PT1696721E - Transgénicos com supressão de gene dominante e processos para a sua utilização - Google Patents

Description

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Descrição "Transgénicos com supressão de gene dominante e processos para a sua utilização"

Antecedentes da invenção

Campo da Invenção

Em geral a invenção diz respeito a composições e processos para a supressão de gene dominante.

Informação Antecedente A reprodução de plantas disponibiliza meios para combinar características desejáveis numa única variedade de planta ou híbrido, incluindo por exemplo, resistência à doença, resistência a insectos, tolerância à geada, rendimento melhorado, e melhor qualidade agronómica. As colheitas são geralmente reproduzidas por polinização, incluindo auto polinização (auto, própria), em que o pólen de uma flor é transferido para a mesma ou outra flor da mesma planta, ou uma planta geneticamente idêntica, e polinização-cruzada (cruzamento; cruzado), em que o pólen de uma planta é transferido para uma flor de uma planta geneticamente diferente.

Plantas obtidas por auto polinização e seleccionadas, quanto ao tipo ao longo de muitas gerações tornam-se homozigóticas em quase todos os locais dos genes e produzem uma população uniforme de verdadeiros descendentes de reprodução. Um cruzamento entre duas linhas homozigóticas diferentes produz uma população uniforme de plantas híbridas que pode ser heterozigótica em muitos locais dos genes. Um cruzamento de duas plantas, em que cada uma é 2 heterozigótica em vários locais dos genes, gera plantas híbridas, que diferem geneticamente e não são uniformes.

Muitas plantas de cultura, incluindo por exemplo, milho podem ser reproduzidas utilizando auto polinização ou técnicas de polinização cruzada. 0 milho possui flores machos e fêmeas separadas na mesma planta, localizadas na bandeira e na espiga, respectivamente. A polinização natural ocorre no milho, quando o vento sopra o pólen das bandeiras para as sedas que se projectam para fora a partir dos topos das espigas. Muitas plantas de cultura incluindo o milho são cultivadas como híbridos que exibem geralmente um maior vigor do que as plantas progenitoras a partir das quais são derivadas. Como tal, é desejável evitar a polinização aleatória, quando se geram plantas híbridas.

As plantas híbridas (Fl) são geradas cruzando duas plantas progenitoras diferentes resultantes de endocruzamento machos (Pl) e fêmeas (P2). As plantas híbridas são valorizadas porque podem exibir rendimentos e vigor melhorados, quando comparadas com as plantas progenitoras de que são derivadas. Além disso, plantas híbridas (Fl) possuem geralmente propriedades mais desejáveis do que as plantas progenitoras (F2) derivadas das plantas híbridas. Assim, as plantas híbridas são comercialmente importantes e incluem muitas culturas agrícolas, incluindo, por exemplo, trigo, milho, arroz, tomates e melões. A hibridização do milho recebeu uma atenção particular desde 1930. A produção do milho híbrido envolve o desenvolvimento de linhagens homozigóticas machos e fêmeas resultantes de endocruzamento, o cruzamento destas linhas, e a avaliação dos cruzamentos no que diz respeito a um comportamento agronómico melhorado. Reprodução de uma linhagem e selecção recorrente são dois dos métodos de reprodução utilizados para desenvolver linhas de populações endocruzadas. Programas de reprodução combinam 3 características desejáveis de duas ou mais linhas resultantes de endocruzamentos, ou várias fontes de uma base alargada em grupos de reprodução, a partir dos quais novas linhagens resultantes de endocruzamento são desenvolvidas por auto cruzamento e selecção dos fenótipos desejados. Estes novos endocruzamentos são cruzados com outras linhas resultantes de endocruzamentos e os novos híbridos resultantes são avaliados para determinar, quais são os que possuem um comportamento melhorado, ou outrss características desejáveis, aumentando deste modo o valor comercial. A primeira geração de descendentes híbridos designada por F]_ é mais vigorosa do que os seus progenitores resultantes de endocruzamentos. Este vigor dos híbridos, ou heterose pode ser manifestado de muitas maneiras, incluindo crescimento vegetativo acrescido e maior rendimento em sementes. A produção de sementes híbridas necessita da manutenção dos stocks de sementes dos progenitores, porque o auto cruzamento das plantas híbridas produz a descendência (F2) que tal como PI e P2 exibem características menos desejáveis do que a planta híbrida Fl. Uma vez que as plantas progenitoras possuem geralmente um menor valor comercial do que os híbridos (Fl) foram feitos esforços no sentido de evitar o auto cruzamento das plantas progenitoras num campo se ("selfing"), uma vez que tais cruzamentos iriam reduzir o rendimento de sementes híbridas. Neste contexto, foram desenvolvidos métodos de auto cruzamento de uma planta progenitora.

Um método para controlar a polinização é a utilização de uma população de plantas progenitoras que são machos estéreis, fornecendo assim o progenitor fêmea. Foram utilizados vários métodos para controlar a fertilidade dos machos, incluindo, por exemplo, emasculação manual, ou mecânica (remoção das bandeiras), esterilidade 4 citoplasmática de machos, esterilidade de machos genética, e a utilização de gametófito. Por exemplo, auto cruzamento de progenitores num campo pode ser evitado removendo as anteras ou removendo as bandeiras das plantas da população progenitora feminina (P2), removendo assim a fonte de pólen P2 do campo. Plantas fêmeas P2 podem então ser polinizadas com pólen PI manualmente ou utilizando meios mecânicos. A semente de milho hibrido é geralmente produzida através de um sistema de esterilidade de machos incorporando a remoção das bandeiras manual ou mecânica. Planta-se num campo duas filas alternadas de milho resultante de endocruzamento, e as bandeiras que contêm o pólen são removidas de um dos endocruzamentos (fêmea P2). Desde que o campo seja suficientemente isolado de fontes de pólen de milho estranho, as espigas do endocruzamento sem bandeiras são fertilizados apenas por pólen do outro endocruzamento (PI macho); a semente resultante é híbrida e forma plantas híbridas. Infelizmente este método é intensivo do ponto de vista de tempo e de trabalho. Além disso, a variação ambiental no desenvolvimento da planta pode resultar em plantas que produzem bandeiras após uma remoção manual de bandeiras do progenitor fêmea ter sido completado. Por isso, a remoção das bandeiras pode não assegurar uma esterilidade de machos completa de uma planta fêmea resultante de endocruzamento. Neste caso, as plantas fêmeas férteis resultantes vão espalhar pólen com êxito e algumas plantas fêmeas serão auto polinizadas. Isto vai resultar na colheita de semente da fêmea resultante de endocruzamento conjuntamente com a semente híbrida desejada. A semente fêmea resultante de endocruzamento não é tão produtiva como a semente F]_. Além disso, a presença da semente de fêmea resultante de endocruzamento pode representar um risco de segurança do plasma germinativo para a empresa que produz o híbrido. A bandeira da fêmea resultante de endocruzamento 5 pode também ser removida mecanicamente. A remoção de bandeiras mecânica é aproximadamente tão fidedigna como a remoção de bandeiras manual, mas é mais rápida e menos onerosa. Contudo, a maior parte das máquinas de remoção de bandeiras produzem mais danos nas plantas do que a remoção manual de bandeiras, que reduz os rendimentos das sementes F]_. Assim, presentemente nenhuma das formas de remoção de bandeiras é completamente satisfatória, e continua a existir a necessidade de métodos alternativos de produção de híbridos que reduzem os custos de produção, aumentam a segurança da produção, e eliminam a auto polinização do progenitor fêmea durante a produção da semente híbrida.

Outro método para evitar o auto cruzamento da planta progenitora é utilizar plantas progenitoras que são machos estéreis, ou fêmeas estéreis. Foram identificados os genes da fertilidade macho em várias plantas e incluem genes de fertilidade masculina dominantes e recessivos. As plantas que são homozigóticas para um gene recessivo de fertilidade masculina não produzem pólen viável e são úteis como plantas progenitoras fêmeas. Contudo, a consequência das plantas fêmeas serem homozigóticas recessivas para um gene de fertilidade masculina é que não são capazes de auto cruzamento e, por isso, têm que ser disponibilizados meios para obter pólen para manter a linha da planta progenitora P2. Geralmente é gerada uma linha celular de manutenção que é heterozigótica para o gene de fertilidade masculina, cruzando uma planta fértil macho homozigótica dominante com uma planta estéril fêmea homozigótica recessiva. As plantas de manutenção heterozigóticas são então cruzadas com as plantas estéreis macho homozigóticas recessivas para produzir uma população em que 50% da descendência são machos estéreis. As plantas estéreis machos são então seleccionadas para serem utilizadas para gerar híbridos. Como tal, o método necessita de reprodução adicional e 6 passos de selecção para obter as plantas estéreis machos, adicionando-se assim ao tempo e custo necessário para produzir as plantas híbridas.

Para ultrapassar a necessidade de se ter de seleccionar machos estéreis a partir de plantas férteis machos geradas por cruzamento de uma linha de plantas de manutenção com uma linha de plantas fêmeas (estéreis macho), foram desenvolvidos processos para obter plantas estéreis macho expressando uma molécula citotóxica em células dos orgãos reprodutivos masculinos de uma planta. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica para uma molécula citotóxica pode estar ligado a um promotor específico do tapetum e ser introduzido em células de plantas de modo a que por expressão a molécula tóxica mate células de anteras, tornando a planta macho estéril. Como acima, contudo, tais plantas progenitoras fêmeas não podem ser auto cruzadas e, por isso, necessitam da preparação e utilização de uma linha celular de plantas de manutenção que quando cruzada com o progenitor fêmea estéril macho restabelece a fertilidade, por exemplo, disponibilizando um gene de fertilidade masculina dominante, ou disponibilizando um meio de inactivar ou de por outro lado inibir a actividade do produto génico citotóxico (ver Pat. US N°5, 977, 433) .

Processos adicionais para conferir esterilidade genética masculina foram descritos incluindo, por exemplo, a geração de plantas com genes mutantes múltiplos em localizações separadas no genoma que confere esterilidade masculina (ver Pat. US N°s 4,654, 465 e 4, 727,219), ou com translocações cromossomais (ver Pat US N°s 3,861,709 e 3,710,511). Outro processo de conferir esterilidade masculina genética inclui a identificação de um gene que é necessário para a fertilidade masculina; silenciando o gene endógeno, gerando um transgénico compreendendo um promotor 7 indutível ligado operacionalmente à sequência de codificação do gene de fertilidade masculino, e inserindo o transgénico de volta na planta, gerando deste modo uma planta que é um macho estéril na ausência do agente de indução, e pode ser recuperado como macho fértil expondo a planta ao agente indutor (ver Pat. US N° 5,432,068).

Enquanto que os processos anteriormente descritos para obter e manter linhas de plantas híbridas foram úteis para a reprodução de plantas e fins agrícolas, eles necessitam de numerosos passos e/ou linhas adicionais para manter populações de plantas machos estéreis ou de fêmeas estéreis para obter as plantas híbridas. Tais requisitos contribuem para custos acrescidos de cultura das plantas híbridas, e consequentemente, custos acrescidos para os consumidores. Assim, existe a necessidade de métodos convenientes e eficazes de produzir plantas híbridas e em particular de gerar linhas progenitoras que podem ser cruzadas para obter plantas híbridas.

Um sistema fidedigno de esterilidade masculina genética iria disponibilizar muitas vantagens em relação a outros sistemas. Os processos de remoção de bandeiras laboriosos podem ser evitados em alguns genótipos utilizando endocruzamentos de machos estéreis citoplasmáticos (CMS-da expressão anglo-saxónica "cytoplasmatic male-sterile"). Na ausência de um gene que restabelece a fertilidade, as plantas resultantes de endocruzamento CMS são machos estéreis como consequência de factores genómicos citoplasmáticos (não nucleares). Assim, esta característica CMS é herdada exclusivamente através do progenitor feminino nas plantas de milho, uma vez que apenas a fêmea disponibiliza citoplasma à semente fertilizada. Plantas CMS são fertilizadas com pólen de uma outra planta resultante de um endocruzamento que não seja um macho estéril. Pólen da planta resultante do segundo 8 endocruzamento pode ou não contribuir com genes que tornam as plantas híbridas machos férteis. Geralmente sementes de milho normal sem bandeiras e sementes produzidas a partir de CMS do mesmo híbrido têm que ser misturadas para assegurar que cargas de pólen adequadas estão disponíveis para fertilização, quando as plantas híbridas são cultivadas e para assegurar diversidade citoplasmática. É revelada um outro tipo de esterilidade genética nas Patentes US 4,654,465 e 4,727,219 de Brar et al. Contudo, esta forma de esterilidade genética masculina necessita da manutenção de genes mutantes múltiplos em localizações separadas no genoma e necessita de um sistema marcador complexo para marcar os genes, tornando este sistema inconveniente. Patterson descreveu um sistema genético de translocações cromossomais que pode ser eficaz, mas que é também muito complexo. (Ver patentes US N°3,861,709 e 3,710,511) .

Foram efectuadas muitas outras tentativas de lidar com as desvantagens dos sistemas de esterilidade existentes. Por exemplo, Fabijanski, et al. desenvolveu vários métodos de provocar esterilidade masculina nas plantas (ver EPO 89/3010153.8 publicação n° 329,308 e pedido de patente PCT PCT/CA90/00037 publicado como WO 90/08828). Um processo inclui a administração a uma planta de um gene que codifica para uma substância citotóxica que é expressa utilizando um promotor específico do tecido masculino. Um outro envolve um sistema anti-sentido, em que um gene crítico para a fertilidade é identificado e uma construção anti-sentido do gene é inserida na planta. Mariani, et al. apresenta também vários sistemas anti-sentido citotóxicos. Ver EP 89/401,194. Ainda outros sistemas utilizam genes "repressores" que inibem a expressão de outros genes críticos para a fertilidade masculina. Ver, WO 90/08829. 9

Ainda um outro melhoramento deste sistema é o descrito na Patente de invenção US N° 5, 478,369 em que um método para conferir esterilidade masculina controlável é conseguido silenciando um gene nativo da planta que é critico para a fertilidade masculina e introduzindo ainda uma cópia funcional do gene de fertilidade masculino sob o controlo de um promotor indutivel que controla a expressão do gene. A planta é assim constitutivamente estéril, tornando-se fértil apenas, quando o promotor é induzido, permitindo a expressão do gene de fertilidade masculina.

Em várias circunstâncias, uma caracteristica particular da planta é expressa mantendo um condição homozigótica recessiva. Surgem dificuldades na manutenção da condição homozigótica, quando um gene de restauração transgénico tem de ser utilizado para manutenção. Por exemplo, verificou-se que o gene MS45 no milho (US 5,478,369) é crítico para a fertilidade masculina. Plantas heterozigóticas ou hemizigóticas para o alelo MS45 dominante, designado ms45 são completamente férteis devido à natureza esporofítica da caracteristica de fertilidade MS45. Uma mutação natural no gene MS45, designado ms45 confere um fenótipo de esterilidade masculina às plantas, quando este alelo mutante se encontra no estado homozigótico. Esta esterilidade pode ser revertida (i.e., a fertilidade pode ser restabelecida), quando a forma não mutante do gene é introduzida na planta, ou através de processos de cruzamento normal, ou de complementação transgénica. Contudo o restabelecimento da fertilidade por cruzamento retira a condição homozigótica recessiva desejada e ambos os processos restabelecem a fertilidade masculina completa e evitam a manutenção de linhas maternas estéreis masculinas puras. As mesmas preocupações surgem, quando se controla a fertilidade feminina da planta, em que uma fêmea homozigótica recessiva tem de ser mantida por 10 cruzamento de uma planta que contém um gene de restauração. Por isso, existe um valor considerável não apenas no controlo da expressão dos genes de restauração numa linha recessiva genética, mas também no controlo da transmissão dos genes de restauração para a descendência durante o processo de produção do híbrido.

Sumário da Invenção A presente invenção encontra-se baseada na constatação de que o genótipo de um organismo (por ex. uma planta ou mamífero) pode ser modificado para conter alelos supressores dominantes ou construções transgénicas que reduzem, mas não efectuam a ablação da actividade de um gene, em que o fenótipo do organismo não é substancialmente afectado. Por exemplo, plantas podem conter os alelos supressores dominantes e/ou construções transgénicas que suprimem a actividade de um gene da planta de fertilidade masculina sem tornar a planta macho estéril, ou pode conter alelos supressores dominantes e/ou construções transgénicas que suprimem a actividade de um gene necessária para a viabilidade, sem matar a planta. Além disso, pares de tais plantas que possuem genótipos seleccionados compreendendo os alelos supressores dominantes, ou construções transgénicas podem ser cruzados para produzir descendência que exibe a alteração fenotípica (por ex. esterilidade masculina). A descendência de plantas que compreende a supressão dos genes de fertilidade masculina, por exemplo, pode ser útil como fêmeas na produção de plantas híbridas.

Neste contexto a invenção disponibiliza um processo de manter a condição homozigótica recessiva de uma primeira planta de milho quando se cruza com uma segunda planta de milho, compreendendo 11 (a) a disponibilização de uma primeira planta de milho macho estéril com um genótipo recessivo homozigótico para uma caracteristica que afecta a viabilidade ou a fertilidade. (b) a introdução por transformação numa segunda planta de milho uma construção de um gene de restauração exógeno compreendendo (i) uma primeira sequência nucleótidica que quando introduzida na primeira planta iria restabelecer a caracteristica homozigótica recessiva, estando a primeira sequência nucleótidica numa condição hemizigótica; (ii) uma segunda sequência nucleótidica ligada operacionalmente à primeira sequência nucleótidica que inibe a formação, função, ou dispersão de gâmetas masculinos da planta de manutenção, em que a segunda sequência nucleótidica encontra-se operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão preferencialmente para os gâmetas masculinos; e disponibilizando uma planta que compreende a dita construção do gene de restauração como uma planta de manutenção; e (c ) cultivando a planta de manutenção de tal modo que todo o pólen viável produzido contém o alelo recessivo e não contém a dita construção do gene de restauração; e (d) polinizando a primeira planta com a planta de manutenção para produzir descendência que mantém a condição homozigótica recessiva da primeira planta. 12 A invenção disponibiliza ainda: -este método em que a primeira sequência de nucleótidos restabelece a fertilidade masculina de forma esporofítica, -este método em que a dita primeira sequência nucleótidica é MS 45. -este método em que a dita primeira sequência nucleótidica é SBMu200, BS92-7, MSI ou MS2, -este método em que o dito promotor é seleccionado a partir de MS45, BS92-7, e SBMu200. -este método em que a segunda sequência nucleótidica se encontra operacionalmente ligada a um promotor indutivel. A invenção também disponibiliza: - uma planta de manutenção como descrito acima que se auto fecundada disponibiliza uma descendência numa proporção 50:50 machos estéreis:machos férteis - uma planta de manutenção como descrito acima compreendendo ainda uma terceira sequência nucleótidica ligada operacionalmente à primeira sequência nucleótidica e que codifica para um produto marcador capaz de ser utilizado para seleccionar a descendência compreendendo a construção do gene de restauração. - uma planta de manutenção como descrito acima em que a terceira sequência nucleótidica codifica para um produto génico que disponibiliza resistência a um químico, um produto génico que disponibiliza um marcador visual num tecido vegetativo ou reprodutivo, ou um produto génico que afecta a cor do tecido. A invenção disponibiliza adicionalmente um processo de propagação da planta de manutenção como descrito acima compreendendo a dita planta de manutenção auto 13 polinizadora e seleccionando a descendência baseada na presença de um produto marcador selecionável. A presente invenção lida com a dificuldade de propagação de uma planta que possui uma caracteristica reprodutiva homozigótica recessiva sem perder a condição homozigótica recessiva na descendência resultante. Isto pode ser conseguido introduzindo numa planta pelo menos uma construção transgénica de restauração, ligada operacionalmente (1) a uma primeira sequência nucleótidica compreendendo uma cópia funcional de um gene que complementa a caracteristica fenotípica mutante produzida pela condição homozigótica recessiva com (2) uma segunda sequência nucleótidica funcional que interfere com a formação, função ou dispersão dos gâmetas femininos da planta e encontra-se operacionalmente ligada a um promotor preferido do tecido do gâmeta masculino. Esta construção é mantida no estado hemizigótico e uma planta contendo uma tal construção é referida aqui como de manutenção. Quando a planta de manutenção contendo uma tal construção ligada é utilizada como um doador de pólen para fertilizar a planta homozigótica recessiva, os únicos gâmetas masculinos viáveis disponibilizados à planta recessiva homozigótica são aquelas que contêm o alelo recessivo, e não contêm qualquer componente da construção transgénica. Nenhuns dos grãos de pólen que contêm a construção transgénica de restauração são viáveis devido à acção do segundo gene ligado que evita a formação de um pólen viável. Por isso, a descendência resultante de um tal cruzamento sexual é não transgénica em relação a esta construção transgénica.

Enquanto que nenhum pólen viável produzido pela planta de manutenção contém a construção transgénica de restauração, 50% dos óvulos (gâmeta feminino) da planta de manutenção vai conter a construção transgénica de restauração. Por isso, a planta de manutenção pode ser 14 propagada por auto fertilização, com a construção transgénica de restauração segregando-a de modo a estar contida em 50% da semente da espiga de uma planta de manutenção auto fecundada. Ligando a construção transgénica de restauração com um marcador seleccionável, 50% da semente contendo o transgénico pode ser isolada para propagar a população de manutenção que permanece homozigótica para o gene recessivo e hemizogótica para a construção do transgénico de restauração.

Se o gâmeta feminino for proibido de ser formado ou de estar funcional pode ser desejado ligar o gene capaz de complementar este fenótipo mutante com um promotor indutivel para auxiliar na conservação da planta de manutenção. Uma tal planta, quando exposta à condição de indução vai ter a fertilidade feminina restabelecida, e a planta pode então ser auto fecundada para produzir descendência que possui tanto a caracteristica recessiva desejada e a construção transgénica de restauração.

Enquanto que a invenção é exemplificada para plantas, um perito no estado da técnica iria reconhecer a sua aplicabilidade a outros organismos não-humanos, incluindo mamíferos.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção é exemplificada em relação à fertilidade da planta, e mais particularmente no que diz respeito à fertilidade masculina da planta. A indústria da agricultura produz colheitas que são utilizadas para alimentar seres humanos e animais, e que são ainda utilizadas noutras indústrias para preparar produtos tão diversos como adesivos e explosivos. Milho, por exemplo, é utilizado como alimento humano, rações para animais (por ex. gado para carne, gado para laticínios, 15 suínos, e rações para aves), e como matéria prima na indústria. A utilização de milho na alimentação inclui o consumo de grãos de milho, assim como de produtos da indústria de moagem a seco e moagem a húmido (por ex. milho meio moído sem casca, farinha, amido de milho, xarope de milho, e dextrose). Óleo de milho é recuperado a partir do gérmen de milho que é um produto secundário das indústrias de moagem a seco e da moagem a húmido. Utilizações industriais do milho incluem a produção de etanol, amido de milho na indústria de moagem a húmido e de farinha de milho na indústria de moagem a seco. As aplicações industriais do amido de milho e farinha estão baseadas nas suas propriedades funcionais, incluindo, por exemplo, viscosidade, formação de película, propriedades adesivas, e capacidade de suspender partículas. 0 amido de milho e a farinha encontram aplicação nas indústrias do papel e têxtil, e também são utilizadas em adesivos, materiais de construção, ligantes de fundição, amidos para lavagem, explosivos, lamas de poços de petróleo, e outras aplicações mineiras.

Muitas plantas de cultura incluindo arroz, trigo, milho, tomates e melões são cultivados como híbridos que exibem um maior vigor e qualidades melhoradas, quando comparadas com as plantas progenitoras. 0 desenvolvimento de híbridos num programa de reprodução de plantas necessita, em geral, do desenvolvimento de linhas de endocruzamentos hemozigóticas, o cruzamento destas linhas, e a avaliação dos cruzamentos. A reprodução de linhagem e processos de reprodução por selecção recorrente são utilizados para desenvolver linhas de endocruzamentos de populações reprodutivas. Por exemplo, programas de reprodução de plantas de milho combinam as bases genéticas de duas ou várias linhas de endocruzamentos (ou várias outras fontes de plasma germinativo) em grupos de 16 reprodução, a partir dos quais são desenvolvidos novas linhas de endocruzamentos por auto polinização (auto cruzamento -expressão anglo-saxónica "selfing") e selecção dos fenótipos desejados. As plantas resultantes de endocruzamentos seleccionadas são então cruzadas com outras linhas de endocruzamentos e os híbridos destes cruzamentos são avaliados para determinar quais possuem um potencial comercial. Como tal, a reprodução de plantas e o desenvolvimento de híbridos são processos caros e demorados. A reprodução da linhagem inicia-se com o cruzamento de dois genótipos, cada um dos quais pode ter uma ou várias características desejadas que falta no outro ou que complementa o outro. Se os dois progenitores originais não fornecerem todas as características desejadas, podem ser incluídas outras fontes na população reprodutiva. Utilizando este método são seleccionadas plantas superiores e auto cruzadas em gerações sucessivas até serem obtidas linhas de plantas homogéneas. Reprodução por selecção selectiva, tal como retro cruzamento pode ser utilizado para melhorar uma linha endocruzada e pode ser produzido um híbrido utilizando as plantas resultantes de endocruzamentos. 0 retro cruzamento pode ser utilizado para transferir uma característica desejável específica a partir da planta resultante de endocruzamento ou fonte para uma segunda planta resultante de endocruzamento a que lhe falta essa característica, por exemplo, cruzando primeiro com uma planta resultante de endocruzamento superior (progenitor recorrente) com uma planta resultante de endocruzamento doadora (progenitor não recorrente) que transporta o gene adequado (ou genes) para a característica em questão, cruzando a descendência do primeiro cruzamento novamente com o progenitor recorrente superior, e seleccionando a descendência resultante para a característica desejada a 17 ser transferida do progenitor não recorrente. Após 5 ou mais gerações de retro cruzamento com selecção para a caracteristica desejada, a descendência é homozigótica para o local que controla a caracteristica a ser transferida, e são como o progenitor superior no que diz respeito essencialmente a todos os outros genes. A última geração de retro cruzamento é auto cruzado para dar uma descendência reprodutora pura para o gene a ser transferido.

Um híbrido de cruzamento único (Fl) resulta do cruzamento de duas linhas de endocruzamentos (PI e P2), cada uma das quais possui um genótipo que complementa o genótipo do outro. No desenvolvimento de híbridos comerciais num programa de reprodução de plantas de milho, por exemplo, apenas as plantas híbridas Fl são procuradas, porque são mais vigorosas do que os seus progenitores resultantes de endocruzamentos. Este vigor híbrido (heterose) pode ser manifestado em muitas características poligénicas, tais como crescimento vegetativo acrescido e rendimento melhorado. 0 desenvolvimento de um híbrido num programa de reprodução de plantas de milho, por exemplo, envolve a selecção de plantas de vários grupos de plasma germinativo para cruzamentos reprodutivos iniciais; o auto cruzamento das plantas seleccionadas da reprodução cruzam-se durante várias gerações para produzir uma série de linhas resultantes de endocruzamentos, que apesar de serem diferentes umas das outras se reproduzem verdadeiramente e são altamente uniformes; e cruzando as linhas resultantes de endocruzamentos com linhas de endocruzamentos diferentes para produzir a descendência híbrida Fl. Durante o processo de endocruzamento no milho, o vigor das linhas diminui, mas é restabelecido, quando duas linhas de endocruzamentos diferentes são cruzadas para produzir as plantas híbridas. Uma consequência importante da homozigosidade e homogeneidade das linhas resultantes de endocruzamentos é 18 que o híbrido F1 entre um par definido de plantas progenitoras resultantes de endocruzamentos é sempre o mesmo. Como tal, quando as plantas resultantes de um endocruzamento que dão origem a um híbrido superior são identificadas, as sementes do híbrido podem ser reproduzidas indefinidamente desde que os progenitores resultantes de endocruzamentos sejam mantidos. A produção de sementes de híbridos necessita da eliminação ou inactivação do pólen produzido pelo progenitor fêmea. A remoção incompleta ou inactivação do pólen disponibiliza o potencial para o auto cruzamento, aumentando o risco de que sementes auto polinizadas inadvertidamente vão ser colhidas não intencionalmente e vão ser embaladas com as sementes híbridas. Quando a semente é plantada, as plantas auto cruzadas podem ser identificadas e seleccionadas; as plantas auto cruzadas são geneticamente equivalentes à linha fêmea resultante de endocruzamentos utilizada para produzir o híbrido. Tipicamente as plantas auto cruzadas são identificadas e seleccionadas baseadas no seu menor vigor. Por exemplo, plantas de milho auto cruzadas, são identificadas pela sua aparência menos vigorosa em relação a características vegetativas e/ou reprodutivas, incluindo uma menor altura da planta, pequeno tamanho da espiga, forma da espiga e do grão, cor da espiga, ou outras características. Linhas auto cruzadas podem também ser identificadas utilizando análises com marcadores moleculares (ver por ex. Smith e Wych, Seed Sei. Technol. 14:1-8, 1995). Utilizando tais métodos a homozigosidade da linha auto polinizada pode ser verificada analisando a composição alélica em vários locais no genoma.

Como as plantas híbridas são culturas importantes e valiosas os reprodutores de plantas trabalham continuamente para desenvolver híbridos de alto rendimento que sejam robustos do ponto de vista agronómico baseados em linhas 19 resultantes de endocruzamentos estáveis. A estabilidade de tais híbridos permite que uma quantidade máxima de colheita seja produzida com as entradas utilizadas, minimizando ao mesmo tempo a suscetibilidade a pestes e stresses ambientais. Para se atingir este objectivo, o reprodutor de plantas tem que desenvolver linhas progenitoras superiores resultantes de endocruzamentos para produzir híbridos identificando e seleccionando indivíduos únicos que ocorrem numa população em segregação. A presente invenção contribui para este objectivo, disponibilizando por exemplo plantas, que quando cruzadas geram descendência com esterilidade masculina que podem ser utilizadas como plantas progenitoras fêmeas para gerar plantas híbridas.

Foi identificado um grande número de genes como sendo preferidos das bandeiras no seu padrão de expressão utilizando métodos tradicionais e processos de alto débito recentes. A correlação da função destes genes com importantes processos bioquímicos ou de desenvolvimento que conduzem em última análise a pólen fértil é árdua, quando as estratégias se encontram limitadas à análise clássica mutacional genética directa ou inversa. Como aqui divulgado, estratégias de supressão no milho disponibilizam meios rápidos alternativos para identificar genes que se encontram relacionados directamente com o desenvolvimento de pólen no milho. 0 gene de fertilidade masculino bem caracterizado, MS45 e vários genes preferidos de anteras de função desconhecida foram utilizados para avaliar a eficácia da geração da esterilidade masculina utilizando estratégias de silenciamento de genes pós-transcripcionais (PTGS; ver, por exemplo, Kooter et al. (1999) Trends Plant Sei. 4:340-346), ou silenciamento de genes transcricionais (TGS; ver, por exemplo, Mette et al. (2000) EMBO J. 19:5194-5201) . 20

Para examinar PTGS, foram introduzidas no milho construções de ARNi de gancho de cabelo, que possuem estruturas em haste compostas de repetições invertidas de outras sequências de ADNc expressas por antera, e um circuito fechado contendo uma sequência de codificação não homóloga ou um intrão passível de união do milho.

Para examinar TGS como uma estratégia para desactivar a função do gene da antera foi gerado um segundo conjunto de construções em que os promotores das sequências de genes específicos das anteras formavam a haste e uma sequência não homóloga formava o laço. As construções foram expressas utilizando promotores constitutivos e promotores preferidos de antera.

Foram observados fenótipos de fertilidade contrastantes dependendo do tipo de construção de gancho para cabelo expresso. As plantas que expressavam as construções PTGS eram machos férteis. Em constaste, plantas que expressavam as construções TGS eram machos estéreis, e faltava-lhes MS45 ARNm e proteína. Além disso, o fenótipo de esterilidade das plantas contendo o ARNhp específico para o promotor MS45 (i.e., as construções TGS) foi invertido quando o MS45 foi expresso a partir de promotores heterólogos nestas plantas. Estes resultados demonstram que TGS disponibiliza um instrumento para correlacionar rapidamente a expressão genética com a função de genes desconhecidos tal como genes monocotiledóneos expressos por anteras.

Quando aqui utilizado, o termo "endógeno", quando utilizado em relação a um gene, significa um gene que se encontra normalmente presente no genoma de células de um organismo especificado, e encontra-se presente no seu estado normal nas células (i.e. presente no genoma no estado em que normalmente se encontra presente na natureza). O termo "exógeno" é aqui utilizado para referir 21 qualquer material que é introduzido numa célula. 0 termo "molécula de ácido nucleico exógeno" ou "transgénico" diz respeito a qualquer molécula de ácido nucleico que não se encontra normalmente presente num genoma de uma célula ou que é introduzido numa célula. Tais moléculas de ácido nucleico exógeno são geralmente moléculas de ácido nucleico recombinantes que são geradas utilizando métodos de ADN recombinante como aqui divulgado ou conhecido do estado da técnica. Um organismo transgénico não humano é aqui revelado pode conter, por exemplo, um primeiro transgénico e um segundo transgénico. Estes primeiros e segundos transgénicos podem ser introduzidos numa célula, por exemplo, uma célula progenitora de um organismo transgénico como moléculas de ácido nucleico individuais ou como uma unidade única (por ex. contidos em diferentes vectores ou contidos num único vector, respectivamente) . Em qualquer caso, pode ser efectuada uma comfirmação em que uma célula a partir da qual o organismo transgénico deverá ser originado contém ambos os transgénicos utilizando métodos de rotina e bem conhecidos, tal como a expressão de genes marcadores ou hibridização de ácido nucleico ou análise por PCR. Alternativamente, ou adicionalmente a confirmação da presença dos transgénicos pode ocorrer mais tarde, por exemplo após regeneração de uma planta a partir de uma célula transformada putativamente.

Um gene de fertilidade endógeno de uma planta de um par de reprodução aqui descrito pode ser inactivado devido por exemplo a (1) a uma mutação do gene endógeno de modo que a função de um produto codificado pelo gene é suprimida (por ex. o produto genético não é expresso ou é expresso a um nivel que é insuficiente para mediar o seu efeito completo na planta, ou célula de planta); ou (2) para exprimir uma molécula de ácido nucleico exógeno que reduz ou inibe a expressão do produto genético codificado pelo 22 gene endógeno. Assim, o termo inactivado é aqui utilizado num sentido lato para referir qualquer manipulação de um gene endógeno, ou uma célula contendo o gene, de modo a que a função mediada por um produto codificado pelo gene seja suprimido. Deveria ser ainda reconhecido que apesar do gene endógeno inactivado possuir uma actividade reduzida ou ser completamente inactivado o fenótipo relevante desejado é mantido.

Pode ser efectuada uma mutação de um gene endógeno que resulta na supressão de uma função genética, por exemplo suprimindo ou inserindo um ou vários nucleótidos na sequência nucleótidica do gene (por ex. no promotor, na sequência de codificação, ou intrão), substituindo um ou vários nucleótidos no gene com outros nucleótidos diferentes, ou inactivando o gene (por ex. por recombinação homóloga utilizando um vector dirigido para um alvo adequado). Plantas que tenham tais mutações em ambos os alelos podem ser obtidos, por exemplo utilizando métodos de cruzamento como aqui revelados ou conhecidos do estado da técnica. Inactivação de um gene endógeno que resulta na supressão da função do gene pode também ser efectuada introduzindo em células da planta um transgénico que suprime a expressão do gene endógeno ou um produto expresso a partir do gene endógeno (por ex. um polipéptido codificado), ou um transgénico que codifica para um produto (por ex. um ARN) que suprime a expressão do gene endógeno ou de um produto codificado pelo gene endógeno em células da planta em que o gene é normalmente expresso. A titulo de exemplo, inactivação de genes de fertilidade endógenos pode ser efectuada expressando moléculas ARN de gancho de cabelo (ARNhp) em células dos orgãos reprodutivos de uma planta (por ex. células de estames em que os genes de fertilidade endógenos a serem inactivados são genes de fertilidade masculinos). Os 23 estames que compreendem os orgãos reprodutores masculinos das plantas incluem vários tipos de células, incluindo por exemplo, o filamento, antera, tapetum e pólen. Os ARNhp úteis para os fins da presente invenção são designados para incluir as repetições invertidas de um promotor de um gene endógeno a ser inactivado; ARNhp que possuem a capacidade de suprimir a expressão de um gene foram revelados (ver por ex. Matzke et al. (2001) Curr. Opin. Genet. Devei. 11:221-227; Scheid et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei., USA 99:13659-13662; Waterhouse e Helliwell (2003) Nature Reviews Genetics 4:29-38; Aufsaftz et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. 99 (4):16499-16506; Sijen et al., Curr. Biol. (2001) 11:436-440). Como aqui referido, a utilização de promotores específicos dos estames ou preferidos dos estames incluindo promotores específicos de anteras, promotores específicos do pólen, promotores específicos de tapetum, e semelhantes permite a expressão de ARNhp em plantas (particularmente em células reprodutoras das plantas), em que o ARNhp suprime a expressão de um gene de fertilidade endógeno, inactivando deste modo a expressão do gene de fertilidade endógeno. Assim, uma supressão utilizando um ARNhp específico para um promotor que dirige a expressão de um gene de fertilidade disponibiliza um meio de inactivar um gene de fertilidade endógeno.

Os termos "primeiro", "segundo", "terceiro", e "quarto" são aqui utilizados apenas para clarificar relações de várias células e moléculas ou para distinguir diferentes tipos de uma molécula, e, a não ser que quando indicado especificamente não se pretende que indiquem qualquer ordem, importância ou característica quantitativa. Por exemplo, e a não ser quando indicado especificamente, referência a uma "primeira planta" contendo um "primeiro gene endógeno" destina-se a indicar apenas que o gene especificado se encontra presente na planta especificada. A 24 título de segundo exemplo, e a não ser que especificado de outro modo referência a uma "primeira planta contendo um primeiro transgénico e um segundo transgénico" pretende-se indicar apenas que a dita planta contém duas moléculas de ácido nucleico exógeno que são diferentes umas das outras.

Quando aqui utilizado o termo "molécula de ácido nucleico" ou polinucleótido ou "sequência polinucleótida" diz respeito em geral a uma sequência de dois ou mais desoxiribonucleótidos ou ribonucleótidos que estão ligados um ao outro através de uma ligação fosfodiéster. Assim, os termos incluem ARN e ADN, que podem ser um gene ou uma sua porção, um ADNc, uma sequência de ácido polidesoxiribinucleótido sintética, ou semelhantes, e que possa ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, assim como um híbrido de ADN/ARN. Além disso, os termos são aqui utilizados para incluir moléculas de ácido nucleico de ocorrência natural que podem ser isoladas de uma célula, assim como moléculas sintéticas que podem ser preparadas por exemplo, através de métodos de síntese química ou através de métodos enzimáticos tal como o da reacção em cadeia da polimerase (PCR). 0 termo "recombinante" é aqui utilizado para referir uma molécula de ácido nucleico que é manipulada fora de uma célula, incluindo duas ou mais sequências nucleótidicas heterólogas ligadas. 0 termo "heterólogo" é aqui utilizado para referir sequências nucleótidicas que não estão normalmente ligadas na natureza, ou que se encontram ligadas de uma maneira diferente do que a revelada. Por exemplo, referência a um transgénico compreendendo uma sequência de codificação operacionalmente ligada a um promotor heterólogo significa que o promotor é um, que normalmente não dirige directamente a expressão da sequência nucleótidica numa determinada célula na natureza. 25

Em geral, os nucleótidos compreendendo uma molécula de ácido nucleico exógena (transgénico) são desoxiribonucleótidos que ocorrem naturalmente, tal como adenina, citosina, guanina, ou timina ligada à 2'-desoxiribose, ou ribonucleótidos, tais como adenina, citosina, guanina ou uracilo ligado à ribose. Contudo, uma molécula de ácido nucleico ou sequência nucleótidica pode também conter análogos de nucleótidos, incluindo nucleótidos sintéticos de ocorrência não natural ou nucleótidos modificados de ocorrência natural. Tais análogos de nucleótidos são bem conhecidos do estado da técnica e comercialmente disponíveis, assim como são os polinucleótidos que contêm tais análogos de nucleótidos (Lin et al., Nucl. Acids Res. 22:5220-5234, 1994; Jellinek et al., Biochemistry 34: 11363-11372, 1995; Pagratis et al., Nature Biotechnology. 15:68-73, 1997). De forma semelhante, a ligação covalente que liga os nucleótidos de uma sequência nucleótidica é geralmente uma ligação fosfodiéster, mas também pode ser por exemplo, uma ligação tiodiéster, uma ligação fosforotioato, uma ligação semelhante à de um péptido, ou qualquer outra ligação conhecida dos peritos no estado da técnica úteis para ligar os nucleótidos para produzir polinucleótidos sintéticos (ver, por exemplo, Tam et al., Nucl. Acids Res. 22:977-986, 1994; Ecker e Crooke, BioTechnology 13:351360, 1995). A incorporação de análogos nucleótidicos de ocorrência não natural ou de ligações que ligam os nucleótidos ou análogos pode ser particularmente útil, quando a molécula de ácido nucleico vai ser exposta a um meio que contém uma actividade nucleolítica, incluindo, por exemplo, um meio de cultura de tecido de planta, ou numa célula de planta, uma vez que as moléculas modificadas podem ser menos susceptíveis de degradação. 26

Uma sequência nucleótidica contendo nucleótidos de ocorrência natural e ligações de fosfodiéster pode ser sintetizada quimicamente, ou pode ser produzida utilizando métodos de ADN recombinante, utilizando um polinucleótido adequado como molde. Em comparação, uma sequência nucleótidica contendo análogos de nucleótidos ou ligações covalentes diferentes de ligações fosfodiéster é geralmente sintetizada quimicamente, apesar de uma enzima, tal como uma polimérase T7 possa incorporar determinados tipos de análogos de nucleótidos num polinucleótido e possa por isso ser utilizada para produzir um tal polinucleótido de forma recombinante a partir de um molde adequado (Jellinek et al., supra, 1995).

Uma molécula de ácido nucleico exógena pode compreender sequência nucleótidicas ligadas operacionalmente, tal como um promotor ligado operacionalmente a uma sequência nucleótidica que codifica para um ARNhp, ou um promotor ligado a uma sequência nucleótidica que codifica um produto génico de fertilidade masculina. 0 termo "operacionalmente ligado", quando aqui utilizado diz respeito a duas ou mais moléculas que quando juntas geram uma molécula que partilha características de cada uma das moléculas individuais. Por exemplo, quando utilizada em relação a um promotor (ou outro elemento regulador) e uma segunda sequência nucleótidica que codifica para um produto génico, o termo "operacionalmente ligado" significa que o elemento regulador se encontra posicionado em relação a uma segunda sequência nucleótidica, de modo que a transcrição ou translacção da sequência nucleótidica isolada esteja sob a influência do elemento regulador. Quando utilizado em relação a uma proteína de fusão compreendendo um primeiro polipétido e um ou vários polipéptidos adicionais, o termo "ligado operacionalmente" significa que cada componente da proteína 27 de fusão (quimérica) exibe ou exibem todos uma função que é caracteristica de um componente polipéptidico (por ex. um domínio de localização de compartimento celular e uma actividade enzimática). Noutro exemplo, duas sequências nucleótidicas operacionalmente ligadas cada uma das quais codificando para um polipéptido, podem ser tais que as sequências de codificação se encontram na estrutura e, por isso, a transcrição e tradução resulta na produção de dois polipéptidos que podem ser dois polipéptidos separados, ou uma proteína de fusão.

Quando uma molécula de ácido nucleico exógena inclui um promotor operacionalmente ligado a uma sequência nucleótidica que codifica para um ARN ou um polipéptido de interesse, a molécula de ácido nucleico exógena pode ser designada como uma molécula de ácido nucleico exógeno (ou transgénico). 0 termo "expressável" é aqui utilizado, porque enquanto que uma tal sequência nucleótidica pode ser expressa a partir do promotor, não é preciso que necessariamente seja expressa num determinado intervalo de tempo. Por exemplo, quando um promotor de um trnasgénico expressável é um promotor indutível que lhe falta actividade basal, uma sequência nucleótida operacionalmente ligada que codifica para um ARN, ou polipéptido de interesse é apenas expresso a seguir a uma exposição a um agente indutor adequado.

Promotores transcricionais actuam geralmente de uma maneira dependente da posição e orientação e encontram-se geralmente posicionados no quinto ou cerca de cinco nucleótidos a cerca de 50 nucleótidos 5' (a montante) do local de iniciação da transcrição de um gene na natureza. Em comparação os amplificadores podem actuar de uma maneira relativamente independente da posição ou orientação e podem estar posicionados várias centenas ou milhares de nucleótidos a montante ou a jusante de um local de 28 iniciação de transcrição, ou num intrão dentro da região de codificação de um gene, estando ainda no entanto ligado operacionalmente a uma região de codificação de modo a amplificar a transcrição. As posições relativas e orientações de vários elementos reguladores para além de um promotor incluindo o posicionamento de uma sequência reguladora transcrita, tal como um local de entrada interno de um ribossoma, ou um elemento regulador traduzido, tal como um dominio de compartimentalização de uma célula numa grelha de leitura adequada, são bem conhecidos, e processos para ligar operacionalmente tais elementos são rotina no estado da técnica (ver por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley and Sons, Baltimore MD 1987, e suplementos ao longo de 1995)). e promotores de

Promotores úteis para expressar uma molécula de ácido nucleico de interesse podem ser quaisquer de uma gama de promotores de ocorrência natural conhecidos por serem operacionais em plantas ou animais, como desejado. Promotores que dirigem a expressão em células de orgãos reprodutivos masculinos ou femininos de uma planta são úteis para gerar uma planta transgénica ou um par de plantas reprodutoras da invenção. Os promotores úteis na presente invenção podem incluir promotores constitutivos que são geralmente activos na maior parte, ou em todos os tecidos de uma planta; promotores indutiveis que são geralmente inactivos ou exibem um baixo nível basal de expressão e podem ser induzidos para terem uma actividade relativamente elevada por contacto com células com um agente indutor adequado; promotores específicos do tecido (ou preferidos do tecido), que geralmente são expressos em apenas uma ou nalgumas células em particular (por ex. células de anteras de plantas); 29 desenvolvimento ou específicos da fase, que são apenas activos durante um período definido durante o crescimento ou desenvolvimento de uma planta. Os promotores podem ser frequentemente modificados se necessário, para variar o nível de expressão. Determinadas concretizações compreendem promotores exógenos às espécies a serem manipuladas. Por exemplo, o gene Ms45 introduzido no plasma germinativo ms45ms45 do milho pode ser conduzido por um promotor isolado de outra espécie de planta; uma construção de gancho para cabelo pode então ser desenhada para tomar como alvo o promotor exógeno da planta, reduzindo a possibilidade de interacção de gancho de cabelo com promotores endógenos não de alvo do milho. A título de exemplo promotores constitutivos incluem o promotor do vírus 35S do mosaico da couve-flor (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), o promotor de ubiquitina do milho (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); o promotor nuclear do promotor Rsyn7 e os outros promotores constitutivos revelados na WO 99/43838 e Patente US N° 6,072,050; actina do arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); pEMU (Last et al; (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patente US N° 5,659,026); promotor de actina do arroz (Patente US N° 5,641,876; WO 00/70067), promotor da histona do milho (Brignon et al., Plant Mol. Biol 22(6):1007-1015 (1993); Rasco-Gaunt et al., Plant Cell Rep. 21 (6):569-576 (2003)) e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles descritos na Patente US Nos 5,608,144 e 6,177,611, e a publicação PCT WO 03/102198.

Elementos reguladores específicos do tecido, preferidos do tecido, ou específicos da fase incluem ainda, por exemplo, o elemento regulador AGL8/ FRUITFULL, que é 30 activado por indução floral (Hempel et al., Development 124:3845-3853, 1997); elementos reguladores específicos da raiz, tais como os elementos reguladores do gene RCP1 e o gene LRP1 (Tsugeki e Fedoroff, Proc. Natl. Acad., USA 96:12941-12946, 1999; Smith e Fedoroff, Plant Cell 7:735-745, 1995); elementos reguladores específicos da flor, tais como os elementos reguladores do gene LEAFY do gene APETALA1 (Blazquez et al., Development 124:3835-3834, 1997; Hempel et al. supra, 1997); elementos reguladores específicos da semente, tal como o elemento regulador do gene da oleoresina (Plant et al., Plant Mol. Biol. 25:193-205), e elemento regulador específico da zona de deiscência. Elementos reguladores adicionais específicos do tecido ou específicos da fase incluem o promotor Znl3 que é um promotor específico do pólen (Hamilton et al., Plant Mol. Biol. 18:211-218, 1992); o promotor UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO), que é activo no meristema do rebento apical; o promotor activo nos meristemas do rebento (Atanassova et al., Plant J. 2:291, 1992), o promotor cdc2 e o promotor cyc07 (ver, por exemplo, Ito et al., Plant Mol. Biol. 24: 863-878, 1994; Martinez et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 89:7360, 1992); os promotores meristemáticos preferidos meri-5 e H3 (Medford et al., Plant Cell 3:359, 1991; Terada et al., Plant J. 3:241, 1993); promotores preferidos meristemáticos e do floema dos genes relacionados com Myb na cevada (Wissenbach et al., Plant J. 4:411, 1993); Arabidopsis cyc3aAt e cyclAt (Shaul et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 4868-4872); C. roseus cyclins CYS a CYM (Ito et al. (1997) Plant J. 11: 983-992); e Nicotiana CyclinBl (Trehin et al. (1997) Plant Mol. Biol. 35:667-672); o promotor do gene da APETALA3, que é activo no meristema floral (Jack et al., Cell 76:703, 1994; Hempel et al., supra 1997); um promotor de um membro da família semelhante a agamá (AGL), por exemplo, AGL8, que é activo 31 no meristema do rebento na transição para a fluorescência (Hempel et ai., supra 1997); promotores da zona da abcisão floral; promotores específicos Ll; o promotor poligalacturonase que reforça o amadurecimento do tomate (Nicholass et al., Plant Mol. Biol. 28:423-435 (1995)), o promotor E8 (Deikman et al., Plant Physiol. 100:2013-2017 (1992) ), e o promotor 2A1 específico do fruto, promotores U2 e U5 ARNsn do milho, o promotor Z4 de um gene que codifica para a proteína zeína Z4 22kD, o promotor Z10 de um gene que codifica para uma proteína zeína de 10 kD, um promotor Z2 7 de um gene que codifica para uma proteína zeína de 27kD, o promotor A20 do gene que codifica para uma proteína zeína de 19 kD, e semelhantes. Além disso, promotores específicos de tecido adicionais podem ser isolados utilizando métodos bem conhecidos (ver por ex. US pat N° 5,589,379). Promotores preferidos dos rebentos incluem promotores preferidos do meristema do rebento, tal como os promotores revelados em Weigel et al. (1992) Cell 69:843-859 (N° de acesso M91208); N° de acesso AJ131822; N° de acesso Z71981; N° de acesso AF049870 e promotores preferidos dos rebentos revelados em McAvoy et al. (2003) Acta Hort. (ISHS) 625:379-385. Promotores preferidos de inflorescência incluem o promotor da chalcone sintase (Van der Meer et al. (1992) Plant J. 2 (4):525-535), promotor específico da antera LAT52 (Twell et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217:240-245), específico do pólen Bp4 (Albani et al (1990) Plant Mol Biol 15:605, maize pollen-specific gene Zml3 (Hamilton et al. (1992) Plant. Mol. Biol. 18:211-218; Guerrero et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 224:161:168), promotores específicos do microsporo tais como o promotor do gene apg (Twell et al., Sex. Plant. Reprod. 6:217-224 (1993) ), e promotores específicos de tapetum tal como o promotor do gene TA29 (Mariani et al., Nature 347 : 737, 1990; Pat. US N° 6,372,967), e outros promotores 32 específicos dos estames, tal como o promotor do gene MS45, promotor do gene 5126, promotor do gene BS7, promotor do gene PG47 (US 5,412,085; US 5,545,546; Plant J. 3(2):261-271 (1993)), o promotor do gene SGB6 (US 5,470, 359), promotor do gene G9 (5,8937,850; 5,589,610), promotor do gene SB200 (WO02/26789), ou semelhantes (ver Exemplo 1). Promotores preferidos do tecido de interesse incluem ainda um gene SF3 expresso pelo pólen do girassol (Baltz et al. (1992) The Plant Journal 2:713-721), genes específicos do pólen de B. napus (Amoldo et al. (1992) J. Cell. Biochem, Abstract N° Y101204). Promotores específicos do tecido incluem ainda aqueles reportados por Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2):255-265 (psaDb); Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803 (PsPALl); Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343 (ORF13); Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168 (waxy ou ZmGBS; 27kDa zein, Zm727; osAGP; osGTl); Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341 (Fbl2A de algodão); Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535 (Nicotiana SodAl e SodA2); Canesvacini et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2):513-524 (Nicotiana ltpl); Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778 (Pinus cab-6 promoter); lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138 (spinach rubisco activase(Rca)) ; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90(20):9586-9590 (PPDK promoter); e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4 (3):495-505 (Agrobacterium pmas promotor). Um promotor específico do tecido que é activo em células de orgãos reprodutores de machos, ou fêmeas pode ser útil na presente invenção.

Promotores "preferidos das sementes" incluem tanto os promotores "específicos das sementes" (aqueles promotores que são activos durante o desenvolvimento da semente, tais como os promotores das proteínas de armazenamento das 33 sementes), assim como promotores da "germinação da semente" (aqueles promotores activos durante a germinação da semente). Ver Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108. Tais promotores preferidos das sementes, incluem, mas não se encontram limitados a, Ciml (mensagem induzida pela citoquinina), CZ19B1 (zeina de 19 kDa do milho), milps (mio-inositol-l-fosfato sintase); ver WOOO/11177 e Pat. US n° 6.225.529. A gama zeina é um promotor especifico de endoespérmicas. Globulin-1 (Glob-1) um promotor representativo especifico do embrião. Para as dicotiledóneas, os promotores específicos das sementes, incluem, mas não estão limitadas à β-faseolina do feijão, napin, β-conglicina, lectina de soja, cruciferina, e semelhantes. Para as monocotiledóneas os promotores específicos das sementes incluem, mas não se encontram limitadas a, zeina de milho de 15 kDa, zeina de 22 kDa, zeina de 27 kDa, gama zeina, amiloide, contraído 1 ("shrunkenl"), contraído 2("shrunken2"), globulina 1, etc. Ver também WO 00/12733 e Patente de invenção US 6,528,704 em que os promotores preferidos das sementes dos genes endl e end2 são revelados. Promotores específicos adicionais dos embriões são revelados em Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. 93:8117-8122 (rice homeobox, OSH1); e Postma-Haarsma et al. (1999) Plant. Mol. Biol. 39:257-71 (rice

KNOX genes). Promotores específicos adicionais de endoespérmicas são revelados em Albani et al. (1984) EMBO 3:1405-15; Albani et al. (1999) Theor. Appl. Gen. 98:1253- 62; Albani et al. (1993) Plant J. 4:343-55; Mena et al. (1998) The Plant Journal 116:53-62 (barley DOF); Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12:235-46 (maize Esr); e Wu et al. (1998) Plant Cell Physiology 39:885-889 (arroz GluA- 3, GluB-1, NRP33, RAG-1).

Um elemento regulador indutível é um elemento que é capaz de activar directamente ou indirectamente a 34 transcrição de uma ou várias sequência de ADN ou de genes em resposta a um indutor. 0 indutor pode ser um agente químico, tal como uma proteína, um metabolito, um regulador de crescimento, um herbicida ou composto fenólico; ou um stress fisiológico, tal como o imposto directamente pelo calor, frio, sal, ou elementos tóxicos, ou indirectamente através da acção de um patogéneo ou agente da doença, tal como um vírus; ou outro agente físico ou biológico ou condição ambiental. Uma célula de planta contendo um elemento regulador indutível pode ser exposto a um indutor aplicando externamente o indutor à célula ou planta, tal como pulverizando, regando, aquecendo, ou através de processos semelhantes. Um agente indutor útil para induzir a expressão de um promotor indutível é seleccionado com base no elemento regulador indutível particular. Em resposta à exposição a um agente indutor, a transcrição do elemento regulador indutível é geralmente iniciado de novo ou é aumentado acima de um nível basal ou constitutivo de expressão. Tipicamente o factor proteico que se liga especificamente a um elemento regulador indutível para activar a transcrição encontra-se presente numa forma inactiva que é então convertido directamente ou indirectamente na forma activa pelo indutor. Qualquer promotor indutível pode ser utilizado na presente invenção (ver Ward et al., Plant Mol. Biol. 22:361-366, 1993).

Exemplos de elementos reguladores indutíveis incluem um elemento regulador de metalotioneína, um elemento regulador indutível pelo cobre, ou um elemento regulador indutível pela tetraciclina, cuja transcrição pode ser efectuada em resposta a iões metálicos divalentes, ccobre ou tetraciclina, respectivamente (Furst et al., Cell 55:705-717, 1988; Mett et al., Proc. Natl Acad. Sei., USA 90:4567-4571, 1993; Gatz et al., Plant J. 2:397-404, 1992; Roder et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994). Elementos 35 reguladores indutíveis também incluem um elemento regulador de ecdisona, ou um elemento regulador glucocorticoide, cuja transcrição pode ser efectuada em resposta à ecdisone ou a outro esteroide (Christopherson et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 89:6314-6318, 1992; Shena et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 88:10421-10425, 1991; Patente de invenção US N° 6,504,082); um elemento regulador que responde ao frio, ou um elemento regulador de choque de calor, cuja transcrição pode ser efectuada em resposta à exposição ao frio ou ao calor, respectivamente (Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992); o promotor do gene da desidrogenase do álcool (Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982); Walker et al., PNAS 84 (19):6624-6628 (1987)) indutíveis por condições anaeróbicas; e o promotor indutível pela luz derivado do gene rbcS da ervilha ou do gene da ervilha psaDb (Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2): 255-265); um elemento regulador indutível pela luz (Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991; Lam e Chua, Science 248:471, 1990: Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90(20):9586-9590; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138) um elemento regulador indutível por uma hormona de planta (Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, (1990), e semelhantes. Um elemento regulador indutível pode ser também o promotor do gene do milho ln2-l ou ln2-2 que responde a antídotos herbicidas de benzenosulf onamida (Hershey et al., Mol. Gen. Gene. 227:229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994), e o repressor Tet do transposão TnlO (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991). Promotores indutíveis pelo stress incluem promotores indutíveis por stress sal/água tal como P5CS (Zang et al. (1997) Plant Sciences 129:81-89); promotores indutíveis pelo frio, tal como corl5a (Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), 36 corl5b (Wihelm et al. (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077), wscl20 (Ouellet et al. (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch et al (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909), ci21A (Schneider et al. (1997) Plant Physiol. 113:335-45); promotores indutíveis pela geada, tal como, Trg-31 (Chaudhary et al (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57), rd29 (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); promotores indutíveis osmóticos, tal como Rabl7 (Vilardell et al. (1991) Plant. Mol. Biol. 17-985-93) e osmotin (Raghothama et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28); e promotores indutíveis pelo calor, tais como proteínas de choque por calor (Barros et al. (1992) Plant Mol. 19.665-75; Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47:325-338), e o elemento indutível por choque de calor do promotor da ubiquitina da salsa (W003/102198) . Outros promotores indutíveis pelo stress incluem rip2 (Patente de invenção US N° 5,332,808 e Publicação US N° 2003/0217393) e rd29a (Yamaguchi-Shinozaki et al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340). Determinados promotores são indutíveis por ferimento, incluindo o promotor pmas de Agrobacterium (Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505) e o promotor de Agrobacterium ORF13 (Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343).

Elementos reguladores adicionais activos em células de plantas e úteis nos métodos ou composições da invenção incluem, por exemplo, o elemento de regulação do gene da nitrito redutase do espinafre (Back et al., Plant Mol. Biol. 17:9, 1991); um promotor gama da zeína, um promotor olel6 de uma oleoresina, um promotor de globulina I, um promotor de uma actina I, um prommotor cl de uma actina, um promotor da sacarose sintetase, um promotor INOPS, um promotor EXM5, um promotor de globulina 2, um b-32, um promotor da ADPG da pirofosforilase, um promotor Ltpl, um 37 promotor Ltp2, um promotor olel7 de uma oleoresina, um promotor olel8 de uma oleoresina, um promotor de actina 2, um promotor específico de uma proteína do polén, um promotor do gene pectato liase específico do polén ou promotor do gene PG47, um promotor do gene RTS2 específico da antera, promotor do gene SGB6, ou um promotor do gene G9, um promotor específico do gene RAB24 de tapetum, um promotor da subunidade alfa da antranilato sintase, um promotor da zeína alfa, um promotor da subunidade beta da antranilato sintase, um promotor da dihidrodipicolinato sintase, um promotor Thi I, um promotor da álcool desidrogenase, um promotor da proteína de ligação cab, um promotor H3C4, um promotor da enzima de ramificação RUBISCO SS do amido, um promotor da actina 3, um promotor da actina 7, um promotor da proteína reguladora GF14-12, um promotor L9 da proteína ribossomal, um promotor da enzima biossintética da celulose, um promotor da S-adenosil-L-homocisteína hidrolase, um promotor da superóxido dismutase, um promotor do receptor da C-cinase, um promotor da fosfoglicerato mutase, um promotor do ARNm RCc3 específico da raiz, um promotor da glucose-6-fosfato isomerase, um promotor da pirofosfato-frutose-6-fosfato-I-fosfotransferase, um promotor de beta-cetoacil-ACP sintase, um promotor do fotosistema 11 de 33 kDa, um promotor da proteína de desprendimento de oxigénio, um promotor da subunidade da ATPase vacuolar de 69 kDa, um promotor do gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, um promotor indutível da proteína semelhante a ABA e promotor de proteína do amadurecimento indutível, um promotor da fenilalanina amónia liase, um promotor da adenosina trifosfatase S-adenosil-L-homocisteína hidrolase, um promotor da calcone sintase, um promotor da zeína, um promotor da globulina 1, um promotor da proteína que se liga à auxina, um promotor do gene da UDP glucose 38 flavonoide glicosil-transferase, um promotor NTI, um promotor de actina, e um promotor da opaca 2.

Pode ser introduzida uma molécula de ácido nucleico exógena numa célula como uma molécula de ADN nua, pode ser incorporada numa matriz, tal como um lipossoma, ou uma partícula, tal como uma partícula virai, ou pode ser incorporada num vector. A incorporação de um polinucleótido num vector pode facilitar a manipulação do polinucleótido, ou introdução do polinucleótido numa célula de planta. Neste contexto, o vector pode ser derivado de um plasmídeo ou pode ser um vector virai tal com um vector de ADN-T (Horsch et al., Science 227:1229-1231 (1985)). Se desejado, o vector pode incluir componentes de um elemento transponível de uma planta, por exemplo, um transposão DS (Bancroft e Dean, Genetics 134:1221-1229, 1993) ou um transposão Spm (Aarts et al., Mol. Gen. Genet. 247:555-564, 1995).Para além de conter o transgénico de interesse, o vector também pode conter várias sequências nucleótidicas que facilitam, por exemplo a recuperação do vector a partir de uma célula de planta transformada; a sub-cultura de um vector numa célula hospedeira que pode ser uma planta, um animal, uma bactéria, ou uma célula hospedeira de um insecto; ou a expressão de uma sequência nucleótidica de codificação no vector, incluindo toda, ou uma porção de uma região de codificação recuperada. Como tal, um vector pode conter qualquer um de vários elementos adicionais de transcrição e de translacção, incluindo promotores constitutivos e indutíveis, amplificadores e semelhantes (por exemplo, Bitter et al., Meth. Enzymol. 153:516-544, 1987). Por exemplo, um vector pode conter elementos úteis para uma sub-cultura, crescimento ou expressão num sistema bacteriano, incluindo uma origem de replicação bacteriana; um promotor, que pode ser indutível, e semelhantes. Um vector pode também conter um ou vários locais de 39 reconhecimento e de cisão pela endonucleases de restrição, incluindo, por exemplo, uma sequência de de poli-ligação para facilitar a inserção, ou remoção de um transgénico.

Para além de, ou em alternativa a uma sequência nucleótidica relevante para um gene de fertilidade (por ex. um ARNhp compreendendo uma repetição invertida de um promotor do gene de fertilidade, ou uma sequência de codificação de um gene de fertilidade, isoladamente ou ligado operacionalmente a um promotor heterólogo), uma molécula de ácido nucleico exógena, ou um vector que contém um tal transgénico pode obter uma ou várias outras sequências nucleótidicas expressáveis que codificam para um ARN, ou para um polipéptido de interesse. Por exemplo, a sequência nucleótidica adicional pode codificar uma molécula de ácido nucleico anti-sentido; uma enzima tal como a β-galactosidase, β-glucuronidase, luciferase, fosfatase alcalina, glutationa α-transferase, cloroanfenicol acetiltransferase, guanina xantina fosforibosiltransferase, e neomicina fosfotransferase; um polipéptido virai ou uma sua porção peptidica; ou um factor de crescimento da planta ou hormona.

Em determinadas concretizações, o vector de expressão contém um gene que codifica para um marcador de selecção que se encontra funcionalmente ligado a um promotor que controla a iniciação da transcrição. Para uma descrição geral de vectores de expressão de uma planta e genes repórter, ver Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods of Plant Molecular Biology e Biotechnology 89-119 (CRC Press, 1993). Utilizando o termo, pretende-se incluir todos os tipos de marcadores de selecção, quer sejam pontuais, ou selectivos. A expressão de uma tal sequência nucleótidica pode disponibilizar meios para seleccionar uma célula contendo a construção, por exemplo, conferindo um fenótipo desejado a uma célula de 40 planta contendo a sequência nucleótidica. Por exemplo, a sequência nucleótidica adicional pode ser, ou codificar para um marcador seleccionável, que quando presente, ou expresso numa célula de planta disponibiliza um meio de identificar a célula de planta contendo o marcador.

Um marcador selecionável disponibiliza um meio para pesquisar uma população de organismos ou célula de um organismo (por ex. plantas, ou células de plantas) para identificar aquelas que possuem o marcador e, por isso, o transgénico de interesse. Um marcador seleccionável confere geralmente uma vantagem selectiva à célula, ou a um organismo (por ex. uma planta) contendo a célula, por exemplo, a capacidade de crescer na presença de um agente negativo selectivo, tal como um antibiótico ou, para uma planta, um herbicida. Uma vantagem selectiva pode também ser devida, por exemplo a uma capacidade reforçada ou nova de utilizar um composto adicionado como nutriente, um factor de crescimento, ou uma fonte de energia. Uma vantagem selectiva pode ser conferida através de um polinucleótido único, ou pelo seu produto de expressão, ou através de uma combinação de polinucleótidos, cuja expressão numa célula de planta dá à célula uma vantagem selectiva positiva, uma vantagem selectiva negativa, ou ambas. Deveria ser reconhecido que a expressão do transgénico de interesse (por ex. que codifica para um ARNhp) também disponibiliza um meio de seleccionar células contendo a sequência nucleótidica de codificação. Contudo, a utilização de um marcador seleccionável adicional, que por exemplo, permite a uma célula de planta sobreviver em condições que de outra forma seriam tóxicas, disponibiliza um meio de enriquecer em células de plantas transformadas contendo os transgénicos desejados. Exemplos de genes de pontuação, ou de selecção adequados conhecidos no estado da técnica podem ser encontrados por exemplo, em Jefferson et 41 al. (1991) em Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pp 1-33; DeWet et al. Mol. Cell. Biol. 7:725-737, 1987; Goff et al., EMBO J. 9:2517-2522, 1990; Kain et al., BioTechniques 19:650-655, 1995; e Chiu et al., Curr. Biol.6: 325-330, 1986.

Exemplos de marcadores seleccionáveis incluem aqueles que conferem resistência a antimetabolitos, tais como herbicidas ou antibióticos, por exemplo, dihidrofolase redutase, que confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13:143-149, 1994; ver também Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, 1983; Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991); neomicina fosfotransferase que confere resistência aos aminoglicósidos neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983) e higro, que confere resitência à higromicina (Marsh, Gene 32:481-485, 1984; ver também Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985; Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1195); trpB que permite às células ultilizarem indole em vez de triptofano; hisD que permite às células utilizarem histinol em vez de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 85:8047, 1988); manose-6-fosfato isomerase que permite às células utilizarem manose (WO94/20627); ornitina descarboxilase que confere resistência ao inibidor da ornitina descarboxilase, 2-(difluormetil)-DL-ornitina (DFMO; McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); e desaminase de Aspergillus terreus, que confere resistência à Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnology. Biochem. 59:2336-2338, 1995). Marcadores seleccionáveis adicionais incluem, por exemplo, uma EPSPV-sintase mutante, que confere resistência ao glifosato (Hinchee et al., Bio Technology 91:915-922, 1988), uma acetolactato sintase mutante, que confere resistência à imidazolinona ou 42 sulf onilureia (Lee et al., EMBO J. 7: 1241-1248, 1988), um psbA mutante que confere resistência à atrazina (Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, 1993), ou uma oxidase protoporfirinogénica mutante (ver Pat. US N° 5,767,373), ou marcadores que conferem resistência a um herbicida, tal como glufosinato. Exemplos de genes marcadores seleccionáveis adequados incluem, mas não se encontram limitados a genes que codificam para resistência ao cloroamfenicol (Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, 1983); estreptomicina (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210 : 86-91, 1987); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, 1996), bleomicin (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990); sulfonamida (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990); bromoxinil (Stalker et al., Science 242:419-423, 1988); glifosato (Shaw et al., Science 233:478-4.81, 1986); fosfinotricina (DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, 1987), e semelhantes. Uma opção para utilizar um gene selectivo é um ADN que codifica para a resistência ao glufosinato e numa concretização pode ser a fosfinotricina acetil transferase ("PAT") do gene PAT optimizado do milho, ou gene bar sob o controlo dos promotores CaMV 35S ou de ubiquitina. Os genes conferem resistência a bialaphos. Ver, Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimya et al., Biotechnology 11:835, 1993; White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990; e Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989). Uma versão do gene PAT é o gene PAT optimizado do milho, descrito na patente US N° 6,096,947.

Para além disso, os marcadores que facilitam a identificação de uma célula de uma planta contendo o polinucleótido que codifica para o marcador, incluem por exemplo, a luciferase (Giacomin, Plant Sei. 116:59-72, 1996; Scikantha, J. Bacteriol. 178:121, 1996), proteína 43 fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389:44-47, 1996; Chalfie et al., Science 263:802, 1994), e outras variantes de proteína fluorescente, ou β-glucuronidase (Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387, 1987; Jefferson et al., EMBO J. 6:3901-3907, 1987; Jefferson, Nature 342(6251):837-838, 1989); os genes do milho que regulam a produção de pigmento (Ludwig et al., Science 247;449, 1990; grotewold et al., PNAS 88:4587-4591, 1991; Cocciolone et al., Plant J 27(5):467-478, 2001; Grotewold et al., Plant Cell 10:721-740, 1998); β-galactosidase (Teeri et al., EMBO J. 8:343-350, 1989); luciferase (Ow et al., Science 234:856-859, 1986); cloranfenicol aceetiltransferase (CAT) (Lindsey e Jones, Plant Mol. Biol. 10:43-52, 1987); e muitos outros como aqui revelado ou como conhecido do estado da técnica. Tais marcadores podem também ser utilizados como moléculas repórter. Muitas variações de promotorees, marcadores seleccionáveis e outros componentes da construção estão disponíveis ao perito no estado da técnica. O termo "planta" utilizado aqui de forma geral inclui qualquer planta em qualquer qualquer fase de desenvolvimento, ou uma parte de uma planta, incluindo uma estaca, uma célula de planta, uma cultura de uma célula de planta, um orgão de uma planta, uma semente de uma planta, e uma plântula. Uma célula de planta é a unidade estrutural e fisiológica da planta, compreendendo um protoplasto e uma parede celular. Uma célula de planta pode-se encontrar na forma de uma célula única isolada ou agregado de células tal como um caule friável, ou uma célula cultivada, ou pode ser parte de uma unidade organizada superior, por exemplo, um tecido de planta, um orgão de planta, ou planta. Assim, uma célula de planta pode ser um protoplasma uma célula produtora de gâmeta, ou uma célula ou colecção de células que se podem regenerar numa planta completa. Como tal, uma semente que compreende células múltiplas de planta e é 44 capaz de se regenerar numa planta completa é considerada uma célula de planta para os fins deste documento. Um tecido de planta, ou um orgão de planta pode ser uma semente, um protoplasto, caule, ou qualquer outros grupos de células de plantas que se encontra organizado numa unidade estrutural ou funcional. Partes de uma planta particularmente úteis incluem partes possíveis de colher e partes úteis para a propagação das plantas descendentes. Uma parte possível de ser colhida de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta, por exemplo, flores, pólen, plântulas, tubérculos, folhas, caules, frutos, sementes, raízes, e semelhantes. Uma parte da planta útil para propagação inclui por exemplo, sementes, frutos, estacas, plântulas, tubérculos, rizomas e semelhantes.

Uma planta transgénica pode ser regenerada a partir de uma célula de planta geneticamente modificada, i.e. uma planta completa pode ser regenerada a partir de uma célula de planta; um grupo de células de plantas; um protoplasto; uma semente; ou um pedaço de uma planta tal como uma folha, um cotilédone, ou uma estaca. A regeneração dos protoplastos varia entre espécies de plantas. Por exemplo,pode ser efectuada uma suspensão de protoplastos e, em determinadas espécies a formação do embrião pode ser induzida a partir da suspensão do protoplasto até ao estádio de amadurecimento e germinação. 0 meio de cultura contém geralmente vários componentes necessários ao crescimento e regeneração, incluindo, por exemplo, hormonas, tais como as auxinas e citoquininas; e aminoácidos tais como ácido glutâmico e prolina dependendo da espécie de planta em particular. A regeneração eficiente vai depender, em parte do meio, do genótipo e da história da cultura e é reprodutível se estas variáveis forem controladas. 45 A regeneração pode ocorrer a partir do caule da planta, explantes, orgãos, ou partes de plantas. A transformação pode ser efectuada no contexto da regeneração de orgão ou de parte de planta (ver Meth. Enzymol. Vol. 118; Klee et al. Ann. Rev. Plant Physiol. 38:467 (1987)). Utilizando a folha no método de regeneração de transformação do disco, por exemplo, os discos são cultivados em meios selectivos, seguindo-se a formação de rebentos em cerca de duas a quatro semanas (ver Horsh et al., supra, 1985). Rebentos que se desenvolveram são excisados a partir do caule e transplantados para um meio selectivo adequado indutor de raizes. Plântulas enraizadas são transferidas para o solo, o mais rapidamente possível após o aparecimento dos rebentos. As plântulas podem ser novamente envazadas de acordo com o necessário até atingirem a maturidade.

Em colheitas propagadas por sementes, as plantas transgénicas maduras podem ser auto-polinizadas para produzir uma planta resultante de um endocruzamento homozigótico. A planta resultante de endocruzamento produz sementes que contêm o transgénico introduzido e podem ser feitas crescer para produzir plantas que expressam o polipéptido. Métodos para reproduzir plantas e de selecção para plantas obtidas por cruzamento possuindo características desejadas ou outras características de interesse incluem aquelas aqui reveladas e outras bem conhecidas dos reprodutores de plantas.

Em vários aspectos da presente invenção, um ou mais transgénicos são introduzidos nas células. Quando utilizado em relação a um transgénico, o termo "introduzindo" significa a transferência da molécula de ácido nucleico exógena para uma célula. Uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida numa célula de planta através de uma variedade de processos. Por exemplo, o transgénico pode 46 estar contido num vector, pode ser introduzido numa célula de planta utilizando um processo de transferência de genes directos tal como a electroporação ou transformação mediada por microprojécteis, ou utilizando transformação mediada por Agrobacterium. Quando aqui utilizado, o termo "transformado" refere-se a uma célula de planta contendo uma molécula de ácido nucleico introduzida de forma exógena.

Uma ou várias moléculas de ácido nucleico exógenas podem ser introduzidas em células de plantas utilizando qualquer um dos numerosos processsos de rotina bem conhecidos para transformação de plantas, incluindo protocolos de transformação biológica e física das plantas (ver, por ex. Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants"; In Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, Edts. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pág. 67-68). Para além disso, vectores de expressão e processos de cultura in vitro para células de plantas ou transformação de tecido e regeneração de plantas são rotina e bem conhecidos (ver, por ex., Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation"; Id. nas págs. 89-119).

Processo adequados de transformação de células de plantas incluem microinjecção, Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334; electroporação, Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606; transformação mediada por Agrobacterium, ver por exemplo, Towsend et al. patente US 5,563,055; transferência directa de genes, Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722; e aceleraçao balística de partículas, ver por exemplo, Sanford et al Patente de invenção US 4,945,050; Tomes et al. (1995) in Plant Cell , Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Philips (Springer-

Verlag, Berlim); e McCabe et al. (1988) Biotechnology 47 6:923-926. Ver também Weissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Datta et al. (1990) Bioteechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559.563 (milho); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839; Hooydaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G. P. Chapman et al. (Longman, Nova Iorque), pág. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (whisker-mediated transformation); D. Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 e Christou et al. (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens); em que todas estas referências são aqui incorporadas por referência. A transformaçção mediada por Agrobacterium disponibiliza métodos úteis para introduzir um transgénico em plantas (Horsch et al., Science 227:1229 1985). A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias patogénicas do solo de plantas que transformam geneticamente células de plantas. Os plasmídeoos Ti e Ri de A. tumef aciens e A. rhizogenes, respectivamente, transportam genes responsáveis pela transformação genética da planta (ver por ex. Kado, Crit. Rev. Plant Sei. 10:1, 1991; ver também Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238, 1989; Pat US N° 5,591,616; 48 W099/47552; Weissbach e Weissbach, "Methods for Plant Molecular Biology" (Academic Press, NI 1988), secção VIII, páginas 421-463; Grierson e Corey, "Plant Molecular Biology" 2a Ed. (Blackie, Londres 1988), Capítulos 7-9; ver, também, Horsh et al., supra, 1985).

No que diz respeito a A. tumefaciens a forma do tipo selvagem contém um plasmídeo Ti que dirige a produção tumorigénica do crescimento da coroa de galha nas plantas hospedeiras. A transferência da região de ADN-T indutora de tumor do plasmídeo Ti para o genoma de uma planta necessita do plasmídeo Ti codificado pelos genes da virulência, assim como das fronteiras de ADN-T que são colocadas para dirigir as repetições de ADN que delineiam a região a ser transferida. Um vector baseado em Agrobacterium é uma forma modificada de um plasmídeo Ti, em que as funções indutoras de tumor são substituídas por uma sequência nucleótidica de interesse que é para ser introduzida no hospedeiro da planta. Processos de utilização de transformação mediada por Agrobacterium incluem co-cultura de Agrobacterium com protoplastos cultivados isolados; transformação de células de plantas ou tecidos com Agrobacterium; e transformação de tecidos, ápices ou meristemas com Agrobacterium. Além disso, a transformação de plantas pelo Agrobacterium pode ser efectuada utilizando infiltração por vácuo de uma suspensão de células de Agrobacterium (Bechtold et al., C. R. Acad. Sei. Paris 316:1194, 1993).

Transformação mediada pelo Agrobacterium pode utilizar vectores co-integrados ou sistemas de vectores binários, em que os componentes do plasmídeo Ti são divididos entre um vector auxiliar, que reside permanentemente no hospedeiro de Agrobacterium e transporta os genes de virulência, e um vector de vai-vém que contém o gene de interesse ligado por sequências de ADN-T. Os vectores binários são bem conhecidos do estado da técnica (ver, por exemplo, De 49

Framond, BioTechnology 1:262, 1983; Hoekema et al., Nature 303:179, 1983) e encontram-se comercialmente disponíveis (Clontech; Paio Alto CA) . Para a transformação, a Agrobacterium pode ser co-cultivada, por exemplo, com células de plantas ou tecido ferido, tal como tecido de folha, explantes de raízes, hipocotilos, cotilédones, partes de caules ou tubérculos (ver, por exemplo, Glick e Thompson, "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (Boca Raton FL, CRC Press 1993)). Células feridas no tecido da planta que foram infectadas com Agrobacterium podem desenvolver orgãos de novo, quando cultivadas nas condições adequadas; os rebentos transgénicos resultantes dão origem a plantas transgénicas que contêm o polinucleótido introduzido. A transformação mediada pelo Agrobacterium foi utilizada para produzir uma variedade de plantas transgénicas, incluindo, por exemplo, plantas transgénicas crucíferas tais como Arabidopsis, mustarda, colza e linho; plantas leguminosas transgénicas, tais como alfa-alfa, ervilha, soja, trevo e trevo branco; e plantas solanáceas transgénicas, tal como a beringela, petunia, batata, tabaco e tomate (ver, por exemplo, Wang et al., "Transformation of Plants and Soil Microorganisms" (Cambridge, University Press 1995)). Para além disso, a transformação mediada pelo Agrobacterium pode ser utilizada para introduzir uma molécula de ácido nucleico exógena na maça, faia preta, beladona, groselheira negra, cenoura, aipo, algodão, pepino, uva, rábano silvestre, alface, glória da manhã, melão vulgar, amargoseira, choupo, morango, cana-de-açúcar, girassol, avelã, espargo, arroz, trigo, sorgo, cevada, milho e outras plantas (ver, por exemplo, Glick and Thompson, supra, 1993; Hiei et al., Plant J. 6:271-282, 1994; Shimamoto, Science 270:1772-1773, 1995). 50

Estirpes adequadas de A. tumefaciens e vectores, assim como a transformação de Agrobactérias e meios de crescimento e selecção adequados são bem conhecidos do estado da técnica (GV3101, pMK9 ORK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204:383-396, 1986; (C58C1, pGV3850kan), Deblaere, Nucl. Acid Res. 13:4777, 1985; Bevan, Nucleic Acid Res. 12:8711, 1984; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sei. US 86:8467-8471, 1986; Koncz, Plant Mol. Biol. 20:963-976, 1992; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Em: Plant Molecular Biology Manual Vol. 2, gelvin e Schilperoort (Eds.), Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publ. (1994), 1-22; Patente de invenção europeia A-120516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Capitulo V; Fraley, Crit. Rev. Plant. Sei., 4: 1-46; An, EMBO J. 4:277-287, 1985) .

Quando aqui mencionado, a presente invenção disponibiliza vectores capazes de expressar genes de interesse sob o controlo de elementos reguladores. Em geral, os vectores deveriam funcionar em células de plantas. Por vezes poderá ser preferível possuir vectores que sejam funcionais em E. coli (por ex. produção d e proteína para criar anticorpos, análise de sequência de ADN, construções de inserções, obtendo quantidades de ácidos nucleicos). Vectores e procedimentos para clonagem e expressão em E. coli são discutidas em Sambrook et al. (supra). O vector de transformação, compreendendo o promotor da presente invenção operacionalmente ligado a uma sequência nucleótidica isolada numa cassette de expressão, pode também conter pelo menos uma sequência nucleótidica adicional para um gene para ser co-transf ormado no organismo. Alternativamente, as sequências adicionais podem ser disponibilizadas num outro vector de transformação. 51

Quando a molécula de ácido nucleico exógena está contida num vector, o vector pode conter elementos funcionais por exemplo sequências "de fronteira esquerda" e "fronteira direita" do ADN-T de Agrobacterium que permite a integração estável num genoma de uma planta. Além disso, são conhecidos métodos e vectores que permitem a geração de plantas transgénicas isentas de marcadores, por exemplo, em que um gene marcador seleccionável é perdido numa determinada fase do desenvolvimento da planta, ou repordução da planta, e incluem, por exemplo, processos de co-transformação (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13:151-161, 1989; Peng, Plant Mol. Biol. 27:91-104, 1995), ou métodos que utilizam enzimas capazes de promover recombinação homóloga em plantas (ver por ex. WO97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18:353-361, 1992; Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242:653-657, 1994; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230:170-176, 1991; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19:6373-6378, 1991; ver, também, Sambrook et al., supra, 1989).

Processos de transferência directa de genes podem ser utilizados para introduzir o transgénico desejado (ou transgénicos), em células, incluindo células de plantas que são refractárias a transformações mediadas pelo Agrobacterium (ver, por ex. Hiei et al., Plant J. 6:271-282, 1994; Pat US N° 5,591,616). Tais métodos incluem transferência de genes directa (ver patente de invenção europeia A 164 575), injecção, electroporação, processos biolisitcos tais como bombardeamento de partículas, transformação mediada pelo pólen, transformação do ARN da planta mediada por vírus, transformação mediada por lipossomas, transformação utilizando embriões imaturos feridos ou degradados pelas enzimas, ou caules embriogénicos feridos ou degradados por enzimas, e semelhantes. Processos de transferência directa de genes incluem métodos de transformação mediados por micro- 52 projécteis (biolísticos), em que o transgénico é transportado para a superfície de microprojécteis que medem de 1 a 4 mm. Um vector, particularmente um vector de expressão contendo o(s) transgénico(s) de interesse são introduzidos nos tecidos das plantas com um instrumento biolístico que acelera os microprojécteis para velocidades de 300 a 600 m/s, suficientes para penetrar nas paredes celulares das células e membranas (ver por ex. Sanford et al., Part. Sei. Technol. 5:27, 1987; Sanford, Trends Biotech. 6:299, 1988, Klein et al., Biotechnology 6:559-563, 1988; Klein et al., Biotechnology 10 :268, 1992). No milho, por exemplo, vários tecidos alvo, podem ser bombardeados com microprojécteis revestidos com ADN de modo a produzir plantas transgénicas, incluindo, por exemplo, caule (tipo I ou tipo II), embriões imaturos, e tecido de meristema.

Outros métodos de administração física de um transgénico para as plantas utiliza sonicação das células alvo (Zhang et al., BioTechnology 9:996, 1991); fusão de lipossomas ou esferoplastos (Deshayes et al., EMBO J. 4:2731, 1985; Christou et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 84:3962, 1987); precipitação com CaCl2 ou incubação com álcool polivinílico ou poli-L-ornitina (Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:61, 1985; Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451, 1982); e electroporação de protoplastos e células completas e tecidos (Donn et al., In "Abstracts of Vllth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture" IAPTC, A2-38, pág. 53, 1990; D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505,; Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61, 1994) .

Um processo de transferência de genes directo, tal como electroporação pode ser particularmente útil para introduzir moléculas de ácidos nucleicos exógenas numa célula, tal como numa célula de planta. Por exemplo, 53 protoplastos de plantas podem ser electroporados na presença de uma molécula de ácido nucleico recombinante, que pode estar num vector (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 82:5824, 1985). Impulsos eléctricos de força de campo elevada permeabilizam reversivelmente as membranas permitindo a introdução do ácido nucleico. Protoplastos de plantas electroporados formam novamente a parede celular, dividem-se e formam um caule de planta. A microinjecção pode ser efectuada como descrito em Potrykus e Spangenberg (eds.), Gene Transfer to Plants. Springer Verlag, Berlim, NI (1995). Uma célula de planta transformada contendo a molécula de ácido nucleico recombinante introduzida pode ser identificada devido à presença de um marcador seleccionável incluído na construção.

Como mencionado acima, a transformação mediada por microprojécteis também disponibiliza um processo útil para introduzir moléculas de ácido nucleico exógenas numa célula de planta (Klein et al. Nature 327:70-73, 1987). Este método utiliza microprojécteis tais como ouro ou tungsténio que são revestidos com a molécula de ácido nucleico desejada por precipitação com cloreto de cálcio, espermidina, ou polietileno glicol. As partículas de microprojécteis são aceleradas a alta velocidade num tecido de uma planta utilizando um aparelho tal como a pistola de apartículas BIOLISTIC PD-100 (BioRad; Hercules CA). A administração mediada por microporjécteis (“bombardeamento de partículas) é especialmente útil para transformar células de plantas que são difíceis de transformar ou de regenerar utilizando outros métodos. Processos de transformação utilizando processos biolísticos são bem conhecidos (Wan, Plant Physiol.104:37-48, 1984; Vasil, Biotecnology 11:1553-1558, 1993; Christou, Trends in Plant Science 1:423-431, 1996). Foi utilizada a transformação mediada por microprojécteis, por exemplo para gerar uma 54 variedade de espécies de plantas transgénicas, incluindo algodão, tabaco, milho, trigo, centeio, cevada, sorgo, arroz, choupo híbrido e papaia (ver Glick e Thompson, supra, 1993; Duan et al., Nature Biotech. 14:494-498, 1996; Shinamoto, Curr. Opin. Biotech. 5:158-162, 1994).

Um sistema de regeneração rápido para a produção de plantas transgénicas, tal como um sistema que produz trigo transgénico em dois a três meses (ver Eur. Pat. N° EP 0709462A2) também pode ser útil para produzir uma planta transgénica de acordo com um processo da invenção, permitindo assim uma identificação mais rápida das funções génicas. A transformação da maior partes das plantas dicotiledóneas é possível através dos processos acima descritos. As plantas monocotiledóneas podem também ser transformadas utilizando, por exemplo, processos biolísticos como descrito acima, transformação de protoplastos, electroporação de células parcialmente permeabilizadas, introdução de ADN utilizando fibras de vidro. Transformação mediada por Agrobacterium, e semelhantes. A transformação de plastídeos pode também ser utilizada para introduzir uma molécula de ácido nucleico numa célula de planta (Patente US N°s 5,451,513,5,545,817, e 5,545,818; WO 95/16783; McBride et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 91:7301-7305, 1994). A transformação de cloroplastos envolve a introdução de regiões de ADN de plastídeos clonados que ladeia uma sequência nucleótidica desejada, por exemplo, um marcador seleccionável conjuntamente com polinucleótidos de interesse, num tecido alvo adequado, utilizando, por exemplo, um processo de transformação biolística, ou de transformação de protoplasto (por ex. cloreto de cálcio ou transformação mediada por PEG). Uma até regiões flanqueantes de 1,5 kb ("sequências alvo") facilitam a recombinação homóloga com o 55 genoma do plastídeo, e permite a substituição ou modificção de regiões especificas do plastoma. Utilizando este processo, mutações pontuais nos genes do cloroplasto 16S ARNr e rps 12 que conferem resistência à espectinomicina e estreptomicina podem ser utilizados para transformação como marcadores seleccionáveis (Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 87:8526-8530, 1990; Staub e Maliga, Plant Cell 4:39-45, 1992), resultou em transformantes estáveis homopiasmáticos, numa frequência de aproximadamente uma por 100 bombardeamentos de folhas alvo. A presença de locais de clonagem entre estes marcadores permitiu a criação de um vector que toma como alvo um plastideo para introdução de genes estranhos (Staub e Maliga, EMBO J. 12:601-606, 1993). Aumentos substanciais na frequência de transformação são obtidos por substituição dos genes ARNr recessivos ou da proteína r de resistência a antibióticos com um marcador seleccionável dominante, o gene aadA bacteriano que codifica para a enzima destoxificante de espectinomicina aminoglicósido-3'-adeniltransferase (Svab e Maliga, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 90:913-917, 1993). Aproximadamente 15 a 20 ciclos de divisão celular a seguir à transformação são geralmente necessários para atingir o estado homoplastídico. A expressão plastídica em que os genes são inseridos por recombinação homóloga em todos os vários milhares de cópias do genoma do plastídeo circular presente em cada célula de planta, aproveita a vantagem do enorme número de cópias que é uma vantagem em relação a genes nuclearmente expressos para permitir níveis de expressão que podem exceder facilmente 10% da proteína total solúvel da planta.

As células que foram transformadas podem ser feitas crescer em plantas de acordo com processos convencionais. Ver, por exemplo McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser feitas crescer e 56 polinizadas com a mesma estirpe transformada ou estirpes diferentes e as plantas resultantes que possuem a expressão das caracteristicas fenotípicas desejadas podem ser identificadas. Duas ou mais gerações podem ser feitas crescer para assegurar que a expressão da caracteristica fenotipica desejada é mantida de forma estável e herdada.

As plantas adequadas para os objectivos da presente invenção podem ser monocotiledóneas ou dicotiledóneas e incluem, mas não estão limitadas ao milho, trigo, cevada, centeio, batata doce, feijão, ervilha, chicória, alface, couve, couve flor, bróculos, napo, rabanete, espinafres, espargos, cebola, alho, pimenta, aipo, abóbora, cânhamo, curgete, maça, pêra, marmelo, melão, ameixa, cereja, pêssego, tangerina, alperce, morango, uva, framboesa, amora silvestre, ananás, abacate, papaia, manga, banana, soja, tomate, sorgo, cana-de-açúcar, beterraba açúcareira, girassol, colza, trevo, tabaco, cenoura, algodão, alfa-alfa, arroz, batata, beringela, pepino, Arabidopsis thaliana, e plantas lenhosas, tais como coníferas e árvores de folha caduca. Assim, uma planta transgénica, ou uma célula de planta genticamente modificada da invenção pode ser angiospérmica ou gimnospérmica.

As angiospémicas estão divididas em duas grandes classes baseadas no número de cotilédones, que são folhas de sementes que geralmente armazenam ou absorvem a comida; uma angiospérmica monocotiledónea possui um cotilédone único, e uma angiospérmica dicotiledónea possui dois cotilédones. As angiospérmicas produzem uma variedade de produtos úteis incluindo materiais tais como madeira, borracha, e papel; fibras tais como algodão e linho; ervas e medicamentos, tais como quinino e vinblastina; flores ornamentais, tais como rosas, e onde incluídas no âmbito da presente invenção, orquídeas; e alimentos, tais como grãos, óleos, frutos e vegetais. As angiospérmicas abrangem uma 57 variedade de plantas que florescem, incluindo por exemplo plantas de cereais, plantas leguminosas, plantas oleaginosas, árvores de madeira lenhosa, plantas que frutificam e flores ornamentais, cujas classes gerais não são necessariamente exclusivas. Plantas de cereais que produzem um grão vegetal, incluem por exemplo, milho arroz, trigo, cevada, aveia, centeio, erva dos pomares, erva da guiné, e sorgo. Plantas leguminosas incluem membros da família da ervilha (Fabaceae) e produzem um fruto característico conhecido por legume. Exemplos de plantas leguminosas incluem, por exemplo, soja, ervilha, grão-de-bico, vigna aconitifolia, feijão largo, feijão comum, feijão-de-lima, lentilha, feijão-fradinho, feijão seco, e amendoim, assim como alfa-alfa, comichão, trevo e sanfeno. Plantas oleaginosas que possuem sementes que são úteis como fonte de óleo, incluem soja, girassol, colza (canola) e semente de algodão. As angiospermicas também incluem árvores de madeira lenhosa que são plantas lenhosas perenes que geralmente possuem um caule único (tronco). Exemplos de tais árvores incluem amieiro, freixo, faia preta, tília americana (tílias) faia, bétula, cerejeira, algodoeiro, ulmeiro, eucalipto, nogueira americana, locusta, ácer, carvalho, diospiro, choupo, sicómoro, aveleira, sequoia, e salgueiro. As árvores são úteis por exemplo como fonte de pasta para papel, papel, material estrutural e fuel.

As angiospérmicas produzem sementes encerradas num ovário amadurecido. Um fruto de angiospérmica pode ser adequado para consumo humano, ou animal ou para a recolha de sementes para propagar as espécies. Por exemplo, o lúpulo é um membro da família da amoreira que é valorizado devido à sua aromatização do licor de malte. Angiospérmicas que frutificam também incluem uvas, a laranja, limão, toranja, abacate, tâmara, pêssego, cerejeira, oliveira, ameixa, coco, maçã e pereiras e amora silvestre, mirtilo, 58 groselha, morango, ananás, tomate, pepino e beringela. Uma flor ornamental é uma angiospérmica cultivada devido à sua flor decorativa. Exemplos de flores ornamentais comercialmente importantes incluem a rosa, lirio, tulipa e crisântemo, boca-de-lobo, camélia, cravo e petúnias, e podem incluir orquídeas. Será também reconhecido que a presente invenção pode também ser praticada utilizando gimnospérmicas que não produzem sementes num fruto.

Determinadas concretizações desta invenção ultrapassam o problema da manutenção de características homozigóticas recessivas, quando se utiliza uma estratégia de restauração transgénica, enquanto que se diminui o número de plantas, plantações e passos necessários para a manutenção das plantas com tais características. A homozigosidade é uma condição genética que existe quando alelos idênticos residem no local correspondente nos cromossomas homólogos. A heterozigosidade é uma condição genética que existe, quando diferentes alelos residem nos locais correspondentes nos cromossomas homólogos. A hemizigosidade é uma condição genética que existe, quando há apenas uma cópia do gene (ou conjunto de genes) sem um correspondente alélico no cromossoma irmão. A manutenção da condição recessiva homozigótica para a esterilidade macho é conseguida introduzindo numa planta uma construção transgénica de restauração que se encontra ligada a uma sequência que interfere com a formação, função, ou dispersão dos gâmetas masculinos da planta, para criar uma planta de "manutenção", ou "doadora". 0 transgénico de restauração por introdução numa planta que é homozigótica recessiva para a característica genética de esterilidade masculina, restaura a função genética daquela característica. Devido ao gene ligado conduzido por um promotor específico do gâmeta masculino, todo o pólen que contém o transgénico de restauração é tornado não viável. 59

Todo o pólen viável produzido contém uma cópia do alelo recessivo, mas não contém o transgénico de restauração. 0 transgénico é mantido no estado de hemizigosidade na planta de manutenção. 0 pólen da planta de manutenção pode ser utilizado para fertilizar plantas que são homozigóticas para o traço caracteristico, e a descendência vai por isso reter a sua condição homozigótica recessiva. A planta de manutenção contendo a construção transgénica de restauração é propagada por auto-fertilização com metade da semente resultante utilizada para produzir mais plantas que são homozigóticas recessivas para o gene de interesse e homozigóticas para a construção transgénica de restauração. A planta de manutenção serve como doador de pólen à planta que tem a condição a caracteristica homozigótica recessiva. A planta de manutenção é produzida de forma óptima a partir de uma planta que possui uma caracteristica homozigótica recessiva e que também possui sequências nucleótidicas ai introduzidas que iriam restaurar a caracteristica criada pelos alelos homozigóticos recessivos. Além disso, a sequência de restaurar encontra-se ligada às sequências nucleótidicas que interferem com a função, formação ou dispersão dos gâmetas masculinos. 0 gene pode operar de modo a evitar a formação de gâmetas masculinos ou evitar a função dos gâmetas masculinos através de qualquer uma das modalidades bem conhecidas e não se encontra limitada a uma metodologia particular. A titulo de exemplo, mas não sendo uma limitação isto pode incluir a utilização de um ou vários genes que expressam um produto citotóxico para os gâmetas masculinos (ver por exemplo Pat US Nos 5,792,853; e 5,689,049; PCT/EP89/00495); inibe a formação de produto de um outro gene importante para a formação de gâmetas masculinos, função, ou dispersão (ver, Patente US N°os 60 5,859,341 e 6,297,426); combinam-se com outro produto genético para produzir uma substância que evita a formação, função, ou dispersão de gâmeta (ver Patente US Nos 6,162,964; 6,013, 859; 6,281,348; 6,399,856; 6,248,935; 6,750,868; e 5,792,853); são anti-sentido em relação a ou podem provocar a co-supressão de um gene critico para a formação do gâmeta masculino, função, ou dispersão (ver Patentee US N°s 6,184,439; 5728,926; 6,191,343; 5,728,558; e 5,741,684), ou semelhantes.

Geralmente para produzir mais plantas que possuem a condição recessiva, pode-se cruzar a planta recessiva com outra planta recessiva, ou auto-polinizar uma planta recessiva. Isto pode ser não desejável para alguns traços recessivos e pode ser impossível para traços recessivos que afectam o desenvolvimento reprodutivo. Alternativamente poder-se-ia cruzar a planta homozigótica com uma segunda planta que possui o gene de restauração, mas isto necessita mais cruzamentos para segregar o gene de restauração para se atingir novamente o estado fenotípico recessivo. Em vez disso, numa concretização a invenção disponibiliza um processo em que a condição homozigótica recessiva pode ser mantida, enquanto que se cruza com a planta de manutenção. Este processo pode ser utilizado em qualquer situação em que é desejável continuar a condição recessiva. Isto resulta num sistema relativamente simples eficaz sob o ponto de vista de custos para manter uma população de plantas homozigóticas recessivas.

Quando a condição homozigótica recessiva é tal que produz esterilidade masculina, a planta de manutenção por necessidade tem de conter uma construção transgénica de restauração funcional capaz de complementar a mutação e de tornar a planta homozigótica recessiva capaz de produzir pólen viável. Ligando este gene de restauração de fertilidade masculina com uma segunda sequência 61 nucleótidica funcional que interfere com a formação, função ou dispersão dos gâmetas masculinos da planta resulta numa planta de manutenção que produz pólen contendo apenas o alelo recessivo do gene restaurado no seu local nativo devido à acção citotóxica específica para o pólen da segunda sequência nucleótidica. Esta fracção viável de pólen é não transgénica no que diz respeito à contrução transgénica de restauração.

Por exemplo, é desejável produzir plantas fêmeas com esterilidade masculina para serem utilizadas no processo de produção de híbridos que são estéreis como resultado de serem homozigóticos para uma mutação no gene MS45, um gene que é essencial para a fertilidade masculina. Um tal alelo mutante MS45 é designado como ms45. Uma planta que é homozigótica para ms45 (representada pela notação ms45/ms45) exibe o fenótipo de esterilidade masculina homozigótico recessivo e não produz pólen funcional. Ver Pat. US Nos 5,478,369; 5,850,014; 6.265,640; e 5,824,524. Tanto nos processos de produção de endocruzamentos e de híbridos é altamente desejável manter esta condição homozigótica recessiva. Quando as sequências que codificam para o gene MS45 são introduzidas numa planta que possui a condição homozigótica, resulta a restauração esporofítica da fertilidade masculina. (Cigan et al. (2001) Sex. Plant Repro. 14:135-142). Através do método da invenção, uma planta que é ms45/ms45 homozigótica recessiva pode ter introduzida nela um gene funcional MS45, e assim a fertilidade masculina é restaurada. Este gene pode ser ligado a um segundo gene que opera para tornar o pólen não funcional ou que evita a sua formação, ou que produz um produto letal no pólen, e que se encontra ligado a um promotor que dirige a sua expressão nos gâmetas masculinos. Isto resulta numa planta que produz um pólen viável contendo ms45 sem a construção transgénica de restauração. 62

Um exemplo é uma construção que inclui o gene MS45 ligado operacionalmente ao promotor 5126, um promotor preferido do tecido masculino (ver Pat. US N° 5,837,851) e ligado ainda ao gene metilase DAM citotóxico sob o controlo do promotor PG47 (ver Pat. US N° 5, 792, 853; 5, 689, 049). A planta resultante produz pólen, mas apenas o pólen viável contém o gene ms45. Pode por isso ser utilizada como um polinizador para fertilizar a planta homozigótica recessiva (ms45/ms45), e 100% da descendência produzida vai continuar a ser macho estéril como resultado da manutenção da homozigosidade em relação a ms45. A descendência não vai conter a construção transgénica de restauração introduzida.

Evidentemente, muitas variações deste método encontram-se disponíveis no que diz respeito à esterilidade masculina. Qualquer outro gene crítico para a fertilidade masculina pode ser utilizado neste sistema. Por exemplo e sem limitação, tais genes incluem o gene SBMu200 (também conhecido como SB200 ou MS26) descrito em WO02/26789; o gene BS92-7 (também conhecido como BS7) descrito na WO 02/063021; o gene MS2 descrito em Albertsen e Philips, "Development Cytology of 13 Genetic Male Sterile Loci in Maize" Canadian Journal of Genetics & Cytology 23:195-208 (Jan. 1981); ou o gene da Arabidopsis MS2 descrito em Aarts et al., "Transposon Tagging of a Male Sterility Gene in Arabidopsis", Nature, 363:715-717 (Jun. 24, 1993); e o gene de Arabidopsis MSI descrito em Wilson et al., "The Arabidopsis MALE STERILITY1 (MSI) gene is a transcriptional regulator of male gametogenesis, with homology to the PHD-finger family of transcription factors", Plant J., 1:27-39 (Oct. 28, 2001).

Um resultado desejável do processo da invenção é de que a planta que possui a sequência nucleótidica de restauração pode ser autof ecundada; isto é, o pólen da planta é transferido para a flor da mesma planta para 63 atingir a propagação de plantas de restauração (Notar que a "auto-fertilização" inclui tanto a situação em que a planta que produz o pólen é fertilizada com esse mesmo pólen, e a situação em que o pólen de uma planta, ou de um grupo de plantas geneticamente idênticas poliniza uma planta que é um indivíduo geneticamente idêntico, ou um grupo de tais plantas geneticamente idênticas). A contrução transgénica de restauração não vai estar presente no pólen, mas vai estar contido em 50% dos óvulos (o gâmeta feminino) . A semente que resulta da auto-fertilização pode ser plantada, e a selecção efectuada para a semente que possui a construção transgénica de restauração. O processo de selecção pode ocorrer, através de qualquer um ou vários dos muitos processos conhecidos, sendo o mais comum, quando a sequência nucleótidica de restauração se encontra ligada a um gene marcador. O marcador pode ser pontual ou de selecção e permite a identificação da semente compreendendo a sequência de restauração, e/ou daquelas plantas produzidas a partir da semente que possui a sequência de restauração.

Numa concretização da invenção, é possível fazer com que o promotor que dirige o gene de restauração seja indutível. É assim permitido um controlo adicional no processo, onde é desejado, fazendo com que a planta que possui as sequências nucleótidicas de restauração seja constitutivamente um macho estéril. Este tipo de esterilidade masculina é apresentada na patente de invenção US N° 5,859,341. De modo a que a planta se torne fértil, a substância indutora tem que ser disponibilizada e a planta torna-se fértil. Novamente, quando combinada com o processo da invenção como descrito supra, o único pólen produzido não vai conter as sequências nucleótidicas de restauração. O gâmeta que controla a transmissão das sequências nucleótidicas de restauração pode ser o gâmeta feminino, em 64 vez do gâmeta masculino. 0 processo é o mesmo que o descrito acima, com a excepção naqueles casos em que se deseja também manter a planta com as sequências de restauração nucleótidicas por auto-fertilização, nesse caso, vai ser útil fazer com que o promotor que conduz o gene de restauração seja indutivel, de modo que a fertilidade feminina possa ser desencadeada por exposição à substância indutora, e a semente possa ser formada. 0 controlo da fertilidade feminina desta forma é descrito na Patente US N° 6,297,426. Exemplos de genes que conferem fertilidade feminina incluem o gene da teosinte ramificado 1 (Tbl), que aumenta a dominância apical resultando em bandeiras múltiplas e repressão do tecido feminino. Hubbard et al. (2002) Genetics 162:1927-1935; Doebley et al. (1997) Nature 386:485-488 (1997). Um outro exemplo é o chamado "infértil3 -expressão anglo-saxónica barren3" ou "ba3". Este mutante foi isolado a partir de uma planta de milho mutante infectada com o virus do mosaico do trigo listrado e é descrito em Pan e Peterson, J. Genet. and Breed. 46:291-294 (1992). As plantas desenvolveram bandeiras normais, mas não possuem nenhum rebento da espiga ao longo dos caules. Fastigiado de caules inférteis é descrito em Coe e Beckett, Maize Genet. Coop. Newslett 61:46-47 (1987). Outros exemplos incluem o gene infértil do caulel (Gallavotti et al., Nature 432:630-635 (2004)); mutante do óvulo letal (Vollbrecht, Maize Genetics Cooperation Newsletter 68:2-3 (1994)); e pistilo mutante defeituoso (Miku e Mustyatsa, Genetika 14(2):365-368 (1978)).

Quaisquer elementos promotores compatíveis com plantas podem ser utilizados para controlar a expressão de regiões da construção transgénica de restauração que codifica para proteínas específicas e funções. Essas podem ser promotores de genes de plantas, tais como, por exemplo, o promotor da ubiquitina, o promotor para a pequena sub-unidade de 65 ribulose-1, 5-bis-fosfato carboxilase, ou promotores dos plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens, tais como os promotores da nopalina sintase e octopina sintase, ou promotores virais tal como o promotor do vírus do mosaico da couve de flor (CaMV) 19S e 35S ou o promotor do vírus da verruga do figo 35S. Ver Kay et al., (1987)

Science 236:1299 e pedido de patente de invenção europeia N° 0342926. Ver pedido de patente de invenção internacional WO 91/19806 para uma revisão de promotores de plantas ilustrativos utilizados de forma adequada na presente invenção. A gama de promotores compatíveis com plantas incluem promotores específicos dos tecidos e promotores indutíveis. A invenção contempla a utilização de promotores que disponibilizam a expressão de tecido preferida, incluindo promotores que expressam preferencialmente o tecido de gâmeta, macho ou fêmea da planta. A invenção não necessita de que qualquer promotor particular de tecido de gâmeta preferido seja utilizado no processo, e qualquer um dos muitos promotores conhecidos de um perito no estado da técnica pode ser utilizado. A título de exemplo, mas não sendo limitativo, um dos tais promotores é o promotor 5126 que dirige preferencialmente a expressão do gene ao qual está ligado o tecido macho das plantas, como descrito na Patente de invenção US N°s 5,837,851 e 5,689,051. Outros exemplos incluem o promotor MS45 descrito na patente de invenção US N° 6,037,523; promotor SF3 descrito na Patente de Invenção US N° 6,452,069; o promotor BS92-7 ou BS7 descrito na WO 02/063021; o promotor SBMu200 descrito na WO02/26789; um elemento regulador SGB6 descrito na Patente US N° 5, 470,359, e TA39 (Koltunow et al. (1990) "Diferent temporal and spatial gene expression patterns occur during anther development." Plant Cell 2:1201-1224; Goldberg et al., (1993) Anther development: basic principies and 66 praticai applications. Plant Cell 5:1217-1229; e patente US N° 6,399,856. Ver também Nadeau et al., Plant Cell 8 (2):213-39 (1996); e Lu et al., Plant Cell 8(12):2155-68 (1996) . 0 promotor P67 apresentado na SEQ ID N°:l possui 1112 nucleótidos de comprimento. Este promotor foi isolado a partir de um clone genómico correspondente a uma sequência EST de milho. A sequência apresentou uma homologia limitada em relação à metilesterase putativa da pectina. A especificidade do pólen para exprimir P67 foi confirmada por RT-PCR e análise de transferência de Northern de amostras de ARN de diferentes tecidos incluindo folha, raiz antera/ grãos de pólen maduros de bandeiras na fase de vacúolos, espícula, espiga, casca, seda e embrião. Os resultados indicam um elevado nível de especificidade para a expressão no pólen em desenvolvimento, particularmente no estádio de uninucleado médio. A análise de transferência de Southern mostrou que o clone representa genes de cópia única ou de baixo número de cópias no genoma do milho. 0 mapeamento de cromossomas utilizando a linha de substituição do cromossoma de aveia revelou que a sequência se encontra localizada no cromossoma 1 do milho. 0 clone foi utilizado para pesquisar uma biblioteca de milho BAC. Foram encontrados clones BAC positivos e subclonados em pBluescript KS. Os subclones correspondentes a sequências de ADNc foram identificados e sequenciados. 0 local de iniciação transcricional foi determinado utilizando uma estratégia de amplificação rápida do terminal 5' mediada pela ARN ligase. A região promotora foi designada P67. 0 promotor P95 apresentado na SEQ ID N°2 possui 1092 nucleótidos de comprimento. Este promotor foi isolado a partir de um clone genómico correspondente a uma sequência 67 de milho EST. A sequência mostrou uma homologia limitada à L-ascorbato oxidase putativa. A especificidade de expressão do pólen para P95 foi confirmada por RT-PCR e análises de transferência de Northern de amostras de ARN de diferentes tecidos incluindo folha, raiz, antera/grãos de pólen maduro, bandeira na fase de vacúolo, espicula, espiga, casca, seda e embrião. Os resultados indicam um elevado nivel de especificidade para a expressão no pólen em desenvolvimento, particularmente no estádio uninucleado médio. A análise de transferência de Southern mostrou que o clone representa genes de cópia única ou de baixo número de cópias no genoma do milho. 0 mapeamento de cromossomas utilizando a linha de substituição do cromossoma de aveia revelou que a sequência se encontra localizada nos cromossomas 1 e 8 do milho. 0 clone foi utilizado para pesquisar uma biblioteca de milho BAC. Foram encontrados clones BAC positivos e subclonados em pBluescript KS. Os subclones correspondentes a sequências de ADNc foram identificados e sequenciados. 0 local de iniciação transcripcional foi determinado utilizando uma estratégia de amplificação rápida do terminal 5' mediada pela ARN ligase. A região promotora foi designada P95.

Utilizando técnicas bem conhecidas, sequências promotoras adicionais podem ser isoladas baseadas na sequência da sua homologia para a SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2. Nestas técnicas, toda ou parte de uma sequência promotora conhecida é utilizada como sonda que se hibridiza selectivamente com outras sequências presentes numa população de fragmentos de ADN genómicos clonados (i.e. bibliotecas genómicas) de um organismo escolhido. Processos que estão facilmente acessíveis no estado da técnica para a hibridização de sequências de ácidos nucleicos podem ser 68 utilizados para obter sequências que correspondem a estas sequências promotoras em espécies incluindo, mas não limitadas ao milho (milho, Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.) alfa-alfa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , girassol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max) tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogae), algodão (Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), cassava (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Coco nucifera), ananás (Ananas comosus), árvores de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.) abacate (Persea americana). Figo (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais e coníferas.

Preferencialmente as plantas incluem milho, soja, girassol açafrão, canola, trigo, cevada, centeio, alfa-alfa e sorgo. A sequência promotora completa ou suas porções podem ser utilizadas como sondas capazes de se hibridizarem especificamente às sequências promotoras correspondentes. Para se conseguir uma hibridização específica sob uma variedade de condições, tais amostras incluem sequências que são únicas e são preferencialmente de pelo menos cerca de 10 nucleótidos de comprimento e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 nucleótidos de comprimento. Tais amostras podem ser utilizadas para amplificar as sequências promotoras correspondentes de um organismo escolhido a partir do processo bem conhecido da reacção em cadeia da polimerase (PCR). Esta técnica pode ser utilizada para isolar sequências promotoras adicionais a partir de um organismo desejado, ou de um ensaio de diagnóstico para 69 determinar a presença da sequência promotora num organismo. Exemplos incluem rastreio por hibridização de bibliotecas de ADN em placas (placas ou colónias; ver por ex. Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, eds., Academic Press).

Em geral, sequências que correspondem a uma sequência promotora da presente invenção e se hibridizam com uma sequência promotora aqui revelada vai ter pelo menos uma homologia de 50%, 55% de homologia, 60% de homologia, 65% de homologia, 70% de homologia, 75% de homologia, 80% de homologia, 85% de homologia, 90% de homologia, 95% de homologia e mesmo 98% de homologia, ou mais com a sequência divulgada.

Fragmentos de uma sequência promotora em particular aqui revelada podem operar para promover a expressão preferida de pólen de uma sequência nucleótidica isolada operacionalmente ligada. Estes fragmentos vão compreender pelo menos cerca de 20 nucleótidos contíguos, preferencialmente pelo menos cerca de 50 nucleótidos contíguos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 75 nucleótidos contíguos, e mesmo mais preferencialmente pelo menos cerca de 100 nucleótidos contíguos da sequência nucleótidica promotora particular aqui divulgada. Os nucleótidos de tais fragmentos vão geralmente compreender a sequência de reconhecimento TATA da sequência promotora particular. Tais fragmentos podem ser obtidos através da utilização de enzimas de restrição para cindir as sequências promotoras de ocorrência natural aqui reveladas; sintetizando uma sequência nucleótidica a partir da sequência de ADN de ocorrência natural; ou através da utilização de tecnologia PCR. Ver particularmente, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350, e Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, Nova Iorque). Novamente as variantes destes fragmentos, tais como as que 70 resultam da mutagénese dirigida para o local são compreendidas pela composição da presente invenção.

Assim, são abrangidas as sequências nucleótidicas compreendendo pelo menos cerca de 20 nucleótidos contíguos do conjunto de sequências apresentado na SEQ ID N°1 ou SEQ ID N° 2. Estas sequências podem ser isoladas por hibridização, PCR, e semelhantes. Tais sequências abrangem fragmentos capazes de dirigir a expressão preferida de pólen, fragmentos úteis como amostras para identificar sequências semelhantes, assim como elementos responsáveis pela especificidade temporal ou de tecido.

Variantes biológicas activas da sequência promotora são também abrangidas pelas composições da presente invenção. Uma "variante" reguladora é uma forma modificada de um promotor em que uma ou várias bases foram modificadas, removidas, ou adicionadas. Por exemplo, um processo de rotina para remover parte de uma sequência de ADN é utilizar uma exonuclease em combinação com amplificação de ADN para produzir supressões em ninho unidireccionais de clones de ADN de cadeia dupla. Um kit comercial para este propósito é vendido sob o nome comercial Exo-Size ™ (New England Biolabs, Beverly, Mass). Resumidamente, este procedimento compreende a incubação da exonuclease III com ADN para remover progressivamente nucleótidos na direcção 3' a 5' em partes salientes 5', terminais rombos, ou em fendas no molde de ADN. Contudo, a exonuclease III é incapaz de remover os nucleótidos na parte saliente 3',4-base. Digestão atempada de um clone com esta enzima produz supressões unidireccionais em ninho.

Um exemplo de uma variante de uma sequência reguladora é um promotor formado através da provocação de uma ou várias supressões num promotor maior. A supressão da porção 5' de um promotor até à caixa TATA próximo do local de iniciação de transcrição pode ser conseguida sem abolir a 71 actividade do promotor como descrito por Zhu et al., The Plant Cell 7:1681-89 (1995). Tais variantes deveriam reter a actividade do promotor, particularmente a capacidade de conduzir a expressão em tecidos específicos. Variantes biologicamente activas incluem, por exemplo, as sequências reguladoras nativas da invenção que possuem uma ou mais substituições nucleótidicas, supressões, ou inserções. A actividade pode ser medida através de análise por transferência de Northern, medições de actividade repórter, quando se utiliza fusões transcripcionais, e semelhantes. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nc^ ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I), aqui incorporada por referência.

As sequências nucleótidicas para os promotores preferidos pelo pólen revelados na presente invenção, assim como variantes e seus fragmentos são úteis na manipulação genética de qualquer planta, quando operacionalmente ligada com uma sequência nucleótidica isolada, cuja expressão é para ser controlada para se atingir uma resposta fenotípica desejada. A sequência nucleótidica operacionalmente ligada aos elementos reguladores aqui revelados pode ser uma sequência anti-sentido para um gene alvo. Por "sequência nucleótidica de ADN anti-sentido" entende-se uma sequência que está na orientação inversa em relação à orientação 5'- a 3' normal à da sequência nucleótidica. Quando administrada a uma célula de planta, a expressão de uma sequência de ADN anti-sentido evita a expressão normal da sequência nucleótidica de ADN para o gene alvo. A sequência nucleótidica anti-sentido codifica para um transcripto de ARN que é complementar e é capaz de se hibridizar com o mensageiro endógeno de ARN (ARNm) produzido pela transcrição de uma sequência nucleótidica de ADN para o gene alvo. Neste caso, a produção da proteína nativa codificada pelo gene tomado 72 como alvo é inibida para se conseguir a resposta fenotípica desejada. As sequências reguladoras aqui reivindicadas podem ser ligadas operacionalmente a sequências de ADN anti-sentido para reduzir ou inibir a expressão de uma proteína nativa ou exógena na planta. São conhecidas muitas sequências nucleótidicas que inibem a formação de pólen ou função ou dispersão, e quaisquer sequências que efectuam esta inibição são suficientes. Uma discussão dos genes que podem influenciar um desenvolvimento ou função encontra-se incluído na patente US N° 6,399,856 e inclui genes negativos dominantes, tais como genes da citotoxina, genes da metilase e genes que inibem o crescimento. Genes dominantes negativos incluem o gene da cadeia A da toxina da difteria (Czabo e An (1981) Plant Physiol. 95 687-692); mutantes do ciclo da divisão celular tais como CDC no milho (Colasanti et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 3377-3381); o gene WT (Farmer et al., Hum. Mol. Genet. 3, 723-728, 1994); e P68 (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 315-319, 1991). Um gene adequado pode também codificar para uma proteína envolvida na inibição do desenvolvimento do pistilo, interaeções entre o pólen e o estigma, crescimento do tubo polínico ou fertilização, ou uma sua combinação. Além disso, os genes que interferem com a acumulação normal de amido no pólen ou afectam o equilíbrio osmótico no pólen podem também ser adequados. Estes podem também incluir, por exemplo, o gene da alfa amilase do milho, o gene da beta amilase do milho, enzimas de desramificações, tal como Sugaryl e pullulanase, glucanase, e SacB.

Numa concretização ilustrativa, é utilizado o gene da metilase-DAM, cujo produto de expressão cataliza a metilação de resíduos de adenina no ADN da planta. As adeninas metiladas não vão afectar a viabilidade celular e vão ser encontradas apenas em tecidos em que o gene da 73 metilase-DAM é expresso, porque tais resíduos metilados não são encontrados de forma endógena no ADN da planta. Exemplos dos chamados genes citotóxicos são discutidos acima e podem incluir, mas não se encontram limitados ao gene da pectate liase pelE, de Erwinia chrysanthemi (Kenn et al. (1986) J. Bacteriol 168:595); gene da cadeia A da toxina da difteria (Greenfield et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:6853, Palmiter et al. (1987) Cell 50:435); gene de T-urfl3 dos genomas mitocondriais do milho cms-T (Braun et al. (1990) Plant Cell 2:153; Dewey et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5374); gene da toxina CytA do Bacillus thurigiensis Israeliensis que provoca a destruição da membrana celular (McLean et al.(1987) J. Bacteriol 169:1017, Patente de invenção US N° 4,918,006); ADNases, ARNases, (Patent de invenção US N° 5,633,441); proteases, ou genes que expressam ARN anti-sentido.

Além disso, os métodos da invenção são úteis para reter a condição homozigótica recessiva de carácteres diferentes dos que têm influência na fertilidade da planta. O gene de interesse que restaura a condição seria introduzido numa planta ligada a uma sequência nucleótidica que inibe a formação, função, ou dispersão de pólen e que pode ser ainda ligada a um promotor preferido de um tecido de gâmeta masculino e a um gene que codifica para um marcador, por exemplo um marcador específico da semente. Pólen viável produzido pela planta em que a construção é introduzida contém apenas o alelo recessivo do gene de interesse e nenhuma das sequências transgénicas de restauração. Metade dos gâmetas femininos da planta transgénica homozigótica contêm o transgénico e podem ser auto-polinizadas, ou polinizadas por uma planta que compreende os alelos recessivos. Metade das sementes produzidas vão transportar o gene e podem ser identificadas através do marcador de ligação. A condição hemizogótica 74 pode ser mantida por auto-cruzamento da planta hemizigótica; metade da descendência vai conter o transgénico e assim, o carácter de interesse.

Os genes de interesse reflectem os mercados comerciais e interesses dos envolvidos no desenvolvimento da colheita. Colheitas e mercados de interesse mudam, e à medida que as nações em desenvolvimento se abrem aos mercados mundiais vão também emergir novas colheitas de tecnologias. Além disso, à medida que o nosso conhecimento de traços e caracteristicas agronómicas, tais como rendimento e hererose aumentam, a escolha dos genes para a transformação vai variar de forma correspondente. A regulação da fertilidade masculina é necessariamente medida em termos do seu efeito em células individuais. Por exemplo, a supressão em 99,99% dos grãos de pólen é necessária para se conseguir uma esterilidade fidedigna para utilização comercial. Contudo, a supressão ou restauração bem sucedida da expressão de outros traços pode ser conseguida com mais baixa severidade. Num tecido em particular, por exemplo, expressão em 98%, 95%, 90%, 80%, ou em menos células pode resultar no fenótipo desejado.

Esta invenção tem utilidade para uma variedade de genes recessivos, não estando limitada aqueles onde a expressão do carácter homozigótico recessivo compromete a capacidade da planta de manter a sua capacidade reprodutora completa. Categorias gerais de genes de interesse incluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos na informação, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos na comunicação, tais como cinases, e aqueles envolvidos na manutenção, tal como proteínas de choque por calor. Categorias mais específicas de transgénicos, por exemplo, incluem genes que codificam para características agronómicas importantes, resitência a insectos, resistência à doença, resistência a herbicidas, esterilidade, características do grão, e 75 produtos comerciais. Genes de interesse incluem geralmente, aqueles envolvidos no metabolismo do óleo, amido, hidratos de carbono, ou de nutrientes, assim como aqueles que afectam o tamanho do grão, a carga de sacarose, e semelhantes. Caracteristicas agronómicas importantes tais como óleo, amido, e teor proteico podem ser geneticamente alteradas para além da utilização dos processos de reprodução convencionais. As moodificações incluem o teor acrescido de ácido oleico, óleos saturados e insaturados, niveis acrescidos de lisina e enxofre, que disponibilizam aminoácidos essenciais, e também modificação de amido. Modificações da proteína de hordotionina são descritas na Pat US Nos 5,703,049, 5,885,801, 5,885,802 e 5,990,389. Outro exemplo é uma lisina e/ou proteína de semente rica em enxofre codificada pela albumina 2S de soja descrita na Pat. US N° 5, 850,016, e o inibidor da quimotripsina da cevada descrita em Wiliamson et al., Eur. J. Biochem. 165:99-106 (1987). Outros genes importantes que codificam para factores de cresciemnto e factores de transcrição.

Caracteristicas agronómicas podem ser melhoradas alterando a expressão dos genes que: afectam o crescimento e o desenvolvimento, especialmente durante os stresses ambientais. Estas incluem por exemplo, genes que codificam para enzimas da biosíntese da citoquinina, tais como isopentenil transferase; genes que codificam para as enzimas catabólicas da citoquinina, tais como citoquinina oxidase; genes que codificam para polipéptidos envolvidos na regulação do ciclo celular, tais como CyclinD ou cdc25; genes que codificam para receptores da citoquinina ou sensores, tais como CRE1, CKIl, e CKI2, fosfotransmissores de histidina, ou reguladores da resposta da citoquinina.

Genes da resistência a insectos podem codificar para resistências a pestes que são um grande estorvo nos rendimentos, tal como o verme da raiz, agrótis, broca do 76 milho europeia, e semelhantes. Tais genes incluem, por exemplo: genes das endotoxinas de Bacillus thurigiensis Pat US Nos 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 593,881; Geiser et al. (1986) Gene 48:109; lectinas, Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825; e semelhantes.

Genes que codificam para traços resistentes à doença incluem: genes de destoxificação, tais como contra a fumonisina (WO9606175 depositado em 7 de Junho de 1995); genes de avirulência (avr) e resistência à doença (R ) , Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78 : 1089; e semelhantes.

Traços comerciais podem também ser codificados num/nuns genes que poderiam alterar ou aumentar por exemplo amido para a produção de papel, têxteis e etanol, ou para disponibilizar a expressão de proteínas com outras utilizações comerciais. Um outro uso comercial importante de plantas transformadas é a produção de polímeros e bioplásticos, tal como descrito na patente US N° 5,602,321 concedida a 11 de Fevereiro de 1997. Genes tais como as B-cetotiolase, PHBASE (polihidróxibutirato sintase) e acetoacetil-CoA redutase (ver Schubert et al. (1988) J. Bacteriol 170(12):5837-5847) facilitam a expressão de polihidroxialcanoatos (PHAs).

Produtos exógenos incluem enzimas de plantas e produtos assim como outros de outras fontes incluindo procarióticos e outros eucarióticos. Tais produtos incluem enzimas, cofactores, hormonas, e semelhantes. O nível de proteínas de sementes, de proteínas de sementes modificadas de um modo particular possuindo uma distribuição de aminoácidos melhorada para aumentar o valor nutriente da semente pode ser aumentado. Isto é conseguido através da expressão de tais proteínas possuindo um teor aumentado de aminoácidos. 77

Cassettes de expressão da invenção, compreendem um promotor e sequências de nucleótidos isolados de interesse podem também incluir no terminal 3' da sequência nucleótidica isolada de interesse, uma região transcricional e região de terminação de tradução funcional nas plantas. A região de terminação pode ser nativa com a sequência nucleótidica promotora da cassette, pode ser nativa com a sequência de ADN de interesse, ou pode ser derivada de outra fonte.

Outras regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação da octopina sintase e da nopalina sintase. Ver também: Guerineau et al (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. 1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid. Res. 15:9627-9639 .

As cassettes de expressão podem conter adicionalmente sequências leader 5'. Tais sequências leader podem actuar de maneira a reforçar a tradução. São conhecidos dos estado da técnica leaders de tradução e incluem: leaders de picornavirus, por exemplo: leader EMCV (região de não codificação da 5'encefalomiocardite), Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sei.USA 86:6126-6130; leaders de potyvírus, por exemplo leader TEV (Vírus Etch de tabaco), Allison et al. (1986); leader MDMV (vírus do mosaico anão do milho), Virology 154:9-20; proteína de ligação (BiP) da cadeia pesada da imunoglobulina humana, Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94; leader não traduzido da proteína do ARNm do vírus do mosaico da alfa-alfa (AMV ARN 4), Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); leader do vírus do mosaico do tabaco (TMV), Gallie et al. (1989) Molecular 78

Biology de ARN, páginas 237-256; e leader do vírus mosqueado clorótico do milho (MCMV) Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385. Ver também Delia Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965-968. A cassette pode também conter sequências que reforçam a tradução e/ou a estabilidade do ARNm tal como os intrões.

Nestes casos, em que é desejável ter o produto expresso da sequência de ácidos nucleicos isolada dirigido para um determinado organelo, particularmente para o plastídeo, amiloplasto, ou para o retículo endoplásmico, ou secretado à superfície da célula ou por via extracelular, a cassette de expressão pode ainda compreender uma sequência de codificação para um péptido de trânsito. Tais péptidos de trânsito são bem conhecidos do estado da técnica e incluem, mas não estão limitados ao: péptido de trânsito para a proteína do transportador acilo, pequena sub-unidade de RUBISCO, EPSP sintase da planta, e semelhantes.

Para preparar a casette de expressão, os vários fragmentos de ADN podem ser manipulados de modo a disponibilizar sequências de ADN com a orientação adequada e, na grelha de leitura apropriada. Com este objectivo podem ser utilizados adaptadores ou ligantes para se juntarem os fragmentos de ADN ou outras manipulações podem estar envolvidas para disponibilizar locais de restrição convenientes, remoção do ADN supérfluo, remoção dos locais de restrição, ou semelhantes. Para este fim, pode estar envolvida mutagénese in vitro, reparação dos iniciadores, digestão por restrição, emparelhamento, e resusbtituições, tais como transições e transversões.

Os termos seguintes são utilizados para descrever as relações entre sequências entre dois ou vários ácidos nucleicos ou polinucleótidos: (a) “sequência de referência", (b) "janela de comparação", (c) "percentagem 79 de identidade da sequência", e (d) "identidade substancial". (a) quando aqui utilizado "sequência de referência" é uma sequência definida utilizada como uma base para a comparação da sequência. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a sequência especificada completa; por exemplo, um segmento de uma sequência promotora de comprimento completo, ou a sequência promotora completa. (b) Quando aqui utilizado, "janela de comparação" faz referência a um segmento contíguo e específico de uma sequência polinucleótidica, em que a sequência polinucleótidica pode ser comparada com uma sequência de referência e em que a porção da sequência polinucleótidica na janela de comparação pode compreender adições ou supressões (i.e hiatos) comparados com a sequência de referência (que não compreende adições ou supressões) para um alinhamento óptimo das duas sequências. Geralmente, a janela de comparação é de pelo menos 20 nucleótidos contíguos em comprimento e opcionalmente pode ser 30, 40, 50, 100, ou mais nucleótidos contíguos em comprimento. Os peritos no estado da técnica compreendem que para evitar uma elevada semelhança em relação a uma sequência de referência devido à inclusão de hiatos na sequência polinucleótidica, é tipicamente introduzida uma penalidade pelo hiato e é subtraída do número de emparelhamentos. (c ) Quando aqui utilizado "percentagem da identidade de sequência" significa o valor determinado comparando duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação, em que a porção da sequência nucleótidica na janela de comparação pode compreender adições ou supressões (i.e hiatos), quando comparado com a sequência de referência (que não compreende adições ou supressões) para o alinhamento óptimo das duas sequências. A percentagem é 80 calculada determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ocorre em ambas as sequências para dar o número de posições emparelhadas dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem da identidade da sequência. (d) O termo "identidade substancial" das sequências polinucleótidicas significa que um polinucleótido compreende uma sequência que possui pelo menos 70% de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, comparada com uma sequência de referência utilizando um dos programas de alinhamento descritos utilizando parâmetros padrão.

Processos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos no estado da técnica. Comparações de genes podem ser determinadas efectuando pesquisas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; ver também www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) utilizando os parâmetros por defeito para a identidade de sequências contidas na base de dados BLAST "GENEMBL". Uma sequência pode ser analisada para a identidade em todas as sequências de ADN publicamente disponíveis contidas no algoritmo BLASTN sob os parâmetros por defeito.

Com o objectivo de definir a presente invenção é utilizado o programa GAP (Global Alignment Program). O GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsh (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximizam o número de emparelhamentos e minimiza o número de hiatos. A criação de valores de penalização de hiatos por defeito e valores da 81 extensão de penalidade na Versão 10 da Wisconsin Package ® (Accelrys, Inc., San Diego, CA) para sequências de proteínas são 8 e 2 respectivamente. Para sequências nucleótidicas a penalidade por defeito de criação de hiatos é 50, enquanto que a penalidade por defeito da extensão de hiatos é de 3. A percentagem de semelhança é a percentagem de símbolos que são semelhantes. Os símbolos que atravessam os hiatos são ignorados. A semelhança é avaliada, quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos é maior do que ou igual a 0,50 do que o patamar de semelhança. A matriz de pontuação utilizda na versão 10 da Wisconsin Package® (Accelrys, Inc., San Diego, CA) é BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikof (1989) proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).

Grandes quantidades dos ácidos nucleicos da presente invenção podem ser produzidos por replicação num hospedeiro adequado de construções de ácido nucleico, geralmente construções de ADN capazes de serem introduzidas e replicadas numa célula procariótica ou eucariótica. Geralmente as construções de ácido nucleico vão ser adequadas para replicação num hospedeiro unicelular, tal como a levedura, ou bactérias, mas podem também ser destinadas para introdução em linhas celulares cultivadas de mamíferos ou plantas, ou outras células eucarióticas (com e sem integração no genoma). A purificação de ácidos nucleicos produzidos pelos processos da presente invenção é descrita, por exemplo em Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I. (1989) ou Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, N. I (1992) .

As construções de ácido nucleico preparadas para serem introduzidas num hospedeiro procariótico ou eucariótico pode compreender um sistema de replicação reconhecido pelo 82 hospedeiro, incluindo o fragmento de ácido nucleico que codifica para a proteína desejada, e vai preferencialmente também incluir as sequências de regulação da iniciação de transcrição e de tradução ligadas preferencialmente ao segmento que codifica para a proteína. Os vectores de expressão podem incluir, por exemplo, uma origem de replicação, ou uma sequência de replicação autónoma (ARS) e sequências de controlo de expressão, um promotor, um amplificador e locais de processamento de informação necessária, tais como locais de ligação de ribossomas, locais de união de ARN, locais de poliadenilação, sequências de terminação transcripcionais, e sequências de estabilização de ARNm. A secreção de sinais pode também ser incluída, quando apropriado. Tais vectores podem ser preparados, através de técnicas padrão recombinantes bem conhecidas do estado da técnica e discutidas, por exemplo em Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2a Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, N.I. (1989) ou Ausubel et al., Current protocols in Molecular Biology, J. Wiley ans Sons, NI (1992). São conhecidos do estado da técnica vectores para a introdução de genes tanto para a recombinação e para a manutenção extracromossomal, e qualquer vector adequado pode ser utilizado. Processos para introduzir AND em células tais como electroporação, precipitação de fosfato de cálcio, e transdução virai são conhecidos do estado da técnica, e a escolha de métodos encontra-se no âmbito da competência do perito no estado da técnica (Robbins, Ed. Ggene Therapy Protocols, Human Press, NJ (1997)).

Sistemas de transferência de genes conhecidos do estado da técnica podem ser úteis na prática da presente invenção, estes incluem processos de transferência virais e não virais. Foram utilizados vários vírus como vectores de transferência genética, incluindo polioma, i.e., SV40 83 (Madzak et al., J. Gen. Virol., 73:1533-1536 (1992), adenovírus (Berkner, Curr. Top. Microbiol. Iinmunol., 158:39-61 (1992); Berkner et al., Bio tecniques, 6:616-629 (1988); Gorziglia et al., J. Virol., 66:4407-4412 (1992); Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:2581-2584 (1992); Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155 (1992); Wilkinson et al., Nucl. Acids Res., 20:2233-2239 (1992); Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther., 1:241-256 (1990)), virus vaccinia (Mackett et al., Biotechnology, 24:495499 (1992)), virus adeno-associado (Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123 (19929; Ohi et al., Gene, 89:279-282 (1990)), virus de herpes incluindo HSV e EBV (Margolskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90 (1992); Johnson et al., J. Virol., 66:2952-2965 (1992); Fink et al., Hum Gene Ther., 3:11-19 (1992); Breakfield et al. , Mol. Neurobiol., 1:337-371 (1987); Fresse et al., Biochem. Pharmacol., 40:2189-2199 (1990)), e retrovirus de aves (Brandyopadhyay et al., Mol. Cell Biol., 4:749-754 (1984) ; Petropouplos et al., J. Virol., 66:3391-3397 (1992)), de murino (Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24 (1992); Miller et al. Mol. Cell Biol., 5:431-437 (1985) ; Sorge et al. , Mol. Cell Biol., 4:1730-1737 (1984); Mann et al., J. Virol., 54:401-407 (1985)), e de origem humana (Page et al., J. Virol., 64:5370-5276 (1990); Buchschalter et al., J. Virol., 66:2731-2739 (1992)). 294:92-94 (1981))

Processos não virais de transferência de genes conhecidos do estado da técnica incluem técnicas químicas tais como co-precipitação com fosfato de cálcio (Graham et al. Virology, 52:456-467 (1973); pellicer et al., Science, 209: 1414-1422 (1980)), técnicas mecânicas, por exemplo microinjecção (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5399-5403 (1980 = ; Gordon et al., Proc. natl. Acad. Sei. USA, 77:7380-7384 (1980); Brinster et al. Cell, 27:223-231 (1981); Constantin et al., Nature, 84 transferência mediada por fusão de membrana via lipossomas (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7413-7417 (1987); Wang et al. Biochemistry, 28:9508-9514 (1989);

Kaneda et al., J. Biol. Chem., 264:12126-12129 (1989);

Stewart et al., Hum. Gene Ther., 3:267-275 (1992); Nabel et al., Science, 249:1285-1288 (1990); Lim et al.,

Circulation, 83:2007-2011 (1992)), e toma directa de ADN e transferência de ADN mediada por receptor (Wolff et al., Science, 247:1465-1468 (1990); Wu et al., Bio Techniques, 11:474-485 (1991); Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:3655-3659 (1990); Wu et al., J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989): Wolff et al., BioTechniques, 11:474485 (1991); Wagner et al., 1990; Wagner et al. proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 88:42554259 (1991); Cotton et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:4033-4037 (1990); Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3:147-154 (1991)).

Exemplo 1

Expressão do promotor de ARN gancho de cabelo afecta a fertilidade da planta

Este exemplo demonstra que a fertilidade ou o potencial de fertilidade das plantas pode ser alterado pela expressão de moléculas de ARN gancho de cabelo (ARNhp) especificas para os promotores dos genes que codificam para proteínas envolvidas nas vias de fertilidade masculina.

Foram geradas construções de ARNhp ligando um promotor da ubiquitina a uma repetição invertida do promotor desejado, incluindo um segmento de um promotor NOS entre as sequências de repetição invertidas. A expressão de cada construção gerou um ARNhp específico para um dos promotores seguintes: MS45, 5126, BS7, SB200, e PG47. Moléculas de ácido nucleico e processos de preparação de construções e 85 de transformação do milho foram efectuados de acordo com o anteriormente descrito (Cigan et al. (2001) Sex Plant Reprod. 14:135-142). Foi analisada a descendência (geração Tl) de plantas (TO) transformadas.

De 32 acontecimentos de transformação compreendendo ARNhp específicos para o promotor do gene MS45, 29 produziram plantas Tl que eram machos estéreis.

Dos 32 acontecimentos de transformação compreendendo ARNhp específico para o promotor do gene 5126, 29 produziram plantas Tl que eram machos estéreis.

Dos 32 acontecimentos de transformação compreendendo ARNhp específico para o promotor do gene BS7 específico, 23 produziram plantas Tl que produziram uma pequena quantidade de pólen não viável ( fenótipo "infractor") ou eram machos estéreis, mas produziam apenas uma pequena quantidade de pólen viável (fenótipo de "derramamento").

De 31 acontecimentos de transformação compreendendo ARNhp específico para o promotor do gene SB200, 13 produziram plantas Tl de fenótipo infractor ou de derramamento.

Dos 24 acontecimentos de transformação compreendendo ARNhp específico para o promotor do gene PG47 ligado a uma construção para resistência ao herbicida, 15 não revelaram transmissão de resistência a herbicida da plântula Tl, quando se utiliza pólen dos transformantes primários. Isto é consistente com a expressão pós-meiótica esperada de PG4 7. 0 ARN de anteras de plantas que expressam os vários ARNhps foi analisado por transferência de Northern. Para cada alvo foram analisados seis acontecimentos independentes na geração Tl para determinar se a expressão de ARNhp reduzia os níveis de ARN de estado estacionário dos genes alvo. As anteras foram preparadas para a libertação de tetradas para a fase precoce uninucleada do 86 desenvolvimento dos microesporos. Foi isolado Poly A+ ARN, separado por electroforese, transferido para membranas e hibridizado sequencialmente com sondas especificas para MS45, 5126, BS7, SB200, NOS, e actina (controlo de carga de ARN). Não foram detectados transcritos MS45, 5126, ou BS7 em plantas que expressam ARNhp especifico para estes promotores endógenos. Apenas uma ligeira redução do ARN SB200 foi observada nas plantas que expressam o ARNhp SB200. A análise da imunotransferência de proteínas de anteras foi também efectuada essencialmente como descrito anteriormente (Cigan et al., Sex Plant Reprod. 14:135-142, 2001) . Para cada alvo foram analisados seis acontecimentos independentes na geração TI para determinar se a expressão do promotor de ARNhp reduziu o estado estacionário dos níveis de proteína dos genes alvo. As anteras foram preparadas como acima, moídas em tampão de Laemelli, separadas por electroforese e feitas reagir sequencialmente com anticorpos específicos para MS45, BS7, SB200 ou proteína 5126. De forma semelhante aos resultados da transferência de Northern não foram detectadas nenhumas proteínas MS45, 5126 ou BS7 em plantas que expressam o ARNhp específico para estes promotores endogenos, e apenas uma pequena redução da proteína SB200 foi observada para acontecimentos que compreendem SB200 hp.

Estes resultados demonstram que a expressão do promotor ARNhp pode suprimir selectivamente a expressão de genes endógenos em células de plantas. Para além disso, os resultados demonstram que a supressão de diferentes genes envolvidos na esterilidade masculina de plantas pode afectar de forma diversa o fenótipo da planta, incluindo o grau de fertilidade masculina.

Exemplo 2 87 A expressão do produto génico exógeno MS45 restaura a fertilidade

Este exemplo demonstra que a fertilidade de plantas tornadas machos estéreis, através da expressão de uma construção de um promotor MS45 de gancho para cabelo pode ser restaurada por expressão de uma construção génica de MS45 exógeno.

Foram preparadas construções contendo a sequência de codificação MS45 ligada operacionalmente a um promotor de ubiquitina heterólogo (UBI), 5126, SB200 ou BS7, estas construções foram introduzidas em células de plantas ms45ms45. Plantas regeneradas e a sua descendência foram férteis, demonstrando que o promotor nativo de MS45 pode ser substituído por um promotor constitutivo ou promotor preferido de antera para conferir um fenótipo fértil masculino ao mutante ms45 do milho. (Ver também Cigan et al. , Sex Plant Reprod. 14.135-142, 2001).

Além disso, as plantas que contêm a construção UBI:MS45 ou 5126:MS45 foram cruzadas com plantas que eram machos estéreis devido à expressão de um promotor génico MS45 de ARNhp. A descendência foi testada por PCR, quanto à presença da construção hp e de UBI:MS45 ou 5126:MS45. Foram efectuadas análises de hibridização de ARN e os fenótipos de fertilidade foram pontuados. A análise de transferência de Northern de ARN obtido a partir de folhas das plantas descendentes revelou que MS45 foi expresso a partir do promotor de ubiquitina em 7 de 12 descendentes contendo hp obtidos a partir do cruzamento UBI:MS45. Além disso, a expressão de MS45 do promotor UBI correlacionou-se com a fertilidade observada nas plantas descendentes. Estes resultados demonstram que MS45 é expresso a partir do promotor de ubiquitina constitutivo, e 88 que a expressão constitutiva do produto génico MS45 confere fertilidade masculina às plantas descendentes.

Além disso, ARN de anteras destas plantas de milho MS45hp contendo 5126:MS45, BS7:MS45, ou UBI:MS45 foi analisado. Foram preparadas anteras na libertação de tetradas até à fase uninucleada precoce do desenvolvimento de microesporos, e ARN de poli A+ foi colhido, submetido a electroforese e hibridizado sequencialmente com sondas para MS45, SB200, e BS7. Foi expresso MS45 em anteras dos machos férteis das plantas descendentes, quando conduzidas pelo promotor constitutivo UBI ou pelos promotores específicos de anteras 5126 ou BS7, sendo provável que a altura da colheita das anteras afectasse a força do sinal. Não foi observado nenhum ARN MS45 nas plantas macho estéreis contendo apenas o gancho de cabelo. Estes resultados demonstram que a supressão da expressão de MS45 devido ao ARNhp MS45 pode ser ultrapassada expressando MS45 de um promotor heterólogo que conduz a expressão pelo menos nas células das anteras. 0 promotor que expressa o gene MS45 pode ser obtido a partir de uma fonte diferente do milho, e pode ser, por exemplo, qualquer promotor de planta capaz de transcrever MS45 de modo a que a expressão da unidade de transcrição torne as plantas machos férteis. Por exemplo, foram isolados e identificados os homólogos dos genes do milho MS45, 5126, BS7 e MS26 do arroz e de Arabidopsis. Em todos existe uma semelhança significativa entre as regiões de codificação com conservação das regiões intrónicas. De forma importante, os promotores correspondentes do arroz e do milho são aproximadamente de 50 a 60% idênticos, sugerindo que estes promotores podem funcionar de forma suficiente no tapetum do milho para transcrever o gene MS45. Para testar este facto, cada um dos promotores do arroz MS45, BS7, MS26 e de Arabidopsis 5126 foi fundido com 89 a região de codificação do milho MS45 e testados, quanto à capacidade da construção conferir fertilidade, quando transformada em mutantes ms45ms45. Utilizando este sistema de teste, foi observada uma elevada frequência de plantas férteis masculinas para todas as construções.

Em determinados aspectos é vantajoso a utilização de promotores sem ser de milho para expressar o gene MS45. Por exemplo, onde o promotor ARNhp da mesma espécie reduz a função do gene alvo de modo a que a planta não seja viável, ou não reprodutiva, um promotor de uma espécie diferente pode ser utilizado para expressar de forma transcripcional a função do gene complementar (por ex. MS45), contornando assim este problema potencial. Além disso, construções de ARNhp podem ser geradas para tomar como alvo os promotores sem ser de milho para suprimir a expressão do gene MS45 como meio para reduzir ou abolir a função e tornar a planta macho estéril tomando como alvo o promotor sem ser de milho utilizado na cassette de expressão MS45. Por exemplo, uma planta recessiva homozigótica ms45 pode ser transformada com um homólogo do promotor MS45 do arroz conduzindo a expressão do gene MS45 (MS45r::MS45) , tornando a planta macho fértil. Para suprimir a expressão desta cassette MS45r::MS45, pode ser gerada uma segunda planta do milho que é heterozigótica para a mutação do milho MS45 e expressa um promotor MS45r ARNhp. Como não existe nenhum equivalente endógeno das sequências alvo do promotor do arroz MS45 nesta planta de milho, esta planta seria um macho fértil. Esta segunda planta pode ser cruzada numa planta ms45 homozigótica contendo a construção MS45r::MS45 e a descedência pesquisada para as construções de ARNhp MS45r::MS45 e ARNhp MS45r. Nesta situação, a função do gene MS45r::MS45 é suprimida pela presença e expressão de MS45rHP, resultando numa planta estéril masculina. 90 A utilização de tais construções é suportada pelo facto que a expressão do promotor hp 5126 do arroz no milho não resulta em plantas estéreis machos. Este facto constrasta com os resultados obtidos utilizando um ppromotor de milho hp 5126 (ver Exemplo 1) e sugere que a expressão do promotor gancho de cabelo 5126 do arroz é incapaz de suprimir o gene endógeno do milho 5126.

Considerados em conjunto, os presentes exemplos demonstram que os genes da fertilidade da planta endógena podem ser inactivados utilizando supressão mediada por ARNhp e que um fenótipo fértil pode ser reestabelecido nas plantas fenotipicamente estéreis.

Exemplo 3 O promotor de ARN de gancho de cabelo específico suprime a transmissão da resistência herbicida mediada por transgénico

Este exemplo demonstra que o pólen das plantas hemizigóticas para uma construção de gancho de cabelo UBI:PG47 não é viável de acordo com o determinado através da não transmissão de resistência a herbicidas a cruzamentos de exemplares da mesma raça mas sem quaisquer relações de parentesco Tl, quando uma resistência a herbicida é ligada à contrução de gancho de cabelo PG47.

Um ARNhp especifico para o promotor do gene PG47 compreendendo uma repetição invertida do promotor do gene PG47 conduzido por um promotor de ubiquitina (UBI:PG47hp), ligado a uma construção 35S:PAT foi introduzido em células de plantas. 0 pólen de plantas que expressam o transgénico, representando 24 acontecimentos de transformação de número baixos de cópias ou de cópia única foi efectuado a espigas de plantas de milho do tipo selvagem. A colocação das 91 sementes nas espigas era muito boa, e comparável à observada quando o pólen do tipo selvagem foi utilizado. Para cada acontecimento, foram plantadas 32 sementes no solo, e as sementes foram pulverizadas 5 dias após-germinação com 2x herbicida LIBERTY para detectar a transmissão de UBI:PG47hp ligado a 35S:PAT.

Era esperado que se ARNhp específico para PG47 funcionasse na divisão pós-meiótica dos microesporos, então a viabilidade seria normal, e 50% do pólen iria transportar o transgénico conferindo resistência herbicida em 50% da descendência. Contudo, se a função PG47 fosse necessária para a viabilidade do pólen, e a construção de gancho para cabelo pode suprimir a expressão do produto génico PG47, então 50% dos grãos de pólen seriam não viáveis; a todo o pólen não viável iria faltar o transgénico e seria incapaz de transmitir resistência herbicida. Construções UBI:PG47hp sem funcionar seriam detectadas pela presença de plantas resistentes a herbicidas.

Quinze dos 24 acontecimentos testados eram sensíveis aos herbicidas. Este resultado demonstra que as contruções UBI:PG47hp suprimem a expressão do gene PG47 no pólen, tornando 50% do pólen não viável e evitando a transmissão da resistência herbicida ligada operacionalmente à construção de supressão.

Exemplo 4

Plantas contendo promotores múltiplos específicos de ARNs de gancho de cabelo suprimem promotores de alvos múltiplos

Plantas contendo 5126HP (i.e. um transgénico que codifica para um promotor ARNhp 5126) são utilizados como receptores de pólen para plantas que expressam BS7HP. Nas plantas que contêm tanto 5126HP e BS7HP a expressão 92 endógena de 5126 3 BS7 é suprimida conduzindo a um fenótipo de esterilidade mais forte do que o observado com qualquer uma das construções isoladas. São seleccionadas plantas para conter ο 5126HP ou BS7HP, ou ambos e em estado avançado para a maturidade, e são determinados os fenótipos de fertilidade destas plantas resultantes.

Alternativamente ou para além do cruzamento como meio de combinar construções de gancho de cabelo, uma das ditas construções, por exemplo ο 5126HP, pode ser colocado sob o controlo transcripcional de um promotor indutivel. Na ausência de indução, as plantas que contêm BS7HP são capazes de produzir suficientemente pólen para auto-cruzamento. Contudo, por indução de 5126HP, estas plantas são machos estéreis e podem ser utilizadas como fêmeas durante a produção de híbridos. Este processo depende da expressão combinada das construções de gancho para cabelo (HPs) para tornar as plantas inférteis, enquanto que a expressão de apenas um dos HPs não acarreta esterilidade.

Em determinadas concretizações, a expressão de ambos os ARNshp são colocadas sob o controlo transcricional de um único promotor. Neste cenário, os ARNshp podem ser desenhados de forma a conter promotores de alvos múltiplos dentro do mesmo ARN codificado. Por exemplo, a região promotora 5126 pode ser justaposta em relação à região promotora BS7 e colocada sob o controlo transcricional de um único promotor da ubiquitina ou outro promotor constitutivo, de desenvolvimento, ou preferido do tecido, resultando na expressão de um ARN contendo um gancho de cabelo híbrido 5126 e BS7 que dirige a supressão de ambos os genes 5126 e BS7 endógenos. Qualquer combinação e número de vários promotores que tomam como alvo múltiplos e diferentes promotores podem ser utilizados no esquema. Por exemplo, um promotor que regula os genes da altura da planta e um promotor importante para um processo 93 reprodutivo pode ser combinado resultando em plantas estéreis que possuem uma estatura baixa.

Exemplo 5

Manutenção da produção de endocruzamentos e híbridos de plantas que contêm promotores específicos de ARNs gancho de cabelo específicos que suprimem promotores alvo e construções complementares

Este exemplo demonstra como uma planta resultante de endocruzamento contendo duas construções, uma construção de ARN gancho de cabelo dominante (ARNhp) especifica para um promotor e um gene MS45 expresso a partir de um promotor específico do tecido pode ser mantido e utilizado na produção de fêmeas machos estéreis para a produção de híbridos.

Plantas resultantes de endocruzamentos Al e A2 são ambas homozigóticas recessivas ms45ms45. A fertilidade de plantas resultantes de endocruzamentos Al é restaurada através da introdução de um transgénico que expressa a região de codificação MS45 utilizando o promotor 5126. As plantas endocruzadas Al também contêm uma construção que expressa BS7HP. Estas plantas podem ser auto-cruzadas e mantidas independentemente da planta resultante do endocruzamento A2. Nas plantas endocruzadas A2, a fertilidade é restaurada expressando a região de codificação MS45 utilizando o promotor BS7. As plantas resultantes de um endocruzamento A2 também contêm uma construção que expressa um 5126HP. Estas plantas podem ser auto-cruzadas e mantidas independentemente das plantas resultantes de endocruzamentos Al.

Para gerar sementes de fêmeas resultantes de endocruzamentos para a produção de híbridos, a bandeira da planta resultante do endocruzamento Al é removida e 94 fertilizada utilizando pólen da planta resultante de endocruzamento A2 . A semente resultante deste cruzamento é plantada e todas as plantas descendentes são machos estéreis devido à presença de ms45 alelos homozigóticos e de 5126HP e BS7HPs que suprimem os genes de restauração de fertilidade, 5126-MS45 e BS7-MS45, respectivamente. Estas plantas são utilizadas como fêmeas na produção de híbridos e são polinizadas com plantas que possuem o gene MS45 do tipo selvagem que resulta da semente híbrida Fl. Todas as plantas derivadas desta semente são heterozigóticas para o gene MS45 e são por isso machos férteis.

Este exemplo demonstra que plantas contendo tanto construções de supressão dominante e de restauração podem ser mantidas e utilizadas na estratégia de produção de sementes híbridas para gerar plantas resultantes de endocruzamentos fêmeas estéreis e plantas férteis híbridas.

Exemplo 6

Utilidade de plantas que contêm promotores específicos de ARNs de gancho de cabelo que suprimem promotores que tomam como alvo promotores específicos do pólen e construções de complementaridade MS45 para a produção de híbridos e manutenção de plantas resultantes de endocruzamentos

Este exemplo demonstra como um processo que compreende a utilização de duas construções, uma construção de ARN gancho de cabelo dominante (ARNhp) específica para um promotor específico do pólen e um transgénico de restauração, permite a propagação de uma planta que possui uma característica reprodutiva homozigótica recessiva sem perder a condição homozigótica recessiva na descedência resultante para utilização na produção de plantas estéreis para a produção híbrida. Isto é conseguido introduzindo 95 numa planta pelo menos uma construção de restauração transgénica, ligada operacionalmente a uma primeira sequência nucleótidica compreendendo uma cópia funcional de um gene que complementa a caracteristica fenotipica do mutante, através da condição homozigótica recessiva com uma segunda sequência nucleótidica funcional que interfere com a formação, função ou dispersão dos gâmetas machos da planta. A construção é mantida no estado homozigótico e uma planta contendo uma tal construção é designada como de manutenção. A interferência com a formação, função ou dispersão do gâmeta masculino pode ser conseguida ligando as sequências que interferem com a formação, função, ou dispersão do gâmeta masculino com um promotor preferido do tecido do gâmeta. Uma vez que o transgénico se encontra no estado hemizigótico, apenas metade dos grãos de pólen produzidos contêm a construção transgénica de restauração e nehuma destas é viável devido à acção do segundo gene que evita a formação de pólen viável. Por isso, quando a planta de manutenção contendo uma tal construção ligada é utilizada como um doador de pólen para fertilizar a planta homozigótica recessiva, os únicos gâmetas masculinos viáveis fornecidos à planta homozigótica recessiva que contém o alelo recessivo, mas que não contém qualquer componente da construção transgénica. A descendência resultante de um tal cruzamento sexual são não transgénicos em relação a esta construção transgénica.

Enquanto que nenhum pólen viável produzido pela planta de manutenção contém a construção transgénica de restauração, 50% dos óvulos (gâmeta feminino) vão conter a construção transgénica de restauração. Por isso, a planta de manutenção pode ser propagada por auto-fertilização, com a construção transgénica de restauração segregando de tal modo que vai estar contida em 50% da semente de uma planta de manutenção auto-fertilizado. Ligando a construção 96 transgénica de restauração com um marcador seleccionável, 50% da semente que contém o transgénico pode ser isolado para propagar a população da planta de manutenção que permanece homozigótico para o gene recessivo e hemizigótico para a construção transgénica de restauração. Neste cenário, uma planta resultante de um único endocruzamento pode ser mantida. A planta resultante de um endocruzamento AI é homozigótica recessiva para o gene de fertilidade ms45. Plantas resultantes de endocruzamentos AI contêm uma construção em que a fertilidade masculina é restaurada através da expressão da região de codificação MS45 utilizando um promotor especifico de tecido, por exemplo o promotor MS45 nativo. Plantas resultantes de endocruzamentos AI também possuem uma contrução de gancho de cabelo direccionada para suprimir um promotor expresso pelo pólen, neste exemplo, uma construção que expressa PG47HP ligada operacionalmente à construção de restauração MS45; e um marcador seleccionável ou pesquisável, por exemplo um marcador que confere resistência herbicida e/ou uma construção que serve como um marcador visual ou detectável para o rastreio de plantas e/ou de sementes. Estas plantas são férteis e podem ser auto cruzadas e mantidas. A semente nestas plantas vai segregar 50:50 do transgénico, porque apenas o pólen não transgénico é viável e capaz de efectuar a fertilização de um óvulo, 50% do qual contém a construção.

Para gerar sementes para plantas fêmeas resultantes de endocruzamentos para a produção de híbridos, numa única fila, apenas as plantas não-transgénicas das plantas resultantes de endocruzamentos AI são mantidas; estas plantas são homozigóticas recessivas ms45 e machos estéreis. Numa fila adjacente ambas as plantas transgénicas e não transgénicas de plantas resultantes de 97 endocruzamentos AI são cultivadas. A fertilidade nesta fila segrega um para um (fértil para estéril); plantas férteis são utilizadas para polinizar plantas estéreis na fila adjacente. As sementes deste cruzamento são não-transgénicas para o restaurador operacionalmente ligado, as contruções de ARNhp e de marcadores rastreáveis, e toda a descendência são machos estéreis devido à presença do alelo ms45 homozigótico. Estas plantas são utilizadas como fêmeas na produção de híbridos e polinizadas com plantas que possuem o gene MS45 do tipo selvagem resultando na semente híbridoa Fl. Todas as plantas derivadas desta semente são heterozigóticas para o gene MS45 e, por isso são machos férteis .

Este exemplo demonstra que plantas contendo uma construção dominante de gancho para cabelo de supressão de pólen e uma construção de restauração de fertilidade podem ser mantidas como plantas resultantes de endocruzamentos e utilizadas numa estratégia de produção de semente híbrida para gerar plantas resultantes de endocruzamentos fêmeas estéreis e plantas híbridas férteis.

Exemplo 7

Combinações

Dois ou mais componentes das construções aqui descritos podem ser combinados de várias formas para criar sistemas para controlar a expressão genética. Tais combinações podem ser efectuadas ligando os ditos componentes num vector único, utilizando vectores múltiplos em transformações simultâneas ou sequenciais, e/ou através da reprodução de plantas compreendendo um ou vários componentes. São descritos abaixo possíveis componentes e na tabela 1. A tabela 2 fornece representações de 98 combinações ilustrativas, mas não exaustivas úteis para controlar a fertilidade masculina.

Por exemplo, os componentes podem incluir promotores ou regiões de codificação diferentes das listadas, e a ordem dos componentes e a ordem dos componentes nas construções pode ser diferente daquelas apresentadas. Além disso, uma construção poderia compreender combinações de sequências de promotores individuais/promotores, ou de um promotor que conduz a transcrição de componentes múltiplos de sequências de codificação. Como exemplo deste último, uma construção poderia compreender um promotor constitutivo que conduz a transcrição de uma sequência de codificação de MS45, assim como de um polinucleótido que codifica para um produto génico envolvido na produção ou regulação de um marcador rastreável (por exemplo um pigmento) para criar um produto de fusão. Isto permitiria o rastreio de transformantes utilizando qualquer tecido da planta, enquanto que a expressão de MS45 resulta em fertilidade masculina.

Em qualquer uma das construções, um ou vários componentes do promotor gancho de cabelo poderia ser incluído, por exemplo num intrão de qualquer um dos genes codificados, ou numa região de não codificação 5' ou 3', ou como uma extensão inicial ou terminal. Um gancho de cabelo pode tomar como alvo um único promotor, ou dois ou mais promotores num único ARN transcrito. Configurações pólen-promotor de gancho de cabelo e/ou polinucleótidos que codificam para os polipéptidos que destroiem o pólen podem ser vir para evitar a transmissão de transgénicos através dos gâmetas masculinos.

Promotores preferidos ou específicos do pólen ("Poll-P"), incluem, por exemplo, PG47, P95 (início entre os estádios uninucleados médios e tardios; ver SEQ ID N°2), e 99 Ρ67 (perfil semelhante a P95, de expressão mais elevada no estádio uninucleado médio; ver SEQ ID N°:l).

Promotores de tapetum específicos ("Tisp-P") ou preferidos de tapetum ("Tap-P") incluem, por exemplo, MS45 (Patente US 6,037,523); 5126 (Patente US 5,837,851); Bs7 (WO 02/063021); e SB200 (WO 02/26789).

Outros promotores específicos do tecido ou preferidos do tecido úteis na invenção incluem, por exemplo Br2 (Science 302(5642):71-2, 2003, CesA8, e LTP2 (Plant J 6 : 849-860, 1994) .

Promotores constitutivos ("ConstP") incluem, por exemplo, o promotor CaMV 35S (WO 91/04036 e WO 84/02913); e o promotor da ubiquitina do milho.

Genes de fertilidade masculinos ("MF") úteis na invenção incluem, por exemplo, MS45 (Cigan et al., Sex. Plant Reprod. 14:135-142 (2001); patente US 5,478,369) e MS26 (publicação da patente de invenção US 20030182689).

Genes de ablação do pólen ("Cytotox") úteis na invenção incluem DAM (GenBank J01600, Nucleic Acids Res. 11:837-851 (1983); alfa-amilase (GenBank L25805, Plant Physiol. 105(2): 759-760 (1994)); D8 (Physiol. Plant. 100 (3):550-560 (1997)); SacB (Plant Physiol.110(2):355-363 (1996)), lipases e ribonucleases. Neste contexto, é contemplado um único, ou uma fusão de dois ou mais polipéptidos para gerar um produto de fusão. Sistemas de marcadores seleccionáveis úteis na prática da invenção incluem, por exemplo, resistência a herbicidas conferida por PAT ou MoPAT. Sistemas de marcadores rastreáveis úteis na prática da invenção, por exemplo na identificação de sementes transgénicas entre os descendentes da linha de manutenção auto-cruzada, incluem GFP (Gerdes (1996) FEBS Lett. 389:44-47; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), RFP, Dsred (Dietrich et al. (2002) Biotechniques 2 (2):286-293), KN1 (Smith et al. (1995) Dev. Genetics 16 (4):344- 100 348), CRC, P, (Bruce et al. (2000) Plant Cell 12(1):65-79, e Sugaryl (Rahman et al. (1998) Plant Physiol. 117:425-435; James et al. (1995) Plant Cell 7:417-429; U18908).

Configurações de gancho para cabelo podem compreender, por exemplo, PG47hp, P95hp, ou P67hp. Um gancho de cabelo pode tomar como alvo um único promotor ou pode tomar como alvo dois ou mais promotores através de um único ARN transcrito. O gancho de cabelo poderia estar localizado em qualquer posição adequada na construção, tal como um intrão de qualquer dos genes codificados ou nas regiões 5' ou 3' não codificadas.

Tabela 1 Símbolo Descrição Exemplo Poll-P Promotor de pólen PG4 7, P95, P76 Tisp-P Promotor específico do tecido Br2, CesA8, LTP2 Tap-P Promotor de tapetum Ms45, 5126, Bs 7, Sb200 ConstP Promotor constitutivo 35S, Ubi MF Gene de fertilidade Ms45, Ms26 Cytotox Gene citotóxico DAM, Alfa-amilase, D8, SacB Herb R Resistência ao herbicida PAT, MoPAT rastreio Marcador rastreável RFP, GFP, KN1, CRC, Sul HP Gancho de cabelo PG47hp, P95hp, P6 7hp 101

Tabela 2

Descrição Componentes Cytotox único+Selecção Poll-P: Cytotox/Tap-P:MF/ConstP:Herb R Cytotox único +Selecção+rastreio Poll-P: Cytotox/Tap-P:MF/ConstP:Herb R/Tisp-P:rastreio Cytotox dupla+Selecção Poll-P: Cytotox/Poll-P:Cytotox/Tap-P:MF/ConstP:Herb R Cytotox única +rastreio Poll-P: Cytotox/Tap-P:MF/Tisp-P:rastreio Cytotox dupla+rastreio Poll-P: Cytotox/Poll-P:Cytotox/Tap-P:MF/Tisp-P:rastreio Gancho de cabelo+Cytotox única +Selecção ConstP:HP/Poll-P:Cytotox/Tap-P:MF/ConstP:Herb R Gancho de cabelo+Cytotox única +rastreio ConstP:HP/Poll-P:Cytotox/Tap-P:MF/Tisp-P:rastreio Gancho de cabelo+selecção ConstP:HP/Tap-P:MF/ConstP:Herb R Gancho de cabelo+rastreio ConstP:HP/Tap-P:MF/Tisp-P-rastreio Gancho de cabelo/fusão de macho fértil+rastreio ConstP:HP+MF/Tisp-P-rastreio Gancho de cabelo/fusão de macho fértil+selecção ConstP:HP+MF/ConstP:Herb R Gancho de cabelo incorporado/macho fértil + selecção ConstP:MF HP incorporado/ConstP:Herb R Gancho de cabelo incorporado/macho fértil + selecção ConstP:MF HP incorporado HP/Tisp-P:rastreio Gancho de cabelo incorporado/ rastreio Tap-P:MF/ConstP:rastreio HP incorporado Cytotox único gancho de cabelo incorporado/ rastreio Poll-P:Cytotox/Tap- P:MF/ConstP:rastreio HP incorporado Fertilidade constitutiva/ rastreio com gancho de cabelo incorporado ConstP : (MF+rastreio) HP incorporado Tap-P:Cytotx/ConstP: (MF+rastreio) HP incorporado 102

Exemplo δ

Selecção baseada em marcador visual

As experiências descritas abaixo foram concebidas para perguntar se o gene pl do milho, quando expresso a partir de vários promotores não-pl poderia ser utilizado como um marcador visual para uma semente que transporta um transgénico ligado. Como parte da concepção experimental, a coloração da semente da planta transformada, assim como a coloração da semente gerada por pólen de cruzamentos de exemplares da mesma raça, mas sem quaisquer relações de parentesco da planta transformada foi testada para examinar a herança maternal e paternal da expressão do gene pl. 0 gene pl do milho é um activador transcricional relacionado com Myb que se demonstrou regular os genes al e c2 para produzir 3-desoxi flavonoides, tal como C-glicosil flavonas, 3-desoxiantocianinas, flavan-4-ois e flobafenos (Grotewold et al., PNAS 88:4587-4591 (1991)). Sintese destes compostos e de compostos relacionados resulta na coloração de orgãos florais incluindo o pericarpo, espiga, sedas, cascas e glumas de bandeiras (Cocciole et al., Plant J 27(5):467-478 (2001)). Tipicamente a expressão deste gene é maternal; isto é cruzamentos do gene pl de exemplares da mesma raça mas sem quaisquer relações de parentesco não confere coloração a partes reprodutoras até a próxima geração ser crescida a partir da semente. Como se verificou que o gene pl conferia cor aos tecidos do milho não reprodutivos por expressão constitutiva em células BMS (Black Mexican Sweet) (Grotewold et al., PI Cell (1998) a expressão do gene pl foi investigada colocando o gene pl sob o controlo transcricional sob os promotores preferidos da semente de milho END2 e LTP2. Os promotores constitutivos actina de arroz e ubiquitina do milho foram 103 também utilizados para regular transcricionalmente o gene pl. Estes vectores iriam testar se a expressão do gene pl iria conferir suficientes diferenças de cor para ser utilizado como um marcador visual.

Os vectores seguintes foram introduzidos no milho por transformação de Agrobacterium e testados, quanto à cor da semente tanto da planta transformada e das espigas polinizadas com pólen das plantas transformadas.

23030 End2:Pl-UbimoPAT 23066 Actin:Pl-UBimoPAT 23069 LPT2:Pl-UBlmoPat 23528 End2:P1-35SPAT 23535 LTP2:P1-35S:PAT 23537 UBI:P1-35S:PAT

Transformação com PHP23030 e PHP23069 produziu plantas que apresentam sementes coradas segregadas ambas nas espigas das plantas primárias transformadas e nas espigas polinizadas pelo pólen destas plantas transformadas. Para PHP23030, 12 dos 14 acontecimentos independentes utilizados para cruzamentos de exemplares da mesma raça mas sem quaisquer relações de parentesco apresentaram grãos de cor castanha segregados entre os grãos amarelos numa proporção de segregação aproximada de 1:1. As espigas nos transformantes primários foram polinizadas com pólen de plantas não-transformadas e os grãos nestas espigas também estavam segregados em grãos castanhos:amarelos numa proporção aproximada de 1:1. Foram observados resultados idênticos em três dos quatro acontecimentos gerados com PHP23069.

Foram escolhidas sementes castanhas e amarelas de 5 acontecimentos de PHP23030 de cópia única e plantadas para testar a germinação das sementes castanhas e co-segregação 104 do marcador de resistência herbicida ligado, 35SPAT, com os grãos coloridos. Neste pequeno teste, a maioria da semente castanha (>95%) produziu plantas resistentes a herbicidas, em que 39 das 40 plantas que germinaram a partir de sementes amarelas eram sensíveis ao herbicida.

Um exame detalhado das sementes castanhas de PHP23030 revelou que a camada de aleurona apresentava fluorescência verde, enquanto que o endoesperma das sementes castanhas de PHP23069 apresentava uma fuorescência verde forte, quando comparada com as sementes amarelas segregadas da mesma espiga. Este facto é consistente com a observação de fluorescência verde observada em células BMS bombardeadas com 35S:P1 (Grotewold et al., Plant Cell 10(5):721-740 (1998)). Além disso, um exame dos caules transformados com PHP23528 (End2:P1-35SPAT) e PHP23535 (LTP2:P1-35S:PAT) revelou em contraste com caule não transformado GS3, que ambos os caules fluoreceram a verde PHP23528 e PHP23535. A observação de fluorescência verde nestes caules transformados e a co-segregação de sementes castanhas com o marcador herbicida seleccionável nas plantas transformadas indicou que a expressão de pl a partir de pelo menos promotores preferidos das sementes pode ser utilizado como um marcador visual para identificar tecidos de milho transformados.

Exemplo 9

Alternativas para citotoxicidade do pólen

Como apresentado nas tabelas 1 e 2, a destruição da função do pólen pode ser conseguida através de numerosos processos, incluindo degradação dirigida do amido no grão de pólen, ou interferência com a acumulação de amido no pólen em desenvolvimento. Por exemplo, uma construção 105 compreendendo a região de codificação da alfa-amilase encontra-se operacionalmente ligada a um promotor especifico do pólen. A região peptidica do sinal secretor nativo pode-se encontrar presente; pode ser removido; ou pode ser substituído por um péptido de sinal dirigido por um amiloplastídeo. Noutras concretizações, uma construção pode compreender um operador específico do pólen ligado operacionalmente a uma região de codificação para a beta-amilase; ou para uma enzima de desramif icação tal como Sugaryl (Rahman et al. (1998) Plant Physiol. 117:425-435;

James et al. (1995) Plant Cell 7:417-429; U18908) ou pululanase (Dinges et al. (2003) Palnt Cell 15(3): 666-680;

Wu et al. (2002) Archives Biochem. Biophys. 406(1):21-32). São criadas por exemplo, construções de gancho para cabelo que tomam como alvo o gene do promotor do milho Sugaryl. Devido à perda da actividade da enzima de desramificação do amido, mutantes sugaryl apresentam grãos contraídos. Expressão constitutiva da repetição invertida do promotor deveria provocar perda da actividade do promotor Sul e resultar em morfologia do grão alterada herdada.

Listagem de Sequências <110> Pioneer Hi-bred International, Inc. <OôíSííiíS* β««8 Τ***9**» 3!>-3 *3m« «*30> 15M-Krr «1S0> SS;630.4?0 «1S1> 2003-12-1¾ -is3:-6«íssi;276 -151:-2004-0720 «m* 2 -:170=- FsstSEO ís? Wiftdsws VWSê0ft44 -013:--1 -7<í··- 5H2 Ό -2- Df-íA «213> 2eã msy* -220:- -221:- jsfóspoa-í -:222- {1)..-1112--223 - ?«? -:400- 1 «0 i20 isa 34.9 3 OS 36« 4*0 460 S48 ««« «SS 72« 78« 84« SSO «60 Í0*S 4980 Xll?. gacgcgactg cfcaxctgcgfc gagateacgt •jfctt.tfcgAga gaccetgcsa tafcaatgcag ogttacát.gt cceacgfccgt í.gtagagatg attK.i^tge tcaeeaaaaá cgafctcOçctc c«}«aãcgi:ga ccgaaírsaag tcggcxceíiis tgfcagcgcag ««afcegagtg «çtc&gaçta aaattggaea ctgacaacaií t^tcgatsffca etetgg-saac agagfcatfcea gctx-câcgt ftxcaocxgfet t*9§fcas«a® ccetaacogc tgsggfcaaag t-çe^çfcíffcg tatgactáct fc9§â«c:®99« gagectggca gafcae&ee&g e.gccastgc.-a «afcaasaaat: «<fga»fct;Kfc« «atatactft fcctaggecgfc nagcsagsa» gfctfcfcctfcfca tgfctgfccfctc cat.gaí-í.aet t-.gf-cattsag afcggtagtaag «ascagagat; <sa«ag3tgfc« eagcOi-.tgas egçtacgccs fctgaágfttxfc fca«gR;gagg« aacfctíctclpa tgaccgocgfc saaç«9SC«c oacctcgssg Xafefcggfcgtg gtfctgtgtgfc gcgtaoecfcg eaeeeíígaae fccfccgagcac gagatcfcfcgt fcafcgtfcogac fcgfegt«g«afc tacctctgta tgaatcatga egagaassgee gfcfcgfctfcceg «gtasiccagag çfetettat.ie.a gaaaaa««aa ccgtcgtcgt í.c-.-vcgcícat «tctfcgctcg «fcfcggggge» sgtaagccgt cg ««tagtxagg egafcgfcgcafe atfcaggaSfaa ttgceatcga cgcafceatcc tctrtat-aaáfc caccatfcgfct ccctctfcttt aaa«f.CQçgt ecaeggafcgt fcgggcccag» gatcattCcç attcgcaaíiç? tgcttgg«fce gccccagfctfc. gt««tcessfc ctaaaaaecfc aagcgtftgt tfcvtccfcctg etgfcgaoegg ggaaaabaag ccacgfccgtK gatctaaect agcaxgt&ag gçsttcatxg aggagtagtc gcstccg&gs,· eggesgctça egccgfetgçfc gcfcg»aaggc aaaatttttt cccccttaet tgacgct.gcc tcacaccaaa aecacattgçr gagctegcgc - 2S0.- 2 - 211:--212- DfiA <72 - 2ao í-iay-s. -220- -221:- p?«m«i-í?· -222· ;i) <i«S2- -:223- 200 -700- 2 107 gçgaegEega gsesacgag» ggctegtaeg gggaeasege gefcaggtetc ttagtcagat 50 ee.gttcaaafc ctettaatfce ttgtoetcct tctcagteoa gttcttacat ctatctgtct 120 gateaeafcta fcfcteea&eae caettgaacc aatcfcgçttft gatgccecgt teetgatgfct ISO gtcgtefttg tcactttctc gaegtgcgtt çjtcgtccgac cctgacccct Cctcgatgce 24S tcatctcega cagacgacga gtfefcageaâa ceagcgageg ttgattctct gccgaaa&gg 3õo ttgcetgace ecgtctcctc cccgatggcc etecacfctcg sgaagatçae cacfctcgaga íêó agatcaecag ateaatatcc gsaaagatac acatagtt ta gattxagtca geaa&aagct 42o aac&ttatgfc Etgeetctte· tatfceatafca gfctfctcttag eatgs.aattt aaat&etat» 450 tagtâctggt ttçecacgag eotactfcaat tKtaecaggg ctaatttggt aaccacatte 540 fctcçaeggaa ftetcaattfct cetaaggaaa attagttaat tfctcgcfctgg gaaaatagaa 400 attteatggg aaaatgçggt tcceaaacta gcettagcct tataggtttt fctttagççca 650 tgtgaattct egteaaaggg açtcagtcsa cttcacagca ggtgraggifcgg fcfctttgaatg 720 cceaaataca gatecgttaa ttaaoettea. gagggccagg acgeggtcgc ccgaacgggc 760 ggaegcgcga acaatcegec cgcccgegcg cgcgacctge cacttegggc cafcggccagc 040 seçcagcatg cgfccgtccta aacg&egaae accgcscgtt ggcgcfcafcaa agccccgccc 900 eggcgtcecc tEgtcaattc ga.agecfefcee çggttacccc tfecggcctoc accstatcacc 960 acccgggacg tcttcfiaggg tcteeccgta gtagaafcage fccfcatcfccae cgcaacaacfc lãSO ccccattaca tccttfcagga gaggctgatc gattggtâga fcacgtaeteg ggtggagoag 1000 •sacaacgaga §a 1092

Lisboa, 29 de Abril de 2010.

Claims (9)

1 Reivindicações 1. Processo para manter a condição homozigótica recessiva de uma primeira planta de milho, quando se cruza com uma segunda planta de milho, compreendendo (a) disponibilização de uma primeira planta de milho macho estéril com um genótipo homozigótico recessivo para uma caracteristica que afecta a viabilidade ou fertilidade. (b) introdução por transformação numa segunda planta de milho de uma construção génica de restauração exógena compreendendo (i) uma primeira sequência nucleótidica que quando introduzida na primeira planta iria restaurar a caracteristica homozigótica recessiva, estando a primeira sequência nucleótidica numa condição hemizigótica; (ii) uma segunda sequência nucleótidica ligada à primeira sequência nucleótidica que inibe a formação, função, ou dispersão de gâmetas masculinos da planta de manutenção, em que a segunda sequência nucleótidica encontra-se operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão preferencialmente para os gâmetas masculinos; e disponibilizando uma planta que compreende a dita construção génica de restauração como uma planta de manutenção; (c ) cultivando a planta de manutenção de tal modo que todo o pólen viável produzido contém o alelo recessivo e não contém a dita construção do gene de restauração; e (d) polinizando a primeira planta com a planta de manutenção para produzir descendência que mantém a condição homozigótica recessiva da primeira planta. 2

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira sequência nucleótidica restaura a fertilidade masculina de forma esporofitica.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a dita primeira sequência nucleótidica é MS45.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a dita sequência nucleótidica é SBMu200, BS92-7, MSI ou MS2.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito promotor é seleccionado a partir de MS45, BS92-7, e SBMu2 0 0 .

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a segunda sequência nucleótidica encontra-se operacionalmente ligada a um promotor indutivel.

7. Planta de manutenção de milho de acordo com a reivindicação 1, em que se é autofecundada produz descendência numa proporção 50:50 machos estéreisrmachos férteis.

8. Planta de manutenção de acordo com a reivindicação 7, compreendendo ainda uma terceira sequência nucleótidica ligada à primeira sequência nucleótidica que codifica para um produto marcador capaz de ser utilizado para a selecção de descendência compreendendo a construção génica de restauração.

9. Planta de manutenção de acordo com a reivindicação 8, em que a terceira sequência nucleótidica codifica para um produto genético que fornece resistência a um químico, um produto génico que fornece um marcador visual num tecido 3 vegetativo ou reprodutor, ou um produto génico que afecta a cor do tecido. Lisboa, 29 de Abril de 2010.