KR0152245B1 - 에이메리아 테넬라 왁찐 - Google Patents

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Description

에이메리아 테넬라 왁찐

제1도는 파지 λgt 10Et 1A1에 삽입된 DNA 단편물(Et1A1)의 제한효소지도이며,

제2도는 파지 λgt 10Et 1A1에 삽입된 Et 1A1의 DNA 핵산서열과 추론되는 아미노산 서열이다.

본 발명은 에이메리아 테넬라(Eimeria tenella) 폴리펩타이드를 코오딩하는 핵산서열, 상기의 핵산서열을 포함한 재조합 핵산 분자, 상기의 핵산 서열을 포함하는 벡터 또는 숙주세포, 에이메리아 테넬라의 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드와 면역 반응하는 항체 또는 항혈청 뿐만 아니라, 이러한 생성물에 기초한 콕시듐증(coccidiosis)에 대한 왁찐에 관한 것이다.

콕시듐증은 아피콤플렉사 아문(subphylum Apicomplexa) 및 에이메리아속(genus Eimeria)의 세포내 기생충, 원생동물에 의해 야기되는 질환이다. 상기의 기생충은 숙주의 소화 기관과 위장관의 일부를 형성하는 세포에서 증식한다.

증가하는 집중 생산에 따라 양계업에 있어서, 상기 기생충에 의해 발생되는 손해가 최근 크게 증가하였다. 네델란드의 양계농장주는 매년 손실이 수백만 길더에 이르며; 1986년에는 손해가 약 1300만 길더였다. 같은 해에 미합중국은 콕시듐증 저지제(coccidiostats)를 사용했음에도 불구하고 미화 3억불의 손실을 보았다.

병아리의 콕시듐증의 병인은 9가지 유형으로 나눌 수 있다; 에이메리아 아케르불리나(Eimeria acervulina), E. 맥시마(E. maxima), E. 테넬라(E. tenella), E. 네카트릭스(E. necatrix), E. 브루네티(E. brunetti), E. 미티스(E. mitis), E. 프레콕스(E. praecox), E. 미바티(E. mivati) 및 E. 하가니(E. hagani). 그러나, 일부 사람들은 마지막 두가지 유형의 존재는 의심하고 있다.

상기 모든 종류는 단지 병아리만이 숙주이며 조직에 높은 특이성을 나타내고 있다. 상기 종류의 생존 사이클은 유사하다.

생존 사이클 과정중, 에이메리아 기생충은 수 많은 단계를 지난다. 감염 단계(포자형성 난모세포)는 병아리의 입을 거쳐서 위로 들어가며, 이곳에서 분쇄작용의 결과로 포낭이 열리게 된다. 난모세포를 함유하는 4개의 스포로시스트(sporocyst)가 방출되어 십이지장으로 들어가고, 따라서 담즙 및 소화효소에 노출된다. 결과적으로, 스포로시스트 벽에 구멍이 형성되고 스포로시스트내에 존재하는 포자소체(sporozoites)가 방출된다. 상기 포자소체는 이동성이 있으며 적당한 숙주 세포(예, 상피 세포)를 찾아 침투하여 생식을 한다. 유형에 따라, 첫 번째 생식 단계는 20 내지 48시간 동안 지속되며 수십 내지 수백의 분열체(merozoites)가 형성되고, 이것은 다시 각각 새 숙주세포에 침투하여 생식을 한다. 상기 무성생식 사이클의 2 내지 5회 이후, 세포내의 분열체가 유성형태, 즉 암수의 생식모세포(gametocytes)로 성장한다. 수 생식 세포에 의해 암 생식 세포가 수정된 후에, 접합체가 그것 주위의 포낭벽을 생성할 수 있도록 형성된다. 이 난모 세포는 숙주 세포를 벗어나서 배설물로 나온다. 병아리 외부의 온도와 습도가 상당히 높고, 그와 동시에, 공기중에 충분한 산소가 있는 경우, 난모세포는 감염 단계에서 포자를 형성할 수 있다.

따라서, 병아리로부터 병아리에게 기생충이 전달되는데 있어서, 중간 숙주가 필요치 않다. 또한 사용 가능한 표면적의 점유도가 높아짐에 따라 병아리 농장에서의 감염 압력이 급격히 증가하는 것으로 추측된다.

기생충은 여러 가지 방법으로 퇴치할 수 있다.

우수한 관리와 더불어, 콕시듐증은 종종 사료나 음료수와 함께 혼합한 구제약물을 사용함으로써 퇴치할 수 있다. 그러나, 상기의 약물은 부분적으로 기생충이 고도의 유전 능력으로 여러 가지 구제약물에 대한 내성을 갖게 되었기 때문에, 최근에는 유효성이 감소하고 있다. 또한, 상기 약물들은 고기에 잔류할 수도 있어서, 소비시 문제를 야기할 수 있다.

따라서, 면역 예방은 훨씬 더 우수한 구제 방법을 구성한다. 충분히 심한 감염을 거쳐서 생존한 병아리는 이후에 동일한 유형의 에이메리아와의 접촉에 대해 내성을 가질 수 있다. 에이메리아에 대한 내성은 소량의 난모세포나 약화된(비-병원성) 균주의 난모세포를 몇차례 병아리에게 감염시킴으로써 유도할 수 있다. 그러나, 특히 도살용의 수많은 병아리에게 조절 투여하는 것은 이 경우 사실상 견뎌낼 수 없는 문제점이 있다. 따라서 불활성화된 왁찐이 유일하게 남아있는 해결책이라고 할 수 있다.

불활성화 왁찐은 가능하게는 보조제와 함께 기생충으로부터 형성된 항원으로 구성될 수 있다.

기생충으로부터 분리한 항원의 선택에 있어서, 재조합 DNA 기법으로 제조한 생성물을 사용하는 것이 가능하며, 이 기법은 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

또한 예방접종은 박테리아, 균류 또는 비루스와 같이 살아 있는 숙주 유기체로 투여함으로써 수행할 수 있으며, 여기에서 숙주 유기체의 항원을 코오딩하는 유전자가 결합된다. 이 유기체는 병아리의 면역 시스템을 적당하게 촉진할 수 있도록 적당히 장기간 동안 항원 합성이 가능하다.

그와 동시에, 항원이나 그것의 일부를 합성, 증식하는 것이 가능하며, 보조제의 존재하에 담체 단백질에 결합되어 있는, 면역학적으로 인식 가능한 촉진 형태로 조류에 투여하는 것이 가능하다.

본 발명에 따르면, 에이메리아 테넬라의 단백질을 적어도 일부분 코오딩하는 핵산 서열(이 단백질의 아미노산 서열은 제2도에 나타냄)은 콕시듐증에 대해 가금류를 면역시키기 위한 왁찐의 제조법에 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용하고 있는 핵산 서열은 임의의 길이를 갖는 중합체 형태의 뉴클레오티드를 언급하며, 이것은 리보핵산 서열과 데옥시리보핵산 서열 둘다 포함한다. 원칙적으로, 상기 용어는 분자의 일차 구조를 나타내며, 따라서 이중쇄 및 단일쇄 RNA와 그것의 변형체 뿐만 아니라, 이중쇄 및 단일쇄 DNA도 포함한다.

에이메리아 테넬라 단백질의 일부를 코오딩한 핵산 서열(제2도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 부위(Et1A1)은 파지 λgt 10Et1A1에 존재한다. 상기 언급한 파지는 수탁 번호 CBS 286.89하에 Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn(네델란드 왕국)에 Escherichia coli 균주 BNN 102로 기탁되었다.

파지 λgt 10Et1A1은 포자 형성된 E. tenella 난모세포로부터 cDNA라이브러리를 먼저 형성함으로써 제조한다. 상기 cDNA 라이브러리의 스크리닝은 플라즈미드 pEa1A에 존재하는 296bp의 표지된 EcoR1 프로브로 수행되었으며, 이 플라스미드로 이. 콜리 균주 K12JA221을 형질 전환시켰으며, 이것은 수탁번호 CBS 143.88하에 Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn(네델란드 왕국)에 기탁되었다.

그후, 본 발명에 의한 핵산 서열을 포함한 E. tenella 클론을 플라크-정제하였다. λgt 10Et1A1에 삽입한 DNA 서열은 상기 파지 클론으로부터 분리할 수 있다. Et1A1의 제한 효소 지도를 작성하였다(제1도).

상기의 삽입물중 cDNA 단편에 대해서 결정된 뉴클레오티드 서열은 그것으로부터 유도된 아미노산 서열과 함께 제2도에 나타내었다.

상기의 서열은 단지 에이메리아 테넬라의 단백질 일부를 나타낸다. 뉴클레오티드 서열에 있어서, E. tenella 단백질을 코오딩한 유전자의 5'-말단은 존재하지 않으며, N-말단은 아마도 E. tenella 단백질의 아미노산 서열로부터 누락된 것으로 생각된다.

본 발명은 제2도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 그것의 항원성 단편물을 코오딩한 핵산 서열 뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열로 정의된 E. tenella의 전체 단백질 또는 그것의 항원성 단편물을 코오딩한 핵산 서열을 포함한다.

제2도에 나타내지 않은 E. tenella 단백질의 5' 핵산 서열은 E. tenella의 RNA를 분리하고, 이 RNA를 기존 핵산 서열의 5'-면으로부터 유도한 프라이머와 하이브리드하고, 이 프라이머를 예를 들어 역전사 효소로 연장시키는 등 일반적인 분자 생물학 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 따라서, 새롭게 합성한 DNA는 적당한 백터중에 클론하는 일반적인 분자 생물학 방법을 사용하여 그것의 이중쇄형태로 전환시킨 후 서열 분석을 한다.

또 다른 가능성은, 본 핵산 서열의 5'-면으로부터 유도된 제한 단편물로 상기 언급한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고 제2도에서 보여지는 핵산 서열과 중복되지만 부가의 5' 서열을 포함하는 DNA 서열로 이루어진 클론을 분리하는 것이다.

E. tenella의 일부를 코오딩한 데옥시리보핵산 서열은 제2도에서 보여진다. 이 cDNA 서열은 길이가 1970 뉴클레오티드이다(정지 코돈 포함). E. tenella 단백질을 상응하는 부가의 뉴클레오티드 단편물 또는 그 밖의 cDNA를 함유한 핵산 서열(예 E. tenella 단백질을 코딩한 완전한 유전자), 뿐만 아니라 상기 cDNA 서열 또는 그것의 단편물을 함유하는 핵산 서열은 본 발명의 일부를 형성한다.

공지된 기술에서 알 수 있는 바와 같이, 유전자 코오드의 축퇴(degeneracy)는 코돈 중의 염기를 치환시켜서, 동일한 아미노산을 코오딩하지만 다른 코돈을 갖게 된다(예, 글루타민 산에 대한 코돈은 GAT와 GAA 둘다이다). 결과적으로, 제2도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드나 그것의 항원성 단편물을 형질 발현하기 위하여, 제2도의 핵산 서열과 상이한 선택적인 코돈 조성물을 갖는 핵산 서열을 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 범위내에서, 제2도에 나타낸 핵산 서열 또는 그것의 단편물과 거의 동일성을 나타내는 일부분이 존재하는 핵산 서열도 포함되며, 그러나, 이것은 뉴클레오티드 치환체, 변이체, 삽입물, 결실체, 역위체 등을 포함하며, 제2도에 나타낸 폴리펩타이드 또는 그것의 단편물과 기능적으로 동일한 단백질 또는 폴리펩타이드를 코오드한다.

본 발명은 상기 언급된 핵산 서열에 의해 코오딩되며, 콕시듐증에 대해 가금류를 면역시키는데 사용할 수 있는 폴리펩타이드를 포함한다.

또한, 실질적으로 제2도에 나타낸 아미노산 서열의 적어도 일부분을 포함한 폴리펩타이드도 본 발명에 포함된다.

폴리펩타이드란 아미노산의 분자쇄를 뜻하며 생성물의 특정한 길이를 의미하는 것은 아니다; 따라서 그중에서도 펩타이드, 올리고펩타이드와 단백질은 폴리펩타이드의 정의내에 포함된다.

제2도에 나타낸 특정한 폴리펩타이드의 경우, 자연적인 변이체도 존재할 수 있으며, 이 변이체도 여기서 포함된다. 상기의 변형물은 전반적인 서열에 있어서의 아미노산 변이체(들), 또는 결실체, 치환체, 삽입물, 역위체 또는 상기 폴리펩타이드중의 아미노산(들)의 첨가물에 의해 입증된다.

또한 제2도에 나타낸 폴리펩타이드의 여러 가지 유도체를 제조하기 위해 재조합 DNA 기법을 사용할 수도 있으며, 수득한 단일 또는 다중의 아미노산 치환체, 결실체, 첨가물 또는 교체물에 의해 다양하게 변형된다.

상기의 유도체나 그것의 단편물을 포함한 폴리펩타이드 뿐만 아니라 제2도에 나타낸 폴리펩타이드의 유도체나 그것의 단편물에 기인하는 상기의 변형체는 제2도에 나타낸 폴리펩타이드 또는 그것의 항원성 단편물의 특징적인 활성이 존재하는 한 본 발명의 범위내에 포함된다.

부가하여, 콕시듐증에 대해 가금류를 면역화시키는데 상기 폴리펩타이드의 단편물을 사용할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 단편물도 본 발명의 일부를 형성한다. 공지되거나 공지되지 않은 아미노산 서열내에 상기의 유용한 폴리펩타이드 단편물(일명, 에피토프)을 검출하는 방법이 여러 가지 알려져 있다. 공지된 아미노산 서열을 근거로 하여, 상기의 에피토프는 특허 공보 WO 84/03564와 WO 86/06487에 기술되어 있는 스크리닝법으로 실험적으로 결정할 수 있다.

또한 폴리펩타이드의 여러 부위는 현재 공지된 에피토프와의 구조적 일치성과 이론적인 면을 근거로 에피토프로 정의할 수 있다. 상기 부위의 결정은 J.P.Hopp와 K.R. Woods(참고 문헌. 5)에 의한 친수성 요건 및 P.Y. Chou 및 G.D. Fasman(참고 문헌. 6)에 의한 2차 구조 측면의 조합에 근거하였다.

필요한 T-세포의 에피토프는 베르조프스키(Berzofsky)의 양쪽친화성(amphiphilicity) 요건(참고 문헌. 7)의 이론적 근거로 유추해낼 수 있다.

본 발명에 의해 콕시듐증 감염에 대한 면역화에 있어서, 항-이디오타입(anti-idiotype)항체 또는 그것의 항원-결합 단편물을 사용하는 것이 가능하다. 상기의 항체는 항체의 이디오타입에 대한 것이고, 이것은 본 발명에 의한 폴리펩타이드에 대한 것이다. 상기에서 지적한 본 발명의 폴리펩타이드의 면역원은 이러한 유형의 항-이디오타입 항체를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명의 핵산 서열은 DNA 서열에 영향을 미치는 여러 가지 형질 발현물에 결찰시키며, 선택적으로 β-갈락토시다제와 같은 서열을 코오딩한 폴리펩타이드의 부위를 포함하며, 그 결과 적당한 숙주를 형질 변환시키는데 사용할 수 있는 재조합 핵산 분자를 형성할 수 있다. 상기의 하이브리드 DNA 분자는 박테리오파지나 비루스중에 존재하는 핵산 서열 또는 플라즈미드로부터 유도되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용하는 형질 변환(Transformation)은 직접 흡수 또는 형질도입 등 사용 방법에 관계없이 숙주 세포로 이종의 핵산 서열을 도입하는 것을 의미한다. 이종 핵산 서열은 자동 복제를 통해 유지되거나 숙주 게놈속에 결합되기도 한다. 재조합 DNA 분자는 바람직하게는 삽입된 핵산 서열의 발현을 조절할 수 있는 규정된 숙주와 양립 가능한 적당한 조절 서열을 구비한다.

적당한 숙주 세포는 폴리펩타이드를 코오딩한 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 분자에 의해 형질 변환될 수 있고 상기 핵산 서열에 의해 코오드된 상기 폴리펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 박테리아등의 원핵 생물원(예, E. coli, B. subtilis 및 Pseudomonas 종); 또는 효모등의 진핵생물원(예, Saccharomyces cerevisiae) 또는 곤충, 식물 또는 포유류 세포(HeLa 세포와 CHO(chinese hamster ovary)세포) 등의 고등 진핵 세포이다.

예컨대, 의도하는 면역화는 본 폴리펩타이드 또는 그것의 면역원 부분 또는 그것의 동등물을 조류등에 투여하거나, 또는 재조합 DNA에 의해 유전적으로 변화되어 폴리펩타이드, 또는 그것의 면역원 부분 또는 그것의 동등물을 그 자체로 생성할 수 있는 미생물을 조류에 투여함으로써 면역화시킬 수 있다.

본 발명에 의해, 콕시듐증에 대해 가금류를 면역화시키기 위하여, 본 폴리펩타이드, 그것의 단편물 또는 면역원 동등물을 조류에 투여하거나, 필요하다면 유전자 조작에 의해 본 폴리펩타이드 등을 생성하는 능력을 획득한 미생물을 투여하는 것이 가능하다. 서브 유니트 왁찐(Subunit vaccines)은 첫 번째 경우에 사용되는 용어이며 벡터 왁찐(vector vaccine)은 대개 두 번째 경우에 사용된다. 본 명세서에서도 이 명칭을 사용한다.

본 발명에 의한 서브 유니트 왁찐은 일반적으로 정제된 형태, 선택적으로 약제학적 허용 부형제의 존재중의 폴리펩타이드를 포함한다. 이 폴리펩타이드는 선택적으로 융합 생성물의 정제에 유리한 미관련 단백질에 공유 결합될 수 있다. 그 예는 β-갈락토시다제, 단백질 A, 프로키모신, 혈액 응고신자 Xa 등이 있다.

상기 사용을 위한 폴리펩타이드는 공지된 방법, 즉 E. tenella로부터 분리하고, 펩타이드 합성이나 재조합 DNA 기법으로 제조할 수 있다.

필요하다면, 생체내 또는 시험관내에서, 가령, 글리코실화, 아미드화, 카르복실화 또는 포스포릴화에 의해 변형될 수도 있다.

벡터 왁찐에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드 생성물을 면역화될 개체에 투여하고 신체내에 잠시 동안 또는 생식 동안 그 자체를 유지하는 유전적으로 조작된 유기체에 의해 이루어진다. 여러 가지 유기체가 본 목적용 숙주로 사용될 수 있는데, 그 예는, Escherichia coli. Bacillus, 또는 Salmonella와 같은 박테리아, 또는, 우두 또는 조류의 수두 비루스 등의 비루스가 있다. 이러한 유형의 숙주 유기체로, 폴리펩타이드는 표면항원으로서 그 자체를 발현할 수 있다. 이러한 점에서, Escherichia coli의 OMP 단백질 또는 섬모(pilus) 단백질, 또는 유기체에 의해 인지되는 시그날 및 앵커(anchor) 서열의 합성 단백질과 상기 폴리펩타이드를 융합하는 것도 생각할 수 있다. 또한, 전체적으로 설명하자면, 상기 면역원 폴리펩타이드는 면역화되는 동물내부에서 방출된다. 상기의 모든 경우에, 여러 가지 병원체 및 / 또는 주어진 병원체의 각종 항원에 대한 보호를 제공하는 하나 이상의 면역원성 생성물을 발현하는 것이 가능하다.

본 발명의 핵산 서열과 DNA 단편물(이, 아케르불리나(E. acervulina)로부터 유도된 보호성 폴리펩타이드를 코오딩함 : 실시예 2) 사이의 동일성에 관하여, 상기 핵산 서열과 그에 상응하는 폴리펩타이드를 기타 Eimeria 종, 특히 이. 아케르 불리나에 대해 가금류를 예방 접종하는데 사용하는 것이 이해될 것이다.

이미 E. tenella로 감염된 조류는 상기의 E. tenella에 대한 항체로 처리할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드로 특징지어지는 항혈청 또는 항체는 콕시듐증의 치료에 사용할 수 있다. 상기 항 혈청이나 항체는 상기 폴리펩타이드로 동물을 면역화시키고 그것으로부터 항혈청을 분리함으로써 수득할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드에 대한 모노클로날 항체는 E. tenella로 감염된 조류를 치료하는데 사용할 수 있다. 상기의 모노클로날 항체는 본 목적을 위해 당업계에서 공지된 방법, 즉 상기 폴리펩타이드로 마우스를 면역화시키고, 마우스의 비장 세포를 불멸화시키고 유용한 항체를 생성하는 하이브리도마를 선별함으로써 제조할 수 있다. 불멸화된 항체-생성 세포주는 B 임파구를 발암성 DNA로 직접 형질 변환시키거나, 또는 엡스타인-바르 비루스로 트랜스펙션(transfection)시킴으로써 생성할 수도 있다.

특히 모노클로날 항체는 당업계에서 공지된 방법에 의해 항-이디오타입 항체를 생성하는데 사용할 수 있다. 상기의 항-이디오타입 항체는 또한 조류의 콕시듐증 예방에 유용하다.

상술한 항 혈청과 모노클로날 항체는 E. tenella로 감염된 조류의 면역진단에 사용할 수도 있다.

[실시예 1]

[E. tenella 난모 세포의 포자 형성]

60ml의 10^-4M 소듐 디티오나이트중의 5×10⁸E. tenella 난모세포의 현탁액을 원심분리한 후, 펠렛을 100ml 멸균수로 1회 세척하였다. 세포를 5% 중크롬산 칼륨, 500ml중에 재현탁시킨 후 30℃에서 7시간 동안 강한 통기하에 배양했다. 난모세포를 원심 분리로 수거하고 200ml의 멸균수로 3회 세척했다.

[RNA의 분리]

DNA를 분리하기 위하여(참고 문헌 1), 세포 펠렛을 10mM 트리스 아세테이트(pH 7.6), 75mM 소듐아세테이트, 1% SDS, 2mM EDTA, 0.2mg/ml의 프로테인아제 K와 10mM 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체를 포함한 2.8ml의 완충액 속에 취하였다. 난모세포를 13g의 글래스 비드(glass bead)(

0.5mm) 존재하에 60초(최대) 동안 진탕함으로써 파괴시켰다. 5ml의 페놀을 전체 추출물에 첨가하고 이 혼합물을 60초 동안 더 진탕시켰다. 원심분리후, 현탁액을 피펫으로 분리하여 다시 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25 : 24 : 1)로 추출하였다. 2.5부피의 에탄올을 첨가한 후 RNA가 침전되었으며, 산출한 침전물을 800μ1의 Tris 10mM, EDTA 0.1mM pH 7.6(T₁₀E_0.1) 중에 용해시킨 후, 생성물을 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25 : 24 : 1)로 2회 및 클로로포름/이소아밀 알코올(24 : 1)로 2회 더 추출한 후 에탄올로 침전시켰다. 폴리 A⁺-RNA는 올리고(dT)- 셀룰로오즈 크로마토그래피(참고 문헌. 2)로 분리하였다. 대략 100㎍의 폴리 A⁺-RNA를 5×10⁸난모세포로부터 분리하였다.

[cDNA 합성]

폴리 A⁺-RNA를 효소 MMLV 역전사 효소로 cDNA로 전환시켰다. 이러한 목적을 위하여 25㎍의 폴리 A⁺-RNA를 90㎕의 물중에 용해시키고 20℃에서 5분 동안 10mM의 수은 메틸 히드록사이드를 첨가함으로써 변성되며, 그후 β-메르캡토에탄올을 45mM로 첨가하여 이 혼합물을 20℃에서 3분 동안 더 배양했다. 효소 반응은 4㎍의 올리고(dT)₁₅·150∪ RNAsin^(R), 20mM의 Tris(pH 7.6), 30mM KC1, 4mM 디티오트레이톨(DTT), 2mM MgCl₂, 1mM의 각 dNTP와 3000∪의 MMLV 역전사효소를 함유한 완충액 190㎕중에서 수행하였다. 이 반응은 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 10㎕의 0.5M EDTA를 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25 : 24: 1)로 추출한 후 RNA / DNA 하이브리드 2M의 암모늄 아세테이트와 2.5부피의 에탄올을 첨가함으로써 침전되었다. 효소 DNA-폴리머라제 I과 RNase H(참고 문헌. 3)의 조합된 작용에 의해 두 번째 줄이 합성된다. 펠렛을 20mM Tris(pH 7.6), 5mM MgCl₂, 100mM (NH₄)₂SO₄, 0.6mM β-NAD, 16∪ RNase H, 200∪ DNA-폴리머라제 I과 20∪ DNA-리가아제(이. 콜리)를 함유한 960㎕의 완충액중에 용해시켰다. 배양을 12℃에서 1시간 한 후, 22℃에서 1시간하고, 그후 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25 : 24 : 1)을 첨가하고 에탄올로 침전시켜서 반응을 중단시켰다.

본 목적에 적당한 벡터중에 cDNA를 클로닝하기 이전에, 그것을 먼저 변형시켰다. cDNA(5㎍)을 30mM 소듐아세테이트(pH 5.6), 50mM NaCl, 1mM ZnSO₄및 21μ 녹두(Mung Bean) 뉴클레아제를 함유한 완충액 100㎕ 중에 용해시켰다. 30분동안 37℃에서 배양한 후, EDTA 10mM과 Tris 25mM을 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25 : 24: 1)로 추출한 후, 혼합물을 세파덱스 G50 컬럼으로 탈염시켰다.

하기의 물질을 용출물(125㎕)에 첨가하였다 : Tris pH 7.6, 50mM, EDTA 2.5mM, DTT 5mM, S'-아데노실메티오닌 0.5μM과 100

EcoRI-메틸라제. 30분동안 37℃에서 배양한 후, 65℃에서 15분 동안 가열함으로써 반응을 중단시킨 후, Tris-HCI 100mM, MgCl₂100mM과 NaCl 500mM(pH 7.5)을 함유한 용액 1/10 부피를 첨가하고, 그와 동시에 각 dNTP, 1mM과 12.5

클레노우(Klenow) DNA 폴리머라제를 첨가하였다. 22℃에서 60분동안 배양한 후, 동량의 페놀/콜로로포름/이소아밀 알코올(25 : 24 : 1)을 첨가함으로써, 반응을 중단시켰다. 상층액은 350㎕의 H₂O와 50㎕의 3M 소듐 아세테이트(pH 5.6)을 500㎕의 이소프로판올과 함께 첨가한 후 침전되었다. 100㎕ H₂O로 용해시킨 후, 펠렛을 세파덱스 G50으로 탈염시키고 그 용출물을 에탄올로 침전시켰다.

상기 펠렛을 24㎕ H2O중에 용해시킨 후, 24㎍ EcoRI 링커, Tris-HCl(pH 8.0) 30mM, MgCl₂10mM, 디티오트레이톨 10mM, ATP 1mM, 젤라틴 0.1mg/ml과 10u T4 DNA-리가아제를 50㎕ 첨가함으로써 진찰시켰다. 이 반응은 100mM Tris-HCl(pH 7.6), 50mM NaCl, 10mM MgCl₂, 2.5mM DTT 및 500u EcoRI을 함유한 210㎕의 완충액 중에서 제한효소 EcoRI으로 절단한 후, 4℃에서 16시간 동안 배양한 후 가열(70℃에서 15분 동안)하여 반응을 중단시켰다. 37℃에서 90분간 배양한 후, 동량의 페놀/콜로로포름/이소아밀 알코올(25 : 24: 1)로 추출함으로써 반응을 중단시켰다. 상층액은 300mM의 cDNA에 소듐 아세테이트(pH 5.6)를 첨가한 후, 2.5 부피의 에탄올을 첨가하여 침전시키고, 링커는 Biogel A15m 컬럼을 이용하여 분리하였다. cDNA는 에탄올로 침전시킨후, 침전물을 Tris-HCI 10mM, EDTA 0.1mM(pH 7.6)중에 용해시켰다. cDNA 분자를 파지 λgt10(4)로 클로닝시켰다.

[실시예 2]

[E. acervulina DNA로의 E. tenella cDNA라이브러리의 스크리닝]

pUC 18/EalA의 296bp EcoRI 단편물을 무작위 프라이밍(random priming)하여 디곡시제닌(digoxigenin)-dUTP로 표지한 후, 베링거만하임의 DNA 표지 및 검출용 키트, 비방사성(Cat. No. 1093657)로 그 프로토콜에 따라 진행하였다.

상기한 E. tenella cDNA 라이브러리의 고정화된 DNA를 함유한 필터를 메니아티스 등(Maniatis et al.)에 의해 기술된 방법(2)에 따라 제조하며, 제조자의 지시에 따라 42℃에서 16시간 동안 새롭게 변성되고(10분, 95℃), 표지화된 E. acervulina 단편물에 의해 프로브했다. 필터를 다음과 같이 세척했다 : 실온에서 2×SSC, 0.1%(w/w) SDS(1×SSC는 0.015mol/1 시트르산나트륨(pH 7.0)+0.15mol/1 NaCl 임)로 15분 동안 2회, 68℃에서 1×SSC, 0.1%(w/v) SDS로 15분 동안 2회, 68℃에서 0.1×SSC, 0.1%(w/v) SDS로 30분 동안 2회 및 15분 동안 1회 그리고 실온에서 PBS-tween(7.65g/l NaCl, 0.91g/1Na₂HPO₄·2H₂O, 0.21g/1 KH₂PO₄, 0.05%(v/v) Tween 80, pH 7.3)으로 15분 동안 2회 세척했다.

필터는 양의 폴리클로날 항-디곡시제닌 Fab-단편물의 PBS-tween 1 : 5000배 희석액으로 반응시키고, 실온에서 30분동안 알칼리성 포스타파제에 결합시켰다. 실온에서 PBS-tween으로 15분동안 필터를 4회 세척한 후 0.01M Tris-HC1(pH 8.0), 0.15M NaCl로 15분 동안 1회 세척하고, 필터와 알칼리성 포스파타제 결합을 0.1M Tris-HC1(pH 9.6), 0.1M NaCl, 0.01M MgCl₂중에 0.33g/l 니트로블루 테트라졸륨과 0.17g/15-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트 용액으로 배양하여 검출했다. 각 400λgt 10 E. tenella 클론중 하나를 E. acervulina 프로브와 반응시키고; 이들중 10개(E. tenella 1A1 내지 10 : λgt 10Et 1A1 내지 10)를 플라크-정제하였다. E. coli 균주 BNN102와 함께 λgt 10Et1A1을 CBS. No. 296.89하에 Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn(네델란드왕국)에 기탁하였다. 플라즈미드 pGEM 4Z 또는 박테리오파지 M13(2)에서 제조된 상기 cDNA 삽입물의 서브클론으로부터, 완전한 뉴클레오티드 서열을 제조자의 지시(USB 시퀸스 키드)에 따라 결정하였다.

[참고문헌]

1) J. Pasternak et al. : Mol. Bioch. Par 3(1981), 133-142

2) T. Maniatis et al. : Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory) 1982.

3) U. Gubbler et al. : Gene 25(1983), 263-269

4) T.V. Huynk et al. : DNA Cloning Techniques : A Practical Approcach ; D. Glover Oxford(1984).

5) J.P. Hopp et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 78(1981) 3824-3828.

6) P.Y. Chou et al. : Advances in Enzymology 47(1987), 45-148.

7) M. F. Gool et al. : Science 235(1987), 1059-1062.

Claims (8)

1. 제2도에 나타낸 아미노산 서열에 의해 정의되는 에이메리아 테넬라의 단백질의 적어도 일부를 코오딩하는 핵산서열.
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 일부가 제2도에 나타낸 데옥시리보핵산 서열에 의해 코오드되는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
3. 제1항 또는 제2항의 핵산서열을 발현시킬 수 있는 프로모터 서열 및 리보솜 결합부위에 작동가능하게 연결된, 제1항 또는 제2항의 핵산 서열을 함유한 재조합 핵산분자.
4. 제3항의 재조합 핵산 분자를 함유한 비루스 벡터.
5. 제1항 또는 제2항의 핵산 서열, 제3항의 재조합 핵산 분자 또는 제4항의 비루스 벡터를 함유한 숙주 세포.
6. 제2도에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 그것의 항원성 단편.
7. 제1항 또는 제2항의 핵산 서열, 제3항의 재조합 핵산 분자, 제4항의 비루스벡터, 제5항의 숙주세포 또는 제7항의 폴리펩타이드를 함유한, 콕시듐증에 대해 가금류를 예방하기 위한 왁찐.
8. 제6항의 폴리펩타이드와 면역-반응성이 있는 항체 또는 항혈청.

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