JP2002027991A

JP2002027991A - コクシジオーシス鶏ワクチン

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Publication number: JP2002027991A
Application number: JP2001151886A
Authority: JP
Inventors: Paul Van Den Boogaart; パウル・フアン・デン・ボーハート; Jacobus Johannus Kok; ヤコブス・ヨハヌス・コツク; Arnoldus Nicolaas Vermeulen; アーノルドウス・ニコラース・ウエルメウレン
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1991-06-18
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2002-01-29
Also published as: NZ243167A; AU1832492A; ZA924203B; DK0519547T3; ATE165867T1; EP0838522A3; ES2117029T3; DE69225357T2; EP0519547B1; EP0838522A2; AU653236B2; US5925347A; HUT65598A; EP0519547A2; US5792644A; US5789233A; HU213419B; DE69225357D1; HU9202024D0; CA2071395A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】コクシジオーシス鶏ワクチンの提供。【解決手段】 Eimeria抗原の、１個以上の免疫原決定
基、そのタンパク質をコードする特定の核酸配列、該核
酸配列を含む組換えベクター分子ないし組換えベクター
・ウイルス、該組換えベクター分子で形質転換された宿
主細胞、又は組換えベクター・ウイルスに感染された宿
主細胞、上記タンパク質に対して免疫反応性を持つ抗体
の提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、エイメリア(Eimeria)抗原の、
１個以上の免疫原決定基、そのタンパク質をコードする
核酸配列、その様な核酸配列を含む組み換えベクター分
子ないし組み換えベクター・ウィルス、そのような組み
換えベクター分子で形質転換された宿主細胞、または、
組み換えベクター・ウィルスに感染された宿主細胞、上
記タンパク質に対して免疫反応性を持つ抗体、また、コ
クシジオーシスから鳥類を保護するワクチンに関わる。

【０００２】コクシジオーシスは、Apicomplexa亜門、E
imeria属の細胞内寄生種、原虫によって引き起こされる
病気である。この寄生種は、胃腸管や、消化器官の一部
を形成する細胞中で増殖する。

【０００３】集約的生産の広がりによって、養鶏産業に
おいて、この寄生種による損害は、ここ数十年、危機的
な勢いで上昇している。例えば、オランダの養鶏農家
が、毎年被る損失は、数百万ギルダーに昇る。すなわ
ち、１９８６年の損失は、約１千３百万ギルダーであ
り、同年、米国では、コクシジア抵抗薬の使用にもかか
わらず、３億米ドルの損失を被った。

【０００４】鶏のコクシジオーシスの病原体は、９の異
なる種に分けることができる。すなわち、Eimeria acer
vulina, E.maxima, E.tenella, E.necatrix, E.brunett
i, E.mitis, E.praecox, E.mivatiおよびE.haganiであ
る。しかしながら、最後の二種については、その存在を
疑うものもいる。この種はすべて、鶏を、宿主とするも
ので、高度の組織特異性を示す。しかし、上記の種のラ
イフサイクルは、似ている。

【０００５】この種の、鶏にたいする病原作用は異な
る。また、鶏の種類も関係する。このため、ブロイラー
鶏は、E.acervulinaや E.maximaのような寄生種によっ
て多大の被害を受ける。というのは、このものは、小腸
の大部分に寄生し、しかも、食物消化が主に行なわれる
のはその部分だからである。

【０００６】ライフサイクルの間に、Eimeria寄生種
は、いくつかの段階を経過する。感染段階（胞子形成接
合子嚢）のものが口中に取り込まれ、鶏の胃に入り込
み、そこで、石臼作用の結果、嚢子の壁が開く。この接
合子嚢の含む、４個のスポロキストが解き放たれ、十二
指腸に入り、そこで、胆汁、消化酵素に接触する。その
結果、スポロキスト細胞壁に穴が開き、その中のスポロ
ゾイト（種虫）が開放される。このスポロゾイトは、運
動性であり、適当な宿主細胞、上皮細胞を求め、そこに
侵入し、生殖する。種によっては、この最初の生殖相は
２４から４８時間続き、数十から数百のメロゾイトが形
成される。この一つ一つが、新たに宿主細胞に侵入し、
生殖する。このような無性生殖サイクルを、種によっ
て、２回、時には５回重ねた後、細胞内で雌雄の生殖母
細胞に成長する。雌の母細胞の、雄の母細胞による授精
後、接合子が形成され、これが自身の周囲に嚢子壁を造
る。この接合子嚢は、宿主細胞を離れ、大便とともに外
へ出される。鶏の外部の温度、湿度が比較的高く、同時
に、空気中に十分な酸素があると、この接合子嚢は、胞
子を形成し、感染段階に移行する。

【０００７】したがって、この寄生種が、鶏から鶏へと
移行するには、中間宿主は要らない。それ故、利用面積
が高度に占有されている所では、養鶏場の感染圧は急激
に上昇する。

【０００８】この寄生種は、様々なやり方で駆除し得
る。

【０００９】適切な管理を実行することの他に、コクシ
ジオーシスは、抗コクシジウム剤を用いても駆除でき
る。このものは、しばしば、餌や、飲用水に混じて用い
られる。しかしながら、近年、このような薬剤もその効
力が低下している。これは、一部は、この寄生種が、各
種駆除剤にたいし、耐性を発達させる、その遺伝的能力
の高いためである。さらに、これら薬剤のあるものは、
肉の中に残査として残り、これが、消費上の問題を形成
する恐れがある。

【００１０】したがって、免疫学的予防法があれば、そ
れは、従来のものよりはるかに優れた駆除法となるであ
ろう。十分に高い感染を生き抜いてきた鶏は、その後、
同系のEimeriaとの接触に耐性を持つことはよく知られ
ている。Eimeriaにたいする耐性は、鶏を、数回、低用
量の接合子嚢、または、弱化（非病原性）種の接合子嚢
で感染させて誘発することもできる。しかしながら、調
節された投与を、特に、多数のブロイラー鶏に実施する
ことは、この場合、ほとんど解決不能の問題となる。

【００１１】本発明においては、Eimeria抗原の、１個
以上の免疫原決定基を有する精製タンパク質を用いる
が、これは、全寄生種、または、それと通常結びつくそ
の他のタンパク質を実質的に含まないものである。これ
は、鳥類の、特に、コクジオーシスにたいする鶏の、免
疫用ワクチンの調製に用いることができるものである。

【００１２】ここで用いる「核酸配列」とは、その長さ
を問わない、ヌクレオチドのポリマー形であって、リボ
核酸、デオキシリボ核酸の両方に関わる。原則として、
この用語は、該分子の第一次構造を意味し、二重鎖、一
重鎖ＤＮＡ同様、二重鎖、一重鎖ＲＮＡ、およびそれら
の修飾形をも指す。

【００１３】一般に、「タンパク質」という用語は、生
物的活性を持つアミノ酸分子鎖を指し、ある特定長の産
物を指すものではなく、また、要すれば、インビトロな
いしインビボで、例えば、グリコシル化、アミド化、カ
ルボキシル化、または、燐酸化によって、修飾すること
のできるものである。したがって、特に、ペプチド類、
オリゴペプチド類、ポリペプチド類が含まれる。

【００１４】「Eimeria抗原の、１個以上の免疫原決定
基を有するタンパク質」という用語は、１個以上のエピ
トープを持ち、宿主動物のEimeria寄生種にたいして免
疫反応を惹起することのできるタンパク質を指す。

【００１５】「分子量」という用語は、ここでは、個々
の具体例に記載される条件下での、見掛上の大きさの推
定量として用いられる。真の分子量は、タンパク質全長
の配列決定を待って始めて可能である。個々のタンパク
質については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量
は、タンパク質の疎水性や、オリゴサッカライド、脂質
（アシル鎖）、その他の干渉性置換物の存在のために、
間違いを生ずる可能性がある。アクリルアミド・ゲルの
パーセントでさえ、水溶性マーカータンパク質にたいす
る、ゲル中での相対的移動度に影響を及ぼすことがあ
る。実例は、Frank, R.N. and Rodbard, D. (1975) Arc
h. Biochem. Biophys. 171, 1-13に記載されている。こ
のような制限は別として、本発明応用のために実施す
る、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ウェスタン・ブロット）泳動の
多くは、非還元状態で行なった（したがって、ベータ・
メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールを添加
しない）。これは、Mabsによる識別を良くするためであ
る。

【００１６】特に、本発明は、Eimeria抗原の、１個以
上の免疫原決定基を持つタンパク質を与えるが、ここ
に、Eimeria抗原は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、約、2
00, 100, 50ないし20kDの分子量を持ち、このEimeria抗
原は、モノクローナル抗体E. ACER 11A-2AまたはE. ACE
R 12B-2B, E.ACER 5F-2, E.ACER 10C-2AまたはE.ACER 1
0E-2とそれぞれ特異的に結合する。上記モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統の例は、英国、
Porton Down,ヨーロッパ動物細胞培養体収集施設（Euro
pean Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)）
に、受託番号、91061223 (E.ACER 12B-2B), 及び 91061
222 (E.ACER 11A-2A), 91061219(E.ACER5F-2), 9106122
0 (E.ACER 10C-2A), 及び 9106221 (E.ACER 10E-2) の
下に寄託されている。

【００１７】上に開示されたEimeria抗原は、その単離
法によって特徴づけられる。すなわち、抗原を入手する
のに１．２％トリトン X114液で、Eimeria acervulina寄生
種を抽出する。２Ａ．手順１で相分離後入手した疎水性分画を、１．E.ACER 10C-2AセファロースCL-4B結合免疫アフィニ
ティー・クロマトグラフィーにかけるか、または、２．E.ACER 10E-2セファロース CL-4B結合免疫アフィニ
ティー・クロマトグラフィーにかけるか、または、２Ｂ．手順１の相分離後入手した親水性分画を、E.ACER
11A-2AセファロースCL-4B結合免疫アフィニティー・ク
ロマトグラフィーにかけるか、または、２Ｃ．手順１の相分離後入手した親水性分画を、E.ACER
5F-2セファローズCL-4B結合免疫アフィニティー・クロ
マトグラフィーにかけ、３．１．精製された、50, 100または200kD Eimeriaタン
パク質を、0.1Mグリシン・塩酸＋0.1% NP4O pH 2.6で溶
出し、２．精製された、20 kD Eimeriaタンパク質を、25mM Tr
is/HCl + 0.5M NaCl +0.1% NP4O pH 8.0に溶解した 3M
KSCNで溶出する。

【００１８】本発明による好ましいタンパク質は、Eime
ria acervulina抗原 Eam200, Eam100またはEas100, Eam
45またはEam 20（実施例２）の、１個以上の免疫原決定
基である。

【００１９】Eam200とは、Eimieria acervulina メロゾ
イトから抽出した、約 200 kD の Eimeriaタンパク質
で、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）E.ACER 11A-2Aとの
免疫反応性を持つ。

【００２０】Eas100とは、Eimieria acervulina スポロ
ゾイトから抽出した、約100kDのEimeriaタンパク質で、
Mab E.ACER 5F-2との免疫反応性を持つ。Eam100は、メ
ロゾイトの等価物である。

【００２１】Eam45とは、Eimieria acervulina メロゾ
イトから抽出した、約50kDのEimeriaタンパク質で、Mab
E.ACER 10C-2Aとの免疫反応性を持つ。

【００２２】Eam20 とは、Eimieria acervulina メロゾ
イトから抽出した、約20kDのEimeriaタンパク質で、Mab
E.ACER 10E-2との免疫反応性を持つ。

【００２３】モノクローナル抗体E.ACER 11A-2A, E.ACE
R 12B-2Bは、主に、Eam200抗原に対する。第１図に示す
ように、E.ACER 12B-2Bは、このタンパク質を、還元形
でも、非還元形でも認識した。パネルＢのレーン１、２
の示すとおりである。E-ACER11A-2Aは、非還元形のみを
認識した。パネルＡ、レーン１、２の示す通りである。
しかしながら、このいずれのＭａｂも、E. acervulina
スポロゾイトに含まれるＭＷ 100から200kDの一組のポ
リペプチドと、E. tenellaスポロゾイトの、MW±130kD
の明瞭な陽性バンドとを認識した。レーン３、５に見る
通りである。

【００２４】蛍光を用いると、スポロゾイトにたいする
交差反応は、スポロゾイトの前端に限局していた。ここ
には、侵入に関わる小器官が局在する。

【００２５】E.tenella第２世代メロゾイトは、これら
のＭａｂ類と結合するように見えないが、これは、どう
やらこの段階では、このタンパク質が小量であることに
よるらしい。

【００２６】モノクローナル抗体 E.ACER 10C-2A抗 Eam
45は、E.acervulinaのスポロゾイト中の、分子量の似た
タンパク質のみを認識したが、E.tenellaにたいする反
応は認められなかった。第２図Ａに示す通りである。

【００２７】E.ACER 10E-2, 抗Eam20も、同種のスポロ
ゾイトのみにおいて、かすかに、あるバンド（MW±20k
D）を認識した。もっとも、E.acervulina,及びE. tenel
laを除いた、他の種についてはテストしなかった。第２
図、パネルＢ参照。

【００２８】モノクローナル抗体 E.ACER 5F-2は、E.ac
ervulinaのスポロゾイトに対するものだが、同種もメロ
ゾイト中の、±100kDのタンパク質をも認識した。その
他の種にたいする反応性は、テストしなかった。

【００２９】さらに、本発明は、上に特定した、精製Ei
meria抗原の、１個以上の免疫原決定基を有するタンパ
ク質の実例を与える。この実例とは、配列番号、２、
６、８または１０に示したアミノ酸配列から成るタンパ
ク質である。

【００３０】さらに、本発明は、配列番号４番に示した
アミノ酸配列を持つEimeriaタンパク質と、その機能的
変種（variant）を与える。このタンパク質は、Eimeria
メロゾイトｃＤＮＡライブラリーを、抗-Eam45血清でス
クリーニングして同定したものである。この血清は、そ
れをメロゾイト・ブロットにプローブとして用いると、
約100kDのタンパク質（約50kDのタンパク質との陽性反
応の他に）と陽性反応を示した（第９図）。

【００３１】ここに特定的に開示したタンパク質の機能
変種は、上記アミノ酸配列から得た、例えば、１個以上
のアミノ酸を、除去、挿入、および／または、置換して
得たタンパク質であるが、Eimeria抗原の１個以上の免
疫原決定基を保持している。すなわち、上記変種は、宿
主動物において、免疫反応を引き起こすことのできるエ
ピトープを１個以上持っている。

【００３２】ここに含まれる特定のタンパク質にたい
し、天然の変種が、個々の Eimeria寄生種またはその株
の中に存在し得ることは了解されるであろう。この変種
は、全体配列における単数または複数のアミノ酸の差
異、すなわち、上記配列における、アミノ酸（単数また
は複数）の除去、置換、挿入、逆転、添加として示し得
る。アミノ酸置換で、生物学的及び免疫活性を本質的に
変えないことが予想される、そのような置換が記載され
ている。関係アミノ酸間のアミノ酸置換、または、進化
においてよく見られる置換は、特に、Ser/Ala, Ser/Gl
y, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val （Dayhof, M.D., Atlas
of protein sequence and structure, Nat.Biomed. Re
s. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl.
3、参照）である。この知識に基づき、Lipman and Pear
sonは、高速、高感度のタンパク質比較法を開発し（Sci
ence 227, 1435-1441, 1985）、相同タンパク質間の機
能的類似性を定量した。

【００３３】さらに、ここに特定的に開示されるタンパ
ク質の、免疫原フラグメント、または、その機能的変種
も、本発明に含まれる。

【００３４】ここで用いる「フラグメント」とは、本発
明の、核酸配列またはタンパク質の、部分的配列から成
る、ＤＮＡ，または、アミノ酸配列を意味する。上記フ
ラグメントは、Eimeria 抗原の、１個以上の免疫原決定
基を有するポリペプチドであるか、または、そのポリペ
プチドをコードする。操作可能な免疫原ポリペプチド・
フラグメントの定量法を下記に概略する。フラグメント
は、先ず、前駆体分子を酵素的に分断して生産する。す
なわち、ＤＮＡにたいしては制限エンドヌクレアーゼ
を、ポリペプチドにたいしてはプロテアーゼを用いて行
なう。その他の方法としては、フラグメントの化学的合
成や、ＤＮＡフラグメントによるポリペプチド・フラグ
メントの発現がある。

【００３５】本発明による、タンパク質の、適当な免疫
原性ポリペプチド・フラグメントは、エピトープ（単数
または複数）を含むものであるが、これは、特許出願 W
O 86/06487, Geysen, H.M. et al. (Proc. Natl. Acad.
Sci. 81, 3998-4002, 1984), Geysen, H.M. et al.
(J. Immunol. Meth. 102, 259-274, 1987)に記載される
方法を用いて見つけだすことができる。この方法は、い
わゆるペプスキャン法に基づくもので、注目する完全な
ポリペプチドの部分配列に相当する、部分的に重なり合
う、一連のペプチドを合成し、その、抗体との反応性を
調べるものである。

【００３６】さらに、上記アミノ酸配列を有する、ポリ
ペプチドの数個の領域を、理論的な考察と、現在既知の
エピトープとの構造的一致に基づいて、エピトープとす
ることができる。この領域の決定は、Hopp and Woods
(Proc. Natl. Acad. Sci. 78,3824-3828, 1981) による
親水性基準と、Chou and Fasman (Advances in Enzymol
ogy 47, 45-148, 1987) による、２次構造の性質を突き
合わせて行なう。

【００３７】Ｔ細胞エピトープの必要となる場合がある
が、これも同様に、理論的根拠に基づいて、例えば、Be
rzofskyの両親媒性基準（Science 235, 1059-62, 198
7）を用いて得られる。

【００３８】本発明はさらに、Eimeriaの上記タンパク
質をコードする、単離及び精製された核酸配列を与え
る。

【００３９】当該技術分野においてよく知られているよ
うに、遺伝コードの縮重のさいに、あるコドンの塩基を
置換して、別のコドンとはするが、依然として、同一ア
ミノ酸をコードする、そのような置換があり得る。例え
ば、グルタミン酸というアミノ酸にたいするコドンは、
ＧＡＴ、ＧＡＡの両方である。したがって、配列番号号
2,4,6,8,または10に示されるアミノ酸配列を有するタン
パク質の発現にとっては、配列番号1,3,5,7または9にそ
れぞれ示された核酸配列とは異なる、別様のコドン組成
を持つ、派生型核酸配列を利用することができることは
明かである。

【００４０】したがって、本発明は、配列番号2,4,6,8
または10に示したアミノ酸配列、および、その機能的変
種を持つタンパク質の、少なくとも一部をコードする核
酸配列を与える。

【００４１】配列番号1,3,5,7および9に与えられる情報
によって、当業者ならば、ここに特定的に開示したEime
riaタンパク質に相応する免疫学的特徴を持つ、各種機
能的変種タンパク質をコードする核酸配列を単離・特定
することは可能である。この目的に、一般的に用いられ
るサザン・ブロット法、コロニー・ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いることができる（Experiments in Molecul
ar Biology, ed. R.J.Slater, Clifton, U.S.A., 1986;
Singer-Sam, J. et al., Proc. Natl., Acad. Sci. 8
0, 802-806, 1983; Maniatis, T. et al., Molecular C
loning, A laboratory Manual, second edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, USA,1989）。例え
ば、ある特定のEimeria株から得たcDNAライブラリー
は、一枚のニトロセルロース・フィルターに移したり、
または、「ブロット」することができる。現在では、こ
のフィルター上で、ある特定された標識ＤＮＡフラグメ
ントすなわち「プローブ」にたいしてハイブリダイゼー
ションすることによって、特定の Eimeria核酸配列を特
定することができる。このプローブとは、すなわち、配
列番号1,3,5,7,9に示した核酸配列から得た、（合成）
ポリないしオリゴヌクレオチド配列で、このものは、塩
濃度、温度の特定条件の下で、フィルター上に存在する
相同の核酸配列と交雑（ハイブリダイズ）する。このフ
ィルターを洗浄後、交雑物を、オートラジオグラフィー
によって検出してもよい。これで、相応するＤＮＡフラ
グメントをアガロース・ゲルから溶出することができる
し、また、これを用いて、配列番号2,4,6,8または10で
明示されたポリペプチドの機能的変種の合成を行なうこ
ともできる。

【００４２】通常、EimeriaのcDNA ライブラリーは、実
施例３に記載した方法によって正確に構築することがで
きる。クローン pGEM4Z Eam200, pGEM4Z Eam45 M1(E),
pGEM4Z Eam45 M3(E), pGEM4Z Eam20(E)または、pGEM4Z
Eam100Eから得た挿入体は、ランダム・プライム法によ
り、ジゴキシジェニン−ｄＵＴＰによって標識すること
ができる。この時、Boehringer, Manheim （カタログ番
号 1093657）供給の「ＤＮＡ標識・検出キット、非放射
性」に添えられたプロトコルに正確に従う。

【００４３】上記のEimeria cDNAライブラリーから得た
固定ＤＮＡを含むフィルターを、上記 Maniatis et al.
の記載する通りに調製し、メーカーの指示に従って、タ
ンパク質を変性させたばかりの（９５℃で１０分）、標
識した Eimeriaフラグメントをプローブとして、４２℃
で１６時間インキュベートする。次に、フィルターを下
記のように洗浄する。2xSSC, 0.1%(w/v) SDS (1 x SSC
とは、0.015 mol/l クエン酸ナトリウム、プラス、0.15
mol/l NaCl)で、室温で、１５分、２回、次に、1xSSC,
0.1%(W/V) SDSで、５５℃で、１５分、２回。最終同定
のために、次に、フィルターを、PBS-tween (7.65 g/l
NaCl, 0.91 g/l Na_２HPO_４. 2H_２O, 0.21g/l KH2 PO4 ,
0.05% (v/v) Tween 80, pH 7.3)で、室温で、１５分、
２回洗浄した。次にフィルターを、ポリクロナール山羊
抗−ジゴキシジェニンＦａｂフラグメントの、PBS-twee
nの1:5000 希釈液と反応させ、室温で３０分アルカリ・
フォスファターゼに結合させた。フィルターを、PBS-tw
een で、室温で、１５分、４回、0.01 M Tris-HCl pH
8.0, 0.15M NaClで１５分１回洗浄した後、フィルター
にたいするアルカリ・フォスファターゼの結合を、0.33
g/lニトロブルー・テトラゾリウムと、0.17g/l ５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル燐酸の、0.1Mトリス
HCl pH 9.6, 0.1M NaCl, 0.01M MgCl2 に溶解させた溶
液でインキュベートして検出した。このプローブと反応
するＤＮＡを用いて、そのコードするペプチドを、後に
述べるように発現させることができる。

【００４４】その後、このポリペプチドについて、下記
の方法の内の一つを用いて、Eimeria 抗原タンパク質の
免疫原決定基が１個以上存在するかどうかを測ることが
できる。

【００４５】ポリペプチドは、E. coli溶解物から、当
該技術分野において既知の方法によって精製することが
できる。例えば、塩分画法、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、金属キレー
トクロマトグラフィーである。精製産物は、後述するよ
うに、単一特異的抗体を生成するのに用いられる。この
抗体を、寄生物材料、例えば、メロゾイトやスポロゾイ
ドのウェスタン・ブロット上に戻してプローブする。陽
性信号は、E. coliの翻訳産物を直接寄生種タンパク質
に結合させる。

【００４６】上記を実行するもう一つの可能性は、抗体
を、次のものを含むフィルターに直接結合させることで
ある。すなわち、E. coliに含まれる、Eimeria DNA 挿
入体を発現する組み換えファージの単一培養体である。
この結合抗体を、Osaki ら（J. Immunological Methods
89, 213-219, 1986）の方法を用いて溶出し、これをふ
たたび、Eimeria 抗原のウェスタン・ブロットに結合さ
せることによって、結合が確定する。Eas100, Eam45 ク
ローンについては、この後の方法に準じて行なった（実
施例３、第８、９図）。

【００４７】上記のハイブリダイゼーション法は、ま
た、全コード配列のごく一部しか同定されない場合に、
完全長クローンを実現するのにも用いてもよい。特に、
クローン pGEM4Z Eam200, pGEM4Z Eam100Eは、cDNAまた
はゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、別
にコード配列があるかどうか確かめるのに用いてもよ
い。

【００４８】ＤＮＡ配列を延長するもう一法として、実
施例３に概略した「半特異的」ポリメラーゼ鎖反応があ
る。

【００４９】したがって、ここに開示したタンパク質の
機能的変種をコードする核酸配列は、Eimeria 抗原の１
個以上の免疫原決定基を含むポリペプチドをコードし、
配列番号1,3,5,7または 9に示したＤＮＡ配列とハイブ
リッドする。

【００５０】また一法として、Eimeria cDNAを、Huynh
et al. (In: D. Glover (ed.) DNACloning:A Practical
Approach, IRL Press Oxford, 49-78, 1985)の記載の
通りに、λgt11ファージ中にクローンし、細菌宿主に発
現させてもよい。次に、組み換えファージを、上記精製
Eimeriaタンパク質に対するポリクロナール血清、また
は、配列番号2,4,6,8,10でスクリーニングし、変種ポリ
ペプチドの相応する免疫学的領域を決定する。Eimeria
タンパク質にたいしてここで用いられるポリクロナール
血清の製法は、下記に述べる。

【００５１】さらに、本発明は、Eimeria 抗原の、１個
以上の免疫原性決定基を有するタンパク質をコードする
核酸配列を含む。この抗原においては、核酸配列は、配
列番号 1, 3, 5, 7,または 9にそれぞれ示されるＤＮＡ
配列の少なくとも一部を含む。

【００５２】本発明による核酸配列は、特定の Eimeria
株から単離し、ポリメラーゼ連鎖法（ＰＣＲ）を含む、
組み換えＤＮＡ法によって増幅してもよいし、当該技術
分野に既知の方法によって、インビトロで化学的に合成
してもよい。

【００５３】本発明による核酸配列は、天然では、それ
と関係したり結合したりしていないような、複製可能な
ＤＮＡ配列に結合させ、いわゆる組み換えベクター分子
を作成することもできる。そして、このものを、適当な
宿主の形質転換に用いることもできる。有用な組み換え
ベクター分子は、例えば、プラスミド、バクテリオファ
ージ、コスミド、または、ウィルスから得ることが望ま
しい。

【００５４】本発明により、核酸配列をクローンするの
に用いられる特定のベクター、または、クローン用搬送
体（ベヒクル）は、当該技術では既知であるが、特に、
pBR322, 各種 pUC, pGEM, 青斑性プラスミドようなプラ
スミド・ベクター、例えば、λgt-Wes, Charon 28, M13
由来ファージのような、バクテリオファージ、SV40,ア
デノウィルス、ポリオーマ・ウィルスのようなウィルス
・ベクター（Rodriquez, R.L. and D.T. Denhardt, e
d., Vectors:A survey of molecular cloning vectors
and their uses, Butterworths, 1988; Lenstra, J.A.
et al., Arch. Virol. 110, 1-24, 1990をも参照のこ
と）を挙げることができる。本発明により組み換えベク
ター分子を構築するのに用いられる方法は、当該技術分
野の通常の技術者には既知のものであり、特に、Maniat
is, T. et al. (Molecular Cloning,A Laboratory Manu
al, second edition; Cold Spring Harbor Laboratory,
1989) に述べられている。

【００５５】例えば、本発明により、核酸配列を、クロ
ーンニング用ベクターに挿入するには、遺伝子と、所期
のクローニング用搬送体を、相補的ＤＮＡ末端を調製す
るのに用いたのと同一の制限酵素（単数または複数）で
切断することによって、容易に達せられる。

【００５６】別法として、調製された制限部位を、１本
鎖ＤＮＡを消化することによって、もしくは、適当なＤ
ＮＡポリメラーゼで、１本鎖末端を充填することによっ
て、平滑端になるように修飾しなければならない場合が
ある。その後で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのような酵素によ
る平滑端結合を実行すればよい。

【００５７】もし望むなら、このＤＮＡ末端にリンカー
を結合することによって、いかなる制限部位をもうける
こともできる。このようなリンカーは、制限部位配列を
コードする、特定のオリゴヌクレオチド配列を含むもの
である。制限酵素で分断されたベクター、核酸配列も、
相同ポリマー末端によって修飾してもよい。

【００５８】ここで用いる「形質転換」とは、使用する
方法とは無関係に、例えば、直接摂取または形質導入に
よって、異種の核酸配列を宿主細胞に導入することを指
す。異種核酸配列は、自己複製によって維持してもよい
し、または、宿主ゲノムに統合してもよい。もし望むな
ら、この組み換えベクター分子は、指定された宿主と適
合する、適当な調節配列を備えることもできる。すなわ
ち、この配列は、挿入された核酸配列の発現を調節す
る。微生物の他にも、多細胞生物から得られた細胞培養
物を宿主として用いてもよい。

【００５９】本発明による組み換えベクター分子は、で
きれば、例えば、pBR322においてはアンピシリンやテト
ラサイクリン耐性、pUC8においてはアンピシリン耐性や
β−ガラクトシダーゼのαペプチドのような、所望の形
質転換体を選択するのに使用できる、１種以上のマーカ
ー活性を含んでいることが好ましい。

【００６０】適当な宿主細胞とは、微生物ないし細胞で
あって、あるポリペプチドをコードする核酸配列、また
は、そのような核酸配列を含む組み換えベクター分子に
よって形質転換され、かつ、もし望むなら、上記核酸配
列によってコードされる上記ポリペプチドを発現するの
に使用できる、そのような微生物ないし細胞である。こ
の宿主細胞は、原核性起源のもの、例えば、Escherichi
a coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas属のような細
菌であってもよいし、真核性起源のもの、例えば、Sacc
haromyces cerevisiaeのような酵母であってもよいし、
高等な真核細胞、例えば、HeLa細胞、チャイニーズ・ハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、昆虫、植物、ほ乳
類細胞のようなものでもよい。昆虫細胞には、Spodopte
ra frugiperda のSf9 細胞系(Luckow et al., Biotechn
ology, 6, 47-55, 1988)が含まれる。本発明の核酸配列
を、真核性クローニング・システムで、クローンし、発
現する方法の詳細は、Esser, K. et al. (Plasmids of
Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986)に見ることができ
る。

【００６１】一般に、本発明の有効な組み換えベクター
分子の構築には、原核生物が好ましい。例えば、E. col
i K12 株が特に好ましい、例えば、DH5 α、または、MC
1061λのような株である。

【００６２】発現のために、本発明の核酸配列を、発現
ベクターに導入する、すなわち、上記配列を、操作可能
な形で、発現調節配列に結合させる。そのような調節配
列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、イ
ンデューサー、リボソーム結合部位などを含む。したが
って、本発明の組み換えベクター分子は、発現調節配列
に操作可能な形で結合した、上に特定した Eimeriaタン
パク質をコードする核酸配列を含み、その含んだＤＮＡ
配列を、形質転換宿主細胞（単数または複数）において
発現できる、そのようなベクター分子である。

【００６３】当然のことであるが、このクローン用ベク
ターの選択部位に挿入されるヌクレオチド配列は、形質
転換された宿主が、Eimeria 抗原の、少なくとも１個以
上の免疫原性決定基を持つポリペプチドを生産する限
り、所期のポリペプチドにたいする実際の構造遺伝子の
一部ではないヌクレオチドを含んでいてもよいし、また
は、所期のタンパク質にたいする完全な構造遺伝子のわ
ずか１フラグメントを含むものであってもよい、ことは
了解されるであろう。

【００６４】宿主細胞が細菌であれば、典型的な、有効
な発現コントロール配列としては、Trp プロモーター、
オペレーター（Goeddel, et al., Nucl. Acids Res. 8,
4057, 1980); lac プロモーター、オペレーター（Chan
g, et al., Nature 275, 615, 1978);外側膜タンパク質
プロモーター（Nakamura, K. and Inoue, M., EMBO J.
1, 771-775, 1982);バクテリオファージλプロモータ
ー、オペレーター（Remaut, E. et al., Nucl. Acids R
es. 11, 4677-4688, 1983); αアミラーゼ（B. subtili
s)プロモーター及びオペレーターや、末端配列、その他
の発現強調、コントロール配列で、選んだ宿主細胞と適
合可能なものがある。宿主細胞が酵母であれば、典型的
な、有効発現コントロール配列としては、例えば、αメ
イティング因子がある。昆虫細胞では、バキュロウィル
スの、ポリヘドリンまたは p10プロモーターを用いるこ
とができる（Smith, G.E. et al., Mol. Cell. Biol.
3, 2156-65, 1983)。宿主細胞が、ほ乳類起源のもので
あれば、典型的な、有効発現コントロール配列として
は、SV-40 プロモーター（Berman, P.W. et al., Scien
ce222, 524-527, 1983)または、例えば、メタロチオネ
イン・プロモーター（Brinster, R.L., Nature 296, 39
-42, 1982)または、熱ショック・プロモーター（Voellm
y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4949-53,
1985) が挙げられる。また別法として、Eimeria 中に存
在する発現コントロール配列も用いることができる。遺
伝子発現を最大限に行なうやり方については、Roberts
and Lauer (Methods in Enzymology 68, 473, 1979）を
も参照されたい。

【００６５】以上により、本発明は、上記の核酸配列な
いし組み換え発現ベクター分子によって形質転換され、
その核酸配列の発現によって、Eimeria タンパク質を生
産できる、宿主（単数または複数）を含む。

【００６６】Eimeria 感染にたいして鳥類を免疫するの
は、例えば、その動物に、本発明によるタンパク質を、
いわゆるサブユニット・ワクチンとして、免疫的な方策
に沿って、投与することで達成される。本発明によるサ
ブユニット・ワクチンは、純粋な形のタンパク質を、好
みによっては、医薬的に受容可能な搬送剤の存在下に含
む。このタンパク質は、好みでは、無関係のタンパク質
に、共有的に結合させてもよい。無関係のタンパク質と
は、例えば、融合産物の精製に有利となるようなもので
ある。実例は、β−ガラクトシダーゼ、タンパク質Ａ、
プロキモシン、血液凝固因子Ｘａなどである。

【００６７】場合によっては、このタンパク質それだけ
を用いては、予防免疫を向上させる能力が低いことがあ
る。できれば、小フラグメントを、搬送体分子に複合
し、それによってその免疫原性を向上させるとよい。こ
の目的のために適当な搬送体は、天然のポリマー（ほや
（key hole limpet ）のヘモシアニン、アルブミン、毒
素のようなタンパク質類）ポリアミノ酸（ポリリジン、
ポリアラニン）のような合成ポリマー類、のような巨大
分子、サポニンのような両親媒性化合物のミセルであ
る。別に、このフラグメントを、そのポリマーとして、
できれば直鎖ポリマーとして供給してもよい。

【００６８】このようなサブユニット・ワクチンで使用
されるタンパク質は、当該技術分野で既知の方法、例え
ば、上記ポリペプチドを、Eimeria 寄生種から単離する
ことによって、または、組み換えＤＮＡ法を用いること
によって、または、化学的合成法によって、調製するこ
とができる。

【００６９】要すれば、本発明による、ワクチンに使用
されるタンパク質は、インビトロないしインビボで、例
えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、燐酸
化によって修飾してもよい。

【００７０】サブユニット・ワクチンにたいする別法と
して、生ベクター・ワクチンがある。本発明による核酸
配列を、組み換えＤＮＡ法によって、微生物（例えば、
細菌あるいはウィルス）に挿入する。そのさい、その挿
入を、組み換え微生物が依然として複製し、挿入された
核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現し、
感染宿主動物に、免疫反応を惹起するような、そのよう
なやり方で行なう。

【００７１】本発明の好ましい実施例は、上記の異種核
酸配列を含む組み換えベクター・ウィルスで、そのＤＮ
Ａ配列を、その組み換えベクター・ウィルスで感染した
宿主細胞（単数または複数）、または、宿主動物におい
て発現することのできる、そのようなベクター・ウィル
スである。「異種」という用語は、本発明による核酸配
列は、通常、天然では、そのベクター・ウィルス中には
存在しないことを示す。

【００７２】さらに、本発明は、組み換えベクター・ウ
ィルスに感染し、その核酸配列の発現によって、Eimeri
a タンパク質を生産することができる、宿主細胞（単数
または複数）、または、細胞培養体を含む。

【００７３】例えば、インビボ相同組み換えという既知
の方法を用いて、異種核酸配列、例えば、本発明による
核酸配列を、ベクター・ウィルスのゲノムに挿入するこ
とができる。

【００７４】第１に、ベクター・ゲノムの挿入領域、す
なわち、異種配列の取り込みに用いることはできるが、
しかし、だからといって、感染や複製に必要な、ベクタ
ーの本質的機能は損なわない、そのような領域に相当す
るＤＮＡフラグメントを、標準組み換えＤＮＡ法によっ
て、クローン用ベクター内に挿入する。挿入領域は、多
数の微生物について報告されている（例えば、EP 80,80
6, EP 110,385, EP 83,286, EP 314,569, WO 88/02022,
WO 88/07088, US 4,769,330 および US 4,722,848
）。

【００７５】第２に、もし望むなら、欠損部を、第１手
順で得た組み換えベクター分子中に入れた挿入領域に導
入することができる。これは、例えば、第１手順で得た
組み換えベクター分子を、適当なエキソヌクレアーゼＩ
ＩＩで消化することによって、または、制限酵素処理す
ることによって、実行することができる。

【００７６】第３に、異種核酸配列を、第１手順の組み
換えベクター分子内の挿入領域に、または、上記組み換
えベクター分子から除去されたＤＮＡの代わりに、挿入
する。挿入領域のＤＮＡ配列は、ベクター・ゲノムとの
相同組み換えを実現し得るほどの、適当な長さを持って
いなければならない。その後、適当な細胞を、野生型の
ベクター・ウィルスで感染させたり、ベクター・ゲノム
ＤＮＡによって形質転換させてもよい。後者の場合、適
当なベクターＤＮＡ配列に結合された挿入体を含む組み
換えベクター分子の存在下に行なう。それによって、組
み換えベクター分子とベクター・ゲノムの対応領域間
に、組換えを起こすためである。組み換えベクターの子
孫を、今度は、細胞培養で生成し、例えば、遺伝形質的
に、または、表現形質的に、例えば、ハイブリダイゼー
ションによって、選択してもよい。これによって異種核
酸配列と相互に作用し合った遺伝子のコードする酵素活
性を検出するか、または、組み換えベクターによって免
疫的に発現される抗原性異種ポリペプチドを検出する。

【００７７】次に、この組み換え微生物を、免疫化のた
めに、鶏に投与する。これにより、微生物は、接種動物
の中で、しばらく生存し、場合によっては複製さえし、
本発明による、挿入核酸配列によってコードされるポリ
ペプチドをインビボで発現し、接種動物の免疫系を刺激
する。本発明による核酸配列の取り込みに適当なベクタ
ーは、ウィルスから、例えば、ワクシニア・ウィルス
（EP 110,385, EP 83,286, US 4,769,330, US 4,722,84
8 ）や、鳥ポックス・ウィルス（WO 88/02022 ）のよう
なポックス・ウィルス、ＨＶＴ（WO 88/07088 ）や、マ
レック病ウィルスのようなヘルペス・ウィルス、アデノ
ウィルス、または、インフルエンザ・ウィルス、もしく
は、細菌から、例えば、E. coli や、特定のサルモネラ
種から得られる。この種の組み換え微生物においては、
宿主動物で合成されるポリペプチドは、表面抗原として
暴露されてもよい。このやり方を進めるならば、上記ポ
リペプチドと、ＯＭＰタンパク質、例えば、E. coli の
繊毛タンパク質、または、その微生物によって認識され
る信号、端末配列の合成物との融合が考えられる。ま
た、上記免疫原性ポリペプチドを、もし望むなら、大き
な全体の一部として、動物の内部に開放して、免疫化す
ることも可能である。これらすべての場合において、１
個以上の免疫原産物が、発現され、各種病原体にたい
し、および／または、ある特定の病原体の各種抗原にた
いして、予防を講じることも可能である。

【００７８】本発明によるベクター・ワクチンは、本発
明による核酸配列を含む、組み換えベクター・ウィルス
によって感染した、組み換え細菌、または、宿主細胞を
培養することによって調製される。すなわち、それによ
って、組み換え細菌、ウィルス含有細胞、および／また
は、その細胞中で増殖した組み換えベクター・ウィルス
を、好みであれば純粋な形で、回収し、好みであれば凍
結した形で、ワクチンに形成することができる。

【００７９】本発明による組み換えベクター分子によっ
て形質転換された宿主細胞はまた、上記核酸配列によっ
てコードされるポリペプチドの発現に好都合な条件の下
で培養することができる。ワクチンは、粗製培養標本、
宿主溶解物、または、宿主細胞抽出物を用いて調製して
もよい。もっとも、もう一つの実施例では、本発明によ
るポリペプチドのさらに純粋な精製物が、その使用目的
に応じて、ワクチンに調製される。生産されたポリペプ
チドを精製するために、本発明による組み換えベクター
で変換された宿主細胞を、適当な容量になるまで培養
し、生産されたポリペプチドを、その細胞から、また
は、そのタンパク質が分泌されるものであるなら、培養
液から単離する。培養液中に分泌されたポリペプチド
は、標準法、例えば、塩分画法、遠心、超遠心、クロマ
トグラフィー、ゲルろ過、または、免疫アフィニティー
・クロマトグラフィーによって単離・精製できる。一
方、細胞内ポリペプチドは、先ず上記細胞を回収、その
細胞を、例えば、超音波処理、または、その他の機械的
破壊手段、例えば、フレンチ・プレスで破壊し、その後
で、そのポリペプチドを、他の細胞内成分から分離し、
ワクチンに形成することができる。細胞破壊はまた、化
学的（例えば、ＥＤＴＡや、トリトン X114 のような洗
剤）、または、ライソザイム消化のような酵素的手段を
用いて実行できる。

【００８０】本発明によるポリペプチドに対する抗体ま
たは抗血清は、受動的免疫療法、診断用イムノアッセ
ー、抗イディオタイプ抗体の生産にたいし有用性を秘め
ている。

【００８１】上記の特徴を持つ Eimeriaタンパク質を用
いて、ポリクロナールな抗体も、単一特異性でモノクロ
ーナルなものも生産することができる。もしポリクロナ
ール抗体が欲しいのであれば、ポリクロナール血清を生
産、処理する方法は、当該技術において既知のものであ
る（例えば、Mayer and Walter, eds., Immunochemical
Methods in Cell and Molecular Biology, Academic P
ress, London, 1987)。要するに、選んだほ乳動物、例
えば、兎に、上記免疫原物質を、（複数回）注入する。
すなわち、１免疫化あたり、約 20 μg から約 80 μg
のタンパク質を注入する。免疫化は、受容可能なアジュ
ヴァント、一般には等容量の免疫原とアジュヴァントに
よって与えられる。受容可能なアジュヴァントとして
は、フロインドの完全、フロインドの不完全、明礬沈
澱、あるいは、油中水懸濁液が挙げられるが、最初の免
疫化には、フロインドの完全アジュヴァントが好まし
い。フロインドの不完全アジュヴァントは、全てのブー
スター免疫化にとって好ましい。最初の免疫化は、兎の
背中の多数の皮下部に、約１ｍｌの懸濁液を投与するこ
とである。等容量の免疫原物質を含むブースター免疫
を、約１カ月間隔で与え、個々の兎血清中に十分な濃度
の抗体が出現するまで続ける。血液を回収し、血清を、
当該技術に既知の方法によって単離した。

【００８２】免疫原にたいする単一特異的抗体を、精製
タンパク質により、上記のように兎を免疫化して調製し
た多特異的抗血清から、Hall et al. (Nature 311, 379
-387, 1984) の変法によって、アフィニティーにより精
製する。ここに用いる単一特異的抗体は、関係抗原にた
いし、単一抗体種、または、相同結合特性を持つ、多数
抗体種と定義される。ここで用いる相同結合は、複数の
抗体種が、ある特定の抗原ないしエピトープに結合する
能力を指す。

【００８３】Eimera免疫原物質にたいして反応性を持つ
モノクローナル抗体は、純系マウス、できれば、Balb/c
を適当なタンパク質で免疫化して調製してもよい。マウ
スは、受容可能なアジュヴァントを等容量含む、０．５
ｍｌ用量当り、約 100ngから約10μg の免疫原物質を、
腹腔内に注入して免疫する。このような受容可能な免疫
原物質としては、フロインドの完全、フロインドの不完
全、明礬沈澱、油中水懸濁液が挙げられる。このマウス
に、１次免疫後、約１４日、２１日、６３日に、アジュ
ヴァントなしの、等量の免疫原物質によって、静注によ
るブースター免疫する。最終ブースター免疫後約３日
で、個々のマウスを血清学的にテストし、抗免疫物質抗
体の有無を調べる。抗体産生マウスの脾臓細胞を単離
し、げっ歯類骨髄細胞、例えば、SP-2/0などと、当該技
術に既知の技法（Kohler and Milstein, Nature 256; 4
95-497, 1975) によって融合させる。ハイブリドーマ細
胞を、適当な細胞培養液中、例えば、ダルベッコの修正
イーグル液（ＤＭＥＭ）で、ヒポキサンチン、サイミジ
ンおよびアミノプテリン存在下に育成して選択する。抗
体産生性ハイブリドーマを、できれば、MacPherson (So
ft Agar Techniques, Tissue Culture Methods and App
lications, Kruse and Paterson, eds., Academic Pres
s, 276, 1973) の軟寒天法でクローンし、不連続コロニ
ーを、培養プレートの個々のウェルに移し、適当な培養
液で培養する。抗体産生細胞は、適当な免疫原でスクリ
ーニングして特定する。免疫原陽性ハイブリドーマ細胞
を、当該技術に既知の方法により維持する。このハイブ
リドーマをインビトロで培養し、当該技術に既知の手順
によって、ハイブリドーマを注入後、マウス腹水液を調
製して、特異的、抗−モノクローナル抗体を生産する。

【００８４】抗イディオタイプ抗体とは、予防の対象と
なる病原体の抗原の「内部像」を持つ免疫グロブリンで
あり、ワクチンで免疫原として用いることができる（Dr
eesman et al., J. Infect. Disease 151, 761, 1985)
。抗イディオタイプ抗体を育成する方法は、当該技術
においては知られている（MacNamara et al., Science2
26, 1325, 1984 ）。

【００８５】本発明によるワクチンは、通常の、能動的
免疫処方で投与することができる。すなわち、投与形態
と適合するやり方で、かつ、予防的に有効な量として、
単一、または、繰り返し投与することであり、予防的に
有効な量とは、すなわち、免疫性抗原ないし組み換え微
生物の量であって、悪性の Eimeria寄生種によるチャレ
ンジにたいして、鳥類に、免疫を誘発する上記抗原を発
現させるのに十分な量である。免疫とは、ワクチン化実
施後の鶏集団において、ワクチン化していない集団に比
べて、有意に高い水準の予防が誘発されること定義され
る。

【００８６】生ウィルス・ベクター・ワクチンの場合、
鶏１羽当りの用量割合は、１０5 −１０8 ｐｆｕに恒っ
ている。

【００８７】本発明による、典型的な、サブユニット・
ワクチンは、本発明によるタンパク質の 1μg - 1mg を
含む。

【００８８】ワクチンの投与は、例えば、皮内、皮下、
筋注、腹腔内、静注、経口、または、鼻孔内、から実施
できる。

【００８９】さらに、ワクチンはまた、水性の溶媒、ま
たは、懸濁物、また、しばしば他の成分を含む水、を含
んでいてもよい。この成分の添加は、活性、および／ま
たは、保存期間を増すためである。この成分は、塩、ｐ
Ｈバッファー、安定剤（スキム・ミルクやカゼイン加水
分解物のようなもの）、懸濁剤、免疫反応改善のための
アジュヴァント（例えば、油類、ムラミル・ジペプチ
ド、水酸化アルミニム、サポニン、多数陰イオン、両親
媒性物質）、および、保存剤であってよい。

【００９０】本発明によるワクチンはまた、鶏の、他の
病原体に関する免疫原を含んでいてもよいし、あるい
は、そのような免疫原をコードする核酸配列を含んでい
てもよい。例えば、マレック病ウィルス（ＭＤＶ），ニ
ューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウ
ィルス（ＩＢＶ）、感染性嚢胞病ウィルス（ＩＢＤ
Ｖ）、鶏貧血性物質（ＣＡＡ），レオ・ウィルス、鳥レ
トロ・ウィルス、鶏アデノ・ウィルス、七面鳥鼻気管炎
ウィルス、Ｅ．ｃｏｌｉ、その他の Eimeria種である。
これによって、多価のワクチンを生産することができ
る。

【００９１】本発明はまた、「免疫化学的試薬」に関わ
る。この試薬は、本発明によるタンパク質を含む。

【００９２】「免疫化学的試薬」という用語は、本発明
によるタンパク質が適当な支持体に結合する、または、
標識物質とともに供給されることを指す。

【００９３】用いられる支持体は、例えば、微小ウェル
ないしキュベットの内壁、管ないし毛細管、膜、フィル
ター、試験片ないし、粒子、例えば、ラテックス粒子、
赤血球、染料ゾル、金属ゾルないし、ゾル粒子としての
金属化合物の表面である。

【００９４】用いられる標識物質は、先ず、放射性同位
元素、蛍光物質、酵素、染料ゾル、金属ゾル、ゾル粒子
としての金属化合物である。

【００９５】本発明による核酸配列はまた、ハイブリダ
イゼーション実験のための特定のプローブを設計するの
に用いることもできる。すなわち、それによって、どの
ような種類の組織においても、Eimeria関係の核酸の検
出に用いることができる。

【００９６】本発明はまた、Eimeria感染の診断に有効
な、上記核酸配列を含む試験キットを含む。

【００９７】本発明はまた、イムノアッセーに用いられ
る試験キットに関わる。かつ、このキットは、本発明に
よる、少なくとも１種の免疫化学的試薬を含む。

【００９８】この試験キットを用いて得られる免疫化学
的反応は、できれば、サンドイッチ反応、凝集反応、競
合反応、または、阻害反応であることが望ましい。

【００９９】サンドイッチ反応を実施するには、テスト
・キットは、例えば、固相の支持体に結合した、本発明
によるペプチドと、本発明による標識ポリペプチドか、
標識抗−抗体のいずれかから成るものであってもよい。
この支持体は、例えば、微小テスト・ウェルの内壁であ
る。

【０１００】

【実施例】実施例１寄生種の調製と単離 E. acervulina Houghton株を、AFRC Houghton 研究所か
ら入手し、コクシジウム非感染鶏に継代した。

【０１０１】寄生種及びその分画の調整。E. tenella寄
生種を維持し、接合子嚢を、Longら（Fol. Vet. Lat.
6, 201-217, 1976 ）の記載する方法に従って単離し
た。スポロゾイトは、Wisher & Rose (Parasitology 8
8, 515-519, 1984 ）の記載する通りに単離及び精製
し、さらに、Larsenら（J. Parasitol. 70, 597-601, 1
984 ）の記載する、ナイロン・ウール精製法を実施し
た。

【０１０２】メロゾイトを下記の要領で接種し、７２時
間後に収集した（さらに、Jenkinsand Dame, Mol. Bioc
hem. Parasitol. 25, 155-164, 1987 を参照）。４から
６週令の鶏に、1-5x106 個の胞子形成接合子嚢を経口的
に感染させた。接種してから７２時間後に鶏を殺し、十
二指腸をメッケル憩室まで取り出し、氷冷燐酸バッファ
ー塩類液（0.04M PBS pH 7.3）中に保存した。この十二
指腸を長軸方向に切断し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。次
に、この腸管を５ｃｍ片に切断し、100-200U/mlペニシ
リン及び100-200 μg ストレプトマイシン／ｍｌを含む
Hanks-BSS中に、３７℃で１５−３０分懸濁した。

【０１０３】上清を取り出し、120, 60,及び 35 メッシ
ュのステンレス・スチールのふるいでろ過した。この溶
液を130gで８分間遠心分離した。遠心上清を回収し、15
00g４℃で１０分間遠心してメロゾイトを濃縮した。

【０１０４】濃縮ペレットを、150mM NaClを含む 25mM
Tris-HCl pH 8.0 に再懸濁し、同一バッファーで平衡さ
せたＤＥ−５２（Whatman ）で精製した。メロゾイト
は、非結合分画に溶出した。収量は、感染鶏１羽当り約
1x109 メロゾイトであった。

【０１０５】実施例２ Eimeria抗原の精製Ａ．方法Triton X114 抽出 Bordier (Bordier, C., J. Biol. Chem. 256, 1604-160
7, 1981)に従い、材料は、 −予備濃縮した Triton X114 (TX114)（下記参照） −10mM Tris/HCl-150mM NaCl pH 7.4 (TBS) −イソプロパノールに溶解した、100mM フェニルメチル
スルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ） −0.06% TX114 を含む、ＴＢＳに溶解した、６％蔗糖溶
液（蔗糖クッション）ＴＢＳ１ｍｌ中の5x108 個の E. acervulinaメロゾイト
をホモジェネートした。混合物を、1mM PMSF及び１０％
（ｖ／ｖ）の予備濃縮した TX114に加えた。

【０１０６】機械的せん断によって、タンパク質を０℃
で少なくとも２時間抽出した。非溶解性物質は、エッペ
ンドルフの遠心分離機により、12,000g ４℃で１０分間
遠心してペレットとした。溶解した物質を含む上清を、
等容量の蔗糖クッションに上層し、４０℃で１０分間イ
ンキュベートした。

【０１０７】４００ｇで１０分間（室温で）遠心した
後、親水物質を含む上相を取り出し、再度抽出し、同じ
蔗糖クッションに上層し、上記のように遠心した。

【０１０８】下相分画は、残してある上相分画と別に保
存した。

【０１０９】疎水性物質から、水相を完全に除去しなけ
ればならない場合には、抽出をもう一度繰り返した。

【０１１０】全分画は、分析に使用するまで−７０℃に
冷凍保存した。トリトン X114 の予備濃縮 20mlトリトン X114 (Serva) を冷却 TBS pH 7.4 で１リ
ットルとし、混合し、０−４℃でインキュベートした。
完全に溶解した後、溶液を４０℃の水浴に移した。相分
離は１６時間後完了した。上相を除去し、かわりに等量
のＴＢＳを加えた。この操作を２度繰り返した。最終的
な下相、これを「予備濃縮したＴＸ１１４」と呼ぶが、
これを 100mlの瓶中に４℃で保存した。最終ＴＸ１１４
濃度は、約２０％である。

【０１１１】モノクローナル抗体１０6 −１０7 個のメロゾイトを、繰り返し腹腔内に接
種することにより、Balb/cマウスにおいて、E. acervul
ina メロゾイトに対する抗体を得た。

【０１１２】各個体の脾臓細胞と、骨髄腫 P3X63Ag 8.
6.5.3. を融合させ、Scheonherrら（Develop. biol. St
and. 50, 235-242, 1982)の記載した方法でクローン化
した。

【０１１３】スクリーニングは、乾燥し、アセトン固定
されたメロゾイトに対し免疫蛍光法で行なった。高濃縮
度モノクローナル抗体液は、透析用モジュールを培養容
器として用い、培養液を連続的に交換しながら、インビ
トロで調製された。この方法は、Schonherr and van Ge
lder (Animal Cell Biotechnology 3, 337-355) の記載
する通りである。

【０１１４】免疫アフィニティー・クロマトグラフィー −アフィニティー・マトリックスの活性化セファローズ CL-4B (Pharmacia)を、蒸留水に溶解した
臭化シアン（CNBr）50mg/ml で活性化した。活性化は、
十分換気したフードの中で行なった。混合物を、ゆっく
り回転するマグネチックスターラーで撹拌し、ｐＨは、
4M NaOH により室温で30分間、10.5-11.0 に維持した。
反応完了後、セファローズをガラスフィルター上で、50
0ml 冷水、500ml 冷 0.2M NaHCO3（結合用バッファー）
により洗浄した。このゲルは直ちに免疫グロブリンの結
合用に用いられた。 −モノクローナルＩｇＧのセファローズへの結合モノクローナル抗体は、高濃縮度上清として用いたが、
0.2M NaHCO3 （結合用バッファー）に対して十分に透析
した。また、ＰＤ１０カラム（Pharmacia ）を用いてバ
ッファー交換も行なった。方法は、メーカーのプロトコ
ルに従った。CNBr活性化セファローズ CL-4Bを、最終濃
度が 2-5 mg/ml MoAb IgG となるように加え、その混合
物を、４℃で一晩、もしくは、室温で２時間、回転倒立
撹拌した。非結合分画を除去し、ＢＣＡ試薬（Pierce）
を用いて、タンパク質を測定した。セファローズを１０
回洗浄し、次に、１容量の1Mエタノールアミン／HCl pH
8.5と、室温で２時間回転倒立混合した。200ml の0.1M
Tris/HCl -0.5M NaCl pH8.0 と0.1M酢酸-0.5M NaCl pH
4.0 を交互に４回交換して洗浄し、非共有結合物質を
除去した。このゲルを0.05% アザイドを含むＰＢＳ中
に、４℃で保存した。

【０１１５】−アフィニティー精製バッファー類Ａ）25mM Tris/HCl + 0.5M NaCl + 0.1% Nonidet P40
(NP40) pH 8.0 Ｂ）0.1M グリシン／HCl + 0.1% NP40 pH 2.6 Ｃ）0.1M Tris/HCl + 0.5M NaCl + 0.1% NP40 pH 8.0 Ｄ）3M KSCN をＡ液に溶解したものＥ）1M Tris/HCl pH 8.0 Ｆ）10mM Tris/HCl + 150mM NaCl pH 8.0 7ml セファローズ−ＩｇＧを、冷却用ジャケットを備え
た、ファルマシア C10/20 カラムに移した。バッファー
Ａに溶解した１０倍希釈 TX114疎水性抽出物（ペレッ
ト）を、0.5ml/分でカラムに供給し、８℃で１６−２０
時間再び循環させた。カラムを、カラム層の５−１０倍
容量のバッファーＡで洗浄した後、流れの方向を逆転さ
せ、次に、7.5ml バッファーＢ），5ml バッファー
Ｃ），10mlバッファーＡ）、7.5ml バッファーＤ），及
び40mlバッファーＡ）で溶出した。

【０１１６】酸性分画（１ｍｌ）を直ちに、0.1ml バッ
ファーＥ）で中和した。KSCN分画をバッファーＦ）に対
して一晩透析した。全ての分画について、SDS-PAGE, 免
疫ブロット法で分析し、タンパク質含量については、Ｂ
ＣＡ法で分析した。

【０１１７】ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動（SDS-PAGE）および免疫ブロット法ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Laemmli のバッファー・システム
（Laemmli, U.K., Nature 227, 680-685, 1970）を用い
て、１２％アクリルアミド・ゲル上で行なった。ウェス
タン・ブロットは、Vermeulen ら（Vermeulen, A.N. et
al., J. Exp.Med. 162, 1460-1476, 1985 ）にならっ
て実施した。ブロット・バッファーとして、２５倍希釈
Laemmliの下層容器用電気泳動バッファーを用いた。ブ
ロットは、バイオ・ラッドトランスブロット・セルに、
９０Ｖ１．５時間で生じた。

【０１１８】ニトロセルロース（0.25μm, Schleicher
and Scheull)を、ＰＢＳ（０．９％塩類液に溶解した
0.01M燐酸塩ｐＨ７．３）に溶解した 0.1% NFMP（脱脂
粉乳（OXOID ））で、３０分ブロックした。

【０１１９】血清と、アルカリ・フォスファターゼ複合
抗血清（Zymed ）を１．５時間インキュベートした。基
質として BCIP/NBT を用いて、陽性結合を検出した。

【０１２０】ポリクロナール抗体兎 8275 (K8275) 抗体は、兎（ニュージーランドホワイ
ト）に、不完全フロイント様アジュヴァント懸濁液中の
E. acervulina７２時間メロゾイトを、４週間隔で２回
皮内注射を行なって免疫化することで得られた。

【０１２１】単一特異的抗体は、血清中に抗−Eimeria
抗体の無いことを以てあらかじめ選んだ兎中で得られ
た。

【０１２２】兎 5706, 5792 に、不完全フロイント様ア
ジュヴァントで乳化させた（油の中に水を入れたも
の）、55-100μg のアフィニティー精製した Eam45を２
回（４−５週間隔）注入した。

【０１２３】兎 5796 にも、同じプロトコルによって、
アフィニティー精製した Eam20を注入した。

【０１２４】兎 5794 にも、同じプロココルによって、
アフィニティー精製前の TX114疎水性抽出物を注入し
た。この分画は、Eam45, Eam20及びその他の数種のタン
パク質を含んでいた。

【０１２５】Eas100に対する単一特異的抗体は、鶏に、
100mM Tris-HCl + 150mM NaCl + 0.1% NP40 pH8.0 に溶
解し不完全フロイント様アジュヴァントに乳化させた精
製タンパク質を頸部の皮下に１４日間隔で３回注入する
ことで得られた。最後の免疫化処置後１１日目に、鶏を
放血し、血清を回収した（鶏３２３の血清をその後の分
析に用いた）。

【０１２６】Ｂ．結果ＴＸ１１４による抽出第３図は、ＴＸ１１４抽出と、相分離後に得られた様々
の分画を示す。試料を電気泳動し、ニトロセルロース上
にブロットし、モノクローナル抗体の混合液で調べた。
この混合液は、それぞれ、非還元状態で測定した場合、
相対的分子量 180-210kD（平均 200kD）、95-105kD（平
均 100kD）、45-55kD （平均 50kD ）、及び18-22kD
（平均 20kD ）を持つEam200, Eam100, Eam45,及び Eam
20タンパク質にたいし特異性を持つ、モノクローナル抗
体を含むものである。

【０１２７】Eam200及びEam100タンパク質は、親水性を
持つと思われる。というのは、それらは疎水性ペレット
（レーン５）中には見られなかったからである。逆に、
Eam45 及び Eam20は、親水性分画には存在しなかった。

【０１２８】Eam45, Eam20の免疫アフィニティー・クロ
マトグラフィーモノクローナル抗体 E.ACER 10C-2Aをセファローズに結
びつけ、Eam45 タンパク質と結合させた。一方、Eam20
に結合させるのには E.ACER 10E-2 を用いた。

【０１２９】結合効率は、両 MoAb にたいして９０％以
上であり、カラムからの MoAb の漏出は最小であった。

【０１３０】「Eam20 」カラムを「Eam45 」カラムと接
続した。これによって、後者の非結合分画が、前者のマ
トリックスに結合できる。両カラムは別々に溶出させ
た。

【０１３１】第４図は、10C-2A (Eam45)マトリックス分
画の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／イムノ・ブロットを示す。こ
の図は、第３図とは別の実験から得られた。このブロッ
トは、兎 K8275抗体で調べた。Eam45 は、主にｐＨ２．
６（レーン１２から１４）で溶出すると思われるが、若
干は残っており、ＫＳＣＮと共に溶出される（レーン１
６から１８）。しかしながら、後者の分画は、Eam45 抗
原とは恐らく無関係な、他の低分子量物質も含んでい
た。

【０１３２】第５図も、同様のブロット図であるが、Ea
m20 試料と結合する１０Ｅ−２カラムからのものであ
る。

【０１３３】レーン３は、１０Ｃ−２Ａカラムに結合せ
ず、したがって、１０Ｅ−２吸着物質の開始物質である
試料を含んでいた。この分画は、Eam45 試料は全く含ん
でいないと考えられる。29kDにマークしたバンドはアー
チファクト性のもので、Eam20 タンパク質に属してい
た。このアーチファクトは、電気泳動標本中にトリトン
Ｘ１１４があることで誘導されたものであった。

【０１３４】レーン４は、１０Ｅ−２カラムの非結合分
画を含んでいるが、このことから、この MoAb がEam20
全試料を吸収する、その高い効率が示されている。

【０１３５】試料中いくらかはｐＨ２．６（レーン１０
から１２）で溶出するが、大部分は、3M KSCN （レーン
１４から１７）で溶出した。この分画は、非特異的に結
合する試料を全く含んでいなかった。

【０１３６】Eam45, Eam20に対するモノクローナル抗体
は、メロゾイト生体上の表面タンパク質を認識した。

【０１３７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で測定したEam45 の見
かけの分子量は、 45-55kDであったが、以前の報告を参
照して、その同一性は変化していないと判断した。Eam4
5 の分子量は、ここでは、約 50kD とされた。還元ゲル
上では、Eam45 は、55kDを示す。

【０１３８】抗−Eam45 血清はすべて、メロゾイト・ブ
ロット上で調べると、50kD, 100kD付近で陽性反応を示
した。

【０１３９】スポロゾイト由来、E. acervulina 100kD
タンパク質の精製 E. acervulina 100kD タンパク質の精製のために、スポ
ロゾイトを、前記のプロトコルに従って、ＴＸ１１４で
抽出した。Eas100は、もっぱら親水相に検出された。次
に、これを、CNBr- 活性化セファローズ-4B に結合した
MoAb E.ACER 5F-2 の免疫アフィニティー・カラムに結
合させた。結合、溶出条件は、前記の通り。

【０１４０】Eas100は、酸性ｐＨで２重バンドとして溶
出した。Eas100を含む分画を第６図に示す（レーン
４）。次に、このブロットを、兎抗−E.acerスポロゾイ
ト抗体で後処理した。

【０１４１】この分画には、他には、寄生種由来のバン
ドは見られなかった。唯一の汚染性バンド（ＭＷ＞200k
D ）は、基材からのＩｇＧ漏出によるもののようであ
る。

【０１４２】本試料を用いて、Eas100に対する鶏の抗体
を得た。

【０１４３】鶏 323の抗体を用いて、７２時間 E. acer
vulinaメロゾイト mRNA （実施例３）から得たｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングした。

【０１４４】陽性クローン上で抗体選択したものは、予
期した通りEas100に反応し、また、E. acervulina メロ
ゾイト中の同じ大きさのタンパク質にも反応した。免疫
ブロットされ、アフィニティー精製された Eam100 (MoA
b E.ACER 16B-2B 使用）は、E.ACER 5F-2,すなわち、ス
ポロゾイトと等価の Eas100 を精製するのに用いた MoA
b と陽性反応を呈した。したがって、両タンパク質は相
関を持つ。

【０１４５】メロゾイト由来 Eam200 の免疫アフィニテ
ィー・クロマトグラフィーモノクローナル抗体 E.ACER 11A-2Aをセファローズに結
びつけ、Eam200タンパク質を結合させた。

【０１４６】結合効率は９０％以上であり、カラムから
の MoAb の漏出は最小ではあったが、検出し得るもので
あった。

【０１４７】Eam200, Eam100を含む TX114抽出物の疎水
性分画を、前記のEam45, Eam20で用いたプロコトコルに
したがって、カラムに結合させた。

【０１４８】第７図に示すように、精製 Eam200 を酸性
溶出によりカラムから遊離した（レーン４）。

【０１４９】実施例３ E. acervulinaメロゾイトのｃＤＮＡライブラリーの調
製、免疫学的スクリーニング、ＤＮＡ配列分析Ａ．方法ＲＮＡの単離ＲＮＡの単離のため、１０9 メロゾイトのペレットを、
0.5ml H 2 O に再懸濁した。0.5ml の溶液Ａ（トリス 1
0mM,酢酸ナトリウム 75mM, EDTA 2mM, SDS 1%(pH 7.
2)）、1ml の溶液Ｂ（5Mグアニジン・モノ・イソチオシ
アネート、EDTA 10mM,トリス 50mM (pH 7.5)）および、
2gガラス・ビーズ（0.5mm)を添加後、懸濁液を、１分間
撹拌した。４ｍｌの溶液Ｂと、0.4ml のβ−メルカプト
エタノールを添加し、試験管を、水浴（６０℃）に１５
分置いた。５ｍｌのフェノールを添加してから、試験管
を６０℃でさらに１５分加熱し、室温（ＲＴ）に冷却し
た。この懸濁液を、２．５ｍｌの（0.1M酢酸ナトリウム
pH 5.2, 10mM Tris (pH 7.5), 1mM EDTA）、及び５ｍｌ
のクロロフォルム−イソアミルアルコール（２４：１）
と共に撹拌、混合し、その後、遠心（6000 rpm で５
分）により相分離した。水相を、再び２０ｍｌフェノー
ル・クロロフォルム・イソアミルアルコール（25:24:1
）により、これをローラードラム上で１０分間混合し
て抽出した。6000 rpmで５分間遠心後、２容量のエタノ
ールを加えて核酸を沈澱させ、遠心（6000 rpmで１０
分）で回収した。ペレットを７０％エタノールで洗浄
し、Maniatisらの記載する方法で、 A+ RNA を単離した
（Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A labora
tory Manual, second edition, Cold Spring Harbor La
boratory Press, USA, 1989)。１０^９個のメロゾイトか
ら、約１μｇのポリ A+ RNA が単離された。

【０１５０】ｃＤＮＡライブラリーの構築ポリ A+ RNA は、MMLV逆転写酵素によって、ｃＤＮＡに
転換した。このために、0.5 μg ポリ A+ mRNAを、10μ
ｌ H_２O に溶解し、６５℃で１０分間加熱し、次に氷上
で急速に冷却した。ｃＤＮＡ合成は、ファルマシア（Ph
armacia ）のｃＤＮＡ合成キットを用いて行なった。端
の鈍いＤＮＡ分子を得るために、ｃＤＮＡを、１μｌの
クレノウ（Klenow）ＤＮＡポリメラーゼ（7U/ μｌ）３
７℃２０分処理し、次に、１μｌのＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ（7.5U/ μｌ）と、３７℃で、１０分間インキュベ
ートした。等容量のフェノール・クロロフォルム・イソ
アミルアルコール（25:24:１）で抽出し、遠心（13000
rpm で、５分間、Biofuge）した後、１容量の酢酸アン
モニウム，及び４容量のエタノールを添加して、ｃＤＮ
Ａを沈澱させた。このペレットを、７０％エタノールで
洗浄し、82μｌ H2O に溶解した。10μｌの結合バッフ
ァー（Tris 500mM (pH 8.0），MgCl2 100mM,DTT 100mM,
ATP 100mM, 50%(w/v) ポリプロピレングリコール 8000
）、５μｌの EcoRI受容体溶液（ファルマシアｃＤＮ
Ａ合成キット）及び３μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（7U／
μｌ）を添加して、１２℃で一晩インキュベートして、
EcoRI受容体をｃＤＮＡに結合させた。反応は、加熱
（６５℃で１０分）により停止させた。このｃＤＮＡ
を、１０μｌのＡＴＰ（１０ｍＭ）及び２μｌのポリヌ
クレオチド・キナーゼ（7U／μｌ）を添加し、３７℃で
１時間インキュベートすることによりリン酸化した。こ
のｃＤＮＡを、１容量のフェノール・クロロフォルム・
イソアミルアルコール（25:24:１）で抽出し、Biogel A
-15 m カラムで精製した。分画を含むｃＤＮＡを、０．
１容量酢酸ナトリウム(3M 酢酸ナトリウム (pH5.6))、
２容量のエタノールを添加により沈澱させた。このペレ
ットを７０％エタノールで洗浄し、20μｌ T10E0.1(Tri
s 10mM (pH 7.6), EDTA 0.1mM)に溶解した。このｃＤＮ
Ａ分子を、λgt10, またはλgt11 DNA（Huynh らDNA cl
oning techniques: A practical approach, 1984中に記
載の方法による）中でクローン化した。

【０１５１】Eimeria タンパク質にたいする抗血清を用
いたラムダ gt11 cDNA ライブラリーのスクリーニング lambda gt11 cDNAライブラリーを、Eimeria 寄生種由来
タンパク質に対して得られた抗体でスクリーニングし
た。マウス・モノクローナル抗体、または、兎ないし鶏
の単一特異的抗血清のいずれかを用いた。使用前に、抗
体を、１ｘトリス塩（Tris-HCl 10mM, NaCl 150mM, pH
8.0) + 0.05% Tween 20 + 10% 牛胎児血清（ＦＣＳ）で
希釈し、フィルター上で、室温で、２時間インキュベー
トした。次に、フィルターを、１回１０分ずつで４回、
各フィルターにたいし、50ml 1x Tris塩 + 0.05% Tween
20 で洗浄した。２回目の抗体インキュベーションに
は、山羊抗マウス、または、山羊抗兎、または、兎抗鶏
抗体と、アリカリフォスファターゼの複合体を用い（1x
Tris 塩 + 0.05% Tween 20 + 10% FCS で 1:7500 希
釈）、室温で３０分インキュベートし、その後フィルタ
ーを上記のように洗浄した。発色反応を、あらかじめ、
0.33mg/mlニトロブルーテトラゾリウムと、0.17 mg/ml
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル燐酸が溶解し
てあるTris-HCl 100mM, NaCl 100mM, MgCl_２ 10mM (pH
9.6) 中で行なった。室温で３０分インキュベーション
後、反応を停止させた。

【０１５２】免疫反応陽性クローンは、単離プラークを
さらに２・３回繰り返してプレーティングし、上記の免
疫学的スクリーニングをすることにより精製した。

【０１５３】ラムダｇｔ１１ｃＤＮＡクローンの特徴ファージ株の調整と、ＤＮＡ抽出は、標準法により行っ
た（Maniatis, T. etal., Molecular Cloning, A labor
atory Manual, second edition, Cold SpringHarbor La
boratory Press, USA, 1989 ）。制限エンドヌクレアー
ゼによる分解後、ＤＮＡは、89mMトリス、89mMほう酸、
2mM EDTA, pH 8.3に溶解した寒天ゲルの電気泳動により
分析した。

【０１５４】抗体選択実験は、Osaki, L.S. et al. (J.
Immunological Methods 89, 213-219, 1986) にしたが
って行ない、これを、単離されたラムダｇｔ１１ｃＤＮ
Ａクローンがコードするタンパク質を同定する最終試験
とした。ファージ株を、5×10^４ pfu/μlまで希釈し、
１μｌを、２００μｌの E. coli Y1090- 細胞とインキ
ュベートし、プレートした。ＩＰＴＧで２．５時間飽和
させたニトロセルロース・フィルターを、プレートの上
に置き、５．５時間インキュベートした後、フィルター
を裏返し、インキュベーションをさらに２時間続けた。
フィルター付きのプレートを、４℃で一晩保存し、その
後、フィルターを、１ｘトリス塩で、２０分洗浄し、室
温で２時間、１ｘトリス塩に溶解した２０％ＦＣＳでブ
ロックした。室温で５分間トリス塩洗浄を行なった後、
フィルターを、空気乾燥した。抗体標本は、カプリル酸
沈澱によって精製し、1x Tris 塩 + 20% FCS + 0.05% N
P4O で１：１５０に希釈した。各フィルターを、室温で
６０分、１５ｍｌの血清とインキュベートした。フィル
ターを、1x Tris 塩 + 0.05% NP40 で、１０分間３回洗
浄した。結合ＩｇＧを、5ml の 0.2M グリシンＨＣｌ
（ｐＨ２．８）により室温で１分間溶出し、150μl 2M
Tris, 0.2ml PBS Tween (25x), 1ml FCS で急速に中和
した（溶出操作に用いた皿はすべて、先ず、室温で１時
間、1x Tris 塩+ 10% FCSを添加してブロックした）。
この溶出液を、Eimeria メロゾイドまたはスポロゾイト
のウェスタン・ブロット片に用いて、相応するタンパク
質を同定した。

【０１５５】ハイブリダイゼーションによる、ラムダｇ
ｔ１０ｃＤＮＡのスクリーニングラムダ gt11/Eam20 クローンから得た 200 bp 挿入部
を、ランダム・プライム法により、ジゴキシジェニン−
ｄＵＴＰで標識した。これは、Boehringer, Mannheim
（カタログ番号 1093657）の発行する、“DNA labeling
and detection kit, non-radioactive”に添えられた
プロトコルを正確に守って行なった。上記の、ラムダｇ
ｔ１０ E. acervulina cDNA ライブラリー由来の固定Ｄ
ＮＡを含むフィルターを、Maniatisら（上記）の記載す
る方法で調整し、変性したばかりの（９５℃で１０分）
標識 E. acervulina cDNA フラグメントで、４２℃１６
時間プローブした。方法は、メーカーの指示に従った。

【０１５６】フィルターは下記のように洗浄した。2×S
SC, 0.1% (w/v) SDS (1 x SSCは、0.015 mol/l クエン
酸ナトリウム、pH 7.0 + 0.15mol/l NaCl)で、室温で１
５分２回、1 × SSC, 0.1%(w/v) SDSで、６０℃で１５
分２回、0.1 × SSC, 0.1% (w/v) SDS で、６０℃で３
０分２回、１５分１回、PBS-tween (7.65g/l NaCl, 0.9
1g/l Na_２HPO_４. 2H_２O, 0.21g/l KH_２PO_４, 0.05%(v/
v) Tween 80, pH 7.3)で、室温で、１５分２回。

【０１５７】次に、フィルターを、PBS-tween で1:5000
に希釈したポリクロナール羊抗−ジゴキシジェニンＦａ
ｂフラグメントと反応させ、室温３０分間でアルカリフ
ォスファターゼと複合させた。フィルターを、室温で、
PBS-tween で、１５分４回、0.01M Tris-HCl pH 8.0,
0.15M NaCl で１５分１回洗浄した後、フィルターへの
アルカリフォスファターゼの結合を、0.33g/l ニトロブ
ルー・テトラゾリウムと、0.17g/l ５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル燐酸を、0.1M Tris-HCl pH9.6,
0.1M NaCl, 0.01M MgCl_２に溶解した溶液でインキュベ
ートして検出した。陽性プラークを、単離プラークをさ
らに２・３回繰り返してプレーティングし、上記のよう
にハイブリダイゼーションすることにより精製した。

【０１５８】「半特異的」ＰＣＲによる拡張ＤＮＡ配列
の単離免疫学的スクリーニングによってラムダｇｔ１１ライブ
ラリーから単離した最初のクローン、または、ハイブリ
ダイゼーション分析によってラムダｇｔ１０から単離し
たクローンは、それぞれのタンパク質の全長リーディン
グフレームを含んでいなかったので、ポリメラーゼ連鎖
反応法によって、さらにＤＮＡ配列を生成した。

【０１５９】この末端に向かって、ラムダｇｔ１１の一
次ｃＤＮＡライブラリーを増幅した。5x104 pfu を、60
0 μl の E. coli Y1090- 細胞でインキュベートし、プ
レーティングした。一晩インキュベートした後、寒天の
上層を試験管に収集し、５ｍｌのファージ希釈バッファ
ー（Tris (pH 7.6) 10mM, MgCl2 10mM, NaCl 100mM,ゼ
ラチン 1mg/ml ）を加え、４℃で、１６時間インキュベ
ートした。この懸濁液を、遠心で清澄し、上清を用い
て、直ちにＰＣＲ反応を行なった。Blakely andCarman
(Bio Techniques 10, 53-55 (1991)）の方法を、修正を
加えて用いた。約1010 pfu/ μｌを含む上清 2.5μl に
対し、 1μｌ dNTP 保存溶液（それぞれのdNTP20mM)10
μｌのバッファー（Tris 150mM (pH 7.6), KCl 600mM,
MgCl2 25mMを含む）、各プライマー 1μg, 3μｌの DMS
O を加えた。100 μｌの最終混合液に2.5UのTaq ポリメ
ラーゼ（Cetus/Perkin-Elmer）を加えた。

【０１６０】各プライマー・セットの一つは延長する E
imeria配列、例えばEam20, Eam45,Eam100のいずれかに
たいして特異的である。各セットの第２プライマーは、
「一般的」プライマーで、ラムダｇｔ１１のβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子の３′末端と相同である（ラムダｇｔ
１１プライマー（逆転写）、24 MER #1222 (New Englan
d Biolabs)。

【０１６１】ＰＣＲフラグメントを、ゲル電気泳動で精
製し、厳密にメーカーの指示に従ってＴＡクローニング
・キット（Invitrogen）のベクター中でクローン化し
た。得られたクローンの配列を決定した。個々のＤＮＡ
クローンに存在する、ＰＣＲ由来のエラーを訂正するた
め、各延長ＤＮＡフラグメントに対し少なくとも３個の
独立クローンで、その配列を決定した。

【０１６２】ＤＮＡ配列分析上記λgt10, λgt11クローン由来の挿入部を、配列決定
のためにpGEM-4Z ベクター（Promega ）中でサブクロー
ン化した。配列決定反応は、ジデオキシ法（Bankier &
Barrell, Techniques in the Life Sciences (Biochemi
stry) 85: Techniques in Nucleic Acids Biochem. 1-3
4; 1983)で行なった。配列決定用プライマーは、Applie
d Biosystems 380B 装置で、β−シアノエチルフォスフ
ォラマダイト化学を用いて合成した。

【０１６３】Ｂ．結果 Eam200リーディングフレーム（その一部）をコードする
クローンを、ラムダｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするのに用いたマウス・モノクロナール抗
体によって単離した。独立した2.10^５個のクローンのう
ち一つが陽性であった。Eam200に対する、各種マウス・
モノクローナル抗体の内、例えば、E.ACER 12B-2A, E.A
CER 12C-2B, E.ACER 12B-2B と、今後の分析用に選んだ
クローンとの反応は、このクローンに含まれるリーディ
ングフレームの同一性を立証する、十分な、決定的証拠
と思量された。ラムダ gt11/Eam200の溶原性株によって
コードされる融合タンパク質と、抗体 E.ACER 12B-2B
の反応を、第１０図に示す。Eam200の一部の配列を、配
列番号 1, 2 に示す。この表から分かるように、挿入部
の全長は、1491bpで、その内 1341bp がタンパク質をコ
ードする。

【０１６４】兎 5706 （実施例２参照）から得た、単一
特異的、抗−Eam45 血清を用い、このタンパク質をコー
ドするクローンの単離を行なった。スクリーニングした
5.104 個のプラークから、２個のクローンを単離した。
このクローンの挿入部、これを、Eam45 M1と、Eam45 M3
と呼ぶが、これらはそれぞれ、817bp, 786bpであった。
両挿入体は、E. coli で発現した。Eam45 M1は、約 13k
D のタンパク質としてコードされ、Eam45 M3は、24kDタ
ンパク質としてコードされる。両発現産物とも、ウェス
タン・ブロット上で、単一特異性兎抗−Eam45 血清（デ
ータここには載せず）と反応した。抗体選択実験におい
て、クローンＭ３から溶出した抗体は、メロゾイト由来
の Eam45タンパク質と反応した（第９図）。同種の実験
を、クローンＭ１と行なっても、反応は全く見られなか
った。

【０１６５】Eam45 M1, M3の延長クローンを、先に方法
で記載したＰＣＲによって調製した。Ｍ１については、
延長ＰＣＲフラグメントは、127bp,Ｍ３においては、84
5bpの付加が認められた。したがって、Ｍ１について得
られた全配列は944bp であり、Ｍ３の場合は1631bpであ
った。それぞれ、Eam45 M1E, Eam45 M3Eと呼ばれるこの
配列を、配列番号3 (MIE), 5(M3E) に示す。Ｍ１Ｅにお
ける第１ＡＴＧは、８２から８４位置にあり、Ｍ３Ｅで
は、５０５から５０７にあった。両ＡＴＧとも、イン・
フレーム上流停止コドンが先行しており、したがって、
真の開始コドンを表しているようであった。Eam45 M1E
及びM3E によってコードされる一次アミノ酸配列を、配
列番号4 (M1E) 及び 6 (M3E)に示す。兎 5796 （実施例
２参照）由来の、単一特異的、抗−Eam20 を用いて、こ
のタンパク質をコードするクローンを単離した。ラムダ
ｇｔ１１発現ライブラリーから単離したすべてのクロー
ンが、200bp よりも小さい挿入部を持っていた。したが
って、このクローンの内の一つの挿入部をプローブとし
て用い、ラムダｇｔ１０ライブラリーをスクリーニング
した。2.105 個のプラークのうち１個が陽性であった。
得られたものの内最長の挿入体は、579bp で、コード容
量は 11kD であった。これより、付加される221bp を含
むＰＣＲを用いて、延長クローンは生成された。Eam20
について得られた全配列は、したがって、800bp であ
る。このクローンを Eam20E と名付け、その配列を、配
列番号 7に示す。Eam20Eのリーディングフレームは、最
初のヌクレオチドから完全にオープンではあるけれど
も、第１ＡＴＧ（配列番号7 のポジション８０から８
２）が、開始コドンを表すのは確かである。Eam20Eのタ
ンパク質コード配列（配列番号8）は、したがって、ポ
ジション２７の Metから読みとるのが望ましい。

【０１６６】Eam100タンパク質をコードするクローンの
単離には、単一特異的血清（３２３）を用いた。これ
は、免疫アフィニティー精製されたEas100で免疫した鶏
から得たものである。Eas100を、固定モノクローナル抗
体E.ACER5F-2 を用いたアフィニティー・クロマトグラ
フィーで精製し、これを用いて、実施例２に記載した方
法により、鶏から抗体を得た。この抗体を用いて、E. a
cervulina メロゾイト mRNA 由来の、ラムダｇｔ１１ｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。スクリーニ
ングした、2.10^５個のクローンの内１個のクローンが陽
性であった。各種血清から、このクローンによって選択
した抗体は、ウェスタン・ブロット上で、メロゾイト、
スポロゾイトの両方に存在する100kDタンパク質と反応
することが判明した（図８）。これより、このクローン
のリーディングフレームは実際には、この 100kDタンパ
ク質（その一部）をコードするものであることが明らか
になった。このクローンの挿入部は、1259bp長であり、
34kDのコード容量を持っていた（データ記載せず）。こ
れより、延長クローンは、付加される1116bpを含むＰＣ
Ｒによって、生成された。したがって、Eam100について
得られた全配列は、2375bpとなる。これをEam100Eと名
づけ、配列番号9 に示す。これより推測されたアミノ酸
配列を、配列番号10に示す。

【０１６７】実施例４アフィニティー精製抗原による、鶏の免疫化Ａ．方法 6×10^１０個の、E. avervulina ７２時間、疎水性・親
水性メロゾイトを開始物質として、抗原を、ＴＸ１１４
抽出によって分離した（実施例２）。個々の抗原を、免
疫アフィニティー・クロマトグラフィーによって精製し
た。

【０１６８】

【表１】

【０１６９】タンパク質濃度は、両シンコニン酸法（Pi
erce Chemicals）を用い、メーカーの処方に従って、定
量した。

【０１７０】免疫化スケジュール精製抗原を、Quil A (Superfos Biosector A/S) と混合
し、各投与量が、0.5ml 全容量の中に、１００マイクロ
グラムの Quil A を含むようにした。２０羽の白色レグ
ホンから成るグループを、ふ化日から、プライム日まで
独立ケージで飼った。鶏に0.5ml Quil A/ 抗原を頚部の
皮下に１週間隔で３回注入して、免疫した。この抗原用
量を、上の表に示す。

【０１７１】チャレンジ３回目の接種から１０日後、鶏に個々に、２００−３０
０の新鮮な胞子形成性E. acervulina 接合子嚢を投与し
た。感染後、４日から７日に採取した大便標本から、放
出された接合子嚢を数えた。

【０１７２】免疫学的パラメータ抗体価血清を、免疫化ごとに、免疫化の前、チャレンジの前、
チャレンジ後７日目に採取した。血清につき、E. acerv
ulinaメロゾイト抗原にたいする抗体価を調べた。これ
には、ELISAテストを用いた。これに、0.1mlの50mM炭酸
／重炭酸バッファー pH 9.6に懸濁した１×１０^５のメ
ロゾイトを、微小検定プレートの１ウェルごとに、５０
℃で一晩加熱してコートした。プレートを洗浄し、牛血
清アルブミンでブロックし、各種血清希釈液と、３７℃
で、１時間インキュベートし、数回洗浄し、次に、ペル
オキシダーゼ標識兎抗−鶏 IgG(H+L)と、３７℃で、１
時間インキュベートした。適当に洗浄して後、尿素−Ｔ
ＭＢ基質を用いて、陽性結合を検出し、吸収を、450nm
で測定した。抗体価は、2log（末端希釈度）で表した。

【０１７３】リンパ球刺激チャレンジ前に、末梢血球を、各グループの１０羽の鶏
から採取した。末梢血白血球を、全血から、室温で、６
４ｇで、６分間遠心して、単離した。生皮状のコートを
除去し、残りの細胞、血漿を再混合し、再び撹拌した。
２工程を経て収集した白血球を、血球算定器でカウント
し、濃度が、RPMI 1640（オランダの基準）において、
１ｍｌ当り1×10^７個の細胞となるように調整した。

【０１７４】E. acervulinaメロゾイト（4×10^８）を、
6.7ml RPMI 1640に懸濁し、マイクロ・チップ装着 Bran
son超音波処理器で、超音波処理した。位置６で、中間
冷却を伴ない、3×20秒間であった。これを希釈して、
刺激に用いる濃度にふさわしいものとした。９６ウェ
ル、丸底組織培養用プレートに、0.05ml細胞懸濁液、0.
150ml 抗原懸濁液を接種し、5% CO_２雰囲気下におい
て、４１℃６４時間培養した。その後、１ウェルに付
き、0.5 イクロキューリーの^３H-サイミジンを加え、８
時間後、細胞を、グラスファイバー・フィルター（Phar
macia/LKB）に収集した。この時、９６ウェル細胞収集
器（Skatron Norway）を用いた。フィルターを、シンチ
レーション液で飽和させ（LKB BetaScint）で、Betapla
te 1205(Pharmacia/LKB Sweden）でカウントした。

【０１７５】Ｂ．結果免疫学的パラメータ抗体価第２表は、A. acervulina メロゾイト抗原に対して、Ｅ
ＬＩＳＡで調べた、各種グループのチャレンジ前の平均
抗体価を示す。抗原はすべて、高い抗体価を誘発し、そ
れは、コントロールよりも、最小で係数３０の差があっ
た。

【０１７６】

【表２】

【０１７７】リンパ球刺激全グループのＰＢＬを、３つの異なる濃度の、E. acerv
ulina メロゾイト抗原、すなわち、１ウェル当り、それ
ぞれ、5x105 , 1×10^６, 3×10^６個の、超音波処理メロ
ゾイトで刺激した。各グループについて、至適濃度を決
定した。

【０１７８】第３表は、平均Ｄｃｐｍ（抗原刺激ウェル
ｃｐｍ、マイナス、非刺激コントロールのｃｐｍ）を示
す。すべての抗原が、チャレンジ時に、末梢血に、検出
可能な程度の、陽性Ｔ細胞を誘発するようである。一般
に、１０羽の内６あるいは７羽が反応したのにたいし、
コントロールでは０であった。

【０１７９】

【表３】

【０１８０】接合子嚢生産第４表は、各グループごとに、放出接合子嚢の平均数
を、コントロールに対するパーセントで表したものであ
る。コントロールは、Quil Aアジュヴァントのみを投与
された。Eam200, Eam100, Eam45, Eam20は、接合子嚢放
出を低下した。

【０１８１】

【表４】

【０１８２】

【配列表】

【０１８３】

【化１】

【図面の簡単な説明】

【図１】各種 Eimeria種、および、段階にたいするMabs
E.ACER 11A-2A（パネルＡ）、E.ACER 12B-2B （パネル
Ｂ）の認識を示す電気泳動の写真。レーン１−−E. acervulina メロゾイト、非還元ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（ＮＲ）レーン２−−E. acervulina メロゾイト、還元レーン３−−E. acervulina スポロゾイト、ＮＲレーン４−−E. tenella, 第２世代メロゾイト、ＮＲレーン５−−E. tenellaスポロゾイト、ＮＲ矢印は、分子量マーカーの位置を示す。ベータ・ガラク
トシダーゼ（MW=116kD）、下方矢印。ミオシン（MW=200
kD）、上方矢印（レーン３には示していない）。

【図２】各種 Eimeria種、および、段階にたいする Mab
s E.ACER 10C-2A （パネルＡ）、E.ACER 10E-2（パネル
Ｂ）の認識を示す電気泳動の写真。レーン１−−E. acervulina メロゾイト、非還元ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（ＮＲ）レーン２−−E. acervulina メロゾイト、還元レーン３−−E. acervulina スポロゾイト、ＮＲレーン４−−E. tenella, 第２世代メロゾイト、ＮＲレーン５−−E. tenellaスポロゾイト、ＮＲ矢印は、認識陽性のバンドの位置を示す。

【図３】E. acervulina メロゾイトのＴＸ１１４抽出物
の各種分画のウェスタン・ブロット（非還元ＰＡＧＥ）
を示す電気泳動の写真。ブロットは、 Eam200（”２０
０”で表す）、Eam100（“100”）, Eam45（“50”）,
Eam20（“20”）を認識するMab の結合体でプローブし
た。レーン１−−非溶解性試料（濃縮）レーン２−−溶解全試料レーン３−−親水性分画（水相）レーン４−−蔗糖分画（接触相）レーン５−−疎水分画（洗剤相）

【図４】E.ACER 10C-2A を用いたときの、免疫アフィニ
ティー精製による各種フラクションのウェスタン・ブロ
ット（非還元ＰＡＧＥ）を示す電気泳動の写真。ブロッ
トは、K8275 ポリクロナール兎血清によってプローブし
た。レーン２−−分子量マーカーレーン３−−TX114 疎水性分画レーン４−１０−−結合後、洗浄工程から得た分画レーン１１−１４−−酸性溶出分画（ｐＨ２．６）レーン１５−１８−−3M KSCN 溶出レーン１９−−非結合分画

【図５】E.ACER 10E-2を用いたときの、免疫アフィニテ
ィー精製による各種フラクションのウェスタン・ブロッ
ト（非還元ＰＡＧＥ）を示す電気泳動の写真。ブロット
は、K8275 ポリクロナール兎血清によってプローブし
た。レーン２−−分子量マーカーレーン３−−TX114 疎水性分画、ただし、E.ACER 10C-2
A カラム通過後。レーン４−−非結合分画レーン５−９−−結合後、洗浄工程から得た分画レーン１０−１２−−酸性溶出分画（ｐＨ２．６）レーン１４−１８−−3M KSCN 溶出

【図６】E.ACER 5F-2 を用いたときの、免疫アフィニテ
ィー精製による各種フラクションのウェスタン・ブロッ
ト（非還元ＰＡＧＥ）を示す電気泳動の写真。ブロット
は、E. acervulina スポロゾイト（K802）にたいして向
けたポリクロナール兎血清によってプローブした。レーン１−−スポロゾイトの TX114親水性分画レーン２−−非結合分画レーン３−５−−酸性溶出分画（ｐＨ２．６）レーン６−７−−3M KSCN 溶出矢印は、Eas100の２重バンドを示す。

【図７】E.ACER 11A-2A を用いたときの、免疫アフィニ
ティー精製による各種フラクションのウェスタン・ブロ
ット（非還元ＰＡＧＥ）を示す電気泳動の写真。ブロッ
トは、Eam200, Eam100, Eam45, Eam20にたいして反応性
を持つ、一組のモノクローナル抗体によってプローブし
た。レーン１−−分子量マーカーレーン２−−TX114 親水性分画レーン３−−非結合分画レーン４−−酸性溶出分画（ｐＨ２．６） Eam200バンドの直上に、レーン３と４では、薄いＩｇＧ
バンドが見える。これは、Ｍａｂがカラムからリークし
たことによる。

【図８】E. acervulina タンパク質（非還元ＰＡＧＥ）
のウェスタン・ブロットにおける、Eam100選択抗体クロ
ーンの反応を示す電気泳動の写真。E. acervulina のス
ポロゾイトタンパク質を含むストリップ５を除き、その
他のストリップはすべて、メロゾイトタンパク質を含
む。ストリップは、下記のものと反応した。１．E. acervulina メロゾイト由来の全タンパク質にた
いする抗血清（兎 K8275から得たもの）。２．免疫アフィニティー精製 Eam100 にたいする単一特
異性抗血清（鶏３２３）。３．鶏３２３抗血清から得た、ラムダ gt11/Eam100クロ
ーンによって選択された抗体。４．兎 K8275抗血清から得た、ラムダ gt11/Eam100クロ
ーンによって選択された抗体。５．兎 K802 抗血清から得た、ラムダ gt11/Eam100クロ
ーンによって選択された抗体。６．５番と同じ。７．鶏３２３抗血清から得た、野生型ラムダ gt11 によ
って選択された抗体。８．兎 K802 抗血清から得た、野生型ラムダ gt11 によ
って選択された抗体。９．全スポロゾイトタンパク質にたいする抗体（兎 K80
2 から得たもの）。１０．モノクローナル抗体 E.ACER 5F-2

【図９】E. acervulina タンパク質（非還元ＰＡＧＥ）
のウェスタン・ブロットにおける、Eam45 (M3)選択抗体
クローンの反応を示す電気泳動の写真。ストリップはす
べて、メロゾイトタンパク質を含む。ストリップは、下
記のものと反応した。１．兎 K5706抗血清から得た、ラムダ gt11/Eam45 (M3)
クローンによって選択された抗体。２．兎 K5794抗血清から得た、ラムダ gt11/Eam45 (M3)
クローンによって選択された抗体。３．兎 K5796抗血清から得た、ラムダ gt11/Eam45 (M3)
クローンによって選択された抗体。４．兎 K8275抗血清から得た、ラムダ gt11/Eam45 (M3)
クローンによって選択された抗体。５．免疫アフィニティー精製 Eam45にたいする単一特異
的抗血清（兎 K5706から得たもの）。６．メロゾイトからのＴＸ１１４疎水性抽出物にたいす
る抗血清（兎 K5794）。７．免疫アフィニティー精製 Eam45にたいする単一特異
的抗血清（兎 K5792から得たもの）。８．兎 K5706抗血清から得た、野生型ラムダ gt11 によ
って選択された抗体。９．兎 K5794抗血清から得た、野生型ラムダ gt11 によ
って選択された抗体。１０．兎 K5796抗血清から得た、野生型ラムダ gt11 に
よって選択された抗体。１１．兎 K8275抗血清から得た、野生型ラムダ gt11 に
よって選択された抗体。１２．モノクローナル抗体 E.ACER 10C-2A

【図１０】ラムダ gt/Eam200発現産物のウェスタン・ブ
ロット分析を示す電気泳動の写真。ラムダ gt/Eam200の
溶原性株から得た発現産物を、（還元して）、SDS-PAGE
ゲル上を走らせ、ブロットし、モノクローナル抗体 E.A
CER 12B-2B（レーン２）でプローブした。コントロール
として、ラムダ gt11 発現産物をレーン１に走らせた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (72)発明者ヤコブス・ヨハヌス・コツクオランダ国、6546・デー・ハー・ニエイメヘン、メーウセアツケル・11−28 (72)発明者アーノルドウス・ニコラース・ウエルメウレンオランダ国、5431・ハー・ハー・クウエイク、コールホーエンデルウエルド・34 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA42 BA61 CA04 CA11 CA12 DA06 EA03 GA11 HA04 4B064 AG26 AG27 AG31 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 CE12 DA01 4B065 AA26X AA86Y AB01 BA01 CA24 CA45 4C085 AA03 BA05 CC13 DD21 DD33 DD62 EE01 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA20 DA75 DA76 DA86 EA20 FA74 GA01 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 Eimeria抗原の1以上の免疫原決定基を有
するタンパク質であって、Eimeria抗原が、ａ）SDS-PAGEにおいて約200 ｋDの分子量をもち、ヨー
ロピアンコレクション・オブ・アニマルセルカルチャー
（ECACC）に寄託番号91061222で寄託されているモノク
ローナル抗体E.ACER 11A-2Aに結合する抗原、ｂ）SDS-PAGEにおいて約100 ｋDの分子量をもち、ヨー
ロピアンコレクション・オブ・アニマルセルカルチャー
（ECACC）に寄託番号91061219で寄託されているモノク
ローナル抗体E.ACER 5F-2に結合する抗原、およびｃ）SDS-PAGEにおいて約20 ｋDの分子量をもち、ヨーロ
ピアンコレクション・オブ・アニマルセルカルチャー（EC
ACC）に寄託番号91061221で寄託されているモノクロー
ナル抗体E.ACER 10E-2に結合する抗原、よりなる群から
選択されることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２】配列番号２で示されるアミノ酸配列若し
くはその機能的変種の少なくとも一部を含むことを特徴
とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】配列番号４で示されるアミノ酸配列若し
くはその機能的変種の少なくとも一部を含むことを特徴
とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】配列番号８で示されるアミノ酸配列若し
くはその機能的変種の少なくとも一部を含むことを特徴
とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】配列番号１０で示されるアミノ酸配列若
しくはその機能的変種の少なくとも一部を含むことを特
徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】請求項１〜５に記載のタンパク質をコー
ドする核酸配列。
【請求項７】配列番号１で示されるDNA配列の少なく
とも一部を含むことを特徴とする請求項６に記載の核酸
配列。
【請求項８】配列番号３で示されるDNA配列の少なく
とも一部を含むことを特徴とする請求項６に記載の核酸
配列。
【請求項９】配列番号７で示されるDNA配列の少なく
とも一部を含むことを特徴とする請求項６に記載の核酸
配列。
【請求項１０】配列番号９で示されるDNA配列の少な
くとも一部を含むことを特徴とする請求項６に記載の核
酸配列。
【請求項１１】請求項６〜１０に記載の核酸配列を含
む組換えベクター分子。
【請求項１２】上記核酸配列が操作可能的に発現調節
配列に結合していることを特徴とする請求項１１に記載
の組換えベクター分子。
【請求項１３】請求項６〜１０に記載の異種核酸配列
を担持する組換えベクターウイルス。
【請求項１４】請求項６〜１０に記載の核酸配列また
は請求項１１若しくは１２に記載の組換えベクター分子
で形質転換された、あるいは、請求項１３に記載の組換
えベクターウイルスに感染した宿主細胞。
【請求項１５】請求項１４に記載の宿主細胞を培養す
ることを含む、請求項１〜５に記載のタンパク質を発現
する方法。
【請求項１６】請求項１〜５に記載のタンパク質に対
して免疫反応性である抗体または抗血清。
【請求項１７】コクシジオーシスに対して鳥類を防御
するためのワクチンであって、請求項１３に記載の組換
えベクターウイルス、請求項１４に記載の宿主細胞、請
求項１〜５に記載のタンパク質または請求項１５に記載
の方法によって調製されたタンパク質を、医薬的に許容
される担体とともに含むことを特徴とする前記ワクチ
ン。
【請求項１８】コクシジオーシスワクチンの調製方法
であって、請求項１４に記載の感染宿主細胞を培養し、
組換えベクターウイルスを回収し、該ウイルスを免疫活
性を有する医薬製剤に調剤する工程を含むことを特徴と
する前記方法。
【請求項１９】コクシジオーシスワクチンの調製方法
であって、請求項１〜５に記載のタンパク質または請求
項１５に記載の方法によって調製されたタンパク質を、
免疫活性を有する医薬製剤に調剤する工程を含む前記方
法。
【請求項２０】コクシジオーシスに対して鳥類を防御
する方法であって、請求項１７に記載のワクチンをトリ
に投与する工程を含む前記方法。