ES2224106T3 - Metodo para obtener plantas masculinas esteriles. - Google Patents
Metodo para obtener plantas masculinas esteriles.Info
- Publication number
- ES2224106T3 ES2224106T3 ES94917179T ES94917179T ES2224106T3 ES 2224106 T3 ES2224106 T3 ES 2224106T3 ES 94917179 T ES94917179 T ES 94917179T ES 94917179 T ES94917179 T ES 94917179T ES 2224106 T3 ES2224106 T3 ES 2224106T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- plant
- male
- promoter
- sterile
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
UN GEN AISLADO DE LA LIBRERIA CADN DE UNA PLANTA QUE CODIFICA LA PROTEINA MS2 QUE PARTICIPA EN EL DESARROLLO DEL POLEN, DICHO GEN TIENE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA QUE SE MUESTRA EN LA FIG.2 O UN GEN HOMOLOGO. TAMBIEN SE DESCRIBE UN PROMOTOR DEL CITADO GEN QUE TIENE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA QUE SE MUESTRA EN LA FIG.3 O UN PROMOTOR HOMOLOGO. ADEMAS LA INVENCION PRESENTA UN POLINUCLEOTIDO RECOMBINANTE QUE PUEDE UTILIZARSE DE FORMA APROPIADA PARA PRODUCIR PLANTAS ANDROESTERILES, QUE SE COMPONE ESENCIALMENTE DE A) UN GEN INHIBIDOR CAPAZ DE INHIBIR LA EXPRESION DE UN GEN OBJETIVO QUE CODIFIQUE LA PROTEINA MS2 O UNA PROTEINA OBJETIVA ANALOGA, Y B) UN PROMOTOR QUE SEA ACTIVO EN LA ESTRUCTURA DE RECUBRIMIENTO DE LA CITADA PLANTA.
Description
Método para obtener plantas masculinas
estériles.
La invención implica la manipulación genética de
plantas mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante. La
invención describe un método para la obtención de plantas que
exhiben esterilidad masculina en código nuclear, debido a la
expresión de dicho ADN recombinante, así como partes de dichas
plantas que se pueden reproducir de manera sexual, asexual, o
ambas.
La heterosis es el efecto por el que la
descendencia obtenida mediante polinización cruzada muestra mejores
propiedades agronómicas que la descendencia derivada mediante
autopolinización. Estas mejores propiedades tienen como consecuencia
unos mayores beneficios, razón por la cual el desarrollo de semillas
híbridas es uno de los principales objetivos de la industria de las
semillas.
Para obtener semillas híbridas es necesario que
las plantas femeninas no puedan autopolinizarse. Muchas plantas de
cultivo contienen los órganos reproductores femeninos y masculinos
en el mismo individuo, por lo que la autopolinización predomina
sobre la polinización cruzada. Por lo tanto, es necesaria la
introducción de la esterilidad masculina en muchos cultivos para la
producción de semillas híbridas.
En los campos de producción, las plantas
masculinas estériles aceptoras y las plantas masculinas fértiles
donantes se cultivan unas al lado de las otras, y tras la
polinización cruzada se cosecha la semilla híbrida. La semilla
híbrida se recolecta por separado de las semillas no híbridas
formadas en las plantas donantes mediante la destrucción de estas
plantas masculinas fértiles antes de la cosecha. Este enfoque hace
necesaria la discriminación entre plantas fértiles y plantas
estériles, que se puede llevar a cabo mediante la aparición de
diferentes fenotipos. Asimismo, se puede emplear con esta finalidad
un gen marcador genético, tal como un gen que codifica la
resistencia a herbicidas, estrechamente relacionado con el locus de
la esterilidad masculina. La selección de las semillas híbridas
puede conseguirse entonces fumigando con el herbicida, lo que
destruirá las plantas masculinas fértiles. Como alternativa, las
semillas híbridas se pueden seleccionar después de la cosecha
mediante un marcador fenotípico expresado al nivel de semilla.
Hoy en día, en la práctica de la agricultura, las
líneas parentales de plantas masculinas estériles se obtienen
mediante la castración física de las plantas o mediante la
aplicación de mutantes masculinos estériles citoplasmáticos o en
código nuclear.
El desarrollo de plantas masculinas estériles en
código nuclear mediante la aplicación de técnicas de ADN
recombinante ha tenido éxito en nuevos enfoques que salvan muchos de
los inconvenientes mencionados anteriormente.
La Solicitud de Patente Internacional WO92/18625,
MOGEN International N.V., propone métodos para la producción de
plantas masculinas estériles restaurables en términos generales, que
comprende esencialmente la integración de un polinucleótido
recombinante en su genoma, que comprende esencialmente un gen
inhibidor que, con la expresión adecuada en las anteras de la
planta, es capaz de inhibir la expresión de uno o más genes que
codifican una enzima implicada en la síntesis de charcona, o uno de
sus antecesores.
El documento WO93/02197 describe la creación de
plantas masculinas estériles mediante la manipulación de genes
implicados en el desarrollo del polen. Se describe un gen al que se
alude como el gen A6. La proteína codificada por el gen A6 de B.
napus tiene 474 aminoácidos y el gen A6 equivalente en A.
thaliana codifica una proteína de 479 aminoácidos.
Gen antisentido: una secuencia de nucleótidos que
posee una homología superior al 50%, preferentemente superior al 80%
con el gen objetivo como se define en el presente documento, y
vinculada a un promotor en orientación 3' a 5' con respecto al gen
objetivo y que se pueda expresar como una molécula de ARN.
Gen o gen sentido: una secuencia de nucleótidos
que se puede expresar como molécula y/o polipéptido de ARN.
Promotor: una secuencia de nucleótidos que dirige
la expresión de un gen (sentido) o un gen antisentido, o secuencias
de nucleótidos derivadas de la misma.
Gen inhibidor: un gen (sentido) o gen
antisentido, cuya expresión conduce a la prevención o inhibición de
la expresión de un gen objetivo como se define en el presente
documento.
\newpage
Gen de reparación: un gen capaz de prevenir o
inhibir de manera suficiente la acción de un gen inhibidor,
reparando así la actividad de un gen objetivo.
Gen objetivo: un gen cuya actividad ha de ser
inhibida por la expresión adecuada de un gen inhibidor como se
define en el presente documento.
La presente invención describe mutante AP de
Arabidopsis thaliana masculina estéril y el aislamiento y el
análisis molecular del gen llamado MS2 (Fig. 1). La mutación de este
gen es responsable del fenotipo masculino estéril de AP. El otro
único mutante masculino estéril de Arabidopsis thaliana, ms1, está
documentado por Van der Veen y Wirtz (1968). Este mutante se obtuvo
mediante mutagénesis clásica y es el otro único mutante de
esterilidad masculina descrito en la bibliografía que no muestra
efectos pleiotrópicos. No se han documentado más caracterizaciones
moleculares de ms1, por lo que no existe información disponible
sobre la naturaleza del gen de esterilidad masculina.
En consecuencia, la presente invención
proporciona un gen aislado del banco de ADNc de una planta que
codifica una proteína indicada como MS2 que está implicada en el
desarrollo del polen, estando caracterizado dicho gen por la
secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 como se muestra en la Fig.
2.
Además, la invención proporciona un promotor del
gen MS2 aislado del ADN cromosómico de una planta, teniendo dicho
promotor la secuencia de nucleótidos que se muestra en la Fig.
3.
Además, la invención proporciona un
polinucleótido recombinante para su uso en la obtención de plantas
masculinas estériles, que comprende:
- a)
- un gen sentido MS2 o un gen antisentido MS2 capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo, con lo cual el gen MS2 posee la secuencia mostrada en SEQ. ID. NO: 1, cuyo gen objetivo está presente en la planta y se caracteriza por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 como se muestra en la Fig. 2 o una codificación de la secuencia de nucleótidos para el mismo producto de proteína como la codificada mediante SEQ ID NO:1 y
- b)
- un promotor que es activo en el tapetum de dicha planta, vinculado de manera operable a dicho gen sentido MS2 o gen antisentido MS2 para conseguir la expresión del mismo en el tapetum de dicha planta.
En una realización preferida según la invención,
el promotor que es activo en el tapetum de una planta comprende el
promotor del gen MS2, teniendo dicho promotor la secuencia que se
muestra en la Fig. 3.
La presente invención proporciona también un
método para obtener una planta masculina estéril, que comprende los
pasos de:
- a)
- transferir un polinucleótido recombinante de acuerdo con la invención a células de una planta masculina fértil;
- b)
- generar plantas totalmente nuevas a partir de células que hayan incorporado dicho polinucleótido recombinante; y
- c)
- seleccionar una planta que sea masculina estéril.
Todavía otra realización de la invención es un
genoma de planta recombinante, que lleve incorporado un
polinucleótido recombinante de acuerdo con la invención.
En aspectos adicionales, la invención proporciona
una planta masculina estéril que comprende dicho genoma de planta
recombinante; una célula, un fruto, una semilla o descendencia de
dicha planta masculina estéril que comprenda en su genoma dicho
polinucleótido recombinante; una semilla autógama de dicha planta
masculina estéril que comprenda en su genoma dicho polinucleótido
recombinante; una planta masculina estéril homocigótica que se pueda
obtener a partir de dicha semilla autógama y que comprenda en su
genoma dicho polinucleótido recombinante.
Todavía en otra realización preferida de la
invención, se proporciona un método para una producción rentable de
semillas híbridas, debido al empleo de cantidades elevadas de
plantas masculinas estériles, que se han obtenido cruzando una
planta masculina estéril homocigótica de la variedad deseada con una
planta masculina fértil de la misma variedad.
La invención también abarca semillas (híbridas),
obtenidas mediante el cruce o la autopolinización de cualquiera de
las plantas de acuerdo con la invención.
Otras realizaciones preferidas de la invención
son las plasmidios pMS2 y pMS2as (véase la figura 6).
Figura 1: Análisis Southern de la descendencia de
un cruzamiento entre el mutante AP de Arabidopsis thaliana
masculina estéril y el ecotipo Landsberg erecta de
Arabidopsis thaliana masculina fértil.
Figura 2: La secuencia de nucleótidos del ARNm de
MS2.
Figura 3: La secuencia de nucleótidos del
promotor del gen MS2.
Figura 4a: Análisis Northern de la expresión del
gen MS2 en diferentes órganos de Arabidopsis thaliana.
Figura 4b: Análisis Northern de la expresión del
gen MS2 en diferentes órganos de Raphanus satirus
(rábano).
Figura 5: Análisis Southern de la presencia de
homólogos de MS2 en rábano y planta de colza.
Figura 6: Una representación gráfica de los
diferentes pasos de clonación para obtener los constituyentes
quiméricos de MS2 sentido y antisentido y los plasmidios pMS2 y
pMS2as.
El sistema de elementos transponibles del
potenciador-inhibidor del maíz
(En-I) (Peterson, 1953), también conocido como
Supresor-Mutador (Spm) (McClintock, 1954), se ha
empleado para el marcaje de una serie de genes con la ayuda de un
transposón en el maíz y se demostró que se transponen cuando se
introducen mediante la transformación en una especie de planta
heteróloga (Masson y Federoff, 1987; Pereira y Saedler, 1989; Frey
et al., 1989). Los autores de la invención construyeron un
vector de transformación que contenía tres unidades, a seber: a) una
fuente inmóvil de transposasa En (Masson y Federoff, 1987),
controlada el fuerte promotor del Virus del Mosaico de la Coliflor
35S; b) un elemento I/móvil como mutágeno de inserción
(Schwartz-Sommer et al., 1985); c) un gen de
fosfotransferasa de higromicina (Van den Elzen et al., 1985)
que confiere resistencia al antibiótico higromicina. Esta
construcción de vectores de "En-I de dos elementos
en cis" se empleó para la transformación de Arabidopsis
thaliana por mediación de Agrobacterium tumafeciens
(Valvekens, 1988). Una planta masculina estéril se encontró entre la
descendencia de tercera generación (T3) de un transformante primario
(T1) sucesivamente autofertilizado con elementos I frecuentemente
transpositores. La planta se codificó como AP (Ausencia de Polen).
Puesto que la mutación implicada puede complementarse con ms1, el
otro único mutante masculino estéril sin efectos pleiotrópicos
descritos en Arabidopsis (Van der Veen y Wirts, 1968), los
autores de la invención llamaron a este nuevo mutante ms2. El
análisis de segregación del fenotipo masculino estéril y el elemento
I transponible se realizó de la siguiente manera. Se realizó una
transferencia Southern del ADN de la descendencia de F2 a partir de
un cruzamiento entre AP x Landsberg erecta y la hibridación con una
sonda específica del elemento I (figura 1). El ADN se digirió con
HindIII, que no corta el interior del elemento I. Esta descendencia
F2 carecía de genes de En de transposasa y, por lo tanto, todos los
fragmentos detectados indican insertos estables de elementos I. Un
elemento I de 6,6 kb que contiene el fragmento (\sqbullet), es
homocigótico sólo en plantas que muestren un fenotipo masculino
estéril (me). La planta F2 3-1 (*) sólo posee este
elemento I ms2 acompañante y, por lo tanto, se empleó para el
aislamiento de ADN flanqueador del transposón por Reacción Inversa
en Cadena de la Polimerasa (RICP) (Masson y Federoff, 1989; Ochman
et al., 1988). El fragmento de RICP se clonó, secuenció y
utilizó como una sonda para aislar clones de un ADNc específico de
la flor (Weigel et al., 1992) así como un banco de genomas
lambda de Arabidopsis.
Se secuenció en cadena doble el clon de ADNc (el
mayor de 3 aislados) empleando el kit de secuenciación Taq Dye Deoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) y un
secuenciador automatizado de ADN (Applied Biosystems).
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
previstos del ADNc de MS2 se muestran en la figura 2. El análisis de
las secuencias se realizó empleando el paquete de software de
Genetics Computer Group (GCG) (Devereux et al., 1984). Los
nucleótidos se numeran empezando por la primera posición del
triplete de iniciación ATG. Un codón sin sentido hacia arriba (-36)
indica el inicio de la traducción. La secuencia de señales de
poliadenilación (posición 1967 subrayada) precede a la cola de
poli(A). La posición de la inserción del elemento I (AAA) en
la posición 1800 está subrayada. Los últimos tres aminoácidos
(Gly-Arg-Gly) contienen una señal
diana que detecta supuestos microcuerpos C-terminal
(CMTS) sugiriendo un papel de esta parte en la proteína que está
ausente en alelos masculinos estériles mutantes debido a improntas
de escisión que provocan desplazamientos. Las búsquedas en bases de
datos (PASTA/BLAST) revelaron una homología con una secuencia de ADN
(EMBL libera 33,0, 12/92) situada más arriba del gen rrn26 de
ARN ribosomal de mitocondrias de trigo 26S. La región de homología
en el ADNc de MS2 (1040-1203) está subrayada
y muestra el 77,6% de identidad con la secuencia de nucleótidos de
las mitocondrias del trigo. Esta región está situada a unos 2 kb/p
más arriba del gen rrn26 en la posición
650-814 de la secuencia publicada (Spencer et
al., 1992). No se ha atribuido ninguna función a este segmento
de ADN mitocondrial, lo que revela un marco de lectura abierto cuyos
aminoácidos previstos muestran el 81,7% de identidad con la proteína
MS2 (55 aminoácidos). La homología en el segmento de ADN
mitocondrial no se extiende más allá de esta región, pero está
flanqueado con precisión con fronteras de intrones y exones.
La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos
del promotor del gen MS2. Dicha secuencia se obtiene a partir
de clon genómico de A. Thaliana ecotipo Landsberg erecta del
gen MS2. La caja TATA del gen MS2 se muestra subrayada
(posición 835) y el extremo 5' de la secuencia de ADNc de MS2
está marcada con un asterisco (posición 957). Un único sitio de
restricción AseI (ATTAAT) en la posición 953 permite la clonación
del promotor para construcciones adicionales de plasmidios
descritas.
Los análisis Northern de la expresión del gen MS2
en diferentes órganos de Arabidopsis thaliana mostraron que
el ARNm de MS2 sólo se podía detectar en flores y silicuas, pero no
en plántulas ni en tejido de hojas o de tallos (véase la figura
4a).
Como se muestra en la Figura 4b el ARN de MS2
también se podía detectar en capullos de rábano. Mediante el
análisis del borrón Southern los autores de la invención han
confirmado que los genes homólogos MS2 están presentes en el rábano,
pero también en la planta de colza (Fig. 5), lo cual indica que la
esterilidad masculina se puede inducir en la planta de colza
mediante una expresión de MS2 sentido o MS2 antisentido.
Un gen MS2 sentido o antisentido de
Arabidopsis thaliana o su equivalente homólogo de otras
especies se sitúa bajo el control del promotor de MS2, cuya
secuencia de ADN se muestra en la figura 3, y estas construcciones
pueden emplearse para la transformación de plantas de cultivo
fértiles. Tras la selección de plantas transformadas, que expresan
la construcción, y después de que se permita que las plantas
florezcan, se pueden seleccionar las plantas transgénicas que
muestren un desarrollo perturbado del polen.
El esquema de la Fig. 6 muestra los pasos del
procedimiento para preparar las construcciones, sentido endógenos y
antisentido anteriores. Un vector binario (origen pBIN19), que
contiene un gen NPT II quimérico que confiera resistencia a la
kanamicina a las células de las plantas, con sitios de restricción
únicos SalI (S) y EcoRI (R), sirve como unidad de vector básico. El
promotor del gen MS2 y la secuencia de señal de adición de
terminador (term) de poli (A) CaMV 35S se clonan después del
tratamiento con la polimerasa Klenow (Klen). El fragmento de ADNc de
MS2 se vuelve romo (con polimerasa Klenow) y se clona en el sitio de
restricción SmaI en dos orientaciones respecto del promotor de MS2
(prom). Ello resulta en los dos plasmidios designados pHS2 (sentido)
y pHS2as (antisentido). Otras abreviaturas empleadas: BD = borde
derecho de T-ADN; BI = borde izquierdo de
T-ADN; 5' y 3' se refieren a los extremos de ADNc
(la cadena codificadora) definida por sitios de restricción únicos
del clon de ADNc.
En general, las plantas masculinas estériles en
código nuclear pueden, por tanto, obtenerse y utilizarse para la
producción de semillas híbridas. Las plantas de una variedad
seleccionada han de ser transformadas genéticamente introduciendo en
las células de dicha planta uno o más polinucleótidos recombinantes,
que comprendan esencialmente uno o más genes inhibidores, que,
mediante una expresión adecuada en la planta, sean capaces de
inhibir la expresión de un gen MS2.
La inhibición de la expresión del gen MS2 dará
como resultado plantas masculinas estériles. Ello puede conseguirse
mediante la expresión adecuada de un gen inhibidor dirigido contra
ese gen objetivo. Los genes inhibidores pueden seleccionarse
adecuadamente de una variedad de alternativas, incluidos genes o
partes de estos genes (sintéticos) homólogos o heterólogos (por
ejemplo, obtenidos a partir de una fuente diferente), sentido y
antisentido con una longitud y homología adecuadas para una
inhibición apropiada, como se ilustra en la Solicitud de Patente
Internacional WO92/18625, MOGEN International NV y la Solicitud de
Patente Internacional WO90/11682, DNA Plant Technology Inc.
Preferentemente el gen inhibidor se expresa en el
tapetum de acuerdo con la presente invención. Esto se puede lograr
fusionando el gen inhibidor bajo el control del promotor derivado
del gen MS2 (véase la figura 4) de Arabidopsis o su
equivalente heterólogo (es decir, obtenido de otra fuente).
La transferencia de polinucleótidos recombinantes
a plantas o partes de la misma se puede conseguir mediante numerosas
técnicas. Algunas de ellas se enumeran aquí como ejemplo y
comprenden la transformación de protoplastos empleando el método de
calcio/polietilenglicol (Krens et al., 1982; Negrutiu et
al., 1987), electroporación (Shillito et al., 1985),
microinyección (Crossway et al., 1986), bombardeo de
partículas (cubiertas de ADN o ARN) (Klein et al., 1987),
infección con virus y similares, transferencia natural de ADN
mediante especies de Agrobacterium, preferentemente mediante el uso
del llamado sistema de vector binario (Bevan et al.,
1984).
Tras la identificación de material vegetal
transformado, plantas completas se regeneran utilizando protocolos
bien conocidos, descritos en la bibliografía (véase por ejemplo,
Horsch et al., 1985). No existe ninguna restricción en cuanto
al uso de partes de la planta.
Después de que se hayan obtenido plantas
transformadas, éstas se pueden evaluar en cuanto a la presencia del
rasgo deseado y/o el grado en que se expresan dichos rasgos. Una
primera evaluación puede incluir el nivel de expresión del gen
inhibidor y la medida en que las plantas transgénicas sean
masculinas estériles. Posteriormente, se pueden seleccionar plantas
transgénicas que muestren una herencia estable y/o predecible del
rasgo masculino estéril, y similares. A continuación, las plantas
masculinas estériles (heterocigóticas) pueden emplearse directamente
para la producción de semillas híbridas o, alternativamente, se
pueden autopolinizar con polen rescatado con el fin de obtener
plantas masculinas estériles homocigóticas. Claramente, la ventaja
de tener unas pocas plantas masculinas estériles homocigóticas
permite que se adquieran rápidamente grandes cantidades de semillas
masculinas estériles heterocigóticas que pueden utilizarse
directamente para la producción a gran escala de semillas
híbridas.
La presente invención se puede aplicar a
cualquier planta capaz de autopolinizarse, para la cual la
producción de semillas híbridas es de interés comercial.
La invención también proporciona un método para
obtener plantas masculinas estériles homocigóticas. Éste puede
llevarse a cabo autopolinizando las plantas masculinas estériles de
acuerdo con la invención. El desarrollo de polen de estas plantas
puede rescatarse superando la inhibición de la síntesis in
vivo de proteínas de MS2. La inhibición de la expresión del gen
MS2 puede sortearse permitiendo la producción in vivo
(temporal) de proteína de MS2 en el tapetum de la planta. Esto se
puede conseguir introduciendo, además del gen inhibidor, un gen
reparador bajo el control de un promotor inducible. En esta
configuración, la expresión del gen reparador puede controlarse de
manera externa añadiendo un inductor apropiado. Preferentemente,
dicho gen reparador incluye un gen que contiene al menos parte del
gen MS2, que es capaz, tras la expresión, de inhibir el efecto de la
expresión del gen MS2 antisentido. Alternativamente, se pueden
emplear otros enfoques para inhibir la expresión de un gen inhibidor
como se describe en la Solicitud de Patente Internacional
WO92/18625, MOGEN International N.V.
Si se realizan cultivos híbridos por su semilla o
fruto, se necesita la restauración inducible de la fertilidad. La
esterilidad masculina se debe entonces eliminar para permitir la
polinización y la cosecha de la semilla o el fruto. La reparación de
la fertilidad masculina puede invocarse administrando un inductor al
cultivo en el campo, lo que provoca una expresión suficientemente
alta del gen reparador para neutralizar la inhibición del gen MS2
por parte del gen inhibidor.
Métodos anteriores para proporcionar plantas
masculinas estériles nucleares implican la expresión de genes que
codifican productos que son tóxicos para las células somáticas,
tales como ADNasas, ARNasas, proteasas o una de las enzimas
implicadas en la ruta de la biosíntesis de chalcona. La chalcona es
un componente clave en la ruta de biosíntesis de flavonoides. Los
flavonoides son metabolitos secundarios conocidos por poseer una
función clave en la pigmentación de las flores y los frutos. Además,
al parecer, los flavonoides están implicados en la defensa contra
los fitopatógenos (Lamb et al., 1989), la protección contra
la luz UV (Schmelzer et al., 1988) y la inducción de la
nodulación (Long et al., 1989). Los flavonoides también se
han visto implicados en la regulación del transporte de auxina
(Jacobs y Rubery, 1988) y la resistencia a los insectos (Hedin y
Waage, 1986).
Como consecuencia de las propiedades mencionadas
anteriormente de los productos tóxicos o el papel del producto del
gen inhibido en la planta, sólo se necesita un desarrollo estricto y
una expresión de especificidad del tejido limitada a las anteras. El
presente método no necesariamente requiere dicho desarrollo estricto
ni dicha expresión de especificidad del tejido.
Las plantas masculinas estériles de acuerdo con
la invención son extremadamente estériles y su aspecto es
completamente femenino fértil.
La presente invención también proporciona métodos
para obtener plantas masculinas estériles homocigóticas. Sólo se
necesitan unas cuantas que puedan multiplicarse in vitro
mediante técnicas bien establecidas. La planta aceptora masculina
estéril homocigótica se poliniza mediante polinización cruzada con
la planta donante masculina fértil y la semilla masculina estéril
heterocigótica empleada para la producción de cultivos híbridos. De
las semillas híbridas producidas, el 50% serán masculinas estériles
y el 50% masculinas fértiles. Por si esta relación no fuera
suficiente para la obtención de un producto comercial de gran
rendimiento (es decir, semillas o frutos) mediante autopolinización,
esta relación puede mejorarse con la restauración parcial de la
esterilidad masculina mediante la administración de un inductor para
activar la expresión del gen restaurador.
El plasmidio cwEnN::I empleado para la
transformación de Agrobacterium tumefaciens se construyó con
el objetivo de diseñar un ensayo de escisión fenotípica utilizando
la resistencia a la kanamicina, para la familia de transposones
En-I, que puede emplearse en una serie de
especies vegetales. El vector binario pGDW3.1 (Wing et al.,
1989) era la fuente del gen promotor higromicina fosfotransferasa
(PHT) de nopalina sintasa (nos) quimérica empleado para la selección
durante la transformación. Primero se insertó un gen de neomicina
fosfotransferasa II (NPTII) quimérica en pGDW3.1, que es similar al
gen de NPTI empleado por Baker et al. (1987) excepto que se
introdujo un enlazador ClaI en 5' al único BamHI presente en el
conductor no traducido entre el promotor T_{R}I' y la región
codogénica NPTII. Esto introdujo un inicio de la traducción
(GCGATGG) en 5' con respecto al sitio BamHI. Además, el incio
de la traducción de NPTII se eliminó intercambiando las secuencias
de genes NPTII del plasmidio pBCK1 (Kaulen et al., 1984) más
abajo del sitio BamHI. Ello generó el plasmidio pBHN en el que un
inicio de traducción está presente más arriba en la cadena del único
sitio BamHI en el cual un elemento I, I-6078
de 2,2 kb con ADN flanqueante de 56 pb (Pereira y Saedler, 1989), se
insertó para generar el plasmidio pBHNI. En-1
(Pereira et al., 1986) fue digerido con BssHII, lo cual corta
en las posiciones 399 y 8041, que se han vuelto romas con el
fragmento de Klenow de ADN polimerasa I y fue clonado entre la
casete del promotor 35S-terminador del virus del
mosaico de la coliflor (CaMV), originado a partir de pD51 (Pietrzak
et al., 1986) en pBR322. Este En de ala de punta recortada
(cwEN) bajo el control del promotor 35S fue clonado a continuación
en el vector binario pBHNI para producir el plasmidio cwEn::I
(Figura 1), que fue trasladado a la cadena de Agrobacterium
pGV3101 (pMP90RK) (Koncz y Schell, 1986).
Para la transformación de una planta, los
explantes de la raíz del ecotipo Landsberg erecta fueron
infectados con la cepa de Agrobacterium que contiene la
construcción del vector binario, según un método descrito por
Valvekens et al. (1988). Los callos transformados se
seleccionaron en un medio que contenía higromicina a 20 mg.l^{-1}.
Los brotes emergentes T_{1} se cultivaron sin selección y se
permitió la autopolinización y la producción de semillas in
vitro. La producción de semillas de A. thaliana es muy
pobre in vitro debido a la elevada humedad. Esto se resolvió
levantando un poco la tapadera de los receptáculos. Las condiciones
de cultivo eran de 12 a 16 horas de luz a 22ºC en cámaras de
desarrollo. Las semillas de T_{2} y generaciones posteriores
fueron esterilizadas en tubos Eppendorf mediante un tratamiento con
etanol al 70% (2 min), 50% de lejía comercial (5% de hipoclorito
sódico, 5 min) y cinco lavados posteriores con agua estéril. Las
semillas se sembraron o bien húmedas o bien secas en un medio GM
(Valvekens et al., 1988) o en MS de fuerza media (Murashige y
Skoog, 1962) solidificado con un 0,8% de agar purificado. Para
determinar el número de loci de T-ADN, las semillas
se sembraron mayoritariamente en MS de fuerza media con
20mg.l^{-1} de higromicina. La no utilización de azúcar en el
medio permitió la esterilización con etanol al 70% durante 2 min y
sólo dos o tres lavados con agua estéril. La segregación de la
resistencia a antibióticos se anotó 5 a 10 días después de la
germinación. Si era necesario, las plántulas se transferían a suelo
(compost:vermiculita:arena = 4:1:1) y se cultivaban en un
invernadero de clima controlado a 20ºC con luz adicional (16 h).
Para evitar la polinización cruzada y la proliferación de semillas,
las plantas se cultivaban en contenedores Aracon (Beta Developments,
Gante, Bélgica). Para los ensayos de escisión fenotípica, las
semillas se hicieron germinar en un medio GM que contenía 100
mg.l^{-1} de sulfato de kanamicina. La resistencia, la variegación
o la sensibilidad se anotó 5 a 10 días después de la germinación.
Las plántulas abigarradas y sensibles se transferían a un GM sin
antibióticos para rescatarlas antes de transferirlas al suelo.
El número de ploidías se determinó contando los
cloroplastos de las células guardianas estomáticas de la epidermis
inferior de las hojas jóvenes como describe Detrez et al.
(1989). Se tuvieron en cuenta al menos 25 estomas de diferentes
plantas T_{2} y T_{3}.
El ADN genómico se aisló a partir de hojas
jóvenes de plantas individuales cultivadas en invernadero tanto para
el análisis PCR como el de Southern. El método que utilizaron los
autores de la invención fue una versión modificada del descrito por
Dellaporta et al. (1983). Se trituraron 100 mg de tejido de
hoja congelado con N_{2} líquido en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y
se mezclaron con 300 \mul de tampón de extracción
(Tris-HCl 100 mM pH 8,0, EDTA 50 mM pH 8,0, NaCl 500
mM, \beta-mercapto-etanol 10 mM) y
25 \mul del SDS al 20%. La mezcla se incubó a 65ºC durante 10 min,
después de lo cual se añadieron 115 \mul de acetato potásico 5 M,
se mezcló y se guardó en hielo durante al menos 20 min y, a
continuación, se centrifugó. El ADN se precipitó a partir del
sobrenadante resultante añadiendo de 0,6 a 2 volúmenes de
isopropanol y, si era necesario, se mantenía a -20ºC durante unas
cuantas horas. El sedimento se volvió a disolver en 200 \mul de TE
(Tris-HCI 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0) se
centrifugó durante 5 min para eliminar restos, se transfirió a un
nuevo tubo y se añadió RNasa A a 20 \mug.ml^{-1}. La mezcla de
la reacción se incubó a 37ºC durante 15 min cuando se añadió
Proteinasa K hasta 50 \mug.ml^{-1}. Después de otros 15 min a
37ºC, se extrajo la solución con fenol-cloroformo.
El ADN se precipitó de nuevo añadiendo 0,25 volúmenes de acetato
amónico 10 M y 2 volúmenes de etanol al 100%. El sedimento se
disolvió en 20 \mul de TE. Este proceso se adaptó a escala tanto
hacia arriba como hacia abajo si se empleaban diferentes cantidades
de tejido de hoja. En general, producía de aproximadamente 1 a 2
\mug de ADN por 100 mg de tejido de hoja.
La subclonación de ADN, los análisis de
restricción y la secuenciación se realizaron empleando
procedimientos estándares bien conocidos por expertos en la técnica,
véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1982.
El análisis inverso de PCR para amplificar el ADN
flanqueante de transposones de transformantes se realizó con 100 a
200 ng de ADN genómico. Para la reacción se emplearon 15 pmol de
cada cebador, 0,1 mM de dNTPs (cantidades iguales de cada dNTP) y
0,1 unidad de ADN-polimerasa SuperTaq (HT
Biotechnology Ltd., Cambridge, Inglaterra) en un volumen total de 50
\mul de tampón de reacción como se proporciona junto con la enzima
(Tris-HCI 10 mM pH 9,0, KCl 50 mM, 0,01% de gelatina
(p/v), MgCl_{2} 1,5 mM y Tritón X-100 al 0,1%). Se
realizaron 30 ciclos de desnaturalización (94ºC, 30 s), la
hibridación de ácidos nucleicos (61ºC, 60 seg.) y la extensión
(72ºC, 60 s). Una décima parte del volumen de producto PCR se
comprobó en gel agarosa y si se consideró de interés, se clonó en
Bluescript SK^{+} como un fragmento de extremos romos después del
tratamiento con Klenow y la elución con gel. El análisis de la
secuencia se realizó en plasmidio de super-hélice de
doble cadena empleando un secuenciador automatizado (Applied
Biosystems). Inicialmente se secuenciaba una cadena y, si era
necesario, las dos cadenas.
El ADN genómico se digirió con EcoRI y BgIII y de
0,5 a 1 \mug se separaron en un gel de agarosa al 0,8% en tampón
de dución de Tris-acetato. Tras la electroforesis,
el ADN se transfirió con álcali a una membrana de Gene Screen Plus
mediante transferencia al vacío. Se realizó la prehibridación y la
hibridación de los borrones siguiendo el proceso recomendado por el
fabricante de la membrana. Las sondas (Figura 1) fueron de
fragmentos de ADN al azar marcados con [^{32}P] de calidad
excelente. Se empleó un fragmento de 0,27 kb que contenía el borde
izquierdo de En (hasta un sitio de restricción SalI) para detectar
elementos I. La sonda del borde derecho del T-ADN
era un fragmento de 1,1 kb que contenía el gen HPT. Se empleó un
fragmento de 1,8 kb que contenía el gen NPTII completo más
terminador de octopina sintasa (ocs) para detectar fragmentos de la
escisión. En el experimento que se muestra en la figura 5 se empleó
ADNc de MS2 como sonda. Tras la hibridación, las membranas se
lavaron dos veces con 2xSSC, SDS al un 1% a 65ºC durante 30 minutos
y se les realizó una autorradiografía en películas de rayos X (Fuji
o Kodak) a -80ºC utilizando pantallas intensificadoras.
Se recogió material vegetal, se congeló en
N_{2} líquido y se trituró empleando mortero y mano de almirez. Se
añadieron volúmenes iguales de tampón de extracción
(Tris-HCI 0,1 M, pH 9,0, SDS al 1%, LiCl 0,1 M, EDTA
0,01 M) y fenol (4 ml de cada) y la mezcla se incubó a 60ºC. Tras la
centrifugación a 4ºC (10 min, 3000 rpm) y la capa acuosa se extrajo
con 5 ml de cloroformo, se recogió y, tras añadir 1/3 del volumen de
LiCl 8 M, se permitió al ARN que se precipitara durante una noche a
4ºC. El precipitado de ARN se recogió mediante centrifugación a 4ºC
(10 min, 12000 rpm) y se lavó dos veces con etanol al 70%. El
sedimento secado se disolvió finalmente en tampón fosfato 0,06 M pH
6,5.
5 \mul de ARN (2 \mug/ul) se desnaturalizan
en 5 \mul de glioxal y 10 \mul de DMSO durante 60 min a 50ºC y
se separan según longitud en gel agarosa al 1% (3,5 h, 40 V) en
tampón fosfato 15 mM. Posteriormente, el ARN se transfirió a una
membrana Hybond N de acuerdo con el fabricante (Amersham). Se
realiza la prehibridación y la hibridación del borrón siguiendo el
proceso recomendado por el fabricante de la membrana. La sonda (ADNc
de MS2) al azar estaba marcada con [^{32}P] de primera calidad.
Tras la hibridación, las membranas se lavaron dos veces con 2xSSC,
SDS al 1% a 65ºC durante 30 minutos y se les realizó una
autorradiografía en películas de rayos X (Fuji o Kodak) a -80ºC
utilizando pantallas intensificadoras.
Baker, B., Coupland, G.,
Fedoroff, N., Starlinger, P. y Schell, J.
(1987) Phenotypic assay for excision of the maize controlling
element Ac in tobacco. EMBO J. 6,
1547-1554.
Bevan, M.A. (1984) Binary
Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucl Acids
Res. 12, 8711-8712.
Crossway, A., Oakes, J.V.,
Irvine, J.M., Ward, B., Knauf, V.C.,
Shewmaker, C.K. (1986) Integration of foreign DNA
following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol.
Gen. Genet. 202, 179-185.
Dellaporta, S.L., Woods, J., y
Hicks, J.B. (1983) A plant DNA minipreparation version
II. Plant Mol. Biol. Rep. 4, 19-21.
Detrez, C. Sangwan, R.S. y
Sangwan-Noreel, B.S. (1989) Phenotypic
and karyotypic status of Beta vulgaris plants regenerated from
direct organogenesis in petiole culture. Theor. Appl. Genet.
77, 462-468.
Devereux, J., Haeberli, P. y
Smithies, O. (1992) Nucleic Acids Res. 12,
387-395.
Frey, M., Travantzis, S.M. y
Saedler, H. (1989) Mol. Gen. Genet. 217,
172-177.
Hedin, P.A., Waage, S.K.
(1986) Roles of flavonoids in plant resistance to insects, en
Progress in Clinical and Biological Research. Vol. 213: Plant
Flavonoids in Biology and Medicine. V. Cody, E. Middleton Jr y J.B.
Harborne (Nueva York: Alan R. Liss), pp. 87-100.
Horsch, R.B., Fry, J.E.,
Hoffmann, N.L., Eichholtz, D, Rogers, S.G.,
Fraley, R.T. (1985) A simple and general method for
transferring genes into plants. Science 227,
1229-1231.
Jacobs, M., Schell, J. y
Kreuzaler, F. (1986). Light-induced
expression of the chimeric chalcone synthase-NPTII
gene in tobacco cells, EMBO J, 5, 1-8.
Klein, T.M., Wolf, E.D., Wu,
R., Sanford, J.C. (1987) High-velocity
microprojectiles for delivering expression of chimaeric genes
carried by a novel type of Agrobacterium binary vector.
Mol. Gen. Genet. 204, 383-396.
Krens, F.A., Molendijk, L.,
Wullems, G.J, Schilperoort, R.A. (1982) In
vitro transformation of plant protoplasts with
Ti-plasmid DNA. Nature 296,
72-74.
Lamb, C.J., Lawton, M.A.,
Dron, M., Drixon, R.A. (1989) Signals and
transduction mechanisms for activation of plant defenses against
microbial attack. Cell 56, 215-224.
Long, S. (1989)
Rhizobium-legume nodulation: Life together in the
underground. Cell 56, 203-214.
Masson, P. y Fedoroff, N.
(1989) Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A. 86,
2219-2223.
McClintock, B (1954) Carnegie
Inst. Washington Year Book 53, 254-260.
Negrutiu, I., Mouras, A,
Horth, M., Jackobs, M. (1987) Direct gene
transfer to plants: Present developments and some future
prospectives. Plant Physiol. Biochem. 25,
493-503.
Ochman, H., Gerber, A.S. y
Hartl, D.L. (1988) Genetics 120,
621-623.
Maniatis, T. y Skoog, F.
(1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15,
473-497.
Pereira, A, Cuypers, H.,
Gierl, A., Schwartz-Sommer, Zs.
y Saedler, H. (1986). Molecular analysis of the
En/Spm transposable element system of Zea mays. EMBO
J. 5, 835-841.
Pereira, A. y Saedler, H.
(1989). Transpositional behavior of the maize En/Spm
element in transgenic tobacco. EMBO J. 8,
1315-1321.
Peterson, P.A. (1953) Genetics
38, 682-683.
Pietrzak, M., Shillito, R.D.,
Hohn, T. y Potrykus, I. (1986) Expression in
plants of two biological antibiotic resistance genes after
protoplast transformation with a new plant expression vector.
Nucl. Acids Res. 14, 5857-5868.
Schwartz-Sommer,
Zs., Gierl, A., Berndtgen, R. y Saedler,
H. (1985) EMBO J. 4, 2439-2443.
Schmelzen, E., Jahnen, W.,
Hahlbrock, K. (1988) In situ localization of
light-induced chalcone synthase mRNA, chalcone
synthase and flavonoid endproducts in epidermial cells of parsley
leaves. Proc. Natl. Acad. Sci USA 85,
2989-2993.
Shillito, R.D., Saul, M.V.,
Paszkowski, J., Müller, M., Potrykus, I.
(1985) High frequency direct gene transfer to plants.
Bio/Tech ology 3, 1099-1103.
Spencer, D.F., Scharne, M.N.,
Culthart, M.B. y Gray, M.V. (1992) Plant
Mol. Biol. 20, 347-352.
Valvekens, D., Van Montagu, M. y
Van Lijsebettens, M. (1988) Agrobacterium
tumefaciensis mediated transformation of Arabidopsis
thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 85, 5536-5540.
Van den Elzen, P., Townsend, J.,
Lee, K. y Bedbrook, J. (1985) Plant Mol.
Biol. 5, 299-302.
Van der Veen, J.H. y Wirtz, P.
(1968) Euphirica 17, 371-377.
Weigel, D., Alvarez, J.,
Smyth, D.R., Yanofsky, M.F. y Meyerowitz, E.M.,
E.M. (1992) Cell 69, 843-859.
Wing, D., Koncz, C. y
Schell, J. (1989) Conserved function in Nicotiana
tabacum of a single Drosophila hsp70 promoter heat
shock element when fused to a minimal T-DNA
promoter. Mol. Gen. Genet. 219, 9-16.
Claims (10)
1. Un gen aislado del banco de ADNc de una planta
que codifica una proteína que está implicada en el desarrollo del
polen, caracterizado dicho gen por la secuencia de
nucleótidos SEQ ID NO:1:
2. Un promotor del gen según la reivindicación 1
aislado del ADN cromosómico de una planta, caracterizado
dicho promotor por la secuencia de nucleótidos:
3. Un polinucleótido recombinante para obtener
una planta masculina estéril, que comprende:
- a)
- un gen sentido o un gen antisentido capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo, en que el gen objetivo es un gen como se define en la reivindicación 1, siendo el gen sentido una secuencia de nucleótidos que puede expresarse como molécula y/o polipéptido de ARN, y siendo el gen antisentido una secuencia de nucleótidos con una homología superior al 50% con el gen objetivo y que pueda expresarse como molécula de ARN, y
- b)
- un promotor que es activo en el tapetum de dicha planta, vinculado de manera operable a dicho gen sentido o gen antisentido para conseguir la expresión del mismo en el tapetum de dicha planta.
4. Un polinucleótido recombinante según la
reivindicación 3, en el que el promotor que es activo en el tapetum
de una planta comprende el promotor que tiene la secuencia según se
define en la reivindicación 2.
5. Un método para obtener una planta masculina
estéril, que comprende los pasos de:
- a)
- transferir un polinucleótido recombinante según las reivindicaciones 3 ó 4 a células de una planta masculina fértil,
- b)
- generar plantas totalmente nuevas a partir de células que hayan incorporado dichos polinucleótidos recombinantes, y
- c)
- seleccionar una planta que sea masculina estéril.
6. Un genoma de planta recombinante que incorpora
un polinucleótido recombinante según las reivindicaciones 3 ó 4, con
la condición de que el genoma no sea el genoma de Arabidopsis
thaliana.
7. Una planta masculina estéril que comprende el
genoma de planta recombinante de la reivindicación 6.
8. Una célula, un fruto, una semilla o
descendencia que se pueda derivar de una planta masculina estéril
según la reivindicación 7 y que comprende en su genoma el
polinucleótido recombinante de las reivindicaciones 3 ó 4.
9. Semillas autopolinizadas de una planta
masculina estéril según la reivindicación 7 que comprende en su
genoma el polinucleótido recombinante de las reivindicaciones 3 ó
4.
10. Una planta masculina estéril homocigótica que
se puede obtener a partir de una semilla según la reivindicación 9 y
que comprende en su genoma el polinucleótido recombinante de las
reivindicaciones 3 ó 4.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93201233 | 1993-05-03 | ||
| EP93201233 | 1993-05-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2224106T3 true ES2224106T3 (es) | 2005-03-01 |
Family
ID=8213805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94917179T Expired - Lifetime ES2224106T3 (es) | 1993-05-03 | 1994-05-03 | Metodo para obtener plantas masculinas esteriles. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5932784A (es) |
| EP (1) | EP0698098B1 (es) |
| AT (1) | ATE269407T1 (es) |
| CA (1) | CA2161515A1 (es) |
| DE (1) | DE69433847D1 (es) |
| ES (1) | ES2224106T3 (es) |
| WO (1) | WO1994025593A2 (es) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6297426B1 (en) | 1990-06-12 | 2001-10-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods of mediating female fertility in plants |
| US5824524A (en) * | 1990-06-12 | 1998-10-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating fertility and method of using same |
| US5478369A (en) * | 1990-06-12 | 1995-12-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
| EP0787189B1 (en) * | 1994-10-28 | 2005-06-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
| GB9526218D0 (en) * | 1995-12-21 | 1996-02-21 | Gene Shears Pty Ltd | DNA Sequences |
| CA2168934C (en) * | 1996-02-06 | 2004-11-02 | Laurian S. Robert | A brassica sp. gene promoter highly expressed during tapetum development |
| US7154024B2 (en) | 1997-06-23 | 2006-12-26 | Pioneer Hi-Bred, Inc. | Male tissue-preferred regulatory sequences of Ms45 gene and method of using same |
| US6037523A (en) * | 1997-06-23 | 2000-03-14 | Pioneer Hi-Bred International | Male tissue-preferred regulatory region and method of using same |
| IL137972A0 (en) | 1998-02-20 | 2001-10-31 | Zeneca Ltd | Hybrid seed production |
| CA2449810A1 (en) * | 2001-06-07 | 2002-12-12 | National Research Council Of Canada | Anther-specific taa1 genes encoding fatty acyl co-a reductases, and uses thereof |
| GB0213749D0 (en) * | 2002-06-14 | 2002-07-24 | Tozer Seeds Ltd | Method of producing hybrid seeds and plants |
| EP2128254A4 (en) | 2007-03-28 | 2011-01-19 | Scivax Corp | INHIBITOR OF TRANSPIRATION |
| CN112830963B (zh) * | 2021-03-12 | 2022-05-31 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种调控棉花雄性生殖发育的GhFLA19-D蛋白及其编码基因与应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ227835A (en) * | 1988-02-03 | 1992-09-25 | Paladin Hybrids Inc | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
| ATE294872T1 (de) * | 1989-02-02 | 2005-05-15 | Pioneer Hi Bred Int | Molekulare verfahren zur vermehrung von hybriden saaten |
| US5034323A (en) * | 1989-03-30 | 1991-07-23 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
| GB9028060D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| BR9205894A (pt) * | 1991-04-16 | 1994-09-27 | Mogen Int | Plantas macho-esteril, metodo para obtençao de plantas macho-estéril e ADN recombinante para uso ali. |
| GB9115909D0 (en) * | 1991-07-23 | 1991-09-04 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
-
1994
- 1994-05-03 DE DE69433847T patent/DE69433847D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-03 US US08/545,745 patent/US5932784A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-03 EP EP94917179A patent/EP0698098B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-03 CA CA002161515A patent/CA2161515A1/en not_active Abandoned
- 1994-05-03 ES ES94917179T patent/ES2224106T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-03 WO PCT/NL1994/000096 patent/WO1994025593A2/en active IP Right Grant
- 1994-05-03 AT AT94917179T patent/ATE269407T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1994025593A3 (en) | 1994-12-22 |
| US5932784A (en) | 1999-08-03 |
| WO1994025593A2 (en) | 1994-11-10 |
| DE69433847D1 (de) | 2004-07-22 |
| ATE269407T1 (de) | 2004-07-15 |
| EP0698098B1 (en) | 2004-06-16 |
| EP0698098A1 (en) | 1996-02-28 |
| CA2161515A1 (en) | 1994-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7115798B1 (en) | Methods for regulated expression of triats in plants using multiple site-specific recombination systems | |
| Coppoolse et al. | Cre recombinase expression can result in phenotypic aberrations in plants | |
| Cotsaftis et al. | Transposon-mediated generation of T-DNA-and marker-free rice plants expressing a Bt endotoxin gene | |
| ES2224106T3 (es) | Metodo para obtener plantas masculinas esteriles. | |
| JPH09511909A (ja) | Ｒｐｓ２遺伝子およびその使用 | |
| JPH11500617A (ja) | 雄性不稔植物を得る方法 | |
| JP2014236731A (ja) | コメの生産高の増加方法 | |
| Kopertekh et al. | PVX-Cre-mediated marker gene elimination from transgenic plants | |
| ES2211864T3 (es) | Secuencias de adnc especificas de antera, secuencias de adn genomico y secuencias de adn recombinante. | |
| WO1998000533A2 (en) | Maize promoter sequence for leaf- and stalk-preferred gene expression | |
| WO2009097823A1 (zh) | 植物表皮毛特异表达启动子fif1及其应用 | |
| US5850018A (en) | Expression control sequence for general and effective expression of genes in plants | |
| Hewezi et al. | Antisense expression of a NBS-LRR sequence in sunflower (Helianthus annuus L.) and tobacco (Nicotiana tabacum L.): evidence for a dual role in plant development and fungal resistance | |
| EP0963433A1 (en) | Transgenic plants expressing geminivirus genes | |
| Stanislaus et al. | Genetically engineered self-destruction: an alternative to herbicides for cover crop systems | |
| ES2316481T3 (es) | Sistema de muerte de la celulas vegetales. | |
| WO1997039110A9 (en) | Transgenic plants expressing geminivirus genes | |
| JP4814686B2 (ja) | 雌雄配偶子形成不全植物の作成方法 | |
| WO2001007590A2 (en) | Chimeric genes for plastid expression | |
| Zakharchenko et al. | Enhanced resistance to phytopathogenic bacteria in transgenic tobacco plants with synthetic gene of antimicrobial peptide cecropin P1 | |
| ES2223533T3 (es) | Promotor que permite la expresion de transgenes en toda la planta excepto en la semilla. | |
| ES2372476T3 (es) | Secuencia reguladora de la expresión específica en antera de un gen y su empleo en la producción de plantas androestériles y semillas híbridas. | |
| EP4146811A1 (en) | <smallcaps/>? ? ?ipt7? ? ? ? ?expression offrom <ns1:i>tss</ns1:i>?promoter increases root mass and carbon sequestration | |
| ES2371645T3 (es) | Promotores específicos del polen de rigrás y las construcciones de expresión. | |
| EP1210436A2 (en) | Male sterile plants |