JPH07508879A - アミノペプチダーゼ酵素をコードする組換えｄｎａ分子および蠕虫感染に対するワクチンの調製におけるその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 二辷３１したゴ！１じ二韮１Ｊ盈りご酊灯洟主りυ侵來臼口１ワクチンの調製に おけるその用途 本発明は、畑土ｆｈｅ１ｍｉｎｔｈ　＋寄生虫によって引き起こされる疾患の制 御において、殺虫剤および防御免疫原として使用するための、組換えＤＮＡ技術 による防御抗原の調製に関する。

畑土寄生虫は、家畜の広範な疾患および感染の原因であり、これら疾患および感 染は、生産性の低下および動物の死亡につながるため、無視できない経済的重要 性がある。即ち例えば、血液栄養性（ｂｌｏｏｄ　ｆ＠ｅｄ工ｎｇ）の線虫ヘモ ンヵス属＋Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　）は、反部動物の胃腸管壁に感染し、貧血お よび体重減少を引起し、かつ治療しない場合には、しばしば死に至る。関連する 非血液栄養性（ｎｏｎ−ｂｌｏｏｄ　ｆｅｅｄｉｎｇ）の線虫オステルタジア属 （Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｌに感染した動物も同様に、成長せず、治療しない場 合には死亡する可能性がある。経済的に重要な他種の嬬虫としては、様々な動物 の腸炎を引き起こすトリコストロンギルス属（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕ ｓ　）およびネマトデルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）　、および吸虫類を挙 げることができる。

問題は、鉤虫（例えば、Ｎｅｃａｔｏｒ、　Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ、　Ｕｎｃ ｉｎａｒｉａおよびＢｕｎＯ８ｔＯ＋ｎｕｍ　８ｐＰ）および吸虫（例えば、Ｆ ａｓｃｉｏｌａ、　ＰａｒａｍｐｈｉｓｔｏｍｕｍおよびＤｉｃｒｏｃｏｅｌｉ ｕｍ　）およびこれらの同分類種などの畑土によっても引き起こされ、これらは 、反卿動物および家畜ペットに加えて、ヒトにも感染し、しばしば命にかかわる 結果となる。

現在の畑土寄生虫の制御は、第一に、放牧管理と組合せた駆虫薬の使用によって いる。しかしながら、このような技術は、頻繁な薬剤投与および放牧管理がしば しば実際的ではなく、かつ薬剤耐性蛎虫種が益々広がりつつあることなど多くの 不利益を有する。

従って、この分野において効果的な抗−嬬虫ワクチンへの必要性があり、近年多 くの努力がこの領域に集中している。しがしながら、大多数の輻虫種に対する、 特に例えばヘモンカス属およびオステルタジア属などの反拐動物の胃腸管寄生虫 に対する市販の分子またはサブ−ユニットワクチンはいまだにない。

今日までで最も有望な結果は、ヘモンヵス属から単離された新規タンパク質で得 られており、このタンパク質はへモンカス属に対してのみならず、ある範囲の他 の嬬虫に対しても防御抗原としての能力を有している。特に、ヘモンヵスコント ルトゥス（Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ、捻転毛様線虫）の腸内腔表面で発見された タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤは、ヒツジのへモンヵス感染に対する防御免疫 を付与することが示されている。

ヘモンカスコントルトゥスからのＨＩＩＯＤは、５ＤＳ−ＰＡＧＥで決定される ように、還元条件および非還元条件でほぼ１１０キロダルトン（ｋｄ）の分子量 を有し、ｗｏｅｓ１００８３５およびＷ０９０／１１０８６に説明されている。

ここで用いられる用語”）＋１１０Ｄ”ハ、ＷＯ３Ｂ１００８３５およびＷＯ９ ０／１１０８６で定義されたタンパク質ダブレットＨ１１０Ｄを指している。対 応するタンパク質もまた、他の畑土種、例えばネヵトルアメリカヌス（Ｎｅｃａ ｔｏｒ　ａ＋ｎｅｒｉｃａｎｕｓ　、アメリカ鉤虫）において、最近示された。

ＨｌｌｏＤを精製するための多（の方法が、１１０８８７００８３５において説 明されており、これらはタンパク質を特性決定するのに充分であり、実験的にあ るいは市販するのに有用な量のタンパク質を製造することを許容するまでスケー ルアップすることができるであろう。しかしながら、ＨＩＩＯＤだけでなく、関 連する抗原性タンパク質をも調製するための改善されかつ便利な原料への要請、 特に組換えＤＮＡ技術、および適切な形質転換された原核細胞微生物または真核 細胞微生物におけるタンパク質の発現に基づいた方法への要請がある。

本発明は、このような改善された方法を提供することを目的としている。ヘモン カスコントルトゥスからのＨｌｌｏＤのためのＣＤＮＡの配列決定がなされ、予 想されるアミノ酸配列が、膜内在性アミノペプチダーゼ（系統的名称：α−アミ ノアシルペプチドヒドロラーゼ（ミクロソーム性））族と相同性を示すことが判 明した。

哺乳類の膜内在性アミノペプチダーゼは、幾つかの組織、例えば腸の絨毛突起刷 子縁、および腎臓に局在する。これらの腎臓での役割ははっきりしないが、腸内 におけるこれらの機能は、消化の最終生成物である小ペプチドを開裂することで ある（再調査のため、Ｋｅｎｎｙ　＆　ＭａｒＯｕＸ、　１９Ｂ２ＨＫｅｎｎｙ 　＆　Ｔｕｒｎｅｒ、　１９８７＋　Ｎｏｒｅｎｅｔ　ａｌ、　１９８６＋　Ｓ ｅｍｅｎｚａ、　１９８６参照）。

１つの観点において、本発明は、畑土アミノペプチダーゼ酵素をコードするか、 または図２．３．４または５に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ！　 ｌ〜１５）の全てまたは一部に実質的に対応するその抗原性タンパク質をコード する１つ以上のヌクレオチド配列、あるいは前記配列の何れかと実質的に相同性 であるか、または前記配列の何れかとハイブリッド化する畑土アミノペプチダー ゼ酵素のためにコードする配列を含む核酸分子を提供する。

従って、本発明に係る核酸は、−重鎖または二重鎖のＤＮＡ　、ｃＤＮＡまたは ＲＮＡであってもよい。

アミノペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列の変異は、一つの種内の畑土 の異なる系統（ｓｔｒａ工ｎ）間、畑土のライフサイクルの異なるステージ間（ 例えば幼生および成虫間）、地理的起源の異なる類似系統間、および同一の畑土 内においても、発生しつる。このような変異は本発明の範囲内に含まれる。

ここで、°°実質的に相同”には、約５０％以上、例えば６０％以上の配列同一 性を有する配列、および機能的に等価な対立遺伝子変異体および単一または複数 の塩基の置換、付加および／または削除により修飾された関連配列が包含される 。

°゛機能的に等価”とは、同様に免疫反応性であり、即ち畑土に対する宿主防御 抗体を発生させるアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配 列を意味する。

図２．３．４または５に示す配列（ＳＥＱよりＮＯ：１〜１５からなる）または 上記定義のように実質的に相同な配列あるいは機能的に等価な配列とハイブリッ ド化する核酸分子もまた、本発明の範囲内に含まれる。ここで用いられる”ハイ ブリット化”とは、非緊縮条件（６Ｘ　５ＳＣ１５０％ホルムアミド、室温）に おいて結合し、低緊縮条件（２ｘ　ＳＳＣ，室温、より好ましくは２ｘＳＳＣ， ４２℃）において、またはより高い緊縮条件、例えば２ＸＳＳＣ１６５℃にて洗 浄された配列と定義される（ここで、ＳＳＣ＝　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０ １５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，２）。

このような誘導体関連配列を製造する方法は、例えば特定部位の突然変異誘発、 不特定部位の突然変異誘発、または核酸の酵素的開裂および／または連結反応な とによる方法は、この分野で公知であって、このように修飾された核酸が目的と する配列に対して有為な相同性を有するかどうかを、例えばハイブリッド化など により決定する方法も同様である。

本発明に係る核酸分子の提供は、組換えアミノペプチダーゼ酵素、またはその免 疫原フラグメントを従来得られなかったほどの量で得ることを可能とし、これに よって対畑土ワクチンの開発を可能にする。

他の観点において、本発明は、１つ以上のヌクレオチド配列を含み、この配列か 、畑土寄生虫に対する防御抗体を産生させることが可能で、図２．３．４または ５に示すアミノペプチダーゼをコードする配列ＴＳＥＱよりＮ０ＩＩ〜１５から なる）からの１つ以上の抗原決定基をコードする領域を含む、核酸分子を提供す る。

本発明はまた、図２．３．４または５に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱよりＮＯ ：１〜１５）の全てまたは一部に実質的に対応し、アミノペプチダーゼ酵素また はその抗原部位を構成するか、または、タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤに対応 する合成ポリペプチド以外の、あるいはＷ０９０／１１０８６に開示された個々 のポリペプチド配列の何れかに対応する合成ポリペプチド以外の、機能的に等価 なその変異体を構成する１つ以上のアミノ酸配列を含む合成ポリペプチドにまで 拡張される。

更に他の観点では、本発明は、図２．３．４または５に示すヌクレオチド配列（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　１〜１５）の全てまたは一部に実質的に対応するアミノ ペプチダーゼ酵素またはその抗原部位を構成するか、または、他のへモンカスコ ントルトウス成分を実質的に含まない機能的に等価なその変異体を構成するアミ ノ酸配列を含む合成ポリペプチドを提供する。

本発明は、更に、薬剤上許容される担体と一緒に、少なくとも１つの上記定義に よる合成ポリペプチドを含み、ヒトあるいはヒト以外の動物において畑土寄生虫 に対する免疫応答を刺激するためのワクチン組成物まで拡張される。

ｗｏ９０／１１０８６は、タンパク質ダブレットＨＩＩＯＤのタンパク質分解消 化または化学開裂によって得られた、以下のような一部のポリペプチド配列また は部分的なポリペプチド配列を開示している。

ｆａ）　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｕｈｅ （ｂｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 Ｇｌｕ　５ｅｒ（ｅｌ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｈ ｉｓ　Ｓｅｒ　−Ｐｈｅ　Ｖａｌば）　Ｍｅｃ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　Ｇｌｕ／Ｔｙ ｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ／Ａｌａ　にｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ（ｇｌ　Ｍｅｎ　Ｇｌｙ 　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　ｒ、ａｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＡｌａＰｈｅ 　Ｔｙｒ （ｈ）　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ｖａｌ／ Ｌｅｕ　ＧｉｎＡｌａ　Ｐｈ＠／Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ／Ｇｌｙ　Ｐ ｈｉ　Ｐｒ。

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Ｗ００９／１１０８６において開示された個々のポリペプチド配列は、請求項か ら除外される ここで用いられる”ポリペプチド”という用語は、全長のタンパク質、およびよ り短いペプチド配列の両方を含む。

ポリペプチドアミノ酸配列に関して上記で用いられた”機能的に等価”という用 語は、アミノ酸配列が、単一または複数のアミノ酸の置換、付加および／または 削除により修飾された上記ポリペプチド配列、そしてまた、アミノ酸配列が、例 えばグリコリル化または脱グリコジル化により化学的に修飾された配列であるが 、それにもかかわらず防御抗原（免疫原）活性を維持するポリペプチドアミノ酸 配列に関連するか、あるいはこれらのアミノ酸配列から誘導されるポリペプチド を定義している。このような機能的に等価な変異体は、天然の生物学的変異とし て発生することがあり、または公知技術を用いて製造することができる。例えば 、機能的に等価な組換えポリペプチドは、特定部位の突然変異誘発、不特定部位 の突然変異誘発、またはアミノ酸の酵素的開裂および／または連結反応などの公 知技術を用いて製造することができる。

全般的に、本発明に係る合成ポリペプチドは、防御抗原配列を表す。ここで用い られる用語”防御抗原”は、宿主−防御（免疫原性）免疫応答（ａ　ｈｏｓｔ− ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）　、 即ち、寄生虫の繁殖性を阻止するか、寄生虫に傷害を与えるか、寄生虫を阻害す るか、あるいは寄生虫を殺傷する免疫エフェクター分子、抗体または細胞の産生 につながる宿主の反応を起こすことが可能な抗原を定義している。このような防 御免疫応答は、寄生虫の代謝機能を阻害することかでき、これか発育の阻止、非 産生の欠如および／または死亡につながる抗体の産生によって、一般的に立証さ れる。

本発明のこの観点に係る合成ポリペプチドは、発現制御配列に作動的に結合した 、広範に上述したようなヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡを含む宿主細胞、 またはこのような組換えＤＮＡ分子を含むビヒクルまたはベクターを含む宿主細 胞中での発現によって製造することができる。あるいは、ポリペプチドは、本発 明に係る裸のＤＮＡ分子を、宿主細胞に直接に注射することによっても発現させ ることができる。

このようにして発現された合成ポリペプチドは、アミノペプチダーゼ酵素の全て または一部の免疫原性を示す部分を含む融合＋ｆｕｓｉｏｎｌポリペプチド、お よびそれに融合した組換え分子のＤＮＡによってコードされた付加的ポリペプチ ドであり得る。例えば、β−ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ、グルタチオン −８−トランスフェラーゼ、ウレアーゼ、ＨＢココア原（ｈｅｐａｔｉｔｉ、ｓ 　Ｂ　ｃｏｒｅａｎｔｉｇｅｎ＋　Ｆｒａｎｃｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９ ）などのタンパク質にカップリングされた本発明に係る合成アミノペプチダーゼ または他のポリペプチドを含む融合タンパク質を製造することが望ましいであろ う。殆どの融合タンパク質は、２つのコード配列が、同調した（　ｉｎ　ｐｈａ ｓｅ）読み取り枠とともに結合された組換え遺伝子の発現によって形成される。

あるいは、ポリペプチドは、インビトロで、化学的手段によって結合することが できる。アミノペプチダーゼをコードする核酸分子およびその各々のアミノ酸配 列における、このような融合またはハイブリッド誘導体の全ては、本発明に包含 される。このような好適な組換えＤＮＡ技術およびポリペプチド発現技術は、例 えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９Ｂ９に説明されている。あるい は、合成ポリペプチドは、化学的手段、例えば公知のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相 合成手段などによって製造することができる。

本発明の更なる観点は、ヒトまたはヒト以外の動物、好ましくは哺乳類動物にお ける蛎虫寄生虫感染に対する免疫応答を刺激するワクチン組成物の製造のための 、上述したような核酸分子または合成ペプチドまたはポリペプチドの使用を含ん でいる。

他の観点から、本発明は、ヒトまたはヒト以外の動物、好ましくは哺乳類動物に おける畑土寄生虫感染に対する免疫応答を刺激するための、上述したような核酸 分子によってコードされた１つ以上のポリペプチドを含むワクチン組成物を該動 物に投与することからなる方法を提供する。

本発明に係るワクチン組成物は、ワクチン製造の分野において公知の方法によっ て製造することができる。従来からのワクチン処方は、１つ以上の薬剤的に許容 される担体または希釈剤の存在下に、もし適切ならば、１つ以上の好適なアジュ バント、例えば水酸化アルミニウム、サポニン、ＱｕｉｌＡ　、またはそのより 精製された形態、ムラミルジペプチド、鉱油、またはノバソーム（Ｎｏｖａｓｏ ｍｅ）などと−緒に、１つ以上の本発明に係る合成ポリペプチドを含むことがで きる。好適な担体としては、患者にペプチドまたはポリペプチドを導入するのに 用いるビヒクルとして好適な生理食塩水溶液などの液体媒体を挙げることができ る。防腐剤などの追加成分が含まれていてもよい。

他のワクチン処方は、本発明に係る核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）をその中に 挿入（これは、挿入された核酸分子によってコードされるポリペプチドに対する 免疫応答を刺激するためである）された、ウィルスまたは宿主細胞、例えば微生 物（例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、サルモネラ属ｆ匣總叩１ハ ｌ　）を含むことができる。

ワクチン組成物の投与は、従来の経路、例えば経口または非経口（例えば、任意 に間隔を置いた筋肉的注射、例えば７〜２８日間隔での２回の注射）などの何れ で行われてもよい。

上述したように、図２．３．４または５に示されたヌクレオチド配列のアミノ酸 翻訳は、一群の膜内在性アミノペプチダーゼ酵素と配列相同性を示す。これは、 図２．３．４または５に示された配列の翻訳を用い、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍ ｐｕｔｅｒ　ＧｒｏｕｐＳｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｏｆｔｗａｒ ｅ　ｐａｃｋａｇｅ、バージョン７．０１．１９９１年１１月（諏ｖｅｒｅｕｘ 　ｅｔ　ａｌ、、　ｆ１９８４）　）において入手される様々なデータベースを 調査することによって決定された。２つのこのような比較が、図６に示されてい る。

本発明に係るアミノペプチダーゼをコードする配列は、上述したように、一群の 公知の技術および発現システム、例えばＥ、　ｃｏｌｉなどの原核細胞における 発現、イースト、バキュロウィルス昆虫細胞系または形質転換哺乳類細胞などの 真核細胞における発現、およびトランスジェニック哺乳類および植物における発 現などを用いて達成することができる。特に有利には、ヌクレオチド配列は、例 えばＦｉｒｅ、　ｆ１９８６）；　Ｆｉｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ｆ１９８９）＋ 　５ｐｉｅｔｈ　ｅｔ　ａｌ、＋　ｆ１９８８）；　Ｒａｎ　■煤@ａｌ、。

（１９９０＋で説明される線虫類（ｎｅｍａｔｏｄｅｌ　Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄ ｉｔｉｓのためのシステムなど、トランスジェニック線虫類システムを用いて発 現させることができる。

本発明の更なる観点は、上述の核酸分子を含む真核細胞あるいは原核細胞を、上 記ポリペプチドが発現する条件下で培養し、このようにして製造されたポリペプ チドを回収することからなる上述するような合成ポリペプチドの製造方法を提供 する。

従って、本発明の他の観点は、本発明に係るヌクレオチド配列を含むクローニン グベクターおよび発現ベクターを包含している。このような発現ベクターは、本 発明の核酸分子と読み取り枠を適合させて結合された適切な制御配列、例えば翻 訳調節要素（開始および停止コードなど）および転写調節要素（プロモーター− オペレーター領域、リポソーム結合部位、終止停止配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ ｎ　５ｔｏｐｓｅｑｕｅｎｃｅ　）など）を含んでいる。

本発明に係るベクターには、この分野で公知かつ文書に記録された技術にかかる プラスミドおよびウィルス（バクテリオファージおよび真核ウィルスを含む）が 包含され、そしてこれも、本分野で公知かつ文書に記録発行された様々な異なる 発現システムにおいて発現させることができる。適切なウィルス性ベクターは、 上述したように、バキュロウィルスおよびアデノウィルスおよびワクシニアウィ ルスをも含んでいる。多（の他のウィルス性ベクターが、この分野で説明されて いる。

様々な技術が公知であり、発現のために原核細胞または真核細胞内に、あるいは トランスジェニック動物を形成するために生殖系列細胞あるいは体細胞内に、こ のようなベクターを導入するために用いることができる。好適な形質転換技術ま たはトランスフェクション技術が、文献において良く説明されている。

上記で定義されるような本発明に係るアミノ酸分子を含んだ、形質転換されるか あるいはトランスフェクションされた真核または原核宿主細胞、またはトランス ジェニック微生物は、本発明の更なる観点を形成する。

一般的な真核発現システム、特に線虫類発現システムは、翻訳後過程、および特 にグリコシレーンランが起こりうるという利点があり、トランスジェニック線虫 類システムの場合には、天然タンパク質において発見されたのに対応するグリコ ル−ンヨンを期待することができる。このことは、多くの場合、翻訳後過程が、 最適な生体活性を発現するために組換えタンパク質に要求されるので、本発明の 重要な観点を表す。

哺乳類細胞発現システムもまた、多くの利点を有している。哺乳類宿主細胞は、 抗原の天然形態および防御エピトープの良好な再生を提供する。なぜならば、真 核発現システムは再生を必要とし、天然形態の再生に乏しい不溶性タンパク質を 産生ずるかもしれないｐ、、　ｃｏｌｉと比較して、より類似したグリコシレー ジョンパターン、ジスルフィド結合および他の翻訳後修飾を起こすであろうから である。

加えて、哺乳類のグリコンレーションは、防御抗タンパク質応答から外れた免疫 応答を誘発しないようである。ヒトおよび家畜動物の防御のためには、ヒトまた は動物の繊維芽細胞またはミエローマセルライン、例えばＨｅ１ａ−ヒトセルラ イン、Ｂｌ（Ｋ−幼児ハムスター腎臓細胞、ＶＥＲＯ−サル腎臓セルライン、Ｆ Ｒ３Ｔ３−　Ｆｉｓｈｅｒラット繊維芽細胞、ＮＩＨ３Ｔ３−マウス繊維芽細胞 セルライン、Ｃ１２７エーマウス乳癌セルライン、ＣＶ−１−アフリカグリーン モンキー腎臓繊維芽細胞、３Ｔ６−マウス胚繊維芽細胞、Ｌ細胞−マウスセルラ イン、ＣＨＯ−チャイニーズハムスター卵巣セルライン、ＮＳＯＮＳＸ　−ＳＦ ３および他のマウスミエローマセルライン、およびＹＢ２１０およびＹ３等の他 のマウスミエローマセルラインおよびラットミエローマセルラインなどを用いる ことが好ましい。

異なったクラスの哺乳類セルラインに適切なベクターは、この分野で公知である 。一般的に、これらは、抗原またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド 配列に作動的に結合されたプロモーターおよび／またはエンハンサ−を含むであ ろう。好適なプロモーターは、５Ｖ４０初期または後期プロモーター、例えばＰ ＳＶＬベクター、サイトメガロウィルス（ＣＭＶＩプロモーター、マウスメタロ チオネインＩプロモーターおよびマウス乳癌ウィルスＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅｒ ｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔｌなとを挙げることかできる。ベクターは、好ましく は、好適なマーカー、例えば７ヒトロフオレ一ト還元酵素またはグルタミン合成 酵素のための遺伝子なとを含んでいる。このようなタイプのベクターは、ＷＯ３ ６１０５８０７、ＷＯ３７１０４４６２、ＷＯ３９１０１０３６およびＷＯ３９ ／１０４０４１：説明されテいル。

宿主細胞のトランスフェクションは、標準的な技術、例えばリン酸カルシウム、 ＤＥＡＥデキストラン、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、直接マ イクロインジェクション、シーンキャノンまたはエレクトロポレーションなどを 用いて行うことができる。後者の技術が好ましく、エレクトロポレーションを用 いた哺乳類セルラインのトランスフェクション方法は、Ａｎｄｒｅａｓｏｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９８０に説明されている。一般的に、線状ＤＮＡは環状ＤＮＡ よりも容易に導入される。

タンパク質Ｈ１１０Ｄの場合、特異で、普通ではないグリコシレージョンパター ンを有しており、このグリコシレージョンパターンは、ヘモンヵス属からのＨｌ ｌｏＤに対して今までのところ得られた多くのモノクローナル抗体が、有用なワ クチンを開発するのに重要であろう炭水化物エピトープを認識するため、免疫活 性に貢献すると考えられる。

特に、ヘモンカスからのＨｌｌｏＤに関し、以下のグリコシレージョンパターン が示された。

ｉ、はぼ６５亀のオリゴサツカライドがＮ−結合であり、残りが缶結合である； １１、Ｎ−結合オリゴサツカライドの主要な部分（例えば、はぼ４８亀）が、複 合クラスである。

１１１、オリゴサツカライドの実質的に全て（例えば、９５％より大）が、不荷 電である： １ｖ、構成要素モノサッカライドの相対的モル含有量が、Ｎ−アセチルガラクト サミン１．０、フコース３．６、ガラクトース４．１、グルコース４．４１．マ ンノース６．２　およびＮ−アセチルグルコサミン５．２である。

Ｖ、主要なオリゴサツカライド（オリゴサツカライドＤと称する）以外のオリゴ サツカライドが、広範囲なエキソグリコシダーゼ（例えば、α−Ｄ−マンノシダ ーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−グリコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトノ ダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−Ｄ−キ７０シ ダーゼ、β−Ｄ−Ｎ−アセチルクルコサミニダーゼ）による分解に実質的に耐性 である。

これらを含むこのようなオリゴサツカライドおよび糖タンパク質は、本発明の更 なる観点を形成する。

ヘモンカス属ＨＩＩＯＤ糖タンパク質のオリゴサツカライドＤは、Ｎ−結合型で あり、α−１，３−架橋およびα−１，２−架橋により、マンノース（Ｎ−アセ チルグルコサミン）、コアに結合した２個のフコース残基からなる新規構造を有 している。

従って、本発明の他の観点は、組換えタンパク質、例えば畑土アミノペプチダー ゼタンバグ質またはその抗原フラグメントに結合する場合に、あるいは特に非常 に若い動物の免疫のための抗−イディオタイプ抗原を発生させるのに用いる場合 には特に、以下の構造・ 更に詳しくは以下の構造・ を有するオリゴサツカライドを提供する。

動物糖タンパク質は、一般的に、フコースα−１，６−結合を有しており、本発 明のオリゴサツカライドの７コースα−１，３−結合は、独特の特徴である。

以下に本発明を、ヘモンカスコントルトゥス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｏ ｔｒｔｕｓ）から得たタンパク質Ｈ１１０Ｄを特に挙げて、より詳しく説明する 。しかしながら、組織化学およびＤＮＡハイブリッド化などの技術の多様性によ り、ＨＩＩＯＤ等価物が他の寄生虫種において観察されている。Ｈ１１０Ｄタン パク質は、多重遺伝子複合体であり、加えてそれをコードするヌクレオチド配列 は、嬬虫の種の違いおよびライフサイクルステージの違いによる配列多様性を示 すと考えられる。更に、異なるステージまたは種で、異なって発現されるであろ う多重酵素形態（イソ酵素）が存在し得る。この研究では、ＤＮＡ配列、および 従って予想されるアミノ酸配列は、異なる原料からの、およびヘモンカスコント ルトウスのライフサイクルの異なる寄生段階での、組換えＤＮＡ技術により、Ｈ ＩＩＯＤ遺伝子に対応するｍ１ｔＮＡから得られたｃＤＮＡクローンおよびＰＯ 生産物から決定された。

ｃＤＮＡおよびＰＣＲ産生物のアミノ酸配列作成は、３つの密接に関連するＨＩ ＩＯＤ配列を同定することを可能とし、これら配列は、ここに、Ｈｌｉ−１（Ｓ ＥＱＩＤ　Ｎｏ：　１９）、Ｈｌｌ−２（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　２０１および Ｈｌｌ−３（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　２１）　テ示される。Ｈｌｉ−１は、３つ の連続し、かつオーバーラツプした配列、即ちＣＤＮＡクローンＡｕ５ｔＢ１　 （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　６）、ＰＯ産生物Ａ−６４８（ＳＥＱよりＮｏｔ９） および３′末端ＰＣＲ産生物０１４−１７８　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏｔ　１２） からなり；　ＥＬｌ−２は、ＰＣＲ産生物Ａ−６５０および２．５ｋｂ（各／２ 　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　ｔｏおよび７）からなりｉ　Ｈｌｌ−３は、ＰＣＲ産 生物３．５　ｋｂおよびＡ−６４８（各々ＳＥＱ　ＩＤ園＝８および１１）から なる。

個々の配列ｃＤＮＡおよびＰＣＲ産生物クローンおよびＨｌｄ（、−２および− ３の間の、特定関係は、図１に要約されており、図３．４および５に詳細に示さ れている。

ｃＤＮＡクローンおよびＰＣＲ産生物から得られた配列の違いおよび変異が観察 された。これらは、特に図２．３．４および５　（ＳＥＱ　ｌ’Ｋ）＋　１〜１ ５および１９〜２１から構成される）から知ることができ、かつ表１に要約され ているとおりである。

表１　図２に示されたヌクレオチド配列の翻訳によって得られた推論されるアミ ノ酸配列の相同性 ％類似性　％同一性 これらの違いは、（多重遺伝子族の）異なる＋ＴｌＲＮＡに帰することができる 。加えて、これらの変異は、少なくとも部分的には、ライフサイクルの異なった ステージで、あるいは地理的由来が異なった種に存在するＨ１１ＯＤコード配列 またはｍＲＮＡの異なる変異体によるものであろう。

乳類アミノペプチダーゼ配列との同一性および類似性のレベルを示している。

表２　Ｈ１ｌＯＤアミノ酸配列とラフトアミノペプチダーゼＭ　（ＡｐＭｌとマ ウスアミノペプチダーゼＡ　ｆＡｐＡ）との相同性％類似性　％同一性 Ｈｌｌ−３：　ＡｐＭ　５３　３２ Ｈ１１−３：　ＡｐＡ　５２　３０ ａ１は、ヘモンカスコントルトゥスＨ１ｌＯＤ　ｃＤＮＡおよびＰＣＲ産生物ク ローン配列、およびＨｌｌｏＤ　ｍＲＮＡに沿ったその関係および相対位置の地 図を示している。

２　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　２０、クローン化ＰＣＲ産生物ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏｔ　７および１０から誘導される）、およびＨｌｌ−１＋ＳＥＱより　Ｎｏｔ 　１９、クローン化ＰＣＲ産生物５ＥＱＩＤ園：９および１２、およびｃＤＮＡ クローンＡｕ５ｔＢ１＋　ＳＥＱよりＮｏｔ６から誘導される）で示されたＨＩ ＩＯＤヌクレオチド配列を示す。

図３は、配列８１１−３　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　２１１　（図２に示される ）、およびこれと並べたｃＤＮＡクローンＭ１およびＭＬＡＵＳ　（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ｋＫ）！　１および５）を示す。

図４は、配列Ｈ１ｉ−２ｆｓＥＱ　ＩＤ薗：２０、図２に示される）、およびこ れと並べたｃＤＮＡクローンＢ２　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４）を示す。

図５は、配列）ｆｉｌ−１、（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１９　、図２に示されル ）、およびコレと並へたｃＤＮＡ　ＢＩＡおよびＡｕ５ｔ、　Ｂ１　（各々ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏｔ　２および６）を示す。

図６は、ａ）図２に示されたＤＮＡ配列）＋１１−１、Ｈｌｉ−２およびＨｌｌ −３から誘導された予想されるアミノ酸配列ｆｓＥＱ　ＸＤ　Ｎｏｔ　２２．２ ３および２４）を示し；ｂ工）および１１）は、各々ラットミクロソーマルアミ ノペプチダーゼＭ（Ｗａｔｔ　ｅｔ　ａｌ、　、１９Ｂ９］およびマウスミクロ ソーマルアミノペプチダーゼＡ　（Ｗｕａｔ　ａｌ、、　１９９０１の文献公開 されたアミノ酸配列と比較したＨｌｌ−３の予想されるアミノ酸配列を示し、同 一性は囲み内に記載され、ダッシュは、比較された配列間の相同性のレベルを最 大とするために導入されたスペースを示す。アミノ酸のための伝統的な単一文字 コードが用いられている。配列上の水平な線は、トランスメンプラン領域を示し 、星印は亜鉛結合モチーフの位置を示す。類似性のレベルは表１および２に示さ れている。

恩ユは、上述のＨＩＩＯＤのＣＮＢｒおよびＬｙｓ−Ｃフラグメント（国際特許 出願ｗ□ｇｏ７１１０８６　、各々、既にリストしたポリペプチド配列（ａｌ、 （ｂ）　、（ｅ）　、（ｋ＋および（ａａｌ　）から得た一連のアミノ酸配列（ 各々　Ｐｅｐ　Ａ　５Ｐｅｐ　Ｂ、　Ｐｅｐ　Ｃ。

Ｐｅｐ　ＤおよびＰｅｐ　Ｅと称する）、およびａｌ　Ｈｌｌ−１、ｌ）　ｌ　 Ｈｌｌ−２およびｃ　ｌ　ｆ（１，Ｌ−３の翻訳物を、エラスターゼまたはサー モリシンにより消化した後の、）＋１１０Ｄから得た３つの新規配列（各＃　Ｓ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　１６．１７および１８）を示す。

更なる観点において、本発明は、クローン附、ＢＩＡ＋ＢＩＡ−３’、Ｂ２、煎 へＵＳ。

Ａｕ５ｔＢｉ、０１４−０１５　＜２．５ＰＣＲ１，０１４−８７２（３，５Ｐ ＣＲクローン２＞　、Ａ−６４８（Ｂｉの５′末端）　、Ａ−６５０＋２．５Ｐ ＣＨノ５’末端）　、Ａ−６４９（３，５ＰＣＲ（７）　５’末端）　、０１４ −１７８ｔＡｕｓｔＢ１クローン２の３′末端）　、０１４−１７８　（Ａｕｓ ｔＢ１クローン３＆６の３嘗末端）　、０１４−８７２　＋３．５ＰｃＲクロー ン１０）および０１４−８７２　（３，５ＰＣＲクローン１９）の配列、８１１ −１　、Ｈｌｌ−２およびＨｌｌ−３の配列、ＳＥＱ　ＸＤ　Ｎｏｔ　ｌ〜１５ および１９〜２１（各々図２．３．４および５に示される）、または上記配列の 何れかと実質的に相同であるか、または上記配列の何れかとハイブリッド化する 配列から選択される１つ以上の配列と、実質的に対応するか、あるいは実質的に 相補的な１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子をも堤供する。

上述したように、上記クローンの様々な配列を、公知配列におけるコンピュータ データベースに対して比較することにより、ミクロソーマルアミノペプチダーゼ 酵素族（ＥＣ，３，４，１１，−）との実質的な相同性が証明される。Ｈ１１０ Ｄタンパク質およびそのサブフラグメントに関してなされた酵素学的活性および 阻害研究により、このタンパク質が実際に、ミクロソーマルアミノペプチダーゼ （α−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ（ミクロソーマル））であることが確 認される。このような研究により、蔓に、アミノペプチダーゼＡ様活性およびア ミノペプチダーゼＭ様活性の両方が示され、ＨＩＩＯＤダブレットの各々の構成 要素が個々に酵素活性を示すことをことが示された。

ＨＩＩＯＤのタンパク質分解消化に関する研究も行われた。酵素エラスターゼを 用いた場合、ＨＩＩＯＤは部分的に開裂することができ、２つのフラクション、 界面活性剤−可溶性フラクション（膜とともに残存する）および水−可溶性フラ クション（ＨｌｌＢと称する）を形成することが判明した。ＨＩＩＳは、２つの 構成成分に還元し得るタンパク質二量体の形態において生じる。興味深いことに 、アミノペプチダーゼＭ様活性だけが水−可溶性）１１１８フラクシヨンと結合 しており、アミノペプチダーゼＡ様活性だけが界面活性剤−可溶性フラクション と結合していることが判明した。

以下の実施例は、図１〜７に示された配列の決定に導く研究を、以下の追加図面 とともに説明する。

図８は、潜在的）１１１０Ｄクローンから溶離された親和性精製抗体によりプロ ーブされたヘモンカスコントルトウス成虫の界面活性剤抽出物に存在する膜内在 線タンパク質のウェスタンプロットを示す。ａ）へモンカスの界面活性剤抽出物 中の抗原は、この抽出物に対する抗血清により認識され＋ｂ）ストリップ、例え ば界面活性剤抽出物のプロットに対して再テストされたａ）に示されるようなス トリップから溶離された抗体は、溶離工程の成功を確認し；Ｃ）クローン阻発現 タンパク質に結合するｂ）に示される抗体は、１１０ｋｄの領域（および約２０ ５　ｋｄでの比較的シャープなバンド）を強く認識し；ｄ）血清を吸着するため に非組換え物を用いた場合には、抗体結合はない。

図９は、３）ＣＤＮＡクローンＭｌ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１）；　ｂ　） 　ｃＤＮＡクローンＭＩＡＵＳ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　５）ｉ　ＣＩ　ＣＤ ＮｋクローンＢＩＡ　（ＳＥＱ　ＸＤ　Ｎｏｔ　２および３）；ｄ）ｃＤＮＡク ローンＡｕ５ｔＢ１　（ＳＥＱより　Ｎｏｔ　６）＋　ｅ　ｌクローン化ＰＣＲ 産生物０１４−８７２　（３，５−２、ＳＥＱ　ＸＤ　Ｎｏｔ　８１ｉおよびｆ ）クローン化ＰＣＲ＊生物０１４−０１５　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　７１でプ ローブした１１日令、１５日令および２３日令）へモンカスコントルトウスから 精製されたｍＲＮＡのノーザンプロットを示す。番号１１．１５および２３は、 ｍＲＮＡが得られたヘモンカスの年令を示す。

図１０は、ｃＤＮＡクローンＭＩＡＵＳ　（Ｓ角１０　Ｎｏｔ　５１　、ＢＡＡ 　（ＳＥＱ　ＸＤ　Ｎｏ：　２および３）およびＡｕ５ｔＢｉ　（ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏｔ　６）、およびＰＣＢ産生物０１４−８７２　（ＳＥＱよりＮＯ＋８１ および　０１４−０１５　（Ｓ幻１０■；７）でプローブしたヘモンカスコント ルトウスのサザンプロットを示す。ａ）プロットは、中程度の緊縮条件で洗浄さ れ、ｂ）プロットは高度の緊縮条件で洗浄され；各プローブについて、トラック ｌはλＤＮＡのＨ工ｎｄｌエエ消化物をマーカーとして含むかブランクのままで あり、トラック２および３は各々ヘモンカスゲノムＤＮＡのＥＣＯＲ工およびＨ ｉｎｄエエエ消化物を含んでいた。

図１１は、電気泳動により精製されたＨＩＩＯＤ　（ＨｌｌｏＤＥ）に対して親 和性精製抗体によりプローブされた、組換えＧＳＴ−ＭｌおよびＧＳＴ−ＢＩＡ 融合タンパク質のウェスタンプロットを示す。

り質に対する抗血清でプローブしたＣｏｎＡ　Ｈ１１０Ｄ抗原のウェスタンプロ ットを示す。

図１３は、３１Ｍ０ｎＯＱカラムでのＣｏｎＡ　ＨＩＩＯＤのイオン交換クロマ トグラフィーによって得られたフラクションにおけるＨ１１０Ｄタンパク質およ びアミノペプチダーゼ酵素活性の分析結果を示し；ｂ）図１３ａ）に示されるフ ラクションの５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

凶」１は、ａ）自然流出等電点電気泳動実験においてフラクションが得られたｐ Ｈ値を示し１ １）１図１４ａ）からのフラクションの還元条件での５ＤＳ−ＰＡＧＥを示し、 ここで、）＋１１０８の下側バンドはフラクション６で発見され、上側バンドは フラクション１６で発見された（中間のフラクションにおける各々の量は変化し た）；ｃ　ｌ　ｉ）　ＴＳ　３／１９．７と称するモノクローナル抗体およびｌ ｊ）親和性精製ポリクローナル抗−Ｍ１抗体によりプローブされた図１４ｂ）に 示されるフラクションのウェスタンプロットを示（７；コントロール抗体は、検 出可能な反応を与えなかった。

図１５はＳａ）他の自然流出等電点電気泳動実験においてフラクションが得られ たｐＨ（Ｌｂ）ｌｊ？素アッセイに用いられた図１５ａ）からのフラクションの 還元条件下での５ＤＳ−１？ＡＧＥを示し、ここで、ＨＬＩＯＤの下側バンドは フラクション４〜５で発見され、上側バンドが１６〜１８で発見された（中間の フラクションにおける各々のバンドの量は変化した）；Ｃ）図１５ｂ）において 示されたフラクションのミクロソーマルアミノペプチダーゼ特異的活性を示す。

図１６は、ＨＩＩＯＤから分離された上側ｆｕ）、下側（Ｌ）、組合わせ（Ｕ＋ Ｌ）および中間ダブレット　（Ｄｌバンドを用いたワクチン接種によるヒツジの 防御を示し、ａ）糞１グラム当たりの卵の数で表される寄生虫卵排出ｉｂ）死亡 後でのコントロールと比較した畑土感染率である。

図１７は、エラスターゼを用いた消化によりＩ（ＩＩＯＤから得られた水−可溶 性７ラグメント　（ＨＩＩＳＩおよびＨｌｌＡ　（残余の界面活性剤−可溶性Ｈ ＩＩＯＤ）を用いたワクチン接種によるヒツジの防御を示し、ａ）糞１グラム当 たりの卵の数で表される寄生虫卵排出；ｂ）死亡後でのコントロール（Ｃ）と比 較した畑土感染率Ｈ１１０ＤのＡｉ）、Ｂｉ）アミノペプチダーゼＭ様活性の阻 害と、Ａ１１）　％　Ｂｉｔ）アミノペプチダーゼＡ様活性の阻害との間の関係 の例を、Ａｉ、ｉｉｌ死亡後の畑土感染率減少％およびＢｉ、ｉｉ）糞中卵数減 少％によって測定したレベルで示す。口は抗−ＨｌｌｏＤ　、■は抗−Ｈ１１Ｏ Ｄウマフェリチンコントロールである。

１１１９は、成虫へモンカスコントルトウスにおけるアミノペプチダーゼ酵素活 性の組織学的局在を示し、成虫雌性へモンカスコントルトウスの凍結切片の光学 顕微鏡写真は、Ｍｌ（ｉ）の微絨毛（ｍｖｌのみに結合するアミノペプチダーゼ 活性（これら白黒写真では、赤い反応生成物は暗黒〕くンド（矢印）として現れ て−する）。他の何れの組織（例えばキューティクルｆｃ）、皮下組織（ｈ）、 生殖管（９ｔ）、壁状筋肉（−））も活性を示さない。ａ）において、基質はＬ −ロイシン−４−メトキシ−β−ナフチルアミドであり、ｂ）において、基質は Ｌ−グルタミン酸α−（４−メトキシ−β−ナフチルアミドであった。

殴主旦は、バキュロウィルス発現ベクターｐＢ１ｕｅＢａｃエエ内にサブクロー ン化された３、５ＰＣＲ産生物（クロー　ン２）　（ＳＥＱ　ＸＤ　Ｎｏｔ　８ １　（７）地図を示す。

２つのクローン化されたプラーク、Ｐ３ＡおよびＰ４Ａが、全長の免疫陽性１ｕ ｌＯＤ（矢印）を発現し、コントロールは発現しなかった。

寒！男 裏−迭 肌に、λＧＴｉｉライブラリーの構成 ｍＲＮＡの単離 液体窒素中で粉砕した。０．５％Ｗ／Ｖのサルコシルおよび０．７％Ｗ／Ｖの２ −メルカプトエタノールを含有する２５ｍＭクエン酸ナトリウム中の４Ｍグアジ ニン塩酸１１０体積で、粉砕物からＲＮＡを抽出し、次いでＣｈｏｍｃｚｙｎｓ ｋｉ　＆　５ａｃｃｈｉ（１９８７１の方法を用いてフェノールおよびクロロホ ルムで抽出した。これから、オリゴｄＴセルロース上でのアフィニティークロマ トグラフィー（２回）により、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｌ＝ｔ　ａｌ　（１９８２） に記載されているようにして、メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ　ｌを調製し、 Ａｍｅｒｓｈａｎ＋工ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃより入手したウサギ網 赤血球溶解キットおよび１ＩＳ−メチオニンを用いて製造者の指示に従ってｉｎ 　ｖｉｔｒｏ翻択することにより、品質を評価した。１２０　ｋｄまでのポリペ プチドが検出された。

相補的ＤＭの調製 Ｇｌｕｂｅｒ　＆　ｏｏｆｆｍａｎ　（１９８３）の方法に従って、ランダムブ ライミングおよびトリ逆転写酵素を用い、１μ９のｍＲＮＡから第１ストランド 相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ＋を合成し、またＲＮａＳｅ　Ｈでの置換反応および Ｅ、　Ｃｏ１１　ＤＮＡポリメラーゼを用い、次いでＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ を用いて３°オーバーハングを修復して第２ストランドを合成した。二重ストラ ンド（ｄｓ）　ｃＤＮＡの収量は、１μ９のｍＲＮＡから約４００　ｎｑであっ た。このｄｓ　ｃＤＮＡを１％アガロースゲル中での電気泳動、次いでオートラ ジオグラフィーによって試験した。このｄｓ　ｃＤＮＡは、０．２〜９．４キロ ベース（ｋｂ＋のサイズ範囲にあり、大部分は０．５〜２．３　ｋｂの範囲にあ った。

λ９ｔ１１中でのｃＤＮＡのクローニングＡｍｅｒｓｈａｍ　ｃＤＮＡクローニ ングシステム　ｆｋｉｔ　ｎｏ、　ＲＰＮ　１２８０．　ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎ ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃｌおよびｉｎ　ｖｉセｒｏパッケージング抽出 物（ｋｉｔ　ｎｏ、　Ｎ３３４゜Ａｍｅｒｓｈａｎｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ ａｌ　ｐｉｅ）を製造者の指示に記載されたように用い、またＥＣ０ＲＸリンカ −オリゴヌクレオチド（５’　ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を用いて、λ９ｔ１１中のラ イブラリーを構成するために、非サイズ選択ｃＤＮＡを用いた。得られたライブ ラリーを、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧＩおよび５−ブ ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ　）の 存在下で、Ｅ、ｃｏｌｉ株Ｙ１０９０上にプレートした。この条件下で、組換え λ９ｔ１１は透明（″白色”）プラークとして現れ、野生型の非組換えλ９ｔ１ １は青色プラークとして現れる。

このライブラリーは、９０％の白色プラークを含有し、またクローニング効率は 、４　ｘ　１０’プラ一ク形成単位（ｐｆｕｌ／μｇ　ｃＤＮＡと計算され、ラ イブラリータイターは、１ｍｇ当たり　２ｘ１０６ブラ一ク形成単位であった。

ランダムにピックアップされた２０の組換え体からのＤＮＡ分析は、０．５１　 Ｋｂの平均挿入サイズを示した。しかしながら、この平均値は、３．５　Ｋｂの 挿入物を有する１つのクローンにより歪曲されている。挿入物の大部分は、〉３ ００塩基対（ｂｐ）であった。次いでＵＫ嬬畑土ＲＮＡから誘導された非増幅λ ９ｔ１１を免疫スクリーニングした。

抗体プローブの調製 膜内注性タンパク質の抗血清 成虫へモンカスコントルトウス（英国起源）から腸を切取り、ｌ＋ｎＭのエチレ ンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡＩおよび１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオ ライド（ＰＭＳＦ＋を含有する水冷リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳＩ、ｐＨ７ ，４の中で均質化した。このホモジネートをマイクロフユージを用いて１０分間 遠心分離し、ペレットを、０．１亀ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ　２０　（詣ｅｅｎは商 標）を含有する同一の緩衝液に再懸濁した。再度遠心した後、ペレットを、２％ 　ｖ／ｖ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有する同一の緩衝液に再懸濁し、４° Ｃで２時間抽出した。この抽出物を上記のようにして遠心し、膜内注性タンパク 質（ＩＭＰ）を含む上澄み液を得た。

完全フロインドアジュバント　（ＦＣＡ　ｌ中のＩＭＰを、０．７．１１および １５週に、５０．５０．１２０および１３０μｑのＩＭＰ用量で筋肉内注射する ことにより、ヒツジを高度免疫した。最後の注射から６週後に、血清を採取した 。これを血清ＥＥ−０６８と命名した。

ヘモンカスコントルトウスの界面活性剤抽出による膜内注性タンパク質の調製１ ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦを含有するＰＨ１０〜１０体積中で畑土 を均質化することにより、抽出物を調製した。懸濁液を４°Ｃにて２０分間１０ ．０００　Ｋ　ｇで遠心し、ペレットを上記のようにして、０．１＆　ｖ／ｖ　 Ｔｗｅｅｎ　２０を含有する同一の緩衝液に再懸濁し、次いで５体積の２％ｖ／ ｖ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ（００で抽出した。上澄み液を、１００，０００　ｘ　ｇ で１時間再遠心し、得られた上澄み液（ＨＩＩＯＤを豊富に含有するが他のＩＭ Ｐをも含む）を、ウェスタンプロット実験に、また非変性）１１１０Ｄの調製の ために用いた（下記参照）。

ＨＩＩＯＤおよびアフィニティー精製抗−Ｈ１１ＯＤＮの調製ＨＩＩＯＤに富む 抽出物に、ＣｏｎＡ−アガロース上のアフィニティークロマトグラフィーを行い 、次いでＭｏｎｏＱ　上でイオン交換クロマトグラフィーを行った（Ｗ０８Ｂ１ ００８３５およびＷＯ９０／１１０８６　（Ｄ記載に準する）。精製したＨＩＩ ＯＤをＦＣＡ内で子ヒツジに筋肉注射した。１００μ９の用量を３回、３週間の 間隔で与えた。

最後の注射から４週間後の子ヒツジから採取した血清を、シアノゲンブロマイド で活性化したＳｅｐｈａｒｏｇｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にカップリングして いる精製Ｈ１ｌＯＤを含有するカラムに吸収させることにより、親和性精製した 。５ｅｐｈａｒｏｓｅへのＨＩＩＯＤのカンプリング、抗血清の結合および抗− Ｈｌｌ０Ｄ抗体の溶出は、Ｐｈａｒｍａｃｉａにより与えられた指示に従った。

これらアフィニティー精製された抗体を、抗−ＨｌｌｏＤＮと命名する。′Ｎ″ は、これらの抗体を、抗−ＨｌｌｏＤＥと命名した電気泳動精製された変性され たＨＩＩＯＤに対して産生じた抗体（抗−ＨｌｌｏＤＥと命名する）から区別す る。

ウェスタンプロット法 ウェスタンプロット法は、標準的な手法（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８２＋を用いて行った。

クローンの単離および特性決定 Ｕ、に、λ９ｔ１１ライブラリーの免疫スクリーニングライブラリーの免疫スク リーニングに用いた方法は、実質的にＢｏｗｔｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ（１９８６１ に記載されているとおりである。使用前に血清（ＥＥ−０６８１を、溶解物およ びＥ、ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０の全細胞で吸収させることにより、抗−Ｅ、ｃｏｌ ｉ抗体を枯渇させた。ライブラリーを、９０　ｍｍ直径のプレート当たり　１０ ’　ｐｆｕの密度でＥ、ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０細胞上にプレートした。プレート を、ＸＰＴＧで含浸したニトロセルロースフィルターで覆い、−晩インキユベー トした。フィルターをＴＢＳＴ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｍ、　ｐＨ７，４，１５０ ｍＭ　ＮａＣ１，０，０５％　Ｖ／Ｖ　Ｔｗｅｅｎ　２０１で洗浄し、次いでＴ ＢＳＴ中の５　％　ｖ／ｖウマ血清で２時間ブロックした。５１ウマ血清を含有 するＴＢＳＴで２００倍に希釈した血清ＥＥ−０６８を加え、静かに震盪しなが ら、フィルターを４時間インキュベートした。フィルターを再度’Ｉ’ＢＳＴで 洗浄した後、５％ｖ／ｖウマ血清を含有するＴＢＩＩｉＴで５００倍に希釈した ホースラディツシュパーオキシダーゼ（Ｉ（ＲＰＩ−結合ウマ抗−ヒツジエｇＧ とともに２時間インキュベートした。（ヒツジ１９Ｇに対する抗血清はウマにお いて産生させ、抗−ヒツジエ９ＧはヒツジＩｇＧ　５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム上 でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そしてこれらの抗体は、 Ｎａｋａｎｅ　＆　Ｋａｗａｏｉ、　１９７４の方法によって）［ＲＰに結合さ せた。）フィルターをＴＢＳＴ中で更に洗浄し、０．６　ｍｇ／ｍｌの３．３′ −ジアミノベンジジン（ＤＡＢ＋および０．１％ｖ／ｖの過酸化水素を用いて陽 性プラークを検出した。

２５の想定される陽性を採集し、アフィニティー精製した抗−ＨｌｌＯＤＮで、 上記のようにして再スクリーニングした。この二次スクリーニングにより、５個 の組換え体がなお陽性であり、Ｍｌと命名したクローンが最強の信号を与えた。

組換えファージ上での抗体のアフィニティー精製抗体陽性λクローンあるいは非 組換えλ９ｔ１１陰性コントロールファージをそれぞれ１０’　ｐｆｕプレート することにより、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０クローン上に集密プレートを調製し た。これらのクローンを４２°Ｃで４時間インキュベートし、次いでＩＰ”？’ Ｇで含浸したフィルターで覆い、更に３７℃で一晩インキユベートしたフィルタ ーをプレートから除去し、次いで５％　ｖ／ｖのウマ血清で１時間ブロックする 前に、７Ｂ！；Ｔで洗浄した。ＴＢＳＴで充分に洗浄する前に、抗血清ＥＥ−０ ６８の１００倍希釈液中で６時間インキュベートした。２　ｍｌの溶出緩衝液（ ５ｍＭ　グリシン、５００　ｍＭ　ＮａＣ１，０，２％Ｔｗｅｅｎ　２０．　ｐ Ｈ２，３１を２回、各２〜３分間適用することにより、フィルターから結合抗体 を溶出し、２００μｌのｌ　Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，４を加えて中和 し、２００倍に希釈してＨＩＩＯＤに富む抽出物のウェスタンプロットの免疫ス クリーニングに使用した。

Ｍ１クローンのＤＮＡ配列作成 Ｍｉｎｌａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　（１，９８２）に記載の方法に従って、ラムダ ＤＮＡをＭ１クローンから単離した。３００　ｂｐ　Ｍｌフラグメントを含有す る２、３８　ｋｂ　ＫｐｎＩ−５ｓｔエフラグメントをゲル電気泳動により分離 し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮキット　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　１ｆＧＥＮＥｃＬＥ ＡＮはＢ１０１０１の登録商標）を用いて精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌ： Ｉ　ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　）中にサブクローニングした。ＥＣＯＲエ フラグメントを同じ方法を用いて精製し、同じベクター中に再度サブクローニン グした。

Ｍ１挿入物のヌクレオチド配列を、Ｍ１３前進（ｆｏｗａｒｄｌプライマーおよ び逆進（ｒｅｖｅｒｓｅ）ブイマーの両方を用い、Ｔ７　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ キット　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、υ、に、）を用いて決定した。

オーストラリアλＧＴＩＩおよびλＺＡＰ　ＣＤＮＡライブラリーの調製惑鵬の 単離 液体窒素中で急速冷凍した成虫へモンヵスコントルトウス（オーストラリアＭｃ Ｍａｓｔｅｒ感受性株）　０．５　ｇｍを液体窒素中で粉砕し、Ｃｏｒｄｉｎｇ ｌｅｙ　ａｔ　ａｌ。

（１９８３＋の方法により熱フェノールを用いてＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ収 量は１０．３５　ｍｇであった。このＲＮＡ　１．３　ｍｇを用いて、Ｍａｎｉ ａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　（１９８２１に記載されている方法を用いたオリゴｄＴ セルロース上でのアフィニティークロマトグラフィー（２回の逐次精製）によっ てｌｌｌＲＮＡを調製した。ｍＲＮＡの収量は２１．６μｇであった。ｍＲＮＡ の品質を、Ｉｌｇ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下で、供給者の指示 に従って、ウサギ網赤血球溶解物中でｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳することにより評価 した。得られた翻訳生成物は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド上での電気泳動に続 くフルオログラフィーにより示される＞２００　ｋｄサイズのバンドを含むバン ドを明瞭に識別した。

ＣＤＮＡの合成およびライブラリーの調製Ａ＋ｎｅｒｓｈａｍ工ｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ　ｐｌｃからのｃＤＮＡ合成用キットを製造者の指示に従って用い、 オリゴｄＴプライマーまたはランダムプライマーでのブライミングにより、ｃＤ ＮＡを調製するために、１μ９のｍＲＮＡを用いた。収量は、１１５　ｎｇの二 重ストランド（ｄｓｌ　ｃＤＮＡ　であった。ｃＤＮＡの品質を、Ａｍｅｒｓｈ ａｍ　ｃＤＮＡキットの指示によって記載されているように、アルカリ性アガロ ースゲル上でのｌ　ｊ　ｐ、−標識ｃＤＮＡの電気泳動によって試験した。ＣＤ ＮＡのサイズ（λ−Ｈ１ｎｄｌエエｎ５ａｒｋｅｒｓ。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓとの比較による）は、１５０　ｂｐか ら＞１０　Ｋｂであり、生成物の大部分は、０．６−５　Ｋｂのサイズ範囲にあ った。オリゴｄＴ開始およびランダム開始ｄｓ　ｃＤＮＡをプールし、γ−’　 Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識された過剰のＥＣＯＲ工 ８量体リンカ−（５’ＧＧＡＡＴＴＣＣ３’　Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ ａｂｓ、　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ、　１０１８１に連結した。これらのリン カ−結合ＣＤＮＡをＥｃｏＲ工で消化し、過剰のリンカ−をＭａｎｉａｔｉｓ　 ａｔ　ａｌ　（１９Ｂ２１により記載された方法に従って、５ｅｐｈａｒｏｓｅ 　４ｓ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーによって除去した。カラム からのフラクシヨンを２つのロフトにプールし、その一方は０ｂより大きいｃＤ ＮＡを含有し、他方は２Ｋｂ未満のＣＤＮＡを含有していた。次いで各プールを 別々に、１μ９のＥｃｏＲ工切断物のホスファターゼ処理λＺａｐｌエアーム（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　ｌに連結し、Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ　、登録商標）を用いて別々にパッケージした。大きなサイズのＣ ＤＮＡは１．３　ｘ　１．０’の組換え体を与え、小さなｃＤＮＡは１．４　ｘ 　１０’の組換え体を与えた。これらをプールして、２．７ｘ１０″のライブラ リーを得た。λＺａｐライブラリーを、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ　）上で１３５Ｍプレート当たり２　ｘ　１０’　ｐｆｕでプレートする ことにより増幅した。増幅ライブラリーのタイターは７ｘ１０“ｐｆｕ／ｍｌで あった。

更に２μ９のｍＲＮＡを用いて、上記のようにして、ただしプライマーとしてオ リゴｄＴのみを用いてｃＤＮＡを調製した。ｄｓ　ｃＤＮＡの収量は７４０　ｎ ｇであった。

Ｅｌ：ＯＲ１リンカ−の添加前に、このｃＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｇ　ａｔ　ａ ｌ　（１９８２）に記載のようにして、ＥＣＯＲエメチラーゼで処理し、この場 合は１２量体リンカー（５’ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ３’　Ｎｓｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ、　１０１９１を用いた 。

■ ンカ−処理したｃＤＮＡをＥＣ０ＲＩで消化した後、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ からの、ＣＤＮＡを含有する全てのフラクシヨンをプールし、２μ９のＥｃｏＲ Ｉ切断物のホスファターゼ処理λ９ｔ１１アーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　）に 連結した。連結混合物を２つに分け、Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　ｆｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ）の２つのロフトにパッケージし、これらをプールして７ｘ１０・ ｐｆｕのλ９ｔ１１ライブラリーを得た。１３５Ｍプレート当たり　５ｘ　１０ ”　ｐｆｕでＳＴ９細胞上にプレートすることにより、ライブラリーを増幅した 。増幅λ９ｔ１１ライブラリーのタイターは、４．５　ｘ　１０”　ｐｆｕ／ｍ ｌであった。

＋１１１００に対する抗血清によるオーストラリアλ９ｔ１１のスクリーニング 下記の方法に従ってＳＤＳ中で電気泳動した後、ポリアクリルアミドから電気溶 出したＨ１１０Ｄタンパク質（英国起源）をヒツジに注射することにより、抗血 清を得た。即ち、Ｗｏ　８Ｂ１００８３５およびＷＯ９０／１１０８６に記載の ようにして調製したＣｏｎＡ　ＨｌｉｏＤをＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で 電気泳動してｆＬａｅｍｍｌｉ１９７０）　、電気溶出Ｈ１１０Ｄを得た。電気 泳動の後、ＨｌｌＯＤを含有するポリアクリルアミドゲルの部分を切除し、電気 溶出器（Ａｔｔｏ）に載置し、１０ワツトで３時間溶出を行った。電気溶出され た）＋１１０Ｄ　ｔＨｌｌｏＤＥと命名）をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　１０（Ａｍ １ｃｏｎ　ｌ上で１１縮し、ＰＤＩＯカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で５０　 ｍＭ重炭酸アンモニウム１０．０７％　５０５に緩衝液交換し、アジュバントと 混合し、次いでヒツジに注射した。血清からの免疫グロブリンを硫酸アンモニウ ムで沈澱させた（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ　ａｎｄ　ＴｈｏｒｐｅＨ１９８２１。沈 澱した抗体をリン酸塩緩衝生理食塩水中で６０　ｍｇ／ｍｌに再懸濁し、リン酸 塩緩衝生理食塩水に対して透析し、５％ｗ／ｖの低脂肪粉乳を含有するトリス緩 衝生理食塩水ｆＴＢｓｌ中で１＝１０に希釈した。１０　ｍｇのＣｏｎＡ　Ｈｌ ｌｏＤは０．５１のＳＤＳとなり、１００℃に３分間加熱し、ニトロセルロース フィルター上で乾燥した。０．２％　ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ　２０および０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有するＴＢ！９　（ＴＢＳＴＴＩで洗浄した後、 フィルターをＦＩＩＩＯＤＥに対する抗体とともに、室温で１〜２時間インキュ ベートした。ＴＢＳＴＩでフィルターを２時間洗浄した後、結合した抗体を３ｍ ｌの０．１Ｍグリシン、０．１５　Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ２，６で２分間溶出し、直 後に７５μｍの１．５ＭトリスｐＨ８，０を加えることにより中性ｐＨに調節し た。これらのアフィニティー精製された抗体（抗−ＨｌｌｏＤＥと命名）を、上 記のようにして用いて、５ｘ１０“ｐｆｕのオーストラリアλｇｔｌｌ　ｃＤＮ Ａライブラリーをスクリーニングした。

オーストラリア産へモンカスコントルトゥスに由来するλ９ｔ１１ライブラリー からの５　ｘ　１０’の組換え体を免疫スクリーニングし、３つの陽性を採取し た。

更にスクリーニングした後、これら組換え体の２つは、なお陽性であり、ＢＡＡ およびＢ２と命名した。

ＢＩＡおよびＢ２クローンのＤＮＡ配列作成２つのクローンをＥｃｏＲ工で消化 し、ＢＡＡについては約５００ｂｐの単一挿入物が得うレ、Ｂ２については３つ のフラグメント、Ｂ２Ａ　（約４００ｂｐｌ、８２Ｂ　（約１００ｂｐ）および Ｂ２Ｃ（約１００ｂｐ）が得られた。これらをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ）［ −ｆＳｔｒａｔａｇｅｎｅ　ｌ中にサブクローン化し、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　２ ．０キツト（υｎ１ｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）を用い て配列作成した。

クローンＭ１およびＢＩＡの発現 Ｍｌ　（ＳＥＱ工ｏＮｏ＋１）およびＢＩＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋　２およ び３）の挿入物を、ｐＧＥＸベクター（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ　 １９Ｂ８１を用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ中で発現させた。

虫）グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ−末端においてタン パク質を発現する。ＭｌおよびＢＡＡ　ＥｃｏＲ工挿入物をＥＣＯＲニー切断物 のホスファターゼ処理ＰＧＥＸ１に連結し、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　 １９８２に記載の方法に従ってＥ、ｃｏｌｉ株ＪＭＩＯＩ中に形質転換した。８ つの子孫を各々の形質転換物から採取し、２ｍｌの培養物を３７°Ｃで６時間成 長させた。融合タンパク質合成を誘導するためにＩＰ％を加え、−晩インキュベ ーションを継続した。遠心により細胞を回収し、サンプル緩衝液（Ｌａｅｍｍｌ ｉ、　１９７４）中で沸騰させて分離し、抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　ｔ：より 分析し、また、５ＤＳ−変性ＨＩＩＯＤダブＬ／−／ト（抗−ＨｌｌｏＤＥ　、 上記参照）に対して特異的なアフィニティー精製ヒツジ抗体を用いたウェスタン プロット法に°より分析した。アルカリ性ホスファターゼに接合したウサギ抗− ヒッジ１９Ｇアルカリ性ホスファターゼ接合体を用い、次いで５−ブロモ−４− クロロ−３−インドリルホスファターゼ（ＢＣＩＰＩおよびニトロブルーテトラ ゾリウム（ＮＢＴ）により発色させることにより、結合抗体を検出した。上記の ようにして免疫陽性クローンの培養物を成長させ、誘導し、音波処理により分離 した。音波処理物を、遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−２Ｂ遠心機、Ｈ８４０−タ ー、７０００　ｒｐｍ、　３０分、４”Ｃ）により可溶性フラクションと不溶性 フラクションとに分離した。不溶性ペレットを、音波処理により８Ｍ尿素に再懸 濁し、フラクションのサンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した。融合タンパ ク質は、不溶性の挿入体フラクション中に存在することが見出された。これらの 調製物の各々を用いて、フロインドアジュバント中で、１用量当たり１５０μ９ の融合タンパク質量で３回、２頭のヒツジにワクチン注射した。陽性コントロー ルのヒツジを、天然ＣｏｎＡ　Ｈ１１０Ｄタンパク質で免疫し、陰性フントロー ルのヒツジを、ヘモンカス挿入物を含まないｐＧＥＸベクターを含有するＥ、ｃ ｏｌｉからの可溶化タンパク質で免疫した。ワクチン注射したヒツジからの血清 をウェスタンプロット法でＨＩＩＯＤに対して分析した。

ＭｌおよびＢＩＡ挿入物とのＤＮＡハイブリダイゼーションにょるオーストラリ アλＺＡＰライブラリーのスクリーニングＭ１およびＢＩＡプラスミドＤＮＡ　 （ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中でクローン化した）をＥｃｏＲ工で消化し、挿入物 を、１％アガロースゲル中のＴＢＥ　ＴＴｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴｊＢ　 ８９　ｍＭ　ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ　、　８９　ｍＭホウ酸、Ｚ　ｍＭ　ＥＤ ＴＡ　、　ｐＨ約８．３）緩衝液中での電気泳動により単離し、次いでＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮキットを用いて精製した。単離と精製を繰り返し、許容できないレベ ルのバックグラウンドの原因となる、λＺＡＰ配列とハイブリッド化することの あるプラスミドＤＭ配列がプローブに夾雑するのを防止した。Ｐｒｏｍｅｇａ　 Ｂｉｏｔｅｃｈから入手したＮ１ｃｋ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎキットを製造者 の指示に従って用いて、精製された挿入ＤＮＡをα−”　Ｐ−ｄｃＴＰで標識し た。スピンカラムクロマトグラフィー　（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８２）により、標識されたＤＮＡを導入されなかった標識から分離した。λ ＺＡＰライブラリーの１３５Ｍプレート８つを、１０’　ｐｆｕ　／プレートに プレートし、ニトロセルロースフィルター上へのプラークリフトを行った（Ｍａ ｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２）。真空オーブン中で８０℃で２時間 ベークした後、フィルターを２時間予備ハイブリッド化し、次いで４２℃で一晩 ハイブリッド化した（サザンプロット分析法の部で後述するとおり）。４つのフ ィルターを阻プローブでスクリーニングし、４つをＢＩＡプローブでスクリーニ ングした。これらのフィルターを、０．５％　ＳＤＳを含有する２　Ｘ　ＳＳＣ 中で５０℃にて２度洗浄し、０．５％ＳＤＳを含有する１ｘ　８１；Ｃ中で１度 洗浄し、０．５％ＳＤＳを含有する０、５　ｘ　ＳＳＣ中で１度洗浄し、オート ラジオグラフィーを行った。可能性のある陽性プラークを採取し、プローブで再 クリーニングした。確認された陽性（Ｍｌとハイブリッド化するクローンについ てはＭＩＡＵＳと命名し、ＢＡＡとハイブリッド化するクローンについてはＡｕ ８ｔＢ１と命名した）から、高タイターのファージストックを調製し、ＢＢ４を ホストＥ、ｃｏｌｉ株として用い、λＺＡＰ製造者の指示マニュアル（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ　）に従って、これらのクローンをｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ中に保 存した。得られた子孫のプラスミドＤＮＡのミニ調製物を、アルカリ性溶解（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２１により調製し、ＥｃｏＲ工で消化 した。アガロースゲル電気泳動により、消化物を分析した。

ＭＡＵＳ挿入物の配列作成 Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２ ．Ｏ５ｅｑｕｅｎａｓｅキツトを製造者の指示に従って用い、精製ｐＢＬＵＥ！ ９ＣＲ工ＰＴプラスミドＤＮＡにおいて、ＤＮＡ配列作成を行った。第１配列作 成反応では、ベクター配列の末端からのプライマーを用いて反応を開始した。こ れらの反応から得られた配列データをプライマーの第２対の設計に用い、これら 第２プライマーを用いて得られたデータから、第３対を設計した。このようにし て、５′末端および３′末端の両方から”沿って歩かせる（ｗａｌｋｉｎｇ　ａ ｌｏｎｇｌ”ことによって、ＤＮＡ配列を作成した。

Ａｕ５ｔ阻挿入物の配列作成 これは、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　２．ＯＴ７ボリメラーゼｆＵｓＢ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌｓｌを用いて、ＭＩＡＵＳ挿入物の配列作成について記載したように して行った。

ポリメラーゼ連鎖反応 ＣＤＮＡの調製 ＯＫ成体嬬畑土ついて記載したようにして調製した１１日令の後感染　Ｈ，コン トルトラスからのｍＲＮＡ　ｆｌμ９）を、ジエチルピロカーボネート　（ＤＥ ＰＣ）で処理した水中で、’ｆ１７アダプターーブライマー＋５　’　ＧＡＣＴ ＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡ　３　’　）と混合し、次イテ６５℃で５分間加 熱し、直ちに氷上に置いた。メチル水銀ヒドロキシドを最終濃度２８．６　ｎ＋ Ｈに添加し、混合物を室温で３分間インキュベートした。２−メルカプトエタノ ールを最終濃度１４．２　ｍＭに添加し、混合物を氷上に置いた。ｃＤＮＡを合 成するために、ＲＮＡ５ｅ　Ｇｕａｒｄ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａｌを１単位／μ ｍまで、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ緩衝液ｆＬｉｆｅ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓｌを１倍濃度まで、ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰＳｄＣＴＰおよびｄＴ’ ｒＰを各々ｌＩｎＭまで、そしてＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ ｔａｓｅ　（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ＋を２単位／μｍまで加えた（全て最 終濃度で与えられる）。反応混合物を４１°Ｃで７５分間インキュベートし、次 いでフェノールおよびクロロホルムで抽出し、スパンカラムクロマトグラフィー ＋Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　１９８２１で精製した。精製反応混合物を ２．５倍に希釈し、４℃で保存した。

ＭＩＡ［＋８−特異的プライマーを用いたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅Ｐｒｏｇｒａｎ ｖｎａｂｌｅ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　（Ｍ、Ｊ、　Ｒａ５ｅａｒｃｈ 　ｒｎｃ、ｌを用いてＰＣＲ反応を行った。反応混合物は、１００μｍの反応容 積において、上記のようにして調製した希釈ｃＤＮＡ　２５０μｌの１μ１１第 １ストランドＴ１７−アダプタープライマー２５　ｐｍｏｌ、第２ストランド増 幅プライｖ　−２５ｐｍｏｌ　（ＭＩＡＵＳ配列（ＳＥＱよりＮＯ＋５）ノ位置 ８６５−８８４　（５’　ＡＣＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＴ　３’ ｌ　ｊ、ｍ基づくもの、または位置３０−４９　（５’　ＧＣＴＧＡＡＴＣＴＡ ＡＣｒＣＣＡＡＴＣＣ３’　）に基づくものの何れか）　、１　ｘ　Ｔａｑ緩衝 液ｆＮｏｒｔｈｕｍｂｒｉａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ）および各々０ ．５　ｍＭのｄＡＴＰ　５ｄＴＴＰ。

ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを含有しており、蒸発を防止するために鉱物油４０μｍ で覆った。次いでこの混合物を、熱サイクル基中で９５℃に２分間加熱し、７２ ℃で保持した。７２℃の間に２単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒ ｉａ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓＬｔｄ　ｌを加え、他の反応関与体と緩やかに混 合した。次いで、熱サイクル基中で下記のプログラムを行った。

ステップ１５０℃で５分間アニール ステップ２７２℃で４０分間エクステントステップ３９４℃で４０秒間変性 ステップ４５０℃で２分間アニール ステップ５７２℃で３分間エクステントステップ６　ステップ３〜５を３９サイ クルステツプ７７２℃で１５分間最終エクステンションステップ８４℃で保持 これらの条件は、Ｆｒｏｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８８１から確立され た。

ＰＯ生成物のクローニング 上記反応からのＰＯ生成物をアガロースゲル中での電気泳動により分離した。

約２．５および３．５ｋｂのＤＮＡバンドを、ガラス繊維（Ｗｈａｔｍａｎ　ｌ 　上に電気溶出し、フェノール抽出およびＧ５０クロマトグラフイー（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ　）により精製した　（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８ ９）。精製ＤＮＡを、ｐＴ７Ｂ１ｕｅ　Ｔ−ベクター＋Ｎｏｖａｇｅｎｅｌ中に 製造者の指示に従って連結した。

２．５　ｋｂおよび３．５　ｋｂ　ＰＣＲ生成物の配列作成ＭＩＡＵＳの配列作 成の項で記載した″ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ七ｉｄｅ　ｗａｌｋｉｎｇ”技術を 用い、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　２．０キツト　（υＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｌを用いてＤＮＡ　配列作成を行った。

５′末端のためのポリメラーゼ連鎖反応第１ストランドｃＤＮＡの調製 成虫について記載したようにして調製した１１日令の感染後ＵＫへモンカスコン トルウスからのｍＲｊＭ　Ｉ　Ｌｔ　９を、Ａｕ５ｔＢ１．２．５ｋｂＰＣＲお よび３　、５ｋｂＰＣＲ生成物（それぞれＳＥＱよりＮ０１６．７および８）内 の保存された領域から設計された特定のプライマー（５′品ＩＧＡＡＡＧＣＧＧ ＡＴＧＧＣＴＴＧＡＩＧＣ３’　ｌと混合した。この混合物を６５°Ｃに５分間 加熱し、氷上に置き、メチル水銀ヒドロキシドを最終濃度が２８．６　ｍＭにな るまで加えた。この混合物を室温で５分間インキュベートし、次いで２−メルカ プトエタノールを最終濃度が１４．２　ｍＭになるまで加え、混合物を氷上に置 いた。５’　ＲＡＣＥシステム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬＩからの試薬を、最終濃度 ２０ｍＭ　Ｔｒｉｍ／ＨＣＩ　ｐＨ８，４，５０ｍＭ　ＫＣＩ　、２．５　Ｍ　 ＭｑＣｌ、　、１００　μｑ／ｍｌ　ＢＳＡ、　０．５　ｍＭのｄＡＴＰ　５ｄ ＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰにおいて用いて、第１ストランドＤＮＡを調製 し、２００単位の５ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉ ｐｔａｓｅ　を加え、反応混合物を４２℃で３０分間インキュベートし、次いで ５５℃で５分間加熱した。ＲＮＡ５ｅ　Ｈを最終濃度が１００単位／ｍｌになる まで加え、反応混合物を５５℃で１０分間インキュベートし、次いで氷上に置い た。ＣＤＮＡをＧｌａｓｓｍａｘスピンカラム（ＧｉｂＣＯ／ＢＲＬ　ｌに通し て精製し、−２０°Ｃで保存した。

ｃＤＮＡのＣ−テーリング 第１ストランドｃＤＮＡの１１５を７０°Ｃで５分間加熱し、次いで１分間氷冷 した。Ｓ’　ＲＡＣＥシステム（ＧｉｂｃｏノＢＲＬ　ｌからの試薬を、最終濃 度１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ８，４，２５ｍＭ　ＫＣＩ　、１．２５　 ｍＭ　ＭｇＣｌ、５０℃ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、　０．２　ｍＭ　ｄＣＴＰまで添加 した。

５００単位／ｍｌのターミナルトランスフェラーゼを加え、反応混合物を３７℃ で１０分間インキュベートし、次いで７０℃で１５分間加熱し、氷上で保存した 。

Ａｕ５ｔＢ１．２．５ｋｂＰＣＲおよび３　、５）ｃｂＰＣＲに特異的なプライ マーを用いたＰＯの増幅 ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　（Ｍ、Ｊ、　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ工ｎｃ、ｌ中で、ＰＣＢ反応を行った。３′末端に、３つのプライ マーの中の１つを用いた。

１、位置３７４〜３９４　（５’　ＴＧＩＴＧＴＧＧＣＴＡＡｆｆｒＣＧＴＣＣ Ａ　３’　）　１ｍ基づ（２，５ｋｂＰＣＲ生成物に対して特異的なプライマー 。

２、位置１２１０〜１２２９　（５’　ＣＡＴＣＴＴＩＡＧ’Ｉ’ｒＡＴＣＴＧ ＡＣＣＡＧ　３’　）　１．ｎ基づ＜、３．５　ｋｂ　ＰＣq 生成物に対して特異的なプライマー。

３、位置３５７〜３７７　（５’　ＧＡＣＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＧ Ｇ　３’　ｌに基づ（ＣＤＮＡクローンＡｕ５ｔＢ１に対して特異的なプライマ ー。

これらの反応の５′末端のために、共通の゛アンカープライマー（Ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ）’　＋５’ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＧＧＣＣＡα；ＣＧＴＣＧ ＡＣ１’ＡＧＴＡＣＧＧＧＩ工αＣＸＸα℃エエＧ３’）をpいた。

各反応混合物は、最終容積１００μｌに、Ｃ−テイルしたｃＤＮＡ　５０ｕｌの ４μｍ、適切な２つのプライマー２５　ｐＭｏｌ、　Ｌ　ｘ　Ｔａｑポリメラー ゼ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍｌおよび各々　０．５關の ｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰを含有していた。この混合物 を５０μｌの鉱油で覆い、サイクル話中で９５°Ｃに２分間加熱した。反応混合 物を８０°Ｃに保持し、０．６単位のＴａｑポリメラーゼを加え、次いで下記の プログラムを行った。

ステップ１５０℃で５分間アニール ステップ２７２℃で１０分間エクステントステップ３９４℃で４５秒間変性 ステップ４５０℃で１分間アニール ステップ５７２℃で２．５分間エクステントステップ６　ステップ３〜５を３９ サイクルステツプ７７２℃で１５分間エクステントステップ８４℃で保持 ５′ＰＯ生成物のクローニング ＰＣＲ生成物をアガロースゲル上での電気泳動により分離し、予想されるサイズ 、約１３　ｋｂのバンドを切除し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮキットを用いてＤＮＡを 精製し、ＰＴ７Ｂ１ｕｅ　Ｔ−ベクターｆＮｏｖａｇｅｎｅ　ｌ内に製造者の指 示に従って連結した。

ＡＵＳＴＢｌの３゛末端を製造するためのポリメラーゼ鎮フラクション使用した 第１ストランドｃＤＮＡは、ＭＩＡＵＳプライマーとともに用いるためのＣＤＮ Ａの製造について記載したのと同じであった。Ａｕ５ｔＢｌ　（ＳＥＱ工ｐＮｏ ：６）内の１４１４〜１４３５の特異的プライマー（５’　ＴＣＴＴＧＡＡＧＡ ＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＴＴ　３’ｌを、ＭＩＡｔｌＳ　ＰＣＲのために用いた Ｔ１７アダプタープライマーとともに使用し、熱サイクラ−（Ｍ、、］、　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ工ｎｅ、）中で反応を行った。反応混合物は、１００μｍ中に、２ ５９Ｍ０Ｉの各プライマー、２μｍのｃＤＮＡ　１１　Ｘ　Ｔａｇポリメラーゼ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、０．５關のｄＡＴＰ　、　ｄＣ ＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなっていた。これらを５０μｍの鉱油でカ バーし、９５℃に２分間加熱した。０．６μｌのＴａｇポリメラーゼを加え、同 じプログラムサイクルを、前記の５゛末端ＰＣＲと同様に行った。

３゛生成物のクローニングおよび配列作成ＰＯの生成物を、アガロースゲル中で の電気泳動により分離し、予想されるサイズ、１．３　ｋｂのバンドを切り離し 、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮキットを用いてＤＮＡを精製し、ＰＣＲ−５ｃｒｉｐｔ　 （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｌ内に、製造業者の指示に従って連結した。

クローン化ＰＯ生成物の配列作成 ＰＣＲクローンからのＤＮＡを、５ｅｑｕａｎａｓｅ　２．０キツト　（Ｕｎｉ ｔｅｄ　ＳｔａｔｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　）を用い、製造業者が指示したよ うにして配列作成した。オリゴヌクレオチドブライマーを用いて、５′末端およ び３°末端の両方からのクローンのＤＮＡに”沿って歩かせた”。

全てのＤＮＡ　配列の分析 α：Ｇ　（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ）配列分析ソフト ウェアパッケージ、ＤｅＶｅｒｅｕＸｅｔ　ａｌ、、　１９８４を用いて、配列 を分析した。

ノーザンおよびサザンプロット分析 ノーザンプロットの調製 ノーサンプロット法は、実質的に、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８ ２）に記載されたようにして、ホルムアルデヒドゲル中で行った。＋ｕＲＮＡサ ンプル（１１日令、１５日令および２３日令の成虫Ｈ，コントルウスから）を、 ＜ｐｓ緩衡液（２０ｍＭ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、ｐＨ７， ０，８ｍＭ　酢酸ナトリウム、１關ＥＤＴＡＩ　中の１７．５　％　ｖ／ｖホル ムアルデヒドおよび５０　％　ｖ／ｖホルムアミドを用いて、６５℃で１５分間 処理し、氷上で冷却した。ゲルをＭＯＰＳ緩衝液中で電気泳動し、Ｓａ＋ｎｂｒ ｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８９）に記載されたようにして、キャピラリー トランスファーによりＤｕｒａｌＯｎ膜上にプロットした。

サザンプロットの調製 液体窒素中でスナップ凍結された２９の成虫へモンカスコントルウスを、液体窒 素中で微粉末に磨砕した。この粉末を、２５ｍ１のリジン緩衝液（０，０５ＭＴ ｒｉｓ−ＭＣＩ、　ｐＨａ、　０．Ｉ　Ｍ　ＥＤＴＡ、　１　ｔ　ｗ／ｖ　５ａ ｒｋｏｓｙｌ、　ｏ、ｏｓ　ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ））に徐々に加え、６５℃で２時間インキュベートした 。

次いでこの懸濁液を、クロロホルムを加えたフェノール１容積で２回、クロロホ ルム２容積で２回抽出し、エタノールで沈澱させた。沈澱したゲノムＤＮＡを、 ２０ｍ１のＴｒｉｓ、　ＥＤＴＡ緩衝液ｆＴＥ、　ｐＨ８１中にロッキングテー ブル上で４℃にて一昼夜再懸濁し、次いで１リツトルのＴＥに対して２回変えて 透析した。最終濃度２０　μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅを含まないＲＮａ８ｅ　Ａ　 ＴｙＰｅｌ　（Ｓｉｇｍａ）とともに、３７℃で１時間インキュベートした後、 前記のようにフェノール−クロロホルムで１回抽出し、クロロホルムで１回抽出 し、エタノールで沈澱させた。沈澱したゲノムＤＮＡペレットを、７０％Ｖ／Ｖ エタノールで２回洗浄し、前記のように１ｍｌのＴＥ中に再Ｗ！濁した。

ゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲ工または）ＩｉｎｄｌＩ工（各消化物中２５μ９のＤ ＮＡ）で、３７℃にて一昼夜消化し、Ｔｒｉｓ−アセテート緩衝液中のｌ　％　 ｗ／ｖアガロースゲル上で、トラック当たり５μｍで電気泳動した。ゲルを、Ｍ ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２１に記載されたようにして、キャピ ラリートランスファーにより、）Ｉｙｄｒｏｎ−Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎ ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ＋上にサザンプロットした。製造業者の推奨に従って、 紫外線を用いてＤＮＡを膜上に固定した。

プローブの調製 ＭＩＡｔｌＳ　、　ＢＩＡまたはＡｕ５ｔＢ１挿入物を含有するｐＢＬＩＪＥｓ ｃＲ工阿プラスミドを、Ｅｃｏ１’ｌｌで消化した。３．５ｋｂＰＣＲ生成物挿 入物を含有するｐ７７Ｂ１ｕｅプラスミドを、ＢａｍＨｌで消化し、２．５ｋｂ ＰＣＲ生成物挿入物を含有するｐＴ７Ｂ１ｕｅプラスミドを、ＢａｍＨｌおよび Ｘｂａｌで消化した。消化物を電気泳動し、挿入物を回収し、前記のようにして λＺＡＰライブラリーをスクリーニングしながら、ｎ１ｃｋ翻訳によりα−’　 ”　Ｐ−ｄＣＴＰで放射性標識した。

ハイブリダイゼーション条件 サザンブロソト用 膜をストリップに切り、ハイブリダイゼーション緩衝液中で前記のようにして、 ２８℃で３時間予備ハイブリッド化した。ゲノムＤＮＡサザンプロットストリッ プを前記の各プローブに、　２８°Ｃで一昼夜ハイブリッド化し、０．１　％　 ｗ／ｖ　ＳＤＳを含有する２ＸＳＳＣ（中程度の緊縮調節）中で、先ず室温（２ ４°Ｃ）で２回、次いで４２°Ｃで２回洗浄し、オートラジオグラフィー処理し た。オートラジオグラフの現像に続いて、ストリップを高度の緊縮調節ｆｏ、Ｉ 　Ｘ　ＳＳＣ、０，１％　ｗ／ｖ　ＳＤＳ、６５°Ｃ）で２回洗浄し、再びオー トラジオグラフィー処理した。

ノーザンプロット用 プローブＭｌ　、ＭｉＡＯ８およびＢＩＡ　（各々Ｓ司より■：１．５および２ ）用１１日令、１５日令および２３日令のヘモンカスコントルウスからのｍＲＮ Ａのノーザンプロットを、最初に肘挿入物で探査した。フィルターを、５×Ｄｅ ｎｈａｒｄｔ’ｓ　（０，１％　ｗ／ｖ　Ｆｉｃｏｌｌ　４００　（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）　、０．１　％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ））、０． ５　％ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）　、１０　％硫酸デキスロラン、Ｑ 、ｉ　ｍｇ／ｍｌサケ毫丸ＤＮＡおよび５０亀脱イオンホルムアミドを含有する ２Ｘ　ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣ＝　３　Ｍ　ＮａＣ１，０，３Ｍクエン酸 ナトリウム、ｐＨ７，２）の中で、４２℃にて２時間予備ハイブリッド化した。

プローブへのハイブリダイゼーションは、同じ緩衝液中で４２°Ｃにて一昼夜行 った。フィルターを、０．５　％　ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドを含有する ２ｘＳＳＣ中で３０分間２回洗浄し、０．５％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中で ３０分間２回洗浄し、２ＸＳＳＣ中で３０分間２回洗浄した。最初の洗浄は４２ °Ｃで、残りの全ての洗浄は３７℃で行った。オートラジオグラフィーの後、プ ロットを沸騰０．１　ｔ　ＳＤＳ　中での洗浄によりストリッピングし、再度オ ートラジオグラフィーしてプローブを確実に除去した。次いで同じプロットをＭ ＩＡＵＳ挿入物で探査し、洗浄してオートラジオグラフィーした。このプロット を再びストリッピングしてチェックし、透明になったとき、ＢＩＡ挿入物で探査 した。再びストリッピングした後、プロットを下記のようにして探査した。

プローブＡｕ５ｔＢ１．２．５　ｋｂおよび３．５　ｋｂ　ＰＣＲ生成物（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｋ）Ｉ　６．７および８）用 ノーザンプロットを、サザンブロットハイプリダイゼーションについて記載した ように、中程度の緊縮調節条件を用いて、Ａｕ５ｔＢ１挿入物でハイブリッド化 した。オートラジオグラフィーの後、プロットを、膜の製造業者（Ａｍｅｒｓｈ ａｍ　ｌの指示に従って、沸騰０．ｌ　ｔ　ＳＤＳ　中でストリッピングし、次 いで２．５　ｋｂ　ＰＣＲ挿入物（クローン２）で探査し、再びストリッピング し、３．５　ｋｂ　ＰＣＲ挿入物（クローン２）で探査した。

ＨＩＯＤの消化および酵素活性のアッセイｔｕｌＯＤの調製 天然ＨＩＩＯＤ　ｆＨｌｌｏＤＮｌを、ＷＯ３Ｂ１００８３５およびＷＯ９０／ １１０８６１．：記載された方法により調製した。

ＨｌｌＯＤのエラスターゼフラグメント　（Ｉｌｕｌｓ）の調製成虫へモンカス を、水冷ＰＢＳ１０．０２　％ナトリウムアジドの１０容積中でホモジナイズし 、次いで１３０００　ｒｐｍで２０分間遠心した。ペレットをＰＢＳ／アジドの １０容積中に再等濁し、再ホモジナイズし、遠心を繰り返した。ｓｏ　ｍｓ　Ｍ ＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７，４（懸濁のための容積は各０．１７　ｇの畑土につき１ ｍ１）中に再懸濁し、３７℃で３０分間余熱した後、ペレット物質をエラスター ゼ（ａＯＯμｌ／２０ｍ１懸濁液７１　ｍｇ／ｍｌ新鮮ストック溶液（ｉ　ｍＭ 　ＨＣＩ／２　ｍＭ　Ｃａ’　”中で作成））で１時間消化した。３，４−ジク ロロイソクマリンを添加して消化を中止した（ＤＭＳＯ中の１０ｍＭストック３ ００μｍ／２０　ｍｌ消化物）。混合物を１３０００　ｒｐｍで２０分間遠心し 、ペレット化材料を保留した。上澄み液を１ｏｏｏｏｏ　ｑで１時間２０分超遠 心した。得られた上澄み液をＣｏｎＡカラムにかけ、結合性フラクションを得た 。

分析するため、このフラクションを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに施し、電 気泳動によりポリビニリデンジフルオリド膜（工ｍｍｏｂｉｌｏｎ−ｐ、　Ｍｉ ｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、クーマン−ブルーで簡単に染色し、１０５　ｋｄのバ ンドを切り出し、気相アミノ酸配列分析装置で分析した。ワクチン感作研究のた めに、ＣｏｎＡ　結合性フラクションを、濃縮し、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　１２　 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲル濾過カラムにかけ、アミノペプチダーゼ活性を有す るフラクションを集めることによって、更に精製した。

ＨｌｌｏＤのサーモリシン消化 Ｈ１１０Ｄダブレットを、Ｗ０９０／１１０８６に記載されたようにして、プレ バラティブ規模の８　％　５Ｏ６−ポリアクリルアミドゲルからの電気溶離によ って精製して、ＨｌｌｏＤＥを得、また２００　ｋｄの直ぐ上を走る二量体形態 （これは５Ｏ８−ＰＡＧＥに再度かけると、１１０　ｋｄで特徴的なダブレット を生じた）の電気溶離によって精製して、ＨｌｌｏＤＥを得た。これらＨｌｌｏ ＤＥの溶液を２００μｌに濃縮し、塩化カルシウムを５１ＴＩＭまで加え、混合 物を３７°Ｃに温めた。新たに調製した１　ｍｇ／ｍｌサーモリシン溶液（１１ ＴＩＭ　ＨＣＩ、　２＋１１Ｍ　ＣａＣ１ｚ中）を、ｌμｌのＨｌｌｏＤＥ当た り０．１μｍのサーモリシンの割合で加えた。この混合物を３７℃で１２０分間 インキュベートし、次いで５μｍの０．５　Ｍ　ＥＤＴＡを添加して反応を停止 した。

タンパク質フラグメントを、１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に より分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（工ｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、　Ｍｉ ｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動的に移した。クーマツ−ブルーで染色した後、最も 強い明確なバンドを切り出し、気相アミノ酸配列分析装置で分析した。

アミノペプチダーゼＡ活性が濃縮されたＨ１１０Ｄフラクション（ＨｌｌＡ）の 調製 エラスターゼ処理後に１７０００　ｇで２０分間の遠心によって得られたペレッ ト材料（上記参照）を、ＰＢＳ中に４°Ｃで再懸濁し、遠心により再度ベレット 化し、次いでＰＢＳ／アジド中の１　％　’ｒｗｅｅｎに再懸濁し、１時間（攪 拌しながら）放置した。この懸濁液を１７，０００　ｇで２０分間遠心し、上澄 み液を除去した。ペレットを、ＰＢＳ／アジド中のｌ　％　Ｔｗｅｅｎで繰り返 し抽出した。１７，０００　ｇで２０分間遠心した後の上澄み液を合併し、１０ ０，０００　ｇで２０分間超遠心した。上澄み液をＣｏｎＡアフィニティーカラ ム（Ａｆｆｉｇｅｌ、　Ｂｉｏｒａｄｌにかけ、結合した材料を溶離し、Ｍｏｎ ｏＱカラム上でのイオン交換クロマトグラフィーにより更に分別した。

酵素活性のアッセイ ）１１１．０Ｄ調製物におけるα＝二アミノアシルペプチド水分解酵素（ミクロ ソーム）アミノペプチダーゼ活性を、Ｌ−ロイシン、メチオニン、フェニルアラ ニン、α−グルタミン酸およびリジンのＰ−ニトロアニリド（ｐＮＡｌを用いて 溶液中でアッセイすることによって特性決定した。全てのＰ−ニトロアニリド基 質（α−グルタミン酸を除く）はＳｉｇｍａ、　Ｐｏｏｌｅ、　Ｄｏｒｓｅｔ　 ＵＫから、α−グルタミン酸はＦｌｕｋａ、　Ｄｏｒｓｅｔ、　ＵＫから入手し た。ＨＩＩＯＤアミノペプチダーゼ活性に対する酵素阻害剤の効果および血清の 阻害を測定するために、それぞれ哺乳類アミノペプチダーゼ−Ｍ　（Ａｐｅ）お よび−Ａ　（ＡｐＡｌの基質として知られている単一の疏水性（ロインンーまた はフェニルアラニン−）および荷ｔ（α−グルタミン酸−）アミノ酸ｐＮＡを選 択した。

（ａｌマイクロプレートアッセイ Ｍｉｃｒｏ−ＥＬ工ＳＡプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ工ｍｍｕｌｏｎ　ｌ、　Ｖ ｉｒｇｉｎｉａ、　ｔｌｓＡｌの各ウェルに、アッセイしようとするフラクシヨ ン１−１０μｌを加えた５０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳまたはＭＯＰＳ　ｐＨ７の何れ か２５０μｍを満たした。次いでプレートを、各ウェル当たり１０μｍの２５ｍ Ｍアミノ酸Ｐ−ニトロアニリド基質の添加に先立って、３７°Ｃで１０分間予備 インキュベートした。次いでＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、時間ゼロの ４０５　ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定した後、プレートを３７°Ｃで１５− ３０分間インキュベートした。次いで最終ＯＤ読みを前記のようにして測定し、 Ｉｍｑタンパク質につき１分出たりのＯＤ変化を計算した。

（ｂ）阻害剤の感受性 酵素アッセイに用いた方法は、１　ｍｇ／ｍｌ　ＣｏｎＡ　ＨＩＩＯＤを加えた 緩衝液２５０μｍに阻害剤を添加し、基質（ロイシン−ｐＮＡまたはα−グルタ ミン酸−ｐＮＡ）の添加に先立って、３７°Ｃで１０分間予備インキュベートし た以外は、上記（ａｔに記載したとおりであった。阻害率％は、下記のように計 算した。

−Ｙ −ｘ　ｔｏｏ　＝　阻害率％ 式中、Ｘは、阻害剤を添加しない場合の酵素のΔＯＤ／ｍｉｎであり、Ｙは、阻 害剤を添加した場合の酵素のΔＯＤ／ｍｉｎである。異なる酵素群阻害を有する ９つの化合物：即ちアマスタチン（Ａｎｓａｓｔａｔｉｎ　）、ベスタチン（メ タロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ）　、１．１０−フェナントロリン、Ｅ ＤＴＡ（メタロプロテアーゼ）、ホスホラミトン（メタロプロテアーゼ、サーモ リシン、コラ−ゲナーゼ）、アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）　（セリンプ ロテアーゼ）、ペプスタチン（アスパラギン酸プロテアーゼ）　、ＰＭＳＦ　（ セリンおよびシスティンプロテアーゼ）、およびＥ６４（システィンプロテアー ゼ）を、個々に試験した。アマスタチン、ベスタチン、１．１０−フェナントロ リン、ＰＭＳＦおよびペプスタチンは、Ｓｉｇａｍａ、　Ｄｏｒｓｅｔ、　（Ｉ Ｋから入手した。他の全ての阻害剤は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ ｍから入手した。各阻害剤は、ＢＯ！！ｈｒｉｎｑｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｌｍが推 奨している最高濃度と同じか、またはそれより高い２つの濃度で使用した。

（ｃ）酵素の抗血清阻害のアッセイ このアッセイは、２つのマイクロ−ＥＬＩＳＡプレートを作った以外は、上記（ ａ）に記載したとおりであった。一方のプレートにおいて、ウェル当たり、１０ μｌのＣｏｎＡ　ＨｌｌＯＤ　（ｌ　ｍｇ／ｍｌ＋　＋　各ヒツジからの１０μ ｍの抗血清を、３７℃で１５分間予備インキュベートした。第２のプレートでは 、２５０μｍのＨＥＰＥＳ／重炭酸塩緩衝液　＋　１０μｍのフェニルアラニン −ｐＮＡ基質またはα−グルタミン酸−ｐＮＡ基質の何れかを各ウェルに入れ、 同様に３ブＣで１５分間予備インキュベートした。次いでＣｏｎＡ　Ｈｌｌｏ− 血清混合物を、第２プレートの緩衝液−基質混合物にマルチピペットで加えた。

Δ００／ｗｉｎを測定した。相関させる目的で、上記（ｂｌの式（ここで、Ｘは 、陰性コントロールヒツジ（ウマ牌臓フェリチンでワクチン接種）からの血清を 加えた酵素を含むウェルについての平均ΔＯＤ／ｒｎｉｎであり、Ｙは、酵素十 Ｈ１ｉＯＤでワクチン接種した個々のヒツジからの血清を含むウェルについての 平均ΔＯＤ／ｍｉｎである）を用いて、阻害率％を計算した。相関させる目的で （図１８）、上記（ｂｌの式（ここで、Ｘは、コントロール動物の糞１ｇ当たり の平均排出卵数、または平均畑土感染率の何れかであり、Ｙは、ＨｌｌＯＤでワ クチン接種した個々のヒツジの、実験中における１ｇ当たりの平均排出卵数ｉ 組織化学による酵素活性の極在化 成虫へモンカスコントルトゥスの１０μｍのクリオスタット切片において、基質 としてＬ−ロイシン−４−メトキシ−β−ナフチルアミドおよびＬ−グルタミン 酸−α−４−メトキシ−β−ナフチルアミドを用い、Ｎａｃｈｌａｓ　ａｔ　ａ ｌ、　（１９５７＋、ＮａＪｃａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７４）　およびＬ ｏｊｄａ　ｅｔ　ａｌ、　＋１９８０１　の方法により、アミノペプチダーゼ活 性が実証された。

真核性バクロウィルス−昆虫細胞系における組換えｆｌｌｌｏｏの発現発現プラ スミドの構成 前記の３．５　ＰＣＲフラグメントを、オリゴｄＴアダプター（これは５ａｌ１ 部位を含んでいた）とオリゴ８７２（これはＭＩＡＵＳ　配列において塩基番号 ３０−４９を示す）との間で増幅し、ｐＴ７Ｂｌｕａベクター内にクローン化し た。クローンｐＴ３゜５−２は、ベクターポリリンカーＢａＪｌｌＨ工部位の５ ′末端から、かつＨｉｎｄエエエ、ＸｂａｌおよびＳａｌ工部位の３°末端から 開始する。５“末端の配列は、下記のとおりである。

虐ｗＨＴ　”　！　−−−−−Ｏｆ　ｉｇｏ　８７２−−−−−一−−−−−！ 　−−３、５に−−−−−５’　ＣＧ　ＡＴＣＣＧＡ　ＴＴＣＣＴＧ　ＡＡＴ　 ＣＴＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＡＴＣＣ、、、、、、，３’しｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ 　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　、、、、、、、、。

星印は、ｐ７７　Ｂｌｕｅベクター内のクローニングに用いた３’　ｄＴ／ｄＡ を示す。

３．５　ＰＣＲクローン２をＨｉｎｄＩ工１　（３，５Ｋ遺伝子の３′末端にお けるベクターポリリンカー配列中の単一部位）で消化し、Ｍａｎｉ社ｉｓ　ｅｔ 　ａｌ　（１９８２）に従って、末端を、ＤＮＡポリメラーゼＸ　（Ｋｌｅｎｏ ｗフラグメント）を用いてデオキシヌクレオチドで埋めた。ＢａｍＨＩリンカ− （５’　ＣＧＧＡＴＣＣＧ　３’、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇ　ｎｏ、　１０２１）　、プラント末端に連結し、完全長さのＨ ｌｌｏＤ　遺伝子配列がＢａｍＨエフラグメントとして切り離されるのを可能に する、過剰のＢａｍ）ＩＸ部位を有するクローンを選別した。ＢａｍＨエフラグ メントを、トリス−アセテート緩衝液液中の０．６％　ｗ／ｖアガロースゲル上 での電気泳動、これに続（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（Ｂ工０１０１１を用いる精製に よって単離し、この操作を２回繰り返した。次いで精製フラグメントを、Ｂａｍ ＨＩ−切断物のホスファターゼ処理ｐＢｌｕｅＢａｃ　ＸＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ ｅｎ　Ｃａｒｐ、　）に連結し、フラグメントを正しい方向（即ち、バクロウィ ルスポリヘトリンプロモーターの制御下に置かれた３、５　ＰＣＲクローン２の ５゛末端の方向）に担うクローンを、Ｎｈｅ工およびＸｂａｌで消化することに より決定した。得られたプラスミドをＢａｍＨＸで部分的に消化し、末端を前記 のようにして埋めた。ＡＴＧ　（５’　ＣＣＣＡＴＧ　ＧＧ　３’　７　Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｃａｔａｌｏｇ　ｎｏ。

１０４０１を含有するＮＣＯニリンカーを加え、混合物を連結した。３．５　Ｐ ＣＲクローン２の５°末端ＢａｍＨ工部位（３°部位でない）で連結したリンカ −を含むクローンを、ＮＣＯ工での消化により決定した。ｐＢ８３．５−２（Ｎ ｌと命名された得られたプラスミドは、図１９に示されている。

この構成の結果、フレーム内ＡＴＧが、３．５　ＰＣＲクローン２挿入物の５＋ 末端に挿入され、翻訳が開始される。この開始ＡＴＧを取り巻く配列は、下記の とおりである。

ＢａｍＨＩ−−Ｎｃｏｌｌｉｎｋ−ｉ１ｇ＋ＨＩ−−−−＊！−−−−−ｏＬｉ ｇｏ８７２−−−−−一−＋７＋＋５’ＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＧ　ＧｃＧ　ＡＴ ＣＣＧＡ　ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＣＴＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＡＴＣＣ０ Ｍｅｃ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ａｒｑ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　 Ｐｒｏ　ＩＩｓ発現されるタンパク質は、対応するＨＩＩＯＤ配列のアミノ酸２ −９を欠如しており、ＡＴＧの直後にリンカ−配列の３つのアミノ酸を有するで あろう。

Ｈ１１０Ｄ配列を含有する組換えバクロウィルスの生成線状オートグラフィ力カ リフォルニカ　（Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角 体分解ウィルス（ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ；　 ＡＣＮＰＶ）　ＤＮＡおよび陽イオン性リボゾーム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃ ｏｒｐ、　）ランスフェクションモジュール）を用い、製造業者の指示に従って 、プラスミドｐＢ８３．５−２　（Ｎｌを、スボドブテラフルギベルダ（肛９） 細胞（工ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐから入手可能）中にトランスフェクトし た。ウシ胎児血清（Ｃ８Ｌ　Ｌｔｄｉ　５６℃で４５分間熱失活）および抗生物 質（ペニシリン／ストレプトマイシン、ゲンタマイシン；　Ｃ８Ｌ　Ｌｔ、ｄ） を補充したＴＣ−１００培地（Ｓ工ＧＭＡ）　中で細胞を培養した。３．５ＰＣ Ｒクロ一ン２配列の３°末端に挿入されたＡＴＧを有するｐＢ８３．５−２　（ Ｎ）を用いて、コントロールトランスフェクションも行った。Ｘ−ｇａｌをアガ ロース上層内に推奨濃度で含有させることにより、ｐＢｌｕｅＢａｃ　ＩＩベク ターがＬ玉旦β−ガラクトシダーゼ（β−９３１）をもコードすることに基づい て、組換えプラークを選別した。青色プラークの選別物を採り、更に２回のプラ ーク精製を行った。この時点の後、感染単一層は、野生型ウィルス（これは、核 ポリへドロンの存在によって証明される）が夾雑しているという証拠を示さなか った。精製されたウィルスを、３．５−２−Ｐ２Ａ　、−Ｐ３ＡおよびＰ３Ａと 命名し、使用する前に、照９細胞の２回の逐次的感染によって増幅させた。コン トロールトランスフェクションから精製されたプラークは、３．５−２−ｒｅｖ と命名した。

組換えバクロウィルスに感染させた昆虫細胞におけるＨ１１０Ｄ発現の評価肪９ 細胞（２５ｃｍ’ボトル中ｌＸｌ０’　細胞）の単一層を、３．５−２ウイルス 、野生型（畦）ウィルス、β−ｇａｌを発現するコントロールウィルスに感染さ せるか、あるいは感染させなかった。２６℃で４日間生育させた後、穏やかな振 盪により単一層を離し、遠心（２０００ｒｐｍ　、１０分間）により細胞を回収 し、細胞ペレットを、３サイクルの凍結−融解により分離した。これらの溶解物 を、５００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、２５μｍのアリコートを、マイクロウェ ルアッセイによりＡｐＭ活性についてアッセイした。

上記の溶解物の１５μｍのアリコート（３Ｘ１０＋　細胞と等価）を、変性７． ５％　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動処理した。次いで１つのゲ ルをウェスタンプロット処理し、このプロットを抗−ＨｌｌＯＤＮで探査した（ 先に記載されたとおり）。

クローン阻におけるアフィニティー精製抗体の分析５つの抗体陽性クローンの各 々に対して特異的なアフィニティー精製抗体を調製し、ＨｌｌｏＤに富んだ抽出 物のウェスタンプロットを探査するために用いた。図８に示すように、５つのク ローン全ては、ＨＩＩＯＤダブレットを認識するように見えた。しかしながら、 クローンＭ１との反応は、λ９ｔ１１陰性コントロールプロット（図８ｅ）と較 べて最も強いシグナルを与えた（図８ｄ）。従って、このクローンを更に調査し た。

クローン凪でのノーザンプロット分析 Ｍ１挿入物で探査したヘモンカスコントルトゥス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏ ｎｔｏｒｔｕｓ、捻転毛様線虫）　ｍＲＮＡのノーザンプロット分析は、図９に 示されている。単一のｍ１ｔＮＡバンドが、約３．５　ｋｂで認められた。これ は約１１０　ｋｄのタンパク質のためにコードするのに充分である。

クローンＭ１の配列分析 ＥｃｏＲｌでのＤＮＡの制限消化物の分析は、Ｍ１挿入物が約３００　ｂｐであ ることを示した。Ｍ１フラグメントのＤＮＡ配列を決定した（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏｔ　１１゜これは図３に示されている。このフラグメントは、塩基番号３で始 まるオープンリーディングフレームを有する２９５ｂｐから構成されている。

クローンＢＩＡでのノーザンプロット分析ＢＩＡ挿入物で探査したヘモンクスコ ントルトウスｍＲＮＡのノーザンプロット分析は、図９０に示されている。Ｍｌ については、単一のｍＲＮＡバンドが約３．５ｋｂで認められた。

クローンＢｉＡおよびＢ２の配列作成 りＩＡのクローンの配列を作成した（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　２および３）。完 全な配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　２）は、）＋１１−１　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏｔ　１９１およびＡｕ５ｔＢ１　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　６）に並べて、図 ５に示されている。この挿入物は４８４　ｂｐであり、最初の塩基からの完全な ＯＲＦを有する。ＥＣ０Ｒ１での消化に由来するＢ２の３つのフラグメントの配 列を作成した。Ｂ２の完全な配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　４）は５８１　ｂｐ である。これはＨｌｌ−２に並べて、図４に示されている。この配列は位置３〜 ２１３　ｂｐのＯＲＦを有し、停止コドンおよび非翻訳領域は２．５　ｋｂ　Ｐ ＣＲ生成物の配列（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ：　７１のものに釣り合っている。

Ｅ、ｃｏｌｉ　におけるＭｌおよびＢＬＡの発現ＧＳＴ発現ヘクター内にサブク ローニングすると、Ｍｌについては３Ｂ−４０ｋｄの融合タンパク質、およびＢ ＡＡについては４５　ｋｄの融合タンパク質を発現するクローンが得られた。こ れらは、グルタチオン−９−トランスフェラーゼの分子量を考廖すると、これら の挿入物について予想したサイズと一致している。両方の融合タンパク質は、ウ ェスタンプロットにおいて、ＨＩＩＯＤに対するアフィニティーｌ製抗体と非常 に強く反応した（図１１）。これらの融合タンパク質は不溶性封入体として発現 された。

Ｍｌ−ＧＳＴおよびＢＩＡ−ＧＳＴ融合融合タンパクワクチン接種したヒツジに おける抗体応答 前記の融合タンパク質を注射したヒツジからの抗血清を、ウェスタンプロット法 でＨＩＩＯＤ調製物に対して試験した。ＧＳＴ−ＭｌおよびＧＳＴ−ＢＩＡの両 方が、ＨＩＩＯＤダブレットを特異的に認識する抗体を産生させた（図１２）。

陰性コントロールヒツジからの血清は、ＨＩＩＯＤダブレットを認識しなかった 。

ＭｌまたはＢｉＡ　挿入ＤＮＡでのハイブリッド化により選択したクローンの単 離および特性決定 Ｍ１プローブとハイブリッド化することが確認された陽性クローンは、ＭｉＡＵ Ｓ（ＳＥＱよりＮＯ＋５１と命名され、ＢＩＡとハイブリッド化することが確認 された陽性クローンは、Ａｕ５ｔＢ１　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　６）と命名さ れた。ＥｃｏＲＩでの精製プラスミドＤＮＡ　の制限消化は、ＭＩＡＵＧでは約 ９００　ｂｐ　５ＡｕｓｔＢｉでは約１．６　ｋｂの挿入サイズを示した。図９ ｂｌおよび９ｄｌに示されているように、ノーザンプロットにおいて、ＭＩＡＵ ＳおよびＡｕ５ｔＢ１は、ＭｌおよびＢＩＡがハイブリッド化したのと同じサイ ズのｍＲＮＡ　（約３．５　ｋｂ）とはハイブリッド化しなかった。

ＭＩＡＵＳの配列分析 ＤＮＡに沿って何れか一方の末端から“歩かせる（ｗａｌｋｌ’ために、合成オ リゴヌクレオチドを用いてＭＩＡＵＳの完全な配列化を行なった。得られた配列 の分析は、ＭＩＡＵＳ挿入物のが図３に示すように９４８　ｂｐであることを証 明した。この配列（ＳＥＱよりＮＯ：５１は、ＡＴＧ（これはメチオニンについ てコードする）で始まり、その長さ全体にわたるオープンリーディングフレーム （ＯＲＦ）を有する。この配列は、Ｍ１配列よりも５°末端において１９塩基対 だけ長く、３′末端において６３４　ｂｐだけ長い。２つのクローンに共通な配 列（塩基３０〜３１４）は、３番目のコドンにおいて２つのヌクレオチドが異な っている以外は一致した。あり得る全てのリーディングフレームを様々なデータ ベースと比較したところ、塩基番号１におけるＡ″ｒＧで始まるリーディングフ レームは、ミクロソームアミノペプチダーゼ族の成分との相同性を共有していた 。

Ａｕ吐Ｂ１の配列 ＤＮＡに沿って何れか一方の末端がら”歩がせる（ｗａｌｋｌ″ために、合成オ リゴヌクレオチドを用いてＡｕ５ｔＢ１の完全な配列化を行なった。このＤＮＡ 配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　６＋は図５に示されている。このクローンの長さ は１６８９　ｂｐであり、残基２からのＯＲＦを有する。この配列は、図１に示 すようにＨｌｌ−４の部分を形成している。この配列のアミノ酸翻訳は、アミノ ペプチダーゼに特徴的な亜鉛結合部位モチーフを示した。

Ｈｕｏｏ　ｍＲＮＡのｃＤＮＡにおけるＰＯ増輻ＭＩ　ＡＵＳプライマーを用い るＰＣＢ後続のクローニングおよびＤＮＡ操作を容易にするために、プライマー として、アダプター配列を含有するオリゴ−ｄＴを用いて、ヘモンヵスコントル トゥスｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いでこのＣＤＮＡを使用し、位置８ ６５−８８５に基づく合成オリゴヌクレオチドを５′末端プライマーとして用い 、ＰＯによってＭＩＡＵＳ配列を増幅した。約２．５　ｋｂのＰＲＣフラグメン トが増幅された。これは、大体、既知のｌｌｌＲＮＡサイズおよび哺乳類のアミ ノペプチダーゼｃＤＮＡ配列に基づいて予想したフラグメントのサイズであった 。

ＰＣＲ反応の第２セツトは、ＭＩＡＵＳの５′末端に近いプライマー（３０−４ ９塩基）を用いて行った。アガロースゲル上に４つのバンドが検出された。これ らのうち最も大きい３．５　ｋｂでのバンドは、ＰＣＲ生成物の予想サイズに対 応している。

ＭＩＡＵＳプライマーからの２．５　ｋｂおよび３．５　）ｃｂ　ＰＣＲ生成物 のクローニングおよび配列化 ２．５　ｋｂ　および３．５　ｋｂ　ＰＣＲ生成物をクローニングし、２．５Ｐ ＣＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ７）および３．５ＰＣＲ（クローン番号２．１０お よび１９に関し、それぞれ５ＥＱＩＤ　Ｎｏｔ　８．１４および１５）と命名し た。ノーザンプロットにおいて、２　、５　ＰＣＲおよび３．５ＰＣＲ（クロー ン２．３．５ＰＣＲ−２）は、約３．５　ｋｂの＋ｎＲＮＡと、Ｍｌ　、ＢＩＡ 　、　ＭＩＡＵＳおよびＡｕ５ＴＢ１と同じパターンで（ｍＲＮＡを得るために 用いたヘモンカスの年令に関して）ハイブリッド化した（図９ｅＳｆ）。

クローンの完全配列化は°オリゴヌクレオチドウオーキング（ｗａｌｋｉｎｇ） ’によって行った。図１に示すように、２．５　ｋｂ生成物の配列（ＳＥＱより Ｎ０１７）は、Ｈｌｌ−２（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　２０１の部分であり、３． ５　ｋｂ生成物の配列（ＳＥＱよりＮｏｔ８１は、Ｈｌｌ−３（ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏｔ　２１１の大部分であった。これら両方の配列のアミノ酸翻訳（図６に示 す）は、アミノペプチダーゼに特徴的な亜鉛結合部位モチーフＨｉｓＧＩＵ　Ｘ ａａ　Ｘａａ　Ｈｉｓ　Ｘａａ　Ｔｒｐ　（ＨＥｘＸＨＸｗ）を示した。

５°末端ＰＯクローンの配列化 Ａｕ５ｔＢｌ、２．５ＰＣＲおよび３．５ＰｃＲ（ＳＥＱよりＮＯ：６．７およ び８１　ＣＤＮＡ　クローン中に保存されている配列を調和させるプライマー（ これは５°末端から約１．３Ｋｂで、これらの配列についてのｒＩＩＲＮＡとハ イブリッド化する）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡは５１末 端でＣ−ティリングし＋ｔａｉｌｅｄ　）、次いで５′末端については１つの汎 用アンカー（Ａ）プライマーを用い、３′末端ニツイテはＡＵＳＴＢＩ　、２． ５ＰＣＲおよび３．５ＰＣＲ−クロー：／　２　（ＳＥＱ　ＸＤ　ＮＯ：　６． ７および８）の各配列に特異的な３つのプライマーを用いてＰＯ反応を行った。

これらの反応は各々予想したサイズ、１．３　ｋｂ　直下のそれぞれ１３０１　 ｂｐ　ｆｓＥＱ　ＩＤＮｏ：　９１．１２８０　ｂｐ　（ＳＥＱより　Ｎｏｔ　 １ｏ＞および１２９２　ｂｐ　（ＳＥＱより　Ｎｏｔ　１１１の生成物を与えた 。３つの全ての配列は、５°末端における非翻訳領域を有する（図２）。これら は全て、同じ２２　ｂｐ　配列（５’　ＧＧｍＡＡＴＴＡＣＣＣＡＡＧＴ〒ｒＧ ＡＧ　３　’　）から始まり、コノ配列は、スプライストリーダー配列１　（Ｓ ｐｌｉｃｅｄ　１ｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　１．５ＬＩ）　として知られ ており、かつ種々の線虫の翻訳されない５′領域中に存在している（Ｈｕａｎｇ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０１　。ＳＥＱよりＮｏｔ９および１０において、Ｓ Ｌ１配列は開始ＡＴＧの直前にある。ＳＥＱ　ＸＤ　Ｎｏｔ　ｕにおいて、ＳＬ Ｙと開始ＡＴＧとの間には１３　ｂｐがある。３つの全ての配列は、完全なＯＲ Ｆを有している。

Ａｕ５ｔＢｌ　３’末端ＰＯクローンの配列化Ａｕ５ｔ　Ｂｌ　ｆｓＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏｔ　６１の位置１４１４−１４３８　に調和する特定のプライマーを用い ると、ＰＣＲ生成物は、約１３　ｋｂの予想したとおりのバンドを与えた。クロ ーニングしたバンドの配列化により、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ；　１２および１３が 得られた。これらは１−６１５　ｂｐのＯＲＦおよび実質的な非翻訳領域を与え た。

クローン化ＰＯ’ｌ生成物の配列分析 Ｈ１１−１、Ｈｌｌ−２およびＨｌｌ−３と命名した前記の配列の複合物は、図 ２に示されている。これらから予想されたアミノ酸配列は、図６ａに示されてい る。示されたＤＮＡ配列の予想される翻訳の有効性は、ＣＮＢｒからのＥａｍａ ｎｎ分解およびタンパク質分解開裂フラグメント（図７）で決定されるアミノ酸 配列との適合によって、実質的に確認される。即ち、１（１１８の２９残基Ｎ− 末端配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０ｉ１６）の２７残基は、）＋１１−２と残基６１ −９０が調和する（図７ｂ）。位置７８のバリン（ｖ）および位置９０のグリシ ジ（Ｇ）の調和は、Ｈｌｌ−２に特徴的である。なぜならば、Ｈｌｌ−３は位（ ｌＦ９０にアスパラギン（Ｎ）を有し、８１１−１は位＠８６（これはＨｌｌ− ２の位＠　７８に相当する）にロイシン（Ｌ）を有するがらである。

ＨＩＩＳ　Ｎ＝末端アミノ酸配列ｌ５ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　１６１の２つの残基 は、ここに示す３つのＨＩＩＤのどれにも調和しない。特に注目すべきことは、 それぞれ残基５４０−５５５の領域におけるＨｌｌ−２およびＨｌｌ−３と、極 めて類似しているが区別的な配列ＰｅＰ　ＡおよびＢ（先にＷ０９０／１．１０ ８６に記載されている）とが、完全に適合することである。同様に、４５０−４ ７０残基領域において、Ｐｅｐ　ＤはＨｌｌ−２と正に調和する一方で、類似す るか区別的なＰｅｐ　ＥはＨｌｌ−３とより調和している。

例えば、完全長さの配列の１つ（Ｈｌｌ−３１の翻訳アミノ酸配列は、哺乳類ミ クロソームアミノペプチダーゼの２つの配列と、図６ｂにおいて比較されている 。

ＨＩＩＯＤ翻訳とこれらアミノペプチダーゼとの相同性は、同一アミノ酸を枠で 囲んで示されている。ミクロソームアミノペプチダーゼの特徴的なモチーフは、 アミノ酸配列ＨＥＸＸＨＸＷ　であり、これは亜鉛結合部位として機能するｆＪ ｏｎｇｅｎｅｅｌ　ｅｔａｌ、、　１９８９；　Ｖａｌｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９９０）。これは図６に星印を付して示されている。

Ｈｌｌ−１、Ｈｌｌ−２および８１１−３の翻訳物に存在することが示されるこ の配列は、全てのミクロソームアミノペプチダーゼに保存されている。哺乳類お よびヘモン二のミクロソームアミノペプチダーゼに共通する他の特色は、１つの 比較的に短い細胞内領域、Ｎ−末端に隣接する１つのトランスメンブラン配列お よび幾つかの潜在的なグリコジル化部位が存在することである。哺乳類ミクロソ ームアミノペプチダーゼに対するＨｌｌ−１、−２および−３の相同性の程度（ 類似性５２−５５　％および同一性３０−３２　％）は表２に示されている。

サザンプロット分析 種々のＨＩＩＯＤ　ｃＤＮＡクローンおよびＰＣＲ生成物で探査したＨ、Ｃ０ｎ ｔＯｒｔｕｌｉゲノムＤＮＡサザンプロツトの結果は、図１ｏに示されている。

全てのプローブはハイブリダイゼーションの複数のバンドを示し、これはマルチ 遺伝子ファミリーに典型的である。予想したとおり、ＢＩＡおよびＡｕ５ｔＢ１ は、ＭＩＡＵＳおよび３．５ｋｂＰＣＲのように、互いに類似のハイブリッド化 パターンを示した。しがしながら、これらのパターンは互いに著しく異なってお り、がっ中程度の緊縮条件下でさえも２　、５ｋｂＰＣＲプローブで認められた パターンと異なっていた（図１０Ａ）。

このことは、これら３つのＣＤＮＡ間の相同性の程度が異なることを反映してい る。

ＨｌｌｏＤに関連するアミノペプチダーゼ活性の実証ミクロソームアミノペプチ ダーゼ活性は、ＨＩＩＯＤ含有フラクション、即ちＴｈｅｓｉｔ抽出物の超遠心 からの上澄み液、ＣｏｎＡ結合フ結合シラクシタンＭｏｎｏＱカラムでのイオン 交換クロマトグラフィーにより得られたＨＩＩＯＤ含有フラクションに関連して いることが認められた（表３）。試験した全ての基質での比活性は、ＨＩＩＯＤ の純度が上昇するとともに増加した。

表３　典型的なＨＩＩＯＤ調製物からのフラクションの酵素活性Ｈ１ｌＯＤアミ ノペプチダーゼ活性に対する哺乳類アミノペプチダーゼ阻害剤の影響 阻害剤ベスタチン（哺乳類ミクロソームアミノペプチダーゼを阻害する）をＣｏ ｎＡ　ＨＩＩＯＤに、供給業者ｆＢｉｅｇｒｕｂｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　 が推奨する濃度で加えると、ロイシン−ｐ−ニトロアニリドに対する活性が約７ ０％だけ低下した。一連の実験を行い、ある範囲のプロテアーゼ阻害剤の阻害活 性を試験した。メタロプロテアーゼまたはアミノペプチダーゼに対して特異的で ないこれらの阻害剤は、反応速度に対して阻害効果を有しなかった。メタロプロ テアーゼまたはアミノペプチダーゼに影響を及はずことが知られている阻害剤は 、表４に示すように、反応速度に対して影響を及ぼした。最も効果的な阻害剤は 、５ｍＭフェナントロリンであった。

表４ 種々のプロテアーゼ阻害剤を用いたＨＩＩＯＤ　アミノペプチダーゼ活性の阻害 Ｈ１ｌＯＤのサブ−フラクション分別 ＭＯｎＯＱでのＣｏｎＡ　ＨｌｌｏＤのイオン交換クロマトグラフィーからのフ ラクションに関連する活性分布は、図１３ａに、またフラクションの５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥは図１３ｂに示されている。

更に、酵素活性は、自由流動等電点法のリサイクルによって分離されたＨｌｌｏ Ｄのサブフラクションに関連していた（図１４および１５）。低いｐＨ値（ｐＨ ４，５）において、これらサブワラクシ３ンは、５ＤＳ−ＰＡＧＥに見られるＨ １１０Ｄダブレットを作る大きい方のバンドのみを含んでおり、より高いｐＨ値 （ｐＨ６，５１において、ＨＩＩＯＤダブレットを作る小さい方のバンドのみを 含んでいる。中間的フラクションは、これら両方のバンドを含んでいる。小さい 方のバンドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＳＭＡＲＴ　’装置を用いるＭｏｎｏＱで のイオン交換クロマトグラフィーによる分離フラクションとしても得ることがで きるであろう。これら全てのサブワラクン３ンは、λ９ｔ１１クローンＭ１によ って発現されるタンパク質上でアフィニティー精製されたＨＬＩＯＤに対するヒ ツジ抗体と結合するが、挿入物を有しないλ９ｔ１１から溶離した抗体は結合し ない（１１１４ｃ）。全てのサブフラクションは、ＴＳ　３／１９．７と称する マウスモノクローナル抗体と結合する（図１４ｃ）。

これらＴＳ　３／１９．７は、クローンＭ１により発現される組換えタンパク質 とも結合する。全てのサブフラクションは、ミクロソームアミノペプチダーゼ活 性を示すかく図１５０）、この活性は、最高ｐＩおよび最低ｐＩで得られたフラ クションにおいて比較的低い。この低い活性は、タンパク質濃度が低下したため 、サブ−フラクション分別中の極端なｐＨの影響のため、あるいは最高活性のた めには大小両方のバンドが必要なためかもしれない。

ＨｌｌＯＤの分離された成分でのワクチン接種自由流動等電点法またはイオン交 換クロマトグラフィーにより得られた分離した上方および下方のバンドは、下記 の実験で例示するように、ヒツジに注射すると、防御抗体の形成を引き起こす。

約６方今のヒツジ３０匹を、各グループのヒツジの体重範囲が合致するように、 各６匹の５つのグループに分けた。各動物に、Ｍｕｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ ９２１およびＴａＶｅｒｎｏｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９２ａ、　ｂ）に記載さ れているように、全量１５０μ９のタンパク質を３等分の用量で５４日間にわた り注射した。

グループＬの動物にはＨＩＩＯＤダブレットの下方の（小さい）バンドを注射し 、グループＵの動物には上方のバンドを注射し、グループＵ＋Ｌの動物には再び 組み合わせた上方および下方のバンドをを注射し、グループＤには中間的ｐＨで の自由流動等電点法により得られた２つの（分離していない）バンドを注射し、 コントロール（グループＣ）としてウマ膵臓フェリチン（抗原的に無関係のタン パク質）を注射した。ヒツジに、第３回目の注射から３週間後に、１０　、００ ０匹の感染性幼虫を投与した。実験を、感染後２９〜３１日で終了した。実験の 結果は、図１６にまとめて示されている。どのサブフラクションの注射も、試験 全体を通して寄生虫卵の排出を約９０隻だけ減少させ、寄生虫の全数を６３−８ ４　％だけ減少させ、非パラメータ的統計分析を用いたコントロールに対し有意 差＜ｐ＜　０．０５）を示している。雌寄生虫数の減少率（７０−８８１１は、 雌寄生虫数の減少率よりも大きく、（再び組み合わせた上方および下方のバンド を注射したヒツジにおける雌寄生虫数の減少率、ｐ＜０．０７を除いて）両性の 減少率は有意であった（ｐ＜０．０５１゜ １１１１１８およびＵｔＵでのワクチン接種ＨＩＩＯＤの端部を切断された水溶 性形態（８１１Ｓ＋その酵素活性を保有している）は、天然分子からエラスター ゼでの処理により得ることができる。この形態は、主としてＡｐＭ一種酵素活性 を含むことが見出され、エラスターゼで消化したペレットのＴｈｅｓｉｔ抽出物 （ＨＩＬＡＩはＡｐＡ一様活性に富んでいた（表５参照）。

下記の実験は、ヒツジにＨｌｌｓまたはＨＩＩＡでワクチン接種すると、ヘモン カ各の抗原投与または感染に対する防御か得られることを示している。約８方今 のヒツジ１８匹を、各グループのヒツジの体重範囲が合致するように、各６匹の ３つのグループに分けた。各動物に、Ｍｕｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９２＋お よびＴａＶｅｒｎＯｒ　ｅｔａｌ、　ｆＬ９９２ａ、　ｂｌに記載されているよ うに、全量１００μ９のタンパク質を２等分の用量で２３日間にわたり注射した 。グループＡの動物にはＨＩＩＡを注射し、グループＳの動物にはＨＩＩＳを注 射し、グループＣの動物には陰性コントロールとしてウマ膵臓フェリチン（抗原 的に無関係のタンパク質）を注射した。次いでヒツジに、第２回目の注射の２５ 日後に、１０，０００の感染性幼虫で抗原投与し、感染後３４〜３６日で実験を 終了した。実験の結果は、図１７にまとめて示されている。ＨＩＩＳの注射は、 試験全体を通じて寄生虫卵の排出を８９亀だけ減少させ、寄生虫の全数を７６％ だけ減少させた。ＨＩＩＡの注射は、試験全体を通じて寄生虫卵の排出を９８亀 だけ減少させ、寄生虫の全数を８４％だけ減少させた。これ−らは、非パラメー タ的統計分析を用いたコントロールに対し有意差（ｐ＜　０．０５）を示した。

抗体によるＨ１１０Ｄアミノペプチダーゼ活性の阻害ＨＩＩＯＤ含有溶液を、Ｈ １１０Ｄ含有フラクションを注射した個々のヒツジまたはコントロールヒツジか らの血清とともにインキュベートした。次いでこれらの溶液を、基質としてフェ ニルアラニンｐＮＡおよびα−グルタミン酸ｐＮＡを用いて、アミノペプチダー ゼ活性についてアッセイした。活性阻害の程度（最高８０１）は、血清が得られ た各ヒツジにより示される防御レベルに相関していたく図１８参照）。

酵素活性の極在化 成虫へモンカスコントルトゥスの凍結切片を、アミノペプチダーゼ活性について 調べた。図１９に示すように、アミノペプチダーゼ酵素活性は、腸管のルミナー ル表面に極在している。ＨＩＩＯＤタンパク質もこの場所に明確に認められる。

真核性バクロウィルス−昆虫細胞系を用いたＨＩＩＯＤ　（３，３ＰＤＲクロー ン２）の発現 昆虫細胞中でのアミノペプチダーゼ活性の発現感染細胞を採取し、基質としてｐ ｈｅ−１ｌｅｕ−１ｍｅｔ−および１ｙｓ−ｐＮＡを用いて、アミノペプチダー ゼ活性についてアッセイした。このアッセイは、昆虫細胞が１ｙｓ−結合アミド 結合に対して著しく優先するアミノペプチダーゼ活性を有するという観察によっ て複雑になった。しかしながら、発現されたＨＩＩＯＤ　を含む細胞抽出物は、 更に１ｅｕ−、ｍｅｔ−およびｐｈｅ−ｐＮＡを、この順位の優先性で開裂した 。

発現されたＦｌｌｌｏＤ　（３，３ＰＧｔクローン２）タンパク質の分子量およ び免疫活性感染細胞またはコントロール細胞の抽出物のサンプルを、７．５　％ 　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ついでクーマシーブルーで 染色した。３．５−２−Ｐ３Ａおよび３．５−２−Ｐ４Ａに感染した細胞溶解物 の両者は、ＨｌｌｏＤと同じサイズ、１１０　ｋｄにハンドを有し、これは、１ ２０　ｋｄの分子量を有するともに発現されたβ−ｇａｌ直下に移行した。この １１０　ｋｄバンドは、陰性コントロール溶解物のどれにも存在しなかった。（ これは、酵素活性を示さなかったＰ２Ａ溶解物にも存在しなかった。） 複製ゲルをウェスタンプロット処理し、抗−ＨｌｌｏＤＮで探査した（図２１） 。極めて強い特異的な陽性免疫反応が、３．５−２−Ｐ３Ａおよび３．５−２− Ｐ４Ａにより発現された］−１０ｋｄパンに対して、およびＣｏｎＡ　Ｈ１１０ Ｄ含有コントロールトラックにおける天然ＨＩＩＯＤダブレットに対して得られ たが、どの陰性コントロールトラックにおいても反応は認められなかった。

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Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒ，Ｂ、（１９６４１Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２． 　１コ８５−１３９０゜Ｍｕｎｎ、Ｅ、Ａ、、Ｓｍ１ｔｈ　Ｔ、Ｓ、、Ｇｒａｈ ａｍ、Ｍ、、にｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｃ，Ａ、、Ｔａｖｅｒｎｏｒ、Ａ、Ｓ、＆　 Ｃｏｅｔｚｅｅ、Ｇ、（１９９２１Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　ｌＪ％。

Ｎａｃｈｌａｓ、Ｍ、Ｍ、、Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ｄ、Ｔ、ａｎｄ　Ｓｅｌｉｑｍ ａｎ、Ａ、Ｍ、（１９５７）。

ｙ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　＆　ｃｙｔｏｃｈｅｍ、＞、２６４−２７８゜Ｎａｋ ａｎｅ、ρ、に、＆Ｋａｗｏｘ、Ａ、に、（＋９７４１．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ＋ −＋ｘｓｃｏｃｎｅｍｔｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃ＞’ｕＯＣｈｅｍｌＳＣ１７，′ 、Ｒ，１０Ｂ４−１０９ｉＮｃ　ｅｎ、Ｃ，、Ｓ）ｏｓｔｒｏｍ、Ｈ，、Ｄａｎ ｌｅｌｓａｎ、Ｅ、Ｍ、、Ｃｏｗｅｌｌ、Ｇ、Ｍ、＆一般的情報 配列の記載：　５１！Ｑ　１０　Ｎｏ４＋ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１０の慣轢 ＳＥＱ　ＸＤ閏・１２のｌ１Ｍ＋ ＳＥＱ　ＸＤ史・１４の情軸： ＳＥＱ　ＸＤ　Ｎｏ＋　１６＋１）情ｌｌ！ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１９　＋７ １１１１１１　：Ｓ閏ＩＤ勇：２０の情糟； １２０　３２５　Ｂ。

Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｌｐ　ＭｅＣＸｌｅ　Ａｉａ　Ｌｅｕ　ＰＸＯＡＳＤ　Ｐｈ ｅ　Ｓｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｖ　ＡＩＪ　ＭＡＰＴｈｚ　Ｌｅｕ　Ａｉａ　Ｌｅｕ 　Ｃ１ｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｃ＋　Ｌｅｕ　Ａｉａ　Ｌｅ ｕ　Ｃ１ｖ　ＣＶ！１Ｈｌｌ−Ｉ　ＣＡＣ八ＡへＡ’ｒＣ八　へＣＣＴＣ八ＡＣ ＡへＴ（、ＴＡＴＡＣＡＴＴ　ＣＧＣσｍｒ八ＴＣ八　へＣ（へＡＣＡＴＣ；Ｃ ＴＦＩＧＩ　（続　きつ ＦＩ６．２（続　き） Ｉｆｌ　ｌ−Ｉ　ＡＡＡＴＡ（：Ｃ丁ＧＴ　ＴへＴＴＣへＣへＣへ　丁へＣＴＣ ，ＴＧＣＴＣＴＴＧＣ八にＣ，ＣへＡ　ＡにＡＡＴＧＴＣＴs ＦＩＧ、２（続　き） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、］（続　き） ＋１１１−１　（：Ｃ八にＡ八（：ＣＣＡ　ＣＴに＾丁ＣＴＡＴＣ（：ＧＣ八へ ＴＴＴＴＴ　ＣへＴ（へへ（：ＴｒＧ　ＴＣＡＣＴ（：ＡＣfＴ ＦＩＧコ（続　き） ８１１−コ　ＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＴｒＧＴＡＡＦＩＧ、３（続　き） １１１１　２　ＣＣｍ／、ＡＴｍ’Ａ　ＣＣＣ△八ＣＴへ７（’：　ＡＧＡＴＧ ＡＣＣ，ＧＣＣ；ＧＡＣＴＧ（：ＣＡＣＡＡＧＣＧＴＣＣ；`Ａ　Ｓ。

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ＦＩＧ、６ｂｌ スス　−Ｆ　５二　淋　茄　＝・ヒ　Ｈ二＝　北　ミニ　ニ；　二＝　ススＦＩ Ｇ　、　６ｂ１１ ＝、−；　壬ツ・　二、；、：ｚ−゛　ｉ　モ；；：　本　＝：：ミ　：：：　 ヨ；　本　−：三１　＝三：＝：＝Ｐ＝ポリへドリンプロモーター 八 ｇｆｇｌｔ：３：ｃＤ’７Ｑ　（＋　Ａ　−１に重Ｌｌ”ｐｉｌ／’σ°０／易 要峯麹 ０　５　１０　Ｉｓ　２０ フラクション番号 Ａ　６　７　８　９　１０１１１２１３１４１５１６　Ａフラクション番号 フラクション番号 フラクション番号 Ａ　Ｂ　４５　６７　ｇ　９　１０１１１２１３１４１５１６１７１ｇフラクシ ョン番号 Ｂ＝ＣｏｎＡＨ１１０Ｄ 出発物質 フラクション番号 ４トフエニルアラニン 十αグルタミン酸 ＋メチオニン 糞１ｇ当たりの寄生虫卵の平均数 ＦＩＧ、７８ａ）７７ ＦＩＧ、１８ｂ万 防御率％ 国際調査報告 、□１．−−−−−　ρＣＴ／Ｇ１１ｌ　９３１００９４３フロントページの続 き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４／４７ Ｃ１２Ｎ　９／６４　Ｚ　９１５２−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、 ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＺ。

ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、 ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ （７２）発明者　スミス　トリヴオール　スタンリー英国　ケシブリッジ　シー ビー１６ユーキユー　リントン　ザ　グローブ　１４Ｉ （７２）発明者　マン　ニドワード　アルバート英国　シービー１５イーニス　 ケンブリッジ　フルポーン　ステーション　ロード（７２）発明者　ノックス、 ディピッド　パトリック英国　コツケンジー　エイチ３２　０ジエイデイー　イ ースト　ローリマー　ブレイス（７２）発明者　オリヴアー、ジョアンナ　ジェ ーン英国　ニブインバラ　イーエイチ１１１エルジー　ポールウオース　ブレイ ス　５（７２）発明者　ニュートン、スーザン　エリザベスオーストラリア　３ ４０１　ヴイクトリア州ストラスモア　レバノン　ストリート３

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．蠕虫アミノペプチダーゼ酵素をコードするか、または図２、３、４または５ に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１〜１５）の全てまたは一部に 実質的に対応するその抗原性部分をコードする１つ以上のヌクレオチド配列、あ るいは前記配列の何れかと実質的に相同性であるか、または前記配列の何れかと ハイブリッド化する蠕虫アミノペプチダーゼ酸素のためにコードする配列を含む 核酸分子。
2. ２．蠕虫寄生虫に対する防御抗体を産生できるポリペプチドをコードする１つ以 上のヌクレオチド配列を含み、この配列が、図２、３、４または５に示された、 アミノペプチダーゼをコードする配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１〜１５からなる ）からの１つ以上の抗原決定基をコードする領域を組み込んでいる核酸分子。
3. ３．クローン　Ｍ１、Ｂ１Ａ、Ｂ１Ａ−３１、Ｂ２、Ｍ１ＡＵＳ、ＡｕｓｔＢ１ 、０１４−０１５（２．５ＰＣＲ）、０１４−８７２（３．５ＰＣＲ　クロ−ン ２）、Ａ−６４８（Ｂ１　の　５′末端）、Ａ−６５０（２．５ＰＣＲ　の　５ ′末端）、Ａ−６４９（３．５ＰＣＲ　の　５′末端）、０１４−１７８（Ａｕ ｓｔＢ１クロ−ン２の３′末端）、０１４−１７８（ＡｕｓｔＢ１クロ−ン３＆ ６の３′末端）、０１４−８７２（３．５ＰＣＲクロ−ン１０）および　０１４ −８７２（３．５ＰＣＲクロ−ン１９）、Ｈ１１−１、Ｈ１１−２および　Ｈ１ １−３、それぞれ図２、３、４または５に示すＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１〜１５およ び１９〜２１の配列、あるいは前記配列の何れかと実質的に相同性であるか、ま たは前記配列の何れかとハイブリッド化する配列から選択された１つ以上の配列 に実質的に対応するか、または前記１つ以上の配列に実質的に相補的な１つ以上 のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
4. ４．請求の範囲１〜３の何れかに記載の核酸分子を含む発現ベクターまたはクロ ーニングベクター。
5. ５．請求の範囲１〜３の何れかに記載の核酸分子を含有する原核細胞または真核 細胞、または突然変異生物。
6. ６．図２、３、４または５に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１〜 １５）の全てまたは一部に実質的に対応するアミノペプチダーゼ酵素を構成する か、またはその抗原性部分を構成するアミノ酸配列を含む合成ポリペプチド、あ るいはタンパク質ダブレットＨ１１０Ｄに対応する合成ポリペプチド以外の、あ るいはＷＯ９０／１１０８６に記載の個々のポリペプチドの何れかに対応する合 成ポリペプチド以外の、機能的に等価なその変異体。
7. ７．図２、３、４または５に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１〜 １５）の全てまたは一部に実質的に対応するアミノペプチダ−ゼ酵素を構成する か、またはその抗原性部分を構成するアミノ酸配列を含む合成ポリペプチド、あ るいは他のヘモンカスコントルトゥス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔ ｕｓ、捻転毛様線虫）成分を実質的に含まない機能的に等価なその変異体。
8. ８．請求項６または請求項７に記載の前記アミノ酸配列と融合したポリペプチド を更に含む融合ポリペプチドの形態の請求項６または請求項７に記載の合成ポリ ペプチド。
9. ９．請求項１〜３の何れかに記載の核酸分子を含有する原核細胞または真核細胞 を、前記ポリペプチドが発現される条件下で培養し、こうして生産された前記ポ リペプチドを回収することからなる請求項６〜８の何れかに記載の合成ポリペプ チドの製造方法。
10. １０．製剤上許容される担体と一緒に、請求項６〜８の何れかに記載の少なくと も１つの合成ポリペプチドを含むか、あるいは細胞中に挿入された請求項１〜３ の何れかに記載の核酸分子を有するウィルス細胞または宿主細胞を含み、押入さ れた核酸分子によりコードされるポリペプチドの免疫応答を刺激するための、ヒ トまたはヒト以外の動物におけるよう蠕虫寄生虫に対する免疫応答を刺激するワ クチン組成物。
11. １１．ヒトまたはヒト以外の動物における蠕虫寄生虫に対する免疫応答を刺激す るためのワクチン組成物の製造への、請求項１〜３の何れかに記載の核酸分子ま たは請求項６〜８の何れかに記載の合成ポリペプチドの使用。
12. １２．ヒトまたはヒト以外の動物に、請求項１０に記載のワクチン組成物を投与 することからなる、ヒトまたはヒト以外の動物における蠕虫寄生虫に対する免疫 応答を刺激する方法。
13. １３．下記の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するオリゴ糖。
14. １４．下記の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項１３に記載のオリゴ糖。
15. １５．請求項６〜８の何れかに記載の合成ポリペプチドに結合された請求項１３ または請求項１４に記載のオリゴ糖。