HU213419B

HU213419B - Method for preparation of vaccine against poultry coccidiosis

Info

Publication number: HU213419B
Application number: HU9202024A
Authority: HU
Inventors: Paul Boogaart; Jacobus Johannes Kok; Arnoldus Nicolaas Vermeulen
Original assignee: Akzo Nv
Priority date: 1991-06-18
Filing date: 1992-06-17
Publication date: 1997-06-30
Also published as: ATE165867T1; ZA924203B; EP0838522A3; AU1832492A; EP0838522A2; EP0519547A2; DE69225357T2; NZ243167A; ES2117029T3; US5789233A; US5792644A; DK0519547T3; CA2071395A1; US5925347A; US5780289A; HUT65598A; AU653236B2; EP0519547B1; EP0519547A3; DE69225357D1

Description

A találmány tárgya eljárás egy Eimeria antigén egy vagy több immunogén determinánsát tartalmazó polipeptid, a fenti polipeptidet kódoló nukleinsav-szekvencia, a fenti nukleinsav-szekvenciát tartalmazó rekombináns vektor molekula vagy rekombináns vektor vírus, egy fenti rekombináns vektor molekulával transzformált vagy rekombináns vektor vírussal fertőzött gazdasejt, a fenti proteinnel immunreaktív antitestek, valamint szárnyasokat coccidiosis ellen védő vakcina előállítására.

A coccidiosist intracelluláris paraziták, az Apícomplexa alfajhoz és az Eimeria nemzetséghez tartozó protozoonok okozzák. Ezek a paraziták a gyomor-bél-rendszer és az emésztőszervek részét képező sejtekben szaporodnak.

Ebben az évtizedben az intenzív állattartás elteqedése miatt a fenti paraziták által a baromfiiparban okozott károk riasztóan emelkednek. így például a baromfitenyésztők kára csak Hollandiában minden évben több millió gulden, a veszteség 1986-ban mintegy 13 millió gulden volt, ugyanebben az évben az Amerikai Egyesült Államokban a kár 300 millió dollár volt, a coccidiosztatikumok alkalmazása ellenére.

A csirkékben coccidiosist okozó patogének 9 különböző fajtába oszthatók, úgymint: Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, E. mivati és E. hagani. Néhányan kétségbe vonják az utóbbi két fajta létezését. A fenti összes fajtának csak a csirke a gazdaállata, és nagyfokú szövet-specificitást mutatnak. A fenti fajták életciklusai azonban hasonlóak.

A fenti fajták csirkékre kifejtett patogén hatása azonban eltérő, és a csirke fajtája szintén számít; így a broiler csirkékben a parazita, például az E. acervulina vagy az E. maxima óriási károkat okoz, mivel ezek a paraziták főleg a vékonybélet fertőzik, ahol a táplálék emésztése végbemegy.

Életciklusuk során az Eimeria paraziták különféle stádiumokon mennek át. A fertőző stádium (a spórázó oociszta) orálisan jut be a szervezetbe és a csirke gyomrába kerül, ahol a ciszta fala az őrlőhatás következtében szétnyílik. A négy sporociszta - amelyet ez az oociszta tartalmaz - szabaddá válik és a duodenumba kerül, ahol az epe és az emésztő enzimek hatnak rájuk. Ennek eredményeként a sporociszta falán egy nyílás keletkezik, és a sporocisztában lévő sporozoitok szabaddá válnak. Ezek a sporozoitok mozgásképesek és megfelelő gazdasejteket, hámsejteket keresnek, hogy abba behatolhassanak és szaporodjanak. A fajtától függően ez az első szaporodási fázis 20-48 órán keresztül tart és néhányszor tíz - több száz merozoit képződik, amelyek ismét új gazdasejtekbe hatolnak be és ott szaporodnak. 2 - néha 5 ilyen aszexuális szaporodási ciklus után a fajtától függően az intracelluláris merozoitok szexuális formákká, azaz hím és nőstény gametocitákká fejlődnek. Miután a nőstényt egy hím gaméta megtermékenyítette, kialakul egy zigóta, amely egy cisztafalat alakít ki maga körül. Ez az oociszta elhagyja a gazdasejtet és az ürülékkel távozik a gazdaszervezetből. Ha a hőmérséklet és a nedvesség a csirkén kívül viszonylag magas, és ugyanakkor megfelelő mennyiségű oxigén van a levegőben, az oociszta képes spórásodni és így újra fertőzőképes stádiumba jut.

így nem szükséges köztes gazda a parazita csirkéről csirkére való átjutásához. Ezért elképzelhető, hogy a rendelkezésre álló terület nagyfokú kihasználásával a fertőzés lehetősége egy csirkefarmon gyorsan növekszik.

A parazita ellen különféle módokon lehet harcolni.

A megfelelő állattartás mellett a coccidiosis coccidiosztatikus szerek alkalmazásával gátolható meg, amelyeket gyakran a táplálékba vagy az ivóvízbe kevernek. Azonban ezen szerek hatékonysága az utóbbi években csökkent, részben azért, mert a parazita jó genetikai adottságokkal rendelkezik a gátlószerekkel szembeni rezisztencia kifejlesztéséhez. Ezenkívül ezen szerek többsége a húsból nem ürül ki teljesen, ami fogyasztási problémákat okoz.

Az immunológiai megelőzés ezért sokkal jobb parazitaellenes módszert jelenthet. Ismeretes, hogy a megfelelően nagy mértékű fertőzést túlélt csirkék ellenállóak lesznek egy ugyanezen típusú Eimeria fertőzéssel szemben. Eimeria elleni rezisztencia úgy is indukálható, hogy a szárnyasokat többször fertőzik kis dózisú oocisztával vagy gyengített (nem patogén) törzsek oocisztáival. Ebben az esetben azonban az adagolás szabályozása - különösen nagy számú broiler csirke esetén - tulajdonképpen megoldhatatlan problémát jelent.

Az US 4724145 számú szabadalmi leírásból ismert, hogy Eimeria sporozoit proteinek elegye védő immunválaszt indukál. Eimeria antigénekből származó polipeptideket és ezeket kódoló DNS-szekvenciákat ismertetnek például az EP-A 0390267 számú közrebocsátási iratban és a HU 207453 és HU 212506 számú szabadalmi leírásokban. Az EP-A 0328253 számú közrebocsátási iratban E. acervulina 140 kD móltömegű Μ16 proteinj ét, p58/p70 proteineket és ezek elleni McAb 12—07 antitestet ismertetnek. A HU 203781 számú szabadalmi leírásban Eimeria felületi antigéneket írnak le.

A találmány értelmében viszont az Eimeria antigén egy vagy több immunogén determinánsát tartalmazó, a teljes parazitától vagy egyéb, szokásosan kapcsolódó proteinektől lényegében mentes, meghatározott aminosav-szekvenciákat tartalmazó tisztított proteineket állítunk elő, amelyeket szárnyasok, különösen baromfiak coccidiosis elleni immunizálására alkalmas vakcina előállítására alkalmazhatunk.

Nukleinsavszekvencia alatt a leírásban tetszőleges hosszúságú polimer nukleotidokat értünk, amelyek ribonukleinsav-szekvenciák és dezoxiribonuklein-savszekvenciák egyaránt lehetnek. Elvileg ez az elnevezés a molekula primer szerkezetére utal. így a fenti kifejezés magában foglalja a kettős szálú és egyes szálú DNS-t, a kettős szálú és egyes szálú RNS-t, valamint ezek módosított változatait is.

Apróiéin elnevezés biológiai aktivitással rendelkező, aminosavakból álló molekulaláncot jelent, tekintet nélkül a termék specifikus lánchosszúságára - azaz pepiidet, oligopeptideket és polipeptidet egyaránt jelent -, amely kívánt esetben in vívó vagy in vitro módosítható, például glikozilezéssel, amidálással, karboxilezéssel vagy foszforilezéssel.

Az Eimeria antigén egy vagy több determinánsát tartalmazó polipeptid olyan polipeptidet jelent, amely egy gazdaállatban Eimeria paraziták elleni immunválasz kiváltására képes egy vagy több epitópot tartalmaz.

Móltömeg alatt látszólagos becsült méretet értünk, az adott példában ismertetett körülmények között. A valódi móltömeg csak a protein teljes hosszának szekvenálásával határozható meg. Egyes proteinek esetében az SDS-PAGE módszerrel becsült látszólagos móltömeg hibás lehet a protein hidrofobicitása, vagy oligoszacharidok, lipidek (acilláncok) vagy egyéb zavaró szubsztituensek jelenléte miatt. Még az alkalmazott akril-amid-gél százalékos értéke is befolyásolhatja a gélben a mozgékonyságot a vízben oldható marker proteinekhez viszonyítva [lásd például Frank R. N. és Rodbard D., Arch. Biochem. Biophys. 171,1-13 (1975)]. Eltekintve a fenti korlátozásoktól, a leírásban ismertetett SDS-PAGE (Western biot) futtatások többségét nem redukáló körülmények között (vagyis β-merkapto-etanol vagy ditiotreit hozzáadása nélkül) végeztük, a Mab-ek általi jobb felismerés céljából.

Közelebbről a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek az Eimeria antigén egy vagy több immunogén determinánsát tartalmazzák, amely Eimeria antigén móltömege SDS-PAGE szerint mintegy 200, 100, 50 vagy 20 kD, és az Eimeria antigén specifikusan kötődik az E.ACER 11A-2A vagy E.ACER 12B-2B, E.ACER 5F-2, E. ACER 10C-2A, illetve E.ACER 10 E-2 monoklonális antitestekkel. A fenti monoklonális antitesteket termelő hibridoma sejtvonalakat a European Collection of Animál Cell Cultures-nél (ECACC) helyeztük letétbe (Porton Down, Nagy-Britannia), 91061223 (E.ACER 12B-2B), 91061222 (E.ACER 11A-2A), 91061219 (E.ACER 5F-2), 91061220 (E.ACER 10C-2A) és 91061221 (E.ACER 10E-2) letéti számok alatt, 1991. 06. 12-én.

A fenti Eimeria antigéneket izolálási eljárásukkal lehet jellemezni, azaz az antigéneket úgy állíthatjuk elő, hogy

1) Eimeria acervulina parazitákat 2%-os Triton XI14 oldattal extrahálunk,

A) az 1) lépésben a fázisok szétválasztása után kapott hidrofób frakciót

1) Sepharose CL—4B-hez kötött E.ACER 10C-2A-val immunaffinitási kromatográfíának vagy

2) Sepharose CL-4B-hez kötött E. ACER 10 E-2vel immunaffinitási kromatográfiának vetjük alá, vagy

2B) az 1) lépésben a fázisok szétválasztása után kapott hidrofil frakciót

Sepharose CL-4B-hez kötött E.ACER 11A-2Aval immunaffinitási kromatográfiának vetjük alá, vagy

2C) az 1) lépésben a fázisok szétválasztása után kapott hidrofil frakciót

Sepharose CL-4B-hez kötött E.ACER 5F-2-vel immunaffinitási kromatográfiának vetjük alá,

3) 1) a tisztított 50, 100 vagy 200 kD Eimeria proteint 0,1 mol/1 koncentrációjú glicin/HCl + 0,1% NP40-val (pH 2,6) eluáljuk, vagy

2) a tisztított 20 kD Eimeria proteint 3 mol/1 KSCN-t tartalmazó 25 mmol/1 koncentrációjú Tris/HCl + 0,5 mol/1 Na Cl + 0,1% NP4Pval (pH 8,0) eluáljuk. A találmány szerinti előnyös proteinek az Eam200, EamlOO vagy EaslOO, Eam45 vagy Eam20 Eimeria acervulina antigének egy vagy több immunogén determinánsát tartalmazzák (2. példa).

Az Eam200 Eimeria acervulina merozoitokból tisztított, mintegy 200 kD móltömegű Eimeria protein, és az E.ACER 11A-2A monoklonális antitesttel (Mab) ad immunreakciót.

Az EaslOO Eimeria acervulina sporozoitokból tisztított, mintegy 100 kD móltömegű Eimeria protein, és a Mab E.ACER 5F-2-vel ad immunreakciót, az EamlOO az Eas 100 merozoit ekvivalense.

Az Eam45 Eimeria acervulina merozoitokból tisztított, mintegy 50 kD móltömegű Eimeria protein, és a Mab E.ACER 10C-2A-val ad immunreakciót.

Az Eam20 Eimeria acervulina merozoitokból tisztított, mintegy 20 kD móltömegü Eimeria protein, és a Mab E.ACER 10 Ε-2-vel ad immunreakciót.

Az E.ACER 11A-2A és E.ACER 12B-2B monoklonális antitestek elsődlegesen az Eam200 antigén ellen irányulnak. Amint az 1. ábra mutatja, az E.ACER 12B-2B ezt a proteint mind redukált, mind nem-redukált formában felismeri (B rész, 1. és 2. sáv). Az E.ACER 11A-2A csak a nem-redukált formát ismeri fel (A rész, 1. és 2. sáv).

Mind a két Mab felismer azonban egy 100 és 200 kD közötti móltömegü polipeptid-sorozatot az E. acervulina sporozoitokban, és egy világos pozitív sávot (móltömeg ± 130 kD) az E. tenella sporozoitokban (3. és 5. sáv).

Fluoreszcencia alkalmazásával a sporozoitokkal adott keresztreakció a sporozoitok elülső végére korlátozódik, ahol az invázióban szerepet játszó organellumok lokalizálódnak.

Az E. tenella második generációs merozoitok láthatólag nem kötődnek ezekhez a Mab-hez, valószínűleg azért, mert ebben a stádiumban még nem tartalmaznak elegendő proteint.

Az Eam45 elleni E.ACER 1 OC—2A monoklonális antitest csak egy hasonló móltömegü proteint ismer fel az E. acervulina sporozoitokban és nem mutat reakciót E. tenella ellen (2. ábra, A rész).

Az Eam20 elleni E.ACER 10E-2 is csak egy halvány sávot (móltömeg ± 20 kD) ismer fel a homológ fajták sporozoitjaiban, bár az E.acervulinán és E. tenellán kívül más fajtát nem vizsgáltunk (2. ábra B rész).

Az E.ACER 5F-2 monoklonális antitest E. acervulina sporozoitok ellen termelődik, de a homológ fajta merozoitj aiban is felismer egy ± 100 kD móltömegü proteint. Egyéb fajták elleni reaktivitását nem vizsgáltuk.

Közelebbről, a találmány szerinti eljárással előállított példaszerűen bemutatott proteinek a fent ismertetett tisztított Eimeria antigének egy vagy több immunogén determinánsát tartalmazzák. Ezek a 2., 6., 8. vagy 10. azonosítási számú aminosav-szekvenciát tartalmazó proteinek, és ezek funkcionális ekvivalensei.

Ezeken kívül, találmány szerinti eljárással előállított protein a 4. azonosítási számú aminosav-szekvenciával rendelkező Eimeria protein is, valamint ennek funkcionális ekvivalensei. Ezt a proteint egy Eimeria merozoit cDNS könyvtár anti-Eam45 szérummal való szűrésével azonosítottuk.

Ez a szérum pozitív reakciót ad egy kb. 100 kD móltömegü proteinnel (a kb. 50 kD móltömegű proteinnel adott pozitív reakción kívül), ha ezt a szérumot próbaként merozoit blottal reagáltatjuk (9. ábra).

A leírásban ismertetett proteinek funkcionális ekvivalensei alatt a fenti aminosav-szekvenciákból egy vagy több aminosav deléciójával, inszerciójával és/vagy szubsztitúciójával kapott proteineket értünk, amelyek azonban megtartják az Eimeria antigének egy vagy több immunogén determinánsát, azaz a fenti ekvivalensek rendelkeznek a gazdaállatban immunválasz kiváltására képes egy vagy több epitóppal.

Természetesen a találmány szerinti eljárással előállított proteineknek lehetnek természetes ekvivalensei is az egyes Eimeria paraziták vagy törzsek között. Ezek az ekvivalensek egy vagy több aminosav-eltérést mutatnak a teljes szekvenciában, vagy egy vagy több aminosav-deléciót, -szubsztitúciót, -inszerciót, -inverziót vagy addíciót tartalmaznak a szekvenciában. Azok az aminosav-szubsztitúciók, amelyek várhatóan nem okoznak alapvető változást a biológiai és immunológiai aktivitásokban, már ismertek. Hasonló aminosavak közötti csere, vagy az evolúció során gyakran előforduló helyettesítés például a Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val [lásd Dayhof M. D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Rés. Found., Washington D. C., (1978) 5. kötet, 3. kiegészítés)]. Ezen információ alapján Lipman és Pearson kidolgoztak egy módszert a proteinek gyors és érzékeny összehasonlítására [Science 227,1435-1441 (1985)] és a homológ proteinek közötti funkcionális hasonlóság meghatározására.

A találmány tárgykörébe tartoznak a specifikusan ismertetett proteinek immunogén fragmensei vagy ezek funkcionális ekvivalensei is.

A leírásban fragmens alatt a találmány szerinti nukleinsav-szekvencia vagy protein egy szakaszát magában foglaló DNS-t vagy aminosav-szekvenciát értünk. A fenti fragmens egy Eimeria antigén egy vagy több immunogén determinánsát tartalmazó polipeptid, vagy ezt a polipeptidet kódolja. Az alkalmazható immunogén polipeptid-fragmensek meghatározására szolgáló módszereket alább ismertetjük. A fragmenseket többek között a prekurzor molekulák enzimatikus hasításával állíthatjuk elő, a DNS-ek esetében restrikciós endonukleázok, a polipeptidek esetében proteázok alkalmazásával. Egyéb módszerként említhetjük a fragmensek kémiai szintézisét, vagy a polipeptid-fragmensek expresszióját DNS-fragmensekkel.

A találmány szerinti eljárással előállított protein megfelelő immunogén fragmenseit, amelyek egy vagy több epitópot tartalmaznak, a WO 86/06487 számon publikált nemzetközi szabadalmi leírásban ismertetett eljárással, vagy Geysen Η. M. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. 81,3998-4002 (1984); valamint J. Immunoi. Meth. 102, 259-274 (1987)] módszere szerint állíthatjuk elő, az úgynevezett pepscan módszerrel, amelynek értelmében szintetizáljuk az adott teljes polipeptid részleges szekvenciáinak megfelelő, egymással részleges átfedésben lévő peptidek sorozatát, és megvizsgáljuk ezek antitestekkel szembeni reaktivitását.

Ezen kívül, a meghatározott szekvenciájú polipeptid számos régiója lehet célzott epitóp elméleti megfontolások és ismert epitópokkal való szerkezeti egyezés alapján. A fenti régiók meghatározása a hidrofílicitási kritériumok [Hopp és Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824-3828 (1981)] és a szekunder szerkezetre vonatkozó megfontolások [Chou és Fasman, Advances in Enzymology, 47, 45-148 (1987)] kombinációján alapul.

Az adott esetben szükséges T-sejt epitópok hasonlóképpen elméleti alapokon származtathatók, például a Berzofsky-féle amfifdicitási kritérium segítségével [Science 235, 1059-1062 (1987)].

A találmány a fenti Eimeria proteineket kódoló, izolált és tisztított nukleinsav-szekvenciák előállítására is vonatkozik.

A technika állásából jól ismert, hogy a genetikus kodonok degenerációja megenged olyan báziscseréket egy kodonban, amelyek eredményeként egy másik kodont kapunk, amely azonban ugyanazt az aminosavat kódolja, például mind a GAT, mind a GAA ugyanazt az aminosavat, a glutaminsavat kódolja. Ennek következtében magától értetődő, hogy a 2., 4., 6., 8. vagy 10. azonosítási számú aminosav-szekvenciával rendelkező protein expressziójára egy ilyen alternatív kodonokat tartalmazó nukleinsav-származékot is alkalmazhatunk, amelynek szekvenciája eltér az 1., 3., 5., 7. vagy 9. azonosítási számú nukleinsav-szekvenciától.

Ezért a találmány különösen olyan nukleinsav-szekvenciák és ezek funkcionális származékai előállítására vonatkozik, amelyek a 2., 4., 6., 8. vagy 10. azonosítási számú aminosav-szekvenciát tartalmazó proteinek legalább egy szakaszát kódolják.

Az 1., 3., 5., 7. és 9. azonosítási számú szekvenciák ismeretében egy szakember képes azon nukleinsav-szekvenciákat izolálni és azonosítani, amelyek a leírásban specifikusan ismertetett Eimeria proteineknek megfelelő immunológiai tulajdonságú, különféle fent említett funkcionális variáns proteineket kódolnak. A fenti célra az általánosan használt Southern biot technika vagy telep-hibridizáció alkalmazható [Experiments in Molecular Biology, szerkesztő: R. J. Slater, Cliffon, USA (1986); Singer-Sam J. és munkatársai, Proc. Natl Acad. Sci. 80, 802-806 (1983); és Maniatis T. és munkatársai, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, (1989)]. így például egy specifikus Eimeria törzsből származó cDNS könyvtárat egy darab nitro-cellulóz szűrőre viszünk („blottolunk”). Ezután már lehetséges a specifikus Eimeria nukleinsav-szekvenciák azonosítása egy meghatározott, jelzett DNS-fragmenssel, úgynevezett „próbával” - azaz egy, az 1., 3., 5., 7. vagy 9. azonosítási számú nukleinsav-szekvenciából származó (szintetikus) poli- vagy oligonukleotidszekvenciával, amely meghatározott sókoncentráció és hőmérséklet mellett hibridizál a szűrőn lévő nukleinsav-szekvenciával - végzett hibridizálás segítségével. A szűrő mosása után a hibridizált anyagot autoradiográfiásan detektálhatjuk. A megfelelő DNS ffagmenst ezután az agaróz gélről eluálhatjuk és felhasználhatjuk a 2., 4., 6., 8. vagy 10. azonosítási számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptid funkcionális variánsa szintézisének irányítására.

Eimeriából származó cDNS könyvtárat pontosan a 3. példában ismertetett eljárással állíthatunk elő. A pGEM4Z Eam200, pGEM4Z Eam45 M1(E), pGEM4Z Eam45 M3(E), pGEM4Z Eam20(E) vagy pGEM4Z Eaml 100E kiónokból származó inszerteket digoxigenin-d UTP-vel jelezhetjük, véletlenszerű indítással, pontosan a „DNA labelling and detection kit, non-radioactive” használati útmutatója szerint (Boehringer, Mannheim, katalógusszám 1093657).

A fenti Eimeria cDNS könyvtárból származó, immobilizált DNS-t tartalmazó szűrőket Maniatis és munkatársai fent idézett módszere szerint állíthatjuk elő, és 95 °C-on 10 percen keresztül frissen denaturált, jelzett Eimeria fragmenssel mint próbával 16 órán keresztül 42 °C-on hibridizáljuk, a gyártó útmutatásának megfelelően. A szűrőket ezután az alábbiak szerint mossuk: kétszer 15 percen keresztül 0,1 vegyes% SDS-t tartalmazó 2xSSC-vel (lxSSC: 0,15 mol/1 nátrium-citrát, pH 7,0+0,15 mol/1 Na Cl) szobahőmérsékleten, majd kétszer 15 percen keresztül 0,1 vegyes% SDS-t tartalmazó 1 x SSC-vel 55 °C-on. A végső azonosításra a szűrőket ezután kétszer mossuk PBS-Tween-oldattal (7,65 g/1 NaCl, 0,91 g/1 Na₂ HPO₄-2H₂O, 0,21 g/1 KH₂PO₄, 0,05 térfogat% Tween 80, pH 7,3), 15 percen keresztül, szobahőmérsékleten. A szűrőket ezután PBS-Tween pufferrel 1 : 5000 arányban hígított, alkalikus foszfatázzal konjugált poliklonális birka anti-digoxigenin Fab-fragmensekkel reagáltatjuk 30 percen keresztül, szobahőmérsékleten. A szűrőket négyszer 15 percen keresztül, szobahőmérsékleten PBS-Tween-nel, és egyszer 15 percen keresztül 0,15 mol/1 NaCl-t tartalmazó 0,01 mol/1 koncentrációjú Tris-HCl-val (pH 8,0) mossuk, majd 0,33 g/1 nitrokék-tetrazólium és 0,17 g/1 5-bróm-4-klór-3indolíl-foszfát 0,1 mol/1 NaCl- és 0,01 mol/1 MgCl₂-t tartalmazó, 0,1 mol/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 9,6) készült oldatával inkubálva meghatározzuk az alkalikus foszfatáz kötődését a szűrőkhöz. A próbával reagáló DNS-t alkalmazhatjuk a fent ismertetett, kódolt polipeptid expresszálására.

A polipeptidet ezután az alábbi módszerek egyikével vizsgálhatjuk az Eimeria antigén protein egy vagy több immunogén determinánsának jelenléte szempontjából.

A polipeptidet a szakirodalomból ismert eljárásokkal tisztíthatjuk E. coli lizátumból, például só-frakcionálással, ioncserélő kromatográfiával, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiával, vagy fém-kelát kromatográfiával. A tisztított terméket használhatjuk monospecifikus antitestek termelésére, az alábbiak szerint. Az antitesteket mint próbákat a parazita anyag, így merozoitok vagy sporozoitok Western blotjával hibridizálhatjuk. A pozitív jelek az E. coli transzlációs terméket közvetlenül a parazita proteinhez kötik.

A másik módszer az antitest szelekciós technika, amelyben az antitesteket közvetlenül kötjük az Eimeria DNS inszertet E. coliban expresszáló rekombináns fág monokultúrát tartalmazó szűrőhöz. A fenti kötött antitesteket Osaki és munkatársai módszere szerint eluálva [J. Immunological Methods 89,213-219 (1986)] és Eimeria antigének Western blotjához kötődni hagyva a kapcsolódás bizonyított. Az utóbbi módszert alkalmazzuk az Eas 100 és Eam45 kiónok esetében (3. példa, 8. és 9. ábra).

A fent ismertetett hibridizációs technikák akkor is alkalmazhatók, ha teljes hosszúságú kiónokhoz kívánunk jutni abban az esetben, ha a teljes kódoló szekvenciának csak egy szakaszát azonosítottuk. Közelebbről, a pGEM4Z Eam200 és pGEM4Z EamlOOE klón alkalmazható a cDNS vagy genom DNS könyvtárak szűrővizsgálatára, további lehetséges kódoló szekvenciák azonosítására.

A DNS-szekvenciák meghosszabbításának további módja a 3. példában ismertetett félspecifikus polimeráz láncreakció.

Ezért a leírásban ismertetett proteinek funkcionális származékát kódoló nukleinsav-szekvencia egy olyan polipeptidet kódol, amely egy Eimeria antigén egy vagy több antigén determinánsát tartalmazza, és az 1., 3., 5., 7. vagy 9. azonosítási számú DNS-szekvenciával hibridizálódik.

Másik módszer szerint az Eimeria cDNS-t egy gtll fágba klónozhatjuk Huynh és munkatársai módszere szerint [DNA Cloning: A Practical Approach, szerkesztő: D. Glover, IRL Press Oxford, 49-78. oldal (1985)], és egy bakteriális gazdában expresszálhatjuk. A rekombináns fágokat ezután a fent ismertetett tisztított Eimeria proteinek vagy a 2., 4., 6., 8. vagy 10. azonosítási számú aminosav-szekvenciát tartalmazó polipeptidek ellen termelt poliklonális szérummal szűrhetjük a variáns polipeptid megfelelő immunológiai régiói jelenlétének meghatározására. A fentiekben alkalmazandó, Eimeria proteinek ellen termelődött poliklonális szérum előállítását alább ismertetjük.

Közelebbről, a találmány egy Eimeria antigén egy vagy több antigén determinánsát kódoló olyan nukleinsav-szekvenciák előállítására vonatkozik, amelyek az 1., 3., 5., 7. vagy 9. azonosítási számúDNS-szekvenciáknak legalább egy szakaszát tartalmazzák.

A találmány szerinti nukleinsav-szekvenciát egy adott Eimeria törzsből izolálhatjuk, és rekombináns DNS-technikákkal, például polimeráz láncreakciós (PCR) technikával sokszorozhatjuk meg, vagy kémiailag szintetizálhatjuk in vitro, ismert eljárások alkalmazásával.

Egy találmány szerinti DNS-szekvenciát különféle, replikációs célokra alkalmazható DNS-szekvenciákkal ligálhatunk, amelyekkel természetes körülmények között nem kapcsolódik vagy kötődik, ily módon úgynevezett rekombináns vektor molekulákat kapunk, amelyek megfelelő gazda transzformálására használhatók. A megfelelő rekombináns vektor molekulák előnyösen például plazmidokból, bakteriofágokból, kozmidokból vagy vírusokból származhatnak.

A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciák klónozására alkalmazható specifikus vektorok vagy klónozó eszközök a szakirodalomból ismertek, ide tartoznak például a plazmid vektorok, például pBR322, a különféle pUC, pGEM és Bluescript plazmidok, bakteriofágok, például a gt-Wes, Charon 28 és az Ml3-ból származó fágok vagy virális vektorok, például

HU 213 419 Β az S V40, adenovírus vagy poliomavírus [lásd még Rodriquez R.L. és Denhardt D.T. szerk.: Vektors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths (1988); Lenstra J. A. és munkatársai, Arch. Virol. 110, 1-24 (1990)]. A találmány szerinti rekombináns vektor molekulák szerkesztésére alkalmazható módszerek szakemberek számára ismertek [lásd például Maniatis T. és munkatársai: Molecular Cloning, A Laboratory Manual,

2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)].

így például a találmány szerinti nukleinsav-szekvenciát úgy inszertálhatjuk egy klónozó vektorba, hogy mind a géneket, mind a kívánt klónozó eszközt ugyanazzal a restrikciós enzimmel vagy enzimekkel hasítjuk, ily módon komplementer DNS-végeket kapunk.

Az is előfordulhat, hogy a kapott restrikciós helyeket tompa végekké kell alakítani, ezt vagy az egyes szálú DNS emésztésével, vagy az egyes szálú vég megfelelő DNS-polimerázzal való betöltésével érhetjük el. Ezután végrehajthatjuk a tompa végek ligálását valamely enzimmel, például T4 DNS-ligázzal.

Kívánt esetben bármilyen restrikciós helyet előállíthatunk úgy, hogy a DNS-végekhez úgynevezett linkereket ligálunk. Ezek a linkerek restrikciós helyszekvenciákat kódoló specifikus oligonukleotid-szekvenciákat tartalmazhatnak. A restrikciós enzimmel hasított vektor vagy nukleinsav-szekvencia homopolimer „farkazással” is módosítható.

Transzformálás alatt heterológ nukleinsav-szekvencia bevezetését értjük egy gazdasejtbe, az alkalmazott módszertől - például közvetlen felvétel vagy transzdukció - függetlenül. A heterológ nukleinsav-szekvencia vagy autonóm replikációval maradhat fenn, vagy integrálódhat a gazda genomjába. Kívánt esetben a rekombináns vektor molekulákat megfelelő, a tervezett gazdával kompatibilis kontroll szekvenciákkal állíthatjuk elő, amelyek szabályozhatjuk az inszertált nukleinsav-szekvencia expresszi óját. Mikroorganizmusokon kívül többsejtű szervezetekből származó sejttenyészeteket is alkalmazhatunk gazdaként.

A találmány szerinti rekombináns vektor molekulák előnyösen egy vagy több marker aktivitást tartalmaznak, amely lehetővé teszi a kívánt tamszformánsok szelektálását, ilyen például az ampicillin vagy tetraciklin rezisztencia a pBR322-ben, vagy az ampicillin vagy és a β-galaktozidáz O-peptidje a pUC8 -bán.

Megfelelő gazdasejt egy olyan mikroorganizmus vagy sejt, amely egy polipeptidet kódoló nukleinsav-szekvenciával vagy egy ilyen nukleinsav-szekvenciát tartalmazó rekombináns vektor molekulával transzformálható, és amely kívánt esetben a fenti nukleinsav-szekvencia által kódolt fenti polipeptid expresszálására alkalmazható. A gazdasejtek prokariota eredetűek, például baktériumok, mint például Escherichia coli, Bacillus subtilis vagy Pseudomonas speciesek; vagy eukarióta eredetűek, például élesztők, így például Saccharomyces cerevisiae, vagy magasabb rendű eukarióta sejtek, például rovar, növény- vagy emlős sejtek, többek között HeLa sejtek és kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtek. A rovarsejtek közé tartozik például a Spodoptera ffugiperdából származó Sf9 sejtvonal [Luckow és munkatársai, Biotechnology 6,47-55 (1988)].

A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvencia eukarióta klónozó rendszerekben való klónozására és expressziójára vonatkozó információk például Esser és munkatársai munkájában találhatók (Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986).

Általában a találmány értelmében alkalmazható rekombináns vektor molekulák konstruálására előnyösen prokatioták alkalmazhatók. Különösen alkalmasak például az E. coli K12 törzsek, mint például a DH5a vagy MCI061 λ.

Expresszálás céljából a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciákat expressziós vektorba visszük be, azaz a fenti szekvenciákat működésképesen kötjük az expressziót szabályozó szekvenciákhoz. A fenti szabályozó szekvenciák például promoterek, hatásfokozók, kopertátorok, induktorok, riboszóma-kötő helyek, stb. lehetnek. A találmány tehát olyan rekombináns vektor molekulák előállítására is vonatkozik, amelyek a fent megadott Eimeria proteineket kódoló nukleinsav-szekvenciákat expressziós szabályozó szekvenciákhoz müködésképesen kötve, a bennük lévő DNS-szekvenciát valamely transzformált gazdasejtben való expresszálásra képesen tartalmazzák.

Magától értetődik, hogy a klónozó vektor egy kiválasztott helyére inszertált nukleotidszekvenciák olyan nukleotidokat is tartalmazhatnak, amelyek nem tartoznak a kívánt polipeptidet kódoló aktuális struktúrgénhez, vagy a kívánt proteint kódoló struktúrgénnek csak egy fragmensét tartalmazzák, amennyiben a transzformált gazdasejt olyan polipeptidet expresszál, amely az Eimeria antigén egy vagy több immunogén determinánsával rendelkezik.

Ha a gazdasejt egy baktérium, megfelelő expressziós szabályozó szekvencia például a Trp promoter és operátor [Goeddel és munkatársai, Nucl. Acids Rés. 8, 4057 (1987)]; a lac promoter és operátor [Chang és munkatársai, Natúré 275, 615 (1978)]; a külső membrán-protein promoter (Nakamura K. és Inouge Μ., EMBO J. 1, 771-775 (1982)]; a lambda bakteriofág promoterek és operátorok [Remaut E. és munkatársai, Nucl. Acids Rés. 11,4677-4688 (1983)]; a B. subtilis Ó-amiláz promoter és operátor, terminációs szekvencia és az egyéb, expressziót fokozó és kontroll szekvenciák, amelyek a kiválasztott gazdasejttel összeférhetők. Ha a gazdasejt egy élesztő, megfelelő expressziós szabályozó szekvencia például az Ó-párosodási faktor. Rovarsejtek esetében a baculovírusok polihedrinje vagy plO promoterei alkalmazhatók [Smith G.E. és munkatársai, Mól. Cell. Bioi. 3, 2156-2165 (1983)]. Ha a gazdasejt emlős eredetű, megfelelő expressziós szabályozó szekvencia például az SV40 promoter [Berman P.W. és munkatársai, Science 222, 524-527 (1983)) vagy például a metallotionein promoter (Brinster R. L., Natúré 296, 39-42 (1982)] vagy egy hő-sokk promoter [Voellmy és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4949^1953 (1985)]. Ezeken kívül az Eimeriában jelenlévő expressziós szabályozó szekvenciák is alkalmazhatók. A gén-expresszió maximalizálására vonatkozik még Lauer munkája is [Methods in Enzymology, 68,473 (1979)].

A találmány tehát egy fenti nukleinsav-szekvenciával vagy rekombináns vektor molekulával transzformált gazdasejt előállítására is vonatkozik, amely képes az Eimeria protein termelésére a nukleinsav-szekvencia expresszi ójával.

A szárnyasok Eimeria fertőzéssel szembeni immunizálását például azáltal érhetjük el, hogy az állatnak egy találmány szerinti eljárással előállított proteint adagolunk valamely immunológiailag megfelelő hordozóanyagban, úgynevezett vakcina alegységként. A vakcina alegység a proteint tiszta formában tartalmazhatja, egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyag jelenlétében. A proteint kívánt esetben valamely nem-rokon proteinhez is köthetjük, amely például megkönnyíti a fúziós termék tisztítását. Példaként említhetjük a β-galaktozidázt, a protein A-t, a prokimozint, a Xa véralvadási faktort, stb.

Bizonyos esetekben a védő immunitás kiváltásához a fenti proteinek alkalmazása önmagában kevés lehet. A kis fragmensek immunogén tulajdonságának fokozására azokat előnyösen hordozó molekulákhoz kötjük. A fenti célra alkalmazható hordozók a makromolekulák, például a természetes polimerek (proteinek, mint például a pióca hemocianin, albumin, toxinok), a szintetikus polimerek, például poliaminosavak (polilizin, polialanin) vagy amfifil vegyületek micellái, például szaponinok. A fenti fragmenseket polimerjeik, előnyösen lineáris polimerjeik formájában is alkalmazhatjuk.

A fenti vakcina alegységekben alkalmazható proteinek a szakirodalomból ismert eljárásokkal például a fenti polipeptidek Eimeria parazitákból való izolálásával, rekombináns DNS módszerekkel vagy kémiai szintézissel állíthatók elő.

Kívánt esetben a vakcinákban alkalmazandó, találmány szerinti eljárással előállított proteineket in vitro vagy in vivő módosíthatjuk, például glikozilezéssel, amidálással, karboxilezéssel vagy foszforilezéssel.

A vakcina alegységek másik lehetséges formája az élő vektor vakcina. A találmány szerinti nukleinsav-szekvenciát rekombináns DNS módszerrel egy mikroorganizmusba (például baktériumba vagy vírusba) építjük be oly módon, hogy a rekombináns mikroorganizmus képes marad replikálódni, ezáltal az inszertált nukleinsav-szekvenciát expresszálni, és a fertőzött gazdaállatban immunválaszt kiváltani.

A találmány egyik előnyős kiviteli módja egy rekombináns vírus előállítása, amely egy fenti heterológ nukleinsav-szekvenciát tartalmaz, és képes a rekombináns vírussal fertőzött állatban vagy gazdasejtben aDNS-szekvencia expresszálására. A „heterológ” kifejezés azt jelenti, hogy a találmány szerinti nukleinsav-szekvencia a természetben normálisan nincs jelen a vektor vírusban.

A találmány ezenkívül a rekombináns vektor vírussal fertőzött gazdasejtek vagy sejttenyészetek előállítására is vonatkozik, amelyek képesek Eimeria proteint termelni a nukleinsav-szekvencia expresszálásával.

Heterológ nukleinsav-szekvencia, például egy találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvencia bevezetésére a vektor vírus genomjába többek között a jól ismert in vivő homológ rekombinációs módszer alkalmazható.

Első lépésben a vektor genom inszerciós régiójának - azaz a heterológ szekvencia beépítésére a vektor alapvető funkcióinak, például a fertőzéshez vagy replikációhoz szükséges funkcióknak szétrombolása nélkül alkalmazható régiónak

- megfelelő DNS-fragmenst inszertálunk standard recDNS mód

- megfelelő DNS-fragmenst inszertálunk standard recDNS módszerekkel egy klónozó vektorba. Az inszerciós régiók számos mikroorganizmus esetében ismertek (lásd például a 80806, 110385, 83286, 314569 számú európai, a WO 88/02022 és WO 88/07088 számon publikált nemzetközi és a 4769330 és 4722848 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat).

Második lépésként kívánt esetben egy deléciót vezethetünk be az első lépésben kapott rekombináns vektor molekulában lévő inszerciós régióba. Ezt például az első lépésben kapott rekombináns vektor molekula megfelelő exonukleáz III-mal való emésztésével vagy restrikciós enzimmel való kezelésével érhetjük el.

Harmadik lépésben az első lépésben kapott rekombináns vektor molekulában lévő inszerciós régióba vagy a fenti rekombináns vektor molekulából törölt DNS helyére inszertáljuk a heterológ nukleinsav-szekvenciát. A DNS-szekvencia inszerciós régiójának megfelelő hosszúságúnak kell lennie ahhoz, hogy a homológ rekombináció a vektor genommal végbemehessen. Ezután megfelelő sejteket fertőzhetünk a vad típusú vektor vírussal vagy transzformálhatunk a vektor genom DNSsel a megfelelő vektor DNS-szekvenciákkal határolt inszerciót tartalmazó rekombináns vektor molekula jelenlétében, ezáltal végbemegy a rekombináció a rekombináns vektor molekulában lévő megfelelő régiók és a vektor genom között. Ezután sejtkultúrában előállíthatjuk, a rekombináns vektor utódokat, és genotipikusan vagy fenotipikusan szelektálhatjuk, például hibridizálással, vagy egy, a heterológ nukleinsav-szekvenciával együtt integrálódott gén által kódolt enzim aktivitásának detektálásával, vagy a rekombináns vektor által expreszszált antigén heterológ polipeptid immunológiai úton való detektálásával.

Ezt követően a fenti rekombináns mikroorganizmust immunizálás céljából beadhatjuk a baromfiaknak, amelyekben az egy ideig még fennmarad, sőt replikálódhat is a beoltott állat testében, és in vivő expresszálja az inszertált találmány szerinti nukleinsav-szekvencia által kódolt polipeptidet, amely a beoltott állat immunrendszerének stmulálását eredményezi. A találmány szerinti nukleinsavszekvencia beépítésére alkalmas vektorok vírusokból, például himlővírusokból, így vaccinia vírusból (110385 és 83286 számú európai, és 4769330 és 4722848 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), vagy szárnyasok himlővírusából (WO 88/02022 számon publikált nemzetközi szabadalmi leírás), herpeszvírusokból, így HVT-ből (WO 88/07088 számon publikált nemzetközi szabadalmi leírás) vagy a Marekbetegség vírusából, adenovírusból vagy influenzavírusból; vagy baktériumokból, így E. coliból vagy specifikus Salmonella speciesekből származhatnak. A fenti típusú mikroorganizmusokkal a gazdaállatban szintetizálódó

HU 213 419 Β polipeptid felületi antigénként nyilvánulhat meg. Ebben a vonatkozásban számításba jöhet a fenti polipeptid fúziója is OMP proteinekkel vagy például E. coli pilus proteinekkel vagy szintetikus szignál- és rögzítő szekvenciákkal, amelyeket az organizmus felismer. Az is lehetséges, hogy a fenti immunogén polipeptid kívánt esetben egy nagyobb polipeptid részeként az immunizálandó állatban válik szabaddá. Mindegyik fenti esetben lehetséges az is, hogy egy vagy több immunogén termék expresszálódik, amelyek védelmet fejlesztenek ki a különféle patogének és/vagy az adott patogén különféle antigénjei ellen.

A találmány szerinti eljárással a vektor vakcinát úgy állíthatjuk elő, hogy a rekombináns baktériumot vagy a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciát tartalmazó rekombináns vektor vírussal fertőzött gazdasejtet tenyésztjük, majd a rekombináns baktériumokat vagy a vírust tartalmazó sejteket és/vagy a sejtekben szaporodott rekombináns vektor vírusokat kívánt esetben tiszta formában összegyűjtjük, és kívánt esetben liofilizált formájú vakcinává formáljuk.

A találmány szerinti eljárással előállított rekombináns vektor molekulával transzformált gazdasejteket is tenyészthetjük olyan körülmények között, amelyek kedveznek a fenti nukleinsav-szekvencia által kódol polipeptid expreszsziójának. A vakcinákat a nyers tenyészetből, a gazdasejt lizátumokból vagy gazdasejt extraktumokból vett mintákkal készíthetjük el, azonban a találmány szerinti polipeptideket tisztított formában is alkalmazhatjuk a vakcinák előállítására, a felhasználási céltól függően. A termelődött polipeptidek tisztítására a találmány szerinti rekombináns vektorral transzformált gazdasejteket megfelelő térfogatban tenyésztjük és a képződött polipeptideket a sejtekből, vagy ha a protein kiválasztódik, a tenyészléből izoláljuk. A tenyészlébe kiválasztódott polipeptideket ismert eljárásokkal, például só-frakcionálással, centrifugálással, ultraszűréssel, kromatográfiával, gélszüréssel vagy immun-affinitási kromatográfiával izolálhatjuk, míg az intracelluláris polipeptideket úgy izolálhatjuk, hogy a sejteket először összegyűjtjük, majd például ultrahangos kezeléssel vagy egyéb mechanikai roncsolással, például French-préssel feltárjuk, a polipeptideket az egyéb intracelluláris komponensektől elválasztjuk és a polipeptidet vakcinává formáljuk. A sejtek feltárását kémiai úton (például EDTA-val vagy detergenssel, például Triton XI 14-gyel) vagy enzimatikusan, például lizozimes emésztéssel is végezhetjük.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid elleni antitest vagy antiszérum potenciálisan alkalmazható a passzív immunterápiában, a diagnosztikai immunvizsgálatokban és anti-idiotípusú antitestek fejlesztésére.

A fent definiált Eimeria proteinek antitestek - mind poliklonális, mind monospecifikus és monoklonális antitestek - termelésére alkalmazhatók. Abban az esetben, ha poliklonális antitesteket kívánunk előállítani, a poliklonális szérumok termelésére és feldolgozására alkalmas módszerek a szakirodalomból ismertek (például Mayer és Walter, szerk., Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987). Röviden, egy kiválasztott emlősnek például nyúlnak - egy vagy több injekció formájában adjuk a fenti immunogéneket, mintegy 10 pg-80 pg protein/immunizálás dózisban. Az immunizáló proteint elfogadható adjuvánssal adjuk, általában az immunogént és adjuvánst azonos térfogatban alkalmazzuk. Adjuvánsként például Freund-féle teljes adjuvánst, Freund-féle nem teljes adjuvánst, alumprecipitátumot vagy víz-az-olajban emulziókat alkalmazunk, a kezdeti immunizálásra előnyösen Freund-féle teljes adjuvánst alkalmazunk. A Freund-féle nem teljes adjuváns előnyösen az összes emlékeztető immunizálásra alkalmazható. A kezdeti immunizálás abból áll, hogy mintegy 1 ml emulziót injektálunk a nyúl hátán több helyre, szubkután módon. Az emlékeztető immunizálást mintegy 1 hónapos intervallumokban végezzük, azonos térfogatú immunogénnel, és addig folytatjuk, amíg az adott nyúl szérumában megfelelő antitestkoncentrációt érünk el. A vért összegyűjtjük és a szérumot a szakirodalomból ismert módon izoláljuk.

Az immunogénre monospecifikus antitesteket affinitási kromatográfiás eljárással tisztítjuk a nyulak tisztított proteinekkel való, fent ismertetett immunizálásával előállított, polispecifikus antiszérumból, Hall és munkatársai [Natúré 311,379-387 (1984)] módszerének módosításával. Monospecifikus antitest alatt egyetlen fajta antitestet értűnk, vagy több fajta antitestet, amely a vonatkozó antigénnel szemben homogén kötődési tulajdonságokat mutat. Homogén kötődés alatt az adott antitest-fajta specifikus antigénhez vagy epitóphoz való kötődési képességét értjük.

Az Eimeria immunogénekkel szemben reakcióképes monoklonális antitesteket beltenyésztett egerek, előnyösen Balb/c egerek megfelelő proteinekkel való immunizálásával állíthatjuk elő. Az egereket intraperitoneálisan immunizáljuk mintegy 100 ng-10 pg immunogénnel, 0,5 ml dózistérfogatban, azonos térfogatú megfelelő adjuvánsban. Adjuvánsként például Freund-féle teljes adjuvánst, Freund-féle nem teljes adjuvánst, alum-precipitátumot vagy víz-az-olajban emulziókat alkalmazunk. Az egerek emlékeztető immunizálását intravénásán azonos térfogatú, adjuváns nélküli immunogén beadásával végezzük, az első immunizálás utáni 14.,21. és 63. napon. Az első emlékeztető immunizálás utáni kb. harmadik napon az egereket egyenként szerológiai vizsgálatnak vetjük alá, anti-immunogén antitestekre. Az antitestet termelő egerekből származó lépsejteket izoláljuk és egér myeloma sejtekkel, például SP-2/0 vagy hasonló sejtekkel fuzionáljuk, ismert eljárás alkalmazásával [Kohler és Milstein, Natúré 256,495^497 (1975)]. A hibridoma sejteket hipoxantint, timidint és amino-pterint tartalmazó megfelelő tápközegben, például Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben (DMEM) tenyésztve szelektáljuk. Az antitestet termelő hibridomákat klónozzuk, előnyösen McPherson-féle lágy agar módszert alkalmazva (Soft Agar Techniques, Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, szerk., Academic Press, 276. oldal, 1973). Az elkülönülő telepeket egyenként a tenyésztőlemez megfelelő tápközeget tartalmazó rezervoárjaiba visszük. Az antitestet termelő sejteket a megfelelő immunogénnel végzett szűrővizsgálattal azonosítjuk. Az immunogén-pozitív hibridoma sejteket ismert módszerek alkalmazásával tartjuk fenn. A specifikus anti-monoklonális antitesteket a hibridomák in vitro tenyésztésével, vagy hibridoma sejtek injektálását követően egerekből az aszcitesz folyadék ismert módon történő preparálásával állítjuk elő.

Az anti-idiotípusú antitestek azon patogén antigénjének „belső képét” hordozó immunoglobulinok, amely ellen védeni kívánjuk az állatot, és amelyek vakcinában immunogénként alkalmazhatók [Dreesman és munkatársai, J. Infect. Disease 757,761 (1985)]. Az anti-idiotípusú antitestek termelésének technikáj a ismert [MacNamaraés munkatársai, Science 226, 1325 (1984)].

A találmány szerinti eljárással előállított vakcina a hagyományos aktív immunizálás sémájának megfelelően adagolható: egyszeri vagy többszöri adagolás a dózis formálásával összeférhető módon, és profilaktíkus hatást biztosító mennyiségben, azaz az immunizáló antigén vagy a fenti antigén expresszálására képes rekombináns mikroorganizmust olyan mennyiségben alkalmazzuk, amely elegendő a szárnyasokban a virulens Eimeria paraziták elleni immunitás kiváltására. Az immunitást úgy definiáljuk, mint a védelem szignifikáns szintjének indukálását a vakcináit csirke-populációban, egy nem vakcináit csoporthoz viszonyítva.

Élő virális vektor vakcinák esetén a dózis ΙΟ⁵-10⁸plakk-képzö egység (pfu) csirkénként.

A találmány szerinti eljárással előállított jellegzetes vakcina alegység 1 pg-l mg találmány szerinti proteint tartalmaz.

A vakcina adagolása például intradermális, szubkután, intramuszkuláris, intraperitoneális, intravénás, orális vagy intranazális lehet.

A vakcina ezenkívül tartalmazhat vizes közeget vagy víztartalmú szuszpenziót, gyakran egyéb komponensekkel is elegyítve, például az aktivitás és/vagy a megengedett tárolási idő növelése céljából. Ezek a komponensek például sók, pH-pufferek, stabilizátorok (például fölözött tej vagy kazein hidrolizátumok), emulgeátorok, immunválaszt fokozó adjuvánsok (például olajok, muramil-dipeptidek, alumínium-hidroxid, szaponin, polianionok és amfipatikus anyagok) és konzerválószerek lehetnek.

Többértékü vakcinák előállítására a találmány szerinti eljárással előállított vakcina magától értetődően a baromfiak egyéb patogénjei - például a Marek-betegség vírusa (MDV), a Newcastle betegség vírusa (NDV), a fertőző bronchitis vírusa (IBV), a fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa (IBDV), a csirkeanémia kórokozója (CAA), reovírus szárnyasok retrovírusa, baromfik adenovírusa, pulykarhinotracheitis vírusa, E. coli vagy egyéb Eimeria fajták elleni immunogéneket, vagy ezen immunogéneket kódoló nukleinsav-szekvenciákat is tartalmazhatnak.

A találmány szerinti eljárással előállított protein immunkémiai reagens komponenseként is alkalmazható.

Immunkémiai reagens alatt olyan találmány szerinti eljárással előállított proteint értünk, amely egy megfelelő hordozóhoz van kötve, vagy jelzőanyagot tartalmaz.

A hordozó például egy mikroteszt rezervoár vagy küvetta belső fala, egy cső vagy kapilláris, egy membrán, szűrő, teszt-csík vagy egy részecske, például egy latexrészecske, egy eritrocita, egy festék-szol, egy fém-szol vagy fémvegyület mint szol-részecske felülete lehet.

A jelzőanyag például radioaktív izotóp, fluoreszcensz vegyület, enzim, festék-szol, fém-szol vagy fémvegyület mint szol-részecske lehet.

A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciák az Eimeriával kapcsolatos nukleinsavak vagy egyéb szövetfajták detektálására szolgáló hibridizációs kísérletekben is alkalmazhatók.

A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciát Eimeria fertőzés diagnosztizálására szolgáló készletben is alkalmazhatjuk.

A találmány értelmében ezenkívül immunológiai vizsgálatokban alkalmazható készletekben is alkalmazhatjuk találmány szerinti eljárással előállított proteint tartalmazó immunkémiai reagenst.

A készlet alkalmazásakor végbemenő immunkémiai reakció előnyösen szendvics-reakció, agglutinációs reakció kompetitiv reakció vagy gátlási reakció lehet.

A szendvics-reakció kivitelezésére a készlet például egy szilárd hordozóhoz, így például egy mikroteszt-rezervoár belső falához kötött találmány szerinti polipeptidet, és vagy egy találmány szerinti jelzett polipeptidet, vagy egy jelzett antitestet tartalmaz.

1. példa

Paraziták preparálása és izolálása

Az E. acervulina Houghton törzs az AFRC Houghton Laboratory-ból származott és coccidium-mentes csirkékben passzáltuk.

A paraziták preparálására és frakcionálására az E. tenella parazitákat tartottuk fenn és az oocisztákat Long és munkatársai módszere szerint izoláltuk [Föl. Vet. Lat. 6, 01-217 (1976)]. A sporozoitokat Wisher és Rose módszere szerint izoláltuk [Parasitology 88, 515-519 (1984)], nylongyapjú tisztítással kiegészítve, Larsen és munkatársai módszere szerint [J. Párásítói. 70, 597-601 (1984)].

A merozoitokat 72 órával az inokulálás után gyűjtjük össze az alábbiak szerint [lásd még Jenkins és Dame, Mól. Biochem. Párásítói. 25,155-165 (1987)]. 4—6 hetes csirkéket orálisan fertőzünk 1 x 10⁶~⁵x 106 spórás oocisztával. Az állatok fertőzése után 72 órával azokat leöljük, a duodenumot a Meckels divertikulumig eltávolítjuk és jéghideg, foszfáttal pufferolt sóoldatban (0,04 mol/1 koncentrációjú PBS, pH 7,3) tartjuk. A duodenumot hosszában felvágjuk és jéghideg PBS-sel mossuk. A belet ezután 5 cm-es darabokra vágjuk és 100-200 egység/ml penicillint és 100-200 pg/ml streptomicint tartalmazó Hanks-BBS-ben 37 °C-on 15-30 percen keresztül szuszpendáljuk.

A felülúszót eltávolítjuk és 120, 60 és 35 mesh hálóméretü rozsdamentes acél szitán átszűrjük. Az eluátumot 130 g-vel 8 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszókat összegyűjtjük és a merozoitokat 4 °Con 1500 g-vel 10 percen keresztüli centrifugálással koncentráljuk.

A koncentrált üledéket 150 mmol/1 NaCl-t tartalmazó 25 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-ben (pH 8,0) újraszuszpendáljuk és ugyanezzel a pufferral ekvilibrált DE52-n (Whatman) tisztítjuk. A merozoitokat a nem kötődő frakcióban eluáljuk. A hozam mintegy ΙχΙΟ⁹merozoit/fertőzött csirke.

2. példa

Eimeria antigének tisztítása

A) Módszerek

Extrakció Triton XI 14-gyel

A Bordier szerint alkalmazott anyagok [Bordier C., J. Bioi. Chem. 256, 1604-1607 (1981)]:

- előkondenzált Triton XI14 (TX114) (lásd alább),

- 10 mmol/1 Tris-HCl-150 mmol/1 NaCl (pH 7,4) (TBS),

-100 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF) izopropanolban,

- 0,06% TX114-et tartalmazó 6%-os szacharózoldat TBS-ben (szacharóz puffer).

Milliliterenként 5* 10⁸ E. acervulina merozoitot homogenizálunk TBS-ben. Az elegyet kiegészítjük 1 mmol/1 PMSF-fel és 10 térfogat% előkondenzált TX114-gyel.

Mechanikus roncsolás alkalmazásával a proteineket legalább 2 órán keresztül extraháj uk 0 °C-on. A nem szolubilizálódó anyagot 4 °C-on 12000 g-vel 10 percen keresztül Eppendorf centrifugában centrifugálva összegyűjtjük. A szolubilizált anyagot tartalmazó felülúszót azonos térfogatú szacharóz pufferre rétegezzük, és 40 °C-on 10 percen keresztül inkubáljuk.

Szobahőmérsékleten, 400 g-vel 10 percen keresztüli centrifügálás után a hidrofil anyagot tartalmazó felső fázist eltávolítjuk és azonos szacharóz pufferre rétegezve és a fentiek szerint centrifugálva még egyszer extraháljuk.

Az egyesített alsó fázisokat a maradék felső fázistól elkülönítve tartjuk.

Ha a vizes fázist a hidrofób anyagtól teljesen mentesíteni kell, az extrahálást még egyszer megismételjük.

Az összes frakciót -70 °C-on fagyasztva tároljuk a további analízisig.

Triton XI14 előkondenzálása ml Triton XI 14-et (Serva) hideg TBS-sel (pH 7,4) 1 literre töltünk fel, összekeveijük és 0-4 °C-on inkubáljuk. A teljes szolubilizálódás után az oldatot 40 °C-os vízfürdőre helyezzük. A fázisok 16 óra alatt tökéletesen szétválnak. A felső fázist eltávolítjuk és azonos térfogatú TBS-sel helyettesítjük. Ezt a műveletet kétszer megismételjük. A végső alsó fázist - amelyet előkondenzált TX 114-nek nevezünk - 100 ml-es üvegben 4 °C-on tároljuk. A TX114 végkoncentráció közelítőleg 20%.

Monoklonális antitestek

Az E. acervulina merozoitok elleni monoklonális antitesteket (E.ACER 5F-2, E.ACER10C-2A, E.ACER 10 E-2, E.ACER 11A-2A és E.ACER 12B-2B) Balb/C egerekben termeljük, ΙΟ⁶—10⁷ merozoittal ismételten intraperitoneálisan inokulálva.

A megfelelő lépsejteket P3X63 Ag 8.6.5.3. myelomával fuzionáljuk és Schönherr és munkatársai módszere szerint klónozzuk [Develop. bioi. Stand. 50, 235-242 (1982)].

A szárított, acetonnal fixált merozoitokat immunfluoreszcens vizsgálattal szüljük. Nagytöménységü monoklonális antitest oldatokat állítunk elő in vitro, tenyésztő edényként dialízis-modulokat alkalmazva, folyamatos tápközegcserével, Schönherr és van Gelder módszere szerint [Animál Cell Biotechnology 3, 337-355].

Immun-affinitási kromatográfia

- Affinitási mátrix aktiválása

A Sepharose CL-4B-t (Pharmacia) desztillált vizes, 50 mg/ml bróm-cián-oldattal (CNBr) aktiváljuk. Az aktiválást jól szellőző vegyifülkében végezzük. Az elegyet lassan forgó mágneses keverővei 30 percen keresztül, szobahőmérsékleten keverjük, és a pH-t 4 mol/1 koncentrációjú NaOH-dal 10,5-11,0 értéken tartjuk. A reakció befejeződése után a Sepharose-t üvegszűrőn 500 ml hideg vízzel és 500 ml hideg 0,2 mol/1 koncentrációjú NaHCOrtal (kapcsoló pufferrel) mossuk. A gélt azonnal felhasználjuk az immunglobulinok kapcsolására.

- Monoklonális IgG kapcsolása Sepharose-hoz

A monoklonális antitestet nagy töménységű, de 0,2 mol/1 NaHCO₃-tal (kapcsoló pufferrel) szemben alaposan dializált felülúszó formájában alkalmazzuk. Puffercserét is végzünk PD10 oszlopokon (Pharmacia), a gyártó előírásai szerint. A BrCN-dal aktivált Sepharose CL-4B-hez 2-5 mg/ml végkoncentrációban Mo Ab IgG-t adunk, és az elegyet 4 °C-on egy éjszakán keresztül, vagy szobahőmérsékleten 2 órán keresztül keverjük. A meg nem kötött frakciót eltávolítjuk és protein-tartalmát BCA reagenssel (Pierce) vizsgáljuk. A Sepharose-t 10szer mossuk, és ezután 1 térfogat 1 mol/1 koncentrációjú etanolamin/HCl-val (pH 8,5) keverjük szobahőmérsékleten, 2 órán keresztül. 200 ml 0,1 mol/1 Tris-HCl— 0,5 mol/1 NaCl (pH 8,0) eleggyel és 0,1 mol/1 HAc— 0,5 mol/1 NaCl (pH 4,0) eleggyel négy ciklusban váltakozva mosva eltávolítjuk a kovalensen nem kötött anyagot. A gélt 0,05% azidot tartalmazó PBS-ben 4 °C-on tároljuk.

- Affinitási tisztítás

Pufferek:

A) 25 mmol/1 Tris-HCl + 0,5 mol/1 NaCl + 0,1%

Nonidet P40 (NP40) pH 8,0

B) 0,1 mol/1 glicin-HCl + 0,1% NP40 pH 2,6

C) 0,1 mol/1 Tris-HCl + 0,5 mol/1 NaCl + 0,1%

NP40 pH 8,0

D) 3 mol/1 KSCN A) pufferben

E) 1 mol/1 Tris-HCl pH 8,0

F) 10 mmol/1 Tris-HCl + 150 mmol/1 NaCl pH 8,0

Hűtököpennyel ellátott Pharmacia Cl0/20 oszlopra felviszünk 7 ml Sepharose-IgG-t. Az oszlopra 0,5 ml/perc sebességgel felviszünk A) pufferrel tízszeresére hígított TX114 hidrofób extraktumot (üledék), és 16-20 órán keresztül 8 °C-on visszacirkuláltatjuk. Az oszlopot 5-10-szeres ágytérfogatnyi A) pufferrel mossuk, majd megfordítjuk az átfolyás irányát és 7,5 ml B) pufferrel, 5 ml C) pufferrel 10 ml A) pufferrel, 7,5 ml D) pufferrel és 40 ml A) pufferrel eluáljuk.

A savas frakciókat (1 ml) azonnal semlegesítjük 0,1 ml E) pufferrel. A KSCN frakciókat egy éjszakán keresztül dializáljuk az F) pufferrel szemben. Az összes frakciót SDS-PAGE-n, immunblot-tal és a protein-tartalmat BCA-val analizáljuk.

SDS-poli(akril-amid) gél-elektroforézis (SDSPAGE) és immunbiot analízis

Az SDS-PAGE vizsgálatot 12%-os akril-amid-gélben végezzük, Laemmli puffer-rendszer [Laemmli U.K., Natúré 227, 680-685 (1970)] alkalmazásával. A Wes10 tem biot analízist Vermeiden és munkatársai módszere szerint végezzük [Vermeulen A.N. és munkatársai, J. Exp. Med. 162, 1460-1476 (1985)], biot pufferként 25szörös hígítású Laemmli alsó edény elektroforézis puffért alkalmazva. A blottolást 90 V alkalmazása mellett 1,5 órán keresztül végezzük, Bio-rad transblot cellában.

Nitro-cellulózt (0,25 pm, Schleicher és Schüll) 0,1% NFMP-vel [nem zsíros tejpor (0X0ID) PBS-ben (0,01 mol/1 foszfát 0,9%-os NaCl-ben, pH 7,3)] blokkolunk 30 percen keresztül.

A szérumot és az alkalikus foszfatázzal konjugált antiszérumot 1,5 órán keresztül inkubáljuk. A pozitív kötődést BCIP/NBT-vel mint szubsztráttal detektáljuk.

Poliklonális antitestek

A nyúl 8275 (K8275) antitesteket új-zélandi fehér nyulakban termeljük, E. acervulina 72 órás merozoitot tartalmazó Freund-féle nem teljes adjuváns emulzióval, amelyet intradermálisan adagolunk kétszer, 4 hetes intervallummal.

Monospecifikus antitestek

A monospecifikus antitesteket nyulakban termeljük, amelyeket előzőleg a szérumban anti-Eimeria antitestek hiánya alapján szelektáltunk.

A nyulakat (5706 és 5792) kétszer injektáljuk 4-5 hetes intervallummal 55-100 pg affinitási kromatográfiával tisztított Eam45-tel, Freund-féle nem teljes (vízaz-olajban) adjuvánsban emulgeálva.

Az 5796. számú nyulat ugyanezen protokoll szerint injektáljuk affinitási kromatográfiával tisztított Eam20-szal.

Az 5794. számú nyulat ugyanezen protokoll szerint injektáljuk az affinitási tisztítás előtti ΊΧ114 hidrofób extraktummal. Ez a frakció Eam45 és Eam20 mellett néhány egyéb proteint is tartalmaz.

Az EaslOO elleni monospecifikus antitesteket csirkében termeljük, Freund-féle nem teljes adjuvánsban emulgeált tisztított protein /100 mmol/1 Tris-HCl + 150 mmol/1 NaCl + 0,1% NP40 pH 8,0 puffer alkalmazásával, amelyet szubkután adagolunk a nyakba, három alkalommal, 14 napos intervallumokkal. Az utolsó immunizálás után 11 nappal a csirkéket elvéreztetjük és a szérumot összegyűjtjük (a további vizsgálatokat a 323. csirkéből kapott szérummal végezzük).

B) Eredmények

TX114 ex frakció

A 3. ábrán láthatók a TX114-gyel végzett extrakció és a fázisok elválasztása után kapott különböző frakciók. Az anyagot elektroforetizáltuk, nitro-cellulózra blottoltuk és az Eam200, EamlOO, Eam45 és Eam20 proteinnel [relatív móltömegük 180-210 kD (átlag 200 kD), 95-105 kD (átlag 100 kD), 45-55 kD (átlag 50 kD), illetve 18-22 kD (átlag 20 kD), nem redukáló körülmények között meghatározva] szemben specifikus monoklonális antitestek elegyét alkalmaztuk próbaként.

Látható, hogy az Eam200 és EamlOO proteinek hidrofil jellegűek, mivel ezek nincsenek jelen a hidrofób üledékben (5. sáv). Ezzel szemben az Eam45 és Eam20 a hidrofil frakcióból hiányzik (3. sáv).

Eam45 és Eam20 immunaffinitási kromatográfiája

A Sepharose-hoz kapcsolt E.ACER 10C-2A monoklonális antitesttel kötjük meg az Eam45 proteint, míg az Eam20 protein megkötésére E.ACER 10E-2-t alkalmazunk.

A kapcsolási hatásfok 90%-nál nagyobb mindkét MoAb esetén, a MoAb elfolyása az oszlopról minimális.

Az ,Eam20” oszlopot az „Eam45” oszloppal összekötjük, így az utóbbin meg nem kötött frakció az előbbi mátrixán képes kötődni. Mindkét oszlopot külön-külön eluáljuk.

A 4. ábrán látható a 10C-2A (Eam45) mátrixról kapott frakciók SDS-PAGE/immunblot képe. Az ábra a 3. ábrától eltérő kísérletből származik. A blothoz próbaként nyúl K8275 antitesteket alkalmaztunk.

Látható, hogy az Eam45 elsődlegesen pH 2,6-nál eluálódik(l 2. és 14. sáv), de bizonyos része visszamarad, és ez KSCN-nel eluálódik (16. és 18. sáv). Az utóbbi frakciók azonban más, kisebb móltömegü anyagot is tartalmaznak, amely valószínűleg nincs kapcsolatban az Eam45 antigénnel.

Az 5. ábrán egy hasonló biot képe látható, az Eam20 proteint kötő 10E-2 oszlopról.

A 3. sáv tartalmazza azt az anyagot, amely nem kötődik a 10C-2A oszlophoz, és így a 10E-2 adszorbensen a kiindulási anyagot képezi. Látható, hogy ez a frakció nem tartalmaz Eam45 proteint. A jelzett sáv 29 kD-nál mesterséges, és az Eam20 proteinhez tartozik. A műterméket a Triton XI14 jelenléte okozza az elektroforetikus mintában.

A 4. sáv tartalmazza a 10E-2 oszlopon nem kötődő frakciót, ami ezen MoAb Eam20 protein adszorbeálására vonatkozó nagy specificitását bizonyítja.

Noha az anyag egy része pH 2,6-nál eluálódik (10. és 12. sáv), a többsége 3 mol/1 KSCN-nel eluálódik (14. és 17. sáv). Ezek a frakciók nem tartalmaznak nem specifikusan kötött anyagot.

Mind az Eam45, mind az Eam20 elleni monoklonális antitestek felismerik az élő merozoitokon lévő felületi proteineket.

Az Eam45 látszólagos móltömege SDS-PAGE módszerrel meghatározva 45-55 kD, de tekintettel a korábbi közleményekre úgy határoztunk, hogy nem változtatjuk meg azonosítási jelét. Az Eam45 átlagos móltömege jelenlegi meghatározásunk szerint mintegy 50 kD. Redukált gélben az Eam45 55 kD-nál fut.

Az összes anti-Eam45 szérum pozitív reakciót mutat 50 kD és 100 kD körül, ha ezeket a szérumokat ismét próbaként alkalmazzuk merozoit bloton.

E. Acervulina 100 kD protein tisztítása sporozoitokből

Az E. acervulina 100 kD protein tisztítására a sporozoitokat TX114-gyel extraháljuk a fent ismertetett protokoll szerint. Az Eas 100-at kizárólag a hidrofil fázisban detektáljuk. Ezt azután CNBr-dal aktivált Sepharose 4B oszlophoz kapcsolt MoAb E.ACER 5F-2 immunaffinitási oszlopon hagyjuk kötődni. A kötődés és eluálás körülményei a fent ismertetettek.

Az EaslOO dublettként elulódik savas pH-η. Az Eas 100-at tartalmazó frakció a 6. ábrán látható (4. sáv). Ezt a blotot nyúl anti-E.Acer sporozoit antitestekkel utókezeltük.

Nem látható egyéb, parazita eredetű sáv ebben a frakcióban. Az egyetlen szennyező sávot (móltömeg 200 kD) láthatólag az IgG mátrixból való kifolyása okozza.

Ezt a proteint használjuk EaslOO elleni antitestek termelésére csirkében.

A 323. számú csirkéből származó antitesteket használjuk a 72 órás E. acervulina merozoit mRNS-ből származó cDNS könyvtár szűrésére (3. példa).

A pozitív kiónon szelektált antitest a várt módon reagál EamlOO-zal és az E. acervulina merozoitok egy hasonló méretű proteinjével. Az immunblottolt, affinitással tisztított EamlOO (MoAb E.ACER 16B-2B alkalmazásával) pozitívan reagál E.ACER 5F-2-vel, a MoAb, amelyet a sporozoit tisztítására alkalmaztunk, az Easl 00 ekvivalense. Ezért a két protein kölcsönösen kapcsolatban van egymással.

Eam200 immunaffmitási kromatográfiája merozoitokból

Az E.ACER 11A-2A monoklonális antitestet az Eam200 protein megkötésére Sepharose-hoz kapcsoljuk.

A kapcsolás hatásfoka nagyobb, mint 90%. A MoAb elfolyása az oszlopról minimális, de kimutatható.

A TX114-gyel végzett extrahálással kapott, Eam200at és EamlOO-at tartalmazó hidrofil frakciót az Eam45 és Eam20 esetében fent ismertetett protokoll szerint kötjük meg az oszlopon.

A tisztított Eam200 a savas eluálás után válik szabaddá az oszlopról, amint a 7. ábra mutatja (4. sáv).

3. példa cDNs könyvtár előállítása E. acervulina merozoitokból, immunológiai szűrővizsgálat és DNS-szekvencia meghatározás

A) Módszerek

RNS izolálása

Az RNS izolálása céljából 10⁹ merozoitot tartalmazó üledéket 0,5 ml vízben újra szuszpendálunk. Hozzáadunk 0,5 ml A oldatot [Tris 10 mmol/1, nátrium-acetát 75 mmol/1, EDTA 2 mmol/1, SDS 1% (pH 7,2)], majd 1 ml B oldatot [5 mol/1 guanidin-monoizotiocianát, 10 mmol/1 EDTA, 50 mmol/1 Tris (pH 7,5)] és 2 g 0,5 mm átmérőjű üveggyöngyöt, és a szuszpenziót 1 percen keresztül turmixoljuk. Hozzáadunk 4 ml B oldatot és 0,4 ml B-merkapto-etanolt, és a csöveket 15 percre 60 °C-os vízfürdőre helyezzük. 5 ml fenol hozzáadása után a csöveket további 15 percen keresztül melegítjük 60 °C-on, majd szobahőmérsékletre hütjük. A szuszpenziót 2,5 ml 0,1 mol/1 NaAc-ot (p H 5,2), 10 mmol/1 Tris-t (pH 7,5) és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó oldattal és 5 ml 24 : 1 térfogatarányú kloroform-izoamil-alkohol elegygyel turmixgépben elegyítjük, majd a fázisokat centrifugálással (5 perc, 6000 fordulat/perc) szétválasztjuk. A vizes fázist 20 ml 25 : 24: 1 térfogatarányú fenolkloroform-izoamil-alkohol eleggyel újra extraháljuk, 10 percen keresztül forgó dobos keverőben keverve. Az elegyet 6000 fordulat/perccel 5 percen keresztül centrifugáljuk, majd a nukleinsavakat 2 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk és 6000 fordulat/perccel 10 percen keresztül centrifugáljuk. Az üledéket 70%-os etanollal mossuk és a poliA⁺ RNS-t Maniatis és munkatársai módszere szerint izoláljuk [Maniatis T. és munkatársai, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)]. 10⁹merozoitból mintegy 1 pg poliA⁺ RNS-t izolálunk.

c DNS könyvtárak előállítása

A poliA⁺ RNS-t MMLV reverz transzkriptáz enzim segítségével alakítjuk cDNS-sé, az alábbiak szerint. 0,5 pg poliA⁺ mRNS-t 10 pl H₂O-ben oldunk, 10 percen keresztül 65 °C-on melegítjük, majd jégen gyorsan lehűtjük. A cDNS szintézist Pharmacia cDNS szintézis készlettel végezzük. Tompavégű DNS molekulák előállítása céljából a cDNS-t 1 pl Klenow DNS-polimerázzal (7 egység/pl) kezeljük 37 °C-on 20 percen keresztül, majd 1 pl T4 DNS-polimerázzal (7,5 egység/pl) 37 '’Con 10 percen keresztül inkubáljuk. Azonos térfogatú, 25 : 24 : 1 térfogatarányú fenol-kloroform-izoamil-alkohol eleggyel való extrahálás és centrifugálás (5 perc, 13000 fordulat/perc, Biofuge) után a cDNS-t 1 térfogat NH₄Ac és 4 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. Az üledéket 70%-os etanollal mossuk, és 82 pl H₂O-ben oldjuk. Az EcoRI összekötő elemeket (adaptereket) 10 pl ligáló puffer [500 mmol/1 Tris (pH 8,0), 100 mmol/1 MgCl₂, 100 mmol/1 DTT, 100 mmol/1 ATP és 50 vegyes%polipropilénglikol 8000], 5 pl EcoRI adapteroldat (Pharmacia c DNSszintézis készlet) és 3 pl T4 DNS ligáz (7 egység/pl) hozzáadásával, és egy éjszakán keresztül 12 °C-on inkubálva ligáljuk a cDNS-hez. A reakciót 65 °C-on 10 percen keresztüli melegítéssel állítjuk le. A cDNS-t 10 pl 10 mmol/1 koncentrációjú ATP és 2 pl 7 egység/pl koncentrációjú polinukleotid-kináz hozzáadásával, 37 °C-on 1 órán keresztül inkubálva foszforilezzük. A cDNS-t 1 térfogat 25 : 24 : 1 térfogatarányú fenol-kloroform-izoamil-alkohol eleggyel extraháljuk és Biogel A-15 m oszlopon tisztítjuk. A cDNS-t tartalmazó frakciókat 0,1 térfogat 3 mol/1 koncentrációjú NaAc (pH 5,6) és 2 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot 70%-os etanollal mossuk és 20 pl T10E0,1-ben [10 mmol/1 Tris (pH 7,6) és 0,1 mmol/1 EDTA] oldjuk. A cDNS molekulákat Huynh és munkatársai módszere szerint klónozzuk lambda gtl 0 és lambda gtli DNS-be [Huynh és munkatársai, DNS cloning techniques: A practical approach (1984)].

Lambda gtl 1 cDNs könyvtár szűrővizsgálata Eimeria proteinek elleni antiszérummal

A lambda gtl 1 cDNS könyvtárat Eimeria parazitákból származó proteinek elleni antitestekkel szűrtük. Vagy monoklonális egér antitesteket vagy monospecifikus nyúl vagy csirke antiszérumot alkalmazunk. Alkalmazás előtt az antitesteket 0,05% Tween 20-at és 10% magzati boíjúszérumot (FCS) tartalmazó 1 x Tris-sóval (10 mmol/1 Tris-H Cl, 150 mmol/1 NaCl, pH 8,0) hígítjuk, és szobahőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáljuk a szűrővel. A szűrőket ezután négyszer mossuk, minden egyes alkalommal 10 percen keresztül, szűrőnként 50 ml 0,05% Tween 20-at tartalmazó 1 * Tris-sóval. Az antitesttel végzett második inkubálásra kecske-anti-egér vagy kecske-anti-nyúl vagy nyúl-anti-csirke antitestek és alkalikus foszfatáz konjugátumát alkalmazzuk (1 : 7500 arányban hígítva 0,05% Tween 20-at és 10% FCS-t tartalmazó 1 xTris-sóval) és szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk, majd a szűrőket a fentiek szerint mossuk. A színreakciót 100 mmol/1 Tris-HCl, 100 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 MgCl₂ (pH 9,6) oldatában játszatjuk le, amelyben 0,33 mg/ml nitrokéktetrazólium

HU 213 419 Β és 0,17 mg/ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát van oldva. A reakciót szobahőmérsékleten 30 percen keresztüli inkubálás után leállítjuk.

Az immunpozitív kiónokat úgy tisztítjuk, hogy az izolált plakkokat lemezen szélesztjük és az immunológiai szűrővizsgálatot a fent ismertetett módon elvégezzük, és ezt a ciklust kétszer-háromszor megismételjük.

Lambda gtll cDNS klánok jellemzése

A fág-tenyészetek előállítását és a DNS extrahálását a szokásos módon végezzük [Maniatis T. és munkatársai, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)]. Restrikciós endonukleázokkal végzett emésztés után a DNS-t agaróz gélen elektroforetizálva analizáljuk, 89 mmol/1 Tris, 89 mmol/1 bórsav és 2 mmol/1 EDTA oldatában (pH 8,3).

Az antitest-szelektálási kísérleteket Osaki L.S. és munkatársai [J. Immunological Methods 89, 213-219 (1986)] módszere szerint végezzük, végső bizonyítékként az izolált lambda gtll cDNS kiónok által kódolt proteinek azonosítására. A fág-tenyészeteket 5^X1O⁴pfu/pl-re hígítjuk, 1 μΐ-t 200 μΐ E. coli Y1090-sejttel inkubálunk, és lemezekre szélesztjük. A lemezekre 2,5 óra múlva IPTG-vel telített nitro-cellulóz szűrőket helyezünk, és 5,5 órán keresztül tartó inkubálás után a szűrőket megfordítjuk és az inkubálást 2 órán keresztül folytatjuk. A lemezeket a szűrőkkel együtt egy éjszakán keresztül 4 °C-on tartjuk, majd a szűrőket 1 xTris-sóval 20 percen keresztül mossuk és 20% FCS-t tartalmazó 1 χ Tris-sóval 2 órán keresztül szobahőmérsékleten kezelve blokkoljuk. A szűrőket Tris-sóval szobahőmérsékleten 5 percen keresztül mossuk, majd levegőn szárítjuk. Az antitest-preparátumokat kaprilsavas kicsapással tisztítjuk és 1 : 150 arányban hígítjuk 20% FCS-t és 0,05% NP40-et tartalmazó 1 xTris-sóval. Mindegyik szűrőt 15 ml szérummal inkubáljuk szobahőmérsékleten 60 percen keresztül. A szűrőket háromszor 10 percen keresztül 0,05% NP40-et tartalmazó Tris-sóval mossuk. A kötődött IgG-t szobahőmérsékleten 1 percen keresztül 5 ml 0,2 mol/1 koncentrációjú glicin-HCl pufferrel (pH 2,8) eluáljuk, és 150 p/1 koncentrációjú Tris-sel, 0,2 ml PBSTween-nel (25^x) és 1 ml FCS-sel gyorsan semlegesítjük (az elúciós lépésben felhasznált összes lemezt először 10% FCS-t tartalmazó 1 ^x Tris-sóval szobahőmérsékleten 1 órán keresztül kezelve blokkoljuk). Az eluátumokat a megfelelő proteinek azonosítása céljából Eimeria merozoitok vagy sporozoitok Western biot csíkjaira visszük fel.

Lambda gtlO cDNB könyvtár szűrővizsgálata hibridizációvá)

A lambda gtl l/Eam20 kiónból származó 200 bp inszertált szakaszt véletlenszerű indítással digoxigenin-d UTP-vel jelezzük, nem-radioaktív DNS-jelző és detektáló készlet (Boehringer, Mannheim, katalógusszám 1093657) segítségével, a gyártó előírásait pontosan követve. A lambda gtl 1 E. acervulina cDNS könyvtárból származó, immobilizált DNS-t tartalmazó szűrőket Maniatis és munkatársai fent idézett módszere szerint állítjuk elő, és 95 °C-on 10 percen keresztüli kezeléssel frissen denaturált, jelzett E. acervulina cDNS fragmenssel mint próbával inkubáljuk 42 °C-on 16 órán keresztül a gyártó előírásai szerint. A szűrőket az alábbiak szerint mossuk:

kétszer 15 percen keresztül 0,1 vegyes% SDS-t tartalmazó 2^xSSC-vel [(lxSSC összetétele: 0,015 mol/1 nátrium-citrát (pH 7,0) + 0,15 mól/1 NaCl) szobahőmérsékleten; kétszer 15 percen keresztül 0,1 vegyes% SDS-t tartalmazó l^xSSC-vel 60 °C-on; kétszer 30 és egyszer 15 percen keresztül 0,1 vegyes% SDS-t tartalmazó 1 χ SSC-vel 60 °C-on; és kétszer 15 percen keresztül PBSTween-nel (7,65 g/1 Na Cl, 0,91 g/1 Na₂ HPO₄. .2H₂0, 0,21 g/1 KH₂PO₄, 0,05 térfogat% Tween 80, pH 7,3) szobahőmérsékleten.

A szűrőket ezután alkalikus foszfatázzal konjugált poliklonális birka anti-digoxigenin Fab fragmensek PBS-Tween-nel készült 1 : 5000 hígításával reagáltatjuk szobahőmérsékleten, 30 percen keresztül. A szűrőket négyszer 15 percen keresztül PBS-Tween-nel szobahőmérsékleten, és egyszer 15 percen keresztül 0,15 mol/1 NaCl-t tartalmazó 0,01 mol/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 8,0) mossuk, majd 0,33 g/1 nitrokéktetrazóliumot és 0,17 g/1 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfátot tartalmazó 0,1 mol/1 koncentrációjú Tris-H Cl pufferrel (pH 9,6) inkubálva meghatározzuk az alkalikus foszfatáz kötődését a szűrőkhöz. A pozitív plakkokat az izolált plakkok két vagy három egymást követő szélesztésével és fenti módon végrehajtott hibridizálásával tisztítjuk.

A meghosszabbított DNS-szekvenciák izolálása félspecifikus PCR módszerrel

Mivel a lambda gtl 1 könyvtárból immunológiai szűréssel, vagy a lambda gtlO könyvtárból hibridizációs analízissel izolált kezdeti kiónok nem tartalmazták a megfelelő proteinek teljes hosszúságú leolvasási keretét, további DNS-szekvenciékat állítottunk elő polimeráz láncreakcióval.

A fenti célból az elsődleges cDNS könyvtárat lambda gtl 1-ben megsokszorozzuk: 5χ 10⁴ pfü-t 600 pl E. coli Y1090 sejtben inkubálunk és lemezre szélesztünk. Egy éjszakán keresztüli inkubálás után a felső agaróz réteget egy csőben összegyűjtjük, 5 ml fág-hígító puffért [10 mmol/1 Tris (pH 7,6), 10 mmol/1 MgCl2, 100 mmol/1 NaCl, 1 mg/ml zselatin) adunk hozzá és 4 °C-on 16 órán keresztül inkubáljuk. A szuszpenziót centrifügálással derítjük és a felülúszót közvetlenül felhasználjuk a PCR reakciókban. Blakely és Carman [Bio Techniques 10, 53-55 (1991)] eljárását alkalmazzuk, módosításokkal. Mintegy 10¹⁰ pfü/pl koncentrációjú felülúszó 2,5 pl-éhez 1 pl dNTP törzsoldatot (20 mmol/1 mindegyik dNTP-ből), 10 pl puffért [150 mmol/1 Tris (pH 7,6), 600 mmol/1 KC1,25 mmol/1 MgCl2), az egyes primerekből 1 pg-ot, 3 pl DMSO-t és 2,5 egység Taq polimerázt (Cetus/Perkin-Elmer) adunk, a reakcióelegy végtérfogata 100 pl.

Mindegyik primer-készletben egy primer specifikus a meghosszabítandó Eimeria szekvenciára, azaz az Eam20-ra, Eam45-re vagy EamlOO-ra; a készlet második primerje egy általános primer, amely a lambda gtll β-galaktozidáz génjének 3 végével homológ [Lambda gtl 1 Primer (reverz) 24 Mer #1222 (New England Biolabs)].

A PCR fragmenseket gél-elektroforézissel tisztítjuk és a TA-klónozó készlet (Invitrogen) vektorába klónozzuk, pontosan a gyártó előírásai szerint eljárva. A kapott kiónokat szekvenáljuk. A PCR-okozta hibák korrigálására az egyes DNS-klónokban minden egyes meghosszabbított DNS-fragmens esetében legalább három független kiónt szekvenálunk.

DNS-szekvencia analízis

A lambda gtlO és lambda gtll klónokból származó inszertált szekvenciákat a pGEM-4Z vektorba (Promega) alklónozzuk szekvenálás céljából. A szekvenálási reakciókat didezoxi-módszerrel hajtjuk végre [Bankier és Barrell, Techniques in the Life Sciences (Biochemistry) #5, Techniques in Nucleic Acids Biochem. 1-34 (1983)]. A szekvenáló primereket Applied Bio Systems 380B készülékben szintetizáljuk, β-ciano-etil-foszfor-amidátos módszerrel.

B) Eredmények

Az Eam200 leolvasási keretet (vagy annak egy részét) kódoló kiónokat a lambda gtl 1 c DNS könyvtár szűrésére egér monoklonális antitesteket alkalmazva izoláljuk. Minden 2^x10⁵ független kiónból egyet találtunk pozitívnak. A további analízis céljára kiválasztott klón reakciója több Eam200 elleni egér monoklonális antitesttel - például E.ACER 12B-2A-val, E.ACER 12C2B-vel és E.ACER 12B-2B-vel - meggyőző és következetes bizonyítékot szolgáltatott a kiónban lévő leolvasási keret azonosságát illetően. A lambda gtll/Eam200 lizogén törzs által kódolt fúziós protein reakcióját E.ACER 12B-2B antitesttel a 10. ábra mutatja. Az Eam200 egy részének szekvenciája az 1. és 2. azonosítási számú szekvencia. Látható, hogy az inszertált szekvencia teljes hossza 1491 bp, és ebből 1341 bp kódolja a proteint.

Az 5706. számú nyúlból származó monospecifikus antiEam45 szérumot alkalmazzuk a fenti proteint kódoló kiónok (lásd 2. példa) izolálására. Két kiónt izoláltunk 5 ^x 10⁴ szúrt plakk közül. A fenti kiónok - amelyeket Eam45 Ml-nek, illetve Eam45 M3-nak nevezünk inszertjei 817, illetve 786 bp hosszúságúak. Mind a két inszert expresszálódik E. coliban: az Eam45 Ml egy kb. 13 kD proteint, az Eam45 M3 egy kb. 24 kD proteint kódol. Mind a két expressziós termék reagál Western blotban monospecifikus nyúl anti-Eam45 szérummal (adatokat nem közöltük). Az antitest-szelektálási kísérletekben az M3 klónból eluált antitestek reagálnak a merozoit-eredetű Eam45 proteinnel (9. ábra); egyáltalán nem észlelhető reakció, ha a fenti kísérletet az Μ1 klónnal végezzük.

Az Eam45 Ml-ből és M3-ból a módszerek ismertetésében leírt módon PCR módszerrel előállított meghosszabbított kiónok között az Ml-re egy 127 bp meghosszabbított PCR fragmenst, az M3-ra további 845 bp-t találtunk. Az Ml-re kapott teljes szekvencia így 944 bp, míg az M3-ra 1631 bp. Ezeket a szekvenciákat - amelyeket Eam45 MIE-nek, illetve Eam45 M3Enek nevezünk - a 3. (M1E) és az 5. (M3E) azonosítási számú szekvencia szemlélteti. Az MIE-ben az első ATG a 82-84-es helyzetben van, míg az M3E-ben az 505-507es helyzetben; mindkét ATG-t a leolvasási kereten belül stop-kodonok előzik meg, ezért nagy valószínűséggel valódi iniciátor kodonokat jelentenek. Az Eam45 M1E és M3E által kódolt primer aminosavszekvenciákat a 4. (M1E), illetve a 6. (M3E) azonosítási számú szekvencia képviseli.

A fenti proteint kódoló kiónok izolálására az 5796. számú nyúlból származó monosepcifíkus antiEam20-at alkalmaztuk. Az összes, lambda gtl 1 expressziós könyvtárból izolált klón 100 bp-nál rövidebb inszertált szakaszt tartalmaz. Ezért a fenti kiónok egyikéből származó inszertált szakaszt használtuk próbaként a lambda gtlO könyvtár szűrésére. Minden 2 * 10⁵ plakk közül 1 bizonyult pozitívnak. A leghosszabb inszertált szakasz 579 bp hosszúságú, és kódoló kapacitása 11 kD. Ebből egy meghosszabbított kiónt állítottunk elő PCR módszerrel, amely további 221 bp-t tartalmaz. Az Eam20-ra kapott szekvencia teljes hossza így 800 bp; ezt a kiónt Eam20Enek nevezzük; és szekvenciája a 7. azonosítási számú szekvenciának felel meg. Noha az Eam20E leolvasási kerete teljesen nyitott az első nukleotidtól kezdve, igen valószínű, hogy az első ATG (a 7. azonosítási számú szekvencia 80-82. helyzetében) jelenti az iniciátor kodont. Az Eam20E protein kódoló szekvenciája (8. azonosítási számú szekvencia) ezért előnyösen a 27-es helyzetű Met-tól olvasandó.

Az EamlOO proteint kódoló kiónok izolálására immunaffinitási kromatográfiásan tisztított EaslOO-zal immunizált csirkéből származó monospecifikus szérumot (323) alkalmaztunk. Az EaslOO-at immobilizált E.ACER 5F-2 monoklonális antitest alkalmazásával affinitási kromatográfiával tisztítottuk, és a 2. példában ismertetett módon használtuk csirkében antitestek termelésére. Ezeket az antitesteket alkalmaztuk E. acervulinamerozoitmRNS-ből származó lambda gtl 1 cDNS könyvtár szűrésére. Minden 2χ10⁵ szűrt klón közül 1 kiónt találtunk pozitívnak. A különböző szérumokból a fenti klónnal szelektált antitestek reagáltak Western bloton egy 100 kD proteinnel, amely mind a merozoitokban, mind a sporozoitokban jelen van (lásd 8. ábrát), ezzel bizonyítottuk, hogy ezen klón leolvasási kerete valóban kódolja a 100 kD proteint (vagy annak egy részét). Ezen klón inszértált szakasza 1259 bp hosszúságú, és kódoló kapacitása 34 kD (adatokat nem közöltünk). Ebből egy meghosszabbított, 1116 bp-t tartalmazó kiónt állítottunk elő PCR módszerrel. Az EamlOO-ra kapott szekvencia teljes hossza ennek megfelelően 2375 bp, ezt Eaml 00Enek nevezzük, és szekvenciája a 9. azonosítási számot viseli. A fenti szekvenciából következtetett aminosavszekvencia a 10. azonosítási számú szekvencia. Ebben az esetben a kódoló szekvencia a 106-os helyzetben lévő Met-tól is olvasható.

4. példa

Csirkék immunizálása affiniíási kromatográfiával tisztított antigénekkel

A) Módszerek

6x 10'° 72 órás E. acervulina merozoitból kiindulva a 2. példa szerinti eljárással választjuk szét a hidrofób és hidrofil antigéneket TX114-gyel végzett extrakcióval. Az egyes antigéneket immunaffinitási kromatográfiás eljárással tisztítjuk.

1. táblázat: Tisztított E. acervulina merozoit antigének hozama, és immunizálásra alkalmazott dózisa

Antigén	Protein hozama (mg)	Mikrogramm/dózis
Eam200	0,37	5,4
EamlOO	1,74	25
Eam45	2,55	25
Eam20	1,68	25

A protein koncentrációját bicinkonsav vizsgálattal (Pierce Chemical) határoztuk meg, a gyártó előírásai szerint.

Immunizálási eljárás

A tisztított antigéneket Quil A-val keverjük (Superfos Biosector A/S) úgy, hogy minden dózis 100 pg Quil A-t tartalmaz 0,5 ml végtérfogatban. Csoportonként 20 Leghom csirkét a kikeléstől kezdve az indító dózis beadásáig izolátorban tartunk. A csirkéket háromszor 0,5 ml Quil A/antigén szubkután módon a nyakba injektálásával immunizáljuk, a dózisokat egy hetes időközökben adjuk. Az antigén dózisát az 1. táblázat tartalmazza.

Provokálás

A harmadik injekció beadása után 10 nappal a csirkéknek egyenként 100-300 frissen spórásodon E. acervulina oocisztát adunk orálisan. Az oociszta ürítést a fertőzés után 4-7. napon vett széklet-mintákból számoljuk.

Immunológiai paraméterek

Antitest titerek

Szérum-mintát veszünk az egyes immunizálások előtt, a provokálás előtt és a provokálás utáni 7. napon. A szérumokat E. acervulina merozoit antitest titerre ELISA-módszerrel vizsgáljuk. Ehhez 0,1 ml 50 mmol/1 koncentrációjú karbonát/hidrogén-karbonát pufferben (pH 9,6) 1*105 merozoitot rétegezünk a mikrotitráló lemez egyes rezervoáijaiba, egy éjszakán keresztül 50 °C-on történő melegítéssel. A lemezeket lemossuk, marhaszérum albuminnal blokkoljuk és különböző hígítású szérumokkal 37 °C-on 1 órán keresztül inkubáljuk, néhányszor mossuk, majd 1 órán keresztül 37 °C-on peroxidázzal jelzett nyúl anti-csirke IgG-vel (H+L) inkubáljuk. Megfelelő mosás után a pozitív kötődést karbamid-TMB szubsztrát alkalmazásával detektáljuk és az abszorpciót 450 nm-en mérjük. A titereket a végpont hígítások 2-es alapú logaritmusaként közöljük.

Limfoaita stimulálás

A provokálás előtt minden egyes csoportból 10 csirkéből perifériás vérsejteket veszünk. A perifériás vér leukocitákat a teljes vér centrifügálásával izoláljuk, 64 g-vel, 6 percen keresztül szobahőmérsékleten. Az álhártya-bevonatot eltávolítjuk és a maradék sejteket és plazmát újra összekeverjük és ismét lecentrifugáljuk. A két ciklusból származó fehérvérsejteket összegyűjtjük, hemocitométerben sejtszámlálást végzünk és a koncentrációt 1*107 sejt/ml-re állítjuk RPMI 1640-ben (holland módosítás).

4*10⁸ E. acervulina merozoitot szuszpendálunk 6,7 ml RPMI 1640-ben és mikroheggyel felszerelt Branson készülékben hűtés alkalmazása közben, 6-os helyzetben 3 * 20 másodpercen keresztül ultrahanggal kezeljük. A kapott elegyet a stimulálásra használt koncentrációra hígítjuk. 96 rezervoáros gömbölyű fenekű szövettenyésztő lemezt 0,05 ml, sejtszuszpenzióval és 0,150 ml antigén-szuszpenzióval beoltunk 64 órán keresztül 41 °C-on tenyésztjük, 5% CO₂-t tartalmazó atmoszférában. Ezután minden egyes rezervoárba 0,5 mCi ³H-timidint mérünk és 9 óra múlva a sejteket üvegszálas szűrőn (Pharmacia/LKB) összegyűjtjük, 96 rezervoáros sejt-begyűjtőt (Skatron, Norvégia) alkalmazva. A szűrőket szcintillációs folyadékkal (LKB Béta Scint) telítjük és Betaplate 1205-ben (Pharmacia/LKB, Svédország) számoljuk.

B) Eredmények

Immunológiai paraméterek

Antitest titerek

A 2. táblázatban foglaltuk össze a különböző csoportokban ELISA módszerrel E. acervulina merozoit antigén ellen kapott provokálás előtti átlagos titereket. Mindegyik antigén magas antitest-titert indukált, amely legalább 30-as faktorral különbözött a kontroliétól.

2. táblázat: Provokálás előtti átlagos antitest-titerek E. acervulina merozoitok ellen, ELISA vizsgálattal

Csoport	Antitest-titer (hígítás 2-es alapú logaritmusa)
Eam200	16,2 ± 1,1
EamlOO	14,8 ± 1,4
kontroll	9,9 ± 1,0
Eam200	16,1 ±1,4
EamlOO	15,0 ± 1,6
kontroll	10,1 ± 1,4

Limfocita stimulálás

Az összes csoportban E. acervulina merozoit antigének három különböző koncentrációjával stimuláltuk a PBL-t, azaz rezervoáronként 5*10⁵,l*10⁶illetve3*10⁶ ultrahanggal kezelt merozoitot alkalmaztunk. Minden egyes csoportra meghatároztuk az optimális koncentrációt.

A 3. táblázatban közöljük az átlagos Acpm-et (antigénnel stimulált rezervoárokban mért percenkénti beütésszám (cpm) mínusz nem stimulált kontroll cpm-je). Látható, hogy az összes antigén pozitív T-sejt választ indukált, amely a provokálás időpontjában a perifériás vérben kimutatható. Általában 10 csirke közül 6 vagy 7 adott választ, míg a kontroliokban egy sem.

3. táblázat: ³H-Timidin átlagos beépülése, különféle tisztított E. acervulina merozoit antigénekkel immunizált csoportokból származó PBL merozoit antigénnel való stimulálása után

Csoport	³H-Timidin beépülés (Apm)	Választ adó/ választ nem adó
Eam200	692	6/4
EamlOO	1192	8/2
kontroll	14	1/9
Eam45	716	8/2
Eam20	922	9/1
kontroll	6	1/9

Oociszta képződés

A 4. táblázatban látható az egyes csoportok által ürített oociszta átlagos száma, a kontroll százalékában kifejezve, amely kontroll csak Quil A adjuvánst kapott. Az Eam200, EamlOO, Eam45 és Eam20 csökkenti az oociszta ürítést.

4. táblázat: Oociszta ürítés a kontroll %-ában kifejezve

Csoport	Oociszta ürítés (Kontroliban 100%)
Eam200/Quil A	83
EamlOO/Quil A	83
Eam45/Quil A	62
Eam20/Quil A	72

Az alábbiakban közöljük az egyes ábrák magyarázatát. /. ábra·. E.ACER 11A-2A (A rész) és E.ACER 12B-2B (B rész)

Mab-ek felismerése különböző fejlődési stádiumokban lévő különböző Eimeria fajtákban

1. sáv: E. acervulina merozoitok; nem-redukáló

SDS-PAGE (NR)

2. sáv: E. acervulina merozoitok; redukáló

3. sáv: E. acervulina sporozoitok; NR

4. sáv: E. tenella 2. generációs merozoitok; NR

5. sáv: E. tenella sporozoitok; NR

A nyilak mutatják a móltömeg-markerek helyzetét: β-galaktozidáz (M=116 kD) alsó nyíl; és miozin (M=200 kD) felső nyíl (3. sávban nincs jelölve).

2. ábra: E.ACER 100C-2A (A rész) és E.ACER 10SE-2 (B rész) Mab-ek felismerése különböző fejlődési stádiumokban lévő különböző Eimeria fajtákban

1. sáv: E. acervulina merozoitok; nem-redukáló

SDS-PAGE (NR)

2. sáv: E. acervulina merozoitok; redukáló

3. sáv: E. acervulina sporozoitok; NR

4. sáv: E. tenella 2. generációs merozoitok; NR

5. sáv: E. tenella sporozoitok; NR

A nyilak mutatják a pozitívan felismert sávok helyzetét.

3. ábra: E. acervulina merozoitok TX114-es extrakciójával kapott különböző frakciók Western blotja (nem-redukáló PAGE)

A blotot próbaként Eam200-at (jelölése 200) EamlOO-at (jelölése 100), Eam45-öt (jelölése 45) és Eam20-at (jelölése 20) felismerő Mab-ek kombinációjával hibridizáltuk.

1. sáv: nem-szolubilizált anyag (koncentrált)

2. sáv: szolubilizált teljes anyag

3. sáv: hidrofil frakció (vizes fázis)

4. sáv: szacharózos frakció (középső fázis)

5. sáv: hidrofób frakció (detergenses fázis).

4. ábra: E.ACER 10C-2A alkalmazásával, immunaffinitási tisztítással kapott különböző frakciók Western blotja (nem-redukáló PAGE)

A blotot próbaként K8275 poliklonális nyúl szérummal hibridizáltuk.

2. sáv: móltömeg markerek

3. sáv: TX114-es hidrofób frakció

4- 10. sáv: a kötődés után mosási ciklusokban kapott frakciók

11-14. sáv: savasan eluálódó frakciók (pH 2,6) 15-18. sáv: 3 mól/1 koncentrációjú KSCN-nel eluálódó frakció

19. sáv: nem kötődő frakció.

5. ábra: E.ACER 10E-2 alkalmazásával, immunaffinitási tisztítással kapott különböző frakciók Western blotja (nem-redukáló PAGE)

A blotot próbaként K8275 poliklonális nyúl szérummal hibridizáltuk.

2. sáv: móltömeg markerek

3. sáv: E.ACER 1 OC-2A oszlopon való átfolyatás után TX114-gyel kapott hidrofób frakció

4. sáv: nem kötődő frakció

5- 9. sáv: a kötődés után mosási ciklusokban kapott frakciók

10-12. sáv: savasan eluálódó frakciók (pH 2,6) 14-18. sáv: 3 mól/1 koncentrációjú KSCN-nel eluálódó frakció

6. ábra: E.ACER 5F-2 alkalmazásával, immunaffmitási tisztítással kapott különböző frakciók Western blotja (nem-redukáló PAGE)

A blotot próbaként E. acervulina sporozoitok elleni poliklonális nyúl szérummal (K802) hibridizáltuk.

1. sáv: sporozoitok TX114-gyel kapott hidrofil frakciója

2. sáv: nem kötődő frakció

3-5. sáv: savasan eluálódó frakciók (pH 2,6)

6- 7. sáv: 3 mól/1 koncentrációjú KSCN-nel eluálódó frakció

A nyilak az EaslOO dublettet jelölik.

7. ábra: E.ACER 11A-2A alkalmazásával, immunaffinitási tisztítással kapott különböző frakciók Western blotja (nem-redukáló PAGE)

A blotot próbaként Eam200, EamlOO, Eam45 és Eam20 monoklonális antitestek elegyével hibridizáltuk.

1. sáv: móltömeg markerek

2. sáv: TX114-gyel kapott hidrofil frakció

3. sáv: nem kötődő frakció

4. sáv: savasan eluálódó frakció (pH 2,6). Közvetlenül az Eam200 sáv felett egy vékony IgG sáv látható a 3. és 4. sávban, amelyet a Mab oszlopról való elszivárgása okoz.

8. ábra: EamlOO klónnal szelektált antitestek reakciója

E. acervulina proteinek Western biot csíkjain (nem-reduká ló PAGE)

Az 5. csík kivételével - amely E. acervulinából származó sporozoit proteineket tartalmaz - az összes többi csík merozoit proteineke tartalmaz. A csíkokat az alábbiak szerint reagáltatjuk:

1. E. acervulina merozoitokból származó összes protein elleni antiszérummal (K8275 nyúlból)

2. immunaffinitással tisztított EamlOO elleni monospecifikus antiszérummal (323. csirkéből)

3. 323. csirkéből származó antiszérumból lambda gtl 1/EamlOO klónnal szelektált antitestekkel

4. K8275 nyúl antiszérumból lambda gtl 1/EamlOO klónnal szelektált antitestekkel

5. Κ802 nyúl antiszérumból lambda gtll/EamlOO kiónnal szelektált antitestekkel

6. ugyanaz, mint az 5.

7. 323. csirke antiszérumból vad típusú lambda gt 11 -gyei szelektált antitestekkel 5

8. K802 nyúl antiszérumból vad típusú lambda gtl 1-gyel szelektált antitestekkel

9. összes sporozoit protein elleni antitestekkel (K.802 nyúlból)

10. E.ACER 5F-2 monoklonális antitesttel.

9. ábra: Eam45 (M3) kiónnal szelektált antitestek reakciója E. acervulina proteinek Western biot csíkjain (nem-redukáló PAGE)

Az összes csík merozoit proteineket tartalmaz. Ezeket az alábbiak szerint reagáltatjuk:

1. K5706 nyúl antiszérumból lambda gtl 1/Eam45 (M3) kiónnal szelektált antitestekkel

2. K5794 nyúl antiszérumból lambda gtll/Eam45 (M3) klónnal szelektált antitestekkel

3. K5796 nyúl antiszérumból lambda gtll/Eam45 (M3) klónnal szelektált antitestekkel

4. K8275 nyúl antiszérumból lambda gtll/Eam45 (M3) klónnal szelektált antitestekkel

5. immunaffinitással tisztított Eam45 elleni monospecifikus antiszérummal (K.5706 nyúlból)

6. merozoitokból TX114-gyel nyert hidrofób extraktum elleni antiszérummal (K5794 nyúlból)

7. immunaffinitással tisztított Eam45 elleni monospecifikus antiszérummal (K5792 nyúlból)

8. K5706 nyúl antiszérumból vad típusú gtl 1-gyel szelektált antitestekkel

9. K5794 nyúl antiszérumból vad típusú gtl 1-gyel szelektált antitestekkel

10. K5796 nyúl antiszérumból vad típusú gtl 1-gyel szelektált antitestekkel

11. K8275 nyúl antiszérumból vad típusú gtl 1-gyel szelektált antitestekkel

12. E.ACER 10C-2A monoklonális antitesttel. óbra.Lambda gtl l/Eam200 expressziós termékének

Western biot analízise

Egy lizogén lambda gtl l/Eam200 törzsből származó expreszsziós terméket redukált SDS-PAGE gélben futtatunk, blottoljuk és próbaként E.ACER 12B2B monoklonális antitesttel reagáltatjuk (2. sáv). 10 Kontrollként az 1. sávban a lambda gtl 1 expressziós termékeit futtatjuk.

Az azonosítási számokkal definiált szekvenciákat az alábbiakban ismertetjük.

1. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia j ellemzői:

(A) hosszúság: 1491 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: kettős (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: mRNS-hez cDNS (v) Fragmens típusa: N-terminális (vi) Eredeti forrás:

(A) organizmus: Eimeria acervulina (C) egyes izolátum: merozoitok 25 (vii) Közvetlen forrás :

(A) könyvtár: merozoit cDNS lambda gtl 1 (B) klón: Eam200 (ix) Jellemző:

(A) név/kulcsszó: CDS 30 (B) lokáció: 1..1344 (xi) Szekvencia leírása:

2. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 447 aminosav 35 (B) típus: aminosav

GAA TTC

GGG GGC

ACC Thr 5

TCC ACT ACA CAC CTG ACC CGG GAT

GAT GCA Asp Alá 15

GTG Val

48

Glu 1

Phe

Gly

Ser Thr

Thr His

Leu 10

Thr Arg

Asp

AAC

ACA

GCG

ATT

GAC

TCG

AAG

CTA

GAC

GAA

TTC

TGC

AAT

CCT

ACA

TCA

96

Asn

Thr

Alá

Ile

Asp

Ser

Lys

Leu

Asp

Glu

Phe

Cys

Asn

Pro

Thr

Ser

20

25

30

GAA

CCC

CCT

GAG

GCA

TCG

GGA

AAG

GAG

GAT

TCT

GTC

GAG

GTG

GAG

144

Glu

Pro

Glu

Alá

Ser

Gly

Lys

Glu

Asp

Ser

Val

Glu

Val

Glu

35

40

45

ACA

ACC

CCA

CCC

AGC

CGT

CCA

TTA

AGG

ATG

CAA

CAT

TTC

GTG

192

Thr

Pro

Ser

Arg

Pro

Leu

Arg

Met

Gin

His

Phe

Val

50

55

60

GAC

GAA

TTT

TGT

CTG

GAG

GCA

AAG

CGC

GCG

TGT

CAA

AAT

GGG

CTG

240

Asp

Glu

Phe

Cys

Leu

Glu

Alá

Lys

Arg

Alá

Cys

Gin

Asn

Gly

Leu

65

70

75

80

AGC

GCT

TAC

TGC

GAC

GCC

AGT

GTG

AGC

GCG

CGT

CAC

GAC

GTG

GGA

ACT

288

Ser

Alá

Tyr

Cys

Asp

Alá

Ser

Val

Ser

Alá

Arg

His

Asp

Val

Gly

Thr

85

90

95

GAA

CAG

CGG

ACG

AGG

GAG

TGG

CGC

TGT

TAC

GTG

GAT

TCC

CTA

336

Glu

Gin

Arg

Thr

Arg

Glu

Trp

Arg

Cys

Tyr

Val

Asp

Ser

Leu

100

105

110

GAC TTC

GGC CTC TCC GGC GAT GGT TGT GTA GAC GAC TGT^- GGG

AAT CTC

384

Asp

Phe

Gly 115

Leu

Ser

Gly Asp Gly 120

Cys

Val

Asp

Cys 125

Gly

Asn

Leu

ATC

TCG

TGC

CCT

GGT

GCG GTA AAC

GGC

ACC

TCC

ACT

ACA

CAC

CTG

ACC

432

Ile

Ser

Cys

Pro

Gly

Alá Val Asn

Gly

Thr

Ser

Thr

His

Leu

Thr

130

135

140

CGG

GAT

GCA

GTG

AAC ACA GCG

ATT

GAC

TCG

AAG

CTA

GAC

GAA

TTC

480

Arg

Asp

Alá

Val

Asn Thr Alá

Ile

Asp

Ser

Lys

Leu

Asp

Glu

Phe

145

150

155

160

TGC

AAT

CCT

ACA

TCA

GAA CCC CCT

GAG

GCA

TCG

GAG

AAG

GAA

TCC

528

Cys

Asn

Pro

Thr

Ser

Glu Pro Pro

Glu

Alá

Ser

Glu

Lys

Glu

Ser

165

170

175

GTC

GAG

GTG

CCA

GAG

ACA ACA GCG

CTG

CCT

TCG

AAC

CCC

CCA

TCA

AAT

576

Val

Glu

Val

Pro

Glu

Thr Thr Alá

Leu

Pro

Ser

Asn

Pro

Ser

Asn

180

185

190

CTA

CAA

GCT

TTG

GTG

GAT GGG CTT

TGT

GCT

GAG

GGG

AGA

AAA

GCG

624

Leu

Gin

Alá

Leu

Val

Asp Gly Leu

Cys

Alá

Glu

Gly

Arg

Lys

Alá

195

200

205

TGC

GGA

CAA

GGG

CTG

CAA GCC TAC

TGC

GAC

ACT

GAT

ATG

TTC

GCA

CGC

672

Cys

Gly

Gin

Gly

Leu

Gin Alá Tyr

Cys

Asp

Thr

Asp

Met

Phe

Alá

Arg

210

215

220

CAC

GAC

GTC

GGA

ACT

GGG AGT CAG

AGG

AAC

AGG

GAG

TGG

CGC

TGC

TAT

720

His

Asp

Val

Gly

Thr

Gly Ser Gin

Arg

Asn

Arg

Glu

Trp

Arg

Cys

Tyr

225

230

235

240

GCA

CGA

GTG

TCG

TTG

GAC TTC GGC

ATA

TCC

GGC

GAT

GGT

TGT

GTA

GAC

768

Alá

Arg

Val

Ser

Leu

Asp Phe Gly

Ile

Ser

Gly

Asp

Gly

Cys

Val

Asp

245

250

255

GAC

TGT

GGG

AAT

CTC

ACA TCT TGC

CTT

GGT

GCG

GTA

AAC

GGT

TCC

TCG

816

Asp

Cys

Gly

Asn

Leu

Thr Ser Cys

Leu

Gly

Alá

Val

Asn

Gly

Ser

260

265

270

ACT

ACG

CAT

CTC

TCA

CGG GGA GAA

CGT

ATT

CAA

AAA

CTT

ATT

GAC

ACA

864

Thr

His

Leu

Ser

Arg Gly Glu

Arg

Ile

Gin

Lys

Leu

Ile

Asp

Thr

275

280

285

GAG

AAA

GCT

GGA

CGG

TGC ACA CCA

GAG

GGC

GAA

GAG

GCA

GGT

GGG

912

Glu

Lys

Alá

Gly

Arg

Cys Thr Pro

Glu

Gly

Glu

Alá

Gly

290

295

300

AGC

CCT

GCT

CCA

GCC

CCA GTG CCA

GAA

CTT

CCT

GCA

GGA

GTA

CCG

GCG

960

Ser

Pro

Alá

Pro

Alá

Pro Val Pro

Glu

Leu

Pro

Alá

Gly

Val

Pro

Alá

305

310

315

320

TCT

GAG

GTG

TCG

GAC

AAG GGC CTG

AAG

GTT

CCT

CCA

AGG

GTC

CCA

GGT

1008

Ser

Glu

Val

Ser

Asp

Lys Gly Leu

Lys

Val

Pro

Arg

Val

Pro

Gly

325

330

335

GGT

GGA

GCT

TTA

CAA

GAA ATG GCT

GAC

GTC

AGG

TGC

ATG

GTG

TTC

TTT

1056

Gly

Alá

Leu

Gin

Glu Hét Alá

Asp

Val

Arg

Cys

Met

Val

Phe

340

345

350

GCA

AAG

CAG

TGT

GTA

ACT GAC GAA

AGC

ATG

TGC

CAA

TAC

GCC

GTG

GCC

1104

Alá

Lys

Gin

Cys

Val

Thr Asp Glu

Ser

Met

Cys

Gin

Tyr

Alá

Val

Alá

355

360

365

HU 213 419 Β

CGC AAA ATT

GAC TCC ACG

TGG Trp 375

AAG TGT TAC CCG TAT GGT GCA GTT GAT

1152

Arg Lys 370

Ile

Asp Ser

Thr

Lys

Cys

Tyr Pro

Tyr 380

Gly Alá Val Asp

GAC

TCG

CAG

TCA

GGT

GAT.

GCT

TGT

ACA

GAC

TGT

GGC

AAT

GCA

ATA

1200

Asp

Ser

Gin

Ser

Gly

Asp

Alá

Cys

Thr

Asp

Cys

Gly

Asn

Alá

Ile

385

390

395

400

AAC

TGT

CCG

GGT

ATT

CCG

AAG

AAT

GGA

GAT

GCC

GAC

GGC

ATG

AGA

ATT

1248

Asn

Cys

Pro

Gly

Ile

Pro

Lys

Asn

Gly

Asp

Alá

Asp

Gly

Hét

Arg

Ile

405

410

415

CCA

GCC

CTC

GAT

CAC

CTG

TTC

GAA

GAG

TTG

AAG

AGC

GCC

ACC

TGC

AAG

1296

Pro

Alá

Leu

Asp

Hls

Leu

Phe

Glu

Leu

Lys

Ser

Alá

Thr

Cys

Lys

420

425

430

ATG

AGC

AAA

CAG

CAA

GAG

CTC

AAG

AAA

GTT

CAC

GTG

CAT

CGG

CAA

Met

Ser

Lys

Gin

Glu

Leu

Lys

Val

Hls

Val

His

Arg

Gin

435 440 445

TGACGAGAGG 1351

GTJGTGCTGAC TGGACGACGT GGGTTGCGAG GCCAAACTCA ATGCTAAGCA AGTGAATGAC 1411

AATATAAGTA TTCTGCTGCC GGAAGTACTG AAGTCTTCCC TTATCCAATG CAAAGCAAGG 1471

CTATCCATGG CCTGGCAGGG 1491 (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: protein (xi) Szekvencia leírása:

3. azonosítási számú szekvencia 30 (i) Szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 944 bázispár (B) típus: nukleinsav

Glu 1

Phe

Gly

Thr 5

Ser

Thr

His

Leu 10

Thr

Arg

Asp

Asj?

Alá 15

Val

Asn

Thr

Alá

Ile 20

Asp

Ser

Lys

Leu

Asp 25

Glu

Phe

Cys

Asn

Pro 30

Thr

Ser

Glu

Pro

Pro 35

Glu

Alá

Ser

Gly

Lys 40

Glu

Asp

Ser

Val

Glu 45

Val

Glu

Thr

Thr 50

Thr

Pro

Ser 55

Arg

Pro

Leu

Arg

Met 60

Gin

His

Phe

Val

Asp 65

Glu

Phe

Cys

Leu

Glu 70

Glu

Alá

Lys

Arg

Alá 75

Cys

Gin

Asn

Gly

Leu 80

Ser

Alá

Tyr

Cys

Asp 85

Alá

Ser

Val

Ser

Alá 90

Arg

His

Asp

Val

Gly 95

Thr

Glu

Gin

Arg 100

Thr

Arg

Glu

Trp

Arg 105

Cys

Tyr

Val

Asp

Asp 110

Ser

Leu

Asp

Phe

Gly 115

Leu

ser

Gly

Asp

Gly 120

Cys

Val

Asp

Cys 125

Gly

Asn

Leu

Ile

Ser 130

Cys

Pro

Gly

Alá

Val 135

Asn

Gly

Thr

Ser

Thr 140

Thr

His

Leu

Thr

Arg Asp Asp Alá 145

Val

Asn 150

Thr Alá

Ile Asp

Ser 155

Lys

Leu

Asp

Glu

Phe 160

Cys

Asn

Pro

Thr

Ser

Glu

Pro

Glu

Alá

Ser

Glu

Lys

lys

Glu

Ser

165

170

175

Val

Glu

Val

Pro

Glu

Thr

Alá

Leu

Pro

Ser

Asn

Pro

Ser

Asn

180

185

190

Leu

Gin

Alá

Leu

Val

Asp

Gly

Leu

Cys

Alá

Glu

Gly

Arg

Lys

Alá

195

200

205

Cys

Gly

Gin

Gly

Leu

Gin

Alá

Tyr

Cys

Asp

Thr

Asp

Met

Phe

Alá

Arg

210

215

220

His

Asp

Val

Gly

Thr

Gly

Ser

Gin

Arg

Asn

Arg

Glu

Trp

Arg

Cys

Tyr

225

230

235

240

Alá

Arg

Val

Ser

Leu

Asp

Phe

Gly

Ile

Ser

Gly

Asp

Gly

Cys

Val

Asp

245

250

255

Asp

Cys

Gly

Asn

Leu

Thr

Ser

Cys

Leu

Gly

Alá

Val

Asn

Gly

Ser

260

265

270

Thr

His

Leu

Ser

Arg

Gly

Glu

Arg

Ile

Gin

Lys

Leu

Ile

Asp

Thr

275

280

285

Glu

Lys

Alá

Gly

Arg

Cys

Thr

Pro

Glu

Gly

Glu

Alá

Gly

290

295

300

Ser

Pro

Alá

Pro

Alá

Pro

Val

Pro

Glu

Leu

Pro

Alá

Gly

Val

Pro

Alá

305

310

315

320

Ser

Glu

Val

Ser

Asp

Lys

Gly

Leu

Lys

Val

Pro

Arg

Val

Pro

Gly

325

330

335

Gly

Alá

Leu

Gin

Glu

Met

Alá

Asp

Val

Arg

Cys

Met

Val

Phe

340

345

350

Alá

Lys

Gin

Cys

Val

Thr

Asp

Glu

Ser

Met

Cys

Gin

Tyr

Alá

Val

Alá

355

360

365

Arg

Lys

Ile

Asp

Ser

Thr

Trp

Lys

Cys

Tyr

Pro

Tyr

Gly

Alá

Val

Asp

370

375

380

Asp

Ser

Gin

Ser

Gly

Asp

Alá

Cys

Thr

Asp

Cys

Gly

Asn

Alá

Ile

385

390

395

400

Asn

Cys

Pro

Gly

Ile

Pro

Lys

Asn

Gly

Asp

Alá

Asp

Gly

Met

Arg

Ile

405

410

415

Pro

Alá

Leu

Asp

His

Leu

Phe

Glu

Leu

Lys

Ser

Alá

Thr

Cys

Lys

420

425

430

Met

Ser

Lys

Gin

Glu

Leu

Lys

Val

His

Val

His

Arg

Gin

435

440

445

HU 213 419 Β (C) szál típusa: kettős (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: mRNS-hez cDNS (v) Fragmens típusa: N-terminális (vi) Eredeti forrás:

(A) organizmus: Eimeria acervulina (vii) Közvetlen forrás:

(B) klón: Eam45 M1E (ix) Jellemző:

(A) név/kulcsszó: CDS (B) lokáció: 82..489 (xi) Szekvencia leírása:

4. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 135 aminosav (B) típus: aminosav

TTTTTTTTTT TTTTGCTCTC

CATTTTCCCA ACAATATTTC TCTGTTTCTC GTCTTAGGTC

CGCCTAACCA ACATTTAGGA A	ATG Met 1	AGT TCG AAT	CCA Pro 5	CGA Arg	CTC Leu	CGG Arg	GAA Glu	GCC Alá 10	111
Ser	Ser Asn
TTT GCC CTT TTC GAC AGG	GAT	GGA	GAC GGA	GAG	TTG	ACT	GCC	AGC	GAG	159
Phe Alá Leu Phe Asp Arg	Asp	Gly	Asp Gly	GlU	Leu	Thr	Alá	Ser	Glu
15			20					25

GCT Alá

CTA Leu

TTG Leu

GCT Alá 30

ATC Ile

CGT Arg

TCT Ser

ACG Thr

GGG Gly 35

GTT Val

ATT Ile

GTG Val

GCT Alá

GCC Alá 40

GAG Glu

207

GCA

AGC

CTG

CCG

ACC

ATG

AAC

TGG

GAG

CAG

TTT

GAG

AGT

TGG

255

Alá

Ser

Leu

Pro

Thr

Met

Asn

Trp

Glu

Gin

Phe

Glu

Ser

Trp

45

50

55

GTC

AAC

AAG

AAA

CTG

AGC

AAC

CCG

GAG

GCG

GAC

TTA

ATC

AAG

303

Val

Asn

Lys

Leu

Ser

Asn

Pro

Glu

Alá

Asp

Leu

Ile

Lys

60

65

70

TCC

TTT

AAA

GTA

TTT

GAC

ACA

AAG

GGG

GAC

GGC

ACT

CTC

TCG

ACA

GAC

351

Ser

Phe

Lys

Val

Phe

Asp

Thr

Lys

Gly

Asp

Gly

Thr

Leu

Ser

Thr

Asp

75

80

85

90

GAA

CTT

ATG

CAA

GTT

ATA

AAG

ACC

TTA

GGA

GAT

CTG

ACG

GAC

GAA

399

Glu

Leu

Met

Gin

Val

Ile

Lys

Thr

Leu

Gly

Asp

Leu

Thr

Asp

Glu

95

100

105

GAG

GTT

GAG

CGT

ATG

GTT

AAT

GAC

GCA

GAC

CCA

AGC

AAA

ACA

GGG

CGA

447

Glu

Val

Glu

Arg

Met

Val

Asn

Asp

Alá

Asp

Pro

Ser

Lys

Thr

Gly

Arg

110

115

120

ATT

AAA

TAT

GCC

GAT

TTT

GTA

AAG

TAC

CTC

TTG

AGC

AAC

TGACTTCATG

496

Ile

Lys

Tyr

Alá

Asp

Phe

Val

Lys

Tyr

Leu

Ser

Asn

125

130

135

GGTTCATGCA	GCACCCCACC	ACAGCAGTTA	AAGCGCTCCT	GCTATACTCA	CGTACATGTT	556
GTTCGTGAAC	GTATGCATGG	CTAGGGTTAT	TTGAACCGCA	CGGGTTCATT	TTGTGCGTTT	616
AGTGGAGCCT	CTGCCCATCG	GGTGCTTCCT	CACCTAGCTC	TCACAGCAGA	GGGCCGAGCG	676
CAGGTGTTGC	TTTGCCATGG	TGCATGTGGG	AGTTGCAATC	TTTAACCTGC	GTGCCGCCTG	736
TGTGTTGCTC	GCTGCACAGC	TGGGGCAGTA	TTGCATGCAC	CACATGCATT	ACGATGGACA	796
AAAGACGGGG	AGGGGAGCTA	TGCCTTTCGG	TGCTTCTGCC	GAGAAAGCGA	GCAGCATGCA	856
TGCATGTGTG	CAACATACAT	GCGCCAATGT	GAGCTATACA	ACCCCTCCAG	GCCTTTTTTA	916
TGTGAACGAT	TTGGAACCGA	CAAGTCAG				944

(ii) (xi)	(D) topológia: lineáris Molekula típusa: protein Szekvencia leírása:	5. azonosítási számú szekvencia
(0	Szekvencia jellemzői: (A) hosszúság: 1631 bázispár (B) típus: nukleinsav
Met	Ser Ser Asn Pro Arg	Leu Arg Glu	Alá Phe Alá Leu Phe Asp Arg
1	5		10 15
Asp	Gly Asp Gly Glu Leu	Thr Alá Ser	Glu Alá Leu Leu Alá Ile Arq
	20	25	30
Ser	Thr Gly Val Ile Val	Alá Alá Glu	Glu Alá Ser Ser Leu Pro Thr
	35	40	45
Thr	Met Asn Trp Glu Gin	Phe Glu Ser	Trp Val Asn Lys Lys Leu Ser
	50	55	60
Ser	Ser Asn Pro Glu Alá	Asp Leu Ile	Lys Ser Phe Lys Val Phe Asp
65	70		75 80
Thr	Lys Gly Asp Gly Thr	Leu Ser Thr	Asp Glu Leu Met Gin Val Ile
	85		90 95
Lys	Thr Leu Gly Asp Leu	Leu Thr Asp	Glu Glu Val Glu Arg Met Val
	100	105	110
Asn	Asp Alá Asp Pro Ser	Lys Thr Gly	Arg Ile Lys Tyr Alá Asp Phe
	115	120	125
Val	Lys Tyr Leu Leu Ser	Asn
	130	135
	(C) szál típusa: kettős		(A) név/kulcsszó: CDS
	(D) topológia: lineáris	35	(B) lokáció: 505..1494
(ü)	Molekula típusa: mRNS-hez cDNS	(xi)	Szekvencia leírása:
		6	. azonosítási számú szekvencia
(vü)	Közvetlen forrás:	(i)	Szekvencia jellemzői:
	(B ) klón : Eam45 M3 E		(A) hosszúság: 330 aminosav
(ix)	Jellemző:	40	(B) típus: aminosav

CAACACATTT	GGGGGAGCTC	AGCTAAAGTA	TTTGTCGTTT	CAGCCACAAG	GCCAACTCCC	60
TCTTCCTCAG	GGACCAAAAT	CAGCTGTGAT	GAAGCCCTCA	GCGAGTGGAA	GACAGGGTTT	120
GCAAATTTCG	AGGGCCAAGA	TCCTCCGGCA	TACTCAGACG	CCACCTTGGT	ATATGCAAAC	180
CCAAATTCGG	TAGGCCTTGT	CAG C CTG CTG	AGCGCGACGC	AGCAGACCAT	TTACTGCGGA	240
ACTACAGATA	CGTGTGGAGA	TGATACCCTC	GTTTGCTACT	ACAAGCCCTC	TGGCATAGAG	300
GAGGAAACGG	TTCCTGTGAG	CGAAGATCTG	TGGCACAAGT	TGCAGGAATC	CCACAAGGTG	360
AAGCCCGCAC	TGGCAGCTGA	CGATGCGGGC	TCCCTAGCTG	CGTGACAGCA	GTCAATGCTG	420
CTCGGGGTGC	CGGAGTCTGG	AACTTGCGGG	CTTCACAAAA	GGCTCTAACT	TGGAGGCTGG	480

531

CGA ACG ATA GAT ACC ATG ACA GTC Arg Thr Ile Asp Thr Met Thr Val

CGCAAAGAAG CTGTATGGAT TGAC ATG Met

GAC Asp 10

CCA Pro

ACG Thr

GCG Alá

GCA Alá

CGA Arg 15

GGC Gly

CAC His

ACT Thr

ATC Ile

ATC Ile 20

TAC Tyr

GCC Alá

ACA Thr

AAA Lys

GAA Glu 25

579

GGG

GAC

ACT

CCT

CCA

ACG

GCA

GAA

GCC

GTT

GAG

CAA

TGG

AAA

627

Gly

Asp

Thr

Pro

Pro 30

Thr

Alá

Glu

Alá 35

Val

Glu

Gin

Trp

Lys 40

Lys

GGG

GCA

CGG

CTC

GGC

ACC

GGC

GTC

CTG

CCT

GCC

TTC

ACG

AAG

675

Gly

Alá

Aia

Arg 45

Leu

Gly

Thr

Gly

Val 50

Leu

Pro

Alá

Phe

Thr 55

Lys

TCG

AAA

GCA

GCC

GAC

GGC

GAG

ATC

TAC

TAT

GAC

AGC

GCA

GTA

GCC

GGT

723

Ser

Lys

Alá 60

Alá

Asp

Gly

Glu

Ile 65

Tyr

Asp

Ser

Alá 70

Val

Alá

Gly

TTC

GTC

TCC

ATT

ATG

ACT

GAT

AAT

ACC

CGC

GAA

ACG

GCA

TGC

TAC

AAA

771

Phe

Val 75

Ser

Ile

Met

Thr

Asp 80

Asn

Thr

Arg

Glu

Thr 85

Alá

Cys

Tyr

Lys

GCT

ACA

GGT

TGC

ACT

AAC

GCC

GCA

CTC

ATC

TGC

TTA

CTT

AAA

GGG

CCA

819

Alá 90

Thr

Gly

Cys

Thr

Asn 95

Alá

Leu

Ile

Cys 100

Leu

Lys

Gly

Pro 105

ACT

CTG

GAG

GAA

AAC

CAA

AAG

CCC

ATC

ACC

GAC

GAA

ACA

TGG

AAA

AAG

867

Thr

Leu

GlU

Glu

Asn 110

Gin

Lys

Pro

Ile

Thr 115

Asp

Glu

Thr

Trp

Lys 120

Lys

GTC

TTG

GAT

GTC

TAC

GGA

GAA

AAG

ATG

GAT

TTC

AAA

GAA

CGT

GAG

915

Val

Leu

Asp

Val 125

Tyr

Gly

Glu

Lys

Met 130

Asp

Phe

Lys

Glu

Arg 135

Glu

GGA

GAA

AGC

TGC

CTC

ACG

GAG

ATA

AAT

GAT

TTC

CGC

GCC

CAA

GAT

GGC

963

Gly

Glu

Ser 140

Cys

Leu

Thr

Glu

Ile 145

Asn

Asp

Phe

Arg

Alá 150

Gin

Asp

Gly

CTC

GCT

CTG

CCA

CCG

TTC

GCT

GCC

GCG

ACG

GAC

TTA

CAT

GGT

GCG

AAA

1011

Leu

Alá 155

Leu

Pro

Phe

Alá 160

Alá

Thr

Asp

Leu 165

His

Gly

Alá

Lys

CCG

AAG

GCT

TCC

GAA

TTG

ATT

GGG

AAA

GGC

TTG

ACG

TGC

GAG

GCC

CTC

1059

Pro 170

Lys

Alá

Ser

Glu

Leu 175

Ile

Gly

Lys

Gly

Leu 180

Thr

Cys

Glu

Alá

Leu 185

AAG

TCT

GGG

AAT

GCC

CCC

ATC

TTG

TTT

ACC

GAC

CAA

GAA

ATA

AGC

CTG

1107

Lys

Ser

Gly

Asn

Alá 190

Pro

Ile

Leu

Phe

Thr 195

Asp

Gin

Glu

Ile

Ser 200

Leu

ATG

TAC

ATG

GGT

GAA

ACT

GCC

ACT

TGC

TCT

TTA

GCC

GTC

AGA

GAA

1155

Met

Tyr

Met 205

Gly

Glu

Thr

Alá

Thr 210

Cys

Ser

Leu

Alá

Val 215

Arg

Glu

TGG

AAA

AAT

GGC

ATT

GAC

TTG

TTC

AGC

GAC

TTC

ACC

ATC

CCT

CCA

AAG

1203

Trp

Lys

Asn 220

Gly

Ile

Asp

Leu

Phe 225

Ser

Asp

Phe

Thr

Ile 230

Pro

Lys

TAC

ACT

TCA

ACC

GAA

GTT

TAC

AAG

GGA

GCA

ACA

AAC

TTT

1251

Tyr

Thr 235

Ser

Thr

Glu

Val 240

Tyr

Lys

Gly

Alá 245

Alá

Thr

Asn

Phe

ATC

TCC

CTC

GTC

AGC

GAA

GGA

ACT

GAT

ACC

AAA

ATA

AAA

TGC

TAC

ACC

1299

Ile 250

Ser

Leu

Val

Ser

Glu 255

Gly

Thr

Asp

Thr

Lys 260

Ile

Lys

Cys

Tyr

Thr 265

GTG Val

ACA Thr

GGC Gly

TGC AGC

GAA Glu

CCA Pro

GGA Gly

TTG Leu

CTT Leu 275

TGC Cys

CTG Leu

CAA Gin

CCT Pro 280

CCT Pro

1347

Cys

Ser 270

GTC

TTC

AAG

GAG

AAC

GAA

GCA

CCC

ATC

AGC

GAG

GAA

ACC

TGG

AAA

AAG

1395

Val

Phe

Lys

Glu 285

Asn

Glu

Ala

Pro

Ile 290

Ser

Glu

Thr

Trp 295

Lys

GTT

ACA

GAC

ACC

GTC

ACT

AGT

GGA

GCT

GCC

TCT

GCC

TCT

GCT

TAT

GGA

1443

Val

Thr

Asp 300

Thr

Val

Thr

Ser

Gly 305

Ala

Ser

Ala

Ser 310

Ala

Tyr

Gly

GCC

CTC

CTG

AGC

GTT

TTC

GTT

GCT

GTC

GGT

CTT

TTC

GCG

CTC

AGC

1491

Ala

Leu 315

Leu

Ser

Val

Phe 320

Val

Ala

Val

Gly

Leu 325

Phe

Ala

Leu

Ser

TTC TAAGCGCACA CAGCTCTCCT GCAGCACTTG AGTGGCAGTG CAATGCTTCT 1544

Phe

330

CTGCCACTCT ATCCCACATC GCAGTAATTC AGGCAGCGCA TTAATTCCAT CAAACTCTTT 1604

TCATTGAGAA GAAGCGCTTA ATACTCT 1631

7. azonosítási számú szekvencia (D) topológia: lineáris (i) Szekvencia jellemzői:

(ii) Molekula típusa: protein 25 (A) hosszúság: 800 bázispár

(xi)

Szekvencia leírása:

(B) típus: nukleinsav

Met 1

Arg

Thr

Ile

Asp 5

Thr

Met

Thr

Val

Asp 10

Pro

Thr

Ala

Arg 15

Gly

His

Thr

Ile

Ile 20

Tyr

Ala

Thr

Lys

Glu 25

Gly

Asp

Thr

Pro

Pro 30

Thr

Ala

Glu

Ala 35

Val

Glu

Gin

Trp

Lys 40

Lys

Gly

Ala

Arg 45

Leu

Gly

Thr

Gly

Val 50

Leu

Pro

Ala

Phe

Thr 55

Lys

Ser

Lys

Ala 60

Ala

Asp

Gly

Glu

Ile 65

Tyr

Asp

Ser

Ala 70

Val

Ala

Gly

Phe

Val 75

Ser

Ile

Met

Thr

Asp 80

Asn

Thr

Arg

Glu

Thr 85

Ala

Cys

Tyr

Lys

Ala 90

Thr

Gly

Cys

Thr

Asn 95

Ala

Leu

Ile

Cys 100

Leu

Lys

Gly

Pro 105

Thr

Leu

Glu

Asn 110

Gin

Lys

Pro

Ile

Thr 115

Asp

Glu

Thr

Trp

Lys 120

Lys

Val

Leu

Asp

Val 125

Tyr

Gly

Glu

Lys

Met 130

Asp

Phe

Lys

Glu

Arg 135

Glu

Gly

Glu

Ser 140

Cys

Leu

Thr

Glu

Ile 145

Asn

Asp

Phe

Arg

Ala 150

Gin

Asp

Gly

Leu

Ala 155

Leu

Pro

Phe

Ala 160

Ala

Thr

Asp

Leu 165

His

Gly

Ala

Lys

Pro 170

Lys

Ala

Ser

Glu

Leu 175

Ile

HU 213 419 Β

Gly Lys Gly Leu Thr

Cys Glu Alá Leu Lys Ser Gly Asn Alá Pro Ile

Leu Phe

Thr 195 Cys Asp

180 Asp Gin Ser Leu Phe Thr

185

190

Glu Alá Ile 230

Ile Ser Leu Met Tyr Tyr 200

Met Gly 205 Gly Ile

Glu Thr Asp Leu

Alá Phe 225

Thr 210 Ser

Val 215 Pro

Arg Glu Trp Lys Asn

Pro

Lys

Tyr

Thr 235

220 Ser

Thr

Glu

Val 240

Tyr

Lys

Gly

Alá

Thr

Asn

Phe

Ile

Ser

Leu

Val

Ser

Glu

Gly

245

250

255

Thr

Asp

Thr

Lys

Ile

Lys

Cys

Tyr

Thr

Val

Thr

Gly

Cys

Ser

Glu

Pro

260

265

270

Gly

Leu

Cys

Leu

Gin

Pro

Val

Phe

Lys

Glu

Asn

Glu

Alá

275

280

285

Pro

Ile

Ser

Glu

Thr

Trp

Lys

Val

Thr

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

290

295

300

Gly

Alá

Ser

Alá

Ser

Alá

Tyr

Gly

Alá

Leu

Ser

Val

Phe

305

310

315

320

Val

Alá

Val

Gly

Leu

Phe

Alá

Leu

Ser

Phe

325

330

(C) szál típusa: kettős (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: mRNS-hez cDNS (vii) Közvetlen forrás:

(B) klón : Eam20 E (ix) Jellemző:

(A) név/kulcsszó: CDS (B) lokáció: 2..508 (xi) Szekvencia leírása:

8. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 168 aminosav (B) típus: aminosav

T TTT TGT TTT GCT TTT TCT TGT TTT ΤΤΛ CTC GGT GTT GGG GCT GGA 46

Phe Cys Phe Alá Phe Ser Cys Phe Leu Leu Gly Val Gly Alá Gly

10 15

TGG TCT

TCA Ser

AGC Ser

TTC Phe 20

TGG Trp

GTT GTT GTT GCA

TGC Cys

ATG TGG Met Trp

CTG ATA

CTT Leu

94

Trp

Ser

Val

Alá 25

Leu

Ile 30

TTC

GGA

GGG

TCT

CTT

CCT

GCT

ACT

GGG

GTT

ATT

GCT

142

Phe

Gly

Ser

Leu

Pro

Alá

Thr

Gly

Val

Ile

Alá

35

40

45

TCT

GTT

CCT

GTT

GAA

GTT

AGA

GCA

TTC

GGC

AGC

GGT

TTT

TGT

TTA

ATG

190

3er

Val

Pro

Val

Glu

Val

Arg

Alá

Phe

Gly

Ser

Gly

Phe

Cys

Leu

Met

50

55

60

GTT TAT AAT

GTC GCT

GGC TAT GTC CTC GGT CCC

TTC Phe 75

TTA CCT GGC ATA

238

Val

Tyr 65

Asn

Val

Alá

Gly

Tyr 70

Val

Leu

Gly

Pro

Leu

Pro Gly

Ile

CTC

ATA

GAA

GCA

AAC

CTT

ACC

TGG

GGA

ATG

AGA

GTG

ATT

TAC

CTT

286

Leu

Ile

Glu

Alá

Asn

Leu

Thr

Trp

Gly

Met

Arg

Val

Ile

Tyr

Leu

80

85

90

95

TGG Trp

TCT ATT AAT

GGC Gly 100

GTT Val

CTC Leu

GGG Gly

TTT Phe

GCA Alá 105

TTA Leu

GCG TGC TGC TTC

CTC Leu

334

Ser

Ile

Asn

Alá

Cys

Phe 110

TGG

CGC

TTC

AAA

ATA

CAC

CCT

GCC

TTC

ATC

TCC

GAC

GAT

GAA

382

Trp

Arg

Phe

Lys

Ile

His

Pro

Alá

Phe

Ile

Ser

Asp

Glu

115

120

125

CCA

TGG

CAG

CAA

CAG

TTG

430

Pro

Trp

Gin

Leu

130

135

140

CAG

CTG

CAG

CTG

CAG

TTG

GAG

ACG

AAA

AGC

GAA

CTC

AGG

GAT

AGT

478

Gin

Leu

Gin

Leu

Gin

Leu

Glu

Thr

Lys

Ser

GlU

Leu

Arg

Asp

Ser

145

150

155

GAT

TCT

TGT

GTC

ACA

GCA

GCG

GCT

AAT

TGATGCGGTT GCAACAAGCA

525

Asp

Ser

Cys

Val

Thr

Alá

Asn

160

165

GCAAGCCTTC AATGGTAGTT GCTCACTGAT

GTATTTCCTT

CTAGTTGAGT TGTGTGCATG

585

CCAGCATGCA TGCACGAACA ACAGACTAGC

; AGTGGCTCAT

CTGCTGCATG <

CAGCTGCATG

645

CAACTGCATG CAACTGAAAA GCCCTGCGGA

. GTTAAGCTGT

TTGTCTTTGC '

TTCTTGTCTT

705

GTGCATCGGT TGGCTGGCAT GCGCTGCTGC

: ATGCCCAGCG

AACCTTTCTT

CGAAATATTC

765

TGCGGACACT ATAAACTGAT TTCTCTCCTI

' CTTTG

800

9. azonosítási számú szekvencia

(C) topológia: lineáris	30 (i) Szekvencia jellemzői:
(ii) Molekula típusa: protein	(A) hosszúság: 2375 bázispár
(xi) Szekvencia leírása :	(B) típus: nukleinsav

Phe

Gly

Gly 35

Ser

Leu

Pro

Alá 40

Alá

Thr

Gly Val

Val 45

Ile

Alá

Ser

Val

Pro 50

Val

Glu

Val

Arg

Alá 55

Phe

Gly

Ser

Gly Phe 60

Cys

Leu

Met

Val

Tyr 65

Asn

Val

Alá

Gly

Tyr 70

Val

Leu

Gly

Pro

Phe Leu 75

Pro

Gly

Ile

Leu 80

Ile

Glu

Alá

Asn 85

Leu

Thr

Trp

Gly

Met 90

Arg Val

Ile

Tyr

Leu 95

Trp

Ser

Ile

Asn

Gly 100

Val

Leu

Gly

Phe

Alá 105

Leu

Alá Cys

Cys

Phe 110

Leu

Trp

Arg

Phe

Lys 115

Ile

His

Pro

Alá

Phe 120

Ile

Ser

Asp Asp

Asp 125

Glu

Pro

Trp

Gin 130

Gin

Gin 135

Gin

Gin Gin 140

Gin

Leu

Gin

Leu 145

Gin

Leu

Gin

Leu 150

Glu

Thr

Lys

Ser

Glu Leu 155

Arg

Asp

Ser

Asp 160

Ser Cys Val Thr Alá Alá Alá Asn 165 (C) szál típusa: kettős (A) név/kulcsszó: CDS (D) topológia: lineáris (B) lokáció: 3..1859 (ii) Molekula típusa: mRNS-hez cDNS (xi) Szekvencia leírása:

10. azonosítási számú szekvencia (vii) Közvetlen forrás: 5 (i) Szekvencia jellemzői:

(B) klón : EamlOOE (A) hosszúság: 618 aminosav (ix) Jellemző: (B) típus: aminosav

TC GGG GTT GCT AAG AGG GGA GAC GTC ACA GCT TGC AGG TAC TCC GAC 47

Gly Val Alá Lys Arg Gly Asp Val Thr Alá Cys Arg Tyr Ser Asp

10 15

TCC AGC TGT TAC

TTG Leu 20

AGG Arg

AAT Asn

ATC Ile

GAG Glu

TAC ACT GGA

GCA Alá

GCC Alá

TAC Tyr 30

AAA Lys

95

Ser

Cys

Tyr

Tyr 25

Thr

Gly

GAC

GTC

AAG

AGC

TAC

TTA

CAA

GAG

TGC

CCG

CAT

TTG

TGC

GCC

CTA

143

Asp

Val

Lys

Lys 35

Ser

Tyr

Leu

Gin

Glu 40

Cys

Pro

His

Leu

Cys 45

Alá

Leu

GAA

GCA

CGC

TGT

CAA

CGC

TGG

ACA

TAC

AAC

AAG

ACC

AAG

AAA

TCC

TGC

191

Glu

Alá

Arg 50

Cys

Gin

Arg

Trp

Thr 55

Tyr

Asn

Lys

Thr

Lys 60

Lys

Ser

Cys

AGG

CTC

TTC

GAT

TTG

GAA

TCC

TCT

AAG

GCC

GGC

ACC

TAC

ACC

TCA

CAA

239

Arg

Leu 65

Phe

Asp

Leu

Glu

Ser 70

Ser

Lys

Alá

Gly

Thr 75

Tyr

Thr

Ser

Gin

CCC

TCG

TGG

AGT

GGC

CCT

AAG

AAC

GGC

TGC

GCT

TCT

GAA

CCC

CTG

TAC

287

Pro 80

Ser

Trp

Ser

Gly

Pro 85

Lys

Asn

Gly

Cys

Alá 90

Ser

Glu

Pro

Leu

Tyr 95

ΑΛΤ

GCA

TTT

CAG

AAT

GTG

CCT

TCA

TGC

AGC

ATG

AGA

GGC

GTG

CGC

TAT

335

Asn

Alá

Phe

Gin

Asn 100

Val

Pro

Ser

cys

Ser 105

Met

Arg

Gly

Val

Arg 110

Tyr

GAC

GGG

GTG

CCT

TTT

GCA

GTT

GAG

AAA

ACC

GAG

ACC

GCA

AAC

GCA

TGC

383

Asp

Gly

Val

Pro 115

Phe

Alá

Val

Glu

Lys 120

Thr

Glu

Thr

Alá

Asn 125

Alá

Cys

CAA

GCT

AAA

TGC

CAG

ACG

ACC

ACA

GGA

TGT

GAA

GCC

TTC

TCT

TAC

GAT

431

Gin

Alá

Lys 130

Cys

Gin

Thr

Thr 135

Gly

Cys

Glu

Alá

Phe 140

Ser

Tyr

Asp

ATG

AAA

GGA

GTA

TGC

TAC

ATG

CAT

ATT

GCA

TTT

GCA

GTG

ATG

TCG

479

Met

Lys 145

Gly

Val

Cys

Tyr 150

Met

His

Ile

Alá

Phe 155

Alá

Val

Met

Ser

AAG

CGC

CCC

AAC

TAC

AAC

TTC

GTC

TCA

GGC

CCG

CGT

CAA

TGC

GCA

GGC

527

Lys 160

Arg

Pro

Asn

Tyr

Asn 165

Phe

Val

Ser

Gly

Pro 170

Arg

Gin

Cys

Alá

Gly 17 5

TGC

ATG

AAG

GGT

GTA

GAG

TAC

AAC

GGC

GAA

ATC

AGG

GAG

CTC

575

Cys

Met

Lys

Gly 180

Val

Glu

Tyr

Asn

Gly 185

Glu

Ile

Arg

Glu 190

Leu

ACC

ACG

GCA

GTA

GAG

ACC

GAA

GAG

TGC

CAG

CTG

CAC

TGC

CAA

GCT

623

Thr

Alá

Val 195

Glu

Thr

Glu

Glu 200

Cys

Gin

Leu

His

Cys 205

Gin

Alá

ATA

TCG

ACC

TGC

GCT

GTA

TTC

TCG

TAC

CGT

GGA

AGC

TTC

TGC

AGA

CTC

671

Ile

Ser

Thr 210

Cys

Alá

Val

Phe

Ser 215

Tyr

Arg

Gly

Ser

Phe 220

Cys

Arg

Leu

HU213 419B

ATT Ile

GGA Gly 225

AGA Arg

GAT Asp

GCT Alá

ACA ACC GAG

CAA Gin

AGC Ser

CCC Pro

CTA GCA ACA

AGC Ser

GGC Gly

719

Thr

Thr 230

Glu

Leu 235

Alá

Thr

ACG

AAG

CAC

TGT

GCA

GGA

GAT

TGC

TAT

CTG

CAA

GGT

GTC

CAT

AGC

CCA

767

Thr 240

Lys

His

Cys

Alá

Gly 245

Asp

Cys

Tyr

Leu

Gin 250

Gly

Val

His

Ser

Pro 255

CGG

CGT

GAT

TAC

GGG

TAC

GTG

AAG

GAA

TTG

AGC

GGC

AAG

ACA

GCT

GAA

815

Arg

Asp

Tyr

Gly 260

Tyr

Val

Lys

Glu

Leu 265

Ser

Gly

Lys

Thr

Alá 270

GlU

CAG

TGC

CGC

GAC

ACG

TGC

AAA

GCA

GAT

GAG

AAG

TGC

ACG

AGC

TTC

ACA

863

Gin

Cys

Arg

Asp 275

Thr

Cys

Lys

Alá

Asp 280

Glu

Lys

Cys

Thr

Ser 285

Phe

Thr

CAC

TGG

AAT

GAC

AAA

CGG

TGC

TAC

TTG

AAA

GAT

GAC

GAG

TCC

TTC

AGA

911

His

Trp

Asn 290

Asp

Lys

Arg

Cys

Tyr 295

Leu

Lys

Asp

Glu 300

Ser

Phe

Arg

TAT

CTT

TCA

CCT

ATC

GAG

GGG

GCC

GTC

ACA

GGC

TTC

CCA

ACC

TGC

TCT

959

Tyr

Leu 305

Ser

Pro

Ile

Glu

Gly 310

Alá

Val

Thr

Gly

Phe 315

Pro

Thr

Cys

Ser

ATC

TGC

ATG

AGG

GAA

GGA

GTA

AGG

ATC

CTA

GCA

AAC

GAT

TCG

AAT

CTC

1007

Ile 320

Cys

Met

Arg

Glu

Gly 325

Val

Arg

Ile

Leu

Alá 330

Asn

Asp

Ser

Asn

Leu 335

CTG

TGG

AAC

TTG

GAA

GCC

GGC

AAT

GCA

GAA

TGT

AAG

ATT

CGC

TGC

1055

Leu

Trp

Asn

Leu

Glu 340

Alá

Gly

Asn

Alá

Glu 345

Glu

Cys

Lys

Ile

Arg 350

Cys

GGA

CTC

ATG

AGC

TCG

TGC

ACT

CGC

TTT

GCT

TTC

AAT

ATA

GTG

ACA

AAG

1103

Gly

Leu

Met

Ser 355

Ser

Cys

Thr

Arg

Phe 360

Alá

Phe

Asn

Ile

Val 365

Thr

Lys

CAA

TGC

AGT

CTT

CTC

TCA

GGC

GAA

GGC

GAG

TTG

GTG

GAA

GCA

CGT

GAC

1151

Gin

Cys

Ser 370

Leu

Ser

Gly

Glu 375

Gly

Glu

Leu

Val

Glu 380

Alá

Arg

Asp

TAC

GTC

TCC

GGG

CCC

GCT

AAA

TGC

TTA

ACG

GAC

ATC

TCT

TGC

TTC

CAG

1199

Tyr

Val 385

Ser

Gly

Pro

Alá

Lys 390

Cys

Leu

Thr

Asp

Ile 395

Ser

Cys

Phe

Gin

AGA

GAT

GTC

GCT

TTC

ACT

GGC

GAG

ACA

GTT

GCT

ACA

GAT

GTG

ACA

1247

Arg 400

Asp

Val

Alá

Phe

Thr 405

Gly

Glu

Thr

Val 410

Alá

Thr

Asp

Val

Thr 415

GAG

AAC

GCA

GGG

CTC

TGC

ATG

CGG

TGG

TGT

GCA

AAG

GAA

GCA

CAA

TGC

1295

Glu

Asn

Alá

Gly

Leu 420

Cys

Met

Arg

Trp

Cys 425

Alá

Lys

Glu

Alá

Gin 430

Cys

ACG

CAC

TTC

ACC

TTT

ACT

TTT

GCT

GAA

GAT

CGT

CTC

TCC

GGC

CAA

TGC

1343

Thr

His

Phe

Thr 435

Phe

Thr

Phe

Alá

Glu 440

Asp

Arg

Leu

Ser

Gly 445

Gin

Cys

ACT

CTT

AAG

GGG

GAT

CTG

AAT

GTA

ACG

AAA

ACT

AAG

GGT

GCT

GTC

1391

Thr

Leu

Leu 450

Lys

Gly

Asp

Leu

Asn 455

Val

Thr

Lys

Thr

Lys 460

Gly

Alá

Val

TCA

GGC

CCA

AAG

CGG

TGT

TTC

GAA

CTG

CTC

TCT

CTC

TGC

GAG

GAA

CCA

1439

Ser

Gly 465

Pro

Lys

Arg

Cys

Phe 470

Glu

Leu

Ser

Leu 475

Cys

Glu

Pro

TAC GTC TCC

GGG Gly

CCC Pro

GCT Alá

AAA Lys 390

TGC TTA ACG GAC ATC TCT TGC TTC CAG

1199

Tyr Val

Ser

Cys

Leu

Thr

Asp

Ile 395

Ser

Cys

Phe

Gin

385

AGA

GAT

GTC

GCT

TTC

ACT

GGC

GAG

ACA

GTT

GCT

ACA

GAT

GTG

ACA

1247

Arg

Asp

Val

Alá

Phe

Thr

Gly

Glu

Thr

Val

Alá

Thr

Asp

Val

Thr

400

405

410

415

GAG

AAC

GCA

GGG

CTC

TGC

ATG

CGG

TGG

TGT

GCA

AAG

GAA

GCA

CAA

TGC

1295

Glu

Asn

Alá

Gly

Leu

Cys

Met

Arg

Trp

Cys

Alá

Lys

Glu

Alá

Gin

Cys

420

425

430

ACG

CAC

TTC

ACC

TTT

ACT

TTT

GCT

GAA

GAT

CGT

CTC

TCC

GGC

CAA

TGC

1343

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Phe

Alá

Glu

Asp

Arg

Leu

Ser

Gly

Gin

Cys

435

440

445

ACT

CTT

AAG

GGG

GAT

CTG

AAT

GTA

ACG

AAA

ACT

AAG

GGT

GCT

GTC

1391

Thr

Leu

Lys

Gly

Asp

Leu

Asn

Val

Thr

Lys

Thr

Lys

Gly

Alá

Val

450

455

460

TCA

GGC

CCA

AAG

CGG

TGT

TTC

GAA

CTG

CTC

TCT

CTC

TGC

GAG

GAA

CCA

1439

Ser

Gly

Pro

Lys

Arg

Cys

Phe

Glu

Leu

Ser

Leu

Cys

Glu

Pro

465

470

475

AGA

GAT

ACA

GGT

GTT

ATT

GGG

CCT

AAA

CGC

GAA

TAAACAGCTG i

CTAATAATGT

1876

Arg

Asp

Thr

Gly

Val

Ile

Gly

Pro

Lys

Arg

Glu

610

615

AATTGAAGCT	GTTGCTTCTT	CTGCTGGAGC	TTGTGCTTGT	CGCTCGCTGC	ACGAGAACAC	1936
TGGCAGGCAT	CGATTCGCAG	CTGTATCTCG	GTCGGCTTCA	TGGTTACTTC	CATGTTAGCG	1996
ACTGCACTGC	ATTGCTTTCT	TCTTTTCTCT	TCTCTATTCC	CCTCACTTCT	TAGCCTGCAT	2056
CCCAAAGGGT	TCAGGCATTC	AAGAGAAGAG	GGTGCTCTCT	TCTTTCTCAC	GGTGCAGATA	2116
CACGAGACGT	AAATAAACAC	AATTAACAAA	ACACACCCAC	AGCGAGGACA	GAACATCATC	2176
AGCATTTATA	TCACTGCGTT	GCATGCATTT	AATAACGGCA	AGAACGACAG	GGGAGCGAGC	2236
GACACAGCAG	TCTAGACGTC	GCTCTGTGCT	CCCTTGCAAG	ATGTCTTTTC	GCATACATCA	2296
AACAGAAGAA	AAGAAAGACG	TGCAGTTTGA	ACTGACGTTT	GTTCATGCAT	GCATGCATGC	2356
AAAAAAAAAA	AGGCACGAG					2375

(C) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: protein (xi) Szekvencia leírása:

Gly 1

Val

Alá

Lys

Arg 5

Gly

Asp

Val

Thr

Alá 10

Cys

Arg

Tyr

Ser

Asp 15

Ser

Cys

Tyr

Leu 20

Arg

Asn

Ile

Glu

Tyr 25

Thr

Gly

Alá

Tyr 30

Lys

Asp

Val

Lys

Lys 35

Ser

Tyr

Leu

Gin

Glu 40

Cys

Pro

His

Leu

Cys 45

Alá

Leu

Glu

Alá

Arg 50

Cys

Gin

Arg

Trp

Thr 55

Tyr

Asn

Lys

Thr

Lys 60

Lys

Ser

Cys

Arg

Leu 65

Phe

Asp

Leu

Glu

Ser 70

Ser

Lys

Alá

Gly

Thr 75

Tyr

Thr

Ser

Gin

Pro 80

HU 213 419 Β

ler Trp Ser Gly Pro Lys Asn

Gly Cys

Cys Ser 105

Alá 90 Met

Ser Arg

Glu Gly

Pro Val

Leu Arg 110

Tyr 95 Tyr

Asn Asp

Alá

Phe

85 Gin Asn Val 100

Pro Ser

Gly

Val

Pro

Phe

Alá

Val

Glu

Lys

Thr

Glu

Thr

Alá

Asn

Alá

Cys

Gin

115

120

125

Alá

Lys

Cys

Gin

Thr

Gly

Cys

Glu

Alá

Phe

Ser

Tyr

Asp

Met

130

135

140

Lys

Gly

Val

Cys

Tyr

Met

His

Ile

Alá

Phe

Alá

Val

Met

Ser

Lys

145

150

155

160

Arg

Pro

Asn

Tyr

Asn

Phe

Val

Ser

Gly

Pro

Arg

Gin

Cys

Alá

Gly

Cys

165

170

175

Met

Lys

Gly

Val

Glu

Tyr

Asn

Gly

Glu

Ile

Arg

Glu

Leu

Thr

180

185

190

Thr

Alá

Val

Glu

Thr

Glu

Cys

Gin

Leu

His

Cys

Gin

Alá

Ile

195

200

205

Ser

Thr

Cys

Alá

Val

Phe

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ser

Phe

Cys

Arg

Leu

Ile

210

215

220

Gly

Arg

Asp

Alá

Thr

Glu

Gin

Ser

Pro

Leu

Alá

Thr

Ser

Gly

Thr

225

230

235

240

Lys

His

Cys

Alá

Gly

Asp

Cys

Tyr

Leu

Gin

Gly

Val

His

Ser

Pro

Arg

245

250

255

Arg

Asp

Tyr

Gly

Tyr

Val

Lys

Glu

Leu

Ser

Gly

Lys

Thr

Alá

Glu

Gin

260

265

270

Cys

Arg

Asp

Thr

Cys

Lys

Alá

Asp

Glu

Lys

Cys

Thr

Ser

Phe

Thr

His

275

280

285

Trp

Asn

Asp

Lys

Arg

Cys

Tyr

Leu

Lys

Asp

Glu

Ser

Phe

Arg

Tyr

290

295

300

Leu

Ser

Pro

Ile

Glu

Gly

Alá

Val

Thr

Gly

Phe

Pro

Thr

Cys

Ser

Ile

305

310

315

320

Cys

Met

Arg

Glu

Gly

Val

Arg

Ile

Leu

Alá

Asn

Asp

Ser

Asn

Leu

325

330

335

Trp

Asn

Leu

Glu

Alá

Gly

Asn

Alá

Glu

Cys

Lys

Ile

Arg

Cys

Gly

340

345

350

Leu

Met

Ser

Cys

Thr

Arg

Phe

Alá

Phe

Asn

Ile

Val

Thr

Lys

Gin

355

360

365

Cys

Ser

Leu

Ser

Gly

Glu

Gly

Glu

Leu

Val

Glu

Alá

Arg

Asp

Tyr

370

375

380

Val

Ser

Gly

Pro

Alá

Lys

Cys

Leu

Thr

Asp

Ile

Ser

Cys

Phe

Gin

Arg

385

390

395

400

HU 213 419 Β

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás egy Eimeria antigén egy vagy több immunogén determinánsát tartalmazó polipeptid előállítására, amely a 2., 4., 6., 8. vagy 10. azonosítási számú aminosavszekvencia legalább egy részét, vagy annak egy funkcionális ekvivalensét tartalmazza, azzal jellemezve,

a) hogy a fenti polipeptidet egy Eimeria parazita extraktumából E. ACER 12-2B, E. ACER 11A-2A, E. ACER 5F-2, E. ACER 1OC-2A vagy E. ACER 10E-2 monoklonális antitest vagy ezek valamely kombinációja alkalmazásával, immunaffinitási kromatográfiás eljárással izoláljuk, vagy

b) a fenti polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciát alkalmas expressziós rendszerben kifejezzük, vagy

c) a fenti polipeptidet kémiailag szintetizáljuk.
2. Eljárás egy Eimeria antigén egy vagy több immunogén determinánsát tartalmazó polipeptidet kódoló nukleinsavszekvencia előállítására, amely polipeptid a 2., 4., 6., 8. vagy 10. azonosítási számú aminosavszekvencia legalább egy részét, vagy annak egy funkcionális ekvivalensét tartalmazza, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavszekvenciát Eimeria parazitából izoláljuk, vagy szintetizáljuk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. azonosítási számú DNS-szekvencia legalább egy részét tartalmazó nukleinsavszekvenciát izolálunk vagy szintetizálunk.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. azonosítási számú DNS-szekvencia legalább egy részét tartalmazó nukleinsavszekvenciát izolálunk vagy szintetizálunk.
5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,

HU 213 419 Β hogy az 5. azonosítási számú DNS-szekvencia legalább egy részét tartalmazó nukleinsavszekvenciát izolálunk vagy szintetizálunk.
6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 7. azonosítási számú DNS-szekvencia legalább egy részét tartalmazó nukleinsavszekvenciát izolálunk vagy szintetizálunk.
7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 9. azonosítási számú DNS-szekvencia legalább egy részét tartalmazó nukleinsavszekvenciát izolálunk vagy szintetizálunk.
8. Eljárás rekombináns vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított nukleinsavszekvenciát bevisszük egy vektorba.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavszekvenciát működőképesen ligáljuk a vektorban lévő expressziós kontroll szekvenciákhoz.
10. Eljárás rekombináns vírus előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2-7. igénypontok bármelyike szerinti élj árással előállított nukleinsavszekvenciát bevisszük egy vírus vektorba.
11. Eljárás rekombináns vektorral transzformált gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy a 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns vektorral egy megfelelő gazdasejtet transzformálunk.
12. Eljárás rekombináns vírussal fertőzött gazdasejt előállítására, azzaljellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti eljárással előállított vírus vektorral egy megfelelő gazdasejtet fertőzünk.
13. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy all. igénypont szerinti eljárással előállított gazdasejtet tenyésztjük, és a kívánt polipeptidet izoláljuk.
14. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti eljárással előállított gazdasejtet tenyésztjük, és a kívánt polipeptidet izoláljuk.
15. Eljárás az 1. igénypont szerint előállított polipeptiddel immunreaktív antitest vagy antiszérum előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy organizmust egy, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított polipeptiddel immunizálunk, és a polipeptiddel immunreaktív antitestet vagy antiszérumot izoláljuk, vagy

b) az antitestet vagy antiszérumot hibridoma sejtekkel termeltetjük, és a polipeptiddel immunreaktív antitestet vagy antiszérumot izoláljuk.
16. Eljárás élő vírus vektor vakcina előállítására szárnyasok coccidiosis elleni védelmére, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns vírust gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük.
17. Eljárás vakcina előállítására szárnyasok coccidiosis elleni védelmére, azzaljellemezve, hogy all. igénypont szerinti eljárással előállított gazdasejtet gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük.
18. Eljárás élő vírus vektor vakcina előállítására szárnyasok coccidiosis elleni védelmére, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti eljárással előállított gazdasejtet gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük.
19. Eljárás vakcina előállítására szárnyasok coccidiosis elleni védelmére, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 14. igénypont szerinti eljárással előállított polipeptidet gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük.
20. Eljárás coccidiosis elleni vakcina előállítására, azzaljellemezve, hogy a 13. igénypont szerinti eljárással előállított fertőzött gazdasejtet tenyésztjük, a rekombináns vírusokat összegyűjtjük, és immunizáló aktivitással rendelkező gyógyászati készítménnyé formáljuk.