HU207453B - Method for producing eimare tanella polypeptide, recombinant vector molecule coding the same and host organism transformed with the same - Google Patents
Method for producing eimare tanella polypeptide, recombinant vector molecule coding the same and host organism transformed with the same Download PDFInfo
- Publication number
- HU207453B HU207453B HU896767A HU676789A HU207453B HU 207453 B HU207453 B HU 207453B HU 896767 A HU896767 A HU 896767A HU 676789 A HU676789 A HU 676789A HU 207453 B HU207453 B HU 207453B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- polypeptide
- acid sequence
- dna
- tenella
- same
- Prior art date
Links
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 241001024519 Loktanella Species 0.000 title 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 241000223932 Eimeria tenella Species 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 abstract description 31
- 208000003495 Coccidiosis Diseases 0.000 abstract description 14
- 206010023076 Isosporiasis Diseases 0.000 abstract description 14
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 abstract description 10
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 abstract description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 210000003250 oocyst Anatomy 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 7
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000223931 Eimeria acervulina Species 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003936 merozoite Anatomy 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 description 2
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000224482 Apicomplexa Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010071023 Bacterial Outer Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100516702 Caenorhabditis elegans nlg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000499566 Eimeria brunetti Species 0.000 description 1
- 244000309702 Eimeria hagani Species 0.000 description 1
- 241000223934 Eimeria maxima Species 0.000 description 1
- 241000179199 Eimeria mitis Species 0.000 description 1
- 241000530449 Eimeria mivati Species 0.000 description 1
- 241000499563 Eimeria necatrix Species 0.000 description 1
- 241000499544 Eimeria praecox Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 235000012377 Salvia columbariae var. columbariae Nutrition 0.000 description 1
- 240000005481 Salvia hispanica Species 0.000 description 1
- 235000001498 Salvia hispanica Nutrition 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000014167 chia Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 230000010485 coping Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 244000000056 intracellular parasite Species 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N potassium dichromate Chemical compound [K+].[K+].[O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L sodium dithionite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])=O JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- -1 vanadyl ribonucleoside complexes Chemical class 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/455—Eimeria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya Eimeria tenella polipeptid előállítása.
A találmány közelebbről Eimeria tenella polipeptidet kódoló nukleinsav (DNS) szekvencia, egy ilyen nukleinsav szekvenciát tartalmazó rekombináns nukleinsav molekula, az említett nukleinsav szekvenciát tartalmazó vektor vagy gazdasejt, valamint Eimeria tenella polipeptid előállítására vonatkozik.
A coccidiosis olyan betegség, amelyet az Apicomplexa suphylumba és Eimeria nemzetségbe tartozó intracelluláris paraziták és protozoák okoznak. Ezek a paraziták a gazdaállataik gasztrointesztinális traktusának és emésztőszerveinek sejtjeiben szaporodnak.
Az egyre fokozódó intenzív termelés következtében a baromfiiparban ezen paraziták által okozott kár riasztóan megnőtt az utolsó tíz évben. Hollandiában a baromfitermelők kára évente millió gulden nagyságrendű, 1986-ban a kár kb. 13 millió gulden volt. Ugyanabban az évben az Amerikai Egyesült Államokban a kár 300 millió dollár körül volt, a coccodiostatikumok alkalmazása ellenére.
Csirkék esetén a coccidiosist okozó patogének kilenc típusba oszthatók, éspedig Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, E. mivati és E. hagani. Néhányan azonban kétségbe vonják a két utolsó típus létezését. Ezeknek a típusoknak csak a csirke a gazdaállata, és ezek magas szövet-fajlagosságot mutatnak. Az említett típusok életciklusa azonban hasonló.
Az Eimeria paraziták életciklusuk során számos formán mennek át. A fertőző forma (spórás oociszta) orálisan jut a csirkék gyomrába, ahol az emésztés hatására a ciszta héja felnyílik. Az oocisztában található négy darab sporociszta kiszabadul, és a duodénumba jut, így ezek epe- és emésztőenzimeknek vannak kitéve. Ennek hatására a sporociszta falon egy nyílás keletkezik, így a sporocisztában található sporozoiták kiszabadulnak. Ezek a sporozoiták mozgékonyak, és alkalmas gazdasejtet, például epitéliumsejtet keresnek, ahová behatolnak és ott szaporodnak. A típustól függően ez az első reprodukciós fázis 20-48 óra hosszat tart, és néhányszor tíztől százig terjedő merozoita képződik, amelyek mindegyike új gazdasejtbe hatol be, és reprodukálódik. Kettőtől néhányszor ötig terjedő ilyen aszexuális reprodukciós ciklus után az intracelluláris merozoiták szexuális formába, hím és női gametociták formájába mennek át. Miután egy hím gaméta megtermékenyít egy női gamétát, egy zigóta képződik, amely maga körül cisztafalat képez. Ez az oociszta elhagyja a gazdasejtet, és a fekáliával kiürül. Ha a csirke testén kívül a hőmérséklet és a nedvességtartalom viszonylag magas, és ugyanakkor elegendő oxigén van a levegőben, az oociszta spórát képez, és fertőző formába alakul.
így intermedier gazdaállat nem szükéges ahhoz, hogy a parazita egyik csirkéből a másikba jusson, A területegységre jutó csirék számával tehát a csirkefarmon a fertőzési veszély gyorsan növekszik.
A parazita különböző módokon küzdhető le.
A jótartás mellett a coccidiosis különböző coccidiosis elleni szerekkel küzdhető le, amelyeket többnyire a takarmányhoz vagy az ivóvízhez kevernek. Ezek a szerek azonban az utóbbi években vesztettek hatékonyságukból, részben azért, mert a parazita nagy genetikai kapacitásánál fogva rezisztenciát tud kifejleszteni a különböző coccidiosis elleni szerekkel szemben. Emellett ezen szereknek a maradéka megjelenik a húsban, amely fogyasztási problémákat okoz.
Ezért az immunológiai profilaxis jobb leküzdési módszer lenne. Ismeretes, hogy azok a csirkék, amelyek egy kellően nagy fertőzést átéltek, ellenállóak az ugyanolyan típusú Eimeria fertőzéssel szemben. Eimeria elleni rezisztencia kifejleszthető úgy is, hogy az állatokat néhányszor kisebb dózisú oocisztával vagy gyengített (nem patogén) törzs oocisztájával fertőzzük. A kontrollált adagolás azonban különösen nagyszámú vágóállat esetén szinte leküzdhetetlen probléma. így az egyetlen megoldásnak látszik az inaktivált vakcina.
Az inaktivált vakcina a parazitából származó antigénből áll, adott esetben adjuvánssal kombinálva.
A parazitából izolált antigén helyett alkalmazhatunk rekombináns DNS technológiával előállított terméket.
Ezenkívül a vakcinálást végezhetjük úgy, hogy élő gazdaszervezetet adagolunk, például baktériumot, gombát vagy vírust, amely az antigént kódoló gént tartalmazza. Ez a szervezet azután az antigén kellően hosszú ideig tartó szintézisét biztosítja, így a csirke immunrendszere kellően stimulálódik.
Ugyanakkor lehetőség van arra is, hogy az antigént vagy annak részeit szintetikusan állítsuk elő, és adagoljuk az állatoknak immunológiailag felismerhető és stimuláló formában, például egy hordozó fehérjéhez kötve, adjuváns jelenlétében.
Eimeria tenella antigén előállítását, illetve DNSszekvenciáját számos helyen ismertetik, így például a WO 86/00528 és WO 88/06629 számon közrebocsátott PCT szabadalmi bejelentések; Brothers és munkatársai [Mól. Biochem. Pasrasit. 28, 235-247 (1988)]; Files és munkatársai [UCLA 42, 713-721 (1987)]; Clarké és munkatársai [UCLA 42, 701-711 (1987)]; Profous-Juchelka és munkatársai [Mól. Biochem. Párásítói. 30, 233-241 (1988)], ezek szekvenciája azonban a találmány szerintitől eltérő.
A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvencia, amely lényegében az Eimeria tenella proteinek legalább egy részét kódolja - ezen protein egy részének aminosav-szekvenciáját a 2. ábra szemlélteti -, olyan vakcina előállítására használható, amely baromfiak coccidiosis elleni immunizálására alkalmazható. A „nukleinsav-szekvencia” kifejezés nukleotidok bármilyen hosszúságú polimer formáját jelenti, mégpedig mind ribonukleinsav szekvenciákat, mind dezoxiribonukleinsav szekvenciákat. A kifejezés alapvetően a molekula elsődleges szerkezetére utal. A kifejezés tehát magában foglalja mind a kettősszálú, mind az egyszálú DNS-t, valamint a kettőszálú és egyszálú RNS-t és ezek módosulatait.
Az Eimeria tenella protein egy részét - amelynek aminosav-szekvenciáját a 2. ábra szemlélteti (amelyet Etl Al jellel jelölünk) - kódoló nukleinsav szekvencia a XgtlOEtlAl fágban van jelen. Ezt a fágot az Escheri2
HU chia coli BNN102 törzsben helyeztük letétbe a Centraal Buieau voor Schimmelcultures, Baam, Hollandia intézetnél a CBS 286.89 számon.
A XgtlOEtlAl fágot úgy állítottuk elő, hogy először cDNS könyvtárat készítettünk spórázott E. tenella oocisztákból. A cDNS könyvtár átvizsgálását pEalA plazmidban lévő 296 bp hosszúságú, jelzett EcoRl próbával végeztük. A pEalA plazmiddai Escherichia coli K12JA221 törzset transzformáltuk, és a Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baam, Hollandia intézetnél letétbe helyeztük, CBS 143.88 számon.
Ezután a találmány szerinti nukleinsav szekvenciát tartalmazó E. tenella kiónt plakk-tisztításnak vetettük alá. Ebből a fág klónból izolálható a XgtlOEtlAl-be beiktatott DNS-szekvencia. Elkészítettük a EtlAl restrikciós enzim térképét (1. ábra).
A nukleotid szekvenciát, amelyet az említett inszert cDNS szekciója esetén meghatároztunk, a 2. ábrán mutatjuk be, bemutatjuk továbbá az abból levezetett aminosav szekvenciát.
Az említett szekvenciák Eimeria tenella proteinnek csak egy részét képviselik. A nukleotid szekvenciát illetően az E. tenella proteint kódoló gén 5’-vége nincsen jelen, az N-terminális valószínűleg hiányzik az E. tenella protein aminosav szekvenciájából.
Az E. tenella protein 2. ábrán jelen nem lévő 5’ nukleinsav szekvenciáját szokásos rekombináns DNS módszerekkel előállíthatjuk, így például úgy, hogy E. tenella RNS-t izolálunk, ezt az RNS-t a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvencia 5’végéből származó printerrel hibridizáljuk, és ezt a prímért például reverz transzkriptáz segítségével meghosszabbítjuk. Azután az újonnan szintetizált DNS-t szokásos géntechnológiai módszerekkel kettős szálúvá alakíthatjuk, klónozhatjuk egy alkalmas vektorba, és meghatározhatjuk szekvenciáját.
Egy másik lehetőség szerint arra, hogy cDNS könyvtárat a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszekvencia 5’-végéből származó restrikciós fragmenssel átvizsgáljuk, izoláljuk azokat a kiónokat, amelyek olyan DNS-szekvenciát tartalmaznak, amelyek átfedést mutatnak a 2. ábrán szemléltetett nukleinsav-szekvenciával, de még 5’-szekvenciát is tartalmaznak.
Az E. tenella protein egy részét kódoló dezoxinukleinsav-szekvenciát a 2. ábra szemlélteti. Ez a cDNS szekvencia 1970 nukleotid hosszúságú (beleértve a stop kodont). Egy olyan nukleinsav-szekvencia, amely lényegében véve az említett cDNS-szekvenciából, vagy annak egy fragmenséből áll, valamint egy olyan nukleinsav-szekvencia, amely az említett cDNS vagy annak fragmensei mellett további, az E. tenella proteinnek megfelelő nukleotidokat tartalmaz, például az E. tenella proteint kódoló komplett gént, a találmány tárgykörébe tartozik.
Amint az a technika állása szerint ismert, a genetikai kód degenerációja lehetővé teszi, hogy egy kodonban a bázisokat úgy cseréljük ki, hogy egy másik kodon képződjön, amely azonban ugyanazt az aminosavat kódolja, így például a glutaminsavat a GAT és a GAA kodon kódolja. Nyilvánvaló tehát, hogy egy, a 2. ábrán bemutatott
453 B aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptid vagy annak egy antigén fragmense egy ilyen alternatív, a 2. ábrán bemutatott nukleinsav szekvenciától eltérő kodon kompozícióval kifejezhető.
A találmány tárgykörébe tartozik továbbá az olyan nukleinsav-szekvencia is, amely legalább 95%-ban homológiát mutat a 2. ábrán bemutatott nukleinsav szekvenciával vagy annak egy részével, de nukleotid helyettesítést, mutációt, beiktatást, törlést, inverziót tartalmaz, és olyan proteint vagy polipeptidet kódol, amely funkcionálisan ekvivalens a 2. ábrán bemutatott polipeptiddel vagy annak egy fragmensével.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan polipeptid előállítására, amelyet a fenti nukleinsav-szekvencia kódol, és amely baromfiak coccidiosis elleni immunizálására alkalmazható.
A találmány tárgykörébe tartozik továbbá az olyan polipeptid, amely lényegében a 2. ábrán bemutatott aminosav-szekvencia legalább egy részét tartalmazza.
A „polipeptid” kifejezés aminosavak lánc alakú molekulát jelenti, és nem jelent egy bizonyos hoszszúságot a termék esetén. így többek között peptidek, oligopeptidek és proteinek beletartoznak a polipeptid meghatározásba.
Nyilvánvaló, hogy a 2. ábrán bemutatott polipeptidnek természetes variációi léteznek. Ezekben a variációkban egy vagy több aminosav különbség lehet a teljes szekvenciában, vagy a polipeptidben lehetnek törlések, helyettesítések, beiktatások, inverziók vagy egy vagy több aminosav hozzáadása.
Ezenkívül a rekombináns DNS technológia alkalmazásában benne rejlik a lehetőség, hogy a 2. ábrán bemutatott polipeptid különböző olyan származékát állítsuk elő, amelyek egy vagy több aminosav helyettesítésével, törlésével, hozzáadásával vagy kicserélésével módosítva vannak. Minden, a 2. ábrán bemutatott polipeptid említett módosításával készült származék vagy annak fragmense, valamint az olyan polipeptid, amely ilyen származékot vagy annak fragmensét tartalmazza, a találmány tárgykörébe tartozik mindaddig, míg megtartja a 2. ábrán bemutatott polipeptid vagy annak antigén fragmense alapvető jellemzőit és aktivitását.
Emellett az ezen polipeptidek fragmensei, amelyek baromfiak coccidiosis elleni immunizálására alkalmazhatók, szintén a találmány tárgyát képezik.
Különböző módszerek ismeretesek az ilyen alkalmazható polipeptid fragmensek (epitópok) kimutatására ismert vagy nem ismert aminosav-Szekvencián belül. Egy ismert aminosav-szekvencia alapján ezek az epitópok kísérleti úton átvizsgáló módszerekkerl meghatározhatók, mint amelyeket például a WO 84/03564 és a WO 86/06487 számú közzétett PCT szabadalmi bejelentések ismertetnek.
Emellett a polipeptid számos, az említett aminosav-szekvenciával rendelkező területen epitópként jelölhető meg elméleti megfontolások alapján és a jelenleg ismeretes epitópokkal való strukturális megegyezés alapján. Ezen területek meghatározását a J. P. Hopp és K. R. Wodds szerinti [proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,38243828 (1981)] hidrofilitási kritériumok és a P. Y. Chou és
HU 207 453 Β
G. D. Fasman szerinti [Advances in Enzymology 47, 49148 (1987)] másodlagos strukturális szempontok kombinációja alapján határoztuk meg,
T-sejt epitópok, amelyek szükségesek lehetnek, hasonlóképpen elméleti alapon levezethetők a Berzofskyféle amfifilitási kritériumok alapján. [Μ. E Good és munkatársai, Science 235, 1059-1062 (1987)].
A találmány értelmében coccidiosis elleni immunizálásra alkalmazhatók továbbá például az anti-idiotípusos antitestek vagy azok antigénmegkötő fragmensei. Az ilyen antitestek azon antitestek idiotípusa ellen képződnek, amelyek viszont a találmány szerinti polipeptid ellen képződnek. A találmány szerinti polipeptid immunogén ekvivalensei alatt többek között az ilyen anti-idiotípus antitestet értjük.
A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvencia ligálható különböző kifejeződést eredményező DNS-szekvenciához, amelyek adott esetben más polipeptid, például β-galaktozidáz részét kódoló szekvenciát tartalmaznak, így úgynevezett rekombináns nukleinsav molekulát kapunk, amely alkalmas gazdaszervezet transzformálására használható. Ilyen hibrid DNS molekulákat előnyösen például plazmidokból vagy bakteriofágokban vagy vírusokban jelen lévő nukleinsav-szekvenciákból készítünk. A „transzformálás” kifejezés azt jelenti, hogy egy gazdasejtbe hcterológ nukleinsav-szekvenciát vezetünk be, tekintet nélkül az alkalmazott módszerre, amely lehet például közvetlen felvétel vagy transzdukció. A heterológ nukleinsavszekvencia fenntartható autonóm replikációval, vagy integrálható a gazdaszervezet genomjába. A rekombináns DNS molekulák előnyösen alkalmas szabályozó szekvenciát is tartalmaznak, amelyek kompatíbilisek az alkalmazott gazdaszervezettel. A kontroll szekvenciák szabályozzák a beiktatott nukleinsav-szekvencia kifejeződését.
Az alkalmas gazdasejt olyan sejt, amely a polipeptidet kódoló nukleinsav-szekvenciával vagy egy ilyen nukleinsav-szckvenciát tartalmazó rekombináns nukleinsav molekulával transzformálható, és amellyel az említett nukleinsav szekvenciával kódolt polipeptid kifejezhető. A gazdasejt lehet prokarióta eredetű, például baktérium, mint például E. coli, B. subtilis és Pseudomonas fajok; vagy eukarióta eredetű, mint például az élesztő, például Saccharomyces cerevisiae vagy magasabb rendű eukarióta sejtek, mint például rovarok, növények vagy emlőssejtek, beleértve a HeLa sejteket és a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket.
A kívánt immunizálás elérhető például úgy, hogy a polipeptidet vagy vagy annak immunogén szekcióját vagy ekvivalensét adagoljuk az állatoknak, vagy elérhető úgy, hogy az immunizálandó állatoknak olyan mikroorganizmust adagolunk, amelyet rekombináns DNS-sel genetikailag módosítottunk, és amely képes a polipeptidet vagy annak immunogén szekcióját vagy ekvivalensét in situ termelni. A találmány értelmében baromfiak coccidiosis elleni immunizálása elérhető úgy, hogy egyrészt a polipeptidet vagy annak fragmensét vagy immunogén ekvivalensét adagoljuk az állatoknak, vagy másrészt úgy, hogy olyan genetikailag manipulált mikroorganizmust adagolunk az állatoknak, amely a polipeptid termelésére képes. Az első esetet „alegység vakcináknak”, míg a második esetet „vektor vakcináknak” nevezik. A továbbiakban mi is alkalmazzuk ezt a nómenklatúrát.
Alegység vakcinák általában polipeptideket tartalmaznak tisztított formában, adott esetbern farmakológiailag elfogadható hordozó jelenlétében. A polipeptid adott esetben egy nemrokon proteinhez lehet kötve kovalensen, amely például a fúziós termék tisztításánál lehet előnyös. Ilyenek például a β-galaktozidáz, protein-A, prokimozin, Xa véralvadásfaktor stb.
Az ilyen célra alkalmazott polipeptidek ismert módon állíthatók elő, például E. acervulina fajból történő izolálással, rekombináns DNS technikával vagy peptid szintézissel.
Kívánt esetben a polipeptidek in vivő vagy in vitro módosíthatók, például glikozilezéssel, amidálással, karboxilezéssel vagy foszforilezéssel.
Vektor vakcinák esetén a találmány szerinti polipeptid terméket genetikailag manipulált szervezetek készítik, amelyeket magukat adagolunk az immunizálandó egyednek, és amelyek bizonyos ideig fenntartják magukat, sőt reprodukálódnak a testben. Ilyen célra gazdaként különböző szervezetek alkalmazhatók, mint például baktériumok, mint például baktériumok, például Escherichia coli, Bacillus vagy Salmonella vagy vírusok, például szarvasmarha vagy szárnyas himlővírusok. Ilyen típusú gazdaszervezettel a polipeptid felületi antigénként fejeződik ki. Ilyen összefüggésben az adott polipeptid és OMP proteinek vagy Escherichia coli pilus proteinjei vagy a szervezet által felismert szignál és kötőhely szekvenciák szintetikus formái közötti fúzió képzelhető el. Az is lehetséges, hogy az adott immunogén polipeptid kívánt esetben egy nagyobb egésznek a részeként kerül az immunizálandó állatba. Mindezen esetekben az is lehetséges, hogy egy vagy több immunogén tennék fejeződik ki, amelyek különböző patogének és/vagy az adott patogén különböző antigénjei ellen alakítanak ki védettséget.
Tekintettel arra az alapvető homológiára, amely a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszekvencia és az E. acervulinából származó, egy védő polipeptidet kódoló DNS fragmens (2. példa) között fennáll, feltételezhető, hogy az említett nukleinsavszekvencia vagy egy annak megfelelő polipeptid baromfik más Eímeria fajok elleni, különösen E. acervulina elleni vakcinálására alkalmazható.
Nyilvánvaló, hogy azok a madarak, amelyek már E. tenellával fertőzöttek, kezelhetők az említett E. tenella elleni antitestekkel. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid elleni antiszérum vagy antitestek alkalmazhatók coccidiosis terápiás kezelésére. Az említett antiszérum vagy antitestek úgy állíthatók elő, hogy az említett polipeptiddel állatot immunizálunk, és abból antiszérumot izolálunk.
A találmány szerinti eljárássl előállított polipeptid elleni monoklonális antitestek szintén alkalmazhatók E. tenellával fertőzött madarak kezelésére. Monoklonális antitestek a techn ika állása szerint ilyen célra szolgáló mód4
HU szerekkel állíthatók elő, például úgy, hogy említett polipeptiddel egereket immunizálunk, az egerek lépsejtjeit immortalizáljuk, és kiválogatjuk a hasznos antitesteket termelő hibridómákat. Immortalizált, antitestet termelő sejtvonalakat úgy is készíthetünk, hogy B limfocitákat onkogén DNS-sel közvetlenül transzformálunk, vagy Epstein-Barr vírussal fertőzünk.
Monoklonális antitestek különösen használhatók olyan célra, hogy a technika állása szerinti ismert módszerrel anti-idiotípusos antitesteket állítsurtk elő. Ezek az anti-idiotípusos antitestek szintén alkalmazhatók madaraknál coccidiosis megelőzésére.
Az említett antiszérum és monoklonális antitestek alkalmazhatók E. tenellával fertőzött madarak immunológiai diagnosztizálására is.
A találmány szerinti megoldás előnye, hogy olyan antigén proteinek előállítását teszi lehetővé, amelyek coccidiosis elleni vakcinák előállítására alkalmazhatók. A transzformált gazdaszervezetet vagy annak részét tartalmazó vakcina előnye, hogy védelem érhető el vele a vakcinálásból eredető fertőzés veszélye nélkül. A protein szekvenciájának ismerete lehetővé teszi, hogy ezt egy vírus vektorba juttassuk be, és coccidiosis elleni vektor vakcinát állítsunk elő.
A találmány szerinti eljárást a következő ábrákkal és példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.
Az 1. ábra XgtlOEtlAl fágba beiktatott, EtlAl jelű DNS fragmens restrikciós térképe.
A 2. ábra a XgtlOEtlAl fágba beiktatott DNS nukleotid szekvenciája, és az abból levezetett aminosavszekvencia.
I. példa
E. tenella oociszták spóraképzése
5xl08 E. tenella oociszta 60 ml 10-4 mól/l-es nátrium-ditionittel készült szuszpenzióját lecentrifugáljuk, az üledéket 100 ml steril vízzel mossuk. Eztuán a sejteket 500 ml 2%-os kálium-bikromátban szuszpendáljuk, majd erős levegőztetés közben 7 óra hosszat 30 °C-on inkubáljuk. Ezután az oocisztákat centrifugálással összegyűjtjük, és 3x200 ml steril vízzel mossuk.
RNS izolálása
Az RNS izolálásához [J. Pastemakés munkatársai. Mól. & Bioch. Pár. 3, 133-142 (1918)] a sejtüledéket 2,8 ml pufferrel felvesszük, amelynek összetétele mmól/1 tris-acetát (pH=7,6), 75 mmól/1 nátriumacetát, 1% nátrium-dodecil-szulfát, 2 mmól/1 EDTA, 0,2 mg/ml proteináz-K és 10 mmól/1 vanadil-ribonukleozid-komplexek. Az oocisztákat 13 g, 0,15 mm átmérőjű üveggyöngy jelenlétében 60 másodpercig végzett keveréssel szétzúzzuk. Ezután hozzáadunk 5 ml fenolt és az elegyet további 60 másodpercig erőteljesen keverjük. Centrifugálás után a felülúszót lepipettázzuk, és újra extraháljuk fenol, kloroform és izoamil-alkohol
15:24:1 térfogatarányú, azonos térfogatú mennyiségével. Az RNS-t 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, a kapott csapadékot 800 pl, 10 mmól/1 trist és 0,1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldattal (T10E01, pH=7,6) feloldjuk, majd a terméket azonos térfogatú fenol, kloroform
453 B és izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú elegyével kétszer, és kloroform és izoamil-alkohol 24:1 térfogatarányú elegyével kétszer extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A poliA+-RNS-t-oligo(dT)-cellulóz kromatográfiával izoláljuk [Maniatil és munkatársai: Molecular Cloning (Cold Spring Harter Labratory) 1982)] 5xl0-8 oocisztából kb. 100 pg poliA+-RNS-t izolálunk.
cDNS szintézise
A poliA+-RNSt-t cDNS-sé alakítjuk MMLV (Moloney Murine Leukémia Vírus) reverz transzriptáz segítségével. Ehhez 25 pg poliA+-RNS-t feloldunk 90 μΐ vízben, és 5 percig 20 °C-on merkuri-metil-hidroxid 10 mmól/1 koncentrációig történő adagolásával denaturáljuk, majd az elegyhez β-merkapto-étanolt adagolunk 45 mmól/1 koncentrációig, és az elegyet további 3 percig 20 °C-on inkubáljuk. Az enzimreakciót 190 μΐ puffer-oldatban hajtjuk végre, amelynek összetétele 4 pg oligo(dT)15, 150 egység RNSsinI. * * * * * * * * (R), 20 mmól/1 Tris (pH=7,6) 30 mmól/1 KC1, 4 mmól/1 ditiotreitol (DTT), 2 mmól/1 MgCl2, 1-1 mmól/1 dNTP és 3000 egység MMLV reverz transzkriptáz. A reakcióelegyet 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk, majd 10 pl 0,5 mmól/l-es EDTA-val leállítjuk a reakciót. Ezután azonos térfogatú fenol, kloroform és izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú elegyével extraháljuk és az RNS/DNS hibridet ammóniüm-acetát 2 mól/1 koncentrációig történő adagolásával és 2,5-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk. A második szál szintézisét DNS-polimeráz I és RN-áz H [U. Gulbber és munkatársai, Gene 25, 263269 (1983)] kombinációjával végezzük. Áz előbbi csapadékot 960 pl pufferben oldjuk, amelynek összetétele 20 mmól/1 Tris (pH=7,6), 5 mmól/1 MgCl2, 100 mmól/1 (NH4)2SO4,0,6 mmól/1 β-NAD, 16 egység RN-áz H, (Pharmacia gyártmány) 200 egység DNSpolimeráz I és 20 egység DNS-ligáz (F. coli). Az inkubálást 12 °C-on egy óra hosszat, majd 22 °C-on egy óra hosszat végezzük, ezután a reakciót azonos térfogatú fenol, kloroform és izoamil-alkohol 25:24: 1 térfogatarányú elegyével leállítjuk, és etanollal kicsapjuk.
Mielőtt a cDNS-t egy alkalmas vektorba klónozzuk, előbb azt módosítjuk. 5 pg cDNS-t feloldunk 100 pl pufferben, amelynek összetétele 30 mmól/1 nátrium-acetát (pH=5,6), 50 mmól/1 NaCl, 1 mmól/1 ZnSO4 és 21 egység Mung bab nukleáz (Pharmacia gyártmány), A reakcióelegyet 37 °C-on 30 percig inkubáljuk, majd a reakciót EDTA 10 mmól/1 koncentrációig és Tris 25 mmól/1 koncentrációig történő adagolásával leállítjuk. Extreakciót végzünk fenol, kloroform és izoamil-alkohol 25: 24:1 térfogatarányú elegyével, és az elegyet Sephadex G50 oszlopon sómentesítjük.
125 pl eluátumhoz a következő anyagokat adjuk: Tris (pH=7,6) 50 mmól/l-ig, EDTA 2,5 mmól/l-ig, DTT 5 mmól/l-ig, S’-adenozil-metionin 0,5 mmól/l-ig és 100 egység EcoRI-metiláz. Az elegyet 37 °C-on 30 percig inkubáljuk, majd 15 percig 65 °C-ra melegítve a reakciót leállítjuk, ezután 1/10 térfogatnyi következő összetételű oldatot adjuk hozzá: Tris-HCl 100 mmól/1, MgCl2 100 mmól/1 és NaCl 500 mmól/1
HU 207 453 Β (pH=7,5), ugyanakkor hozzáadunk 1-1 mmól/1 dNTP-t és 12,5 egység Klenow DNS-polimerázt.
A reakciót azonos térfogatú fenol, kloroform, izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú elegy adagolásával leállítjuk, miután 22 °C-on 60 percig inkubáltunk. A felülúszó folyadékot 350 pl víz, 50 μΐ 3 mól/l-es nátrium-acetát (pH=5,6) és 500 μΐ izopropanol adagolásával kicsapjuk. A csapadékot 100 μΐ vízben feloldjuk, és Sephadex G50 oszlopon sómentesítjük, az eluátumot etanollal kicsapjuk.
A csapadékot 24 μΐ vízben feloldjuk, és a ligálást 50 μΐ térfogatban hajtjuk végre, amelyhez a következő anyagokat adjuk: 2 pg EcoRI linker, Tris-HCl (pH=8,0) 30 mmól/l-ig, MgCl2 10 mmól/l-ig, ditiotreitol 10 mmól/l-ig, ATP 1 mmól/l-ig, zselatin 0,1 mg/ml-ig és 10 egység T4DNS-ligáz. A reakcióelegyet 16 óra hosszat 4 °C-on inkubáljuk, majd 15 percig 70 °C-on melegítve a reakciót leállítjuk. Ezután EcoRI endonukleázzal hasítunk 210 μΐ pufferben, amelynek összetétele: 100 mmól/1 Tris-HCl (pH=7,6), 50 mmól/1 NaCl, 10 mmól/1 MgCl2, 2,5 mmól/1 DTT és 500 egység EcoRI. A reakcióelegyet 37 °C-on 90 percig inkubáljuk, majd a reakciót azonos téfogatú fenol, kloroform, izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú eleggyel történő extrakcióval leállítjuk. A felülúszó folyadékot 2,5-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk, majd nátrium-acetátot (pH=5,6) adunk hozzá 300 mmól/1 koncentrációig, majd a cDNS-t és a linkereket Biogel A15m oszlopon elválasztjuk. A cDNS-t etanollal kicsapjuk, majd a csapadékot 10 mmól/1 Tris-HClot és 0,1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldattal (pH=7,6) feloldjuk. A cDNS molekulákat ezután XgtlO fágba klónozzuk. [T. V. Huynh és munkatársai: DNA Cloning Techniques: A Practical Approach; D. Glower Oxford (1984)].
2. példa
E. tenella cDNS könyvtár átvizsgálása E. acervulina DNS-sel pUC18/EalA (CBS 14388) 296 bp EcoRI fragmensét digoxigenin-dUTP-vel jeleztük random színezéssel, pontosan követve a Bochringer, Mannheim gyártmányú DNS jelölő és detektáló készlet (nemradioaktív, 1093 657 katalógusszám) használati utasítását.
A fenti E. tenella CDNS könyvtárból származó immobolizált DNS-t tartalmazó szűrőket állítottunk elő Maniatis és munkatársai előírása szerint (id. h.), és a frissen denaturált (10 perc 95 °C-on), jelzett E. acervulina fragmenssel vizsgáltuk 16 óra hosszat 42 °C-on az előállító instrukciói szerint. A szűrőket ezután mostuk a következő oldatokkal: kétszer 15 percig szobahőmérsékleten 2xSSC (nátrium-citrátos sóoldat) 0,1 töm/térfogat% (lxSSC): 0,015 mól/1 nátrium-citrát, pH=7,0 0,16 mól/1 NaCl), kétszer 15 percig 68 °C-on lxSSC, 0,1 töm/térfogat%, SDS, kétszer 30 és egyszer 15 percig 68 °C-on, 0,lxSSC, 0,1 töm/térfogat% SDS, és kétszer 15 percig szobahőmérsékleten PBS-Tween (7,65 g/1 NaCl, 0,91 g/1 Na2HPO4x 2 H2O, 0,21 g/1 KH2PO4, 0,05 térfogat% Tween 80, pH = 7,3).
A szűrőket ezután 30 percig szobahőmérsékleten alkalikus foszfatázzal kapcsolt poliklonális birka antidigoxigenin fragmensek PBS-Tweennel készült 1:5000-szeres hígításával reagáltatunk. Ezután a szűrőket négyszer 15 percig szobahőmérsékleten PBSTweennel és 15 percig a következő oldattal mostuk: 0,01 mól/1 Tris-HCl (pH = 8,0) +0,15 mól/1 nátriumklorid. Az alkalikus foszfatáz szűrőkhöz való kapcsolódását a következő oldatban történt inkubálás után detektáltuk:
0,33 g/1 nitrokék-tetrazólium és 0,17 g/1 5-bróm-4klór-3-indolil-foszfát 0,1 mól/1 Tris-HCl (pH = 9,6), 0,1 mól/1 nátrium-klorid, 0,01 mól/l magnézium-klorid tartalmú oldatban. Minden 400 XgtlO E. tenella kiónból egy reagált az E. acervulina próbával, ebből tízet, amelyeket a következő jellel láttunk el: E. tenellalAl10 (Á.gtlOEtlAl-10), plakk-tisztításnak vetettünk alá. A XgtlOEtlAl-et az Escherichia coli BNN102 törzzsel együtt Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn (Hollandia) intézetnél helyeztünk letétbe, CBS 286.89 számon. A DNS inzert PGEM4Z plazmidban (beszerezhető ProMega-tól) vagy az M 13 bakteriofágban készített szubklónjainak a teljes nukleotid szekvenciáját meghatároztuk a gyártó előírásai szerint (USB szekvenciameghatározó kit), és így a 2. ábrán megadott szekvenciát kaptuk.
Claims (7)
1. Eljárás Eimeria tenella immunogén aktivitással rendelkező polipeptidet kódoló rekombináns vektor molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy
- E. tenellából DNS-t állítunk elő, amely tartalmazza a 2. ábrán bemutatott DNS-szekvenciát,
- a kapott E. tenella DNS-t és egy vektor DNS-t restrikciós enzimmel hasítunk,
- a kapott DNS-eket ligáljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként lambda-gtlO fágot használunk.
3. Eljárás Eimeria tenella immunogén aktivitással rendelkező polipeptidet kódoló rekombináns vektor molekulával transzformált gazdaszervezet előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas gazdaszervezetet egy, az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárással előállított vektor molekulával transzformálunk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, hogy gazdaszervezetként prokariota szervezetet transzformálunk.
5. Eljárás Eimeria tenella immunogén aktivitással rendelkező, a 2. ábra szerinti aminosav-szekvenciájú, polipeptid előállítására, azz.al jellemezve, hogy valamely a 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárással transzformált gazdaszervezetet tenyésztünk, és kívánt esetben a kapott polipeptidet a tenyészközegből kinyerjük.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezetként a CBS 143.88 számon deponált E. coli törzset tenyésztjük.
7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás a 2. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával 95% homológját mutató polipeptid előállítására,, azzal jellemezve, hogy' a megfelelő gazdaszervezetet tenyésztjük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ZA894726A ZA894726B (en) | 1988-06-27 | 1989-06-21 | Coccidiosis vaccine |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU896767D0 HU896767D0 (en) | 1990-02-28 |
| HUT55640A HUT55640A (en) | 1991-06-28 |
| HU207453B true HU207453B (en) | 1993-04-28 |
Family
ID=26121432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU896767A HU207453B (en) | 1989-06-21 | 1989-12-22 | Method for producing eimare tanella polypeptide, recombinant vector molecule coding the same and host organism transformed with the same |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5637487A (hu) |
| EP (1) | EP0403698B1 (hu) |
| JP (1) | JP3076050B2 (hu) |
| KR (1) | KR0152245B1 (hu) |
| AT (1) | ATE94208T1 (hu) |
| AU (1) | AU626366B2 (hu) |
| CA (1) | CA2006412C (hu) |
| DE (1) | DE68909041T2 (hu) |
| ES (1) | ES2059711T3 (hu) |
| HU (1) | HU207453B (hu) |
| NZ (1) | NZ231918A (hu) |
| ZA (1) | ZA899853B (hu) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ227597A (en) * | 1988-01-15 | 1991-11-26 | Merck & Co Inc | Eimeria tenella group b immunogens and their production |
| US5891432A (en) * | 1997-07-29 | 1999-04-06 | The Immune Response Corporation | Membrane-bound cytokine compositions comprising GM=CSF and methods of modulating an immune response using same |
| US7354593B2 (en) | 2002-12-09 | 2008-04-08 | Merial Limited | Coccidial vaccine and methods of making and using same |
| WO2004052393A1 (en) * | 2002-12-09 | 2004-06-24 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Coccidial vaccine and methods of making and using same |
| WO2005089262A2 (en) | 2004-03-12 | 2005-09-29 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Novel peanut skin extract as a vaccine adjuvant |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4874705A (en) * | 1985-05-16 | 1989-10-17 | Solvay & Cie, S.A. | DNA encoding an antigenic protein derived from Eimeria tenella and vaccines for prevention of coccidiosis caused by Eimeria tenella |
| ATE145245T1 (de) * | 1987-03-06 | 1996-11-15 | Amgen Boulder Inc | Polypeptide zur verwendung bei der diagnose von kokkidien-infektion und rekombinant-dns, verfahren zur herstellung derselben |
| NZ227595A (en) * | 1988-01-15 | 1991-11-26 | Merck & Co Inc | Recombinant production of eimeria tenella antigens and their use |
| US4973551A (en) * | 1988-01-15 | 1990-11-27 | Merck & Co., Inc. | Vector for the expression of fusion proteins and protein immunogens |
| US5122471A (en) * | 1988-02-12 | 1992-06-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Cloned genes coding for avian coccidiosis antigens which induce a cell-mediated immune response |
| ZA893740B (en) * | 1988-06-03 | 1990-02-28 | Hoffmann La Roche | Recombinant coccidiosis vaccines |
| ZA894726B (en) * | 1988-06-27 | 1990-03-28 | Akzo Nv | Coccidiosis vaccine |
| ZA902147B (en) * | 1989-03-28 | 1990-12-28 | Akzo Nv | Coccidiosis vaccine |
-
1989
- 1989-12-20 EP EP89203262A patent/EP0403698B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-20 AT AT89203262T patent/ATE94208T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-20 DE DE89203262T patent/DE68909041T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-20 ES ES89203262T patent/ES2059711T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-21 ZA ZA899853A patent/ZA899853B/xx unknown
- 1989-12-21 NZ NZ231918A patent/NZ231918A/en unknown
- 1989-12-21 CA CA002006412A patent/CA2006412C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-21 US US07/454,218 patent/US5637487A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-22 HU HU896767A patent/HU207453B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-12-26 KR KR1019890019853A patent/KR0152245B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-12-27 JP JP01339897A patent/JP3076050B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-28 AU AU47280/89A patent/AU626366B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR0152245B1 (ko) | 1998-10-01 |
| HUT55640A (en) | 1991-06-28 |
| KR910001055A (ko) | 1991-01-30 |
| CA2006412A1 (en) | 1990-12-21 |
| JPH0330675A (ja) | 1991-02-08 |
| AU626366B2 (en) | 1992-07-30 |
| US5637487A (en) | 1997-06-10 |
| CA2006412C (en) | 2002-06-25 |
| ES2059711T3 (es) | 1994-11-16 |
| EP0403698A1 (en) | 1990-12-27 |
| ATE94208T1 (de) | 1993-09-15 |
| HU896767D0 (en) | 1990-02-28 |
| DE68909041D1 (de) | 1993-10-14 |
| NZ231918A (en) | 1992-03-26 |
| ZA899853B (en) | 1990-10-31 |
| DE68909041T2 (de) | 1994-01-13 |
| JP3076050B2 (ja) | 2000-08-14 |
| EP0403698B1 (en) | 1993-09-08 |
| AU4728089A (en) | 1991-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2907813B2 (ja) | コクシジウム症予防用抗原性蛋白質およびそれを含有するワクチン | |
| JPH07508879A (ja) | アミノペプチダーゼ酵素をコードする組換えｄｎａ分子および蠕虫感染に対するワクチンの調製におけるその用途 | |
| JPH09157293A (ja) | 免疫活性ポリペプチド及びその製法 | |
| AU621903B2 (en) | Coccidiosis vaccine | |
| EP0567512A1 (en) | Sperm cell surface protein ph-20. use in a contraceptive vaccine | |
| HU213419B (en) | Method for preparation of vaccine against poultry coccidiosis | |
| KR0165115B1 (ko) | 콕시듐증 백신 | |
| ES2339227T3 (es) | Acidos nucleicos que codifican antigenos recombinantes de 56 y 82 kda de gametocitos de eimeria maxima y sus usos. | |
| JP4116680B2 (ja) | 家禽コクシジウム症ワクチン | |
| KR100244828B1 (ko) | 콕시디아증 백신 | |
| JPH07196690A (ja) | コクシジウム症家禽ワクチン | |
| HU207453B (en) | Method for producing eimare tanella polypeptide, recombinant vector molecule coding the same and host organism transformed with the same | |
| JP2811190B2 (ja) | ワクチン | |
| HU221123B1 (en) | Coccidiosis poultry vaccine | |
| US20070071776A1 (en) | Recombinant Vaccine Against Fish Infectious Diseases | |
| JP2001524803A (ja) | インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のＮｕｃＡタンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子 | |
| US6235283B1 (en) | DNA encoding a cell membrane glycoprotein of a tick gut | |
| US7335759B2 (en) | Recombinant immunogens for the generation of antivenoms to the venom of scorpions of the genus Centruroides | |
| US20040131633A1 (en) | Parasite antigens | |
| JPS63503512A (ja) | 新規ワクチン | |
| JPS61502586A (ja) | クロ−ン遺伝子とその作成法および利用法 | |
| JPH05271293A (ja) | コクシジオーシス鶏ワクチン | |
| CA2281913A1 (en) | A vaccine against piscirickettsia salmonis based on a recombinant 17 kd protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |