JP3076050B2 - アイメリア・テネラワクチン - Google Patents

アイメリア・テネラワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）
ポリペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配
列からなる組換え核酸分子、前記核酸配列を含有してい
るベクター又は宿主細胞、アイメリア・テネラのポリペ
プチド、これらの産生物をベースとするコクシジウム症
に対するワクチン、及び前記ポリペプチドと免疫反応生
の抗体又は抗血清に関する。
コクシジウム症（coccidiosis）はアピコンプレクサ
（Apicomplexa）亜門及びアイメリア（Eimeria）属の細
胞内寄生虫、原虫類により引き起こされる病気である。
これらの寄生虫は宿主の胃腸管及び消化器部分を形成す
る細胞内で増殖する。
集約生産が増加しているために、最近の数十年間に家
禽業界ではこれらの寄生虫による損害が危機的に増加し
ている。オランダでは家禽農家での毎年の損害が数百万
ギルダーであり、1986年の損害は約1300万ギルダーに上
った。同年、米国ではコクシジウム症を抑制する薬剤
（coccidiostats）が使用されているにもかかわらず、
３億米ドルの損害であった。
鶏のコクシジウム症の病原菌は９つの異なる型、すな
わち、Eimeria acervulina,E.maxima,E.tenella,E.neca
trix,E.brunetti,E.mitis,E.praecox,E.mivati及びE.ha
qaniに分類することができる。しかしながら、最後の２
つの型の存在に疑いを持つ人もいる。これらの型の全て
は鶏のみを宿主とし、高い組織特異性を示す。しかしな
がら、前記の生活環は類似している。
その生活環の間に、アイメリア（Eimeria）寄生虫は
多くの段階を経る。感染段階（胞子形成卵母細胞）が鶏
の口から取り込まれ、胃の中へ入る。ここでの摩砕作用
の結果、嚢子（cyst）の殻が破れて開く。この卵母細胞
が含有する４つのスポロキストが放出され、十二指腸内
に入り、そこで胆汁や消化酵素にさらされる。その結
果、スポロキスト壁が開口し、スポロキスト中に存在す
る種虫（sporozoites）が放出される。これらの種虫は
移動性があり、侵入し且つ増殖するための好適な宿主細
胞、例えば上皮細胞を探す。型に応じて、この最初の増
殖期は20〜48時間持続し、数十〜数百のメロゾイト（me
rozoites）が形成され、その各々が再び新しい宿主細胞
に侵入し、増殖する。２回又は時に５回のこれらの無性
生殖サイクルの後、細胞内のメロゾイトは生殖形態、す
なわち雄性及び雌性の配偶子母細胞に成長する。雄性配
偶子により雌が受精した後、接合体が形成され、これは
その周囲に嚢子壁をつくる。この卵母細胞は宿主細胞を
離れ、糞と共に排出される。鶏の体外の温度及び湿度が
比較的高いと同時に空気中に十分な酸素があると、卵母
細胞は胞子形成して感染段階となる。
このように、鶏から鶏への寄生虫の移行には中間宿主
が必要とされない。従って、利用できる表面積の占有率
が高いと養鶏場の感染率が急速に増加すると考えられ
る。
種々の方法で、寄生虫を撲滅することができる。
管理を良くすることに加え、飼料や飲料水にしばしば
混合される撲滅剤を使用してコクシジウム症を撲滅する
ことができる。しかしながら、最近、これらの薬剤の効
果が低下してきている。その原因の一部は、種々の撲滅
剤に対して耐性となるような寄生虫の高い遺伝能力によ
る。更に、これらの薬剤の多くは肉に残留し、消費上の
問題を生じさせうる。
従って、免疫学的な予防がはるかに良い撲滅方法を構
成するであろう。十分に高い病原菌中で生活してきた鶏
は同型のアイメリア（Eimeria）とその後の接触に対し
て抵抗しうることが知られている。アイメリア（Eimeri
a）に対する耐性は、少投与量の卵母細胞又は弱体化し
た（非病原性）株の卵母細胞で鳥を数回感染させること
によっても誘導しうる。しかしながら、この場合、特
に、屠殺するための大量の鶏に調節投与することは実際
困難な問題である。従って、不活性化したワクチンが唯
一残された解決法と思われる。
不活性化したワクチンは寄生虫由来の抗原と、おそら
くアジュバンドとからなりうる。
寄生虫から単離した抗原の代替物としては、公知の方
法に従って実施しうる手法である組換えDNA法で製造し
た生成物を使用することができる。
更に、抗原をコードする遺伝子を導入した細菌、真菌
又はウィルスのような生きている宿主有機体を投与して
予防接種することもできる。次に、この有機体は十分長
期間に亘り確実に抗原を合成し、そのために鶏の免疫系
が十分刺激される。
同時に、合成的に抗原又はその一部を再生することが
でき、これをアジュバンドの存在下で例えば担体蛋白質
に結合したような免疫学的に認識可能な刺激形態で鳥に
投与することができる。
本発明によれば、アイメリア・テネラ（Eimeria tene
lla）の蛋白質の一部が第２図に示すアミノ酸配列によ
って定義される該蛋白質の少なくとも一部を実質的にコ
ードする核酸配列を、コクシジウム症に対して家禽を免
疫するためのワクチンの製造に使用することができる。
本明細書中の「核酸配列」は任意の長さのヌクレオチ
ドのポリマー型、すなわち、リボ核酸配列及びデオキシ
リボ核酸配列の両者を意味している。主として、この用
語は分子の一次構造を意味する。従って、この用語は二
本鎖及び一本鎖DNA並びに二本鎖及び一本鎖RNA及びその
修飾したものをも含んでいる。
第２図に示すアミノ酸配列を有する、アイメリア・テ
ネラ（Eimeria tenella）の蛋白質の一部分をコードす
る核酸配列（Et1A1と命名される）はファージλgt10Et1
A1内に存在する。上記のファージは大腸菌BNN102株と共
に第CBS286.89号としてCentraal Bureau voor Schimmel
cultures、Baarn（オランダ）に寄託されている。
ファージλgt10Et1A1を、先ず、胞子形成されたアイ
メリア・テネラ（E.tenella）卵母細胞からcDNAライブ
ラリーを構築することにより作製する。大腸菌K12JA221
株を形質転換させ且つ第CBS143.88号としてCentraal Bu
reau voor Schimmel cultures、Baarn（オランダ）に寄
託してあるプラスミッドpEa1A中に存在する標識された2
96塩基対EcoR Iプローブを用いて、このcDNAライブラリ
ーのスクリーニングを行った。
次に、本発明の核酸配列を含むアイメリア・テネラ
（E.tenella）のクローンをプラーク精製した。λgt10E
t1A1内に挿入したDNA配列はこのファージクローンから
単離できる。Et1A1の制限酵素地図を作成する（第１
図）。
上記挿入のcDNA部分について決定したヌクレオチド配
列を、それから得られるアミノ酸配列と共に第２図に示
す。
前記配列はアイメリア・テネラ（E.tenella）の蛋白
質の一部だけを表わしている。ヌクレオチド配列につい
ては、アイメリア・テネラ（E.tenella）蛋白質をコー
ドする遺伝子の５′末端が存在せず、従ってアイメリア
・テネラ蛋白質のアミノ酸配列のＮ−末端がおそらく存
在しないであろう。
本発明は、第２図に示すアミノ酸配列を有するポリペ
プチド又はその抗原性フラグメントをコードする核酸配
列及び、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）蛋白
質の一部が前記アミノ酸配列によって定義されている該
蛋白質の全体又はその抗原性フラグメントをコードする
核酸配列を含んでいる。
第２図に存在しないアイメリア・テネラ（E.tenell
a）蛋白質の５′核酸配列は、例えばアイメリア・テネ
ラのRNAを単離し、そのRNAを、存在する核酸配列の５′
側から誘導したプライマーとハイブリッド形成させ、例
えば逆転写酵素によりこのプライマーを伸長させること
による標準の分子生物学的手法によって得ることができ
る。その後、新規に合成したDNAを標準の分子生物学的
手法を使用して二本鎖型に変換し、好適ベクター中でク
ローン化し、次いで配列決定しうる。
別の可能性は、存在する核酸配列の５′側に由来する
制限フラグメントを用いて上記のcDNAライブラリーをス
クリーニングし、第２図に示す核酸配列と重なり合う
が、更に５′配列も有するDNA配列を含有するクローン
を単離することである。
アイメリア・テネラ（E.tenella）蛋白質の一部をコ
ードするデオキシ核酸配列を第２図に示している。この
cDNA配列は（停止コドンも含めて）長さ1970ヌクレオチ
ドである。実質的に前記cDNA配列又はそのフラグメント
を包含する核酸配列及び、前記cDNA又はそのフラグメン
トの他に、アイメリア・テネラ（E.tenella）蛋白質に
対応する他のヌクレオチドを包含する核酸配列、例えば
アイメリア・テネラ蛋白質をコードする完全な遺伝子は
本発明の一部を形成している。
当業界で良く知られているように、遺伝子コードの縮
退はコドン中の塩基置換を可能にし、同じアミノ酸をコ
ードする他のコドン、例えばアミノ酸であるグルタミン
酸のコドンはGATとGAAの両者である、になりうる。従っ
て、第２図に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド又
はその抗原性フラグメントの発現には、第２図に示す核
酸配列とは異なる代替可能なコドン組成を有する核酸配
列を使用できることは明らかである。
少なくとも配列の一部が第２図に示す核酸配列又はそ
のフラグメントと実質的に相同であるが、ヌクレオチド
の置換、突然変異、挿入、欠失、逆位等を含んでもよ
く、及び第２図に示すポリペプチド又はそのフラグメン
トに機能的に等価である蛋白質又はポリペプチドをコー
ドする核酸配列も本発明の範囲に含まれる。
本発明はまた、上記の核酸配列によってコードされる
且つコクシジウム症に対する家禽の免疫化に使用しうる
ポリペプチドも含んでいる。
更に、実質的に第２図に示すアミノ酸配列の少なくと
も一部からなるポリペプチドも本発明に含まれる。
ポリペプチドという用語はアミノ酸の分子鎖を意味す
るものであって、産生物の特定の長さをさすものではな
い；従って、特にペプチド、オリゴペプチド及び蛋白質
がポリペプチドの定義に含まれる。
本明細書に含まれる第２図に示した特定のポリペプチ
ドには、天然の変異が存在しうることが理解されよう。
これらの変異は、全配列中のアミノ酸の相違により、即
ち前記ポリペプチド中のアミノ酸の欠損、置換、挿入、
転位又は付加により立証され得る。
更に、得られた１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠
損、付加又は交換（replacement）により様々に修飾し
た、第２図に示すポリペプチドの種々の誘導体の製造に
組換えDNA技術を使用すると有利である。第２図に示す
ポリペプチド又はその抗原性フラグメントの本質的、特
徴的活性が重大な影響を受けていないのであれば、上記
の全ての修飾によって得られる第２図に示すポリペプチ
ド又はそのフラグメントの誘導体及びこのような誘導体
を包含するポリペプチド又はそのフラグメントも本発明
の範囲に入いる。
また、コクシジウム症に対する家禽の免疫化に使用し
うるこれらポリペプチドのフラグメントも本発明の一部
を形成する。公知の又は未知のアミノ酸配列中のこのよ
うに有用なポリペプチドフラグメント（エピトープと称
する）を検出するための種々の方法が知られている。公
知のアミノ酸配列を基にして、例えば、これらのエピト
ープは特許WO84/03564及びWO86/06487に記載のスクリー
ニング法を用いて実験的に決定することができる。
更に、ポリペプチドの多数の領域は、理論的な考察及
び公知のエピトープとの構造上の一致に基づいて、エピ
トープと呼ぶことができる。これらの領域は、J.P.Hopp
とK.P.Woodsが記載した疎水性規準（参照文献５）とP.
Y.Chon及びG.D.Fasmanが記載した二次構造アスペクト
（参照文献６）との組合わせをベースとして決定した。
必要となるであろうＴ細胞エピトープも同様にBerzof
skyの両親媒性規準（参照文献７）を用いて理論的に推
論できる。
本発明のコクシジウム感染症に対する免疫化には、例
えば抗イディオタイプ抗体又はその抗原結合フラグメン
トを使用することも可能である。このような抗体はイデ
ィオタイプ抗体に対するものであり、そしてこのイディ
オタイプ抗体は本発明のポリペプチドに対するものであ
る。上記の本発明ポリペプチドの免疫原生等価物は特に
このタイプの抗イディオタイプ抗体を意味するものと理
解される。
本発明の核酸配列を、場合によってβ−ガラクトシダ
ーゼのようなポリペプチドをコードする配列部分を含有
している、種々の発現を導くDNA配列と連結して、好適
な宿主の形質転換に使用しうる所謂組換え核酸分子とな
すことができる。このようなハイブリッドDNA分子は好
ましくは、例えばプラスミッドから又は、バクテリオフ
ァージ又はウィルス中に存在する核酸配列から誘導され
る。本明細書で使用する「形質転換」とは、例えば直接
的な取り込み又は形質導入のような使用する方法とは無
関係に、宿主細胞内に異種核酸配列を導入することを意
味している。異種核酸配列は独自複製（autonomous rep
lication）を通して維持されうるか、又は宿主ゲノム内
に組み込まれうる。組換えDNA分子は、好ましくは、挿
入された核酸配列の発現を調節できる表示の宿主と相性
のよい適切な調節配列（control sequence）を含んでい
る。
好適な宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配
列により又はこのような核酸配列を含む組換え核酸分子
により形質転換することができる細胞であり、且つ前記
核酸配列によってコードされた前記ポリペプチドを発現
するために使用しうる細胞である。宿主細胞は原核生物
起源例えば大腸菌、枯草菌及びシュードモナス属のよう
な細菌；又は真核生物起源例えばSaccharomyces cerevi
siaeのような酵母又は、より高等な真核生物細胞例えば
昆虫、植物若しくはHela細胞及びモルモットの卵巣（CH
O）細胞を含む哺乳類細胞でありうる。
意図した免疫化は、例えば本発明ペプチド若しくはそ
の免疫原生部分若しくは等価物を例えば鳥に投与するこ
とにより又は、免疫すべき鳥に、組換えDNAで遺伝学的
に修飾された且つポリペプチド若しくはその免疫原生部
分もしくは等価物を産生しうる微生物をその場（in sit
u）投与することにより実施しうる。
本発明によるコクシジウム症に対する家禽の免疫化に
ついては、一方において、例えば鳥に本発明ポリペプチ
ド、フラグメント又は免疫原生等価物を投与することが
でき、又は他方において、遺伝子操作により本発明ポリ
ペプチド等を産生する能力を獲得した微生物を所望に応
じて投与することができる。その最初の例には「サブユ
ニットワクチン」という用語がよく使われ、二番目の例
には「ベクターワクチン」という用語が通常使われてい
る。本発明者はこの命名を本明細書中で使用する。
本発明のサブユニットワクチンは一般に、場合により
医薬上許容され得る賦形剤の存在中で、精製形態のポリ
ペプチドを含有している。このポリペプチドを場合によ
り非関連性の蛋白質と共有結合することができ、このこ
とは例えば融合産生物の精製に有利である。具体例とし
てβ−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロキモシ
ン、血液凝固因子Xa等がある。
このような用途のポリペプチドは公知の方法、例えば
アイメリア・テネラ（E.tenella）からの単離、組換えD
NA技術又はペプチド合成によって製造することができ
る。
所望であれば、例えばグリコシル化、アミド化、カル
ボキシル化又はリン酸化によりこのポリペプチドを修飾
することもできる。
ベクターワクチンでは、本発明のポリペプチド産生物
は遺伝子操作した有機体によって作られ、この有機体は
それ自身免疫すべき個体に投与され、且つその個体の体
内でしばらくの間それ自身を維持し又は増殖することさ
えある。この目的には、例えば大腸菌、バチルス若しく
はサルモネラのような細菌又は牛痘ウィルス若しくは鳥
の天然痘ウィルスのようなウィルスといった広範な有機
体を宿主として使用することができる。このタイプの宿
主有機体を用いると、ポリペプチドはそれ自身表面抗原
として発現しうる。これに関しては、OMP蛋白質もしく
は大腸菌の毛蛋白質又は有機体によって認識されるシグ
ナル及びアンカー配列の合成的供給物と前記ポリペプチ
ドとの融合が考えられる。また前記免疫原性ポリペプチ
ドは、所望によりより大きな全体の一部として、免疫す
べき動物の体内に放出される。これらの場合の全てにお
いて、１種以上の免疫原生産生物が、種々の病原体に対
する及び／又は所与の病原体の種々の抗原に対する防御
を生じさせる発現を見出すであろう。
本発明の核酸配列と、アイメリア・アセルブリナ（E.
acervulina）由来の防御用ポリペプチドをコードするDN
Aフラグメント（実施例２）との間の実質的な相同を考
慮すれば、前記核酸配列又は対応のポリペプチドを使用
して他の種のアイメリア、特にアイメリア・アセルブリ
ナに対し家禽を免疫しうることが予想される。
アイメリア・テネラ（E.tenella）に既に感染してい
る鳥を、前記アイメリア・テネラに対する抗体で治療で
きることは言うまでもない。本発明のポリペプチドに特
徴的な抗血清又は抗体はコクシジウム症の治療に使用し
うる。前記ポリペプチドで動物を免疫し、その動物から
抗血清を単離することにより前記抗血清又は抗体が得ら
れる。
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体も
アイメリア・テネラ（E.tenella）に感染した鳥の治療
に使用できる。前記モノクローナル抗体は、この目的で
当業界に公知の方法、例えば、前記ポリペプチドでマウ
スを免疫し、マウス脾細胞に永久増殖性をもたせ、有用
な抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより
製造することができる。腫瘍形成性DNAでＢリンパ球を
直接形質転換することにより、又は、エプスタイン−バ
ーウィルスでトランスフェクションすることにより永久
増殖性抗体産生細胞系を作製することもできる。
当業界で公知の方法により、特にモノクローナル抗体
を使用して抗イディオタイプ抗体を生じさせることがで
きる。これらの抗イディオタイプ抗体は鳥におけるコク
シジウム症の予防にも有用であり得る。
上記の抗血清及びモノクローナル抗体はアイメリア・
テネラ（E.tenella）に感染した鳥の免疫学的診断にも
使用し得る。
実施例１ アイメリア・テネラ（E.tenella）卵母細胞の胞子形成 10-4Mの亜二チオン酸ナトリウム60mlにアイメリア・
テネラ５×108個を含有する懸濁液を遠心分離し、その
後、ペレットを100mlの滅菌水で１回洗浄した。細胞を
２％重クロム酸カリウム500mlに再懸濁させた後、強力
な曝気の影響下に30℃で７時間インキュベーションし
た。次に、遠心分離により卵母細胞を集め、200ml滅菌
で３回洗浄した。
RNAの単離 RNAを単離するために（参照文献１）、10mM Tris酢酸
（pH7.6）、75mM酢酸ナトリウム、１％SDS、2mMEDTA、
0.2mg/mlプロティナーゼＫ及び10mMのバナジルリボヌク
レオシド複合体を含有するバッファ2.8ml中に該細胞ペ
レットを入れた。ガラスビーズ（直径0.5mm）13gの存在
下で（最大）60秒間激しく撹拌することにより卵母細胞
を破壊した。全抽出物にフェノール5mlを加え、混合物
を更に60秒間激しく撹拌した。遠心分離後、上清液をピ
ペットで取り出し、等量のフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（25:24:1）で再度抽出した。2.5
容のエタノールを加えた後にRNAが沈殿し、得られた沈
殿物を800μのTris10ml、EDTA0.1mM、pH7.6（T
10E0.1）に溶解した後、等容量のフェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（25:24:1）で更に２回、
クロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）で２回そ
の産生物を抽出し、次にエタノールで沈殿させた。オリ
ゴ（dT）−セルロースクロマトグラフィでポリA+−RNA
を単離した。（参照文献２）５×108個の卵母細胞から
約100μｇのポリA+−RNAを単離した。
cDNA合成 酵素MMLV逆転写酵素によりポリA+−RNAをcDNAに変換
した。この目的のために、25μｇのポリA+−RNAを水90
μに溶解し、10mMとなるまで水酸化メチル水銀を加え
ることにより20℃で５分間変性させ、次に、β−メルカ
プトエタノールを45mMとなるまで加え、混合物を20℃で
更に３分間インキュベーションした。４μｇのオリゴ
（dT）15′150UのRNAsin(R)、20mM Tris（pH7.6）、30m
M KCl、4mMジチオスレイトール（DTT）、2mM MgCl2、
各dNTP 1mM及び3000UのMMLV逆転写酵素を含むバッファ
190μ中で酵素反応を行った。37℃で１時間インキュ
ベーションした後、0.5M EDTA10μを加えて反応を止
めた。等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール（25:24:1）で抽出した後、2Mとなるまで酢
酸アンモニウムを加え、及び2.5容のエタノールを加え
ることによりRNA/DNAハイブリッドを沈殿させた。酵素D
NAポリメラーゼＩとRNase H（参照文献３）の作用を組
合せると第二の鎖が合成される。20mM Tris（pH7.6）、
5mM MgCl2、100mM（NH4）2SO4、0.6mMβ−NAD、16UのR
Nase H、200UのDNAポリメラーゼＩ及び20UのDNA−リガ
ーゼ（大腸菌）を含有するバッファ960μ中にペレッ
トを溶解した。12℃で１時間、次に22℃で１時間インキ
ュベーションし、その後、フェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（25:24:1）を等容量加え、エタ
ノールで沈殿させることにより反応を止めた。
この目的に適したベクター内でcDNAをクローン化する
前に、先ず、cDNAを修飾した。30mM酢酸ナトリウム（pH
5.6）、50mM NaCl、1mM ZnSO4及び21Uのヤエナリヌク
レアーゼ（Mung Bean Nuclease）を含むバッファ100μ
にcDNA（５μｇ）を溶解した。37℃で30分間インキュ
ベーションした後、EDTAを10mMとなるまで及びTrisを25
mMとなるまで加えることによって反応を止めた。フェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25:24:
1）で抽出した後、混合物をSephadex G50カラムで脱塩
した。
溶出液（125μ）に次のものを加えた:Tris（pH7.
6）50mMまで、EDTA2.5mMまで、DTT5mMまで、Ｓ′−アデ
ノシルメチオニン0.5μＭまで及び100UのEcoR I−メチ
ラーゼ。37℃で30分間インキュベーションした後、65℃
に15分間加熱して反応を止め、次に、Tris−HCl100mM、
MgCl2100mM及びNaCl500mMを含む溶液（pH7.5）1/10容を
加え、同時に各dNTP1mM及び12.5UのKlenow DNA−ポリメ
ラーゼを加えた。22℃で60分間インキュベーションした
後、等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール（25:24:1）を加えることにより反応を止め
た。水350μ、3M酢酸ナトリウム（pH5.6）50μ及び
イソプロパノール500μを加えた後に上清液を沈殿さ
せた。ペレットをH2O100μに溶解させた後、Sephadex
G50で脱塩し、溶出液をエタノールで沈殿させた。
H2O24μでペレットを溶解した後、EcoR Iリンカー
２μｇ、Tris−HCl（pH8.0）30mMまで、MgCl210mMま
で、ジチオスレイトール10mMまで、ATP1mMまで、ゼラチ
ン0.1mg/mlまで及び10UのT4DNA−リガーゼを加え、50μ
中で連結を行った。４℃で16時間インキュベーション
した後、（70℃で15分間）加熱することにより反応を止
めた。次に、100mM Tris−HCl（pH7.6）、50mMNaCl、10
mMMgCl2、2.5mM DTT及び500UのEcoR Iを含有するバッフ
ァ210μ中で制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで切断し
た。37℃で90分間インキュベーションした後、等容量の
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（2
5:24:1）で抽出することにより反応を止めた。酢酸ナト
リウム（pH5.6）を300mMまで加えた後、2.5容のエタノ
ールで上清液を沈殿させ、BiogelA15mカラムでcDNAとリ
ンカーを分離した。エタノールでcDNAを沈殿させ、次に
Tris−HCl10mM、EDTA0.1mM（pH7.6）に沈殿物を溶解し
た。次いで、cDNA分子をファージλgt10（参照文献４）
内にクローン化した。
実施例２ アイメリア・アセルブリナ（E.acervulina）DNAによる
アイメリア・テネラ（E.tenella）cDNAライブラリーの
スクリーニング ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）の
「DNA標識及び検出キット、非放射性」（カタログ番号1
093657）に付随のプロトコールに正確に従って、ランダ
ムプライミング（random priming）することにより、pU
C18/Ea1Aからの296塩基対EcoR Iフラグメントをジゴキ
シゲニン（digoxigenin）−dUTPで標識した。
上記のアイメリア・テネラcDNAライブラリーからの固
定化されたDNAを含むフィルターを、Maniatisら（参照
文献２）が記載したように調製し、（95℃で10分間）変
性させたばかりの標識アイメリア・アセルブリナ（E.ac
ervulina）フラグメントにより、メーカーの指示に従っ
て42℃で16時間精査した。次のようにしてフィルターを
洗浄した:2×SSC、0.1％（w/v）SDS（１×SSCはpH7.0の
クエン酸ナトリウム0.015モル／＋NaCl0.15モル／
）で室温で15分間洗浄を２回;1×SSC、0.1％（w/v）S
DSで68℃で15分間洗浄を２回;0.1×SSC、0.1％（w/v）S
DSで68℃で30分間洗浄を２回及び15分間洗浄を１回;PBS
−Tween（7.65g/Nall,0.91g/Na2HPO4・2H2O、0.21g
/KH2PO4、0.05％（v/v）Tween80、pH7.3）で室温で15
分間洗浄を２回行う。
次に、該フィルターを、アルカリ性ホスファターゼに
結合したポリクローナルヒツジ抗ジゴキシゲニンFabフ
ラグメントのPBS−Tween中の5000倍希釈物と室温で30分
間反応させた。このフィルターを室温でPBS−Tweenで15
分間４回と0.01M Tres−HCl（pH8.0）、0.15M NaClで15
分間１回洗浄した後、0.33g/のニトロブルーテトラゾ
リウム及び0.1M Tris−HCl（pH9.6）、0.1M NaCl、0.01
M MgCl2中0.17g/の５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−ホスフェートの溶液と共にインキュベーショ
ンしてフィルターへのアルカリ性ホスファターゼの結合
を検出した。400個のλgt10アイメリア・テネラ（E.ten
ella）クローンのうち１個がアイメリア・アセルブリナ
（E.acervulina）プローブと反応した；アイメリア・テ
ネラ1A1〜10（λgt10Et1A1〜10）と呼ばれる、前記クロ
ーンのうちの10個をプラーク精製した。λgt10Et1A1は
大腸菌BNN102株と共に、第CBS286.89号としてCentraal
Bureau voor Schimmelculture、Baarn（オランダ）に寄
託されている。プラスミッドpGEM4Z又はバクテリオファ
ージM13（参照文献２）内で作製されたこのcDNA挿入物
のサブクローンから、メーカーの指示（USB配列キッ
ト）に従って完全なヌクレオチド配列を決定した。下記
の文献は明細書中に引用されたものである。
１）J.Pasternakら:Mol.＆ Bioch.Par.３（1981）,133
−142. ２）T.Maniaisら:Molecular Cloning（Cold Spring Har
bor Laboratory）1982. ３）U.Gubblerら:Gene25（1983）、263−269. ４）T.V.Huynkら:DNA Cloning Techniques:A Practical
Approach;D.Glover Oxford（1984）． ５）J.P.Hoppら:Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78（198
1）,3824−3828. ６）P.Y.Chouら:Advances in Enzymology 47（1987）,
45−148。
７）M.F.Goodら:Science 235（1987）、1059−1062.
【図面の簡単な説明】
第１図は、ファージλgt10Et1A1中に挿入されたDNAフラ
グメントEt1A1の制限酵素地図である。 第２図は、ファージλgt10Et1A1中に挿入されDNAのヌク
レオチド配列及びEt1A1の推定アミノ酸配列を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 39/012 Ａ６１Ｋ 39/012 39/395 39/395 Ｄ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ポール・フアン・デン・ブーガート オランダ国、5344・エス・セー・オツ ス、フアン・シエイクストラート・43 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 16/46 C12N 1/00 - 7/08 C12P 21/00 - 21/08 A61K 31/00 - 48/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）
    の蛋白質の少なくとも一部を実質的にコードする核酸配
    列であって、該蛋白質の一部が以下の（配列ａ）に記載
    のアミノ酸配列によって定義されるものである核酸配
    列：
  2. 【請求項２】前記蛋白質の一部分が請求項１に記載の
    （配列ａ）に示されたDNA配列によってコードされてい
    ることを特徴とする請求項１に記載の核酸配列。
  3. 【請求項３】前記核酸配列の発現を可能にする調節配列
    に遺伝子操作により結合させた請求項１又は２に記載の
    核酸配列から成る組換え核酸分子。
  4. 【請求項４】請求項３に記載の組換え核酸分子を含有す
    るベクターウィルス。
  5. 【請求項５】請求項１又は２に記載の核酸配列、請求項
    ３に記載の組換え核酸分子又は請求項４に記載のベクタ
    ーウィルスを含有する宿主細胞。
  6. 【請求項６】請求項１の（配列ａ）に示されたアミノ酸
    配列の少なくとも免疫原性を有する一部を包含するポリ
    ペプチド。
  7. 【請求項７】請求項６に記載のポリペプチドと免疫反応
    性の抗体又は抗血清。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ227597A (en) * 1988-01-15 1991-11-26 Merck & Co Inc Eimeria tenella group b immunogens and their production
US5891432A (en) * 1997-07-29 1999-04-06 The Immune Response Corporation Membrane-bound cytokine compositions comprising GM=CSF and methods of modulating an immune response using same
US7354593B2 (en) 2002-12-09 2008-04-08 Merial Limited Coccidial vaccine and methods of making and using same
WO2004052393A1 (en) * 2002-12-09 2004-06-24 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Coccidial vaccine and methods of making and using same
WO2005089262A2 (en) 2004-03-12 2005-09-29 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Novel peanut skin extract as a vaccine adjuvant

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4874705A (en) * 1985-05-16 1989-10-17 Solvay & Cie, S.A. DNA encoding an antigenic protein derived from Eimeria tenella and vaccines for prevention of coccidiosis caused by Eimeria tenella
ATE145245T1 (de) * 1987-03-06 1996-11-15 Amgen Boulder Inc Polypeptide zur verwendung bei der diagnose von kokkidien-infektion und rekombinant-dns, verfahren zur herstellung derselben
NZ227595A (en) * 1988-01-15 1991-11-26 Merck & Co Inc Recombinant production of eimeria tenella antigens and their use
US4973551A (en) * 1988-01-15 1990-11-27 Merck & Co., Inc. Vector for the expression of fusion proteins and protein immunogens
US5122471A (en) * 1988-02-12 1992-06-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Cloned genes coding for avian coccidiosis antigens which induce a cell-mediated immune response
ZA893740B (en) * 1988-06-03 1990-02-28 Hoffmann La Roche Recombinant coccidiosis vaccines
ZA894726B (en) * 1988-06-27 1990-03-28 Akzo Nv Coccidiosis vaccine
ZA902147B (en) * 1989-03-28 1990-12-28 Akzo Nv Coccidiosis vaccine

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