JPH05502370A

JPH05502370A - 分子量３９ｋＤａの赤痢病原体抗原およびそれに対する遺伝子暗号付与

Info

Publication number: JPH05502370A
Application number: JP2513749A
Authority: JP
Inventors: ゲイブ，ジェフリー; ドレイゴン，エリザベス; マッカマン，マイケル
Original assignee: エムエル　テクノロジー　ヴェンチャーズ　エル．ピー．
Priority date: 1989-09-13
Filing date: 1990-09-11
Publication date: 1993-04-28
Also published as: WO1991004036A1; EP0491859A1; CA2025230A1; EP0491859A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は赤痢病原体抗原に関し、特に家豚赤痢病原体抗原（以下「抗原」と略記する）、それらを遺伝暗号付与（コード）する遺伝子、それらの遺伝子に対してコードするＤＮＡによって遺伝処理される細胞、および前記抗原の使用方法に関する。さらに詳しくは、分子量約３９ｋＤａの家豚赤痢病原体抗原、および遺伝子組み換え法による前記抗原の生産方法に関する。家豚の赤痢は全ての主要養豚国において容易ならぬ感染性の病気で、その症状は、粘液出血性下痢、脱水症状および体重減少である。この発明は、前記赤痢を判定し処理するのに有効な抗原、およびそれを生成するための遺伝子工学的方法を提供する。発明の一見地においては、分子量約３９ｋＤａ　（キロダルトン）の抗原のエピトープを認識する抗体を誘発することが可能なタンパク質を提供する。発明者は、家豚赤痢病原体が、約３９ｋＤａの複数種のタンパク質に対して遺伝暗号付与する（以下、「コードする」とする）ＤＮＡを含むことを発見した。さらに詳しくは、約３９ｋＤａの複数種のタンパク質に対してコードするところの少なくとも８種の遺伝子が存在し、かつこれらの遺伝子でコードされたタンパク質は、複数個の可変区域で連結された複数個の保存区域を有することが判明した。前記可変区域は、タンパク質内の親水性の部位にあり、他方保存区域は疏水性の高に部位に位置する。３９ｋＤａ群遺伝子によってコードされた成熟ペプチドから予測されるアミノ酸の各配列を比較すると第１図の通りとなる。第２Ａ、２Ｂ図中のタンパク質の信号ペプチドに対応するペプチド配列は、この比較の目的からは除外゛する。この比較を検討することにより、各遺伝子は類似分子量のタンパク質をコードし、可変配列によって中断された保存タンパク質配列が存在することが判明する。この保存区域は一般にタンパク質の疏水性の高い区域で、可変区域は親水性の高い区域に存在し易い（Ｋｙｔｅ　＆　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、分子生物学ジャーナル、１９８２年１５７巻１０５頁）。すなわち８種の異なる抗原あるいはその断片または類似体を提供し、これらを以下略して遺伝子１−８あるいはコピー１−８と記載する。この発明の他の見地では、分子量約３９ｋＤａの種々の赤痢病原体抗原に対してコードする少な（とも８種の遺伝子が提供される。さらに異なる見地では、分子量約３９ｋＤａの抗原あるいはその断片または類似体をコードするＤＮＡ配列を含む発現伝播体またはクローニング伝播体を提供する。さらに分子量約３９’ｋＤａの前記抗原に対してコードするＤＮＡによって遺伝子操作される宿主細胞または宿主生体を提供する。抗原あるいはタンパク質を特徴付ける３９ｋＤａという分子量は、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅｌ、２２７巻、６１１１０−６８５頁に記載されたレームリ−（Ｌａｅ＋ｏｎ＋１ｉ）のＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝液を使用する不連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を適用し、濃度１０−１７％のアクリルアミドを使用して、ビスアクリルアミド／アクリルアミド比を１＝２９とすることにより得られる。かくして８種の異なる遺伝子でコードされる分子量約３９ｋＤａの８種の病原体抗原が存在することが判明した。＃５遺伝子（Ｃｏｄ９６８プローブ）（表２）に対して特有的なオリゴヌクレオチドプローブが合成され、スクリーニングに使用された。（以下、場合により、家豚赤痢病原体をｒＴ、Ｈｙｏｊと略記する。）このＤＮＡ配列から生成されるタンパク質が、赤痢病原体抗原のエピトープを認識する１つの抗体を誘発する機能を有すると仮定すれば、このＤＮＡ配列は、全体として単一の抗原であるタンパク質に対して暗号付与ができるのみらなす、その抗原の断片または誘導体のタンパク質、あるいは抗原または断片と、他のタンパク質との融合生成物であっても、それに対して遺伝暗号付与ができるのである。従って例えば、分子量３９キロダルトン（以下、ｋＤａとする）の抗原の断片が３９ｋＤａの抗原のエピトープ（抗原の構造を決定する決定基、１個または複数個）を認識する抗体を発生するならば、前記ＤＮＡ配列は、この３９ｋＤａの抗原の断片あるいはその中に３９ｋＤａの抗原の断片を有するタンパク質に対して遺伝暗号付与ができるのである。同様に、抗原の誘導体が、例えば、ペプチド鎖内の１＠または２個以上のアミノ酸の突然変異体であって、その誘導体が、上記の赤痢病原体の抗原のエピトープを認識する抗体を誘発させる機能を有する限りにおいては、そのような誘導体であるタンパク質に対して、上記のＤＮＡ配列が暗号付与を行うことができるのである。つぎに、（ｉ）前記病原体抗原のエピトープを認識する抗体を誘発させる機能を有する１種のタンパク質と、（ｉｆ）それ以外の１種のタンパク質、例えばカイモシン等との融合生成物のタンパク質に対しても、前記ＤＮＡ配列が暗号付与を行うことができる。これらの分子量３９ｋＤａの抗原は、病原体の特定の菌種間において若干の相違があってもよい。例えば血清型Ｂ２０４の３９ｋＤａタンパク質は血清型Ｂ２３４のものと微差はあるが、かかる型の抗原ならびにこれらに暗号付与する遺伝子も、本質的には互いに同等のものと見なされる。要するに、「特に赤痢病原体用と指定された抗原のエピトープを認識するところの抗体を誘発させる機能を有するところの、１１１のタンパク質に対する遺伝暗号を作成するＤＮＡの配列」という用語の意味は、ＤＮＡの種々の配列が、形質転換された細胞内において、種々のタンパク質に対する遺伝暗号を付与し、要すれば発現することを意味し、そのタンパク質は適切な抗原であることは勿論、その断片または誘導体であってもよ（、あるいは、この抗原とその断片または誘導体と、その他のタンパク質との融合生成物であってもよいということである。また、１つの細胞内にベクターが導入された場合、そのベクター内に存在するＤＮＡ配列は、その配列によって暗号化されているタンパク質の一部分のみを発現することができるものであるが、そのようなりＮＡ配列もまた、発現されたタンパク質の一部が、病原体抗原の１種または２種以上の抗原のエピトープを認識する抗体を誘発することができるならば、そのＤＮＡ配列も前記の用語の範囲に含まれるものとする。例えば、このＤＮＡ配列は、すべての抗原に対して暗号を付与することができるが、発現されるタンパク質は、その抗原の断片である。また、クローン化された伝播体が、２種以上の病原体抗原または断片に対して暗号化するＤＮＡを含み得ることも理解できる。家豚赤痢病原体の３０ｋＤａタンパク質に対して遺伝暗号付与する遺伝子（ｌ、２．３．４．５．６．７あるいは８）とは、完全長遺伝子によって遺伝暗号付与された完全良家豚赤痢病原体の３９ｋＤａの抗原の少くとも１種のエピトープを認識する少くとも１種の抗体を誘発することが可能なタンパク質に暗号付与するところの全遺伝子配列、あるいは完全長遺伝子配列またはそれらの類似体、断片あるいは誘導体を意味する。また「遺伝子１．２．３．４．５．６．７あるいは８によって遺伝暗号付与されるタンパク質」とは、全長すなわち完全長遺伝子によって遺伝暗号付与された家豚赤痢病原体の３９ｋＤａタンパク質あるいはその類似体、または誘導体であって、それが、完全長遺伝子によって暗号付与された完全長の前記病原体の３９ｋＤａ抗原の少くともＩｌｌのエピトープを認識する少くとも１の抗体を誘発することが可能である場合を意味する。適切なりＮＡ配列であれば、広く種々のベクターあるいはプラスミドの何れにも含まれることができる。このようなベクターは、染色体および非染色体の、および合成′のＤＮＡ配列を含み、例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母菌プラスミド、あるいは、プラスミドと、ファージＤＮＡ、ウィルスのＤＮＡ（例えば牛痘、アデノウィルス、家禽痘ウィルス、偽似狂犬病など）との組合せからめられたベクター、などである。この適切なりＮＡ配列は、穐々の方法でベクター中に挿入することができる。一般に、このＤＮＡ配列は、従来周知の方法により、適切な制限酵素の位置に挿入される。これらの手法はいずれも、周知の範囲の技術と見なされる。発現ベクター内におけるＤＮＡ配列は、成る適切な発現制御配列（プロモータ）と有効に連けいされて、メツセンジャーＲＮＡ合成を支配する。かかるプロモータの代表的な例としては、次の各々を挙げることができる。即ち、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモータ、大腸菌（Ｅ、ｃｏｊ２ｉ）の９．ａｃ　（ラクトース）プロモータ、ｔｒｐ　（トリプトファン）プロモータ、ファージラムダＰＬプロモータ、および、原核細胞および真核細胞またはそれらのウィルス内の遺伝子の発現を制御するために知られている他のプロモータである。発現ベクターは、翻訳開始と転写終了のためのリポソーム結合位置をも含む。さらにベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含むこともできる。さらに、好ましくは発現ベクターは、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸塩還元酵素またはネオマイシン耐性の如き、あるいは、大腸菌内のテトラサイタリンまたはアンピシリン耐性の如き、形質転換された宿主細胞を選択するための表現形質を与える遺伝子を含むことが望ましい。前述のとおり適切なりＮＡ配列ならびに適切なプロモータあるいは制御配列を含むベクターを使用すれば、成る適切な宿主の形質を転換させ、その宿主がタンパク質を発現するようにさせることができる。適切な宿主の代表的な実施例を列挙すれば、大腸菌、ねずみチフス菌等の細菌細胞、酵母菌等のカビ細胞、ＣＨＯまたはバラス（Ｂｏｗｅｓ）の黒色腫等の動物細胞：および植物細胞、その他である。適切な宿主の選択は、この分野に精通する者にとっては容易になし得ることである。前述のとおり、選択された部位に挿入された適切なりＮＡ配列を含む発現伝播体は、今問題の病原体抗原のエピトープを認識する抗体を誘発し得るタンパク質に対して暗号付けをする遺伝子の一部ではないところの、ＤＮＡ配列または遺伝子配列を含むものでもよい。例えば、所望のＤＮＡ配列は、発現の助長、純粋化の改善、あるいは適切なタンパク質の発現を可能にしたり、免疫原性を改善するようなりＮＡ配列に対して、同一の解読枠内において、融合させたものでもよい。つぎに、ワクチンを開発しようとする場合、中和化抗体または感染防御抗体を、天然抗原の不連続で立体構造依存性のエピトープに向って狙いを定めることもできよう。それゆえ、組換え形発現系から得られたタンパク質は、自然環境においての、もとのタンパク質分子の３次元構造（立体構造）とは可成り異なった立体構造を有する可能性があることを考慮に入れておかねばならない。かくして遊離されたタンパク質の免疫原性に依存して再生させて、適切な分子的立体構造を回復させることが必要となり得る。タンパク質の再生の方法は、科学文献中に多数見出されるが、その方法は、（１）アルカリ、カオトロープ、有ａｍ媒、およびイオン式界面活性剤等の試薬を使用して、不正規にからみ合ったタンパク質を変性（はどく）シたのち、希釈、透析、またはｐＨ調整によって再生して、変性を除去し、（２）タンパク質を脂質２重層即ちリポソームに再構成し、免疫原性タンパク質に対して細胞膜のような環境を再構成させるのである。この発明によれば、前記説明の形式のクローン化伝播体によって形質転換された宿主から生成されるタンパク質を、生理学的に許容しつる伝播体と関連させることにより、家豚の赤痢病原体に対する予防が可能となる。前記の指摘のとおり、このようなタンパク質は、前記病原体の１種または複数種の抗原のエピトープを認識する抗体を誘発する機能を有する。このような発現されたタンパク質は、以下の説明中では「組換え形鋼原体抗原」と称することもあるが、前述のとおり、タンパク質が同時に断片や誘導体または融合生成物として含まれるような病原体抗原と同一のタンパク質ではない。「組換え形鋼原体抗原」という用語は、断片、誘導体あるいは融合生成物をも包含するものである。組換え形赤痢病原体抗原は、その病原体に対する予防効果を達成する量においてワクチン内に混入される。一般にワクチンの１回処方量は、少くとも５マイクログラムの組換え形赤痢病原体抗原（以下、「病原体抗原」とする）を含有する必要があるが、好ましくは１００マイクログラムの病原体抗原を含有する方がよい、多（の場合、２０ミリグラム以上の量のワクチン中でも、前記の必要量の病原体抗原を含有していないのが通例である。前記病原体に対するワクチンに対して、「予防」または「予防する」という用語を使用する場合、それは、ワクチンが、家豚の赤痢病原体を駆逐すること、あるいはその病患症状の重症を軽減することを意味する場合のみならず、その両者を含める意味にも使用する。複数の処方が行われるときは、一般に６週間の間に３種以上の処方を行ってはならない。組換え形鋼原体抗原との関連において使用される伝播体は、種々の伝播体のうちの何れか１種が使用される。適切な担持体の各実例としては、ワクチン用の鉱物油、明ばん、合成高分子等の担持体が周知であり、適切な担持体の選択は、当業者にとって容易である。その選択は、ワクチンの投与の方式によっても左右される。ワクチンは、注射用の処方でもよく、または筋肉下、静脈内、鼻腔内、あるいは皮下注射によっても行われる。または、ワクチンは、食物または水と混合しての経口投与、または錠剤形とする等も可能である。その他種々の投与方式が考λられるが、この発明においては、特定の投与方式に限定されない。またワクチンには、病原体抗原のまたはその断片の他に、活性成分その他の補助剤が添加されることは、前述のとおりである。またこの発明によれば、前記説明の形の病″原体タンパク質抗原の１種を、特殊な結合体として使用することにより、病原体抗原に対抗する抗体を検出し、判定することが可能となる。換言すれば、病原体抗体用の免疫検定法であって、その検定法中には、病原体抗原が結合体として使用され、特定的に病原体抗体を結合させるようにする方法である。この検定法では、サンドイッチ形の検定器を使用するのがよ（、病原体抗原がバインダとして固体支持体に支持され、試料内にある病原体の特定の抗体と、結合された抗体とを結合させ、適切なトレーサで判定されるものである。このトレーサは、着脱可能なラベルを付着したリガンド（配位子）より成る。リガンドは、病原体抗体によって免疫学的に結合された形のリガンドで、このリガンドは既知の方法でラベル付けすることができる。固体支持器上の病原体抗原に対して結合される病原体抗体は、例えば、１つの適切な着脱可能なラベルで表示された病原体抗体用の１つの抗体を使用することによって判別される。このサンドイッチ式検定法では、病原体抗体に対してラベル付された抗体、単一クローン化抗体でも、多クローン化抗体でもよい。例えば多クローン化抗体は、家豚対向のグロブリンＩｇＧでもよく、または特に赤痢病原体に対して用意された１つの抗体であればよく、これは通常の手法で生成されたものでよい。例えば、その病原体抗体を適切な動物に注射して得られる。着脱形ラベルは、酵素、放射性ラベル、色原体（ケイ光染料または吸光染料でもよい）その他の内から適宜に選択できる。ラベルの選定は周知の技術に属する。抗体の固体保持器も、種々の固体保持器の中から適宜選択でき、その選定も周知の技術と見なされる。例えばマイクロ滴定板、管、粒子等があるが、この発明ではいずれにも限定はしない。抗原は通常の方法で支持され、例えばコーティング、共有結合体等である。その選定も通常の技術と見なされる。サンドイッチ形検定器は、種々の方法で遂行でき、例えば「前進」、「後進」または「同時」があるが、前進法が最適である。代表的な手法では、固体支持器に支持された病原体抗原を、まず病原体抗体を含むと想定されるサンプルに接触させて、サンプル中に存在するいずれか特定の抗体を、支持体上の抗原に結合させる。固定支持器を洗浄したのち、病原体抗体に結合するトレーサに支持器を接触させる。抗体がサンプル中に存在すれば、トレーサは、車体支持器上の抗原に結合された抗体に結合されるようになり、支持器上のトレーサの存在が、サンプル中に病原体抗体が存在することを示すゆトレーサの存在は、周知の手順で着脱形ラベルの存在を判別することによって判断される。サンドイッチ形検定法が最適ではあるが、病原体抗原の検定は他の方法もある。例えば、膠着検定法では、抗原がラテックス粒子などの固体粒子上において使用される。また、この発明は、病原体抗体は前記と同様に支持して、トレーサがリガンド（配位子）と着脱ラベルより成る検定法、即ち１組の試薬キットとした検定法を提供する。トレーサのリガンドは、病原体に結合されている。試薬は、適宜なキット即ち試験パッケージに収納され、さらに緩衝剤等の他の成分を含ませることができる。病原体抗原は、固体支持器に支持させる方がよい。この発明の発現伝播体のＤＮＡ配列により、少くとも１種のタンパク質に対して遺伝暗号を付与し、このタンパク質が病原体抗原のエピトープを認識する抗体を誘発する効果を生ずる。またこの発現伝播体により、宿主生物の形質転換を可能とする。さらに、前記宿主によって発現される少くとも１種のタンパク質を有する予防ワクチンの実現を可能ならしめる効果がある。４、

【図面の簡単な説明】

付表１は、血清型Ｂ２０４からのペプチド単一配列なしの場合の、３９ｋＤａ遺伝子フアミリーの遺伝子生成体の各々の比較表：付表２Ａは、３９ｋＤａ抗原１−４を暗号付与するＢ２０４遺伝子のＤＮＡ配列；付表２Ｂは、３９ｋＤａ抗原５−８を暗号付与するＢ２０４遺伝子のＤＮＡ配列：付表３は；プラスミドｐＴｒｅｐ　１０６　の家豚赤痢遺伝子挿入体のヌクレオチド配列：４４表４は、発現プラスミドｐＴｒｅｐ　３０１　の部分ＤＮＡ配列；付表５は、ＰＣＲから誘導された赤痢病原体（Ｂ２０４）クローンから予想されるアミノ酸配列；付表６・は、プラスミドｐＴｒｅｐ　７０２の推定アミノ酸配列；付表７は、プラスミドｐＴｒｅｐ　７０４の推定アミノ酸配列；付表８は、プラスミドｐＴｒｅｐ　５０５の遺伝子組換え生成体から予想されるタンパク質配列である。第１図は、３９ｋＤａ遺伝子をスクリーンして得られた遺伝子群とサブクローン；第２図は、プラスミドｐＴｒｅｐ　５０５のプラスミドマツプ；第３図は、プラスミドｐＴｒｅｐ　７０２の構成図；第４図は、プラスミドｐＴｒｅｐ　７０４の構成図；第５図は、プラスミドｐＴｒｅｐ　Ｐ　ＣＲ発現伝播体の構成図。今回の発明について、以下の例に関してさらに説明する。しかしながら、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。例では特に断わらない限り、精製、切断および連結は「分子クローン化、実験手技Ｊ　（Ｍａｒｉａｔｉｓら著、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２年）の記載にしたがって実施する。以下の例では、特に示されない限り、変換はＣｏｈｅｎら（ＰＡＮＳ、６９．２１１０　（１９７３年））の方法にしたがって実施する。例１．天然の抗原の精製および回復Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉｅａのＢ２０４株は、下記のように調製した肉汁培地で成長させた。脳・心臓浸出液（Ｄｉｆｃｏ社製）３７グラムを１リツトルの蒸留水で希釈し、オートクレーブ処理後放冷し、ブドウ糖溶液（最終濃度を５グづム１リットルとする）および仔牛血清（最終濃度を５％（容量対容量）とする）を無菌状態で添加した。この培地をあらかじめ還元する（嫌気状態とする）ため、窒素９０％、二酸化炭素１０％の組成のガス流を２４時間潅流させた。この完成した培地に容量１〜１０％の活発に成長している１２立り旦培養物を播種し、温度を３７〜３９℃に保ち、培地のｐＨは６．８に維持して、酸素を含まないガスを連続的に潅流させ（流速、５０ｍｊ２／分／培地１リットル）で培養した。細胞密度が５Ｘ１０′１個／　ｍ　４２以上に到達したら（顕微鏡下で計数）、この発酵過程から細胞を取り出す。細胞を遠心分離によって集め、１０ｍＭの酢酸カリウム、ｐＨ４，７５，１５０ｍＭの塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄と再遠沈な２回繰り返した。次に細胞を１０ｍＭの酢酸カリウム（ｐＨ４，７５）に再浮遊し、光学的濃度が（６００ｎｍで）２５〜３０になるようにした（溶液の希釈液について測定）。この場合、典型的な例では元の培地の容量の約１／２０となる。抽出方法次にこの細胞懸濁液にＴｗｅｅｎ−２０（非イオン化洗剤）を加え、その最終濃度を０．２％とした。１０分間そっと攪拌してから細胞を遠心分離した（１０，０００且で１０ｆ＋間）。上演分画を捨て、細胞を同じ容量の酢酸緩衝液に再浮遊し、Ｔｗｅｅｎ−２０を２．０％の最終濃度で添加して抽出した。遠心分離後、２％Ｔｗｅｅｎ−２０の上清液（洗剤によって可溶化した抗原プール）を取り置いて、細胞の塊は再びＴｗｅｅｎ−２０に浮遊し、抽出した。この一連の操作を５回繰り返し、その間にＴｗｅｅｎ−２０の濃度を約２％から約ｌＯ％へと増加させた。こうして得られた洗剤によって可溶化した上清分画を１つに合わせた。この抽出方法により、エエ立り旦の表面タンパク質が選択的に（定量的ではないが）可溶化され、細菌の溶解や破裂は起きない。抗原調製物を濃縮するために、上清分画を超遠心分離（１００、ＯＯＯｘｇ）に１．５時間かけ、得られた塊（Ｈ３Ｐ’）をｐＨ６，８の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液に再懸濁し、超音波で拡散させた。抗原の精製次に再懸濁したＨ３Ｐを１５容のｐＨｓ、８のＴｒｉｓ塩酸と、６Ｍの尿素を０．４５μＭのフィルターで濾過したものと混合した。これを室温で２．３時間攪拌した。１００，０００Ｘｇで遠心分離し、上演（ＬＩＳＩ）を別に取りおいた。この段階で得られた塊の分画（ＵＰＩ）は第２段階として尿素に再懸濁して抽出を行った。この物質を前回と同じように遠心分離し、上清（ＵＳ２＋および塊（［ＪＰ２１を収集した。ＵＦ４の主要なタンパク質成分は３９ｋＤａで、３９ｐ抗原と呼ばれることがある。この３９ｐ抗原は、ＳＤＳ存在下での分子ふるいカラムクロマトグラフィーまたはアクリルアミドゲルからの電気溶出によってさらに精製された。上記の尿素に溶けない塊（ＵＦ４）の主要タンパク質成分として分離される沈澱可能な形態（３９ｐ）に加えて、可溶性の３９ｋＤａの抗原（３９ｓ）を分離することができる。３９ｓ抗原を作製するため、１工立エユ細胞を上記の方法でＴｗｅｅｎ−２０を用いて抽出した。最後のＴｗｅｅｎ−２０による抽出の後、残った細胞塊を湿重量１グラムあたり約２ｍεの１０ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ４，７５）に再懸濁し、超音波処理を行った。超音波処理をした細胞の塊は、４℃で２６．０ＯＯＸ４の遠心分離を１５分間行い、３９ｓ抗原と分離した。次に得られた上清を２０℃ で１００，０ＯＯＸｚの遠心分離に２時間かけ、超音波処理によっても放出された沈澱可能な膜に関連したあらゆるタンパク質を塊にした。上清（３９°）には、主要なタンパク質成分として３９ｓ抗原が含まれているが、これを２μＭのフィルターで滅菌ろ過し、４℃または凍結状態で保存した。４℃で保存した場合には、何らかのタンパク質分解が３９ｓ抗原に起きる。２６．０ＯＯｘ且で得られた細胞塊に対して、上記の超音波処理および遠心分離の手順を繰り返すことにより、さらに３９°を分離することができる。元の培養物の容量１リツトルあたり、約４ｍｇの３９１が得られる。この収率はＵＦ４の収率とほぼ等しい。３９ｓタンパク質と３９ｐタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で同一の電気泳動移動性を示す。この２つのタンパク質は、免疫学的にも交差反応性を有する。ＵＦ４に対して作製された抗血清や、ゲル精製を行った３９ｐは、ウェスターンプロット法により３９ｓを認識する。逆に３９°に対して作製された抗血清は、ウェスターンプロット上の３９ｐを認識する。また３９ｓと３９９は、工１２８で標識した完全な二工立ｎ細胞の表面上を、優勢なタンパク質とともにいっしょに移動する（　１Ｊａｒｃｈａｌｏｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ、第２４巻、９２１ページ（１９７１年））。ブタから得られた抗血清で、ブタの赤痢を実験的に感染させて回収したものでも、３９ｋＤａ抗原の３９ｓまたは３９ｐのいずれかの型を識別する。例２．３９ｓおよび３９ｐ抗原のタンパク質配列発酵およびタンパク質精製は、例１と同様に実施する。２回目の尿素抽出法の遠心分離によって得られた不溶性物質（ＵＦ４）には、単一の主要なタンパク質成分が含まれており、これが３９ｐ抗原である。この不溶性のタンパク質は、３％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび７０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むｐＨ６，８の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ＝塩酸中で煮沸することにより、溶解することができた。この溶液をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、その際にはセファロ−ゼロ　Ｂ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡＩの３０ｃｍのカラムを用いた。３０ｋＤａのピークは、カラム溶出液の分画についてゲル電気泳動を行って識別した。ピークに相当するあたりの分画な合わせて、アセトンによる沈澱でタンパク質を濃縮し、遠心分離によって回収した。得られた塊を１．１％のＳＤＳに溶解し、次にクロロホルム・メタノールで抽出して残ったＳＤＳを取り除いた。上記のように調製した３９ｋＤａのタンパク質のアミン端末のアミノ酸配列を決定するため、自動化されたＡｐｐｌｉｅｄＢｉａｓｙｓｔｅｍｓ社製のガス相配列機において、連ｍ　Ｅ　ｄ　ｍの分解を用いた。このようにして明らかにした、本タンパク質の最初の４１個のアミノ酸の配列を以下に示す。Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＩＩｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−７−７− Ａｒｇ−３９ｓのアミノ酸端末のペプチド配列は、３９＠の調製物から直接得られた。３９１の調製物はアセトンによる沈澱で濃縮し、配列を決定した。さらに３９ｓ抗原の内部におけるペプチド配列を明らかにするため、内タンパク質分解酵素ＬｙｓＣ（−１／１００Ｗ／Ｗ）をｏ、ｉ％のＳＤＳを含むｐＨ８，５の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸中で作用させ（３７℃、１６時間）、消化した。タンパク質分解により分割生成物は逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、Ｖｙｄａｃ　ＣＪカラム（２５０ｍｒａｘ４．６＋ＩＩｍ、　５μＭ）中でＯ％〜１００Ｂ％の直線勾配（０％は０．１％三弗化酢酸、１００Ｂ％は６７％のアセトニトリル、３３％のイソプロパツールおよび０．１％の三弗化酢酸）を用いて展開し、配列を決定した。３９ｐ抗原のペプチド配列は上記のように展開されたが、これについても同様の方法で決定した。また３９′″からは、内タンパク質分解酵素■８（”　１／１００Ｗ／Ｗ）を０．１％のＳＤＳを含むｐＨ７，８の５０　ｍ　Ｖ　Ｎ　Ｈ４ＨＣＯ３中で作用させて分割生成物を消化によって得、これを精製したところい（つかのタンパク質配列がさらに得られた。また３９ｐ抗原の内部配列は、次のようにして決定された。３９ｋＤａのタンパク質（ＵＦ４の細胞分画にある）を内タンパク質分解酵素Ｌｙｓ−Ｃを用いてタンパク質分解消化を行い、得られたペプチド断片をＨＰＬＣで精製してアミノ酸配列を決定した。３９ｋＤａのタンパク質３００μｇをまずアセトンで沈澱させ、次にｐＨ８，５の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ液に４Ｍの尿素を溶かした溶液に再懸濁し、２．５μｇのＬｙｓＣで消化した（３７℃、１６時間）。Ｃ−４逆相カラムを用い、０．１％三弗化酢酸中のアセトニトリル：イソプロパノール（２：１）の勾配で展開したところ、溶出された物質からはピークとして１つのペプチドが得られた。精製したこの断片は次のような内部配列を示した。ｖａｌ　ｇｉｎ　ｈｉｓ　ｓｅｒ　ｌｅｕ　ａｌａ　ｔｒｐ　ｇｌｙ　ａｌａｔｙｒ　ａｌａ　ｇｌｕ　ｌｅｕ　ｔｙｒ　ｖａｌ　ａｒｇ　ｐｒｏ　ｖａｌ　ｇｉｎ　ａｓｐ　ｌｅｕｇｌｕ　ｇｌｕ　ｔｙｒ　ｐｈｅ　ｇｌｕ　ｍｅｔ　ａｓｐ　ｉｌｅ　ａｓｎ、、。このアミノ酸配列は、ＵＰ２分画の３９ｋＤａ成分のタンパク質分解酵素耐性成分を、キモトリプシンで消化した後にも決定した。ＵＰ２タンパク質を２　ｍ　ｇ　／　ｍ　１２の濃度で懸濁した液を超音波処理し、０．１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３−１２洗剤を含むｐＨｓ、８の２５ｍＭ　ＴｒｉｓＪｉ！ｆｌ液に２０ｕｇ／ｍｊ２のキモトリプシンを入れた申出、３７℃で１６時間培養した。配列決定に先立って予備的なゲル電気泳動を行い、クロロホルム・メタノールによって沈澱および抽出を実施したところ、電気溶出によってタンパク質分解酵素に対して抵抗性の２７ｋＤａの生成物が単離された。この成分は次のような配列を示した。ａｓｐ　ｘｘｘ　ｘｘｘ　ｔｈｒ　１ｙｓ−ａｓｐ　ｔｙｒ　ｍｅｔ　ｇｌｙ　ｉｌｅ　ｓｅｒ　ｔｈｒ　ａｓｐ　ｉｌｅ　ｇｉｎ　ｌｅｕ　ａｒｇ　ｔｙｒ　ｔｙｒ　ｔｈｒ　ｘｘｘｉｌｅ　ａｓｐ　ａｌａ　ｐｈｅ　ａｓｎ　ａｌａ　ｉｌｅ　ａｒｇ　ｌｅｕ　ｔｙｒ　ｐｈｅ　ｌｙｓ　ｔｙｒ　ｇｌｙ　ｇｌｎ　ｘｘｘｘｘｘ　ｐｈｅ３９ｐおよび３９ｓから得られたアミノ酸配列のデータをまとめて比較したものを、例の後に付けた表１に示した。タンパク質の全体について配列の決定を実施してはいないが、いずれのデータも３９ｐ抗原と３９ｓ抗原とにアミノ酸配列の違いを示すものではなかった。したがって、３９ｐ抗原と３９ｓ抗原のアミノ酸配列は非常によく似ており、同一のものかもしれないと結論することができる。例３一般的な方法特に断わらない限り、後出の例では下記のｒ一般的な方法１を使用した。Ａ、ニー立り旦のＤＮＡのゲノム蔵書の構築４８　ｕ　ｇ　（＋）　Ｌ」ニーＢ　２０４株のゲ／　ムＤ　Ｎ　Ａを、Ａ１．ｕＩによって部分的に消化した。ＥｃｏＲＩリンカ−を製造者（Ｐｈａｒｍａｃｉ、ａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙｌの指示に従ってＰ３２ＡＴＰで活素化し、５０単位／　ｍ　ｉｌのＢＭＢリガーゼを用いて１３３ｕｇ／ｍｇのリンカ−濃度でＡｌｕ　Ｉによって部分的に消化されたＬ２立しユのＤＮＡと連結させた。−晩連結を行わせた後、リガーゼを熱によって不活化し、反応物をＥｃｏＲＩで消化した。このＤＮＡは、カラム緩衝液として０．３ＭのＮａＣβ。＄）Ｈ８，Ｏの０．０５ｍＭのＴｒｉｓ塩酸、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０６％アジドナトリウムを用い、Ｓ−２００（Ｐｈａｒｖａｃｉａｌカラムで分画化し、遊離したリンカ−や遊離ＡＴＰを取り除いた。回収された二、立上ユのＤＮＡは、ＰＲｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｌから入手し、製造者の明細書に従って使用した脱リン化したラムダｇｔｌｌ　ＥｃｏＲｒの腕と連結させた。次にこの連結を±ｎ　ｖｉｔｒ。包装キット、ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡＩから人手したｌｒＧｉｇｐａｒｋＪを用いてラムダバクテリオファージ粒子中に収納した０次にこのファージをＥ、ｃｏｌｉ　Ｙ　１０９０ｒ−株（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｌの定富ファージ培地に滴定した。白色斑の数は、もとのファージ保存液が合計０．５ｍｇの中に１．４Ｘ１０’　ｐｆｕ／ｍ℃を含んでいたことを示した。Ｂ２組み換えファージの識別３９ｋＤａ遺伝子について混合オリゴヌクレオチドスクリーニングを実施するために、Ｌ　Ｄ、　ＢｅｎｔｏｎとＲ，１１，Ｄａｖｉｓの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　、第１９６巻、１８０ページ、１９７７年）を用いた。二個ずつのフィルターの各オリゴヌクレオチド探針と交雑した。約１０’　ｃｐｍ　（１〜２ｍｇの探針）の探針をフィルターに使用し、３７℃で一晩処理した。交雑溶液の成分は次のとおりである。５ｘＤｅｎｈａｒｔｓ０．１μｍのｙＡＴＰ２５０ＬＬｇ／ｍｆ２のＥ、　ｃｏ　Ｉ　ｉ＋ＲＮＡ６ｘＮＥＴ　（Ｉ　ＸＮＥＴ＝１５０ｍＭのＮａｃｊ２．１５ｍＭのＴｒｉＳ塩酸、ｐＨ７，５，１ｍＭのＥＤＴＡ）０．５％のＮＰ４０１ｍＭのどロリン酸ナトリウム交雑に先立って、フィルターは交雑溶液で２時間、３７℃で洗浄した。交雑後、フィルターはＲＴ　（２０分・洗浄）で２回、０．１％ＳＤＳを含む６ＸＮＥＴで３７℃（２０分・洗浄）で１回洗浄した。次にフィルターを乾燥させ、Ｘ線フィルムに暴露した。陽性斑を選択し、再びスクリーニングして斑を精製した。ファージＤＮＡはＣ，Ｈｅ１ｍ５らの方法（ＤＮＡ、第４巻、３９ページ、１９８５年）を用いて単離した。Ｃ，ＲＣＲ計画１．１０ｍｇのゲノムＤＮＡ　（Ｂ２０４またはＢ２３４）を１０μρのＩＯＸ反応緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌ＋ａｅｒ　Ｃｅｔｕｓｌ、１６ｕｆ２の１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ　（各々）、２５．、ｇのｐｒｉｗｅｒ＃　１　（４１ＬＭ　）　、および２５ｕ、９のｐｒｉｖｅｒ＃　２（４μＭ）と混合し、ＱＨｘ○を用いて最終容量を１００μβとした。２、この混合物を９４℃で１．５分間加熱し、タンノ（り質を変性させ、５０℃ で２．５分間焼還した。Ｔａｇポリメラーゼ（１５Ｖ／ｕ、９）　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓｌ　ｏ、５μεを添加し、５５℃で１０分間重合を行わせた。３、第２段階で明記した時間および温度条件で、変性、焼還および重合をもう一度実施した。４、重合時の温度を６５℃に上げて、第２段階と同様の変形、焼還および重合を２３回繰り返した。５、最後の増幅過程の後、この混合物をフェノール：クロロホルム（１：　１）およびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた。６、抽出および沈澱の後、この試料を適切な酵素（ＢａｍＨｌおよびＨｉ　ｎｄ３）によって消化させ、望みのベクター（ｐＶＣ８またはｐＶＣ９）を用いて連結した。Ｄ１点斑点スクリーニング計画１、細菌のコロニーを一晩培養してスクリーニング蚤こカニける。２、−晩培養したもの５０μ２を遠心分離し上清を取り除く。３、細胞の塊を、１０ｍＭのＥＤＴＡを加えたｐＨ８，０の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸に、鶏卵の白色リゾチーム（１ｍｇ　／　ｍ　１２　）を添加した液２００ＬＬＩ２中に再懸濁する。４、室温で５分間培養する。５、短時間（３秒間）の超音波処理を行う。６．３ＮのＮａＯＨ２０ｇ、９を添加し、７０℃で１時間培養する。７、ｘｉになる＊で冷却ｔ、、２Ｍ（７）ＮＨ４０Ａｃを２２０μ２添加する。混合する。８、真空を利用してニトロセルロースのフィルターに適用する。９、フィルターを空気乾燥する。９０℃で２時間焼く。１０、望みの探針でフィルターを探索する。Ｅ、割目翻訳探針の調製１．５０ｎｇのＤＮＡの断片を９μ２のＴＥ中で５分間煮沸し、タンパク質を変性させる。氷上で冷却する。２、５ｕＡ（１）ガンｖａＡＴｐ　（６，０ＯＯＣｉ／ｍＭｏｆ２゜１０ｍＣ１／ｍｊ２）、ＩＯＸ反応緩衝液（ＢＭＢ）に溶解した変性ヘキサマー２μ２．３ μ２のｄＮＴＰ　（２５μＭのｄＧ−、ｄＴ−およびｄＣＴＰ、最終濃度）および２ＬＬ！２のＫｌｅｎｏｗ　（２０／ＬＬｎ、ＢＭＢ）を添加する。３．３７℃で３０分間培養する。１０ｒｒ＋ＭのＥＤＴＡ３０μβを添加して停止させる。４、Ｇ−５０回転カラム（ＢＭＢ）を用いて、標識された断片を取り込まれなかった標識化合物から単離する。Ｆ、割目翻訳探針によるスクリーニングの手順スクリーニングの手順は次のとおりである。１、焼いたニトロセルロースのフィルターを、ｐＨ８，０の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸に１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．　１％のＳＤＳを加えたもので、３７℃で２時間あらかじめ洗浄する。２、フィルターを５０％の脱イオン化ホルムアミド、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　５　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　、　０　、　１％のＳＤＳおよびサケの精子のＤＮＡ　（１００ｕｇ／ｍｌの中で２時間４２℃であらかじめ交雑する。３、割目翻訳探計を５分間煮沸してタンパク質を変性させ、氷上で冷却する。４、あらかじめの交雑した溶液およびタンパク質を変性させた探針の中で、４２ ℃で一晩交雑を行わせる。５、フィルターを２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて室温で２回洗浄する。６、Ｏ，ｌＸ５ＳＣ中で４２℃で１回洗浄する。７、フィルターを乾燥させ、−７０℃で遮へい板を強化してＸ線フィルムに暴露する。Ｇ、セメント質の調製１、−晩培養した細胞を、元の容量の１／２５のｐＨ８，０の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸に１０ｍＭ（７）ＥＤＴＡと１ｍｇ／　ｍ　ｊ２のりゾチームを添加した液に再懸濁する。２．３０〜６０分間培養する。超音波処理によってＤＮＡを破壊し、粘度を下げる。３．１／１０の容量の２ｏ％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を添加する。実験用振どう器で２時間攪拌する。必要に応じて超音波処理を行い、粘度を下げる。４．１０，０ＯＯＸ且で１０分間遠心分離し、塊状のセメント質を得る。５、セメント質を元の容量の１／２５のｐＨ８，０の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸に、５ｍＭのＥＤＴＡと５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を添加した液に再懸濁する。超音波処理を行う。実験用振とう器で一晩攪拌する。６．１０．０ＯＯＸ且で１０分間遠心分離し、塊のセメント質を得る。セメント質を５　ｍ　ＭのＥＤ″ＴＡを含むｐＨ８，０の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸で洗浄する。遠心分離する。７．５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ８，０の２０ｍＭ　ＴｒｉＳ塩酸を元の容量の１１５０用意し、この中に再懸濁する。例４．３９ｋＤａ抗原の一族の最初の仲間のコードを示す遺伝子の識別例２に示したアミノ端末のアミノ酸配列のデータを使用して、−組のＤＮＡ探針を合成した。これらの１つ１つは変性した配列のプールから成るもので、下記に示すように目標部位のアミノ酸配列のコードを示すヌクレオチドの可能な組み合わせのすべてを包含する。各探針はヌクレオチド１７個分の長さである。！ＯＧ　ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ＝９６ｆｏｌｄＡｌｕＩによって部分消化された一エ立しユのゲノムＤＮＡ（８２０４株）に由来するＥｃｏＲＩで結鎖した断片を含むラムダＧＴＩＩ蔵書を、探針で走査した。３−５Ｃｆｉという１つのファージが、探針５５３および５５５との交雑によって識別された。このＤＮＡはＥｃｏＲＩによる消化の後に検査され、１．６ｋｂの挿入部を含むことがわかった。このＥｃｏＲＩの側面に位置するファージ３−５ＣＩ２からの１．６ｋｂのＤＮＡ部分は、アクリルアミドゲルからの電気溶出によって単離され、次いでＥｃｏＲＩによる消化を受けて直線化されていたプラスミドｐＵｃ１９に連結したものである。これらのＤＮＡはともに連結し、旦、ｃｏｆｉｉの中に変換され、組み換えプラスミドｐＴｒｅｐ’１０６（付表３）を含むクローンが、プラスミドＤＮＡの分析または制限消化によって確認された。プラスミドｐＴｒｅｐ１０６は、蛋白質の合成を試験管内での３５３−メチオニンを含む組み合わさった転写・翻訳系に向けるために使用した。この系による蛋白質生成物を５ＤＳ−ゲル電気泳動にかけたところ、ニエｍユのＤＮＡ挿入が行われていない親のプラスミドでは見られなかった３９ｋＤａの蛋白質が認められた。このことがら、クローン化されたＤＮＡには、皿、ユＬ旦３９　ｋ　Ｄ　ａ抗原のための完全なコード配列が含まれており、Ｅ、ｃｏＩ２ｉが７のプロモーターおよびリボゾーム結合部位を認識することができ、この異質な蛋白質の合成を方向づけることができることが示唆される。プラスミドｐＴｒｅｐ１０６によって変換された旦、二二工土の株は、目的の３９ｋＤａ　Ｔ、工Ｕ抗原を相当量生産することはなかった。したがって、組み換え抗原が高水準で発現するようにするプラスミドの構築は、以下のように行った。ＥｃｏＲＩの側面に位置する、ｐＴｒｅｐ１０６の１．６ｋｂの断片は、ＥｃｏＲＩによる消化のために直線化したプラスミドｐＵｃ１８へと連結された。得られたプラスミドｐＴｒｅｐＨ２はＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し、次にエグゾヌクレアーゼｍで処理してＣ一方向性に）、３９ｋＤａ　二、立！ユ抗原の開始コドンと予想されているＡＴＧ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｇｅｖｅ　、第２８巻、３５１〜３５９ページ、１９８４年）の上方にある無意味なりＮＡ配列を取り除いた。この消化の間の種々の時間にＤＮＡの部分を取り除き、エグゾｍをフェノール抽出によって不活性化し、残りのＤＮＡはヌクレアーゼＳＩによる消化によって鈍い末端部を持つようにし、次にこのＤＮＡを再連結させてＥ、ｃｏ！２ｉの変換に使用した。このような新しいクローンから得られたプラスミドＤＮＡ、ｐＴｒｅｐＨ２−１のヌクレオチドの配列決定（Ｓａｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ、第７４巻、５４６３ページ、１９７７年）により、成熟したニエ立ヱｏ３９ｋＤａ蛋白質のコードを示す３７２個のコードに近接する配列と、信号配列からの７個のアミノ酸が、親のｐＵＣ１８プラスミドのＨｉｎｄｌＩ［部位の下方に結合していることがわかった。この結合は読み取り枠にあり、その発現がＣａｃプロモーターによって調整されると思われる結合蛋白質のコードを示している。ただし、このためにはクローン化された断片の向きが、ＨｆｎｄＩ［＋がらＥｃｏＲ１部位へとｐＵＣ９の中へクローン化することにより逆にされなくてはならない（付表４参照）。得られたプラスミドｐＴｒｅｐ３０１によって変換されたＥ、ｃｏＩ２ｉは不溶性の３９ｋＤａ抗原を生成したが、この抗原はブタから採取した血清と免疫吸取紙およびプレートＥＬ　ｒ　ＳＡ分析の双方で反応する。（用いたブタの血清は、ブタ赤痢から回収したものと、１２ｍから精製した３９ｋＤａ蛋白質によって免疫した動物からのものの両方であった。）３９ｋＤａ抗原の組み換え型の精製旦、ｃｏＱｉのＣＹ−１５，０００株でプラスミドｐＴｒｅｐ３０１を含むものを、アンピシリンを２００ＬＬｇ／ｍβ含むＬｕｒ　ｉの肉汁２５０ｒｒ＋４２中で培養した。この培養物は３７℃で１８時間培養された。細胞は遠心分離によって収集し、元の容量の１／２０の２５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのｐＨ８，０のＥＤＴＡおよびｉｍｇ／ｍ℃のりゾチームを含む緩衝液に再懸濁した。室温で３０分間培養した後、細胞は溶解してさらに超音波処理で破壊した。非イオン系の洗剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を最終濃度が２％となるように添加し、細胞溶解物を室温で１時間混合し、次に１．０．０００×且で遠心分離した。これらの段階の後の不溶性の塊の分画を回収した。この分画の主要蛋白質成分は、約４０ｋＤａのＭｒを持っていることが、５ＤＳ−ゲル電気泳動後の試料をＣｏ關ａｓｓｉｅブルーで染色することで判断された。この同一の蛋白質成分はウェスターンプロット分析によって、ＵＰ２分画から得られた本物の３９ｋＤａ１−エヱユ蛋白質に対して作製したブタおよびマウスの抗血清によって認識された。またこの組み換え蛋白質は、実験的に引き起こされたブタ赤痢から回復したブタの血清を用いて探りあてた免疫プロットによっても認識された。この例において得られた３９ｋＤａ組み換え抗原について予想されたアミノ酸配列は、１２工！ユのＵＰ２分画の３９ｋＤａ抗原のアミノ酸配列と非常に良く似ているが、同一ではない。しかしながら、これらは単一の血清によって認識される共通のエピトープを有している。これ以降に示すように、この例で生成した３９ｋＤａ組み換え抗原は、異なるニー立しユ抗原のコードを示す多重遺伝子の１つである遺伝子１によってコードを示された蛋白質に相当する。これらの多重遺伝子の分子量は約３９ｋＤａである。以下の例４で議論するように、エエ立り旦のゲノムには分子量が約３９ｋＤａの関連した抗原のコードを示す遺伝子が少なくとも７個存在する。これらの遺伝子のうち１つだけの生成物しか試験管内で培養した細胞からは単離されていないが、この遺伝子群の別のものが生体内では表現され、この分野における感染からの防禦に対して免疫学的な関連のあるものである可能性がある。これらの蛋白質それぞれに先行して信号配列があるという観察効果から、これらはすべて発現する時には細胞の細胞質から搬出されるだろうということがわかる。試験管内で培養した細胞の表面を、ＩＩｔｓとラクトペルオキシダーゼの存在下で標識すると、ＫＧＰ分画の３９ｋＤａ蛋白質が識別される主要な蛋白質である。したがって、３９ｋＤａ遺伝子族の別の遺伝子が発現している細胞では、試験管内でＣｏｐｙ５遺伝子を発現している細胞とは、非常に異なる表面の構造が見られるかもしれない。この３９ｋＤａ遺伝子族の１形態に対して増加する免疫反応は、別の形態のうちの１つを発現している細胞に対してはほとんどはっきりした効果が認められないかもしれな例５．３９ｋＤａ抗原族の追加メンバーのコードを示す遺伝子の識別３９ｐからの内部アミノ酸配列は、ｐＴｒｅｐ３０１のアミノ酸配列として予想されたものとは充分異なっており、変性させたオリゴヌクレオチド（Ｃｏｄ　６６４、表２）の選別および合成が可能と考えられた。このオリゴヌクレオチドは、ｐＴｒｅｐ１０６の遺伝子生成物のコードを示す配列と、３９ｋＤａ抗原のコードを示すものとを識別するために利用できるだろう。ｐＴｒｅｐ１０６のスクリーニングに用いたラムダＧＴＩＴ／Ｂ２０４の蔵書は、Ｃｏｄ６６４によって探査され、またｐ”ｒｒｅｐ３０１からの３９ｋＤａ蛋白質のアミン端末部分のコードを示す４１１個の塩基対５ｐｈｌ−Ｂａｌｌ断片から作り出された割目翻訳探針によっても探査された。さらにＢ２０４ゲノムＤＮＡを部分的に制限酵素５ａｕ３ａで消化したものと、ＢａｍＨＩで消化したラムダＥＭＢＬＳとによる連結によって構成されたライブラリーも、これらのプローブ（消息子）によってスクリーン（分離増殖）された。このスクリーニングの結果、コード５５４．３０１Ｓｐｈ−Ｂｃｌあるいはこれら両者に対して交雑された多くのファージが確認された。交雑化したファージは精製されクローンされ、プラスミドｐＵＣ８，９，１８または１９が得られ、ラムダファージ、その交雑パターンおよびサブクローン群を表３に示す。サブクローン体および内部ペプチド配列からのＤＮＡ配列に基づいて、類似の３９ｋＤａタンパク質にコードする少なくとも６種の関連遺伝子が存在することが判明した。分析の結果、ＵＰ−２，３９★分画中に発見された３９ｋＤａ抗原を、＃５遺伝子が最もよくコードすることが推定された。サブクローンまたはそれらのいずれの組合せであっても、＃５遺伝子の完全長コピーを含んでいなかった。そこで他のプローブを調製して３９ｋＤａ抗原をコードする遺伝子の残余部分を分離するための他のプローブを調製した。３９ｓと３９ｐ抗原から得られたカルボキシ末端断片のペプチド配列から抽出された縮退オリゴヌクレオチド（Ｃｏｄ　１０１９とＣｏｄ１０２０）をも使用して、ＧＴＩＩライブラリーをスクリーニングし、＃５遺伝子用の配列に一層広範にコードする配列を含む１種または２種以上のファージが得られた。若干のアミノ酸に対するコドンの使用が、３９ｋＤａ系の他の遺伝子中に見られる使用法と類似であると仮定すれば、前記Ｃｏｄ　１０１９と　１０２０の変性は減速される。この追加スクリーニングによって特定されたファージと、それらの交雑パターンおよびサブクローン群を総合した結果を表７に示す。重複サブクローン群から抽出されたＤＮＡ配列により、３９ｋＤａ抗原群は、タンデム形に反復された３９ｋＤａ遺伝子の２種のサブファミリー中に発見されることが判る。ファミリー１には（１〜４）が、ファミリー２には（５〜８）が包含される。各遺伝子は、内部バクテリア細胞膜を通してのタンパク質の移送を指示する仮想信号配列により、そのタンパク質にコードする。完全長遺伝子１〜８の各々に対する遺伝子配列および予測アミノ酸配列を付表２．２ａに示す。さらに第１図は２種のライブラリーをスクリーニングして得られた遺伝子ファミリーとサブクローン群のマツプである。付表１は、異なる完全長の７種の３９ｋＤａの病原体抗原および遺伝子のカルボキシ末端断片にコードする１〜７遺伝子の処理生成体の予測アミノ酸配列間の関係を示す。パーキンエルマー／セタス法ポリメラーゼ連鎖反応装置は、３９ｋＤａの完全長コピーを含むクローン群を判別するスクリーニングファージライブラリーに対する補充として使用された。遺伝子＃ｌ、２．３（３°末端のみ）および＃４　（５’末端のみ）は、確かに特有の内部ＤＮＡ配列を含んでいるとはいえ、元来、同一の５°および３°ＤＮＡ配列を含むものである。かくして５′配列および３′配列の反転補動列に相当する２つの連係オリゴヌクレオチドは、合成されてＤＮＡ合成用のプライマー（補助物質）として使用された。次いで血清タイプＢ２０４またはＢ２３４から得られたゲノムＤＮＡの鋳型と混合された。このオリゴヌクレオチドとＤＮＡとの混合体を２５サイクルの熱変性サイクル、アニーリングおよびＴａｑポリメラーゼ使用ＤＮＡ合成を通過せしめ、２個のオリゴヌクレオチドブライマーの間のゲノムＤＮＡ配列を増幅した。これらの合成された配列は、制限酵素ＢａｍＨＩおよび　Ｈｉｎｄ　ＩＩ■によって切断され、ｐｕｃｓあるいはｐＵＣ９にクローニングされた。ｐＵＣ８ににクローンされた場合は、断片の各々は読み取りフレームに整列され、９個のアミノ酸より成る融合タンパク質のＬａｃプロモータから発現されるようにされた。クローン群は、ドツトプロットスクリーニング法の規定に基づいてスクリーニングされた。この非判別プローブおよびＤＮＡ配列分析のみに対して交雑された若干のクローン群は、ＤＮＡ配列に多少の不一致はあるとしても＃７遺伝子に相当することが判明した。これらのサブクローン群および交雑パターンの要約は、実例により表４に示す通りである。ＰＣＲ方式は、完全長３９ｐ／３９ｓ抗原を暗号付与する＃５遺伝子を合成しクローニングするためにも使用された。使用されたオリゴマーはＣｏｄ１０５４、Ｃｏｄ１０５５で、前者は＃６遺伝子の５゛末端のＤＮＡ配列から、また後者は３９ｐ／３９ｓ抗原のカルボキシ末端を暗号付与するＤＮＡ配列の反転補足から抽出された。この配列により、＃５遺伝子が他の遺伝子から識別される。次いでオリゴヌクレオチドはゲノムＤＮＡと混合され、Ｔａｑポリメラーゼの存在において２５サイクルの熱変性サイクル、アニーリングおよびＤＮＡ合成を通過し、干渉配列を増幅された。増幅された混合体は、制限酵素ＢａｍＨ１およびＨｉｎｄ３で切断され、ｐＵＣ８または９中ヘクローンされた。各プローブと交雑された。１つのクローンは、ベータガラクトシダーゼプロモータの制御下において発現される遺伝子に対する全コード配列を有する。選ばれたクローンを選別してＣｏｄ９６８、ＣｏｄｌＯ１９、Ｃｏｄ１０２０およびＣｏｄ９５７へ交雑された。そのうちの１種のｐＴｒｅｐ６１３は、ｐＵＣのベータガラクトシダーゼプロモータの制御下において発現される遺伝子に対するすべてのコード配列を有する。ＰＣＲ方式は、コピー＃８全長抗原をコードする＃８遺伝子を合成しクローンするためにも使用された。この方法で使用されたオリゴマーは、それぞれが遺伝子の３′、５°末端に相当するＣｏｄ１３５９およびＣｏｄ１４３８であった。これらのオリゴヌクレオチドを、Ｂ２０４またはＢ２３４からのゲノムＤＮＡと混合し、複合酵素Ｔａｑポリメラーゼの存在下において熱変性、アニーリングおよびＤＮＡ合成のサイクルを２５回実行して、干渉配列を増幅した。増幅された混合物を制限酵素ＢａｍＨＩと５ａｌｌとで切断し、ｐｕｃｓまたはｐＵＣ９中にクローンした。若干のクローン体を選択し、これらをＣｏｄ９５７に交雑させた。そのうちの１種のｐＴｒｅｐ５４１は、ｐＵＣのベータガラクトシダーゼプロモータの制御下において発現される遺伝子に対するすべてのコード配列を有する。このプロモータ制御反応（ｐＴｒｅｐ　３４５．５４１．６０４．６０５．６２０．６１３）によって抽出された８２０４発現クローンの図解は第５図の通りである。これらのクローンでコードされると予想されるアミノ酸配列を付表５に示す。＃２および６遺伝子に対応するゲノムＤＮＡサブクローンからの３９ｋＤａタ　ンパク質の組換え型の発現ｐＴｒｅｐ５０５は、ｐｕｃｌ　９起源のプラスミドで、Ｌａｃプロモータからの３９ｋＤａ遺伝子群の＃２遺伝子のアミノ酸のうちの最初の１９種のアミノ酸の発現に寄与する。これはラムダＧＴ１１ライブラリーからサブクローンされた制限酵素ＥｃｏＲ１断片を含むｐＴｒｅｐ３２３から構成されている。このＥｃｏＲ１断片をプラスミドｐＷＨＡ１４２中にサブクローンして正規の方向と読取りフレームに正置し、Ｌａｃプロモータから発現させた。このｐＷＨＡ１４２は、ＥｃｏＲ１側に交差する読み取りフレームを有するｐｕｃｌ　９からの誘導体である。ｐＴｒｅｐ５０５のプラスミドマツプを第２図に示す。予想されるタンパク質配列は付表８の通りである。ｐＴｒｅｐ７０２はｐＵＣｌ　９起源のプラスミドで、＃６遺伝子およびｐＵＣ中の補足ペプチドに融合する成熟タンパク質の１３種のアミノ酸の発現に寄与する。これはｐＴｒｅｐ５０１とｐＴｒｅｐ３２７から２ステツプで生成され、制限酵素Ｂａ１ｌ、Ａａｔｌｌで切断され、Ｂｃｌ、１−Ａａｔｌｌの断片で連結される。このクローンからの断片ｐＴｒｅｐ７０１がプラスミドＰＷＨＡ１４２のＥｃｏＲ１側ヘクローンされた。第３図は前記ｐＴｒｅｐ７０２の構成図で、付図６はｐＴｒｅｐ７０２でコードされた遺伝子組換え生成体のタンパク質配列の予想配列を示す。全長コピー＃６抗原をコードする発現クローンｐＴｒｅｐ７０４は、長さ４３０塩基対のＮ５Ｌ１−Ｎｄｅｌ断片を、ｐＴｒｅｐ５０８からの長さ８４７塩基対のＮ５ｉｌ−Ｎｄｅ１断片で置換することによって得られたｐＴｒｅｐ７０２から成る。ｐＴｒｅｐ５０８の３゛クローニング側は、カルボキシ末端をコードするＤＮＡ配列を含む。第３図は前記発現クローンｐＴｒｅｐ７０４の構成図で、付表７は、ｐＴｒｅｐ７Ｑ４でコードされた遺伝子組換え生成体のタンパク質配列の予想配列を示す。ｐＴｒｅｐ５０５、ｐＴｒｅｐ７０２、ｐＴｒｅｐ７０４によってコードされる組換え生成体は、大腸菌中の不溶解成分として再生される。これらは被感染動物体からの血清、およびＵＦ４によってワクチン接種された動物体からの血清に対しても免疫反応性である。表５は、異なる遺伝子またはコピーを有する約３９ｋＤａの７種の家豚赤痢病原体抗原を発現するための３９ｋＤａの発現クローン群を表示する。表１３９８抗原と３９ｐ抗原のアミノ酸の比較ＭＹＧＤＲＤＳＷＩＤＦＬＴＨＧＮＱＦＲＡＲＭＤＱＬＧＦＶＬつＮＧＴＩＫＧＴＦＧＦ？？Ｑ？Ｉ　３９　＊抗原（７）Ｎ末端Ｐ？Ｓ？？ＴＫ？ＹＭＧＩＳＴＤＩＱＬＲＹＹＴＧＩＤＡＦＮＡ工ＲＬＹＦＫＹＧＱＡＧＦＫ　３９　ｐ　”　’ＩＦＰＹＳ？ＳＴＫＤＹＭＧＩＳＴＤＩＱＬＲＹＹＴＧＩＤＡＦＮＡＩＲＬＹＦＫＹＧＱＡＧＦＫＴＡＮＧＡＳＥＹＦＡＱＳＬＧＦＥＡＲＦＹＦＬＮＴＰＶＧＮＶＴＩＮＰＦＩＫＶＶＮＴＡＴＡＮＧＡＳＥＹＦＡＱＳＬＧＦＥＡＲＦＹＦＬＮＴＰＶＧＮＶＴＩＮＰＦＩＫＶＶＮＴＡＬＡＱＡＶＬＧＩＴＡＮＳＤＶＶＳＬＹＶＥＰＳＬＧＹＱＡＴＹＬＧＫＡＱＡＶＬＧＩＴＡＮＳＤＶＶＳＬＹＶＥＰＳＬＨＩＳＥＮＰＹＬＮＩＤＳＫ１（ＩＳＥＮＰＹＬＮＩＤＳＫＶＱＨ３ＬＡｌｌＧＡＹＡＥＬＹＶＲＰＶＱＤＬＥ？ＹＦＥＭＤＩＮＲＮＧＶＰＶＮＦＡＴＳＴＧＩＴ？ＹＬＰＡＬＧＧ？ＱＭＤＩｌｆＮＳＤＳＫＲＮＧＶＰＶＮＦＡＴＳＴＧＩ丁？ＹＬＰＡＬＧＧＡＱ註：指定以外は、ＳＤＳの存在下でリジンＣによる消化切断により生成された断片から抽出された全ての配列を示す。１：ＳＤＳの非存在下ワクチンＣによる消化２、アミノ酸配列の強度とＤＮＡに基づいて解明された断片付与倍数配列３　：　ＳＤＳの存在下におけるＧｌｕＣによる消化４：機差および残査＃１の喪失により、残査＃２によって開始される配列上記配列中における単文字アミノ酸記号Ａ＝アラニン　Ｈ＝ヒスチジン　Ｐ＝プロリンｗ＝ｈリブトファン　Ｃ＝シスチン　Ｉ＝イソロイシンＱ＝グルタミン　Ｙ＝チロシン　Ｄ＝アスパラギン酸に＝リジン　Ｒ＝アルギニン　Ｅ＝グルタミン酸し＝ロイシン　Ｓ＝セリン　Ｆ＝フェニルアラニンＭ＝メチオニン　Ｔ＝トレオニン　Ｇ＝グリシンＮ＝アスパラギン　■＝バリン表２ＣＯＤ　配列　配列の起源　コピーの特定３９ｐ　内部へ°フ゛チト配列６６４　ＡＣＧ−ＡＡＧ−ＧＡＴ−ＴＡＴ−ＡＴＧ−ＧＧＡＡＣ（：　５８４４　ＴＴＡＡＴＣＣＧＣＡＴＧＡＴＡ　ｐＴｒｅｐ　１０６９０８　ＧＴｎ ’ＣＡＴＣＡＣＡＡＦＣＡＡＡ　ｐＴｒｅｐ　３３３　３９３１　ＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡ（：ＧＧＡＴＡＡ　ｐＴｒｅｐ　３３０９３２　ＡＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＡＣＡＡＧＧ　ｐＴｒｅｐ　３３３　４９３４　ＴＡＴＣＡＴＣＣＴｒＣＴＡＡＴＣＣＴ　ｐＴｒｅｐ　３３１　４９５６　ＣＣＧＡＡＡＧＴＡＣＣ’ｆｆｒＡＡＴ　ｐＴｒｅｐ　１０６　ＡｌＩ３６８　ＴＡＴＡＡＴＣＣＴｒＡＴＧＡＴＣＣＴ　ｐＴｒｅｐ　３１７９８７　ＧＡＡＴｒＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＴＧＧ−ｐＴｒｅｐ　１０６　１−４ＡＧＡＴＣＡＧＧＡＣＧＡＴＴＧＧＡＴＴ９８８　ＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴｒＡＴＡＡＴＴＡＡＡ−ｐＴｒｅｐ　１０６　１ −４ＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＣＣＡＡＧＴ１０１０　ＡＴＡＴｒＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴＡＴ　ｐＴｒｅｐ　５０６ＴＣＴＡＣペプチド配列１０５４　ＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＴＧＧＣＧＡＣＡＧ−ｐＴｒｅｐ　３２６　５，６ＡＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＴＣ１０５５ＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴｒＡＴＡＡＴＴＡＴＴＧＡＧＣＡＣ−ｐＴｒｅｐ　５１０　８ＣＧＣＣＴＡＡＡＧＣＡＧＧ１０９２　ＡＧＴＡＴＧＴＴｒＧＡＡＣＣＡＡＴＡ　ｐＴｒｅｐ　３３３　８１１５１　ＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＴＡ　ｐＴｒｅｐ　３３３　４１０９５　ＧＧＡＧＴＡＣＣＴＡＡＡＣＴｒＣＡＡ　ｐＴｒｅｐ　３３７　８１２４８　ＣＧＡＣＡＧＡＧＡＴＴＣＴｒＧＧＡ　ｐＴｒｅｐ　６１３　５，６１３２８　ＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＡＴｒｐＴｒｅｐ　５３７　８１３５９　ＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＡ−ｐＴｒｅｐ　５２０　８ＴＴＧＴＡＡＡＧＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡ−ＣＡ１４３８　ＧＡＡＴｒＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＴＧＧ−ｐＴｒｅｐ　５３７　８ＴＧＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＴＧＧＣＴＴ表３　組換え形ファージとサブクローン群の特定特定の根源ファージ　プラスミド　３０１Ｓｐｈ−Ｂｃｌ　Ｃｏｄ６６４５３．３Ｂ　３２８　＋　＋５６．３　３３０　＋左列の組換えファージはすべてＧＴ１１ライブラリーから得られたもの。但しファージ９ＢのみはＥＭＢＬ３ライブラリーから得られたもの。表４　組換え形ファージとサブクローン群の特定下記各々からのスクリーンにより特定された〕７−ン’　ｐＴｒｅｐ　３０１Ｓｐｈ−Ｂｃｌ　９０８　９３４　９６８　１０１０　１０１９　１０２０　１０９２　１０９５　１１５P　１２４８表５　ＰＣＲからの発現クローンクローン　血清型　Ｃｏｄ９５７　Ｃｏｄ８４４　Ｃｏｄ９０８　Ｃｏｄ９３１　Ｃｏｄ９３２　Ｃｏｄ９６８　Ｃｏｄｌ１５１ｐＴｒｅｐ６２０　Ｂ２０４　＋ｐＴｒｅｐ６５１　Ｂ２３４　＋ｐＴｒｅｐ６４１　Ｂ２０４　＋表６クローンの表示　コピ一番号　根源　備考置換を有する実施例６　ワクチン内への３９★抗原の適用ワクチン投与の２種の実験において３９ｓ抗原を含み、前記実施例１の方法で調製された純化３９★抗原を、補助剤をｆ弁用するワクチン投与、あるいは市販のノ＼イガード（Ｈｙｇａｒｄ。Ｈａｖｅｒ　Ｌａｂｓ、製）の抗原と比較した。最初の実験では、各群から６頭の家豚を選択し、平均体重２６ボンド、生後的５〜６１ｉＩ！であった。、５群の家豚に最初と３６日目に投与し、注射は天然抗原を１回１ｍｇ頚部ｉこ接種した。１頭当り５．５Ｘ　１０”の限界量の赤痢抗原（Ｂ２０４）の純粋培養量を使用した胃内挿入法により５０日目に抗原投与した。試験は９２日目に終了した。ワクチンには乳化補助剤を混用した。乳化剤はＤｕｌｂｅｃＯのＰＢＳ緩衝剤を混合して補助剤の制御として使用した。ノ＼イガードは１種の細菌ワクチンで、製造者の処方に基づＧ１て投与された。被検家豚は赤痢の病状が毎日検査され、１週毎に家豚赤痢菌とサルモネラ菌とに対する直腸内採取の微生物学的評価を実施した。出血性下痢を示す家豚を収集し、即日評価した。被投与家豚の体重と揉食量を毎週検定した。その結果を次表に示す。４１日間の抗原投与間における処理群の総合比較表止常日の認否分率　血便　ＡＤＧ　給食対促進比　平均回復率処理　外見　水分　糞便　（本°ンド）抗原投与なし　１００　９９９９　０　Ｎ／Ａ　０Ａｄｊ＋Ｂｕｆｆｅｒ　９６　７Ｇ　８４　８　１８　１９Ｈｙｂｕｒｄ　１００　７９　９６　０　Ｎ／Ａ　３３９★　１００　８４　１００　０　Ｎ／Ａ　１３註：　ＡＤＧ　＋　日当り平均体重増加（ボンド）赤痢症状からの回復実施例７　天然抗原の使用特に胃内に抗原投与する際に、３９★抗原ワクチンで実行された実施例５の結果を確認するために、第２の検討を実施した。下記の通り、９頭中１頭は３９★抗原の１ｍｇをワクチン投与され、胃内挿入法により４．４Ｘ１０２の限界量の赤痢抗原（Ｂ２０４）が投与された。ワクチン投与群　中断数対生体数　実施日次抗原投与なし　Ｏ／６　１１，１１．１２　（日目）３９★抗原　１ｍｇ　新ロフト　Ｏ／３実施例８　抗体の生成エマルシジン中での２５−２００マイクログラムのセメント質の調製剤（実施例４のバートＧ）を、家豚に筋肉的注射する。２週間後、同一処方により追加抗原投与し、２週間後採血し、これを凝結させる。遠心分離法により４℃で免疫血清を分離する。この発明は前記実施例に限定されず、さらに種々の変形が可能であり、何れも別記の請求の範囲に属すること勿論である。付表　１３９ｋＤａ遺伝子フアミリーの遺伝子生成体の比較表１寸表　２Ａ−１３９ｋＤａ抗原１−４を暗号付与するＢ２０４遺伝子のＤＮＡ配列「！Ｇσ諷ニーー呻口に＾３ｅく１１１ａｃ＠ｏｆ＠２０４Ｇａｎ・ｓＬれＣ■ａ工ｎｇコ％に５ａ入ａｃＬｇｍａｓ１−４？ｙｒ？ｈにλＹ！　！　ｍ　ｉｌＡムｐｒｔａａａｎａｚｕｎ紘四ｍｕｔｙｒｖａｚ＝ｙｓｔｙｒａ↓ｙＯｋＡ　Ｌ４　ｖＧ　Ｌ　ｙ１２４０？入テＡｅＮＡｃＡ？入（ｉＡ？Ｏｃフフ〒）入＾Ｔα入＾＾フ＾＾ａ入デテ＾丁Ａｔ；フ入入＾Ａテ入丁Ｇ口Ｇこ入入ττλＯＧO 付表　２Ａ−２：Ｌ＠Ｓ＊ｒ？ｙｔＪｕａｔｈ・ｑｌｙ！ａｒ）ｌｕＴｈｃｔｒｏＶａＬ−１− −ｃ工Ｌａム１へ人工ａＬａｕＡａへＡ１−＾１ｎ２４０ロ　入丁フ入ａテアλ 丁　、　、　＋　フ入Ｃ〒ＣＣフクフ入ＣτフＡ？α入τフ入＾ｒコ；デ〒〒＾＾＾ＴｃＡ丁人＾丁１寸表　２Ａ−３ｕ−ｄａ　工Ｌａ？ＢＬｙ＊Ａａｐ？ｙｒ？？＋　−一＋ａｕＧＬｙＪｕａＴｈｒ　！　ｌ＊！　＊　ｒＧ　Ｌｆａ　ｌｙ　！　Ｌ　７１　凵f？ｙ　ｒｌｇｏｏ　デマＧＧＣフ＾？Ａτ＾τ＾＾＾ａ＾ｉフ入フル；テフλデ〒フ入０１Ｊａロ入＾Ｃフ人デＴ〒ｅ；ＧＧＣＧＣ７Ａ〒入コ；ム丁■t 付表　２Ａ−４ＧＬｙτ？ｆＡｌａムａｕＧ１ｙＡｇｎ４１＊Ｚ二＊５偕［１ｙＡｓｎ丁ｈｒｃＬｙＡｘｎシ１工＾５ｐＬｅｕＧ上ｎτｈ；ツー；２２８Ｌ　ＳＯ入ＡＣＡＧＣ入ττ入Ｃａ＝τ＾＾τ入τＣλτ）τＣ入（、Ｇ？八へへへＣτＧＯ入＾＾τ ＧフへＧ入τフτ入Ｃ入人Ａ（■OＣτ 付表　２Ｂ−１３９ｋＤａ抗［５−８を暗号、付与するＢ２０４遺伝子のＤＮＡ配列ｒＬｑｓｒｃ＠＠−−ロＮ＾１ｓｑｖ倫ｎｅｓｏｅ！１２０４’ＱｈｎｍｓＣｎｃｏｃｌｉｎｇコ％ｂｏａＡｒ＝ｈｑｅｒｎＳ−＠付表　２Ｂ−２ｉｏｔｏ　？！　＋１　．０Ｔｃフ入入＾＾＾、？ＣＣＧｃ；テ〒〒ＡテＣ二人＾丁入デｉ：フチ為τ九に〒付表　２Ｂ−３Ｓ）４０Ａ、、、λτλ畠〒〒フ〒〒フ入＾Ｔテ？ＡＡ−＋、、、、−、＋＋、入＾Ｃ入τテ入入＾＾Ｇ〒Ｃτフ入＾＾λＱＴ１寸表　２Ｂ−４ｏｐｙ　４ａｍ　ａｃ　釦ｒ？ｙｒｃｙｓ　Ｉｓ　ｆ　！　Ｌ＠Ｉ　Ｍ４１％　ｔＦｙｒＱＬ　ＹＡａ％　ＬａＡａ　ＩＪｕ　１１？　！’ｉｌ　！　kａＡａｐ　Ｐ　ｆｉ＠４１４６　ｒＡｍＴＡｍ？入！ＡｍＡｒＧＧ＾ａＡｍ＾ｅ入？？ロα＾？？Ｑ入 τテ〒ｉ付表　２Ｂ−５付表　２Ｂ−６付表　２Ｂ−７付表　２Ｂ−８付表　２Ｂ−９ｉｓｏ＝　ｔｃ口ｌｌｌＩ付表　３　プラスミドｐＴｒｅｐ　ｔｏｅの家豚赤痢遺伝子挿入体のヌクレオチド配列付表　４　発現プラスミドｐＴｒｅｐ　３０１の部分ＤＮＡ配列買−鵡フ付ａ　５　ＰＣＲから誘導された赤痢病原体（Ｂ　２０４）クローンから予想されるアミノ酸配列一−ＰｒｌＩｄ工Ｃ’ＬａＣ１艙上１’ｌＯ暴Ｃ工ｄ　ｓｅｑ’ｕｓｎｃｓ　ｆｆｒｏｍ　ＦｃＲａ＊ｒｔｖ嗜ａ　Ｊｆ＋！１２０４１　ｅＬｏｒ１＠ｓ 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Ｎ　’ＩＴ”’ＱＫＮfＬＹ− プラスミドｐＴｒｅｐ　６１３−　コピー８、・＝゛ｒ−・−２付表　８　プラスミドｐＴｒｅｐ　５０５の遺伝子組換え生成体から予想されるタンパク質配列ＴｙｒＰＭＧｌｕＭ＠ｃ入３ｐＶａ１＾１八＾Ｈｎｓ＠ｒｋＲｐｓ＠を入ｘｐＳ＠ｒＴｈｒＧｌｙｌｌｅｌ）ｒｏＶａｌｓｅｒＰｈｅ１ｏ２１　τ入ττＴτＣ入入入ＴＧＧ入τＧＴＴλ入丁入入τ入ＧτＧ入ττＣ入Ｇ入τ丁Ｃ丁へ〇入ＧＧ？入ＴＡＣＣＴＧＴＴλＯτ−■■ 第１図ＧＥＮＥＳ　１−４ｏＴｒ＠ｏｌＱ６．ａＴｒａｏＭ２３ｏＴｒａｏｓ２ｓ、ｏＴｒｍｏ６３１一三ヨニ巧三コモ三コ嘔＝五−− ＧＥＮＥＳ　５−８ ≦４呈μ 一二−−工二Ｕ盟−− Ｇ＠ｎｇ　”８０ａｎ１１＃６　Ｇａｘ　＃７　Ｇ＠ｎｇ　Ｉ５第２図Ｈｊａｍ＋１１　１１３第３図国際調査報告１−１−−−１１−−＠ｌ　Ａｐｒ＋＋−ａｕ”　”ｅ訂／ＵＳ９Ｑ　Ｉ０５１２９

Claims

【特許請求の範囲】

１．分子量約３９ｋＤａ（キロダルトン）の少なくとも１種の抗原のエピトープを認識する少なくとも１種の抗体を誘発することが可能なことを特徴とする赤痢病原体抗原。
２．第１の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
３．完全長の第１の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第２項記載の赤痢病原体抗原。
４．第２の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
５．第３の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
６．第４の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
７．第５の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
８．第６の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
９．第７の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
１０．第８の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
１１．完全長の第２の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
１２．完全長の第１の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第２項記載の赤痢病原体抗原。
１３．完全長の第２の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
１４．完全長の第３の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
１５．完全長の第４の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
１６．完全長の第５の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
１７．完全長の第６の遺伝子によって遺伝暗号付与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
１８．分子量約３９ｋＤａの少なくとも１種の抗原のエピトープを認識する少なくとも１種の抗体を誘発する少なくとも１種の赤痢病原体抗原に対して遺伝暗号付与することを特徴とする遺伝子。
１９．前記遺伝子が、分子量３９ｋＤａの赤痢病原体抗原に遺伝暗号付与する第１から第８までのいずれか一種の遺伝子あるいはそれらの混合体であることを特徴とする特許請求の範囲第１８項記載の遺伝子。
２０．完全長遺伝子を保有することを特徴とする請求の範囲第１８項記載の遺伝子配列。
２１．請求の範囲第１８項記載の遺伝子によって遺伝子操作される宿主に保有されることを特徴とする遺伝子。
２２．請求の範囲第１９項記載の遺伝子によって遺伝子操作される宿主に保有されることを特徴とする遺伝子。
２３．請求の範囲第２０項記載の遺伝子によって遺伝子操作される宿主に保有されることを特徴とする遺伝子。
２４．請求の範囲第１８項記載の遺伝子を含む発現伝播体に保有されることを特徴とする遺伝子。
２５．請求の範囲第１９項記載の遺伝子を含む発現伝播体に保有されることを特徴とする遺伝子。
２６．請求の範囲第２０項記載の遺伝子を含む発現伝播体に保有されることを特徴とする遺伝子。
２７．請求の範囲第２１項記載の宿主によって発現されるタンパク質を成分とする抗原。
２８．請求の範囲第２２項記載の宿主によって発現されるタンパク質を成分とする抗原。
２９．請求の範囲第２３項記載の宿主によって発現されるタンパク質を成分とする抗原。
３０．家豚赤痢の予防のために動物体に投与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
３１．家豚赤痢の予防のために動物体に投与されることを特徴とする請求の範囲第２７項記載の赤痢病原体抗原。
３２．家豚赤痢の予防ワクチンに含有されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の赤痢病原体抗原。
３３．家豚赤痢の予防ワクチンに含有されることを特徴とする請求の範囲第２７項記載の赤痢病原体抗原。
３４．分子量３９ｋＤａの抗原を認識する抗体によって特徴ずけられる赤痢病原体抗原。