、植物の雄ずい細胞で生産または過剰生産される と、雄ずい細胞の正常な発育を阻害する、ＲＮＡ、タンパク質若しくはポリペプ チドをエンコードする。

タペータムに特異的なプロモーターは、生育できる雄性配偶子を生産するメカニ ズムの欠損を引き起こすＲＮＡ。

タンパク質若しくはポリペプチドをコードする様々な雄性不稔ＤＮＡ配列を誘導 するのに用いる。本発明は、誘導される配列に限られないが、雄性不稔プロモー ターを誘導できる配列の多くのクラス、特にこれらの実施例が好ましい。

例えば、誘導できる雄性不稔ＤＮＡは分解酵素をエンコードする。この分解酵素 は、核酸、タンパク質（若しくは糖タンパク質）、炭水化物および場合によって は脂質等の高分子等の、１つまたはそれ以上生物学的に重要な分子の分解を引き 起こす。

リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ　Ｔ１等）およびバーナーセ（ｂａｒｎａｓｅ） は、ＲＮＡの分解を引き起こす酵素の例である。ＤＮＡを分解する酵素の例とし ては、ＥｃｏＲＩ等の部位特異的若しくは部位非特異的である、エキソヌクレア ーゼおよびエンドヌクレアーゼが挙げられる。グルカナーゼは、炭水化物の分解 を引き起こす酵素の一例である。

この酵素、グルカナーゼは、朽内で自然に生産され、減数分裂前に作製されたポ リグルカンの保護膜から若い小胞子を放出する機能を有する。この酵素活性化は 、小胞子の発育の正しい段階に一致するように発育段階上で調節される。

強力な不稔ＤＮＡとしてのグルカナーゼの重要な魅力の一つとしては、グルカナ ーゼの発現の時機を逸し、小胞子の破壊を引き起こす突然変異による雄性不稔性 である植物が自然界で知られていることである。グルカナーゼの活性化か成熟前 または遅いかによって、２タイプが認識されている。朽内で発現するもの等の、 多くの遺伝子の発現によって様々なパターンの時間的な調節（ｔｅｍｐｏｒａｌ 　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）がされている。したがって、グルカナーゼを不稔ＤＮ Ａとして用いるために、遺伝子の発現を誘導するように選択されたプロモーター によって、好ましくは自然の雄性不稔に関して見付かった発現のパターンを擬態 することによって、グルカナーゼ活性を発育段階で好ましく調節できる。雄性不 稔を得る一つの方法は、雄性不稔性の突然変異植物内でグルカナーゼ活性を発見 したのと同様の発現パターンを有するタペータムに特異的な遺伝子からプロモー ターを単離することである。グルカナーゼの発現が遅いと機能的な杓のグルカナ ーゼ遺伝子を有する植物において不稔性が生じにくいので、不稔性因子は、正常 なグルカナーゼの活性化の前に転写を誘導できるプロモーターを有することが必 要である。ペチュニア（Ｐｅｊｕｎｉａ）のＲＭ　ｃｍｓ　突然変異体（イチュ ハー、ニス（Ｉｚｈａｔ、　Ｓ、）およびフランケル　アール（Ｆｒａｎｋｅｌ 、　Ｒ，）　、セオル　アプル　ジエネット（ＴｈｅｏｒＡｐｐｌ、　Ｇｅｎｅ ｊ、）　、４１巻、ページ１０４〜１０８　（１９７１年））において、朽内の グルカナーゼの発現はまず減数分裂前期の終りに起こり、さらに、減数分裂の完 了によって最高まで増加する。この発現パターンは正常なペチュニア（Ｐｅｔｕ ｎｉａ）の植物のものとは対照的であり、朽内のグルカナーゼは四分子の破壊お よび若い小胞子の放出に付随して活性化される。このｃｍｓ変異体において見つ かったグルカナーゼ活性の異常なパターンは、小胞子の破壊および雄性不稔に応 答すると考えられる。したがって、グルカナーゼ酵素をエンコードする不稔ＤＮ Ａを用いてこの変異を擬態することには、減数分裂前期と小胞子の四分子の出現 との間の朽の発育期間中に、朽内、好ましくはタベータム内の雄性不稔ＤＮＡの 転写を誘導できるプロモーターが必要である；したがって、上記のＡ３およびＡ ９プロモーターはこの遺伝子を誘導するのに非常に適している。β（１，３）− グルカンが必須な機能をしていると考えられる植物内のどこか、例えば篩部の節 要素において見付かっているので、タペータムに特異的な（または少なくとも杓 に特異的な）プロモーターもまた好ましい。

また、この酵素の空間的な調節（ｓｐａｔｉａｌ　ｒｅｇｕｌａｊｉｏｎ）によ って標的細胞に接近できる。室部分への分泌は、好ましい実施態様においては、 グルカナーゼのコード配列との翻訳融合物（ｔｒａｎｌａｌｉｏｎａｌ　ｆｕｓ ｉｏｎ）における適当なシグナル配列を提供することによって得られる。

グルカナーゼをエンコードするＤＮＡは、標的細胞の外が細胞毒性である生成物 を有さないので、雄性不稔ＤＮＡとして好ましい。雄性不稔ＤＮＡとしてのグル カナーゼは自然のシステムを擬態し、例えばリボヌクレアーゼに比べて本質的に 破壊的でないので、プロモーターが他の細胞のタイプの条件によってはわずかな 活性しか有さない等の問題が存在しない。

アクチニジンは、プロテアーゼの一例であり、これをコードするＤＮＡは適当な 雄性不稔ＤＮＡとなりうる。他の例としては、パパインのチモーゲンおよびパパ インの活性タンパク質が挙げられる。

相当する核酸が雄性不稔ＤＮＡとして有用であるリパーゼとしては、ホスホリパ ーゼ　Ａ２が挙げられる。

雄性不稔ＤＮＡが分解酵素をエンコードする必要はない。

雄性不稔ＤＮＡの他の例では、サイトカイニンの合成に含まれる、イソペンチル トランスフェラーゼ（ｉｓｏｐｅｌｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）等の、植物 ホルモンの合成を触媒する酵素、およびオーキシンの合成に含まれる１つまたは それ以上の酵素をエンコードするものがある。リポキシゲナーゼまたは有害な効 果を有する他の酵素をコードするＤＮＡもまた用いられる。

他の雄性不稔ＤＮＡとしてはアンチセンス配列が挙げられる。自然界で発見され たものとは反対の配向の遺伝子のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏ ｎ）を誘導することによって、遺伝子のダウンレギュレーションが生じ、これに よって、遺伝子生成物がより少量しか生産されないまたは全く生産されない。ア ンチセンスＤＮＡから転写されたＲＮＡは、細胞において一般的に発見される配 列のセンスＲＮＡバージョン（ｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ｖｅｒｓｉｏｎ）に結合で き、さらに上記の機能を破壊でき、これによって機能を欠損させることができる 。このようなアンチセンスＤＮＡの例としては、Ａ３及びＡ９プロモーターの制 御下で朽中で生産されるＡ３及びＡ９遺伝子のアンチセンスＤＮＡがある。この ような遺伝子は一般的にタペータム内で発現するため、上記遺伝子に対するアン チセンスはタペータムの機能を破壊し、これによって雄性不稔が起こると考えら れる。

アンチセンスＤＮＡのみが自然のセンス転写生Ｊ＆物（ｎａ＋ｕｒａｌ　５ｅｎ ｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃ＋）が生産されている時に転 写されることが決定的な要因ではない。アンチセンスＲＮＡは、通常、そのセン ス相補鎖（ｓｅｎｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｊａｒ７ｓｔａｎｄ）である時に結 合するのみであるため、センスＲＮＡが転写される際にのみ毒性効果を有する。

したがって、Ａ３若しくはＡ９遺伝子生成物をエンコードする幾つかのもしくは すべてのＤＮＡに相当するアンチセンスＤＮＡは、Ａ３及びＡ９遺伝子が発現し ている間のみ生産されるわけではない。このようなアンチセンスＤＮＡは、適当 なプロモーターの制御下で構成的に発現する。

したがって、本発明のさらなる概念によると、アラビドプシス　タリアナ（Ａｒ ａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）の１１．６若しくは１２．９ｋＤａの タペタームタンパク質またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅ ａｅ）の他のものの同様のタンノくり質をエンコードする遺伝子において自然に 転写されるＤＮＡ鎖の少なくとの一部に相補的である転写可能なりＮＡ鎖を有す るアンチセンス核酸を提供するものである。

本発明の上記概念によるアンチセンスＤＮＡは、以下の間に限られないが、タペ ータムの発育の間に転写できる適当なプロモーターの制御下にある。したがって 、上述したように、このプロモーターは構成性であるが、本発明の第一の概念に 関する上記のＡ３及びＡ９等のタペータムに特異的なプロモーターを使用しても よく、これらはより大きな制御に対しては好ましい。このようなアンチセンスＤ ＮＡｔ；！、通常〜アブラナＩ）　（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｇｉｃａｃｅａｅ ）のものの雄性不稔を得るのに有用である。

雄性不稔ＤＮＡのさらなる例としては、得られた標的配列に対して非常に特異的 に切断できるＲＮＡ酵素（リボザイムとして知られている）をエンコードするも のがある（ハセロフ（Ｈｓｅｌｏｆｆ）およびガーラツク（Ｇｅｔｌａｃｈ）　 、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３３４巻、ページ５８５〜５９１　（１９８８ 年））。アンチセンスＤＮＡと同様、リボザイムＤＮＡ（例えば、Ａ３若しくは Ａ９遺伝子によってエンコードされるＲＮＡに対して標的にされたりボザイムを コードする）は、Ａ３及びＡ９遺伝子の発現の時にのみ発現するとは限らない。

また、構成性発現（ｃｏｎｓｔ目ｕｔｉＶｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に使用さ れるもの等、リボザイムをエンコードするＤＮＡを誘導するのに好ましいプロモ ーターを使用することも可能である。

したがって、本発明のさらなる概念によると、アラビドプシス　タリアナ（Ａｒ ａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｊｈａｌｉａｎａ）の１１．６若しくは１２．９ｋＤａの タペタームタンパク質またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅ ａｅ）の他のものの同様のタンパク質をエンコードする遺伝子によってエンコー ドされたＲＮＡを特異的に切断できるリボザイムをエンコードするＤＮＡを提供 するものである。このようなりボザイムをエンコードするＤＮＡは、通常、アブ ラナ科（ｆａｍｉ１７　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）のものを雄性不稔化するの に有用である。

本発明のＤＮＡ配列の好ましい実施態様においては、Ａ３／Ａ９プロモーターお よび雄性不稔ＤＮＡ構築物、ポリアゾニレ−ジョンシグナル（ｐｏ１７ａｄｅｎ ７１ａｊｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）等の３′転写調節シグナルからなるもの等があ る。３′転写調節シグナルは、好ましくは、カリフラワー　モザイク　ウィルス （Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ　Ｍｏ５ａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ）　３５　Ｓ遺伝子由来 である。他の３−転写調節シグナルも使用できることを認識しなければならない 。

上記のアンチセンス核酸およびリボザイムをエンコードする核酸は、さらに一般 的な原則の例であるコしたがって、本発明のさらなる概念によると、Ａ３および Ａ９遺伝子の適当な発現を選択的に破壊する（例えば発現に関して）ＤＮＡを提 供するものである。

本発明による組換ＤＮＡは、ベクターの形態を有する。

このベクターは、例えば、プラスミド、コスミドまたはファージである。ベクタ ーは、しばしば、これらの感染した（または形質転換した：これらの言葉は本明 細書において交互に用いられる）細胞を選択でき、好ましくは、異種のＤＮＡを 導入したベクターを有する細胞を選択できるような１つまたはそれ以上の選択マ ーカーを有する。適当な出発シグナル（ｓｔａｒｔ　ｓｉｇｎａｌ）および停止 シグナル（ｓｔｏｐ　ｓｉｇｎａｔ）が通常存在する。さらに、ベクターが発現 しようとすると、発現を誘導するのに十分は調節配列（ｒｅｇｕｌａｊｏｒｙ　 ５ｅｑｕｅｎｃｅ）が存在する；しかしながら、本発明によるＤＮＡは通常植物 細胞において発現するため、微生物を宿主とする発現は、本発明の初期の目的の 中に含まれないが、使用してもよい。調節配列（ｒｅｇｕｌａｆｏｒｙ　５ｅｑ ｕｅｎｃｅ）を含まないベクターはクローニングベクターとして用いられる。

クローニングベクターを大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）または操作が容易である他の適 当な宿主に導入できる。したがって、本発明のさらなる概念によると、上記した ＤＮＡを感染または形質転換した宿主細胞を提供するものである。

本発明によるＤＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのプロセス等、さらに続くヌクレオチ ドを一緒に連結する（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、および／またはオリゴ−および／ま たはポリ−ヌクレオチドを連結する（ｌｉｇａｉｉｎｇ）等の従来の方法によっ て調製できるが、組換ＤＮＡ技術も選択できる。

最後に、本発明によるＤＮＡ　（（ｉ）Ａ３および／またはＡ９プロモーターに 雄性不稔遺伝子を加えたもの、（ｉｉ）Ａ３および／またはＡ９のＲＮＡに標的 にされたＡ３および／またはＡ９遺伝子若しくはリボザイムＤＮＡに対するアン チセンスＤＮＡのどちらであっても）は、適当な方法によって植物細胞に導入で きる。本発明のさらなる概念によると、上記した本発明によるＤＮＡを含む植物 細胞を提供するものである。

好ましくは、不活化された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）　Ｔ　ｉ−プラスミドベクター を用いてさらに、例えば、ＥＰ−Ａ−０１１６７１８号およびＥＰ−Ａ−０２７ ０８２２号に記載されているもの等、既知の方法によってアグロバクテリウム（ Ａｇｒｏｂａｃｌｅｒｉｕｍ）によって運ぶことによって、ＤＮＡを植物細胞中 に形質転換する。または、電気排出装置（ｅｌｅｃ＋ｒｉｃａｌ　ｄｉｓｃｈａ ｒｇｅ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて外来ＤＮＡを直接植物細胞に導入しても よい。上記方法は、例えば、受容植物が単子葉植物である等、アグロバクテリウ ム（Ａｇｒｏｂａｃｊｅｒｉｕｍ）が効果的でない時に好ましい。いずれかの種 の植物細胞の核ＤＮＡ内でＤＮＡを安定して導入できる他の方法も好ましい。

上記植物としては、遺伝的形質転換が一般的に可能でない植物種が挙げられる。

また、本発明によるＤＮＡは、好ましくは、外来のＤＮＡを有する形質転換植物 が外来のＤＮＡを含まない他の植物と容易に区別できる第二のキメラ遺伝子（「 マーカー」遺伝子）を何している。このようなマーカー遺伝子の例としては、抗 生物質耐性（ヘレラーエストレラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）ら、１ ９８３年）、除草剤耐性（ＥＰ−Ａ−０２４２２４６号）およびグルクロニダー ゼ（ＧＵＳ）の発現（ＥＰ−Ａ−０３４４０２９号）等が挙げられる。マーカー 遺伝子の発現は、好ましくは、タペータム以外の細胞において発現できる第二の プロモーターによって制御され、これによって植物の再生のいずれかの段階でマ ーカーを有する細胞若しくは組織を選択できる。好ましい第二のプロモーターは 、カリフラワー　モザイク　ウィルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｖｅｒ　Ｍｏ５ａｉｃ 　Ｖｉｒｕｓ）　（ＣａＭＶ）の３５８サブユニツトのコートタンパク質をエン コードする遺伝子由来である。しかしながら、他の適当な第二のプロモーターも 使用してもよい。

植物全体は、１つの形質転換植物細胞から再生でき、したがって、本発明は、上 記した本発明によるＤＮＡを有する形質転換植物（または増殖材料等の、これら の部分）を提供するものである。再生は既知の方法によって行える。

形質転換された植物の花の場合では、生育できる花粉を生産できないことによる 雄性不稔であると考えられる。花粉が生産できる際には、受容植物の種子を得る ことができないことによって生育できないと考えられる。

ここで、本発明を以下の実施例によって詳細に説明する。

以下の制限酵素および他の略称を用いる：Ａ、Ａｃｃ　Ｉ　；Ｂ、ＢａｍＨＩ　 ；Ｂｇ、Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ　；Ｃ，Ｃ１ａＩ　；Ｈ，ＨｉｎｃＩＩ； Ｈｄ、Ｈｉｎｄｌｌ　Ｉ　；に、ＫｐｎＩ　；Ｍ、ＭｌｕＩ　；Ｎ、Ｎｏｔ　Ｉ 　；Ｎｃ、ＮｃｏＩ　；Ｎｒ、Ｎｒｕｌ　；Ｐ、Ｐｓｔ　Ｉ　；Ｒ，ＲｓａＩ　 ；ＲＩ、ＥｃｏＲＩ　；ＲＶ、ＥｃｏＲＶ；Ｓ、５ｓｔｌ；Ｓａ、５ａｌＩ；Ｓ ｐ、５ｐｈｌ　；Ｓｍ、ＳｍａＩ　；Ｓｓ、５ｓｐＩ　；ＳＩ　Ｉ、５ａｃＩ　 Ｉ　；Ｘ、ＸｈｏＩ　；Ｘｂ、Ｘｂａ１００ＲＦ＝読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅ ａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）実施例は添付した図を参照にしており、図を以下に説 明する： 図１は、Ａ３内に含まれるＯＲＦの推定のタンパク質の配列と共にブラソシカ　 ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のｃＤＮＡ　Ａ３のＤＮＡ配列を示すものである； 図２ａは、アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ３遺伝子と のフラワシカ　ナプス（Ｂ、　ｎａｐｕｓ）のｃ　ＤＮＡであるＥ３およびＥ５ のＤＮＡ配列の比較を示すものである。下線部のトリヌクレオチドは、それぞれ の配列によってエンコードされたＯＲＦの末端を示している；図２ｂは、アラビ ドプシス　タリアナ（Ａ、１ｈａｌｉａｎａ）のＡ３遺伝子によってエンコード された推定のポリペプチドとのブラソシカ　ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のｃＤＮ ＡであるＥ３およびＥ５によってエンコードされた推定のポリペプチドの比較を 示すものである； 図３は、アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）のゲノムクローン 　６３．６の制限酵素地図を示すものである。

関連した部位のみを示し、これらは６３．６にのみ有るものではない。Ａ３のコ ーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）の部分を黒塗りの箱として示す 。また、プラスミドｐＲ８５および１５の中にクローニングされた挿入部分の範 囲をも示す； 図４は、アラヒドプシス　タリアナ（Ａ、１ｈａｌｉａｎａ）のＡ３遺伝子のＤ ＮＡ配列および推定の一次構造を示す。下線部分の配列はＴＡＴＡボックスのモ チーフ（ＴＡＴＡ　ｂｏｘ　ｍｏｊｉｆ）に適合している； 図５は、ブ°ラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡのＡ９のＤ ＮＡ配列およびこのｃＤＮＡに含まれたＯＲＦの推定の一次構造を示す； 図６は、アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のゲノムクローン 　Ｇ９．１の制限酵素地図を示すものである。

Ａ９のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）の部分を黒塗りの箱と して示し、また、プラスミドｐｗｐ３９．５５および６４中の挿入部分の範囲を 示す； 図７は、アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ９遺伝子のＤ ＮＡ配列および推定の一次構造を示す。下線部分の配列はＴＡＴＡボックスのモ チーフ（ＴＡＴＡ　ｂｏｘ　ｍｏｊｉｌ）に適合している； 図８ａは、フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のＡ９　ｃＤＮＡおよびアラ ビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ９遺伝子の間のＤＮＡ配列 の相同性を示す。下線部分のヌクレオチドは、これらの配列の中に含まれるＯＲ Ｆの停止コドン（ｓｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ）の部分を示す；図８ｂは、フラッシカ 　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のＡ９　ｃＤＮＡおよびアラビドプシス　タリアナ （Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ９遺伝子によってエンコードされた推定の生成物 間の相同性を示す； 図９は、Ａ３プロモーターおよびβ−グルクロニダーゼをエンコードする大腸菌 （Ｅ、ｃｏｌｉ）遺伝子の転写融合物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕ ｓｉｏｎ）を有するキメラ遺伝子の構築を示す：図１０は、Ａ９プロモーターお よびβ−グルクロニダーゼをエンコードする大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）遺伝子の転 写融合物（ｔｒａｎｓｃ’ｒｉｐ＋１ｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）を有するキメラ 遺伝子の構築を示す； 図１１は、Ａ９−ＧＵＳを形質転換したタバコ植物の杓におけるβ−グルクロニ ダーゼ活性を示す；図１２は、形質転換植物においてＡ３及びＡ９プロモーター からセンス及びアンチセンスＲＮＡを発現するキメラ遺伝子の製造において使用 される中間のクローニングベクターの構築を示す； 図１３ａおよび１３ｂは、Ａ３及びＡ９プロモーターおよびＲＮＡアーゼである バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）のキメラ遺伝子の構築を示す；および 図１４ａおよび１４ｂは、Ａ３及びＡ９プロモーターおよびＣ末端の拡張（ｅｘ ｔｅｎｓｉｏｎ）が欠損しているニコチアナタバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔ ｏｂａｃｕｍ）のβ−１，３グルカナーゼ遺伝子のキメラ遺伝子の構築を示す。

図１４ａは、転写融合構築物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ 　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の調製を説明し、図１４ｂは、翻訳融合構築物（ｔｒａ ｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の調製を説明する 。

実施例において、特に記載のない限り、組換ＤＮＡの作製および操作方法はすべ て、マニアティス（Ｍａｎｉａｊｉｓ）ら、モレキュラー　クローニング（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ニアラボラトリ−マニュアル（Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｊｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラト リ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　％　１ ９８２年に記載されている標準的な方法を用いて行われた。

ａｎａ）からの朽に特異的な遺伝子であるＡ９およびＡ３の単離 以下に記載したようにして、切開した杓から抽出されたＲＮＡから構築されたフ ラッシカ　ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕＳ）のｃＤＮＡライブラリーを 分画スクリーニング（ｄｉｌｆｅｒｅｎ＋ｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）するこ とによって、朽に特異的なｃＤＮＡを単離した。ｃＤＮＡクローンであるＡ３お よびＡ９を１．４〜１．８ｍｍの長さである朽から構築したライブラリーから単 離した。このライブラリーを、ベクター　ラムダ　ザップ（Ｌａｍｂｄａ　Ｚａ ｐ）　（ストラタジーン（Ｓｊｒａｊａｇｅｎｅ）製）中に構築した。Ａ３およ びＡ９のｃＤＮＡをプローブとして用いて、ベクター　ラムダ　ダッシュ（Ｌａ ｍｂｄａ　Ｄａｓｈ）（ストラタジーン（Ｈｒａｊａｇｅｎｅｌ製）中に構築さ らたアラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）のゲノムライブラリー から相同性のある遺伝子を単離した。

材料および方法 植物材料：核酸を単離するためのすべての播種材料は、２４℃で１８時間の光周 期で環境が制御された生育キャビネットの中で生育した２〜３週令の植物から得 た。分画スクリーニング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）お よびノーザンプロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析のための苗木のＲＮ Ａは、フラッシ力　ナブス　オレイフエラ　変種　「トパーズＪ　（Ｂ、　ｎａ ｐｕｓ　ｏｌｅｉｆｅｔａ　ｗａｒ、’Ｔｏｐａｚ’）より得た。雄性稔性の芽 は、フラッシ力　ナプス　オレイフエラ　変種　［リフタ−Ｊ　（Ｂ、ｎａｐｕ ｓ　ｏｌｅｉｆｅｒａ　ｗａｒ、’Ｌｉｃｊｏｒ’）　（−ッカーソンズ　シー ズ（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎｓ　５ｅｅｄｓ）製、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇ ｅ）　、英国）の野外で生育させた（ｆｉｅｌｄ　ｇｒｏｗｎ）植物から収集し た。雄性不稔性の芽は、野外で生育させた（ｒｉｅｌｄ　ｇｒｏｖｎ）フラッシ 力　ナブス　オレイフエラ　変種　シーエムニス［オグラＪ　（Ｂ、ｎａｐｕｓ 　ｏｌｅｉｆｅｒａ　ｗａｒ、ＣＭＳ　’Ｏｇｕｒａ’）にッカーソンズ　シー ズ（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎｓ　５ｅｅｄｓ）製、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇ ｅ）　、英国）の植物から得た、巧の切開：ｃＤＮＡライブラリーの構築のため に、花序を素早く集め、最大５時間、必要になるまで４℃で保存した。鋭いピン セットを用いて適当な大きさの芽から朽を切開し、直ぐに液体窒素中で凍結した 。

花粉の単離：チョウング（Ｃｈｏｕｎｇ）およびビーバースドルフ（Ｂｅａｖｅ ｒｓｄｏｒｆ）　（プラント　サイ（ＰＩａ＋ｕ　Ｓｃｉ、）、３９巻、ページ ２１９〜２２６　（１９８５年））の方法を用いて適当な長さの新鮮な芽から小 胞子を単離し、ＲＮＡを単離する前に一８０°Ｃで凍結した。（凍結された芽か ら単離された花粉では非常に分解したＤＮＡしか得られない）。

芽の収集：最初の花が開く直前の段階の、芽の完全な輪生体の多くのサンプルを 液体窒素中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。

朽および芽の細胞学的段階（ｃｙｊｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔａｇｉｎｇ）　：ア セトオルセイン（ａｃｅｔｏ−ｏ＋ｃｅｉｎ）若しくはアクリジンオレンジの存 在下でつぶした全朽から押し出された胞子形成細胞（ｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ　 ｃｅｌｌ）、小胞子若しくは花粉粒を光学顕微鏡で調べることによって、予め決 められた長さの芽の発育段階を評価した。目盛のついた接眼レンズの格子を備え た低電力の光学顕微鏡を用いて、芽の長さを正確に測定した。

芽の長さは、小花梗の底がら最も高いがく片の先までを測定した。

ＲＮＡの単離および分析：低分解（ｌｏｗ　ｒｅｓｏｌｌｉｏｎ）ノーザンドッ トプロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）分析またはｍＲＮＡの単離 のために使用する材料を、液体窒素で冷却した乳ばちの中で微粉末になるまでひ いた。従来記載されている（ドレイパー（Ｄｒａｐｅｒ）ら、「プラント　ジエ ネティックトランスフォーメーション　アンド　ジーン　エックスプレッション ニア　ラボラトリ−マニュアル（Ｐｌａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒ ｍａ目ｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒＩ　Ｍａｎｕａｌ）　Ｊ　、ブラックウェル　サイエンティフィックパブリ ッシャーズ（Ｂｒａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ ｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）　（１９８８年））ようなフェノール を基礎とした方法を用いて、粉末から全ＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ）　ＲＮＡ を、本質的にはマニアティス（ＭａｎｉａｊｉｓＪらのマニュアルにおいて記載 されているようにしてオリゴ（ｄＴ）−セルロース　クロマトグラフィーを２回 行うことによって精製した。高分解（ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）ドッド ブロソト（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）用のＲＮＡを、ヴアーウォード（Ｖｅｒｗｏｅｒ ｄ）ら、ヌク　アシッズ　レス（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ（）、１７巻、ペ ージ２３６２　（１９８９年）の方法にしたがって単離した。

ｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニング：製造会社の指示にしたがっ て、（アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）若しくはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）製の）ｃＤＮＡ合成キットを用いてポリ（Ａ）　ＲＮＡから、ｃＤＮＡを 合成した。

ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断した脱リン酸化されたラムダ　ザップ　Ｉ　（Ｌ ａｍｂｄａ　ｌａｐ　Ｉ）　（ストラタジーン（Ｓｊｒａｔａｇｅｎｅ）製）（ 「胞子形成」ライブラリー（ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ’　１ｉｂｒａｒｙ）） またはラムダ　ザップ　Ｉ　Ｉ　（Ｌａｍｂｄａ　ｚａｐ　ＩＩ）（ストラタジ ーン（Ｓｊｒａｔａｇｅｎｅｌ製）（「小胞子−発育」ライブラリー（’ｍｉｃ ｒｏｓｐｏｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ’　１ｉｂｒａｒｙ））に連結し、ア マジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍｌ製のｉｎ　ｖｉｔｒｏのパッケージングエクスト ラクツ（ｐａｃｔａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔｓ）を用いてパッケージングした 。サージェント（Ｓａｒｇｅｎｊ）　、メソッズイン　エンサイモロジー（Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｎｏ１．）　、１５２巻、ページ４２３〜４３２ 　（１９８７年）にしたがって適当な朽のポリ（Ａ）”ＲＮＡまたは苗木のポリ （Ａ）　＋ＲＮＡのいずかより調製した［３２Ｐコで標識された１本鎖のｃＤＮ Ａプローブを含んだ２枚のハイボンドーエヌ（ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ）フィルター（ アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製）上で、クローンを分画してスクリーニング した。（ハイボンドーエヌ（ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ）という表現は商標である。）Ｒ ＮＡドツトおよびゲルプロット：ドツト−プロット（ｄｏｆ−ｂｌｏｔ）用の全 ＲＮＡを、製造会社の指示にしたがって、ハイボンドーエヌ（ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ ）（アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍｌ製）ヒにスポットした。ノーザンゲル（Ｎ ｏｒｔｈｅｒｎ　ｇｅｌ）をランニングさせ、フォーニイ（Ｆｏｕｒｎｅｙ）　 （ピーアールエル　フォーカス（ＢＲＬ　Ｆｏｃｕｓ）　、１０巻、ページ５〜 ７（１９８８年））にしたがって、ＲＮＡをハイボンドーエヌ（ＨＹＢＯＮＤ− Ｎ）上に移した。ハイブリッド形成およびハイポンドーエヌ（ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ ）フィルターの洗浄は製造会社の指示にしたがって行った。

切片上ハイブリッド形成法（ｉｎ　ｓｏｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｓａｊｉｏｎ）　： 包埋および薄断片の作製のために、フラッシヵ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）の芽 をシーアールヮイオーーエムーベッド（ＣＲＹＯ−Ｍ−ＢＥＤ）（ティニーニー ビー　ラボラトリーズイクイップソフト　エルティディ（ＴＡＡＢ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎ＋　Ｌｊｄ、ｌ製）中に凍結した。（シーア ールヮイオーーエムーベッド（ＣＲＹＯ−Ｍ−ＢＥＤ）という表現は商標である 。）薄断片を公称１０μｍの厚さに切断し、サブベッドスライド（ｓｕｂｂｅ＋ Ｉ　５ｌｉｄｅＪ上にのせ（ファン　プロオイジエノーネソト（Ｖａｎ　Ｐｒｏ ｏｉｉｅｎ−Ｋｎｅｇｊｊら、ヒストケミカル　ジエ−（Ｉｌｉｓｊｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｊ、）、１４巻、ページ３３３〜３３４　（１９８３年））、４％パ ラホルムアルデヒド中で固定し、脱水した。［３５Ｓ］　ｒＵＴＰ　（＞１００ ０Ｃｉ／ミリモル、アマジャム（ＡｍｅｒｓｈａｍＪ製、ＳＪ、１３０３）で標 識されたセンスおよびアンチセンスＲＮＡプローブを、ｃＤＮＡがクローニング されている、ブルースクリプトエクケーナイナス（ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ　ＳＫ Ｉ　（ストラタジーン（Ｓｊｒａｆａｇｅｎｅｌ製）のＴ３およびＴ７プロモー ターから転写した。（ブルースクリプト　エクケー−（ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ　 ５Ｋ−）という表現は商標である。）転写後、プローブをアルカリによる加水分 解によって切断し、約１５０ｂｐ長のプローブ断片を得た。ハイブリッド形成用 溶液（ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）は、５０％ホルムアル デヒド、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　２ＨＰ　０４　ｐ 　Ｈ６，８，１０ｍＭ）リス−塩酸　ｐＨ７゜５．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２ ％ウシ血？青アルブミン、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリ ドン、１０ｍＭジチオトレイトール、１０％硫酸デキストラン、０．７ｍｇ／ｍ １　大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のｔＲＮＡ、５０〜ＩＱ　Ｑ　ｎ　ｇ　／　ｍ　１ のプローブストック（６，７ｘ１０５Ｃｐｍ／ｎｇプローブ）であった。薄断片 を３０μｍのハイブリッド形成用溶液（ｈｙｂｒｉｄｉｓｒｌｉｏｎ　５ｏｌｌ ｉｏｎ）において５０℃で１６時間ハイブリッド形成した。スライドを５０％ホ ルムアルデヒド、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭＮ　ａ　２　ＨＰ　０４ 　ｐ　Ｈ６，８，１０ｍＭ）リス−塩酸　ｐＨ７，５で５０°Ｃで１時間ずつ計 ３回洗浄し、さらに、ＲＮアーゼ　Ａバッファーですすぎ、ホルムアルデヒドを 除去した。ＲＮアーゼ　Ａ処理、（５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス 塩酸　ｐ）（’７．５にＲＮアーゼ　Ａを１５０μｇ　／　ｍ　１で溶解したも の）を３７℃で１時間行った。さらに、スライドを２ＸＳＳＣ（０，３Ｍ塩化ナ トリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）において６５℃で３０ 分間を２回洗浄し、濃度勾配のついたアルコール（Ｈａｄｅｄ　ａｌｃｏｈｏｌ ）を通すことによって脱水し、乾燥した。オートラジオグラフィーを目的として 、スライドを、アイエルエフオーアールディ　ケ−５（ＩＬＦＯＲＤＫ５）の核 酸の飛跡用エマルジョン（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｃｋ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ）　 （１：　５９の割合のグリセロール：水の混合物においてＩｇ／ｍｌ）中に４５ ℃で漬けた。（アイエルエフオーアールディ　ケ−５（ＩＬＦＯＲＤ　Ｋ５）と いう表現は商標である。）被爆時間は２から１４日であった。現像は、コダック 　ディ１９　（ＫＯＤＡＫ　Ｄ１９）において行った。（コダック　ディ１９　 （ＫＯＤＡＫ　Ｄ１９）という表現は商標である。）さらに、現像された薄断片 をメチレンブルーで染色し、永久プレパラートを作製した。

ａ）アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｆｈａｌｉａｎａ）　Ａ３遺伝子の単離お よび特性の評価 ブラソシカ　ナプス（Ｂ、　ｎａｐｕｓ）の朽、花粉、雄ずい葉および苗木から 抽出されたＲＮＡを用いたノーザンハイブリダイゼーション（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 　ｈｙｂｔｉｄｉｘａｊｉｏｎ）分析によって、Ａ３は長さが１．６〜２．３ｍ ｍの杓においてしか発現せず、１．８〜２．３ｍｍで発現が最高になることが示 された。このようにして、Ａ３の時間的な発現（ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ）は、小胞子母細胞が減数分裂する時から初期の小胞子の間期までの 朽の発育期間中にわたる。切片上ハイブリッド形成法（ｉｎ　５ｉｔｕ　ｈｙｂ ｒｉｄｉｓａｊｉｏｎ）によって、フラッシカ　ナプス（Ｂ、　ｎａｐｕｓ）に おいては、Ａ３は朽のタペータムにおいてのみ発現することが指摘された。Ａ３ のｃＤＮＡは、３４７ｂｐの長さで、１〜３２９ｂｐから拡張する読み取り枠（ ｏｐｅｎ−ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）　（ＯＲＦ　）を有する（図１）こと からこのクローンは全長でないことが分かる。ノーザンゲルブロソト（Ｎｏｒｊ ｈｅｒｎ　ｇｅｌ　ｂｌｏｔ）からフラッシカナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のＡ３ のｍＲＮＡの推定の大きさは約５００ｂｐであり、これによってもこのクローン が全長でないことが指摘される。このＡ３のｃＤＮＡを用いて、同じフラッシカ 　ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のライブラリーから相同性のあるｃＤＮＡクローン （Ｅ３およびＥ５）を単離した。

Ｅ５のｃＤＮＡは４２２ｂｐ長であり、１〜３３３ｂｐのＯＲＦを釘する（図２ ａ）。このｃＤＮＡは、重なっている領域てはＡ３のｃＤＮＡと一致し、Ａ３の 出発の５−側の５ｂｐおよびＡ３の終結の３−側の６９ｂｐのＡ３配列が拡張し ている。Ｅ３のｃＤＮＡは、１〜３１４ｂｐの位置が拡張するＯＲＦを有する３ ９８ｂｐ長である（図２ａ）。Ｅ３のｃＤＮＡは、ヌクレオチドレベルでＥ５の ｃＤＮＡと９５％一致し、推定のＯＲＦ生成物は９１％一致している。Ａ３と相 同性はあるが一致はしないＥ５のクローニングによって、杓に特異的な遺伝子で あるＡ３の配列を基礎としたプローブによって相同性のある杓に特異的な遺伝子 のクローニングか可能であることが明らかである。

Ａ３のｃＤＮＡとハイブリット形成する１５ｋｂのアラビドプシス　タリアナ（ Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）のゲノムクローン（Ｇ３．６）を単離した（図３）。Ａ ３プローブと強くハイブリッド形成する２３００ｂｐのＨｉｎｄｌ　Ｉ　ｌ−Ｈ １ｎｃｌｌｐｉ域を０３．６からサブクローニングし、一部を配列分析する（図 ４）ことによって、フラッシカ　ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のＥ５のｃＤＮＡと 非常に相同性のある０ＲＦ（７７０〜１１２６の位置）が明らかにされた（ヌク レオチドレベルで８２％およびタンパク質レベルで７６％）（図２　ａ　ｓ　ｂ 　）　ｏアラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ３遺伝子は明 らかにイントロンを含まない。Ａ３によってエンコードされた推定のタンパク質 は、１２．９ｋＤａの分子量を有する１１８アミノ酸から構成される。エフピー アールエフ（ＮＢＲＦ）タンパク質のデータベースの研究（放出３４）によって は、推定のＡ３タンパク質に相同性のあるタンパク質は見つからなかった。Ａ３ のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）の推定の出発点から６９ｂ ｐ上流の、６９９〜７０７ｂｐの間にＴＡＴＡボックスの共通配列（ジョン（Ｊ ｏｓｈｉ）　、１９８７年）がある。

ｂ）Ａ９遺伝子の単離および特性の評価ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）分析およ び切片上ハイブリッド形成法（ｉｎ　ｓ自ｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｓａｌｉｏｎ）に よって、フラツシカ　ナプス（Ｂ、　ｎａｐｕｓ）のＡ９遺伝子は朽の長さが１ ．　５〜２．　３ｍｍのタペータム細胞において発現し、２．０〜２．　３ｍｍ で発現が最高になることが示される。Ａ９の発現は、減数分裂をしている細胞を 有する朽内で開始し、初期の第−間部における小胞子を有する杓にまで続く。Ａ ９のｃ　ＤＮＡは、１〜２９６ｂｐの位置のＯＲＦを含む４９０ｂｐの長すテア ル（図５）。ノーザンゲルプロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｇｅｌｂｌｏｔ）より 、フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）におけるＡ９のｍ　ＲＮ　Ａの測定さ れた大きさは約５５０〜６００ｂｐである。Ａ９のｍＲＮＡの存在量は、朽のポ リＡ＋ｍＲＮＡの全量の０．１〜０．２％の間であった。

Ａ９のｃＤＮＡとハイブリット形成する１３Ｋｂのアラビドプシス　タリアナ（ ＾、ｔｈａｌｉａｎａ）のゲノムクローン（Ｇ９．１）を単離しく図６）　、３ １４５ｂｐのＸｂａｌ断片をクローニングし、一部を配列分析した（図７）。こ の断片は、ヌクレオチドレベルでＡ９のｃＤＮＡのＯＲＦと７６％一致しく図８ ａ）、さらにこれらのＯＲＦの推定生成物と７３％一致する（図８ｂ）１４６１ 〜１７８１ｂｐの位置のＯＲＦを有している。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の比較 によって、ｃＤＮＡにおけるＯＲＦは９ｂｐの位置で開始しく図５）、Ａ９遺伝 子はイントロンを含まないことが指摘される。Ａ９遺伝子の推定の出発点から７ ０ｂｐ上流部分（１３８２〜１３８９の位置）に、ジョン（Ｊｏｓｈｉ）（１９ ８７年）の共通配列に適合するＴＡＴＡボ・ノクスがある。フラッシカ　ナプス （Ｂ、ｎａｐｕｓｌのｃＤＮＡによってエンコードされた推定のＯＲＦは、１０ ．３ｋＤａの算定分子量を有する９６アミノ酸であり、アラビドプシスタリアナ （Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のものは、１１．６ｋＤａの分子量を有する１０７ア ミノ酸である。エフピーアールエフ（ＮＢＲＦ）タンパク質のデータベースの研 究によって推定のＡ９タンパク質に対して全体的な相同性は見つからなかったが 、Ａ９タンパク質は、数種の２８植物の貯蔵タンパク質においておよびある種の 植物のプロテアーゼ阻害剤中に存在するシスティンモチーフを（ｃ７ｓｆｅｉｎ ｅ　ｍｏｔｉｆ）有する。

実施例２　アラビドプシス　タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａ ｎａ）およびニコチアナ　タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔｏｂａｃｕｍ）の 朽におけるβ−グルクロニダーゼの発現を誘導するためのＡ９およびＡ３プロモ ーターの使用 Ａ３およびＡ９の推定のプロモーター領域がアラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｆ ｈａｌｉａｎａ）およびニコチアナ　タバカム（Ｎ、ｊｏｂａｃｕｍ）において 外来遺伝子の発現を誘導することができることを示すために、プロモーターの転 写融合物（ｔ＋ａｎｓｃｒｉｐ！１ｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）をβ−グルクロニ ダーゼ（ＧＵＳ）をエンコードする大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ ）遺伝子について行った。

ａ）Ａ３−ＧＩＪＳ融合物（図９） ６３．６の１０３０ｂｐのＨｉｎｃＩＩ断片をベクターｐＴＺ１８　（７ｙルマ シア　エルティディ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｊｄ、）製）のＨｉｎｃ１１部位 にサブクローニングし、ｐＲ３５を形成した（図９）。これを５ｓｔＩで切断し 、この断片を５ｓｔｌで切断したｐｌｃ１９Ｈ（マルシュ（Ｍａｒｓｈ）ら、ジ ーン（Ｇｅｎｅ）、３２巻、ページ４８１〜４８５　（１９８４年））にクロー ニングし、ｐＷＰ８７を形成した。次に、Ａ３プロモーターをｐＷＰ８７からＨ ｉｎｄＩＩＩ−Ｎｒｕｌ断片として回収し、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ及びＳｍａＩで 切断したｐＢｌｌｏｌ、１　（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）ら、エン ボ　ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）　、６巻、ページ３９０１　（１９８７年）） にクローニングした。このようにして得られたプラスミド（ｐＷＰ９２）（図９ ）は、ＧＵＳに融合した５ｓｔＩ部位（図４において７４５ｂｐの位置）の上流 の７４５ｂｐのＡ３配列を有する。

ｂ）Ａ９−ＧｔＪＳ融合物（図１０） ３２９ｂｐのＨｉｎｃｌｌ−ＲｓａＩ断片（図７において１１０５〜１４３４ｂ ｐの位置）をＨｉｎｃ　Ｉ　Ｉで切断したｐＴ２１８にクローニングし、ｐＷＰ ７０Ａを形成した。ＤＮＡ配列分析によって、Ｒｓａ１部位の再形成において生 じたＲｓａｌ、Ｈｉｎｃｌｌ結合部位でｒＧＪ残基が欠損していることが分かっ た。Ａ９プロモーターを有するｐＷＰ７０ＡのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ、ＢａｍＨＩ 断片をＢａｍＨＩＳＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで切断したビープルースクリプト（ｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（ストラタジーン（Ｓｌｒａｊａｇｅｎｅ）製）にクロー ニングし、ｐＷＰ７１を形成した。より大きなＡ９のヒ流領域を有するプラスミ ドを再構築するために、ｐＷＰ７１のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ断片を９０Ｏ ｂｐのｐＷＰ６４のＨｉｎｄＩ　ｌｌ５ＥｃｏＲＩ断片（図６）（ＡｃｃＩ、Ｂ ａｍＨＩで切断されたｐＴｚ　１９中にクローニングされた１４８６ｂｐのＡｃ ｃＩ、ＢｇｌＩＩ断片を有する）と置き換え、ｐｗｐ７２を形成した。

また、ｐＷＰ７１のＥｃｏＲＩＳＨｉｎｄＩ　Ｉ　１断片を１３９７ｂｐのｐｗ ｐ５５のＨｉｎｄＩ　Ｉ　１．ＥｃｏＲＩ断片（図６）（ＸｂａＩで切断された ｐ”ｒｚ１９中にクローニングされた３１４６ｂｐのＸｂａＩ断片を有する）と 置き換え、ｐｗｐ７３を形成した。ｐＷＰ７１、ｐｗｐ　７２及びｐＷＰ７３の ＨｉｎｄｌＩＩ、ＸｂａＩ断片をＨｉｎｄｌｌＩ、ＸｂａＩで切断したｐＢｌｌ ｏｌ、１中にクローニングし、それぞれｐＷＰ７４、ｐｗｐ７５及びｐＷＰ７６ を形成した。このようにして得られたｐＷＰ７４は、３２９ｂｐのＡ９プロモー ター断片（１１０８〜１４３７ｂｐの位置）を有し、ｐｗｐ７５は、９３６ｂｐ のＡ９断片（５０１〜１４３７ｂｐの位置）を有し、ｐｗｐ７６は、１４３７ｂ ｐのＡ９断片（１〜１４３７ｂｐの位置）を有し、すべてがＧＵＳに融合してい る。

次に、すべてのＧＵＳ構築物を、標準的な形質転換技術を用いてニコチアナ　タ バカム（Ｎ、ｊｏｂａｃｕｍ）およびアラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｆｈａｌ ｉａｎａ）中に形質転換した。形質転換された植物を分析することによって、Ｇ ＵＳ活性が朽の組織、特にタペータム細胞に局在していることが示された。ＧＵ Ｓ活性の時間的な調節（ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、実施例 １に記載されたようにＡ３及びＡ９遺伝子で観察された時間的な発現（ｔｅｍｐ ｏｒａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）と一致した。

図１１は、形質転換タバコ植物の朽におけるＡ９−ＧＵＳ融合物の活性を示して いる。ＧＵＳ活性を、胞子形成細胞（ｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ　ｃｅｌｌ）の発 育の時期にちょうどある朽内を蛍光光度計で測定した。ＧＵＳの発現のパターン は、融合物において用いられた上流領域の長さに関わりなく　（量的にも質的に も）同じであった。これらの実験によって、Ａ９プロモーターが、減数分裂をし ている細胞の発育段階で始まり、初期の小胞子の開部の間に終わる期間を通して タペータム細胞内で転写を誘導することが明らかに示される。

実施例３　発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅＮｅ）の構築およ び形質転換植物における杓に特異的なメツセージ（ｍｅｓｓａｇｅ）に対するセ ンス及びアンチセンスＲＮＡの製造におけるこれらの使用 朽に特異的プロモーターな若しくは構成プロモーター（ＣｏｎｓｌＮｕｔｉｖｅ 　ｐｒｏｍｏｌｅｒｌのどちらかを使用して、形質転換植物における朽に特異的 な転写物に相当するセンスまたはアンチセンスＲＮＡの発現を誘導でき、このよ うにして朽の突然変異および雄性不稔を強力に作製する。同様の朽に特異的なプ ロモーターを用いて、朽の機能に好ましくないタンパク質または酵素をエンコー ドする遺伝子の朽に特異的な発現を誘導でき、これによって雄性不稔が作製でき る。

Ｌ２使用に関する、発現カセットの使用、上記実施例において記載された構築を 実施例４及び５において記載する。

ａ）Ａ９プロモーターを用いてセンス及びアンチセンスＲＮＡを発現するための 中間ベクターの構築ｐＷＰ７２（図１０）をＸｂａｌで消化し、再結合すること によって、ポリリンカーのＢａｎＨＩ部位を除去し、ｐＷＰ７８　（図１２）を 形成する。ｐＷＰ７８のＫｐｎＩ。

５ｓｔＩ（Ｓｓｔｌの末端はフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）によってプラントエンド になっている）のＡ９プロモーター断片をＫｐｎ　Ｉ、Ｓｍａ　Ｉで切断したｐ ＪＩＴ６０中に連結し、ｐＷＰ８０　（図１２）を形成する。ｐＪＩＴ６０は、 ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターが２本鎖のＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター（グエ リノウ（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ）　ら、ヌク　アシッズレス（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、）　、１６巻ナンバー２３、ページ１１３８０　（１９８８年））に 置き代わっている以外はｐＪＩＴ３０　（グエリノウ（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ）　 ら、プラント　モルパイオル（ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、１５巻、 ページ１２７〜１３６　（１９９０年））と同じものである。ｐＷＰｓｏの中間 ベクターは、転写物を安定化させる３５Ｓ　ＣａＭＶポリアゾニレ−ジョンシグ ナルを有するピーブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）由来のポリリン カーに融合した９３６ｂｐのＡ９プロモーター断片から構成される。

ｂ）Ａ３プロモーターを用いてセンス及びアンチセンスＲＮＡを発現するための 中間ベクターの構築ｐＪＩＴ６０のＣａＭＶのプロモーターを、ｐＷＰ８７の７ ４５ｂｐのＫｐｎｌＳＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片（図９）をＫｐｎＩＳＨｉｎｄｌ ＩＩで切断したｐＪＩＴ６０中にクローニングすることによって、Ａ３プロモー ターと置き換え、ｐＷＰ８８　（図１２）を形成する。したがって、ｐＷＰ８０ およびｐＷＰ８８は、プロモーター領域および周りの制限酵素部位以外は同じで ある。

ｃ）Ａ９のｃＤＮＡのセンスまたはアンチセンスの配向（。

ｒｉｅｎｊａｔｉｏｎ）に連結したタペータムに特異的なＡ９プロモーターを有 するキメラ遺伝子の構築 朽に特異的なフラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のｃ　ＤＮＡを、ｃＤＮＡ の末端にＥｃｏＲＩリンカ−（ファルマシアエルテイデイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　Ｌｔｄ、）製）を添加することによって、ＥｃｏＲＩで切断したラムダ　ザッ プ　Ｉ　Ｉ　（Ｌａｍｂｄａ　２ａｐ　ＩＩ）　にクローニングした。また、こ れらのリンカ−は、内部にＮｏｔ１部位を何しており、このため、ｃＤＮＡが内 部にＮｏｔ１部位を有していなければ、全ｃＤＮＡをＮｏｔｌ断片として回収で きる。したがって、Ａ９に関するフラッンカ　ナプス（１３，ｎａｐｕｓ）のｃ ＤＮＡは、ＮｏｔＩ断片として回収され、ＮｏｔＩで切断したｐＷＰ８０中ニ両 方の配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）　（センスおよびアンチセンス）でクロー ニングされる。プロモーター、ｃＤＮＡおよびターミネータ−領域を、Ｈｉｎｄ ｌ　ＩＩ、ＸｈｏＩで消化したｐＷＰ８０誘導体から切り出し、５ａｌＩＳＨｉ ｎｄＩＩＩで切断されたｐＢｉｎ１９　（ベヴアン（Ｂｅｖａｎ）　ら、ヌク　 アシッズ　レス（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、２２巻、ページ８７１ １〜８７２１　（１９８４年）中にクローニングする。

ｐＢｉｎ１９誘導体を、フラッシヵ　ナプス（Ｂ、　ｎａｐｕｓ）に形質転換す る。このようにして得られたアンチセンスＡ９のＲＮＡを発現する形質転換植物 は雄性不稔である。

雄性不稔を生じるように構築できる他のキメラ遺伝子は以下の通りであるニー ｉ）アンチセンスＡ９のＲＮＡを発現するような、アラビドプシス　タリアナ（ Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ９遺伝子のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅ ｇｉｏｎ）に連結されたＡ９プロモーター； １ｉ）Ａ９のｃＤＮＡからまたはアラビドプシス　タリアナ（Ａ、１ｈａｌｉａ ｎａ）のＡ９遺伝子からのいずれかの、アンチセンスＡ９の発現を誘導するＡ３ プロモーター；ｉ　ｉ　１）Ａ３のｃＤＮＡまたはアラビドプシス　タリアナ（ Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ３遺伝子のいずれかを用いた、Ａ３に対するアンチ センスＲＮＡを発現するＡ９プロモーター；１ｖ）Ａ３のｃＤＮＡまたはアラビ ドプシス　タリアナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）のＡ３遺伝子のいずれかを用いた 、Ａ３に対するアンチセンスＲＮＡを発現するＡ３プロモーター。

これらのプラスミドもアブラナ科（ｔｈｅ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他の ものに形質転換することによって形質転換植物において雄性不稔が得られる。

実施例４　キメラのへ３−バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅｌ　およびＡ９−バーナ ーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）遺伝子の構築および形質転換植物におけるこれらの発現 八３およびＡ９プロモーターの利用能を示すために、これらを用いてタベータム 細胞におけるＲＮアーゼである、バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）の発現を誘導す る。雄性不稔性植物を作製するだめのバーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）遺伝子の利 用は、ＥＰ−Ａ−０３４４０２９号（プラント　ジエネテイツクシステムズ（Ｐ ｌａｎｔ　Ｇｅｎｅ目ｃ　ｓ７ｓｌｅｍｓ）　）に記載されており、マリアニ（ Ｍａｒｉａｎｉ）　ら、ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）、３４７巻、ページ７３７〜 ７４１で公表されている。

以下のオリゴヌクレオチドブライマーを特定部位の遺伝子増幅（ｐｏｌｙｍｅｒ ａｓｅ　ｃｈａｉｎ　＋ｅａｃ＋１ｏｎ）　（ＰＣＲ）において用いて、プラス ミドｐＴＧ２　（ホロビッツ（Ｈｏｒｏｖ口ｌ）ら・ジェー　モル　パイオル（ Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　、２１６巻、ページ１０３１〜１０４４　（１ ９９０年））からバースター（ｂａｒｓｌａｒｌ　および成熟したバーナーゼ（ ｂａｒｎａｓｅ）生成物をエンコードする断片を得る： ５−　ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧＴ ＴＴＧＡＣＧＧ　３＝　および５−　ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣ Ｃ３”第一のプライマーは、ノ＼−トレイ　アール　ダブル（Ｍａｒｔｌｅｙ　 Ｒ，Ｗ、）のジエー　モル　パイオル（Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　）、２０ ２巻、ページ９１３〜９１５　（１９８８年）における図１のヌクレオチド９５ −２２１ｂｐと相同性を有する。

第二のプライマーは、ｐＴＺ１８Ｕ　（ファルマシア（ＰｈａｒｌＩｌａｃｉａ ）製）のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部位の直ぐ次ぎの配列と相同性がある。バースター （ｂａｒｓｊａｒ）は、活性のあるバーナーが存在しないとクローニングできな いので、この断片上に残ス（バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）のみが形質転換植物 内では発現する）。ＰＣＲ断片をＸｂａｌ、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで消化し、Ｘｂ ａｌ、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで切断したビープルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ）中にクローニングし、ｐＷＰ１２０（図１３ａ）を形成する。

ａ）バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）　ヘのＡ９プロモーターの転写融合（ｔｒａ ｎｓｃｒｉｐ目ｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）ｐＷＰ１２０をＸｂａ　ｌ５Ｈｉ　ｎ ｃ　Ｉ　Ｉで消化し、バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅｌ　／バースター（ｂａｒｓ ｆａｒ）断片をＸｂａｌ−Ｓｍａ　Ｉで切断したｐＷＰ９１中にクローニングし 、Ａ９プロモーターが成熟したバーナーセ瀘ｂａｒｎａｓｅ）配列に転写融合す る（ｔｒａｎｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ　ｆｕｓｅｄ）　ｐＷＰ　１２７　（図 １３ｂ）を形成するＣｐＷＰ９１は、ＸｂａｌとＥｃｏＲＩとの間のポリリンカ ー領域がＳｐｅ　ＩＳＢａｍＨＩ、ＳｍａｉおよびＰｓｔ１部位と置き代わって いる以外はｐＷＰ８０と同じである）。５ａｌＩで切断したｐＢｉｎ１９にｐ” ｖＶＰ１２７のＸｈｏｌ断片を連結することによって、この遺伝子融合物をｐＢ ｉｎ１９に移す。

ｂ）バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）へのＡ９プロモーターおよび遺伝子の転写融 合（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）以下のプライマーをＰＣ Ｒ反応において用いて、Ａ９遺伝子の５−の転写されない全領域を含み、Ａ９遺 伝子の開始メチオニン（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）周辺の 配列をＮｅｏｆ部位に突然変異させたｐＷＰ６４　（図６）からＡ９プロモータ ー断片を得る（第二のプライマーは、ｐ　Ｔ　Ｚ　１．９Ｕヘクター内の配列と 相同性かある）：５−　ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＴＴＡＧＡＴＡ ＣＴＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＴＡＣ３−および５−　ＡＡＴＡＣＧ、ＡＣＴＣＡＣ ＴＡＴＡＧＧ　３−この断片をＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉで切断し、ｐ ＷＰ８０またはｐＷＰ９］中にクローニングし、これらの中間ヘクター内に存在 するＡ９プロモーター断片を置き換える。

この新たな中間ヘクターは、それぞれｐＷＰ　１１２およびｐｗｐ　１１３であ る。

ｐＷＰ１２０をＮｃｏＩ、ＨｉｎｃＩ　Ｉで切断し、／）−ナーゼ（ｂａｒｎａ ｓｅ）　／バースター（ｂａｒｓｌａｒ）断片をＮｅｏＩ。

Ｓｍａ　Ｉて切断したｐｗｐ　１１３中にクローニングし、ｐＷＰ１２８（図１ ３ｂ）を形成する。次に、このキメラ遺伝子をｐＢｉｎ１９の５ａＩＩ部位にＸ ｈｏｌ断片としてクローニングする。

Ｃ）バーナーセ（ｂａｒｎａｓｅ）へのＡ３プロモーターの転写融合（ｊｒａｎ ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）ｐＷＰ１２７をＳａ　ｌ　Ｉ、Ｘｂａ 　Ｉで切断し、ｐＷＰ３８のＳａ　１１．、Ｘｂａ　ＩのＡ３プロモーター断片 中にクローニングすることによって、ｐＷＰ１２７のＡ９プロモーターをへ３プ ロモーターと置き換え、ｐＷＰ１３１．（図１３ｂ）を形成する。このキメラ遺 伝子を、Ｋｐｎｌ、５ａＩＩて切断したｐＢｉｎ１９中にＫｐｎ　Ｉ、Ｘｈｏ　 Ｉ断片として移す。

このｐＢｉｎ１９誘導体プラスミドを、形質転換植物内ツバー＋−ゼ（ｂａｒｎ ａｓｅ）が発現することによって杓のタベータム細胞が分解し、これによって雄 性不稔が完了するニコチアナ　タバカム（Ｎ、ｉｏｂａｃｕｍ）中に形質転換す る。この植物は雌性稔性である。このようにし７て、両方のＡ３およびＡ９プロ モーターは、タペータムに特異的であり、タベータム細胞内の細胞毒性のある物 質の発現を誘導することによって雄性不稔性であるが、他の点では表現型は正常 である形質転換植物を生産するのに適しでいる。これらのプラスミドはまた、ブ ラソシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）、イネ伺インドトウモロコシｆＸｅａ　ｍ ａｙｓ）及びホルデウム　ブアルガＬ／　（Ｈｏｒｄｅｕｍ　Ｖｕｌｇａｒｅ） 等の他の穀物種中にも形ｎ転換でき、これによって形質転換植物における雄性不 稔が得られる。

実施例５　Ａ３及びＡ９プロモーターおよびβ−１，３グルカナーセ遺伝子のキ メラ遺伝子融合物の構築および形質転換植物における発現 ノーザーン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）分析によって決定されたＡ３及びＡ９遺伝子（ 実施例１）およびプロモーター−ＧＵＳ融合物（実施例２）の発現の時間的なパ ターン（ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｐｉｎｅｒｎ）によって、両方のプロモーターとも 、四分子からの小胞子の放出前の朽の発育段階で活性を有することが示される。

このようにして、いずれのプロモーターも、前記したようのと同様に、朽におい てβ−１，３グルカナーゼの未成熟な発現を誘導することによって雄性不稔を得 るのに適している。

ニコチアナ　タバカム（１１，ｔｏｂａｃｕｍ）のβ−１，３グルカナーゼをエ ンコードするｃＤＮＡは、シンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ）　ら（ビーナス（ＰＮＡＳ ）、８５巻、ページ５５４１〜５５４５（１９８８年））およびニール（Ｎｅａ ｌｅｌ　ら（プラント　セル（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ）、２巻、ページ６７３〜 ６８４　（１９９０年））によって報告されている。この酵素は、液胞内に存在 し、これによってＣ−末端配列は細胞内の部位に応答することが指摘される（フ ァン　デン　ブルッケ（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｌｕｃｋｅｌら、ビーナス（ＰＮＡ Ｓ）、８６巻、ページ２６７３〜２６７７　（１９８９年））。ニコチアナ　タ バカム（Ｎ、ｔｏｂａｃｕｍｌのグルカナーゼの配列（シンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ ）　ら、１９８８年、ニール（Ｎｅａｌｅｌ　ら、１９９０年）に相補的な２本 のオリゴヌクレオチドを用いて、さらにニコチアナ　タバカム（Ｎ、ｔｏｂａｃ ｕｍ）のｍＲＮＡからグルカナーゼｃＤＮＡを単離するために特定部位の遺伝子 増幅（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いることに よって、このグルカナーゼについて操作されるｃＤＮＡをクローニングする。第 一のオリゴヌクレオチドは以下の配列を有する： ５−　ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＣＴＣＣＴＡＧ Ｇ　３− このプライマーはグルカナーゼの５′領域（シンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ）　ら、１ ９８９年における７〜２９の位置）と同じ配列の後にＸｂａＩおよびＮｃｏＩ部 位を有する。第二のオリゴヌクレオチドは以下の配列を有する：５−　ＧＧＧＣ ＣＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＣ３′ このプライマーは、ストップコドン（ｓｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ）であるトリヌクレ オチドの後にＳａｃ　Ｉ　１部位および成熟したグルカナーゼのＣ−末端をエン コードする領域（シンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ）　ら、１９８８年における１０１７ 〜９９３の位置）に相補的な配列を有する。したがって、このグルカナーゼを、 中間ベクターｐＷＰ８０およびｐＷＰ８８中に連結するために、両末端の制限酵 素部位を用いてクローニングする。また、Ｃ−末端の標的シグナル（ｔａｒｇｅ ｔｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ）を除去できるように、この酵素を操作する。したがっ て、この酵素は、形質転換植物において発現する際には、液胞に移るのではなく 分泌されると考えられる。グルカナーゼ遺伝子を、Ｘｂａｌ、Ｓａｃ　Ｉ　Ｉで 切断したｐＷＰｓｏ中にＸｂａｌ、Ｓａｃ　Ｉ　Ｉ断片としてクローニングし、 Ａ９プロモーターとグルカナーゼとの間の転写融合物（ｔｔａｎｓｃｒｉｐｌｉ ｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）を形成し、ｐ　ＤＷ８０　Ｐ　Ｒを形成する。ｐＤＷ ８０　Ｐ　ＲのＳａ　Ｉ　Ｉ、Ｘｂａ　ＩのＡ９プロモーター領域をｐ　Ｗ　Ｐ 　８８のＳａ　１１ＳＸｂａ　ＩのＡ３プロモーター領域で置き換えることによ ってｐＤＷ８８ＰＲ（図１４ａ）を形成し、Ａ３−グルカナーゼ転写融合物（ｔ ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）を構築する。グルカナーゼをＮ ｃｏｌＳＳａｃＩＩ断片としてＮｃｏｌ、５ａｃＩＩで切断したｐｗｐ　１１２ 中にクローニングすることによってｐＤＷ１１２ＰＲ（図１４ｂ）を形成し、Ａ ９プロモーターおよびグルカナーゼに関する遺伝子の転写融合物（ｊｒａｎｓｃ ｒｉｐｊｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉ。

ｎ）を作製する。ｐ　ＤＷ８０　Ｐ　ＲおよびｐＤＷ１１２ＰＲにおけるキメラ 遺伝子をＳａ　１１．ＥｃｏＲＶ断片として５ａｌＩ、Ｓｍａ　Ｉで切断したｐ ＢｉｎｌＱ中に移し、さらに、ｐＤＷ８８ＰＨにおけるキメラ遺伝子を５ａｃＩ 、ＥｃｏＲＶ断片として５ａｃＩ、Ｓｍａ　Ｉで切断したｐＢｉｎｌＱ中に移す 。これらのｐＢｉｎ１９誘導体をニコチアナ　タバカム（Ｎ、＋ｏｂａｃ＋＋ｍ ）に形質転換する。小胞子母細胞周辺のカロースは形質転換植物内で未成熟に消 失し、これによって雄性不稔が得られる。これらのプラスミドはまた、フラッシ カ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）、イネ科インドトウモロコシ（ｌｅａ　ｍａｙｓ ）及びホルデウム　ブアルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　Ｖｕ１ｇａ＋ｅｌ　等の他の 穀物種中にも形質転換することによって形質転換植物における雄性不稔が得られ る。

←　０　←　０　ど　− Ｃ１−− ＜＝」 、　０　＾ ？　トビ　ソ　（ Ｆ／Ｇ、３ 出Ｈ’ｒ’、Ｈ，Ｓａ　Ｘ　Ｓｌ−に：！Ｈ５ＨＲ９５ 囮！−−−ヨ＝　９日Ｓ１５ アラビドプシスｆＡ＋ａｂｉｄｏｐｓｉｉ）≦寧ｍｌ！　Ｉ）ＴＺベクター ■■Ｉ■■　Ａ３のコーディング領域ｔＣｏｄｉｎｇ　＋ｓｇｉｏｎ）Ｆ／Ｇ、 ６ アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐ＋ｉ＋）鵬■■■　コーディング領域（ｃｏ ｄｉＢ　ｒｓｇｉｏｎ）Ｌｎ　０　Ｌ、ｍ　Ｎ マ　−〇”ＩＣ”１ Ｆ／Ｇ、９ ０５に′。

□アラビドプシス（ＡＴａｂｔｄｏｐｓｉ＋）震■■■へ３のコープインク領１ 成（＜ｏｄｔＢ　ｒｓｇ＋ＯｎｉＦＩＧ、　７０ 璽■■Ａ３のコープＩンクｇｅｔ或ｔＣｏｄｉＢ　ｔ＝１：＊８３Ｓ　Ｎ−末端 拡張ｆＮ−ｔ！ｒｍｉｎａｌ　ｏＨｒ＋ミｔｏｎ）＝＝＝　成熟したバーナーゼ （ｂａｒｎａｓご）？Ｚｚ　バースター（ｂａｒｓｔａｒ）！！！！　バーナー セ（ｂｉ＋ｎａ＋ｅ）乙ンｚ２　バースター（ｂａｔｌｌｚｔ）二＝＝コ　タベ ータムに特異的なプロモーターＷ■■　ＣａＭＶのポリアデニル化ンクナルｉｋ ｂ　ＤＮＡ配ダリに 関するキー 区：：コ　コーディング（ｃｏｄｉｎｇ）二＝＝＝　プロモーター領域 ■■■−ポリＡシクナル 国１１５！Ｉ審報牛 １＋＋＋＋＋１＋＋、−１−１＋＋＋１ｈＰＣＴ／ＧＢ９１１０２３１７フロン トページの続き （５１）　［ｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＣＩ　２　Ｎ　９１００　 ９３５９−４８（７２）発明者　ボウル、ワイアット イギリス国、レスター　エルイー２２イーピー、スタウトン　ロード　７４．フ ラット　５ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アラビドプシスクリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）の１ １．６若しくは１２．９ｋＤａのタペータムのタンパク質またはアブラナ科（ｆ ａｍｉｌｙＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のものの同様のタンパク質をエンコ ードする遺伝子の発現を自然に誘導するプロモーターからなる組換えまたは単離 ＤＮＡ。 ２．アラビドプシスタリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）の１１．６ｋＤａのタペ ータムのタンパク質と等価である、プラッシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐ ｕｓ）の１０．３ｋＤａのタペータムのタンパク質の発現を誘導するプロモータ ーからなる請求の範囲１に記載のＤＮＡ。 ３．図４に示される配列のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）の５ ′方向にプロモーターを有する、請求の範囲１に記載のＤＮＡ。 ４．図７に示される配列のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）の５ ′方向にプロモーターを有する、請求の範囲１に記載のＤＮＡ。 ５．該プロモーターを、発現すると、植物において雄性不稔が生じるＤＮＡに操 作して連結した、請求の範囲１から４のいずれかに記載のＤＮＡ。 ６．該雄性不稔ＤＮＡが分解酵素をエンコードする、請求の範囲５に記載のＤＮ Ａ。 ７．該分解酵素によって核酸、タンパク質、炭水化物または脂質が分解する、請 求の範囲６に記載のＤＮＡ。 ８．該分解酵素がリボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼである、請 求の範囲７に記載のＤＮＡ。 ９．該分解酵素によって炭水化物が分解する、請求の範囲６に記載のＤＮＡ。 １０．該分解酵素がグルカナーゼである請求の範囲９に記載のＤＮＡ。 １１．グルカナーゼのコード配列との転写融合物（ｔｒａｎｓｃｒｉＰｔｉｏｎ ａｌｆｕｓｉｏｎ）においてシグナル配列を有する請求の範囲１０に記載のＤＮ Ａ。 １２．該分解酵素によってタンパク質が分解する、請求の範囲６に記載のＤＮＡ 。 １３．該タンパク質分解酵素がアクチニジンまたはパパインである、請求の範囲 １２に記載のＤＮＡ。 １４．該雄性不稔ＤＮＡが、植物のタペータム細胞において一般的に発見される ＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡをコードする、請求の範囲５に記載の ＤＮＡ。 １５．該雄性不稔ＤＮＡが、アラビドプシスタリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の１１．６若しくは１２．９ｋＤａのタペータムのタンパク 質またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のものの同 様のタンパク質をエンコードするＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡをコ ードする、請求の範囲１４に記載のＤＮＡ。 １６．アラビドプシスタリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）の １１．６若しくは１２．９ｋＤａのタペータムのタンパク質またはアブラナ科（ ｆａｍｉｌｙＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のものの同様のタンパク質をエン コードする遺伝子において自然に転写されるＤＮＡ鎖の少なくとも一部に対して 相補的である転写可能なＤＮＡ鎖を有するアンチセンス核酸。 １７．転写が構成プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｐｒｏｍｏｔｅｒ） の制御下にある請求の範囲１６に記載のアンチセンス核酸。 １８．転写がタペータムに特異的なプロモーターの制御下にある請求の範囲１６ に記載のアンチセンス核酸。 １９．該雄性不稔ＤＮＡが植物のタペータム細胞において一般的に発見されるＲ ＮＡを切断できるＲＮＡをコードする、請求の範囲５に記載のＤＮＡ。 ２０．該雄性不稔ＤＮＡが、アラビドプシスタリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の１１．６若しくは１２．９ｋＤａのタペータムのタンパク 質またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のものの同 様のタンパク質をエンコードするＲＮＡを切断できるＲＮＡをコードする、請求 の範囲１９に記載のＤＮＡ。 ２１．アラビドプシスタリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）の １１．６若しくは１２．９ｋＤａのタペータムのタンパク質またはアブラナ科（ ｆａｍｉｌｙＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のものの同様のタンパク質をエン コードする遺伝子によってエンコードされるＲＮＡを特異的に切断できるリボザ イムをエンコードするＤＮＡ。このようなリボザイムをエンコードするＤＮＡは 、通常、アブラナ科（ｆａｍｉｌｙＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）のものを雄性不 稔化するのに有用である。 ２２．転写が構成プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｐｒｏｍｏｔｅｒ） の制御下にある請求の範囲２１に記載のリボザイムをエンコードするＤＮＡ。 ２３．転写がタペータムに特異的なプロモーターの制御下にある請求の範囲２１ に記載のリボザイムをエンコードするＤＮＡ。 ２４．アラビドプシスタリアナ（Ａｒａｂｊｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）の １１．６若しくは１２．９ｋＤａのタペータムのタンパク質またはアブラナ科（ ｆａｍｉｌｙＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他のものの同様のタンパク質をエン コードする遺伝子の適当な発現を特異的に破壊することができるＤＮＡ。 ２５．３′転写調節配列からなる請求の範囲１から２４のいずれかに記載のＤＮ Ａ。 ２６．該３′転写調節シグナルがカリフラワーモザイクウィルス（Ｃａｕｌｉｆ ｌｏｗｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）３５Ｓ遺伝子由来である、請求の範囲２５ に記載のＤＮＡ。 ２７．組換体であり、ベクターの形態を有する、請求の範囲１から２６のいずれ かに記載のＤＮＡ。 ２８．該ベクターがクローニングベクターであり、１つまたはそれ以上の選択マ ーカーを有する、請求の範囲２７に記載のＤＮＡ。 ２９．請求の範囲２７または２８に記載のベクターを感染または形質転換した微 生物の宿種細胞。 ３０．ＤＮＡを形質転換された植物が形質転換されない植物と区別できるマーカ ー配列を有する、請求の範囲１から２８のいずれかに記載のＤＮＡ。 ３１．該マーカー配列によって抗生物質若しくは除草剤耐性が得られるまたは該 マーカー配列がグルクロニダーゼをコードする、請求の範囲３０に記載のＤＮＡ 。 ３２．該マーカー配列がタペータムに特異的でない第二のプロモーターの制御下 にある、請求の範囲３１に記載のＤＮＡ。 ３３．該第二のプロモーターがカリフラワーモザイクウィルス（Ｃａｕｌｉｆｌ ｏｗｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子由来である、請求 の範囲３２に記載のＤＮＡ。 ３４．請求の範囲１から２８および３０から３３のいずれかに記載のＤＮＡを有 する植物細胞。 ３５．少なくとも幾つかの細胞が請求の範囲３４に記載されるものである植物ま たは植物の一部。 ３６．請求の範囲３５に記載の植物からの増殖材料。