JP4814686B2 - 雌雄配偶子形成不全植物の作成方法 - Google Patents
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Description
(1) 減数分裂期特異的なプロモーターの下流に結合させたバルナーゼ遺伝子と、目的遺伝子を配偶子形成期以外の植物細胞で構成的に発現させるプロモーターの下流に結合させたバルスター遺伝子を植物ゲノム中に導入することを特徴とする、雌雄配偶子形成不全植物の作成方法。
(2) 減数分裂期特異的なプロモーターが、シロイヌナズナDMC1(AtDMC1)遺伝子のプロモーターである、(1)に記載の方法。
(3) 目的遺伝子を配偶子形成期以外の植物細胞で構成的に発現させるプロモーターが、シロイヌナズナアクチン2(ACT2)遺伝子のプロモーターである、(1)に記載の方法。
(4) 減数分裂期特異的なプロモーターの下流に結合させたバルナーゼ遺伝子と、目的遺伝子を配偶子形成期以外の植物細胞で構成的に発現させるプロモーターの下流に結合させたバルスター遺伝子を組み込んだT-DNAを含む、組み換えベクター。
(5) 減数分裂期特異的なプロモーターが、シロイヌナズナDMC1(AtDMC1)遺伝子のプロモーターである、(4)に記載の組み換えベクター。
(6) 目的遺伝子を配偶子形成期以外の植物細胞で構成的に発現させるプロモーターが、シロイヌナズナアクチン2(ACT2)遺伝子のプロモーターである、(4)に記載の組み換えベクター。
(7) (4)〜(6)のいずれかに記載の組み換えベクターを導入した形質転換植物。
(8) 植物が、植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞である、(7)に記載の形質転換植物。
選択マーカー遺伝子の向きのみが互いに異なる形質転換用ベクターpBiStl3およびpBiSt23を、図1に示すようにいくつかのPCR-増幅断片を結合することによって構築した。本実施例において用いたオリゴヌクレオチオドはまとめて後記表1に示す。
1) AtDMCIプロモーターおよびACT2プロモーターをtail-to-tail方向で、それらのSalI部位でライゲートさせ、一つのHindIII-EcoRI断片として切り出し、それぞれpMK1およびpMK2に導入し、pMK1ADおよびpMK2ADを得た。
2) Barnase遺伝子を含むプラスミドを持つ細菌がそのリーキーな発現によって死滅するのを防ぐため、バルスター遺伝子を共発現させた。細菌用のバルスター発現系は、タバコ葉緑体リボゾームRNA遺伝子プロモーター(Prrn)コード配列,スペクチノマイシン耐性遺伝子(aadA),リボゾーム結合部位(RBS)およびバルスターコード配列(Bs)からなる。Prrn:aadA DNA断片はpRV112AG(T. Terachi および T. Shiinaより譲与;Shiina T, Hayashi K, Ishii N, Morikawa K, Toyoshima Y (2000) Chloroplast tubules visualized in transplastomic plants expressing green fluorescent protein. Plant Cell Physiol 41 : 367-371.)からPrrn-F(配列番号27)とaadA-RBS(配列番号28)を用いて増幅させ、RBS-barstar(配列番号29)とBarstar-BH(配列番号30)であらかじめ増幅させたBsに、Prrn-FとBarstar-BHを用いたPCRによって結合させた。この断片をSacIとBamHIで消化したpPROLar.A(pGreen骨格のベクターと細菌細胞内で共存可能である)に挿入した。Prrn:aadA:RBS:Bs断片は、タバコpsbA転写終結配列(TpsbA;TpsbA-F(配列番号31)とTpsbA-R(配列番号32)で増幅し、pT7Blueでクローン化した)とpT7Blueのポリリンカー内のBamHI部位で結合させた。Prrn:aadA:RBS:Bs:TpsbAは、XaBsTX-F(配列番号33)とTpsbA-Xho(配列番号34)を用いて増幅し、NCPAのXhoI部位に挿入した。もう一つの細菌用バルスター発現ユニットであるBsTは、Prrn-F(配列番号27)とPrrn-RBS(配列番号35)で増幅したPrrn断片と、RBS-barstar(配列番号29)とTpsbA-R(配列番号32)で増幅したRBS:Bs:TpsbA断片とをPrrn-FとTpsbA-Rを用いたPCRによって結合させて構築した。これをpSoupのSacI-HindIII部位に挿入することによって、バルスターを発現し、pGreenがアグロバクテリウム中で複製するヘルパープラスミドpSBsTを得た。
3) BarnaseおよびBarstarコード領域のSalI-SacI断片と上記のXaBsTX-挿入NCPA (NCPA:aBST)のSacI断片を、SalI-消化pBluescriptに、4つの断片をライゲーションとスペクチノマイシンによる選択によって挿入した。
4) BarnaseおよびBarstarコード配列およびNCPA:aBsTを、一つのSalI断片として切り出し、SalI-切断pMK1ADおよびpMK2ADに挿入した。
5) XaBsTXを、BarnaseおよびBarstarコード配列がAtDMC1プロモーターとACT2プロモーターの制御下にそれぞれ置かれている選択された候補クローンから切り出した。
1.方法
図1に示したBiSt導入ベクターpBiSt13およびpBiSt23、それらからBarnase発現ユニットを欠失させた対照用ベクターpBiSt13ΔおよびpBiSt23Δを用いて常法によってタバコ(Nicotiana tabacum, SR1)を形質転換した。
pBiSt13ΔおよびpBiSt23Δでは多数のカナマイシン耐性シュートが得られたが、pBiSt13およびpBiSt23では、30ずつの葉片からそれぞれ11および10の耐性シュートしか得られなかった。
1.方法
(PCR解析)
PCR解析用のDNAは培養中の植物からDNeasy plant mini kit (QIAGEN)を用いて抽出した。Sal-Bn-F(5'-CCCGTCGACACAATGGCACAGGTTATCAAC-3':配列番号11)とBn-Sac-R(5'-CCCGAGCTCTTATCTGATTTTTGTAAAGG-3':配列番号12)、およびSal-Bs-F(5'-CCCGTCGACAC AATGAAAAAAGCAGTC-3':配列番号13)とBs-Sac-R(5'-CCCGAGCTCTTAAGAAAGTATGATG-3':配列番号14)をそれぞれ用いたPCRによってBarnaseおよびBarstar遺伝子が導入されているかを検討した。PCRの陽性対照としてribulose bisphosphate carboxylase oxygenase 小サブユニット遺伝子(rbcS)のプロモーター領域をrbcS-S1(5'-TTGAGTGAACTGGCTAATCT-3':配列番号36)およびrbcS-S4 (5'-GGTTCTTGATTCACTACACA-3':配列番号37)を用いて増幅した。PCRは、KOD DNA polymerase (TOYOBO, Tokyo) を用い、反応条件は、95℃ 5分,35サイクル×(95℃30秒, 60℃30秒, 68℃1分), 68℃5分にて行った。
形質転換体の特性を評価する目的で、pBiSt13およびpBiSt23による形質転換体それぞれ5および4系統,pBiSt13ΔおよびpBiSt23Δによる形質転換体各2系統を、培養中でクローナルに増殖させ、3個体ずつ育成した。それぞれの個体からDNAを抽出し、サザンブロッティングによって導入遺伝子を検出した。
BiSt導入ベクター(pBiSt13, pBiSt23)で形質転換した植物についてPCR法によって導入遺伝子を確認したところ、pBiSt13で8系統、pBiSt23で5系統がBarnaseおよびBarstar遺伝子を持つことがわかった。培養中の幼若なシュートではAgrobacteriumの混入が疑われるので、それらの系統を、カルベニシリンを含む培地でさらに育成し、再度DNAを抽出してPCRによって解析したところ、全てが両遺伝子を持つことが示された(図2A)。一方、対照用ベクター(pBiSt13Δ, pBiSt23Δ)で形質転換した植物では、Barnase遺伝子は検出されず、Barstar遺伝子のみが検出された(図2A)。野生型タバコではいずれの遺伝子も検出されず、陽性対照のrbcSプロモーター領域のみが検出されたことから、このPCR解析の結果が特異的であることが示された。
AtDMC1は配偶子で強く発現するが栄養器官においても低レベルで発現すること報告されている(Klimyuk, V. I. and Jones, J. D. (1997) AtDMC1, the Arabidopsis homologue of the yeast DMC1 gene: characterization, transposon-induced allelic variation and meiosis-associated expression. Plant J. 11:1-14.)。そこで、各形質転換体の葉およびいくつかの系統の生殖器官からRNAを抽出し、BarnaseおよびBarstar遺伝子の転写産物をRT-PCR法によって検出した。
葉組織RNAは培養中の植物から、生殖器官RNAは幼若な葯および子房からRNeasy Plant Mini kit (Qiagen)を用いて抽出した。RNAは、混入するDNAを除去するためにRNasin-plus (Promega)存在下、RNase-free DNaseで37℃にて15分間処理後、フェノール・クロロホルム混液による抽出およびエタノール沈澱で精製した。RNase-free水に溶解したRNAについてone-step RT-PCR kit (Qiagen)を用い、前記Sal-Bn-FとBn-Sac-RおよびSal-Bs-FとBs-Sac-RをプライマーとしてRT-PCRを行った。対照としてタバコelongation factor 1α(EF1α)をNtEF1-F(5'-CATCAACATTGTGGTCATTGGCCAC-3':配列番号38)とNtEF1-R (5'-ATCTGGTCAGAGCCTCAAGAAGAGT-3':配列番号39)を用いて検出した。RT-PCRの反応条件は、50℃30分, 95℃15分,35サイクル×(95℃30 秒, 60℃30 秒, 72℃1分), 72℃5 分とした。BarnaseおよびBarstar 遺伝子にはイントロンがないため、RNAサンプルを直接PCRに供することによってDNAの除去を確認した。
結果を図3に示す。Barnaseの発現レベルは、葉および生殖器官のいずれにおいても系統間における差が認められた。しかしその発現レベルの差異は系統特異的であり、例えば、BiSt13-1は葉におけるBarnaseの発現がBiSt13-2よりも低いが、生殖器官ではこの関係は逆転していた。この結果は、AtDMC1プロモーターの活性が配偶子形成時に高まることを示唆するものであると同時に、遺伝子の組み込み位置に強く影響を受けることを示唆している。一方、Barstarの発現は、系統間および組織間で差がないことが示されたが、本実験の条件では高発現している遺伝子の発現レベルの差は検出できないため、Barstarの発現に関しては各器官であるレベル以上の発現を示していると考えられる。また、ACT2遺伝子は配偶子では発現しないことが示されている(An, Y. Q., McDowell, J. M., Huang, S., McKinney, E. C., Chambliss, S. and Meagher RB. (1996) Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. 10: 107-21.)が、本実験で用いたRNAは配偶子以外の生殖器官を構成する細胞のRNAも含むためACT2プロモーターで制御されているBarstar転写産物も容易に検出されたものと考えられる。
1.方法
得られた形質転換体から両性不稔導入10系統および対照6系統を選び、節を含む茎を培養することによって腋芽を誘導し、各系統3個体ずつ開花終了まで育成し、生育、花芽形成および開花の状況を観察した。
形質転換体の自殖による種子形成の確認は、開花した花を無処理で経過観察することによって行った。
(1) BiSt形質転換体の生育
BiSt形質転換植物の生育は、同時に鉢上げした対照形質転換植物とほぼ同様でBiSt形質転換による植物の生育への影響はないものと考えられた。野生型および対照形質転換体では、最初の開花から約1ヶ月で花芽形成が終了し、多数の種子を含むサヤが多く得られた。一方、BiSt形質転換体では、花芽形成は2ヶ月以上続き、自殖による種子形成は認められなかった。
BiSt形質転換体では自殖による種子形成が認められなかった。また、その配偶子形成について検討したところ、BiSt形質転換体の葯は、対照形質転換体および野生型に比べて若干小さく、裂開も遅かったものの、裂開時に花粉が観察されないこと以外、明確な異常は認められなかった[図4のa,c(対照形質転換体)とb,d (BiSt形質転換体)]。この観察結果は、BiSt形質転換体で花粉が形成されないことを示唆するが、葯の裂開の瞬間に形成された全ての花粉が脱落飛散する可能性も完全には否定できない。そこで幼若な葯のパラフィン切片を作製し、葯の内容物を観察した。野生型では多数の花粉が幼若な葯内に認められたが、BiSt形質転換体では酢酸カーミンで染色される凝集塊が認められるだけで、花粉は認められなかった(図4のeとf)。また、幼若な葯を酢酸カーミン中で押しつぶした場合も、野生型では多数の花粉が観察されたのに対し,BiSt形質転換体の葯では花粉は観察されなかった。
BiSt形質転換体においては、自殖では種子が形成されなかったが、これは上述のように花粉が形成されていないためと考えられた。BiSt形質転換体では雌性配偶子も形成不全に陥ることが期待されるので、野生型花粉を受粉させることによってBiSt形質転換体の雌性配偶子の機能について検討した。野生型および対照形質転換体では、自殖によって子房の肥大が起こり、それが褐変化した時点では内部に多数の種子が含まれた(図5のa−c)。一方、野生型花粉を受粉させなかったBiSt形質転換体の子房は、図5dに示すように肥大せず、そのまま褐変化し、ついには花柄ごと茎から脱落した。野生型花粉を受粉させたBiSt形質転換体の花の約半数では、野生型よりも顕著に小さいものの子房の肥大が起こり、褐変化後の内部には種子様の粒子が形成されていた(図5のe−j)。pBiSt13による形質転換体(図5のe−i)よりもpBiSt23による形質転換体(図5のj−k)で子房の肥大が若干顕著であり、種子様粒子も大きかったが、野生型と比べると顕著に劣っていた。これらの観察結果は、BiSt形質転換体における雌性配偶子機能が完全ではないが顕著に不全となっていることを示唆する。
1.方法
野生型花粉を受粉させたBiSt形質転換体の花の半数が種子様粒子を形成したことから、それら形質転換体におけるTGの封じ込めが不完全である可能性が示唆された。そこで、
野生型花粉を受粉させたBiSt形質転換体において形成された種子様粒子の発芽能および解剖顕微鏡観察では見落とされた正常種子の形成の可能性について検討した。下記表2に示した各系統において野生型花粉を受粉後、得られた肥大化・褐変化したサヤを手で揉み潰し、内容物を全て3 cm×3 cm×5 cm容器内の土壌に播いた。得られた実生をさらに育成し、DNA抽出および種子形成の観察に用いた。DNAはPCR法によってBarnaseおよびBarstar遺伝子の有無を検討した。PCR法は実施例3に記載の方法および条件に従って行った。
表2に示すように、pBiSt23による形質転換体から得られた三系統で発芽が認められた。それらの実生をさらに育成し、DNAを抽出してPCR解析に供した。その結果、解析した9個体いずれにおいてもBarnaseおよびBarstarの遺伝子は検出されなかった(図6)。対照として同様に解析したpBiSt13Δ形質転換体の子孫では、Barstar遺伝子のみが検出された(図6,13Δ)。このPCR解析においてBarnaseおよびBarstar遺伝子が検出されなかったのが、DNAの分解など、実験上の誤りによるものではないことは、陽性対照のrbcSが全ての個体で陽性であることから支持された。以上の結果から、BiSt形質転換体に野生型花粉を受粉させた場合に形成される発芽能のある種子は、TGを持たないことが示された。
上述のように本法によって効率良く雌雄配偶子形成不全(両性不稔性)を誘導できることが分かったので、これをリンドウの分子育種に応用するべく、リンドウ用雌雄配偶子形成不全誘導ベクターを以下のようにして作製した。リンドウでは形質転換の選抜マーカーとしてビアラフォス耐性が有効であるため、図1のベクター中のカナマイシン耐性遺伝子に代えてビアラフォス耐性遺伝子を利用した。
Claims (8)
- 減数分裂期特異的なプロモーターの下流に結合させたバルナーゼ遺伝子と、目的遺伝子を配偶子形成期以外の植物細胞で構成的に発現させるプロモーターの下流に結合させたバルスター遺伝子を植物ゲノム中に導入することを特徴とする、雌雄配偶子形成不全植物の作成方法。
- 減数分裂期特異的なプロモーターが、シロイヌナズナDMC1(AtDMC1)遺伝子のプロモーターである、請求項1に記載の方法。
- 目的遺伝子を配偶子形成期以外の植物細胞で構成的に発現させるプロモーターが、シロイヌナズナアクチン2(ACT2)遺伝子のプロモーターである、請求項1に記載の方法。
- 減数分裂期特異的なプロモーターの下流に結合させたバルナーゼ遺伝子と、目的遺伝子を配偶子形成期以外の植物細胞で構成的に発現させるプロモーターの下流に結合させたバルスター遺伝子を組み込んだT-DNAを含む、組み換えベクター。
- 減数分裂期特異的なプロモーターが、シロイヌナズナDMC1(AtDMC1)遺伝子のプロモーターである、請求項4に記載の組み換えベクター。
- 目的遺伝子を配偶子形成期以外の植物細胞で構成的に発現させるプロモーターが、シロイヌナズナアクチン2(ACT2)遺伝子のプロモーターである、請求項4に記載の組み換えベクター。
- 請求項4〜6のいずれかに記載の組み換えベクターを導入した形質転換植物。
- 植物が、植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞である、請求項7に記載の形質転換植物。
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