JPS62224293A - コクシジウム症予防用抗原性蛋白質およびそれを含有するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背崇 本明細書を通じて、多くの文献をカッコ内の文献番号に
よって引用する。これらの引用文献は、発明の詳細な説
明の項の末尾に列記する。これらの文献における開示す
べてを、本発明の時点までの本発明技術分野における熟
練者に公知な技術状態をより完全に記述するものとして
参考に供する。 Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ門にはＥｕｃｏｃｃｉｄｉｏｒ
ｉｄａ目に屈する何面もの異種生物が包含される。Ｅｉ
ｍｅｒｉａ属は真性球虫の目に包含される。この属に属
する生物のうち、数種が養鶏産業上きわめて重要である
。これらの種には、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ　
、　Ｅ、ｍａｘｉｍａ。 ［、ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ
、ｂｒｕｎｅｔｔｉ。 Ｅ、ｎ＋１ｖａｔｉＳＥ、１ｉｔｉｓおよびＥ、　ｐｒ
ａｅｃｏｘがある。 種の分類は、宿主内の感染部位および卵母細胞の形態に
基づいて行われる。上述のそれぞれの種についての生化
学的差異は報告されているが、生化学的マーカーがその
特定に用いられたことはない。 烏［ｉｍｅｒｉａは、全ライフサイクルを単一の宿主内
で完了する。そのライフサイクルは複雑で、無性期と有
性期があり、Ｅｉｎ＋ｅｒｉａ種の間で相違している。 感染期は胞子を形成した卵母細胞である。 汚染された糞便、餌または水を摂取すると、胞子を形成
した卵母細胞は剪断力とスポロシストキャップの酵素的
加水分解の両件用が合した結果、消化管内で脱嚢する。 遊離した種虫は、小腸の特異的領域内にお番）る上皮細
胞を動き回る。 発生はリーベルキーン線内で始まり、第１世代メロント
のレベルまで進む。メロントはさらに際立った核を示し
、加えてエネルギー発生と蛋白質合成能が増大した円形
化生物体からなる遷移ｔｌｌｌである。第１世代種虫の
発生がメロントの多分裂によって続く。第１世代種虫の
遊離によって宿主細胞は破壊され、寄生体は移住して新
しい宿主細胞に感染し、第２の無性サイクルが行われる
。メロントは第２世代種虫のレベルまで発生し、それが
遊離するときさらに上皮細胞を破壊する。第３世代種虫
の遊離によって、さらに宿主細胞の破壊が続く。種虫の
世代交代数はＥｉｍｅｒｉａの種によって異なっている
。 有性発生は、配偶子形成過程を経過したのら、小配偶子
および大配偶子の生成によって始まる。 遊離した小配偶子は大配偶子と融合し、接合子を形成す
る。未成熟卵母細胞の発生によって、宿主ＩＩｌ胞の破
壊が続く。腸管内に放出された卵母細胞は糞便を介して
環境に流布され、空気中の酸素の存在下に成熟する（胞
子形成）。 宿主細胞がさらに卵母細胞を摂取しない限り、？５士体
の発生は自ら制限される。しかしながら、これは鶏がぎ
っしり詰め込まれた鶏舎では非現実的な期待である。 Ｅｉｍｅｒｉａによる疾患は、飼料効率の低下と異常発
現を伴い、１大な経済的ｊ０失を招いている。 Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａおよびＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘによる
コクシジウム症の病変は、メロゾイトの遊離時の宿主細
胞の破壊が主な部分を占めるが、一方Ｅ、ｍａｘｉｍａ
の場合ハＥ、ｍａＸｉｍａ卵母細胞のｆ２Ｉ！１時の宿
主１１１Ｉ１１の破壊が病変に重大な意味をもっている
。腸内の出血は、上皮に分布する毛細管の破壊によるも
のである。 いったん無性発生が確立すると、コクシジウム発育阻止
剤を使用しても、この疾患の進行を制御することは困難
である。二次感染がＥｉｍｅｒｉａによって生じる疾患
を悪化させる場合も多い。 Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　ｌａまたはＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘに
感染した鳥では４〜７日以内に死亡することがある。し
かしながら、Ｅ、ｍａｘｉｍａの感染によって死を招く
ことは稀である。 挿出がきわめて特定の組織部位内で感染を開始すること
は、コクシジウムの一定した性質である（３９．４５．
５７）。感染の部位特異性は、Ｅｉｍｅｒｉａの種弁化
に共通して用いられる特性である。たとえば、Ｅ、ｎＱ
ＣａｔｒｉＸの無性段階には、中間部小腸内の上皮細胞
を侵襲する性癖があるが、一方、有性段階では主として
盲腸内で発生する。 コクシジウム症に対する免疫の研究の多くは、体液性免
疫、さらに特定すれば血清抗体に集中してきた。血清抗
体と疾患への抵抗性には相関がないとの報告もあった（
５つ）。しかしながら、とくに有用なデータでは、分泌
免疫系の関与する局所反応もしくは細胞性免疫、または
その両者が防御反応にかかわっているとの主張が支持さ
れている。 宿主Ｉ胞に対する病原体のｖｔ識、浸透および／または
付着の妨害により防御効果が現れることは、ウィルス、
細菌および原生動物のモデルで示されている。主要宿主
ＩＩｌ胞受客受容体は病原体付着特性の遺伝的欠失によ
って初期のコロニゼーション過程が防止できる（１６．
５４）。また、分泌抗体は、必要な受容体に結合し、そ
れをマスクすることによって、コロニゼーション過程の
妨害も可能である（３２．７４）。１種以上の免疫グロ
ブリンクラスがＥｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ　（７
）初期コロニゼーション過程を妨害する能力をもつとの
報告もある（１３）。しかしながら、最近の報告では、
分泌ＩＯＡの産生のみが、天然の保護免疫と相関したコ
トカ示すし”Ｃイル（１２，５９）　。ｐｏｒｔｅｒ　
＆Ｄａｖｉｓ　（１３）および他の研究者達（１９）は
、分泌ＩａＡが病原体の細胞外段階で、その侵入を有意
に制限することにより、あるいは侵入しても以後の発生
の防止可能な程度に生物体を減弱させることにより中和
すると報告している。 この疾患を除去し、鶏のコクシジウム症による破壊作用
を抑制するために、世界中の生産者によって１年間に約
５億〜１０Ｖｌドルが消費されるといわれている（３９
．５２＞。現在用いられている制御手段によってもなお
、鶏のＩＱ害は何面万ドルにも及７Ｓという（７７）。 鶏に対するＥｉｍｅｒｉａ制御手段として、以往もっと
も広く用いられている方法は、抗原虫薬飼料添加物の応
用である。その組成は、使用するコクシジウム発育阻止
剤の種類によって異なるが、それぞれの製品はコクシジ
ウムのライフサイクルのある段階にしか効果を示さない
（３９，５１，５８）。コクシジウム発育阻止剤の使用
における欠点は多い。鳥類における保護効果の短い持続
性、時にみられる行動の低下、寄生体における抵抗性の
発現、またある程度安全性に関する問題がある。 薬剤抵抗性株の発生により、最近の製品寿命はわずか数
年といわれている。このため、開発費用は増大し、たえ
ず有効な製品の製造が続けられているのが現状である（
５１）。 免疫感作による鳥類の保護はある程度成功している。殺
滅した生物体のプレバレージョンを用いて、限られた保
護効果を引き起こすことができている（１．４１．４３
）。鶏のもつと有効な免疫感作へのアプローチは、生存
原生動物製品、たとえばＣ０ＣＣｉＶａＣの利用であっ
た（１５）。低用量の生存卵母細胞を含有する多価組成
物である製品を、飲水中に投与すると、鳥類に緩和な奇
生体面症を生じる。この製品の欠点は、投与後最初の１
週間に鳥の行動の低下を生じる場合があることであった
。過剰投与や敷きわらの含水量などの変動によつて、単
篤なコクシジウム症の突発を招くことさえあった。鶏の
免疫感作のためのＥ、　ｔｅｎｅｌ　ｌａの生菌、胞子
形成卵母細胞の使用に関しては米国特許第３．１４７，
１８６号（１９６４）、および同じ目的でのＥ、ｔｅｎ
ｅｌｌａの挿出の使用に関しては米国特許第４．３０１
，１４８号（１９８１）を参照されたい。 ブロイラー鶏舎への生菌ワクチンの導入の別法どじては
、飼料による方法がある。これについては、最近の英国
特許（ＧＢ２．００８，４０４Ａ）に記載されている。 飼料と混合するに先立って、Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａの有毒
な卵母細胞を水溶性ポリサッカライド中に封入して乾燥
から防御する。卵母細胞は無症状感染を生じるのに十分
な吊のみ使用する。 免疫感作能が優れていることは明らかにされたが、この
方法の発展はフィールドで受は入れられることに疑問が
あって期待できない。しかしながら、すべての重要なコ
クシジウムの減弱株が開発されれば、この操作も受は入
れられるようになるかもしれない。 実際、毒性を減弱し／、′、Ｅｉｍｅｒｉａ細胞系の開
発の努細胞性われてきた。一部の秤についｒ：は、鶏胚
継代接種による減弱化に成功している（１９．３７．４
０．６６）。これらの株では、疾患を惹起する能力は低
下１ノでいるが、免疫を引き起こすだ

【ノの免疫原性は
保持されていた。しかしながら、これらの株の取扱いに
はいくつかの問題が残っている。たとえばＥ、ｎｅｅａ
ｔｒｉｙ：の減弱変異株には継代限界があって、胚継代
によって免疫原性の喪失または元の有毒型の保持を生じ
ることがある。さらに、一部の減弱化生物体は、鶏によ
る最小の戻し継代によって有毒型に復することがある（
３８゜６８）。すなわち、減弱化生物体が一定の性状を
維持することに関連した問題が明白である。 Ｅｉｍｅｒｉａ株の１化鶏卵による継代が容易でない場
合は、早期選択による減弱化も実行されてきた。 この方法では、完全な卵母細胞の脱皮が始まる前の感染
無症候段階の後期に、脱皮した卵母細胞を収穫する（２
８．４８．５０．６７）。このような選択によりライフ
サイクルが省略された培養体が生じ、それに応じた毒性
の減少が認められる（２８．４８．５０．６７）、Ｅ、
ｔｅｎｅｌｌａ　　（２９）Ｊ３よびＥ、ａｃｅｒｙｕ
ｌｉｎａ　（４９）の早熟の特性は遺伝的に安定なこと
が明らかにされてはいるものの、この方法の養鶏産業に
おける手段としての有用性を評価するには情報が十分で
はない。 鳥コクシジウムの表面抗原組成についてはほと／ｖど情
報がない。Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｃｌｌａの挿出の表
面にある抗原に対してモノクロナール抗体を分泌するハ
イブリドーマ細胞系が報告されている（８２）。その分
子量が１３〜１５０キロダルトンであったことを除き、
抗原は同定されていない。 また、その抗原の生物学的重要性もその抗原によるワク
チンの有効性も述べられていない。ヨーロッパ特許公告
用１３５，７１２号にも、Ｅ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａの挿
出と反応するモノクロナール抗体が開示されている。こ
の公告によってＥ、ｔｅｎｅｌｌａ種虫抗原が開水虫抗
原。さらに、ヨーロッパ特許出願公告用１３５．０７３
号には、Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　Ｉａのメロゾイトおよび挿
出に対して特異的に反応するモノクロナール抗体が開示
され、Ｅ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａから誘導されるメロゾイ
ト抗原が記載されている。 Ｈ，ｌ＋、旧５ｈｅｒの研究室におけるこれまでの研究
では、Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　ｔａの脱出した挿出の表面ヨ
ード化により同定される、分子量２０．０００〜２００
゜０００以上の約１６種のポリペプチドの存在が示唆さ
れている（８１）。さらに、ヨーロッパ特許出願公告用
１６７．４４３号には、コクシジウム症に対する防御の
ためのワクチンとして使用できる、［、ｔ（！ｎ０１１
ａの挿出または胞子形成卵母細胞の抽出物が開示されて
いる。これらの抽出物は複数種のポリペプチドを含有し
、その１種または２種以上がコクシジウム症を予防する
抗原として使用できる可能性がある。また、国際特許公
告第ＷＯ１００５２８号には、抗原性蛋白質をコードす
るＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａからのクローン化された遺伝
子またはそのフラグメントが開示される。これらの蛋白
質は、鳥コクシジウムの抗原性蛋白質に対するモノクロ
ナールまたは多価抗体と結合する。 ワクチンの開発に対するサブユニットによるアブローチ
は、過去１年足らずの間に成功を博してきたものである
。このようなアプローチでは、保護抗原の候補を同定し
、最終的火星生産の目的で性質が調べられる。寄生体抗
原の研究では、ひとつの研究グループが、Ｂａｂｅｓｉ
ａ　ｂｏｖｉｓの表面上に保護抗原の可能性が考えられ
る蛋白質を同定するためにモノクロナール抗体を使用し
た（８３）。 その結果、４４．０００ダルトンのＢ、ｂｏｖｉｓ抗原
が同定され、これを精製して実験動物に注射したところ
、初期チＶレンジに対しであるレベルの防御が明らかに
された。Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉの免疫学
的に重要な３０．０００ダルトンの蛋白質もモノクロナ
ール抗体を用いて同定されている（３１）。 １９８１年の中頃から、Ｄａｎｆｏｒｔｈと共同研究者
は、鳥Ｅｉｍｅｒｉａ種の抗原に対するモノクロナール
抗体産生の可能性を示すいくつかの報告を発表している
（９．１０．１１＞、同様に、５ｐｅｅｒら＜６９．７
０）も、Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ　ｋ：対”ｌルＡ　−１’
　７　＋）ドーマの開発と、その生理学的性質を明らか
にしている。抗体分泌ハイブリドーマは、間接的螢光抗
体試験に基づいて選択された（１０）。紫外線顕微鏡で
観察された反応パターンは、使用したモノクロナール抗
体によって変化した。そのパターンには、挿出のみとの
特異的反応と挿出およびメロゾイトとの反応、挿出の前
部のみの染色と膜全体の染色、特定の内部小器官の染色
と漠然として内部染色等がある（１１）。 モノクロナール抗体産生げつ歯頚起源のハイブリドーマ
の調整は、本技術に通暁した研究者が等しく実行すると
ころであるが、種Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　ｌおよびＥ、ｎｅ
ｃａｔｒｉｘに対する挿出中和ハイブリドーマまたは種
Ｅ、ｍａｘｉｍａに対するメロゾイト中和ハイブリドー
マの直接的または特異的選択で、す゛ブユニットワクチ
ンの開発に有用なこれらの種の毒性決定基の同定が可能
になることを示唆するような何の結果も得られていない
。 本発明は、Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ　、　Ｅ、ｎｅｃａｔｒ
ｉｘおよびＥ、ｍａｘｉｍａによって引き起こされるコ
クシジウム症に対する免疫の発現のためのポリペプチド
抗原の同定、特性づけ、製造および使用に関するもので
ある。融合蛋白質を含む組換えポリペプチド抗原も包含
される。 抗原は、抗原の直接合量によって正確に投与されるので
疾患を惹起することはなく、したがってワクチンが種に
よっては疾患の突発、先祖返りまたは免疫性の変化を生
じることも回避できる。 鶏のコクシジウム症による莫大な経流的損失から、Ｅ、
ｔｅｎｅｌｌａ　、　Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥ、
ｍａｘｉＩｌｌａに対するワクチンは望まれている。ハ
イブリドーマ技術を用いて、本発明者らは、サブユニッ
トワクチンに使用できる強力な保護抗原を同定し、精製
した。このようなサブユニットワクチンの使用によれば
、生菌ワクチンを使用した場合に認められるワクチン一
種に関係する疾患の突発および先祖返りまたは免疫性の
変化を回避することができる。 生物体から製造できる寄生体抗原の伍はきわめてわずか
で、きわめて高価につく。組換えＤＮＡクローニングお
よび発現の技術は、大量の保護抗原を安価に生産する新
しい値を開くものである。 簡単にいえば、これらの方法は、抗体のすべてまたは部
分をコードするＤＮＡ配列を、細胞内で抗原性蛋白質を
産生ずるのに必要な遺伝情報のコントロール下に、細胞
内に位首させることを要求する。遺伝情報は、合成ＤＮ
Ａ　（１７）　、ゲノム（たとえばウィルス）もしくは
染色体ＤＮＡまたは抗原をコードするｍＲＮＡから作ら
れたｃＤＮＡである。最後に挙げたアプローチが［；ｍ
ａｒ；ａ種のような複雑な生物体についてはもつとも直
接的な方法である。 しかしながら、ｃＤＮＡは抗原のアミノ酸配列に相当す
る遺伝情報しか含まないので、ｃＤＮＡ遺伝子の発現に
必要な遺伝シグナル（すなわち転写および翻訳）を与え
る発現ベクター中に挿入する必要がある。抗原は単独に
合成されてもよいし、大腸菌内の他の蛋白質と融合させ
た生成物として合成されてもよい。 大腸菌内での有効なサブユニットワクチンの製造は、ブ
タおよびウシの口蹄疫ウィルスの場合について報告があ
る（３３．６６）。口蹄疫ウイルスの表面抗原は、大腸
菌内で融合蛋白質抗原として産生された。ウシおよびブ
タをこれらの抗原で免疫感作すると、有意なレベルのウ
ィルス中和抗体が産生された。組換えＤＮＡ誘導抗原は
口蹄疫ウィルスのヂャレンジに対して保護効果を示した
。 ゲノムおよび表面蛋白質について広範に研究されている
口蹄疫ウィルスのような単純な生物体と異なり、［ｉｍ
ｅｒｉａの分子生物学についてはほとんど知られていな
い。Ｈａｎｇ　＆　５ｔｏｔｉｓｈ　（７９、８０）は
、胞子形成開始後６〜８時間に、Ｅ、　ｔｃｎｃｌ　Ｉ
ａ内で起こる急速かつ一過性のＲＮＡおよび蛋白質の合
成を報告し、胞子形成時の全蛋白質および核酸の合成は
この最初の１時間足らずの間に起こることを示唆した。 たとえば、５ｔｏｔｉｓｈら（７２）は、胞子形成前の
卵母細胞によって合成された挿出膜の糖蛋白質の蛋白質
成分は３０．０００ダルトンで、後に、胞子形成の過程
で挿出膜に導入されると述べている。最近、５ｔｏｔｉ
ｓｈら（７３）は、胞子形成前の卵母細胞、胞子形成時
の卵母細胞および挿出からのＲＮＡの単離とｉｎ　Ｖｉ
ｔｒＯでの翻訳について報告している。ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏでの翻訳生成物はｉｏ、ｏｏｏダルトン未満から２０
０．０００ダルトン以上の範囲にわたっている。胞子形
成前および胞子形成時開母細胞のＲＮＡ指示蛋白質合成
のパターンは異なっていて、胞子形成時に異なるＲＮＡ
集団が存在することを示唆する。 抗原性蛋白質をコードするｃＤＮＡの製造に際しては、
Ｅ、　ｔｅｎｅｔ　Ｉａのライフサイクルのいつ抗原性
蛋白質をコードするｒｒｌＮＡが生じるかを決定する必
要があった。本発明は、抗原性蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡクローンの単離および特性づけ、ならびに大腸菌内
での操作抗原性蛋白質の産生に関する。また、本発明は
、大腸菌内で産生されたこれらの蛋白質の不溶性状態か
らの抽出、およびこれらの蛋白質をモノクロナール抗体
と免疫反応性にする方法に関する。最後に、本発明は、
ｍ菌で産生された抗原性蛋白質の、Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ
、Ｅ、　ｎｅＣａｔｒｉＸおよびＥ、ｍａｘｉｎ＋ａに
にツて惹起されるコクシジウム症に対する免疫を鶏に産
生させる目的でのプレバレージョンおよび使用を提供す
るものである。 Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｃ！ｎｅｌ１８から誘導された抗原
性蛋白質および［、ｔｅｎｅｔ　ｌａによって生じるコ
クシジウム症を予防するための上記抗原性蛋白質含有ワ
クチンについては、ヨーロッパ特許公告第１６４．１７
６＠に記載されている。 発明の要約 第５図に示した核酸配列を有し、Ｅｉｎ＋ｅｒｉａｔｅ
ｎＱｌｌａから誘導される抗原性蛋白質をコードするゲ
ノムＤＮＡ分子が単離された。天然の蛋白質は分子量約
２５，０００ダルトンで、ジスルフィド結合によって結
合した２個のポリペプチドから構成される。一方のポリ
ペプチドは分子量約１７゜０００ダルトンで遮ｒｆｌＮ
末端アミノ酸を特徴とし、第５図に示したアミノ酸配列
を有する。他方のポリペプチドは分子量が約ｓ、ｏｏｏ
ダルトンであることを特徴とし、第５図に示したアミノ
酸配列を有する。 分子量約２５，０００ダルトンで、第７図に示した連続
アミノ酸配列を有する抗原性ペプチドをコードするｃＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡの核酸分子も単離された。ｃＤＮＡ
分子は、２５，０００ダルトンのポリペプチドを直接ま
たは融合ポリペプチドとして発現可能な発現ベクター中
に挿入された。 ベクターｐＤＥＴ１は、分子量約２５．０００ダルトン
で、第７図に示す連続アミノ酸配ダ１を有するポリペプ
チドをコードする。このベクターは大腸菌宿主細胞の形
質転換に使用され、この菌株はＲＥＮ３／ｐＤＥＴ１と
して（ＡＴＣＣ登録番号第５３３１６号）寄託された。 ベクターｐＤＥＴ２も、分子量約２５，０００ダルトン
で、第７図に示す連続アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードする。このベクターは大腸菌宿主細胞の形質
転換に使用され、この菌株はＲＥＮ３／ｐＤＥＴ２とし
て（ＡＴＣＣ登録番号第５３３１８号）寄託された。 ベクターｐＢＧｃ２３は、分子量約１３５．０００ダル
トンで、第７図に示した２５．０００ダルトンのポリペ
プチドのアミノ酸配列とそのアミノ末端にβ−ガラクト
シダーゼのアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドをコ
ードする。このベクターは大腸菌宿主細胞の形質転換に
使用され、この菌株はＲＥＮ３／ｐＢＧＧ２３として（
ＡＴＣＣ登録番号第５３３１７号）寄託された。 ベクターｐＣｏＣ１２は、分子量Ｆ３６５．６００ダル
トンで、第７図に示した２５，０００ダルトンボリベブ
ヂドのアミノ酸配列とそのアミノ末端にプロキモシンの
アミノ酸配列を有する融合ポリペプチドをコードする。 このベクターは大腸菌宿主細胞の形質転換に使用され、
その菌株はＲＥＮ３／ＰＣＯＣＩ　２として（ＡＴＣＣ
登録番号第５３３１４号）寄託された。 ベクターｐｃＯｃ２０は、分子量約５６．５００で、第
７図に示した２５．０００ダルトンポリペプチドのアミ
ノ酸配列とそのアミノ末端に天然配列から８３個のアミ
ノ酸が欠失したプロキモシンのアミノ酸配列を有する融
合ポリペプチドをコードする。このベクターは大腸菌宿
主ｔｆＡＩ１１の形質転換に使用され、その菌株はＲＥ
Ｎ３／ｐＣＯＣ２０として（ＡＴＣＣ登録番号第５３３
１３号）寄託された。 抗原性ポリペプチドの製造は、本発明の任意の宿主細胞
をＤＮＡ発現とポリペプチド産生を可能にする適当な条
イ′［下に生育させ、生成したポリペプチドを適当な条
件下に回収する方法によって行われる。回収は、宿主細
胞からのポリペプチドの分離、ポリペプチドの精製、ポ
リペプチドの可溶化、ポリペプチドの再生、ついで精製
、可溶化、再生を行った抗原性ポリペプチドの回収によ
って実施される。 ［ｉ１＋１１３ｒｉ　　ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能
動免疫を鶏に付与する方法は、本発明の任意のポリペプ
チドの免疫感作有効量を鶏に投与することによって行わ
れる。 本明細書ではＮＡ４蛋白質またはＮＡ４抗原とも呼ばれ
る精製抗原性蛋白質は、Ｅｉｍｅｒｉａ御機構を付与す
る免疫応答を鶏に誘発することが可能である。Ｅ、　ｔ
ｅｎｅｌ　ｌａについて見出された相同性の抗原はＴＡ
４抗原と呼ばれる。ＮＡ４蛋白質は分子量約２６．００
０ダルトンで、ジスルフィド結合で結合された２個のポ
リペプチドから構成されている。このポリペプチドの一
方は、分子量約１８，０００でありＮ末端アミノ酸が遮
閉されていることが特徴的で、他方は分子債が約８，０
００であることが特徴である。両ポリペプチドのアミノ
酸配列を第１７図に示す。 Ｉ！ｉ製抗原性蛋白質は、Ｅ、ｎ０ＣａｔｒｉＸのスポ
ロシストから別個に回収することによっても製造できる
。 すなわち、抗原の回収は、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣ
ＣＮＱＨＢ８５６１によって産生される高度に特異的な
モノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４を用いた免疫
アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈殿によ
り行うことができる。別法として、蛋白質はその蛋白質
をコードするＤＮＡを適当な宿主中に導入し、宿主内に
ＤＮＡを発現させ、蛋白質を回収することによっても製
造できる。 Ｅ、ｎ０ＣａｔｒｉＸおよびＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａ感
染に対する能動免疫は、抗原性蛋白質の免疫感作有効量
を鶏に投与することにより付与される。好ましくは、蛋
白質またはそのフラグメントを適当な担体とともにワク
チンに導入し、ワクチンの適当用ωを非免疫鶏に投与す
る。 Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎ＋ａｘｉｍａの感染に対する防ｍ’
＋ｉ構を付与する免疫応答を鶏に誘導でき、本明細書に
おいては８Ｂ５蛋白質または８Ｂ５抗原とも呼ばれるさ
らに精製された抗原性蛋白質が１ｑられた。この蛋白質
は、還元性および非還元性の両５ＤＳ−ＰＡＧＥに対し
約５５，０００ダルトンの分子母を有する。 Ｅ、ｎ＋ａｘｉｍａ感染に対する防御機構を付与する免
疫応答を鶏に誘導する能力によって特徴づけられる８Ｂ
５蛋白質関連ポリペプチドを得ることもできる。 ５５．０００ダルトンの精製蛋白質抗原は、Ｅｉｍｅｒ
ｉａ　ｍａｘｉｍａのメロゾイトからそれを分離回収す
ることによって製造できる。好ましい一態様においては
、回収は、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８
９４６に：よッテ産生１’Ｌるモノクロナール抗体Ｐｍ
ｘ４７．８Ｂ５を用い、免疫吸着クロマトグラフィーま
たは免疫沈殿で実施される。 ［、ｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫は、５５，００
０ダルトン蛋白質抗原またはその蛋白質抗原の抗原性ポ
リペプチドフラグメントの免疫感作有効量を鶏に投与す
ることによって付与できる。好ましくは、蛋白質または
ポリペプチドを適当な担体とともにワクチンに導入し、
ワクチンの適当用量を鶏に投与する。 Ｅ、ｎ＋ａｘｉｍａ感染に対する受動免疫を付与するに
は、モノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５またはこの
種の任意の他の抗体を、好ましくは適当な担体と況合し
て使用できる。さらに、モノクロナール抗体に対する抗
イデイオタイプ抗体を産生させ、Ｅ、ｍａｘｉｍａ感染
に対する能動免疫の付与に用いることもできる。抗イデ
イオタイプ抗体は、適当な担体とともに、ワクチンの形
で投与することが好ましい。 本発明はさらに、Ｅｉｍｅｒｉａ属抗原またはエピドー
プに対する抗体の産生をワクチン投与動物に誘発するの
に有効な最の任意の［ｉｍｅｒｉａ抗原またはエビ１〜
−プの混合物を１回投与ＲとしたＥｉｍｅｒｉａが原因
となる疾患に対する多成分ワクチンに関する。ワクチン
にはまた、医薬的に許容される担体を加えることもでき
る。 ある。これらは、少なくとも１個のＥｉｍｅｒｉａエピ
ドープを包含する遺伝子操作抗原性融合ポリペプチドで
あってもよい。 発明の詳細な記述 第５図に示した核酸配列を有し、ＥｉｍｅｒｉａｔＱｎ
（３１１ａから誘導される抗原性蛋白質をコードするゲ
ノムＤＮＡ分子が単離された。天然の蛋白質は分子量約
２５．０００ダルトンで、ジスルフィド結合によって結
合された２個のポリペプチドから構成される。ポリペプ
チドの一方は、分子量約１７．０００ダルトンで、遮閉
されたＮ末端アミノ酸が特徴的であって、第５図に示す
アミノ酸配列を有する。他方のポリペプチドは分子量約
８゜０００ダルトンで、第５図に示すアミノ酸配列を有
する。 分子量約２５．０００ダルトンで、第７図に示す連続ア
ミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコードするｃ
ＤＮＡまたはｍＲＮＡである核酸分子も単離された。 本明細書で使用する「抗原性ポリペプチド」の詔には、
本明細書に述べるような非還元条件下で￥Ｊ　Ｂされる
プレバレージョンで、そのプレバレージョン中に還元条
件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥで一定の見かけの分子団を有
するポリペプチドの存在によって特徴づけられるプレバ
レージョンを包含する。このようなプレバレージョン中
に存在する場合、ポリペプチドは他の１個または２個以
上の成分たとえば他のポリペプチドと１個または２個以
上のジスルフィド結合で結合していてもよく、あるいは
そのポリペプチド内の２個またはそれ以上の領域でたが
いにたとえばジスルフィド結合で結合していてもよい。 プレバレージョン内に還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで
１８，０００またはそれ以下の見かけの分子量をもつポ
リペプチドが存在するプレバレージョンの場合、このプ
レバレージョンが完全な抗原性蛋白質内に含有されるア
ミノ酸配列を包含するとの仮定で、このようなプレバレ
ージョンを記述するのにも「フラグメント」の語を使用
する。さらに「フラグメント」の語は、抗原性蛋白質か
ら蛋白分解消化で誘導されるアミノ酸配列に対しても使
用される。 約２５．０００ダルトン未満の分子量をもつ抗原性ポリ
ペプチドと、第５図に示す核酸配列を有するＤＮＡによ
ってコードされる蛋白質のアミノ酸配列内に包含される
アミノ酸配列とをコードするＤＮＡ分子が意図される。 このＤＮＡ分子は他のアミノ酸配列をコードする付加的
ＤＮＡをもっていてもよく、この場合、ポリペプチドの
分子量は付加的アミノ酸配列の分子量によって増大づる
。 約２５，０００ダルトン以上の分子量をもつ抗原性ポリ
ペプチドをコードし、本発明のゲノムＤＮＡ分子と他の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ分子が
意図される。 約２５．０００ダルトン未満の分子量をもつ抗原性ポリ
ペプチドと第７図に示す核酸配列を有するＤＮＡによっ
て］−ドされるポリペプチドのアミノ酸配列内に包含さ
れるアミノ酸配列とをコードするＤＮＡ分子が意図され
る。このＤＮＡ分子は他のアミノ酸配列をコードする付
加的ＤＮＡをもっていてもよく、この場合、その分子量
は付加的アミノ酸配列の分子量によって増大する。 本発明は、約２５．ＱＯＯダルトン以上の分子量をもつ
抗原性ポリペプチドをコードし、第７図に示す核酸分子
と他のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
からなるＤＮＡ分子を提供する。 組換えクローニングビークルは、クローニングビークル
ＤＮＡと本発明のｃＤＮＡからなる。り［」−ニングビ
ークルは第１および第２の制限酵素部位の存在によって
特徴づ【プられ、ｃＤＮＡは上記部位中にクローン化さ
れる。本発明の、ｐＴｃＤ２６と命名されたｃＤＮＡク
ローンを含有し、約２５，０００ダルトンの分子量をも
つ抗原性ポリペプチドと第７図に示すアミノ酸配列をコ
ードするクローニングビークルが構築された。 クローニングビークルは細菌宿主細胞の形質転換に使用
することができる。大腸菌宿主細胞ＪＭ８３はこのクロ
ーニングビークルで形質転換され、この菌株はＪＭ８３
／ｐＴＣＤ２６と命名された（ＡＴＣＣ登録番号第５３
３１５号）。 本発明は、適当な宿主細胞に導入した場合、２５．００
０ダルトンの抗原性蛋白質を発現づ−ることができ、適
当なキャリアーＤＮＡと第５図に示すゲノムＤＮＡから
なる発現ベクターを提供する。 本発明のゲノムＤＮＡを運搬する発現ベクターの場合、
適当な宿主細胞としては真核細胞すなわち酵母細胞また
は浦乳類細胞がある。ほかに適当な宿主細胞は細菌宿主
細胞すなわち大腸菌がある。 さらに、適当な宿主細胞中に導入した場合、約２５．０
００ダルトン未満の分子量をもつ抗原性ポリペプチドを
発現可能な発現ベクターも意図される。このベクターは
適当なキャリアーＤＮＡと約２５．０００ダルトン未満
の分子量をもつ抗原性ポリペプチドおよび第５図または
第７図に示す核酸配列を有するＤＮＡによってコードさ
れる蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるアミノ酸配列
“をコードするＤＮＡからなる。非キャリアーＤＮＡは
他のアミノ酸配列をコードする付加的ＤＮＡをもってい
てもよく、この場合にはポリペプチドの分子量は付加的
アミノ酸配列の分子量によって増大する。 適当なキャリアーＤＮＡとしては、真核細胞の形質転換
に使用するために本発明のゲノムＤＮＡ分子を運搬でき
る任意のＤＮＡセグメントが用いられる。適当なキャリ
アーＤＮＡの例としては真核生物ウィルス、好ましくは
通常使用される烏ウィルス、たとえばマレック病ウィル
ス、ニワトリポックスウィルスもしくは七面鳥ヘルペス
ウィルス（＋−ＩＶＴ）、またはそれらの任意の突然変
異誘導体から導かれるキャリアーＤＮＡがある。 さらに、適当な宿主細胞中に導入した場合、２５．００
０ダルトン以上の分子量をもつ抗原性ポリペプチドを発
現可能な発現ベクターも意図される。このベクターは適
当なキＡ７リアーＤＮＡと本発明のゲノムＤＮＡ分子お
よび他のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる。 適当な宿主細胞に導入した場合、２５．０００ダルトン
の抗原性ポリペプチドを発現できる細菌性発現ベクター
は、プラスミドＤＮＡと本発明のｃＤＮＡからなる。Ｎ
ａＣ，ｌａｍｂｄａ　　ｐＲおよびｔａｃプロモーター
のコントロール下にある場合、このベクターはＤＤＥＴ
ｌと呼ばれる。１ａｃおよびｔａＣプロモーターのコン
トロール下にある場合、このベクターはｐＤＥＴ２と呼
ばれる。 適当な細菌性発現ベクターは二本鎖ＤＮＡ分子で５′か
ら３′への順に、 プロモーターｄ３よびオペレーターまたはプロモーター
のみを含有するＤＮＡ配列、 所望の遺伝子のｒｒｌＮ八を宿主細胞内のリポソームへ
結合可能にするためのリポソーム結合部位を含むＤＮＡ
配列、 ＡＴＧ開始コドン、 所望の遺伝子をベクター内に、ＡＴＧ聞始コドンと同位
相で挿入するための制限酵素部位、宿主ｍ胞内での自動
複製が可能な細菌性プラスミドからの複製オリジンを含
むＤＮＡ配列、選択または同定可能な表現型の特徴を伴
う遺伝子を含有し、ベクターを宿主細胞内に置いた場合
に表現されるＤＮＡ配列、 を包含する。 本発明は、適当な細菌性宿主細胞内に導入した場合、約
２５．０００ダルトン未満の分子量を有する抗原性ポリ
ペプチドを発現可能な細菌性発現ベクターを意図する。 このベクターは、プラスミドＤＮＡと、第７図に示すア
ミノ酸配列内に包含されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡからなる。非プラスミドＤＮ
Ａはまた、他のアミノ酸配列をコードする付加的ＤＮＡ
をもっていてもよく、この場合、ポリペプチドの分子量
は付加Ｗアミノ酸配列の分子ｍによって増大する。 本発明は、適当な宿主細胞に導入した場合、約２５．０
００ダルトンのポリペプチドが他のアミノ酸配列に融合
した融合ポリペプチドの発現が可能な細菌性発現ベクタ
ーを提供する。これは、プラスミドＤＮＡと、他のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡに融合した本発明のｃＤＮ
Ａから構成される。 ベクターＤＢＧＣ２３は、分子量約１３５．０００ダル
トンで第７図に示すアミノ酸配列のアミノ末端にβ−ガ
ラクトシダーゼのアミノ酸配列が融合した抗原性融合ポ
リペプチドをコードする。 ベクターｐｃＯｃ１２は、分子量約６５．０００ダルト
ンで第７図に示すアミノ酸配列のアミノ末端にプロキモ
シンのアミノ酸配列が融合した抗原性融合ポリペプチド
をコードする。 ベクターｐｃＯｃ２ｃｌ、分子ｆｆｉ約５６．５００ダ
ルトンで第７図に示すアミノ酸配列のアミノ末端にプロ
キモシンの天然配列から８３個のアミノ酸が欠失したア
ミノ酸配列が融合した抗原性融合ポリペプチドをコード
する。 本発明の細菌性発現ベクターは大腸菌宿主細胞の形質転
換に使用された。ＲＥＮ３／Ｉ）ＢＧＣ２３と命名され
た大腸菌宿主細胞はベクターｐＢＧＧ２３を（ＡＴＣＣ
登録番号第５３３１４１　、ＲＥＮ３／ｐＣＯＣ２０，
！−命名さｔした大腸菌宿主細胞はベクターｐｃＯｃ２
０を（ＡＴＣＣ登録番号第５３３１３号）　、ＲＥＮ３
／ｐＤＥＴ１と命名された大腸菌宿主細胞はベクターｐ
ＤＥＴ１を（△ＴＣＣ登録番号第５３３１６号）　、Ｒ
ＥＮ３／ｐＤＥＴ２と命名された大腸菌宿主細胞はベク
ターｐＤＥＴ２を（ＡＴＣＣ登録番号第５３３１８号）
含有する。 抗原性ポリペプチドの製造は、本発明の任意の宿主細胞
をＤＮＡの発現、ポリペプチドの産生が可能な適当な条
件下に生育させ、生成したポリペプチドを適当な条件下
に回収することによって行われる。回収工程はまず、ポ
リペプチドを宿主細胞から分離し、ついでそれを精製し
、それを可溶化し、それを再生し、最後に、精製、可溶
化、再生された抗原性ポリペプチドを回収することによ
り行われる。 Ｅｉｍｅｒｉａ　　ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能動免
疫を鶏に付与する方法は、本発明の任意のポリペプチド
の免疫感作有効全を鶏に投与するものである。ポリペプ
チドは２種またはそれ以上のポリペプチドの任意の組合
せで投与することもできる。 Ｅｉｍｅｒｉａ　　ｔｅｎｅｌ１８の感染に対する能動
免疫を鶏に付与するワクチンは、本発明のポリペプチド
任意の１種の免疫感作有効量と適当な担体を１回用０と
したものである。ワクチンは、本発明の２種またはそれ
以上のポリペプチドの組合せと適当な担体からなるもの
であってもよい。一実施態様においては、ワクチンに用
いられるポリペプチドは分子量約１３５．，０００ダル
トンで第７図に示すアミノ酸配列のアミノ末端にβ−ガ
ラクトシダーゼのアミノ酸配列が融合した融合ポリペプ
チドである。他の実施態様においては、ワクチンに用い
られるポリペプチドは分子量約６５．６００ダルトンで
第７図に示すアミノ酸配列のアミノ末端にプロキモシン
のアミノ酸配列が融合した融合ポリベブチドである。 Ｅｉ＋ｎｅｒｉａ　　ｔｅｎ０１１ａ感染カラノ鶏の防
ｔａｃｔ　ハ、本発明の任意のワクチンの適当用量を鶏
に投与する方法で行われる。 プラスミドｐＤＴＥ１は、２５．０００ダルトンのポリ
ペプチドを１　ａ　ｃ　、　Ｉａｍｄａ　ＰＲおよびｔ
ａＣブラモーターのコントロール下にコードする。プラ
スミドｏＤＴＥ２は、２５．０００ダルトンのポリペプ
チドを１ａｃおよびｔａｃプロモーターのコントロール
下にコードする（第８図）。 ｐＤＥＴ１／ｐＤＥＴ２蛋白質の最大収率は、プロテア
ーゼ欠損大腸菌株において達成されたく第９図）。Ｉ）
ＤＥＴＩおよびｐＤＥＴ２蛋白質は、細胞溶解物の不溶
性分画に認められた。 プラスミドｐ［３ＧＧ２３は大腸菌β−ガラクトシダー
ゼの暗号配列の３′末端をｃＤＮＡ誘導Ｔ誘導ポリペプ
チドの暗号配列の５′末端に融合させることによって構
築され、約１３．５．ＯＯＯダルトンの融合ペプチドを
コードする（第１０図）。ｐＢＧＣ２３蛋白質は、大腸
菌中で安定であるが、不溶性である（第１１図）。 プラスミドｐｃＯｃ１２は、ウシプロキモシンの暗号配
列の３′末端をｃＤＮＡ誘導ＴＡ４ボリベブヂドの暗号
配列の５′末端に融合することによって構築され、約６
５．６００ダルトンの融合蛋白質をコードする。プラス
ミドｐｃＯｃ２０は、ｐｃＯｃｌ　２から、融合蛋白質
のプロキモシン領域中の欠失により構築され、約５６，
５００ダルトンの融合蛋白質をコードする（第１３図）
。 ｐｃＯｃｌ２およびｐｃＯｃ２０蛋白質は大腸菌内で安
定であるが、不溶性である（第１４図）。 不１性（１）、細菌産生ＴＡ４蛋白質はＥ、ｔｅｎｅｌ
ｌａ種虫対して産水虫れる中和モノクロナール、Ｐｔｎ
７．２Ａ４／４と免疫反応性を示さなかった。ｐＢＧＧ
２３およびｐｃＯｃｌ　２からの不溶性蛋白質をマウス
に注射しても、Ｅ、ｔｆｌｉｎｅｌｌａから精製された
ＴＡ４抗原と交差反応する抗体は産生されなかった。 本発明はまた、細菌産生ＴＡ４蛋白質を不溶性状態から
抽出する方法およびその蛋白質をモノクロナール抗体Ｐ
ｔｎ７．２Ａ４／４と免疫反応性にする方法を提供する
。それは、蛋白質を８Ｍ尿素中に可溶化し、ついで希釈
して、アルカリ性ｐＨ（Ｄｌｌｌｌ）で再生し、ｐＨ８
，３に逆滴定する方法である。別法として、蛋白質を８
Ｍ尿素中に可溶化し、尿素を透析で除去してもよい。 尿、素−アルカリ可溶化／再生過程をｐｃＯｃ１２蛋白
質に対して用いた場合、再生蛋白質は凝乳活性とモノク
ロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４との免疫活性の両者
を示した。再生条件は１）ＣＯＣ１２蛋白質を用いて至
適化した。 ｆ）ＣＯＣ２０蛋白質およ［ＦｐＢＧＣ２３蛋白質につ
いての至適再生条件もｐＣＯＣ１２の場合と同じである
ことが明らかになった。一方、ｐＤＥＴ２蛋白質の場合
、至適再生条件はアルカリ性１）Ｈでの尿素透析であっ
た。 再生ｐＢＧｃ２３およびｏｃＯｃ１２蛋白質はマウスに
抗体を誘導し、これはＥ、　ｔｅｎｅ！ｌ　Ｉａから精
製したＴＡ４抗原と反応した。鶏を再／ＪｐＢＧＣ２３
およびｐｃＯｃ１２蛋白質で免疫感作したところ、Ｅ、
ｔｅｎｅ＋＋ａの水虫に対する血清中和抗体を誘導し、
Ｅ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａをチャレンジした鶏でコクシジ
ウム症を緩和した。 本発明はまた、細菌性再生ＴＡ４蛋白質を鶏に投与する
ことによる、Ｅｉｍｅｒｉａ　　ｔｅｎｃｌｌａ感染に
対する能動免疫を鶏に付与する方法を包含する。 この方法により、非免疫鶏に能動免疫を付与することが
できる。さらに、これらの物質の投与は、以前にＥ、　
ｔＱｎｅｌ　Ｉａに曝露された鶏における比較的低レベ
ルの免疫を増強するのに、また追加予防接種に用いるこ
とができる。 細菌性ＴＡ４蛋白質は、公知の任意の方法で鶏に投与す
ることができる。望ましい投与方法には、皮下、腹腔内
、もしくは頚背部への筋肉内性ｑ４、または任意の慣用
の形式の経口投与がある。抗原の免疫感作有効ｍは、約
０．１μ３〜約３〜ｒｔｇの任意の黴である。望ましい
抗原分は約１０μＵ以上である。好ましい抗原ｎは体重
Ｉ　Ｋｇあたり約５００μ９である。また、投与は経口
でも（たとえばカプセルによる）、注射（たとえば、皮
下、皮肉、また好ましくは筋肉内注射）でもよい。 投与方法が注Ｉ３１の場合には、任意の医薬的に許容さ
れる担体が使用できる。適当な担体には０．０１〜０．
１Ｍ　　好ましくは０．０５Ｍリン酸緩′ｆＪ液、また
は０．８％ｆ１塩水がある。 ［ｉｍｅｒｉａ　ｔｏｎｏｌｌａ感染に対する能動免疫
をａに付与するためのワクチンは、本発明の抗原性物質
、すなわち細菌性再生ＴＡ４蛋白質の免疫感作有効量と
適当な担体からなる。ワクチン中の抗原性物質の免疫感
作有効量は、鶏の体重Ｉ　Ｋ９あたり約０．１μＪ以上
が好ましい。 さらに、担体には防腐剤も添加することが望ましい。と
くに適当な防腐剤はチメロサール（エチル水銀チオサリ
チル酸ナトリウム）であり、これは細菌および徴の両者
の発育阻止活性を有する。 ワクチン中にチメロサールを最終濃度が１０−４％にな
るように添加するのが好ましい。 さらに、担体は、免疫増強剤、すなわち処置動物のワク
チンに対する免疫応答を増強する物質を含有づることか
望ましい。たとえばＳａ１ｍＯｎ０１１ａ＋＋１ｉｎｎ
（！５Ｏｔａ　Ｌ　Ｐ　Ｓを１用吊あたり１０μＪ加え
る。 本技術分野で公知の各種免疫増強剤が使用である。 現在用いられているアジュバン１〜としては９４％Ｄｒ
ａｋｅｏｌ　　６−　Ｖ　Ｒ、５％へｒｌａｃｅｌ　　
Ａ、　　１　　％Ｔｗｃｅｎ８０がある。Ａｒ１ａＣｅ
ｌ　Ａはマニツドモノオレエ−ｔ−（Ｓａｎｄｎｉａ　
Ｃｏｒｐ、　）であり、抗原と合したときに強力な免疫
増強剤活性を示す。Ｄｒａｋｅｏｌ　　６−ＶＲは低ア
レルギー性の軽鉱油製品（ｐｅｎｒｅｃ。 Ｃｏｒｐ、　）である。Ｔｗｅｅｎ　８０はポリオキシ
エチレンソルビタンのモノオレエート誘導体で、界面活
性作用を有する。その他の適当な担体または免疫増強剤
としては、硫酸カルシウム、水酸化アルミニウム、オキ
シン分子のリガンド発党サブユニット、パオオアドヘツ
シブ、リンホカインおよび水中孔乳化液が包含される。 このＪ：うなワクチンの適当用量を鶏に投与することに
より、鶏はＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａの感染に対して防御
される。１回あたりの抗原性物質の川沿は、投与された
動物に抗原性物質に対する抗体の産生を誘発するのに十
分な世でなければならない。抗体の産生Ｊ３よび防御か
ら判断して十分な免疫応答を得るためには、抗原性物質
の１回投与量は望ましくは、予防接種動物の体重Ｉ　Ｋ
９あたり約２０．０Ｍ３以上である。すなわち、１日齢
、５０ｇのヒナの場合の抗原性物質の徂は約１．０Ｍ９
以上である。現時点では、抗原性物質１０μ９を含有す
るワクチンが好ましい。一般的に、抗原はｔ４ｆｆｉベ
ースでワクチンの約０．００２％から約０．２％までと
し、用量は約０．１ｄとなる。 本発明はまた、分子量約２６．０００ダルトンで、ジス
ルフィド結合で結合した２個のポリペプチドから構成さ
れ、一方のポリペプチドは分子量約１８．０００でＮ末
端アミノ酸が遮閉されていることを特徴とし、他方のポ
リペプチドは分子量約８，０００ダルトンであって、Ｅ
ｉｍｅｒｉａｎＯｃａｔｒｉＸの感染に対する防御機構
を付与する免疫応答を鶏に誘発できる精製抗原性蛋白質
（以下Ｎ△４と呼ぶ）を提供する。 ２６．０００ダルトン抗原性蛋白質またはその１８、Ｏ
ＯＯグル１ヘンおよび８．０００ダルトンポリペプチド
成分の抗原性類縁体も本発明に包含される。本明細書に
おいて用いられる「類縁体」の詔は、アミノ酸配列が第
１７図に示した２６゜ＯＯＯダルトン蛋白質ならびに１
８，０００および８．０００ダルトンポリペプチドにつ
いて記載した配列とは、１種または２種のアミノ酸のｎ
換の結果、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
意味する。このような類縁体は、それがＥ、ｎ（３Ｃａ
ｔｒｉＸまたはＥ、　ｔｅｎｅｔ　Ｉａに対する防御を
イｑ与する免疫応答を誘発できる抗原性を保持している
限り、本発明に包含される。 ＮＡ４蛋白質は、まずＥｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉ
Ｘノスボロシストを適当な非還元条件下、プロテアーゼ
阻害剤の存在下に界面活性剤と接触させて、スポロシス
ト膜蛋白質を可溶化することによって製造される。次に
、可溶化したスポロシスト膜蛋白質から、適当な非還元
条件下に、所望の蛋白質を分離回収する。回収は、可溶
化スポロシスト膜蛋白質を、適当な非還元条件下に、Ｄ
ＥＡＥ−ＨＰＬＣクロマトグラフィ一ついでプレパラテ
イブＳＤＳゲル電気泳動によって部分積［ることにより
行われる。回収はまた、モノクロナール抗体ｐｔｎ７．
２Ａ４／４　（ＡＴＣＣ第トＩＢ８５６１号）を用いた
免疫沈殿また免疫アフィニティークロマトグラフィーに
よっても実施できる。 本発明は、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉＸおよびＥ
ｉｍｅｒｉａｔｏｎｆ３＋１８感染に対する防１１１ｍ
構を付与する免疫応答を鶏に誘導でき、２６．０００ダ
ルトンＮＡ４蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。このような
ポリペプチドは、ＮＡ４蛋白質からの抗原性決定基を含
有し、免疫応答を誘発できるすべてのアミノ酸配列を包
含する。このポリペプチドの類縁体およびそのポリペプ
チドに対するモノクロナール抗体も、本発明に包含され
る。さらに、そのモノクロナール抗体に対する抗−イデ
ィオタイプ抗体ら、本発明に包含される。 ＮＡ４蛋白質中に存在するアミノ酸配列を包含する抗原
性ポリペプチドは、各種の方法によって製造できる。た
とえば、化学的にもしくは酵素的に合成、組換えＤＮＡ
法によって生産、ＮＡ４抗原から製造またはＥ、ｎｅｃ
ａｔｒｉｘのスポロシス１〜もしくは水虫から製造でき
る。 本発明の抗原は、ＮＡ４蛋白質のアミノ酸配シ１内に包
含されるアミノ酸配列のほかに、１種または２種以上の
伯の物質、すなわち、ポリザラカライドたとえばデキス
トラン、または他のアミノ酸配列たとえば第１７図に示
されたアミノ酸配列に含まれないアミノ酸配列を含有す
ることもできる。 また、２６．０００ダルトンＮＡ４蛋白質のアミノ酸配
列とさらに付加的アミノ酸配列を有し、Ｅｉｎ＋ｅｒｉ
ａ　ｎｅＣａｔｒｉＸおよびＥｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅ
ｌｌａの感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏
に誘導可能な、融合抗原性ポリペプチドも本発明に包含
される。このポリペプチドの類縁体、それに対するモノ
クロナール抗体も本発明に包含される。さらに、このモ
ノクロナール抗体に対する抗イデイオタイプ抗体も本発
明に包含される。 ＮＡ４抗原の１８．０００ダルトンポリペブチ適当な条
件下、プロテアーゼ阻害剤の存在下に界面活性剤と接触
させて、スポロシスト膜蛋白質を可溶化させる。ついで
、可溶化したスポロシスト膜蛋白質からポリペプチドを
適当な還元性条件下に、分離回収する。この回収工程に
は、可溶化スポロシスト膜蛋白質の、適当な還元性条件
下でのＤＥ、ＡＥ−ＨＰＬｃクロマトグラフィ一ついで
プレバラテイブＳＤＳゲル電気泳動による部分精製が包
含されてもよい。 本発明は、それ自体Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉＸ
およびＥｉｍｅｒｉａ　ｔＱｎｅｌｌａの感染に対する
防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘導できるＮＡ４抗
原の１８゜ＯＯＯダルＩ・ンボリペブチドのアミノ酸配
列を有する抗原性ポリペプチドを包含する。また、１８
゜ＯｏＯダルトンポリペプチドのフラグメントである抗
原性ポリペプチドまたは、１８．０００ダルトンポリペ
プチドに付加的アミノ酸配列が融合した抗原性ポリペプ
チドも本発明に包含される。これらのフラグメントそれ
ぞれの抗原性類縁体、ならびにそれぞれのフラグメント
に対して産生ずる抗−イディオタイプ抗体も、本発明に
包含される。 ＮＡ４蛋白質の他の製造方法としては、その蛋白質をコ
ードするＤＮＡ分子の製造、そのＤＮＡ分子の適当な発
現ベクターたとえばＰＬもしくはＺａＣプロモーターを
含むベクター中への挿入、得られた発現ベクターの適当
な宿主細胞たとえば大腸菌への、ＤＮＡの発現および蛋
白質の産生を可能にする適当な条件での導入、および産
生蛋白質の回収による方法がある。 ＮＡ４抗原の１８．０００ダルトンポリペプチドの他の
製造方法としては、このポリペプチドをコードするＤＮ
Ａの製造、このＤＮＡ分子の適当な発現ベクター中への
挿入、得られた発現ベクターたとえばＰＬまたは１ａＣ
プロモーター含有ベクターの、そのＤＮＡの発現および
蛋白質の産生を可能にする適当な条件下での適当な宿主
細胞たとえば大腸菌への導入、および産生蛋白質の回収
による方法がある。 胞子形成過程の多くの時点で、スポロシス１〜からメツ
センジャーＲＮ△を単離することができる。 これらのｍＲＮへサンプルは、ついで、ｉｎ　Ｖｉｔｒ
Ｏ（４４）またｉｎ　ｖｉｖｏ系を用いて翻訳すること
ができる。次に、翻訳生成物を、モノクロナール抗体（
１）　ｔ　ｎ　７　、２　Ａ　４　／　４　）を用いて
免疫沈殿させる。ＮＡ４抗原をコードするｍＲＮＡプレ
バレージョンを用いて、次に、二本鎖ｃＤＮＡを製造す
る（４４）。このｃＤＮＡを適当なクローニングベクタ
ーに挿入し、これを用いて大腸菌を形質転換し、ｃＤＮ
Ａライブラリーを発生させる。このｃＤＮＡライブラリ
ーを、ＮＡ４抗原の１８゜ＯＯＯダルトンポリペプチド
成分からのアミノ酸配列情報に基づいて構築された同位
元素標識オリゴヌクレオチドプローブを用い、コロニー
ハイブリダイゼーション法によってスクリーニングする
。 １８．０００ダルトンポリペプチドに対するヌクレオチ
ド配列を含む細菌コロニーからベクター［）ＮＡを１１
１ｍし、挿入されたコクシジウムＩ）ＮＡの配列を決定
する。 本発明はまた、ＮＡ４抗原の８．０００ダルトンポリペ
プチドのアミノ酸配列を有し、ＥｉｍｅｒｉａｎｅＣａ
ｔｒｉＸまたはＥｉｌｌｌｅｒｉａ　ｔｅｎｃ＋＋ａ感
染に対する防ｔｉｌ１機構を付与する免疫応答を鶏に誘
導できる抗原性ポリペプチドを提供する。また、８，０
００ダル１〜ンボリベブヂドのフラグメントである抗原
性ポリペプチドまたはａ、ｏｏｏダルトンポリペプチド
が付加的アミノ酸配列に融合した抗原性ポリペプチドを
提供する。これらのフラグメンｌ〜それぞれの抗原性類
縁体、ならびに各フラグメントに対するモノクロナール
抗体を提供する。モノクロナール抗体に対する抗イデイ
オタイプ抗体も本発明に包含される。 Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘもしくＥｉｍｅｒｉ
ａ　ｔｅｎｅｌｌａ　、またはその両者による感染に対
する能動免疫を鶏に付与する方法は、ＮＡ４蛋白質、１
８．０００ダルトンポリペプチド、８．０００ダルトン
ポリペプチド、それらのフラグメント、それらの融合生
成物またはそれらの類縁体の免疫感作有効０を鶏に投与
するものである。これらの各種抗原それぞれは、単独に
または他の抗原１種もしくは２種以上と組合せて使用さ
れる。これらの物質の投与は、以前にＥ、ｔ（３ｎ［！
ｌｌａまたはＥ、　ｎｅｃａｔｒｉｘに曝露されたこと
がある鶏の比較的に低レベルの免疫を増大させるため、
および追加予防接種のために、使用できる。 本発明のＮＡ４抗原または任意の抗原性ポリペプチドは
、任意の公知の方法によって鶏に投与することができる
。望ましい投与方法としては、歯頚部の皮下または筋肉
的注射がある。抗原の免疫感作有効吊は、約０．１μ３
〜約１１ｆＩの任意のｍである。抗原のＲは約１０μ３
以上であることが望ましい。好ましい抗原ｍは鶏の体ｆ
ｆｉ　Ｉ　Ｋｇあたり約５００μりである。また、投与
は、経口（たとえばカプセルによる）または望ましくは
注射（たとえば皮下、皮肉、また好ましくｔよ筋肉的注
射）によって行われる。投与方法が注射である場合、任
意の医薬的に許容される担体が使用できる。適当な担体
としては、０．０１〜０．１Ｍ好ましくは０．０５Ｍリ
ン酸塩緩衝液または０．８％食塩水を挙げることができ
る。 Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎａｃａｔｒｉｘもしくはＥｉｍｅｒ
ｉａ　ｔｅｎｅｌｌａまたはその両者の組合による感染
に対して鶏に能動免疫を付与するためのワクチンは、１
用撮あたり、ＮＡ４蛋白質、ｉｓ、ｏｏｏダルトンポリ
ペプチド、ｓ、ｏｏｏダルトンポリペプチド、それらの
フラグメント、それらの融合蛋白質、またはそれらの類
縁体の免疫感作有効量と、適当な担体からなる。各種抗
原はそれぞれ、ｌド独にまたは他の抗原１種もしくは２
種以上の組合せで使用できる。 免疫感作有効ｍは通常、鶏Ｉ　ＫＢあたり約０．１Ｍ９
以上である。Ｅｉｎ＋ｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｔｘもし
くはＥｉｍＱｒｉａ　ｔｅｎｅ＋＋ａのいずれかまたは
両者の組合せによる感染に対して鶏を防御する方法は、
このワクチンの適当伍を鶏に投与することである。 このようなワクチン適当用量を鶏に投与することにより
、鶏をＥ、ｎｅＣａｔｒｉＸまたはＥ、　ｔｅｎｅｌ　
ｌａ感染に対して防御される。１用量あたりの抗原物質
量は、ワクチン投与動物に抗原性物質に対する抗体の産
生を誘導するのに十分な届でなければならない。抗体産
生および防御効果の点からみて十分な免疫応答を与える
には、１用伍あたりの抗原性物質の渚は予防接種動物の
体重１　Ｋ９あたり約２０．０μ９以上が望ましい。す
なわち、５０ｇの１日齢ヒナの場合の抗原性物質伍は約
１．０μび以上である。現時点では、抗原性物質１０μ
ｑを含有するワクチンが好ましい。一般的に、抗原はワ
クヂン中約０．００２重伍％から０．２重囲％の割合で
添加され、投与容９は約０．１ｍｅとなる。 本発明はまた、ＮＡ４蛋白質をコードし、第１７図に示
した核酸配列を有する核酸分子を提供する。さらに、Ｎ
Ａ４の少なくとも１種の蛋白質をコードするｃＲＮＡお
よびｍＲＮＡを提供する。 これらの核酸分子はクローニングビークル中に挿入され
、これが適当な宿主細胞に中に挿入される。 適当な宿主細胞は真核細胞、たとえば酵母細胞または哺
乳類細胞である。 本発明はまた、ＮＡ４蛋白質をコードするｃＤＮＡ分子
の少なくとも部分とクローニングベクターＤＮＡからな
る組換えクローニングベクターを提供する。クローニン
グベクターは第１および第２の制限酵素部位の存在を特
徴とする。 ｃＤＮＡはこれらの部位の間にクローン化される。 組換えクローニングベクターＤＮＡはブラミドＤＮＡと
することができる。さらに、宿主細胞は細菌性細胞とす
ることができる。 プラスミドＤＮＡと、ＮＡ４をコードするｃＤＮＡ約９
０％からなる組換えクローニングベクターが構築され、
ＤＳＭＡＣと命名された。このプラスミドで形質転換さ
れた大腸菌宿主細胞はＪＭ８３／ｐＳＭΔＣと命名され
、ＡＴＣＣに登録番号第６７　２４１号で寄託されてい
る。同じ＜ＮＡ４をコードするｃＤＮＡ約９０％を包含
する他の組換えクローニングベクターも構築され、ｐＳ
Ｓ３３と命名された。このベクターで形質転換された大
腸菌宿主細胞はＪＭ８３／ｐＳＳ３３と命名され、ＡＴ
ＣＣに登録番号第６７　２４２号として寄託されている
。蛋白質ＮＡ４をコードするｃＤＮＡ約１００％を包含
する組換えクローニングベクターがさらに構築され、Ｄ
ＮＣＤと命名された。このプラスミドは大腸菌宿主細胞
の形質転換に使用され、これはＪＭ８３／ｐＮｃＤと命
名され、ＡＴＣＣに登録番号第６７２６Ｃ１として寄託
された。 本発明はまた、組換え発現ベクターを提供する。 その一実施態様においては、ＮＡ４蛋白質の少なくとも
部分と他のアミノ酸配列からなる融合ポリペプチドを可
能にする組換え発現ベクターがある。 このような発現ベクターが構築され、ｐＴＤＳｌ、ｐＴ
Ｄｓ２、ＤＤＤＳＩおよびｐＤＤｓ２と命名された。こ
れらのプラスミドは大腸菌細胞の形質転換に使用され、
それぞれＭＨ１／ｐＴＤＳ１、Ｍ　ｌ−１１／　ｐＴ　
Ｄ　Ｓ　２、ＭＨＩ／ｐＤＤＳ１およびＪＭ８３／ｐＤ
ＤＳ２と命名され、ＡＴＣＣに登録番号第６７　２４０
号、第６７　２６４号、第６７　２４３号および第６７
　２６５Ｍとして寄託されている。 ＮＡ／Ｉ蛋白質の製造方法は、上述のクローニングベク
ターを、蛋白質の産生を可能にする適当な条件下に挿入
された宿主ｍ胞を生育させ、生成した蛋白質を回収する
ものである。 本発明はまた、ＮＡ４蛋白質とほぼ同じアミノ酸配列を
有するが、細菌または他の異種宿主内での発現のために
相違する蛋白質をも包含する。 ざらに−態様として、ＮＡ４抗原の主たる保護的構造と
共通の空間的特徴を有する部分構造で、前述の抗原を置
換することもできる。このような組成物の例としては、
ＮＡ４蛋白質または本発明の抗原性ポリペプチドの１種
に対する抗体、たとえばモノクロナール抗体Ｐｔｎ７．
２Ａ４／４で、その構造がそれぞれの抗原決定基に対す
る特異性を付与する抗体の構造に対して産生ずる抗イデ
イオタイプの抗体が包含される。このような抗イデイオ
タイプ抗体はモノクロナール抗体とすることもできるし
、ポリクロナール抗体として産生きせることもできる。 前者の例としては、抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４はハイブ
リドーマ細胞系ＡＴＣＣＮ（ｌＨ８Ｂ５６１から回収さ
れ、精製され、任愈の適当なキャリアー蛋白質たとえば
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共有結
合で（＝Ｊ着させる。精製された抗体、好ましくは精製
された抗体−Ｋ　Ｌ　Ｈ複合体を、好ましくはフロイン
ト完全アジュバントのようなアジュバントとともに、適
当な咄乳類すンパ球ドナー好ましくはＢａｊ！ｂ／Ｃ系
マウスに、反復注射する。免疫処首マウスのリンパ球か
らハイブリドーマが発生する。 ハイブリドーマを、モノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ
４／４との反応ではＮＡ４抗原と競合するが、ＮＡ４抗
原もＰｔｎ７．２Ａ４／４以外のげつ肉類免疫グ１コブ
リンも認識しない抗体についてスクリーニングした。モ
ノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４に対する抗−イ
ディオタイプ抗体を分泌するハイブリドーマをさらに増
殖させ、クローン化する。抗−イディオタイプ抗体の製
造は、ハイブリドーマの生育およびモノクロナール抗体
の発現に適当なメジウム中での細胞培養、または好まし
いビークルとしてＢａｆｂ／Ｃマウスを用いた抗体産生
ハイブリドーマの宿主動物中での生育によって実施され
る。 抗−イディオタイプ抗体はまた、動物へのＰｔｎ７．２
Ａ４／４の注射によっても製造できる。好ましい一方法
は、精製したＰｔｎ７．２Ａ４／４．５００μ３を適当
なアジュバン１〜たとえば完全フロインドアジュバント
中に処方化し、適当な動物たとえばウサギに反復注射す
る方法である。十分に注射したのち、適当な期間後に動
物から血清を採取する。ついで、抗イデイオタイプ抗体
を血清から、たとえば５ｅｐｈａｒｏｓｅ■のような不
溶性支持体に固定化した正常マウス血清に吸着させて回
収した。１ｑられた抗血清の特異性は、モノクロナール
抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と反応性を示すが正常げつ歯
頚抗体に対して反応しないことで確認される。 上述のようにして製造された抗−イディオタイプ抗体を
さらにＩｑＧフラクションのレベルまで精’ＩＴる。精
製した抗−イディオタイプ抗体は、抗原の場合に記述し
たと同様、任意の公知方法で投！ｊすることができる。 本発明の抗イデイオタイプ抗体の有効♀を鶏に投与する
と、これがＥｉｍｅｒｉａ　ｎｃｃａｔｒｉｘまたはＥ
ｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能動免疫を
鶏に付与する方法になる。この目的でのワクチンは抗−
イディオタイプ抗体の免疫感作有効ｍと適当な担体から
なる。このワクチンの適当用最を鶏に投与すと、Ｅｉｍ
ｅｒｉａ　ｎｃｃａｔｒｉｘまたはＥｉｌｅｒｉａ　ｔ
ｅｎｅｌｌａ感染に対する鶏の防御方法になる。 １用量あたりの抗イデイオタイプ抗体の母はワクヂン投
与動物に抗体の産生を誘発するのに十分な量でな【プれ
ばならない。抗体の産生によって示される免疫応答の誘
発に要する１用凸あたりの抗イディオタイプ抗体量は、
予防接種する鳥の体重Ｉ　Ｋｇあたり５０μＵ以上であ
る。すなわち５（１の１日齢ヒナの場合、抗−イディオ
タイプ抗体２．５μＵが投与される。したがって、抗−
イディオタイプ抗体２５μ３を含むワクチンが好ましい
。一般的に、抗−イディオタイプ抗体はワクチン中に約
０．００２重蚤％から０．２重量％の割合で添加され、
投与容量は０．２ＣＣである。 本発明はまた、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉＸの卵
ｒｍｍ胞から全ゲノムＤＮＡを単離し、単離されたゲノ
ムＤＮ△からＤＮＡフラグメントをｌ１ｌＶし、このフ
ラグメントを適当なクローニングベクターにリゲートし
、得られたクローンのＤＮＡを第１７図に示す核配配列
内に存在する核酸配列を含むかまたはそれと相補性のオ
リゴヌクレオチドとハーブリダイゼーションさせて適当
なクローンを同定し、適当なクローンから第１７図に示
す蛋白質をコードし、その核酸配列を有するＤＮＡを単
離することによる、第１７図に示す核酸配列を有するＤ
ＮＡを（９る方法を提供する。 ＮＡ４蛋白質は、［、ｎｅｃａｔｒｉｘのスポロシスｌ
−から誘導される、精製挿出膜蛋白質である。この蛋白
質は、Ｅ、ｎｅＣａｔｒｉＸおよびＥ、　ｔｅｎｅｔ　
ｌａ小腸内寄生体の感染に対する防御別能を付与する免
疫応答を非免疫部に誘導できる抗原である。この蛋白質
はＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘから誘導されたが、この蛋白質
を他の方法、たとえば組換えＤＮＡ技術または全有機合
成によって製造することが可能である。すなわら、本発
明は直接Ｅ、ｎｅＣａｔｒｉＸから製造された蛋白質に
限定されるものではなく、その製造方法とは無関係にそ
の蛋白質自体を包含するものである。このようにして製
造された蛋白質も寄生体から精製された構造と同一であ
るか、同一の一定の７ラグメントとして存在する。それ
は相同性または非相同性配列とＮＡ４の融合体として存
在してもよい。 ざらにそれは類縁体としてまたは同一の内部イメージ（
イディオタイプ）として存在してもよい。 ＮＡ４蛋白質抗原は分子通約２６，０００であり、ジス
ルフィド結合で結合した２個のポリペプチドから構成さ
れる。このポリペプチドの一方は、分子Ｍ約１８．００
０で遮閉されたＮ末端アミノ酸が特徴的である。約１６
，０００ダルトンのＣＮＢｒフラグメントは以下の部分
アミノ酸配列：ＮＨ２Ｚ　　　′Ｌ　　Ｌｅｕ　　　？
　　　Ｌ’ｌ／Ｓ　　　ＡｌａＡｌａ　Ｇｆｌ’ｙ　　
Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　ＧｉｕＰｈｅ　　Ｇｚｙ　　Ａｓ
ｎ　　Ａｊ！ａ　　ＶａｎＧｌ　ｙ　　ヱ　　Ａｊ！ａ
　　　Ｖａ　Ｉ　　Ｖａｌ　　　１−ｅＵｐｒｏ　　Ａ
ｊ！ａ　　Ｔｙｒ　　３ｅｒを有する。８゜０００ダル
トンポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列は：Ｎｌ−１２
−Ａｊ！ａ　　Ａ！ａ　　？　　Ｔｈｒ　　？ＡＳＤ　
　Ａｊ！ａ　　Ｖａｊ！　　Ｉｊ！ｅ　　Ｃｙｓ＋−ｅ
ｕ　　　Ｔｈｒ　　　Ａｓｎ　　　Ｐｒｏ　　　△１ａ
Ｐ　ｒ　ｏ　　　Ｌ　ｅ　ｕ　　　Δ１ａ　　　Ａｊ！
ａ　　　Ｇ、ｆ！ｙＳｅｒ　　　Ｐｒｏ　　　Ｐｒｏ　
　　？　　　Ｐｈｅ　　　７Ａｓｐ　　Ｇｊ！ｕ　　？
　　Ｔｒｏである。ＮＡ４抗原をコードする遺伝子のＤ
ＮＡ配列から推測されるＮΔ４蛋白質の全アミノ酸配列
を第１７図に示す。 Ｅ、ｎｃｃａｔｒｉｘからのゲノムＤＮＡを単離し、制
限エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩで分解した。制限フラ
グメントを適当なクローニングベクター、λ−ｇｔ　　
ｗｅｓ　　λ−Ｂにリゲー１〜し、ゲノムライブラリー
を発生させた。ついで、ゲノムライブラリーを、第２図
のｃ、ｔｅｎｅ＋＋ａゲノムクローンの７８５　ｂｐＳ
　ａ　ｃ　Ｉ　−Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩフラグメントどのプ
ラークハイプリダイピージョンによってスクリーニング
した。ＮＡ４抗原をコードするゲノムクローンをｌ離し
たところ、ＤＮＡ配列は連続ヌクレオチド配列（第１７
図）によってコードされるＮＡ４抗原の２個のペプチド
を示した。１８，０００および８．０００ダルトンペプ
チドは、したがって、１本の２．６，０００ダルトンペ
プヂドの蛋白分解処理から誘導される。また、シグナル
配列をコードするＤＮＡ配列は、通常、多くの分泌また
は膜蛋白質のアミノ末端に見出される。 本発明はさらに、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａの感染
に対する防Ｉ２１１ｉ構を付与する免疫応答を鶏に誘導
できる精製抗原性蛋白質に関する。この蛋白質は分子量
約５５．０００ダルトンで、抗原性ポリペプチドからな
る。 本明細書においては８Ｂ５蛋白質または８Ｂ５抗原とも
呼ばれる５５．０００ダルトン蛋白質は、Ｅｉｍｅｒｉ
ａ　ｍａｘｉｍａのメロゾイトから得られた。この蛋白
質はＥ、ｍａｘｉｍａから誘導されたが、この蛋白質は
他の方法、たとえば粗換えＤＮＡ技術または全有機合成
によっても製造できる。すなわち、本発明は直接Ｅ、ｍ
ａｘｉｍａから製造された蛋白質に限定されるものでは
なく、その製造方法と無関係にその蛋白質自体を包含す
るものである。 本発明はまた、分子量約５５．０００ダルトン未満で、
８Ｂ５１白質内に存在するアミノ酸配列を包含し、Ｅｉ
ｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ感染に対する防御ｖ１構を付
与する免疫応答を鶏に誘導できる抗原性蛋白質を提供す
る。このポリペプチドは８Ｂ５蛋白質からの抗原決定基
を含有し、免疫応答を誘導可能な全アミノ酸配列を包含
する。 ８Ｂ５蛋白質中に存在するアミノ酸配列を含有する抗原
性ペプチドは各種方法により、たとえば化学的もしくは
酵素的合成により、組換えＤＮＡ技術により、また８Ｂ
５抗原から、またはＥ、ｍａＸｉｍａメロゾイトから製
造できる。 本発明はまた、８Ｂ５蛋白質の製造方法を１是供する。 この方法には、Ｅ、ｍａｘｉｍａのメロシイ１〜を適当
な条件下、プロテアーゼ阻害剤の存在下に界面活性剤と
接触させて、メロゾイト膜蛋白質を可溶化させる方法が
ある。ついでこの蛋白質を、蛋白質の分離および精製方
法を用いて、可溶化メロゾイト蛋白質から分離回収する
。このような方法は本発明の技術分野における通常の熟
練者にはよく知られていて、たとえば、可溶化したメロ
ゾイト膜のイオン交換クロマトグラフィーによる部分精
製がある。 また、８Ｂ５？Ｊｉ白質は、ＡＴＣＣ１，：登録番号Ｈ
Ｂ　８９４６号で寄託されているマウスハイブリドーマ
細胞系によって産生され、Ｐｍｘ４７．８Ｂ５と命名さ
れたモノクロナール抗体のように、８Ｂ５蛋白質に対す
るモノクロナール抗体を用いた免疫沈殿または免疫吸着
クロマトグラフィーによって、Ｅ、ｍａｘｉｍａメロゾ
イト膜蛋白質から分離回収される（上記寄託は、特許出
願のための微生物寄託の国際認知に関するブダペスト協
定に従って行われた）。 ８Ｂ５蛋白質のポリペプチドは、８Ｂ５蛋白質の製造の
場合と同じ方法で製造できる。ついでポリペプチドは、
たとえばイオン交換クロマトグラフィーたとえばＤＥＡ
Ｅ−セルロースでの部分精製により、またついで還元条
件下におけるプレパラティア５ＤＳ−電気泳動により、
分離回収される。 本発明の５５．０００ダルトン８Ｂ５蛋白質または各種
抗原性ポリペプチドの、組換えＤＮＡ技術による製造方
法も本発明によって提供される。 すなわち、８Ｂ５蛋白質またはポリペプチドをコードす
るＤＮＡ分子を調製し、このＤＮＡ分子を適当な発現ベ
クターたとえばＰ、またはｊ！ａＣプロモーター含有ベ
クター中に挿入する。得られた発現ベクターを次に適当
な宿主たとえば大腸菌に、ＤＮＡの発現および蛋白質ま
たはポリペプチドの産生を可能にづ゛る適当な条件下に
導入し、生成した蛋白質またはポリペプチドを回収する
。 メツセンジャーＲＮＡ　（ｒｒ＋ＲＮＡ）　は、胞子形
成の任意の時点でメロゾイトから単離できる。これらの
ｍＲＮＡサンプルをｉｎ　ｖ目ｒｏ（４４）またはｉｎ
　ｖｉｖｏ系を用いて翻訳する。翻訳生成物は、モノク
ロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５または抗メロゾイト鶏
血清を用いて免疫沈殿させることができる。８Ｂ５抗原
をコードするｍＲＮ△プレバレージョンを用いて二本鎖
ｃＤＮＡを調製する（４４）。このｃＤＮＡを次に適当
なクローニングベクターに挿入し、ついで大腸菌の形質
転換に用い、ｃＤＮＡライブラリーを発生させる。この
ｃＤＮＡライブラリーを、８Ｂ５抗原のポリペプチド成
分からのアミノ酸配列情報に基づいて構築された同位元
素ｅ２識オリゴヌクレオチドプロブを用い、コロニーハ
イブリダイゼーション法でスクリーニングする。ポリペ
プチドに対するヌクレオヂド配列を含む細菌性コロニー
からのベクターＤＮＡを単離し、挿入されたコクシジウ
ムＤＮＡの配列を決定する（４６．６２）。 プラスミドＤＮＡとモノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８
Ｂ５によって認識されるエピドープをもつ蛋白質をコー
ドする核酸分子からなる発現ベクターが構築された。融
合蛋白質の発現が可能なベクターはｐ５−３、ｐｌｌ−
２、およびｐ１３−８と命名された。これらのベクター
で形質転換された大腸菌細胞は、それぞれ５Ｇ９３６１
　ｐ５−３．５Ｇ９３６／ｐ１１−２および５Ｇ９３６
１０１３−８と命名され、ＡＴＣＣにσ録番号６７２５
３号、６７　２５１号および６７　２５２号として寄託
されている。 本発明はまた、本発明の８Ｂ５抗原、抗原性ポリペプチ
ドまたは他の抗原の免疫処置有効量を鶏に投与すること
による、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａの感染に対する
能動免疫を鶏に付与する方法を包合する。 この方法により、非免疫鶏に能動免疫を付与することが
できる。さらに、これらの物質の投与は、以１）ａにＥ
、ｍａｘｉｍａに曝露された鶏の比較的低レベルの免疫
を増強させるため、また追加予防接種に使用することが
できる。 本発明の８Ｂ５抗原または任意の抗原性ポリペプチドは
、よく知られた任意の方法で鶏に投与することができる
。望ましい投与方法は、背頚部への皮下または筋庄内注
射である。抗原の免疫処置有効量は、約０．１μｊから
約１１ｒｒｇまでの任意の伍である。抗原量は約１０μ
９以上とすることが望ましい。好ましい抗原ｎは、体重
１にびあたり約５００μ９である。また、投与経路は、
経口（たとえばカプセルによる）または望ましくは注射
（たとえば皮下、皮肉または好ましくは筋肉内注射）に
よって行われる。投与方法が注射の場合は、任意の医薬
的に許容されるキャリアーが使用できる。適当なキャリ
アーには、０．０１〜０．１Ｍ好ましくは０．０５Ｍリ
ンリン衝液または０．８％食塩水がある。 本発明の抗原性物質、すなわち８Ｂ５抗原、抗原性ポリ
ペプチドまたは本発明の他の抗原の免疫感作有効咄と適
当なキャリヤーからなる、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍ
ａ感染に対する能動免疫を鶏に付与するワクチンを提供
する。ワクチン中の抗原性物質の好ましい免疫感作有効
ａは、鶏の体重Ｉ　Ｋｙあたり約０．１μＪ以上である
。 このようなワクチンの適当用岱を鶏に投与することによ
り、ｔ、ｍａｘｔｍａ感染に対して鶏が防御される。１
用Ｒあたりの抗原性物質ｍは、ワクチン投与動物に抗原
性物質に対する抗体産生を誘発するのに十分な旦でなけ
ればならない。抗体産生および防御効果で評価される十
分な免疫応答を与えるための、１ｍｍあたりの抗原物質
の爵は、予防接種動物の体ｆ４１　Ｋ９あたり約２０．
０μ３以上とすることが望ましい。すなわち、５０ｇの
１日齢ヒナに対する抗原物質の爪は約１．０μ９である
。 したがって、ワクチンは抗原性物質１０μびを含有する
ことが好ましい。一般的に、抗原はワクチン巾約０．０
０２重患％〜約０．２車φ％添加され、１回投与用量は
約０．１ｍとする。 本発明の他の態様としては、本発明の８Ｂ５蛋白？１お
よび抗原性ポリペプチドに対するモノクロナール抗体が
包含される。特定の態様としては、ハイブリドーマ細胞
系ＡＴＣＣｌ→８Ｂ９４６号によって産生された上述の
モノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５を挙げることが
できる。 ８Ｂ５抗原またはその抗原性フラグメントに対するモノ
クロナール抗体、たとえばモノクロナール杭体Ｐｍｘ４
７．８Ｂ５の防御有効ａを鶏に投与することにより、Ｅ
、ｍａｘｉｍａ感染に対する受動免疫を鶏に付与するこ
とができる。この目的に有用な組成物は、適当なモノク
ロナール抗体たとえばモノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．
８Ｂ５の保護有効量と、適当な担体からなる。上記組成
物は、経口的に投与した場合、感染を防御するのに十分
な用量のモノクロナール抗体から構成することができる
。抗体の通常の用団は１日１羽あたり抗体約１００μび
であり、水溶液または凍結乾燥物として投与できる。組
成物は飲水添加用の水溶液の形とすることが好ましい。 抗体は０．１５Ｍリン酸塩緩衝食塩水ｐ１１７に溶解し
、チメロサールを最終蛋白質含量１〜１１００ＩＩＦ／
ｄに対してｏ、ｏｏ。 １％含有させる。製品は、所望の抗体レベルが維持され
るようにした飲水から連続的に投与される。 このような組成物の適当用量の鶏への投与が、Ｅ、ｍａ
ｘｉｍａ感染に対づる受動免疫の付与方法である。 さらに他の態様によれば、８Ｂ５抗原の主たる保護構造
の特徴と共通の空間的特徴を有する部分構造で、前述の
抗原を置換する。このような組成物の例としては、８Ｂ
５７３白質または本発明の抗原性ポリペプチドの１種、
たとえば各抗原決定基に対する特異性を付与する構造を
もつモノクロナール抗体ＰｍＸ４７．８Ｂ５の構造に対
して産生じた抗−イディオタイプ抗体が包含される。こ
のような抗−イディオタイプ抗体はそれ自体本来モノク
ロナールであるが、またポリクロナール抗体として産生
することもできる。前者の例としては、抗体Ｐｍｘ４７
．８［３５をハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＮαＨＢ８
９４６から回収し、精製し、任意の適当なキレリアー蛋
白質、たとえばキーホールリンベットヘモシアニン（Ｋ
ＬＩ−（＞に共有結合させる。精製された抗体、好まし
くは精製された抗体−ＫＬＨ複合体を、好ましくはフロ
イント完全アジュバントのようなアジュバントとともに
、適当な哺乳類リンパ球ドナー好ましくはＢａＪｌｂ／
Ｃ系マウスに、反復注射する。免疫処置マウスのリンパ
球からハイブリドーマが発生する。ハイブリドーマをモ
ノクロナール抗体ＰｍＸ４７．８Ｂ５との反応では８Ｂ
５抗原と競合するが、８Ｂ５抗原もＰｍｘ４７．８Ｂ５
以、外のげつ歯頚免疫グロブリンも認識しない抗体につ
いてスクリーニングした。このようなハイブリドーマが
分泌する、モノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５に対
する抗イデイオタイプ抗体をさらに増殖させ、クローン
化する。抗−イディオタイプ抗体の”／Ｊ　Ｔｉは、ハ
イブリドーマの生育およびモノクロナール抗体の発現に
適当なメジウム中での細胞培養、またｔま好ましいビー
クルとしてＢａ１ｂ／Ｃマウスを用いた抗体産生ハイブ
リドーマの宿主肋物中での生育によって実施される。 抗−イディオタイプ抗体はまた、動物へのＰｍｘ４７．
８Ｂ５の注射によっても製造できる。 好ましい一方法は、精製したＰｍｘ４７．８Ｂ５．５０
０１１　’Ｊを適当なアジュバントたとえば完全フロイ
ンドアシュパンｌ−中に処方し、適当な動物たとえばウ
サギに反復注射する方法である。ト分に注射したのち、
適当な期間後に動物から血清を採取する。ついで、抗−
イディオタイプ抗体を血清から、たとえば５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　ｏのような不溶性支持体に固定化した正常マウ
ス血清に吸着させて回収した。１９られた抗血清の特異
性は、モノクロナール抗体Ｐｒｎｘ４７．８Ｂ５と反応
性を示すが、正常げつ肉類抗体に対しては反応しないこ
とで確認された。 上述の抗−イディオタイプ抗体はさらに、１ｏＧフラク
シヨンのレベルに精製される。精製された抗−イディオ
タイプ抗体は、抗原の場合に記）ホしたと同様、任意の
公知方法で投与することができる。 本発明の抗−イブイオタ２イブ抗体の有効量を鶏に投与
すると、ごれがＥｉｍｅｒｉａ　ｍ　ｘｉｍａの感染に
対Ｊ゛る能動免疫を鶏にイ」Ｌ３する方法になる。この
目的でのワクチンは、抗−イディオタイプ抗体の免疫感
作有効Ｆと適当な担体からなる。このワクチンの適当用
量を鶏に投与すると、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａの
感染に対重る鶏の防御方法になる。 １用Ｒあたりの抗−イディオタイプ抗体の恒はワクヂン
投与動物に抗体の産生を誘発するのに十分なωでなけれ
ばならない。抗体の産生によって示される免疫応答の誘
発に必要な１用示あたりの抗−イディオタイプ抗体量は
、予防接種する烏の体重Ｉ　Ｋ’Ｊにつき５０ｔｉｙ以
上である。すなわち、５０ｙの１日齢ヒナの場合、抗−
イデイオタイプ抗体２．５μ７が投与される。したがっ
て、抗−イディオタイプ抗体２５μＪを含むワクチンが
好ましい。一般的には、抗−イディオタイプ抗体は、ワ
クチン中に約０．００２重伍重患０．２重量％の割合で
添加され、１回投与容伍は０，２ＣＣである。 本発明の他の態様には、８Ｂ５蛋白質をコードする核酸
分子、たとえばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮ
Ａがある。その−態様は、本発明の抗原性ポリペプチド
をコードするＤＮＡ分子である。 他の態様としては、たとえば８［３５蛋白質または前述
の抗原性ポリペプチドの１種をコードする、本発明の核
酸分子からなるクローニングベクターがある。クローニ
ングベクターは宿主細胞たとえば細菌宿主細胞に導入さ
れる。 本発明の精製された抗原性蛋白質は、８Ｂ５蛋白質をコ
ードする核酸分子を含有するクローニングビークルをＳ
む宿主１胞を用いて製造できる。 この方法によれば、宿主細胞を蛋白質の産生が可能にな
る適当な条件下で生育させ、生成した蛋白質を回収で−
る。本発明の抗原性ポリペプチドは、そのポリペプチド
をコードする適当な核酸分子を用いて同様に製造できる
。 宿主細胞が細菌細胞である場合、生成した８Ｂ５蛋白質
は天然の８Ｂ５蛋白質と同一またはほぼ同一の配列を有
するが、細菌宿主内での発現のため、たとえばＮ末端メ
チオニン分子の付加により、そのアミノ酸配列またはア
ミノ末端が異なる可能性がある。 本発明の態様としては、さらに、本発明の精製抗原性蛋
白質をコードする核酸配列を有するＤＮＡ分子を得る方
法がある。この方法には、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍ
ａの卵母細胞からゲノムＤＮＡを単離し、単離されたゲ
ノムＤＮＡからＤＮＡフラグメントを、たとえば制限酵
素を用いて調製する。 ＤＮＡフラグメントをついで適当なクローニングベクタ
ーにリゲートする。適当なクローンは、そのＤＮＡを８
Ｂ５抗原をコードする核酸配列を含むかまたはそれと相
補性のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさ
せて同定する。ｐｍｘ４７．８Ｂ５免疫反応性蛋白質を
コードするＤＮＡを適当なクローンから単離するか、ま
たは本技術分野において公知の免疫ブロワ１へ操作りに
よりＰｍｘ４７．８Ｂ５免疫反応性蛋白質の存在をスク
リーニングして適当なクローンを同定する。 本発明は、５５，０００ダルトン以上の分子ｍを有し、
５５，０００ダルトン抗原性蛋白質のアミノ酸配列内に
包含されるアミノ酸配列と付加的アミノ酸をもつ抗原性
ポリペプチドを提供する。 このポリペプチドはＥｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ感染
に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘導できる
。 イ・」船釣アミノ酸は、他のポリペプチド、たとえばβ
−ガラクトシグーゼのアミノ酸配列であってもよく、こ
の場合には、５５．０００ダル１〜ン蛋白質−β−ガラ
クｌ−シダーゼ融合ポリペプチドが得られる。本発明は
また、このような融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ
分子、およびそのＤＮＡを含有するクローニングベクタ
ーを提供する。 本発明はまた、本発明の抗原性融合ポリペプチドの免疫
感作右効伍を鶏に投与することからなる、Ｅｉｍｅｒｉ
ａ　ｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫を鶏に付与する
方法を提供σる。また、本発明の抗原性融合ポリペプチ
ドの免疫感作右効最と、適当な担体からなる、Ｅｉｍｅ
ｒｉａ　ｍａｘｉｍａの感染に対する能動免疫を鶏に付
与するワクチンを提供する。 本発明はさらに、Ｅｉｍｅｒｉａ誘発疾患に対する多成
分ワクチンを提供する。ワクチンは１用ｍあたり、ＩＱ
与動物にＥｉｉｅｒｉａ抗原に対する抗体の産生を誘発
するのに有効な吊の、任意の［ｉｍｅｒｉａ抗原または
エピドープの混合物を含有する。１用吊あたりの各抗原
のｍは、約１０μ３〜約２００ｕｇである。ワクチンは
また、医薬的に許容される担体を含有する。 好ましいＫｌにおいては、Ｅｉｍｅｒｉａ抗原は、Ｅｉ
ｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ　ＳＥ、ｍａｘｉｍａおよ
びＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘの抗原であるが、任意のＥｉｍ
ｅｒｉａ種の抗原は同様に有効である。好ましい態様の
ワクチンは、特異的抗体の結合部位により認識される少
なくとも１個の特異的Ｅｉｍｅｒｉａアミノ酸配列、す
なわち少なくとも１個の特異的Ｅｉｍｅｒｉａエピドー
プからなる１種または２種以上の遭伝子操作抗原性融合
ポリペプチドを含有する。 本発明のワクチンは、各種のＥ！ｍ（！ｒｌａ抗原また
はそのエピドープを１種、２種または任意の数の異なる
抗原またはエピドープの各種組合せで含有づることがで
きる。好ましい態様においては、ワクチンは任意のＥｉ
ｍｅｒｉａ抗原の混合物からなる。 すなわち混合物には任意のＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａ抗原
を、任意のＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原またはＥ、ｍａｘ
ｉｍａ抗原を含む他の任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原と組合
せて含有させることができる。好ましい抗原は、２５キ
ロダルトンのＩＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａ抗原、２６キロ
ダルトンのＥ、　ｎ０ｃａｔｒｉＸ抗原または５５キロ
ダルトンのＥ、ｍａｘ’＋ｍａ抗原がある。 さらに、混合物は、２５キロダルトンのＥ、　ｔｅｎｅ
ｔ　ｌａ抗原を、任意のＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘまたは［
、ｍａｘｉｍａ抗原を含めた任意の他のＥｉｍｅｒｉａ
抗原と組合せて含有することができる。好ましい組合せ
としては、２５キロダルトンのＥ、　ｔｏｎｅｌ　ｌａ
抗原と２６キロダルトンＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原また
は５５キロダルトン［、ｍａｘｉｍａ抗原がある。 本発明の態様においては、混合物は、任意のＥ、ｎｅＣ
ａｔｒｉＸ抗原の、任意のＥ、　ｍａｘ　ｉ　ｍａ抗原
を含めた任意の他のＥｉｍｅｒｉａ抗原との組合せを包
含する。 好ましい抗原は、２５キロダル１−ン（、、ｎｅＣａＬ
ｒｉｘ抗原または５５キロダルトンＥ、　ｍａｘ　ｒ　
ｍａ抗原である。 混合物はまた、２６キログルトンＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘ
抗原を、任意のＥ、ｍａｘｉｍａ抗原を含めた他の任意
のＥｉｍｅｒｉａ抗原との組合せでもよい。 最後に、ワクチンには、任意のｌＥ、ｍａｘｉｍａ抗原
を、５５キロダルトンＥ、ｍａｘｉｍａ抗原を含めた任
意の他のＥｉｍｅｒｉａ抗原と組合せて含有させること
ができる。 本発明のワクチンは、任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原と任意
のトリウィルス蛋白質の混合物を含有するものであって
もよい。好ましい態様におけるトリウィルス蛋白質は、
感染性バーサル疾患ウィルスの蛋白質である。他のトリ
ウィルス蛋白質としては、マレック病ウィルスもしくは
そのエピドープ、１ヘリポツクスウイルスまたはそのエ
ピドープ、七面鳥のヘルペスウィルスまたはそのエピト
−プを挙げることができる。 本発明に用いられる抗原性融合ポリペプチドは、遺伝子
操作技ｔＪｊによって製造ツ゛ることができる・Ｔｊす
わノ５、［ｉｍｅｒｉａクローニン’）配列１７）ｃＤ
ＮＡ　　。 のクローニングによって製造できる。融合ポリペプチド
は少なくとも１個のＥｉｍｅｒｉａエピドープ、すなわ
ち［ｉｍｅｒｉａ抗原に対する抗体によって認識される
アミノ酸配列が、少なくとも１個の他のポリペプチドの
アミノ酸配列の少なくとも部分と融合している。 適当な融合ポリペプチドは、β−ガラクトシダーゼまた
はプロキモシンに融合したＥｉｍｅｒｉａ抗原である。 融合ポリペプチドには、ベクターＣＩＤＥＴ１　（ＡＴ
ＣＣＮα５３３１６）、ベクターｐＤＥＴ２　（ＡＴＣ
ＣＮα５３３１８）、ベクターＤＢＧＣ２３（ＡＴＣＣ
Ｎα５３３１７）、ベクターＤＣＯＣ１２（ＡＴＣＣＮ
ｏ、５３３１４）、またはベクターｐｃＯｃ２０　（Ａ
ＴＣＣＮα５３３１６によってコードされるポリペプチ
ドを挙げることができるが、他のベクターでコードされ
る融合ポリペプチドも使用できる。 最後に、本発明のワクチンは、任意の抗原性融合ポリペ
プチドの混合物であってもよい。好ましい態様において
は、融合ポリペプチドには少なくとも１個のＥｉｍｅｒ
ｉａエピドープが包含される。 例　　１ Ｅｌ）１［＋１１八ＮＥＣＡＴＩｔｌχ及びＥＩＨＥＲ
Ｉ八ＴＥ１４へＬｌ−Ａ　の調製ニオオシスト、スポロ
シスト、スポロゾイトＣｏｃｃｉｄｉａ、　　　Ｅｉｍ
ｅｒｉａ　　　ｎｅｃａｔｒｉｘ及びＥｉｍｅｒｉａｔ
ｅｎｅｌ１８の精製された分離物は、元来へｕｂｔｌｒ
ｎ大学のアレン・エドガー博士から入手したものである
。 各分離物の純度は、オオシストの特徴及び感染した腸組
織の組織学的観察をもって確認した。オオシストの大き
さと形状表示はそれぞれしｎｅｃａｔｒｉＸ及びＥ、　
　ｔｅｎｅｌｌａの範囲内であった。 病変は、ジョンソンとレイドの方法（３０）によって評
点をつけた。感染した烏の病変は各々それぞれの分離物
に典型的なものであった。５日間にわたる組織学的検査
で腸中央（Ｅ、　　ｎｅｃａｔｒｉｘ）または盲腸（Ｅ
、　　ｔｅｎｅｔｌａ　）の上皮下に広ａ２！な第２世
代のスキツオントが発見された。ＬｔＱｎｅｌｌａ及び
Ｅ、　　ｎ０ｃａｔｒｉＸによりその重症感染中に（各
々１５，０００．５０．０００オオシスト）死に至る場
合があった。単一オオシストのクローニングが各分離物
の純度を保つため、周期的に行なわれた。 オオシストの生殖。　各分離物の純粋培養物を４〜６週
令のＳＰＦ白色レグしン系鶏に恒常的に継代接種した。 外因性のＣｏｃｃｉｄｉａ感染を避けるために、鶏は生
後１０目から樹脂ガラス製の隔離鶏舎で飼育した。オオ
シストは感染後７日日に盲腸から、シャーリーのトリプ
シン分解法（６６）を用いて採収した。胞子の形成され
たオオシストは、典型的方法により２４℃で２％のＷ／
ＶＫ２Ｃｒ２０□中に保存した。 スポロシストの分離。　残骸から塩浮倣によって部分的
に精製された胞子形成オオシスト（ＩＸ１０８）は、Ｏ
，ＩＭリンＭ緩衝液、ｐＨ７，４（ＰＢＳ）で５回洗浄
し、重クロム酸カリウム保存液を除去した。これらのオ
オ′シストは、１．０５％の次亜塩素酸ナトリウム中で
２０分間攪拌した後にＰＢＳで５回洗浄し残留次亜塩素
酸ナトリウム及び残骸を除去することによってさらに清
浄化した。最後の洗浄にひき続き、清浄したオオシスト
をＰＢＳｌ、Ｏｄ中に再懸濁さＶた。懸濁したオオシス
トを同容量のガラスピーズ（１゜０〜１．０５＃＊）と
−緒に撮とうして鍬械的に分解した。遊離したスポロシ
ストは、グラスウールカラムを通過させてオオシスト壁
及び未分解オオシストから純化され、３０００ｋＰＭで
１０分間、４℃で遠心分離され、ＰＢＳ１０ｒＲ１中で
再懸濁させた。 スポロゾイトの調製。　新たに胞子形成されたオオシス
トは、塩浮澁、反復洗浄及び１．０５％の次亜塩素酸ナ
トリウム処理ににり清浄した。スポロシストは、オオシ
ストをガラスピーズ（１，Ｏ−１，０５ｍ）を用いて機
械的に分解して遊離させた。スポロゾイトを脱嚢させる
ために、スポロシストをトリプシン及びタウロデオキシ
コール酸（それぞれ０．２５．０．５０％ｗ／ｖ　）と
共に１時間、４１℃でインキュベートした。このように
して１９られたスポロゾイトは遠心分離法により洗浄し
て取り除き、バンク培地に再懸濁させた。新たなバンク
培地を用いてスポロゾイトを作業濃度に希釈した。 例　　２ Ｖａｎ　ＤｅｔｌＳＱｎとＷｈｅｔｓｔｏｎｅの方法（
７７）を用いて発育されたハイブリドーマから誘導した
。要約すると、Ｂａ１ｄ／ＣＢｙＪｖウスを１０６〜１
０７のインタクトなＥ、　　ｔｃｎｅｌｌａスポロゾイ
トで繰り返し免疫した。完全無欠なスポロゾイトの最終
静注後３日して、任意に抽出したマウスを殺し、牌切除
した。肺細胞は、牌臓の線維組織から分離し、洗浄した
肺細胞をネズミ形質細胞腫の細胞株（ＳＰ２１０Ｍ＞と
融合させた。 微分中和試験。　微分中和試験は、Ｅ、　　ｔｅｎｅｌ
ｌａについては鶏の一次腎細胞培養物を、またはＬｎｃ
ｃａｔｒｉｘについてはブタ胎児肺細胞を用いて行った
。１〜２週令の鶏を殺し、無菌法による腎切除をした。 細胞は、９６穴の培養プレートに移され、約１０４／ｗ
ｅｌｌの密度で、５％熱処理積胎児血清を添加したＥａ
ｒｌＱ’Ｓ　ＬＡＮ培地で平地培養した。 培養は４１℃、ＣＯ２５％の環境を維持した。細胞培養
が約５０％の交会レベルに達した時、ハイブリドーマの
被検検体またはコン１−ロール検体５０μｍをプレート
の仝での穴に加えた。次に、ＥａｒビＳ培地培地５０申 るスポロゾイトを全てに加えた。１２〜１６ｕ）間後、
培養上清を新たな２％熱処Ｉ！ｌ！１費胎児血清を含む
Ｅａｒｌ’ｓ　　Ｌ　Ａ　ｌ−１培地と交換した。培養
は感染後４０〜４４時間で終了させ、培養上清をプレー
トから除去した。その結果、細胞を５％氷酢酸で酸性と
したメタノールを加えてプレートに固定化した。固定化
された培養細胞は検査前に０．１％トルイジン・ブルー
で染色した。各培養穴は分裂生殖が阻害につきその概略
パーセンテイジレベルで採点した：モノクローナル抗体
による寄生虫の中和は、スキツオントの成熟を完全に阻
害できる血清の最大希釈倍率に基づいて採点された。 間接螢光抗体スクリーニン　。　ＩＦＡ（間接螢光抗体
）スライドをＥ．　　ｔｅｎｅｌｌａまたはＬｎｅｃａ
ｔｒｉｘｏ　スホ０　ソイト（約１　Ｘ　１　０６／ｗ
ｅｌｌ）を用いて調製した。スライドは各穴に１％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）１０μｍを加える前に、数時
間ないし一晩空気乾燥させた。ＢＳＡ添加添加５虹後検
上清２　０　７１１を加えた。上清を３７℃で２０分間
インキュベートして、０．００５％Ｔｗｅｅｎ　−　２
　０を含む０．１　５ＭＰＢＳ　（ＰＢＳ−’ｒｗｅｅ
ｎ　）で３回洗浄した。フルオ゛レスセイン抱合の家兎
対マウス抗体（ＰＢＳで１：４０に希釈）を標本に加え
、３７℃で２０分間インキュベートした。抱合体は封入
剤の添加及びカバーグラスの設置前に、Ｐ　３　３　−
　Ｔｗｅｃｎで３回洗浄した。 結　果。　Ｅｉｍｅｒｉａ　　ｔｃｎｎｅ＋＋ａに対し
て発育した数千のハイブリドーマの内、２４個がスポロ
ゾイト段階の寄生虫に対する中和抗体を作ることがわか
った。検査されたハイブリドーマの全てが膜に結合した
抗原を認識したが、１つのハイブリドーマから得られた
抗体だけは膜内部の抗原を認識した。 Ｉｎ　　ｖｔｔｒｏで、各セルラインの最初のクローニ
ングで得られた数検体の上清について中和能力を比較し
た。あるセルラインの上清が、Ｅ．　　ｔｅｎｃｌｌａ
のスポロゾイトに対して相対的に最も大きい中和力を示
した。各被検上清について含有抗体を評価した場合、あ
る抗体（Ｐｔｎ　　７．２Ａ４／４で示す）がスポロゾ
イトを中和するのに必要なｍは、次に中和力の強い抗体
の２０分の１であった。詳細には、Ｅ．　　ｔｅｎｅｌ
ｌａの中和に必要なｐｔｎ７、２Ａ４／４抗体の吊は約
３．５Ｘ１０”１０＋１１ＩＣＵＩＯ３／５ｐＯｒＯＺ
Ｏｉｔｅであった。Ｐｔｎ７．２Ａ４／４で示されるモ
ノクロナール抗体を産生するハイブリドーマは、ロック
ビル、メリーランド、Ｕ．Ｓ．Ａ．　　２０８５２にあ
るＡｌｌ１ｅｒｉＣａｎ　’ｒｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　＞に供託
され、ＡＴＣＣ取得Ｎｏ．ＨＢ８５６１として識別され
た。 この供託は、特許申請手続を目的とした微生物の供託に
関する国際認定に関するブタベスト条約（以下ブタベス
ト条約という）の規定に従って行われた。モノクロナー
ル抗体ｐｔｎ７．２Δ４／４をＦ、　　ｎｃｃａｔｒ：
ｘに対して評価した揚台、Ｌｔｃｎｃｌｌａと同様のフ
ルオレセイン染色パターンが観察された。ざらにＰｔｎ
７．２Ａ４／４について、Ｅ、　　ｎｅｃａｔｒｉＸに
対するｉｎ　　ＶｉｔｒＯ中和試験を行った結果、同数
のＥ、　　ｔｅｎｅｌｌａで観察されたのと同等の中和
活性をＦ、　　ｎｃｃａｔｒｉｘに対しても持っている
ことがわかった。 例　　３ 中和モノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２△４／４について
ヨウ化を行った。各々について、スポロシストは塩浮Ｉ
Ｎ及び次亜塩素酸ナトリウム処理のオＡシストから精製
され、ガラスピーズで破壊した後にグラスウールカラム
に通した。スポロシスト膜は、半量のスポロシストを用
い、１０ｍＭリン酸ブ１−リウム、０．１５８　ＮａＣ
ｌ　、ｐＨ７，２（ＰＢＳ）１ｄ中でガラスピーズを加
えて機械的分解によって調製した。この調製はプロテア
−ぜ・インヒビター；Ｑ、１ｍＭフェニルメチルスルホ
ニル・フルオライド（ＰＭＳＦ）　、ＯｌｌｍＨＮ−１
−シル−し一フェニルアラニンクロロメチルケトン（丁
ＰＣＫ）、１ｍＨＮ−α−Ｐ−ｔ−シル−Ｌ−リジンク
ロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）及び１０ＫＩＵ／ｄアプ
ロチニンの存在下で行った。 残りのスポロシストは、トリプシンとタウロデオキシコ
ール酸（総容ｆａ１ｍ＞で処理し、スポロゾイトを脱嚢
させた。両方の調製物は４５．００ＯＲＰＭ、４５分間
、４℃で分離し、再びＰＢＳ１〆に懸濁させた。超遠心
を行う前にトリプシン−デオキシコール酸残留物をスポ
ロゾイトからＰＢＳ及び１ｍＨＰＭＳＦで洗浄すること
により完全に除去するよう注意した。 １ｄのサンプルを４０μびのｌ０ＤＯＧＥＮ　（１゜３
．４．６−テ１〜ラクロロ−３−α、ｂ−α−ジフェニ
ルグリコウリル）固相ヨウ化試薬（２４゜５３）でコー
ティングされたガラスシンチレーションバイアルに加え
、窒素ガス下で乾燥させＰＢＳで洗浄した。各チューブ
に　　Ｉを０．５ｍＣ１加え、水中で２０分間インキュ
ベートした。 次にＩＭＫＩ１００μｍを各チューブに加え最終濃度を
１００ｍＨとし、ざらに１５分間反応を続けさせた。ス
ポロゾイト及びスポロシストのＩＩ物は５ｍＨＫｔを含
むＰＢＳ７Ｊｄに希釈り、テ４５．０００ＰＰＭ、４５
分間、４℃で超遠心分離した。 スポロシスト及びスポロゾイト膜タンパクの抽出。 上記の超遠心で１りた　　Ｉでラベルされたスポロシス
ト及びスポロゾイトのペレットを、タンパク抽出緩衝液
（２０ｍＨＴｒ　ｉ　５−１−ＩＣＩ　、ｐｌ＋７．５
；５０ｍＨＭＱＣＩ　　：２５ｍＨＮａＣ１、１％ＮＰ
４０．１ｍＨＰＭＳＦ、０．１ｍＨＴＰＣＫ、１　ｍＨ
Ｔ　Ｌ　ＣＫ及び１０ＫＩＩＪ／ｄアプローヂニン）１
威中に再懸濁させた。懸濁液は時々攪拌しながら水中で
６０分間インキュベートした。不溶性物質は洗滌剤で可
溶化した微酸化状のタンパクから１５分間、４℃で分離
した。上清は一７０℃で保存した。 １２５ＩクンバクのＴＣＡによる沈澱　　各サンプル１
０　ｕ　ｌを５ｍＨＫ１９０μｍで希釈した。次に、各
希釈サンプル１０μｍを、５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ
）１ｍｉ！、ＢＳＡ（１０■／ｄ）及び５ｎ＋ＭＫＩ２
５μｍを含む溶液に加え、水中で３０分間インキュベー
トした。沈澱したサンプルはグラスファイバーフィルタ
ーでろ過して回収し、５％ＴＣＡ、５＋＋＋ＨＫＩ５戒
で２回洗浄、９５％エタノール５ｄで３回洗浄をどちら
も０℃で行い、液体シンチレーションカウンターでカラ
ン１〜した。 モノクローナル抗体との免疫沈降反応：モノクロナール
抗体５０μｍをモノクローナル抗体希釈緩衝液（ＭＡＢ
−Ｄ　Ｉ　Ｌ）　：　５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　
、ｐＨ８，６：　１５０ｍＭＮａＣｌ　：０．１％ＮＰ
−４０：ＲＩＡ用０．１％ＢＳＡ　：　１ｍＨＴＬＣＫ
　；　１ｍＨＰＭＳＦ　；　１０に！Ｕ／ｄアプロチニ
ン２５μｍに加えた。そこに　　Ｉでラベルされたタン
パク２０μｍを加え、攪拌して４℃で一晩インキユベー
トした。抗マウス家兎ＩＱ血清（ＩＯＡ、ＩＱＧ、ＩＱ
Ｍ＞をＭＡＢ−Ｄ　［Ｌで１：２に希釈して１０μｍを
各免疫沈降チューブに加え、４℃で１時間インキュベー
トした。プロティンＡ−セファロース（１０％Ｖ／Ｖ　
）をモノクローナル抗体洗Ｅ緩画液（ＭＡＢＷ）　：　
５０ｍＨＴｒ　ｉ　５−１−ＩＣＩ　、ｐＨ８，３；０
．０５％ＮＰ−４０；０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　
−１００；　１５０ｍＨＮａＣｌ　；０．０２％ＮａＮ
　　：５ｍＨＫＩで１：４に希釈し４００μｉを各デユ
ープに加えた。チューブを緩やかにゆらしながら４℃で
１時間インキュベートした。免疫沈降物は冷たいＭＡＢ
Ｗで２回洗浄しざらに室温のＭＡＢＷで２回洗浄した。 ペレットは５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（３５）５
０μｍに再懸濁させ、５分間煮沸して微敗状態にしてプ
ロティンＡ−セファロースを除去した。上清をカウント
して５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。 電気泳動によるニトロセルロース紙への抗原の■：ヨウ
化されていないスポロシイ１−議タンパク（前述のとお
り洗剤で可溶化したもの）は還元または非還元的条件下
で、−次元のＩｔｉＭドデシルナ１−リウム・ポリアク
リルアミド・スラブゲルにより分離され、電気泳動によ
りニトロセルロース紙へ移動させた（７５）。電気法ｖ
Ｊブロツｌ−はＳｂａｒｍａｓ　　（６４）の方法によ
って処理した。但し、例外として血清、モノクローナル
抗体及び適切な抱合体［ペルオキシダーゼ抱合の山羊成
鶏１ｇＧ、にｉｒｋｅｇａａｒｄ及びべり−、ペルオキ
シダーゼ抱合の家兎抗マウスＩ　ｇＧ　（Ｃａｐｏｃｌ
）は還元型ゲルのプロット用に使われ、ネズミモノクロ
ナール抗体は、非還元型ゲル（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ
　、バーリン１〜ン、Ｃ△）とし１？ウスＩＯＧ用のＶ
ｅｃｔａｓｔｅｉｎ。 ＡＢＣキットとの関連で使用された。ブＯツ１〜は、還
元型分離においては４−クロロ−１−ナフトール（シグ
マ：６６０μ９／ｄ）及びト１２ｏ２（０，１７％）と
反応させ、また非還元型分離においてはＶＯＣｔａＳｔ
ａｉｎ　　試薬と反応させて生成した。 １２５１でラベルされたスポロシスト及びスポロゾイト
の膜タンパクの免疫吸収したもの及び免疫沈降タンパク
は、５〜２５％の指数勾配または８〜２０％の直線勾配
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて２５ｍＡで分
析した。ゲルは乾燥させコダックＸＡＲ−５Ｘ線フィル
ムを一晩−７０℃で感光させた。染色用のゲルは、Ｃｏ
ｏｍａｓｓｉｅ　　（２１）または製造業者のラベル添
付による取扱い要領にもとづいて銀染色（ピアス、ケミ
カル）により目視された。 表面がラベルされたＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａのスポロゾ
イト調製物は、還元型５ＤＳ−ＰＡＧＥでＴａ認された
６、５００と２５．０００の分子量をもった２つのヨウ
化タンパクを含む。６．５００ダル１〜ンのタンパクは
、モノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と容易にか
つ特異的に免疫沈降反応を起こす。スポロシストの膜は
、分子量１７．０００及び２７，０００の２つのヨウ化
タンパクを含むがその他にも多様な分子量をもつヨウ化
タンパクも数個存在する。　　■でラベルされたスポロ
シス１−膜タンパクの免疫沈降反応で、モノクローナル
抗体Ｐｔｎ７．２△４／′４と反応した抗原は、還元型
５ＤＳ−ＰＡＧＥで確認されたように１７゜０００ダル
トンのタンパクだけであった。 上述の様に５ＤＳ−ＰＡＧＥで免疫沈降ヨウ化ポリペブ
タイドを分析した条件下で、ジスルフィド結合で連結さ
れたポリペブタイドを分離した。 しかしながらジスルフィド結合の還元により、スポロシ
スト及びスポロゾイト膜の調製物のウェスタン・プロッ
トにおけるＰｔｎ７．２Ａ４／４の反応性が破壊される
。ヨウ化スポロシスト及びスポロゾイト膜調製物につい
て非還元型条件で５Ｏ３−ＰＡＧＥを行った場合、主要
な放用性標識物は質量数２３−２５．０００の位置に移
Ｖ」する。さらに、この２３−２５．０００クルトンの
物質はモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４とウェ
スタン・プロットによる反応性を示した。 これらの結果により１７．０００タル１−ン及び８゜０
００ダルトンのポリペブタイドが一緒に複合してＴΔ４
抗原を形成することが示唆される。このＴＡ４抗原を構
成する別のポリペブタイドがヨウ化物の免疫沈降反応に
おいて観察されなかったという事実は、このポリペブタ
イドがヨウ化することができるヂロシンを含んでいない
（実例５及び６のＴＡ４抗原のａ、ｏｏｏダルトンのポ
リペブタイドに関する記述を参照）ことで説明できる。 例　　４ 成分の純化。　Ｅ、　　ｔｃｎｅｌｌａの胞子形成した
胞嚢を１０９ｇの胞嚢に対して１０ｄのＰＢＳに再懸濁
し、等体積のガラス粒と共に振盪して破壊した。 膜は遠心分１１ｆ　（１００，ＯＯＯｘｇ、６０分、４
℃）で除去し、その蛋白質は１％（■ハ）のＮＰ−４０
と、１０ｍＨのＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（１）ｔ１７
．５）と２５ｍＨのＮａＣｊ！と、Ｉ　ｎ＋ＨのＰＭＳ
Ｆと、１ｍＨのＴ　Ｌ　ＣＫと、０．１１０８のＴＰＣ
Ｋと、１０ＫＩＵ／ｄのアプロチニン中に可溶化した。 不溶解物は更に１００．ＯＯＯｘｇの回転（６０分、４
℃）で遠沈団塊にした。その蛋白質は、ＤＥＡＥ−セル
ローズ　カラムに吸看させ、１０１１１ＨのＴｒｉｓ−
１−ＩＣｊ！　（ｔ）１１７．７＞と０．０５％のＮＰ
−４０とで平衡させ、次に５ＱｍＨのＮａＣ１を含むこ
の緩衝液で洗滌した。２００１１ＭのＮａＣｊ！を含む
緩衝液で溶出後、１７．０００ダルトンのポリペプチド
はアセトン沈澱で濃縮し、その沈澱物は充填緩衝に再懸
濁し、煮沸し、５ＤＳ−ポリアクリルアミド（１５％）
中で電気泳動した。この実験及び他の実験に使用した旧
来の５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液は、６２．５１１
１ＨのＴｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ６，８）　、２％（Ｗ
／Ｖ　）のドデシル硫酸すｌ・リウム、１０％（Ｗハ）
のグリセロールおよび０．００１％のブロムフェノール
ブルーを含んでいた。非還元條件下で行うと規定した実
験の場合を除いて、この緩衝液は又５％（■ハ）のベー
タメルカプトエタノール ０００ダルトンのポリペプチド帯は染色（　Ｃｏｏｍａ
ｓｓｉｅ青又はＫＣｊりで固定した。ゲルの適切な部分
を取出し、その蛋白質を電気溶出し、アセトン沈澱で濃
縮した。ここで、これらの操作は、蛋白質を変性するも
ので、Ｓ−Ｓ結合で互に繋がったペプチド結合はこの方
法で分割される事を銘記すべきである。この方法で純化
された１７。 ０００ダルトンのポリペプチドは完全に純品であった。 ＴＡ４抗原の純イと特性 ゲル電気泳動に代る純化法として、ＤＥＡＥ−セルロー
スカラムから１９だスポロシス］−膜蛋白質を１Ｏｎ＋
Ｈ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ−ＨＣｉ（ｐＨ８）　、０．０５％
ＮＰ−４０で透析し、この緩衝で平衡にしたＤ　Ｅ　Ａ
　Ｅ　−　Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラム＜Ｂｉｏ　Ｒａｄ　）
　ニかけた。 このカラムはＮａＣｊ！の傾斜（０−３００ｍ）ｌ）で
同じ緩衝液中で溶出した。１７．０００ダルトンのポリ
ペプチド（ゲル電気泳動での移動に基づいて同定）は、
２００ｍＨ　　ＮａＣ１の所で溶出する物質中に見出さ
れた。この蛋白質を含む諸両分は３０ｍＨのリン酸カリ
ウム１１６．　５　）　、０．　０　５％　Ｚｗｉｔｔ
ｅｒｇｃｎじ　３　−　１　２　（　Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｃｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＬａＪｏｌｌａ，　ＣＡ　）　
、０　、　１　ｍＭディチオスレイトールで平衡にした
水酸化アパタイト　カラム（　Ｈ　Ｐ　ＨＴ　−　Ｂｉ
ｏＲａｄ）　Ｉ，−　カ’＋ｆ　タ。コノカラムハ平衡
化緩衝液で洗い、０．０５％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ
’とＱ，１ｍＨヂチオスレイトールを含む硫酸カリ傾斜
にかけて展開した。１７．０００ダルトンのポリペプチ
ド（上記のゲル電気泳動で同定した）は約９３ｍＨのリ
ン搬カリウムで溶出する物質中に現れた。 この方法で純化された１７．０００ダルトンのポリペプ
チドを含む画分は、８．０００ダルトンの第二のペプチ
ドも含んでいた。このペプチドは、Ｓ−Ｓ結合で１７，
０００ダルトンのポリペプチドに結合しているようであ
る。若し１７．０００ダルトンのペプチドを含む分画を
モノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４で免疫沈澱さ
せ、その沈澱蛋白質を上記のように、還元条件下でゲル
電気泳動分析すると、１７．０００ダルトンのポリペプ
チドちｓ．ｏｏｏダルトンのポリペプチドも共に免疫沈
澱することは明らかである故にスポロシスト膜調製液に
おいては、８，０００ダルｌ−ンのポリペプチドと１７
．０００ダルトンのポリペプチドは、Ｓ−８％合（多分
システィン橋）で結合していると思はれる。何故ならば
、このペプチドは強い還元剤が存在しない限り電気泳動
で現れなかった。非還元条件下では、Ｐｔｎ７．２Ａ４
／４の反応性ペプチド種は見かけ上の分子日で２１−２
４．０００として移動する。 ＴＡ４抗原の１１．５００　　ルトン　１の１上記の方
法によりＥ、　　ｔｅｎｏｌｌａのスポロサイト膜を調
製し、１０−のＰＢＳ＋１％ＴｒｉｔＯｎ　　Ｘ　−１
００に再懸濁した。この１０Ｉｔ１の膜懸濁物に０．１
％の８−ヒドロキシキノリンを含む８０％フェノールを
１０１ｄ、加へた。この懸濁は次に最大速度で３分回渦
流し、１０分間４０００ＰＰＭで遠沈した。このフェノ
ールと線状沈澱界面とは、取り出し、１００ｍＨ酢酸ア
ンモニウムを含むメタノール５容で稀釈し、−２０℃で
終夜沈澱させた。 アセトンで２回の洗滌後、不溶性蛋白質を０．５％ＳＤ
Ｓ中で８時間肪拌し、不溶物は２０．０００ＲＰＭの遠
沈を４℃で１時間か（プて除去した。 この試料はΔＧ５０ｌ−Ｘ８ｉ１１２合ベッド樹脂（１
ｕ／　５００　ｄ　）を含むＰＢＳ　（ＤＨ７，２）で
十分に透析した。ＴΔ４抗原の１１．５００ダルトン断
片は、次のようにして上澄からＰｔｎ７．２Ａ４／４モ
ノクロナ一ル抗体で下記のように免疫吸着させた。この
ポリペプチドは微ｉＭ定プレートＥＬＩＳＡでＰｔｎ７
．２Ａ４／４モノクロナ一ル抗体と反応する事が示され
た。 微１ＩＩ８１Ｉｉ定には、ＥＬＩＳＡポリスチレン９６
ウエルクラスター（Ｉｎ＋ｍａｌｏｎ　ＩＩ　）を１０
ｍＨグリシン［ｉ塩液（＋）１１９．６）中に終夜３７
℃で保温し抗原で感応性をつけた。た。ウェルを０．０
００５％１７）　Ｔｗｅｅｎ　−２０を含む０．１５Ｍ
のＰＢＳで洗い、ｐ　３３−　Ｔｗｅｅｎ中で３％のＢ
ＳＡで反応を中止し、再洗し、ＰＢＳで稀釈したＰｔｎ
７．２Ａ４／４単クロ一ン抗体と共に保温した。井穴は
前と同様に洗滌し、パーオキシダーゼと複合した抗−マ
ウスＩＱＧ血清をＰＢＳで稀釈したものと共に保温した
。ウェルは再洗して、Ｈ２ｏ２存在下に基質（２，２’
−アジノーデー［３−エチル−ベンズ−チアゾリンスル
フォンＭｌ）と共に保温した。発色は１５分後にＤｙｎ
ａｔｅｃｈ　ＨＲ−５８０微細滴定板ＥＬＩＳＡ読取器
で決定した。 ＴＡ４抗原の１１，５００ダルトン断片は微細滴定板Ｅ
ＬＩＳＡでＰｔｎ７．２Ａ４／４モノクロナ一ル抗体と
反応性がある事が示された。 例　　５ ■ ＴＡ４抗原の１７．０００ダルトンのペプチド成分のア
ミノ酸配列。　１７．０００ダルトンのペプチドのアミ
ノ酸配列決定は、そのＮ−末端アミノ酸は反応が阻止さ
れる（すなわち、Ｅｄｍａｎ崩壊は影響をうない（１４
））事が発見されてＩＡ雑であった。この問題を避ける
ために、その蛋白質を還元し、アルキル化し、次に種々
の化学試薬や酵素で分解した。得られたペプチドは、逆
相ＨＰＬＣｒ純化り、た（２６）、１７．０００ＴＡ４
抗原のダルトンの蛋白質はＣＮＢｒ（ＣＮ）、Ｖ８プロ
テアーゼ（Ｖ）、チモトリプシン（Ｃｌ−１＞およびエ
ンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ（Ｒ）で分解した。 プロテアーゼ分解の前に、純化した。ＴＡ４抗原の１８
．０００ダルトンのポリペプチドは３０ｍＨのヂチオス
レイトールと６Ｈのグアニヂンー１−１ｃｊ！（１１８
Ｂ）とで１時間空温での処理した。固体の沃化アレドア
ミドを最終濃度が１００ｍＨになるように加え、Ｉ）Ｉ
Ｉを８に調整して試料を室温で１時間保温した。還元と
アルキル化の後に試料は０．１％ＳＤＳ中で平衝化した
Ｐ　６　Ｄ　Ｇ　（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　
ＣＡ　）のスピンカラムで０．１Ｈ１ＭＯＰＳ　（ｐＨ
７，５）か逆相ＨＰＬＣを用いるかして、試薬類を除去
純化した。 ＣＮＢｒ分解には、蛋白質試料は７０％蟻酸中の１％Ｃ
ＮＢｒで２０時間４℃で処理をした。試料は５ａｖａｎ
ｔ　５ｐｅ（ｊｄＶａＣａ心弁１ｆ！ｆ器で乾固する迄
蒸発させ、０．１％トリフロロ醋酸（ＴＦＡ）又は０．
１％ＴＦＡと２０％アセトニドリール（ＣＨ３ＣＮ）中
に再溶解した。Ｖ８の分解は０．１％ＳＯ８と０．１８
　　ＭＯＰＳ　＜ｐＨ７，５）で２時間、３＝温で、５
０ミクログラムの１７，０００ダルトンのポリペプチド
対、１ミクログラムの■８の比で行った。この分解の後
に、試料に４倍容積のアセ１〜ンを加へ終夜−２０℃で
沈澱させた。そのアセトン沈澱物は上述のように再溶解
した。キモトリプシン消化は、０．０５％２ｗｉｔｔｅ
ｒｇｃｎじ３〜１２と０．１ＭＮ１−１４１−１ｃＯ３
（ｐＨ７，８＞中で１時間３７℃で１７．０００ダルト
ンのペプチド対Ａｒ０−Ｃの比が１５：１として行った
。アセトン沈澱を終夜−２０℃で行った後には、当ペプ
チドは主としてアセトン上澄中にあった。この上澄液を
蒸発乾固し、上）本のような方法で再溶解した。 ペプチドはｖｙｄａｃｃＪカラム＜ｔｈｅ　５ｃｐａｒ
ａｔｒｏｎｓＧｒｏｕｐｓ、　Ｉｎｃ、　、　１ｌｅｓ
ｐｅｒｉａ、　ＣＡ）で純化し、０−１００％のＣ１−
１３ＯＮＩＩ！ｉ斜で０．１％ＴＦＡ中で溶出した。 アミノ酸配列決定は、気相配列決定器（八ｐｐｌ　；ａ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｆｏｓｔｅｒ　
ｃｉｔｙ、　ＣＡ）を用いて１１ｕｎｋａｐｉ　ｔ　ｆ
Ｃｒらの方法（２５＞に従ッテ行ツタ。 フェニールチオヒダントイン（ＰＴＨ）Ｗ６アミノ酸は
ＨＰ　Ｌ　Ｃにより分析した（８）。 Ｎ−末端アミノ酸は阻止剤を取除いて直接に決定した。 １７，０００ダルトンのペプチドは０．１Ｍのリン酸カ
リウム（ｐＨ８，ｏ）と１０ｍＨのＥＤＴＡと５％のグ
リセロールと５ｎ＋Ｈのヂチオスレイトールと０．０５
％の２Ｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　”３−１２の中で１時間
、３７℃でビＯグルタメー１〜アミノペプチダーゼ（蛋
白質：　ＰＡＰ＝５　：　１　’）で処理した。処理後
、アミノ酸配列は決定する事が出来たが、それはＮ−末
端アミノ酸のグルタミンは環状化して閉鎖残塁のピロリ
ドン　カルボキル酸になっている事を直接示唆している
。 ＴＡ４抗原の１，７０００ダル１〜ンのペプチド成分の
全アミノ酸配列は「ｉｇｌに示しである。 ＴＡ４抗原の８．０００ダルトンのペプチド１分の部分
的アミノ酸配列。　ＴＡ４抗原から１元とアルキル化で
誘導した）純化８０００ダルトンのポリペプチドをＥｄ
ｍａｎ配列分析にけると、Ｎ−末端部分のアミノ酸配列
が直接に決定できた。このペプチドのＮ−末端部分の部
分アミノ酸配列は下記の通りである。 Ｎａ２　　　ａｌａ　　ａｌａ　　ＱＩＶ　　ｔｈｒｔ
ｈｒ　　ａｓｐ　　ａｌａ　　ｖａｌ　ｉｊ！ｅＣＶＳ
　　１ｅｕ　　ｔｈｒ　　ａｓｎ　　ＤｒＯａｌａ　　
ｐｒｏ　　１ｅｕ　　ａｌｕ　　ａｉａａｒｇ　　ｓｅ
ｒ　　ｇｆｔｎ　　ｐｒｏ　　ｐｈｅａｓｐ　　ａｓｐ
　Ｑｊ！ｕ 例　　６ 胞子形成した卵嚢（５Ｘ１０８）を洗滌し、上述のよう
な方法でスポロシストを分離した。分離したスポロシス
トは２回０．１ＭのＴｒｉｓ−１−Ｉ　Ｃ！、＜１）１
１８　、５　）　、と０．２ＭのＮａＣｊ！と１０ｍＨ
のＥＤＴＡとで洗滌した。このスポロサイトは０．１Ｍ
（７）ＴｒｉＳ−ＨＣｊ！、（ｐＨ１８，５）と０．２
ＭのＮａＣｊ！と５ＱｍＨのＥＤＴＡと１％のＳＤＳと
１５０ミクログラム／戒のブロテイナーゼにとで３０分
間６５℃に保温して溶解した。 室温迄冷却後、そのＤＮＡは等容積の液化フェノールで
１時間穏かに抽出した。１０分間３，００Ｑ　ｒｐ量の
遠心分離の後、水層を除去し、界面とフェノール部とは
１０ｍＨのＴｒ　ｉ　５−１−ｔｃｊ！　（１）１１８
）と１ｍＨのＥＤＴＡとで再抽出した。各水相は合併し
、１回フェノールで、２回クロロフォルム：イソアミー
ルアルコール（２４：１）で抽出した。 ＤＮＡはエタノール沈澱で分離した。そのＤＮＡ団塊は
１ＱｍＨのＴｒ　ｉ　５−１−ｔｃｊ！　（１）１１８
）と１ｍＨのＥＤＴＡ中に再溶解し、０．１５Ｉｒｒｇ
／ｄノＤＮＡアーゼを含まぬＲＮＡアーゼＡで３７℃１
時間の９８置をした。ＲＮＡアーゼ分解の後、試料は１
回フェノールで、１回クロロフォルム：イソアミールア
ルコールで抽出し、次にエタノールで沈澱さぜた。アガ
ロース　ゲル上で、このＤＮＡの大きさを２０キロ塩基
対より大きいと決定した。 バクテリオ　ファージλｇｔ　　ｗｅｓλＢ中でのＥ、
　　ｔｅｎｅｌｌａゲノム・ライブラリーの組立。 バクテリオファージλｇｔ　　ｗｅＳλＢ中にＬｔｅｎ
ｅ＋＋ａのゲノムＤＮＡライブラリー（３６）がＨａｎ
ｉａｔｉＳによって述べられた方法（４４）を用いて組
立てられた。ファージはポリエチレングリコール沈殿と
クロロフォルム抽出とｃｓｃ１傾斜遠心分離によって純
化された。純化したファージは１％ＳＤＳと５０ｍＨの
ＥＤＴＡ＋１５０ｖイクログラム／ｄのブロテイナーゼ
にとで解かれ、ＤＮＡは、フェノール抽出とエタノール
沈澱とで純化された。Ｅ、　　ｔｅｎｅｌｌａのゲノム
ＤＮＡとファージのＤＮＡとはＥＣ０ＲＩで完全に断片
化した。 ファージＤＮＡの左右両腕はそれらの接着末端において
アニイルしそれら腕は蔗糖濃度傾斜遠心分離で純化した
。ＥｃｏＲＩで分断したＤＮＡ腕の３０ミクログラムを
６ミクログラムのＥＣ０ＲＩで分断したＥ、　　ｔｅｎ
ｅｌｌａ　Ｄ　Ｎ　ＡとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接
着した。その接着したＤＮＡの２０ミクログラムをファ
ージ粒子中にｉｎ　　ＶｉｔｒＯで封入し、５×１０６
個の組換ファージ粒子のライブラリィを得た。 合成オリゴヌクレオチド。　ＴＡ４抗体の１７゜ＯＯＯ
ダル１〜ンのペプチド成分をコードした遺伝子部位に相
補的なオリゴヌクレオチドのプローブ（検針）を、Ｂ１
０３ＱａｒＣｈ　５ａＩＩＩＩ　（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ
、　ＩｎｃＳａｎ　Ｒａｆ５ｅｌ、　ＣＡ）を用いて合
成した。適切な部位に予期されるＤＮＡ配列は１７，０
００ダル１−ンのペプチドの示すアミノ酸配列から推定
した。遺伝子コードの二義性の為、正確なＤＮＡ配列は
予測できない。ＤＮＡ諸配列配列合物より成る゛混合検
針″を設計して合成した。そのうちの１つは１７，００
０ダルトンのペプチドに対して遺伝子完全相同適合性が
あるべきである。 オリゴヌクレオチドＣ０Ｄ９２は、ペプチド■１の６か
ら１２のアミノ酸に基づいていた。（例５の１７，００
０ダルトンのペプチドのアミノ酸配列を見よ） これは２５６個の異った配列を含む。オリゴヌクレオチ
ドＣ０Ｄ９２の構造は次のようである。 Ｇ　　八　　ＡＧＡ　　　へ ３’−ＣＣ八［■　へへ　ＣＧＡＡＴ　　ＡＴ　　ＧＧ
−５’丁　　ＧＧＴＧＧ ＣＣ アミノ酸配列：Ｇｊ！ｙ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｃ△ｉａ　
　　Ｔｙｒ　　　Ｔｙｒ　　　Ｐｒ。 オリゴヌクレオチｔ’　ＣＯＤ　９４　ハ、１７．００
０ダルトンのペプチドｖ２の３から６のアミノ酸に基づ
くものであった。それは６４種の異った配列を含んでい
た： ＧＡＧ ５’　　−ＴＧＧＡＡ　　ＡＣＡＧＡ　　ＡＴ八へＧ−
３’　　でＴＧＴ ＣＣ アミノ酸配列：ｒｒｐ　　Ｌｙｓ　　ＴｈｒＧｌｕ　　
Ｉｊ！ｅ　　ｃｙｓ オリゴヌクレオチドＣ０Ｄ１０８はペプチドＶ１の２５
−３０のアミノ酸に基づくものであった。 これは１６種の異った配列の混合より成る。オリゴヌク
レオチドＣ０Ｄ−１０８の構造は：ＴＧ　　　　　ＴＧ ３’−ＣＴ　　八Ｔ　　ＡＣＣＴＴ　　ＣＣＣＣ−５’
　　でＣＡ　　　　　ＣＡ アミノ酸配列は：ＧＩｔｕ　　Ｔｙｒ　　ＴｒｐしｙＳ
　　Ｇｌｙ　Ｇ１’Ｊ。 Ｅ、　　ｔｅｎｅｌｌａのゲノムＤＮＡライブラリィの
組換ファージは、シャーレ当り２−３Ｘ１０４に及ぶ高
密度で１５ｃ量のシャーレにプレートした。各シャーレ
のニトロセルローズ濾紙レプリカは、ＢｅｎｔＯｎとｉ
＋ａｖ　ｒ　ｓの方法（３）に従って調製した。 これら濾紙は次に適切な合成オリゴヌクレオチドと共に
保温した。すなわち（３２Ｐ）−ｄＡＴＰとＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼで高比放射能にラベルしたものであ
る。オートラヂオグラフイーで、ポジティブのプラーク
を同定した。オリゴヌクレオチドのＣ０Ｄ−９２と１０
８との両方に交雑したプラークだけが、ポジディプと記
録された。 交ｍＤＮＡを含む濾紙部分に相当するシャシの部分にあ
る。寒天小片を切り取った。そのファージは溶出し、低
密度（２０〜１００／プレート）で再接種し、３つのオ
リゴヌクレオチドのプローブ全部について再篩別した。 純粋な分離ポジティブのプラーク又はクローンを取上げ
た。ファージ１０８−１は、オリゴヌクレオチドＣ０Ｄ
−９２と強く交雑し、オリゴヌクレオチドＣ０Ｄ−１０
８と９４とにゆるやかに交雑する。Ｅ、　　ｔｅｎｅ＋
＋ａイオサー１−の精製と特性判定のためファージ１０
８−１はより大規模の培養を行った。ファージ１０８−
１の性能検定の結果、５．５００ＰＡ基対がＥＣ０ＲＩ
挿入されている事がわかった。 １０８−１の５．５００塩基対ＥＣ０ＲＩ断片挿入は、
ファージベクターからブラズミドｐＵｃ９にザブ−クロ
ーンしたく７８）。その組換ブラズミドは、種々の制限
エンドヌクレアーぜで分断し、ゲノムＤＮＡクローン中
でかなめとなる制限位置の決定に用いた。ＤＮＡ内にお
ける制限分断位置は、１７．０００ダルトンのペプチド
遺伝子の位６と方向を決定し、ＥｃｃＲＩによるゲノム
ＤＮＡ断片の順序づけの策を立てるに必要である。 その制限酵素分断位置地図はＦｉｇ２に示しである。１
７．０００ダルトンのペプチドの遺伝子位δと向きとは
この地図に示しである。 ＴＡ４抗原の１７．０００ダルトンのペプチド成分の遺
伝子で含むものは、Ｓ　ａ　ｎ　ｇ　ｅ、ｒのデオキシ
法（６２）で種々の制限酵素による断片を用いて配列を
決めた。ＤＮＡ合成のブライマーは、Ｃ０Ｄ−９２，９
４および１０８のオリゴヌクレオチドにも、他のオリゴ
ヌクレオチドと同様に含有されていた。このＤＮＡ配列
はＦｉｇ、３に示す。 Ｔへ４抗原をコードした遺伝子の構造。 ＤＮＡの配列は、アミノ酸配列分析で予１９１シたもの
と一致する。更に、蛋白質配列では明確でなかった特性
がこの遺伝子には３ツあった。蛋白質配列からの情報お
よび分泌性蛋白質の構造についての一般的情報を用いて
Ｔへ４抗原の遺伝子の構造が解明された。 スポロ勺イト膜の１７．０００ダルトンのペプチドの既
知のアミノ酸末端から０１ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｔｒｙ・・・
（例５を見よ）この遺伝子が上流２３個のアミノ酸を余
分にコードしている事は明白である。このＤＮＡ配列は
、典型的な”シグナル″配列で、多くの分泌蛋白質又は
膜蛋白質の遺伝子にあるアミノ酸末端で見られるもので
ある（４，３４）。これのコードするペプチドは、それ
らの合成位置（ｆ（ｌ脂質）からｍ脂質膜或はここを通
って蛋白質を輸送するのに必要なものである。このシグ
ナルペプチドは、分泌の過程で除去されるのが盾である
。ＴＡ４抗体はシグナルペプチドで作られるのは驚くに
当らない。何故ならば、この蛋白質が胞子体の外面に達
するためには、細胞質膜を通過する可能性が最も高いか
らである。このシグナル配列のアミノ末端は、Ｍｅｔゴ
ドンと考えられる。本質的には、それはどの蛋白質の場
合でも合成開始はメチオニンからである為である。 この遺伝子には３ケ所で、ＤＮＡ配列が蛋白質の配列符
合しない部位がある。第１は、既知の熟成１７．０００
ダルトン蛋白質の配列のＶａ＊−７のためのコドン内に
ある１０１塩基対の部分である。第２は、１７．０００
ダルトンのペプチドのＧｊ！Ｖ−６５とＧｊ！ｙ−６６
のためのコントンとの間にある１１４塩基対の配列であ
る。第３は８０００ダルトンのペプチドのＡＳＤ−１８
６コドンの中にある１２４塩基対の配列である。これら
三つの配列は、多くの真核生物遺伝子のコード部分内に
見られる典型的イントロン構造である。 これらはｍＲＮＡの前駆体の中にあって゛ゝスプライシ
ング″で知られるＲＮＡｌ１ｉ換機構によって除去され
中断されていないコード配列を、成熟ｍＲＮＡに作る。 ゛スプライシング接点″附近のＤＮＡ配列は、他の真核
生物遺伝子〈６５）に見られるものと一致している。 １７．０００ダルトンのペプチドの配列は、コドン１５
７と１５８とに相当する。ＧＩＶ−Ｇ１ｙ配列で終ると
思われる。我々は８．０００ダルトンのペプチドを、Ａ
Ｎａ−１６２に始まりＧｌｕ−１８Ｂに及ぶ配列で同定
した。コドンの１５９から１６１に当るＡｒｇ−Ａｒｇ
−１ｅｕのペプチド配列は未だ見付かっていない。この
二連ペプチドが他の蛋白質、例へばインシュリン（７１
）、の分割と同じ義構で除去される可能性がある。従っ
てＴＡ４抗原の２つのペプチドは、連続したヌクレオチ
ドの配列でコードされ、少くとも１つの蛋白質分解段階
がＡｊ！ａ−１６２点から始まる８、０００ダルトンの
ペプチドを発生させる。 例　　７ 胞子形成中のＴＡ４抗原の１ 胞子形成のどの時期にＴＡ４抗原が発生するかを決める
ために、特定のモノクロナール抗体Ｐｔｎ９．９０１２
との免疫反応によってその出現を測定した。モノクロナ
ール抗体ｐｔｎ９．９Ｄ１２は、ＴＡ４抗原と反応する
胞子体中相性のモノクロナール抗体である。還元条件下
では、ＴＡ４抗原のモノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ
４／４との反応性が破壊される。しかし、還元状態″Ｃ
−８ｉｓ　　ＰＡＧＥ　　ウェスターン　プロット上で
は、モノクロナール抗体のＰｔｎ９．９Ｄ１２はＴΔ４
抗原の１７，０００ダルトンのポリペプチド成分と反応
する。 最終ＰＢＳ洗滌の直後に開始して（例１を児よ）１Ｘ１
０７卵嚢を含む等分した部分標本を２４時間まで４時間
の開隔で取り出し、更に胞子形成開始後３６時間から４
８時間にも取り出した。胞子形成卵嚢は７−８００ＸＱ
で１０分間遠沈し、上澄を取り除いた。遠沈団塊はドラ
イアイス／メタノール浴で急凍結し、分析に用いる迄−
７０℃で保存した。 各団塊は２０１１８のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ＤＨ７，５＞
、５０ｍＨのＭＯＣＩ　　　、２５＋ｎＨのＮａＣｊ！
と同容積のガラス玉の中で解凍した。！しく、１０分間
の［１をした後、２００ミクロリツトルの２ＸＳＤＳ試
料入り！！街荷液３５〉を加えた。試料は３分間沸騰さ
せ、遠沈して屑を除き、各試料の２５−５０ミクロリツ
トルをＳＤＳポリアクリルアミドのゲル（２５％傾斜）
に加え分析に供した。蛋白質はニトロセルローズのシー
トに移した（５．７５）。ニトロセルローズ上の蛋白質
吸着位置の残っているものは、３％の（Ｗ／Ｖ）ゼラチ
ン、１０ｍＨのＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（［ｌＨ７，
５＞、１５０ｍＨのＮａＣｊ！と、０．０５％（＊／Ｖ
）のＮａＮ３とで３０分間室温でブロックした。ニトロ
セルローズ濾紙は、モノクロナール抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ
１２　（３％（Ｗ／Ｖ）の牛血清７　ルｙ　ミン、１０
１１１１４のＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　
、１５０１ＨのＮａＣｊ！と０．０５％（ｗ／ｖ）のＮ
ａＮ３中に約１０ミクログラム／ｄ）と終夜４℃で保温
した。そのニトロセルローズ濾紙を、５Ｏ−１００ｄの
抗体稀釈緩衝液で３度洗滌の後、附着したモノクロナー
ル抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ１２の位置と伍とをＶｅＣｔａＳ
ｔａｉｎＯＡ　Ｂ　ＣキットのマウスＩｇＧ用（Ｖｅｃ
ｔｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｉｎｃ、、
Ｂｕｒｌｉｎｇａｉｅ、ＣＡ）を用いて決定した。その
二１へロセルローズ濾紙は、ビオチニー化した抗マウス
ＩＱＧ（８０ミクロリツトルのビＡチニイル化抗マウス
抗体と８０ミクロリツトルの正常馬血清とを２１の抗体
稀釈緩衝液に入れたもの）に浸して、ゆるく３０分間室
温振盪をした。ニトロセルローズｉｆ！紙を、５０〜１
００ｄのＮａＮ３を含まない抗体稀釈緩衝液で３回洗滌
した。このニトロセルローズ濾紙は次に、Ｖｅｃｔａｓ
ｔａｉｎｏＡ　Ｂ　Ｃ試薬で３０分間室ｍに保ＧＬだ（
８０ミクロリツトルのＡｖｉｄｉｎＱ　Ｈ試薬Ａを８０
ミクロリツトルのビオチニイル化した西洋ワサビのパー
オキシダーゼ試薬ＢとをＮ　ａ　Ｈ３を含まない抗体稀
釈！１圀液の１５戒で混合し、濾紙に添加する前に３０
分間前保温を施したもの）。３回の洗滌後、添着した西
洋ワサビのベルオキシグーゼを４−クロロ−１−ナフト
ール（ｓｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、
　Ｌｏｕｉｓ、　ＮＯ）　、で呈色し測定した。このプ
ロットは、呈色液（３ｍｇ４−クロロ−１−ナフトール
／ｉメタノールと５ミクロリツトルの３０％の過酸化水
素とを、１０ｄの１０ＩＩＩＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　
（＋１８７．５）　　と１５ＱｍＨのＮａＣｊ！中にと
混ぜたちの２ｔｄ）で１０〜３０分間保温した。Ｐｔｎ
９．９Ｄ１２中の反応性物質の位置と吊を示す紫色バン
ドが現机だ後に、その二！ヘロセルローズのシートを２
回水洗し、風乾して、暗所貯蔵した。 ＴＡ４抗原の１７０００ダルトンのポリペプチドは、モ
ノクロナール抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ１２と免疫反応をする
が、この成分は、胞子形成開始後１６から２４時間に現
れ始め、その後経続する（図１）。この１６時間は、胞
子形成中の卵嚢内でスポロサイトになるはずの４つの構
造が伸長を始める時に相当する。 例　　８ ＴＡ４抗原をコードしたｍＲＮＡの）１１１と同、−ｃ
ＤＮＡが合成される前に、ＴＡ４抗原をコードするｍＲ
ＮＡが胞子形成のどの時期に現われるかを決める必要が
あった。２．５−５Ｘ１０８の卵嚢を含む等分した部分
標本を４時間間隔で無菌的に取出しく時間ゼロを含む）
、胞子形成開始後３６時間後から４８時間迄も同様に取
出した。この胞子形成中の卵ｎは７−８００ＸＱで１０
分間遠沈にかけ、上澄を取除いた。その遠沈団塊はドラ
イアイス／メタノール浴で急速凍結し、ＲＮＡが分離さ
れる迄−７０℃で保存した。 各団塊を、約１０倍容積の５Ｍのグアニヂンチオシアネ
ート、２ＱｍＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７、５）　１
０ｍＨのＥＤＴＡ、５％（■ハ）のベーターメルカプト
エタノールとの中で解凍し、その卵嚢を等容量の１．０
ａ＋ｍガラス玉と混ぜて１０分間の強振して速かに破砕
した。この試料を２％（Ｗ／Ｖ）のＮ−ラウロイールサ
ルコシンに入れた後、約８，０ＯＯｘｑの遠沈に室温で
かけて屑を除去した。ＲＮＡは上澄からｃｓｃｚクッシ
ョンの沈降（７６）で分離した。 そのＲＮＡの団塊を、２０１１１８のＴｒｉｓ−ＨＣｊ
！　　（ｐＨ７，５）　　と５ＱｍＨのＥＤＴＡ　（ｐ
１１８．０＞、０．２％のＳＤＳと１００単位／ｄのＲ
Ｎ　ａｓｉｎＴＨ（Ｐｒｏｉｅｇａ　Ｂｉｏ℃ｅｃ、　
Ｈａｄｉｓｏｎ、旧）及び１０ｍＨのベータメルカプ１
へメタノール中に再懸濁した。フェノールクロロホルム
：イソアミイルアルコール（２４：１）とクロロホルム
：イソアミイルアルコール＜２４＋１）とで交互に２回
づつ抽出した後、そのＲＮＡを沈澱させて一２０℃でエ
タノール中に貯蔵した。全ＲＮＡで約１００−３００ミ
クログラムが、２．５−５．５Ｘ１０８の卵貴から分離
された。 ポリＡを含むＲＮＡはオリゴ−ｄＴセルローズクロマト
グラフィ（２）で分離された。 全ＲＮＡを１０１０８のＴｒ　ｉ　５−ＨＣＪ！　（１
）ｆ１７．５）、１ｍＨのＥＤＴＡと０．２％（ｗ／ｖ
）のＳＤＳと０．４ＭのしｉＣ１中に入れて、オリゴｄ
Ｔセルローズ　カラム（Ｔｙｐｅ３、Ｃｏ１１ａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、、　Ｌｅｘ
ｉｎａｔｏｎ、　ＨＡ　）にかけた。ＲＮＡはＬｉＣｊ
！を含まない同じ緩衝液で４０”　において溶出された
。約５−１５ミクログラムのＡ”　ＲＮＡが２．５−５
．０ｘ１０８の卵嚢から分離された。 ｃＤＮＡ合成の鋳型としてポリＡ　　ＲＮＡを使う１盲
に、ＴＡ４抗原をコードしたｍＲＮＡの存在実証する事
が必要でった。ＴＡ４抗原のｍＲＮＡが存在づる事は、
種々の胞子形成段階の卵嚢から得たポリ△　ＲＮＡをＴ
Ａ４蛋白質をコードするクローンから得たＤＮＡと交雑
する事で実証された。胞子形成中の各時点のポリＡ　　
ＲＮＡの２ミクログラムをフォルムアルデヒドを含むゲ
ルで電気泳動した（４４）。そのＲＮＡをニトロセルロ
ーズ濾紙に移し、ノーザン　プロット分析にかけた。こ
のニトロセルローズ濾紙を、Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａのゲノ
ムのクローンで、予め［３２Ｐ〕−ｄＡＴＰ（４４）で
ニック翻訳しである１０８−１（Ｆｉｇｕｒｅ５　）と
呼ぶ７８５塩基対の３ａｃニーＰｖｕ　ＩＦ断片で検索
した。ＴＡ４抗原をコードするｍＲＮＡは胞子形成開始
後約１６−２０時間後とそれ以後に存在した（　Ｆｉｇ
ｕｒｅ６　）。ＴＡ４抗原のｍＲＮＡが現れる時間は、
ＴＡ４抗原の１７゜ＯＯＯダルトンでウェスタン　プロ
ットでモノクロナール抗体Ｐｔｎ９．９　　Ｄ１２と免
疫反応するサブユニットの出現と完全に一致する。これ
らの実験から、胞子形成段階から得たｍＲＮＡは、ｃＤ
ＮＡをＴＡ４抗原でコードさせるのに使用し１！７る事
を実証した。 例　　９ ＴＡ４抗原をコードするｃＤＮＡクローンの分離と特性
検定 ｃＤＮＡ ＴＡ４抗原をコードするヌクレオチドのシーケンスは、
容易に生育する、例へば大腸菌のような細胞の遺伝子と
して用い、ある種のＥｉｍｅｒｉａで起る鶏コクシジウ
ム症の予防！Ｂ種用ＴＡ４蛋白質生産に用い得る。ＴΔ
４遺伝子（Ｆｉｇｕｒｅ５　）には、三ケ所に、ＤＮＡ
のシーケンスが蛋白質のシーケンスと合致しない部分が
ある。これら３つのシーケンスは、多くの真核生物遺伝
子のコード部位内に典型的に見出されるイントロンであ
る。しかし、大腸菌では、イントロン付の遺伝子は本来
の蛋白質として発現されないので、ＴＡ４抗原をコード
するｃＤＮＡのクローンを分離する必要があった。 このクローンは、ＴＡ４抗原をコードするシーケンスを
一つながりで含んでいる。 ｃＤＮＡの合成 短連して、例３に述べたように分離した胞子形成卵１１
ｍＲＮＡは、Ｕｌｌｒｉｃｈその他（７６）に述べられ
たようにへＭＶ逆転写酵素の活動でｃＤＮＡに転写され
た。転写は、ＴＡ４抗体ｍＲＮＡの３′−ポリアデニン
化した末端にＪ５いて、オリゴ−６丁をプライマーとし
て始まる。第二のＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーピ１（
クレノフ断片）を用いて複写した。２ミクログラムのｍ
ＲＮＡから、３４０ｎ（ＩのｃＤＮＡを１１だ。 詳細には、２ミクログラムのオリゴ−ｄＴ（１２−１８
ヌクレオチド、ＰｈａｒｍａｃｉａＭｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ、　ＮＪ）は、２ミクログラムの純化ｒｒ＋Ｒ
ＮＡと５０１ｎ１４のＮａＣｊの存在下でアニーリング
させた。この除冷接着反応は９０℃に熱して後、徐々に
冷却するものである。逆転写酵素の反応には、デオキシ
ヌクレオシド三燐酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４種）を０．５
ｍＨのと４０単位の酵素（Ｈｏｌｅｃ旧ａｒＧｅｎｅｔ
ｉｃ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ、　　■ａｍｐａ、　ＦＬ　
）に加へた。逆転写反応緩衝は、次の如くである：１５
ｍＨのＴｒ　ｉ　５−Ｈ（、ｆ！、　ｔ）Ｈ８，３と２
１　ｍＨのＫＣｌと３ｍＨのＭｏＣｌ３　と０．１ｍＨ
のＥＤＴＡと３０ｍＭのベーターメルカプトエタノール
。この混合物は、４２℃で４５分間インキュベートした
。このＲＮＡ−ＤＮＡ複鎖はフェノール　クロロフォル
ムで１回抽出し、次に、エタノールで沈澱させた。 団塊にした試料は、次に１００ミクロリツトルの、次に
示す諸量による反応混合物に再懸濁した：２０ｍＨのＴ
ｒ　ｉ　５−１−（Ｃｌ！Ｉ）８７．　５と５ｍＨのＭ
ｇＣｌ２と１０Ｏｎ＋ＨのＫＣｌとそれぞれ２５０ｍ）
ｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ丁ＴＰ、ｄＧＴＰ。 ＲＮＡ分解酵素１−１（１００単位／ｄのＰｈａｒｍａ
Ｃｉａ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｄｉｖ
ｉｓｉｏｎ。 ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）およびＤＮＡｆｆ１合
酵素Ｉ　−・・にＩｅｎｏｗ断片（５０単位／　ｔｄｌ
　Ｂｏｅｈｒｉｎａｅｒ　Ｈａｎｎｈｅｉｍ。 Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ　）とを、合併し、
１２℃で６０分のインキュベートして反応させた。これ
ら酵素の合併活性で、そのＲＮＡ−ＤＮＡ複鎖からｒｌ
ＮＡを取り外す、それは最初のｃＤＮＡ鎖が次のｃＤＮ
Ａ量の合成として用いであるためである。この反応は、
ＥＤＴＡを最終濃度を１ＱｍＨに加へる事で止め、次に
ＤＮＡ複鎖をフェノール：クロロフォルムで抽出しエタ
ノールで沈澱さヒた。 ＤＮＡポリメラーゼ■とＲＮＡゼＨの反応順序は、３′
と５′の両端で整末端のｃＤＮＡ分子となる事を予想さ
れた。３′末端が整末端である事は、以後のｃＤＮＡク
ローニングに必要である。 ＴＡ４のｃＤＮＡライブラリーの構築 ＤＮＡは、１００ミクロリツトルの滅菌水に再懸濁した
。ｃＤＮＡを蔵書としてクローン化するには、ゲノムの
クローン１０８−１のＤＮＡシーケンスから決定しであ
る制限分断位置を用いた。 １つの５ａＣＩ位置が、ＴＡ４抗原の１．７０００ダル
トンの成熟サブユニットのＮ−末端グルタミンの直ぐ上
流にある。５ａｃＩ（５０１１位／ｄ＞によって、６Ｉ
ＩＩＨのＴ　ｒ　ｉ　Ｓ−１−１ｃ１（ｔｌｌ＋７．４
　＞と６１１１ＨのＭｇＣｌ２と６ＩｌｌＨのベーター
メルカプトエタノール存在下で、６０分間３７℃で約５
０ｎｇが消化された。 この試料は、フェノール：クロロフォルムで再抽出し、
エタノールで沈澱した。クローン化の段階として、ｐＵ
Ｃ１８ベクター（５６）を用いた。 そのベクターは、Ｓａｃ　Ｉと３ｍａｒとでン肖化を施
してあった。ＳｍａＩは、ｃＤＮＡの３′末端のりガー
ゼ接着に必須な整末端位置を提供した。 そのリゲーション反応は、４０ｎ（＋のベクターＤＮＡ
と５０ｒ＋ｏのｃＤＮＡとを用いて行った。リケーショ
ンハ、５ＱｍＨのＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（Ｄｌ１７
．８）と１０１１ＩＨのＭａＣｊ！２と２０ｍＨのヂチ
オスレイトールと１．Ｏａ＋ＨのｒＡＴＰとのりガーゼ
瑳液液に１ｌｉｉ位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１夜
１２℃で行った。 組換ＤＮＡ分子は、次に形質転換で大腸菌に１２、系統
ＭＨ１に導入した。この形質転換バクテリアは、抗生ア
ムビシリンを濃度５０ミクログラム／ｄ含何する寒天プ
レートに拡げた。プラスミドＤｔＪＣ１８（５６）はア
ムビシリン耐性遺伝子を持つので、組換プラスミドを得
たバクテリアだけが生き残った。これらのバクテリアは
各々生育してバクテリアコロニーを形成するため分裂し
た。 コロニー中の各細胞は最初の親細胞の子孫であって、同
一の組換プラスミドを保有する。約６７００のクローン
が組換ブラズミツド作用のため５０ナノグラムのｃＤＮ
Ａから得られた。 Ｔ△４　　ｃＤＮＡクローンの同定 このｃＤＮＡライブラリーは、ＧｒｕｎＳｔｅｉｎとＨ
ｏｇｎｅｓｓ　　（２０）に述べである高密度スクリー
ニング法でコロニー交雑によりスクリーニングした。ゲ
ノムクローンの７５塩基対の５ａｃＩ−ＰｖｕＩ［断片
は純化して、ニック−翻訳（４４）によつ３２Ｐで標識
した。ポジティブのクローンは同定し、純化して、又プ
ラスミドＤＮＡは更に分析するために分離した。ポジテ
ィブのｃＤＮＡのクローンに対する制限酵素分析は、ゲ
ノムのクローンにおける地図と合致した。ｐＴＣＤ２６
と呼ぶクローンのｃＤＮＡ挿入は、ゲノムのクローン（
６２）に対応するように作ったオリゴヌクレオチドを使
ったヂデオキシ配列決定により配列を行った。ｃＤＮＡ
　　ｐＴＣＤ２６クローンの塩基配列は、図表７に示す
。このｃＤＮＡのクローンは、大腸菌の系統ＪＭ８３に
形質転換をし、そのＪＭ８３　／　ｐＴ　ＣＤ　２６　
トＩ’ｆｉ定シタ系統はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ、　ＨＤ、に奇託し、ＡＴＣＣ受入番号５３３１
５を付与された。 この寄託は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ　　条約にもとづくもの
である。　そのＤＮＡ配列は、ゲノムのクローンから予
測されていたものである。そのｃＤＮＡから予測された
アミノ酸配列は、蛋白質の微母配列方法から得たアミノ
酸配列と一致した。 例　　１０ 大腸菌内におけるｃＤＮＡ誘゛ＴＡ４　原　−子の発現 ｃＤＮＡ誘導のＴＡ４Ａ４直接発現プラトミド築 ｃＤＮＡのクローンは、ＴＡ４蛋白質を細菌内で合成す
る遺伝子を提供する。ただし、そのｃＤＮＡは大腸菌内
で転写と翻訳をさせるに適切な信号を含まない。従って
、クローン化したｃＤＮＡは、大腸菌中で挿入されたｃ
ＤＮＡの蛋白質合成を上流ではじめるため、ＲＮＡポリ
メラーゼとリポソーム添着位置に対する強い催進要素を
含む発現ベクターに挿入された。ここで用いられるとお
りＴΔ４蛋白質という用語は図表７のｃＤＮＡの発現産
生物又は組換ＴＡ４誘導物質で細菌宿主細胞内で生成さ
れたいかなるものをもいう。ＴＡ４抗原という用語は、
ゲノムのＴＡ４ＤＮＡにより発現された自然発生の物質
をいい、胞子小体の表面に存在するか、又は胞子小体か
ら分離精製されたものを指す。 発現ベクターのｐＷＨＡ３３とｐＷＨＡ６３とは、３１
１ｉ遺伝子を挿入すれば、大腸菌でそれが発現できるよ
うに構築したものである。その技術に熟達している者に
は既に知られている他の適切なプラスミドも同様に使用
できる。プラスミドｐＷＨＡ３３とｏ　Ｗ　ＨＡ　６３
とは適当なプラスミドの２例である。ｐＷ　ｌ−（Ａ　
３３プラズミドは、３つのプロモーターｉａｃ、　Ｌａ
ｍｂｄａ　　ＰＲおよびｔｒｐ）を持ち、いずれも挿入
された遺伝子の転写を指令する。これらプロモーターと
、プラスミドｐＤＲ４５０からのプロモーターｔａｃ（
６１）ＰｈａｒｍａＣｉａ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ。 Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）とを種々の組合せで所
持するプラスミドを構築した。プラスミドｐＷＨΔ３３
とｐＷＨＡ６３との構造は図表８に図示する。 ＴΔ４蛋白質を大腸菌内で合成させる１つの方策は、リ
ポソーム添着点と、コーディングするシーケンスの前に
、メチオニンのコドン（ＡＴＧ）を単に供与することで
ある。そのような直接発現プラグミドをＴＡ４蛋白質用
に構築するには、ｃＤＮＡクローンであるｐＴＣＤ２６
を５ａｃＩで分断して、次にＤＮＡポリメラーゼエであ
るにＩｅｎｏｗ断片で処理して両端を整末端にする。オ
リゴヌクレオチド連結因子であるＣ０Ｄ−１５°４を整
へた５ａｃＩ分断末端に結紮して蛋白質合成を開始させ
る△ＴＧコドン及び、ｐＷＨＡ６３のＢａｍｔ−１１位
置に挿入してクローン化する時に要る３ａｍＨ１位置を
提供する。Ｃ０Ｄ−１５４の構造は： リポソーム添着点 ＣＡＴΔＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧ ヘ　　　　　　　　　　　　−ｒ ｆ３８　ｍ　Ｉ−１１の位＾　　開始コドンＣ０Ｄ−１
５４の開始コドンへＴＧの直前にＴＴを挿入すると、翻
訳開始の効率を高める。 リガーゼでオリゴヌクレオチドＣ０Ｄ−１５４をＤＴＣ
Ｄ２６の整末端に接着した後、その産物をＢａｍＨＩで
消化した。ＴＡ４ｍ伝子ｍ金子１２７６塩基対の断片は
ポリアクリルアミドのゲル上で純化し、次に発現ベクタ
ーｐＷＨＡ６３のＢａｍＨＩ位置に結紮して、プラグミ
ドＤＤＥＴ１を製作した。ＤＤＥＴＩの構造は図表８に
より図示表示する。もう一つの直接発現プラグミドｐＤ
ＥＴ２は、１）ＤＥＴＩから、Ｅ）ＤＥＴｌをＨｉｎｄ
Ｉ［［で消化してｌａｍｂｄａ　　Ｐ　Ｒとｌａｍｂｄ
ａＣＩとを含むＨｉｎｄｌ［断片を取除き、残部を再び
リゲース接看して構築した。１）ＤＥＴＩとｐＤＥＴ２
の直接発現ベクターは、大腸菌の系統ＲＥＮ３に形質転
換導入した。 組換ＤＮＡおよび寄生微生物でここでＲＥＮ３／ｐＤＥ
Ｔ１およびＲＥＮ３／ｐＤＥＴ２として述べられている
ものは、Ａｉ＋ｅｒｔｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｒｕ
ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　８
０に寄託し、ＡＴＣＣ受入番＠５３３１６および５３３
１８を付与されている。これらの寄託は、Ｂｔｌｄａｐ
ｅＳｔ条約にもとづくものである。 クローン化した遺伝子産物の大腸菌　八　と析 ｐＤＥＴｌとｐＤＥＴ２を内蔵する細胞の溶解物は、Ｔ
Ａ４蛋白質の有無について分析した。 ｐＤＥＴｌとｐＤＥＴ２とによって合成された蛋白質は
、細胞溶解物を、Ｅ、　　ｔｅ０ｅ１１ａＴＡ４抗原の
、還元して変性させた１７，０００ダルトンの蛋白質に
対して生成したマウス抗血清と共にウェスターンプロッ
ト検索で同定し、た。 ｐＤＥＴｌとｐＤＥＴ２の発現は、先ず大腸菌系統Ｗ３
１１０（Ｗ３１１０は、野生型ＬＯｎ＋プロテアーゼ遺
伝子を保有する）で分析した。、Ｗ３１１０／ｐＤＥＴ
１およびＷ３１１０／ｐＤＥＴ２の培養物は、し−ブロ
ス（１０ｇ／ｊ！のトリプトン（Ｄｉｒｃｏ　）と５　
ｇ／ｊ！の酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ　）と、５３／ｌの
ＮａＣ１とをＮ　ａＯＨでｐＨ７，５としたもの）に１
００ミクログラム／ｄのアムビシリンを加へて生育させ
た。最適の発現を得る為に、培養物は３０℃で細胞密度
が１−５Ｘ１０８／ｄになる迄振盪培養し、新しい培養
液で１：５に稀釈し、３７℃で２から６時間振盪培養し
た。遠心分離で細胞を収穫し、Ｍ９塩（６ｇ／ｌのＮａ
２ＨＰｏ４と３ｇ／ｌの Ｋ　ｌ−Ｉ　　Ｐ　Ｏ４と０．５ＳＪ／ｊ！のＮａＣ１
と１ｇ／１のＮＨ４Ｃｆ）中で洗い、５Ｘ１０　　／成
密度でＬａｅｍｍｌ　ｉゲル資料Ｗｌｌｉ（３５）に再
懸濁した。 １２ミクロリツ１〜ルの資料を１０分間、１００度に熱
し、１２−１／２％５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ｃｏｏｍ
ａｓｓ＋ｅブルーで染めるか、又はニトロセルローズ薄
片に移して１：１０００稀釈のマウス抗血清により上述
したような還元変性した１７．０００ダルトンのＴＡ４
ボリブチドを検索した。 ＴＡ４３ｆｆ伝子のＤＤＥＴｌおよびＣＩＤＥＴ２内で
の発現は、大腸菌のＷ３１１０系では非常に低い。２５
．０００ダルトンのＴ△４蛋白質は、単に稀薄にウェス
ターン　プロツー−に現れ、全細胞溶解物のＣｏｏｍａ
ｓｓｉｃブルーで染めたポリアクリルアミドのゲルでは
バックグラウンドの色の上には可視できず、この蛋白質
の合成量が大腸菌の全蛋白質の０．５％以下であること
を示唆している。 見かけ上の、ｐＤＥ丁１およびｐＤＥＴ２の低発現は、
ＴＡ４蛋白質が大腸菌Ｗ３１１０内で不安定なためであ
ったと思われる。その他の真核生物蛋白質も、大腸菌で
合成されると不安定である事が示されている（１８）。 従って、プラスミドｐＤＥＴ１とｐＤＥＴ２とがＩｏｎ
プロテアーゼを欠く大腸菌系統ＭＴＭ６　（７）に形質
転換導入した。ＭＴＭ６はＬｏｎ系ＡＢ１８９９（ＣＧ
ＳＣ＃１８９９）の非ムコイド誘導体である。 ＴＡ４遺伝子のｐＤＥＴｌおよびｐＤＥＴ２内での発現
は、系統ＭＴＭ６　（Ｌｏｎ−）で大幅に増進している
。発現はＷ３１１０について上述のように分析した。図
表９では、Ｗ３１１０（Ｌｏｎ＋）とＭＴＭ６　（Ｌｏ
ｎ−）　で（ＤｐＤＥＴｌの合成を比較している。ｐＤ
ＥＴｌからｐＤＥＴ２かいづれかのＤＮＡを内蔵する系
統は、’Ｍ元Ｌｔ：変性シタＥ、　　ｔｅｎｅｌｌａ　
Ｔ　Ａ　４抗原に対してつくられたマウス抗血清に免疫
反応を示す２５．０００ダルトンのポリペプチドを生産
した。これらの結果は、ＴＡ４抗原遺伝子がコードして
いる２５，０００ダルトンの蛋白質が、ＬｔＱｎｅｌｌ
ａ内ではジスルフイツドボンドにより結合した１７．０
００ダルトンと８，０００ダルトンのポリペプチドに分
断されているが、この翻訳後の処理は大腸菌内では起ら
ないことを示している。 溶解した材料を遠心分離法により可溶成分と非可溶成分
とに分ける場合、大部分の２５．０００ダルトン蛋白質
は不溶性の細胞溶解物の断片内に偏在する（図表９）。 この非溶解性蛋白質は胞子体膜中でＴＡ４抗原を認識す
るか、又はジスルフイツドボンドを還元することなく胞
子体膜から抽出した単クローン抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／
４と免疫反応を示さない。 ｐＤＥＴｌとｐＤＥＴ２との発現度ｔよＬｏｎ”の大腸
菌で低いため並びに、１ｏｎ−大腸菌は大規模培養を行
うのには非実用的であるために、丁Ａ４蛋白質は他の蛋
白質との融合によりそれを安定化した。適当な蛋白質は
如何なるものでも、この蛋白質融合に採用することがで
きる。以下の例では、適当と思われる２つの蛋白質のみ
を図示することにとどめる。即ち、ベータガラクトシダ
ーゼおよびプロキモシンである。 例　　１１ ミドの構築 プロテアーゼ欠失系統において、遺伝子工学で作るＴＡ
４蛋白質の最大数組をうる１１１２寮は、ＴＡ４蛋白質
が正常大腸菌細胞内での劣化によることを示唆している
。ＴＡ４遺伝子融合ブラズミドの構築は、ＴＡ４蛋白質
を大きな蛋白質に付着させることにより、ＴＡ４を大腸
菌内で安定させるという理由によるものである。数種の
真核生物蛋白質は、融合蛋白質（１７，２８＞としてバ
クテリア内で、安定性が更に高くなる。 組換プラスミドｐＢＧＧ２３は、雑種で、べ一ターガラ
ク１〜シダーぜＴＡ４抗原の融合蛋白質の発現用に構築
したものである。それは１００調節部位を含むブラズミ
ツドｐＤＫ２で、実質的にはブラズミツドＤＢＲ３２８
のＥＣ０ＲＩに挿入されたｌａｍｂｄａ　ｐｌａｃ　　
（２２、６２）からのベーターガラクトジターぜ遺伝子
（１００８コードン）から、及びｃＤＮへクローンｐＴ
ｃＤ２６から誘導される。ｐＢＧＣ２３の構築は図式に
て図表１０に示す。ｐＤＫ２以外の安定したプラスミド
も使用可能である。プラスミドｐＤＫ２は適当なプラス
ミドの１つの事例である。 ＴＡ４のｃＤＮＡシーケンスを含むｐＴＣＤ２６から得
た１２７６塩基対のＥＣＯＲｌ−Ｂａｍ１−ＩＩ断片は
、ｐＤＫ２２を０１出するため予めＥＣ０ＲＩとＢ　ａ
　ｍ　ＨＩにより消化されているブラズミツドｐＤＫ２
にクローン化されたものである。 クローンｏＤＫ２２は、予期したプラスミドを含み、そ
の中ではＴＡ４ｃＤＮＡのシーケンスがベーターガラク
１ヘーシダーゼのコードシーケンスのＣ末端部に、融合
化されていたものである。しかし、このプラスミド中で
は、ｃＤＮＡ誘導によるＴΔ４の］−ディングシーケン
スが、ベーターガラクトジグ−ぜのものと同一位相には
ない。従って、プラスミドＤＤＫ２２は、ＥｃｏＲＩで
消化され、ＤＮＡポリメラービエにｌｅｎｏｗ断片で処
理し、次いでＴ△４のコーディングシーケンスを正当な
読取り枠にはめるため再結紮された。このプラスミドは
ｐＢＧｃ２３として指定されたもので、ベーターガラク
トシダーゼ＜１ａＣＺ）のＣ−末端部に融合したＴＡ４
の蛋白質からなる蛋白質をコード化する雑種遺伝子を含
む。ｐＢＧＧ２３は大腸菌の系統ＪＭ８３とＲＥＮ３と
を形質転換するために使用された。 その組換ＤＮＡと、ＲＥＮ３／ｐＢＧＣ２３としてここ
に述べるその宿主微生物とは、＾ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｔｏｎ、　Ｉｔｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ、　ＨＤに寄託し、ＡＴＣＣ受入番号５
３３１７を付与されている。この寄託は、Ｂｕｄａｐｅ
ｓｔ条約にもとづくものである。 クローン化遺伝子産物の発現と分析 ｐＢＧＣ２３にコード化された蛋白質は、事例１０によ
る記述どおり純化、還元、変性した１７゜０００ダルト
ン分単位のＥ、ｔｅｎｅ１１ａＴＡ４抗原に対し、マウ
ス血清を使用して細胞溶解物のウェスタンプロットを検
索することにより同化したものである。ＪＭ８３／ＤＢ
ＧＣ２３およびＲＥＮ３／Ｃ）ＢＧＧ２３は、０．１％
のブドー糖と１００ミクログラム／ｄのアムビシリンを
補足されてし−プロスで培養した。培養物は３７℃で１
晩振とうし飽和状態に生育させた。ｉ［１Ｉ１１は遠心
分離により収穫し、Ｍ９塩中にて洗浄し、５×１０９／
ｄの密度でＬａｅｍｍｌｉゲル資料緩衝液に再懸濁した
。 この資料の２０ミクロリツトルは１０分間１００℃で加
熱し、７−１／２％の５Ｏ８−ＰＡＧＥにかけ、そして
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色するか、又は、ウェス
ターンプロットにかけるかの何れかによった。 染色、免疫汚点付けしたゲル（図表１１）は、予期した
１３５，０００ダルトンの融合蛋白質がＪＭ８３／Ｉ）
８ＧＣ２３およびＲＥＮ３／ＤＢＧＣ２３の培養で合成
されているが、ＪＭ８３単独では合成されてはいないこ
とを示した。そのウェスターン　プロットは、その蛋白
質がＥ。 ｔｅｎｅｌｌａ　Ｔ　Ａ　４抗原の還元、変性したもの
に対しマウス清面を使って免疫活性であることを示す。 図表８は、その蛋白質が細胞溶解物の不溶性断片中にあ
る事を示す。上述のように生育された培養物は、リソザ
イムとＥＤＴＡによる処理後超音波でＦＪ解し、次に細
胞膜は２％のトリトンで１晩４℃にて溶液化されたもの
である。不溶性物質は、遠心分離法により収集され、１
３５．０００ダルトンのｐＢＧｃ２３の産生物はこの断
片中にあった。 ρＢＧＣ２３の蛋白質は大腸菌で高水準で合成されてい
るが、しかし不溶性であり、単クローン抗体、Ｐｔｎ７
．２Ａ４／４に反応しない。更に、この不溶性ｐＢＧＣ
２３蛋白質はマウスに注射した場合、天然のＴＡ４抗原
と交叉反応をする抗体を産生しない。 例　　１２ Ｅ、Ｃ０ＬＩ中のプロキモシン融合タンパク質としての
ＴＡ４タンパク質の発現 ρＤＥＴ１、ｐＤＥＴ２またはｐＢＧｃ２３を含む細胞
が生成したタンパク質は大部分または全体的に不溶性で
あり、そのため明らかにモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．
２Ａ４／４に対し活性でない。不溶性で不活性な形で旦
、Ｃ０１ｉ中で生成されたその他の真核タンパク質は可
溶性となり、その活性をとり戻すことが認められた。こ
のようなタンパク質の１つがウシのプロキモシンである
。 ＴＡ４ｃＤＮＡ配列をプロキモシン用に開発された方法
により可溶化及び活性化された不溶性融合タンパク質の
生成のためにウシのプロキモシンと融合させた。融合タ
ンパク質の特有の再結合の範囲は、キモシンの活性を追
跡することによりモニターすることができた。 プラスミドコード化プロキモシン−ＴＡ４融合タンパク
質はＴＡ４ｃＤＮＡ配列をクローン化されたウシのプロ
キモシン遺伝子ｐ　Ｗ　ｌ−Ｉ　Ａ　４３に組み入れる
方法すなわちそれはＥ、ｃｏｌｉ中の安定ではあるが不
溶性型のプロキモシンの合成を指令するもので、その方
法により作成された（４７）。その伯のプラスミドも利
用できるものがある。適切なプラスミドの１つはｐＷＨ
Ａ４３である。 プロキモシン−ＴＡ４遺伝子融合を構築するためｌ）　
Ｗ　ＨＡ　４３を図１２に示すようにＤ　Ｗ　ＨＡ　９
３に転換した。初めにｔａｃプロモーターｐＤＲ５４０
（６１）を特定制限エンドヌクレアーゼ置換によりｐ　
Ｗ　ｌ−Ｉ　Ａ　４９を生成するためｔｒｏプロモータ
ーに２換した。次にプロキモシンの正常停止コドンをｐ
　Ｗ　ｆ−Ｉ　Ａ　９３を得るために、ｐＭＨ２２の修
飾プロキモシンＣ末端部位にＤＷＨＡ４９のプロキモシ
ン遺伝子のＣ末端部位を置換して取り除いた。ｏＭｔ−
１２２はｃＤＮＡのクローンＰ５Ｇ３の遺伝子の半分の
Ｃ末端を含み、そのＣ末端はプラスミドｐｕｃｉ　ｓ中
のポリリンカー及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子フラグ
メントのプロキ［シン３ｃ１１位（停止コドンの欠失位
）は融合されたちのである。プロキモシン−Ｔ’　Ａ　
４　遺伝子融合の構築では１２９４ｂＤのフラグメント
ｐｃｏｃ１２をＥｃｏＲＩ及びＰＳｔｌの酵素と消化さ
せてｃＤＮＡクローンＤＴＣＤ２６から取り除き、次い
でＤＮＡプラント末端を形成するためにヤエナリヌクレ
アーピと消化させた。プラスミド１）ＷＨ△９３をＸｂ
ａＩと消化させ、ヤエナリヌクレアーぜと処理し、プラ
ント末端ベクターを組換えプラスミドｐｃＯｃ１１を生
成させるためＴＡ４ｃＤＮＡ配列（ヤエナリヌクレアー
ゼ処理後の１２８６ｂｏ）を持つプラント末端と連結し
た。この連結後ＴＡ４誘導配列はプロキモシンのコード
配列の読み取りフレームからはずれていることがわかっ
た。読み取りフレームを変えるためｐｃＯｃｌｌを５ａ
Ｃ１及びヤエナリヌクレアーゼと消化し、次にｐｃＯｃ
ｌ　２を生成させるため再連結を行った。ｐｃＯｃｌ　
２の構造は図１３に図表として示した。プラスミドｐｃ
Ｏｃ１２をＮａｒ工の消化及び再連結による２つのＮａ
ｒＩフラグメントの除去により、プロキモシンまたはＴ
Ａ４配列を欠失せずにプラスミドの量を減らして、ｐｃ
Ｏｃｌ４に修飾した。プラスミドｐＣＯＣ１４を５ｐｈ
ｉとの消化及び再連結による２　４９　ｂｐＳ　ｐｈ　
Ｉフラグメントの除去によりｐｃＯｃ２０に修飾した。 １）ＣＯＣ２０のプロキモシン配列中の２４９ヌクレオ
チドの欠失は正しい読み取り枠を保持しており、融合タ
ンパク質のプロキモシン部位の８３アミノ酸の欠失を生
じることになる。 発現研究のためｐｃＯｃｌ　２及びｐｃＯｃ２０をＲＥ
Ｎ３菌株、ＣＹ１５００１のバクテリオファージＴ１耐
性誘導体、Ｗ３１１０のｕＲ誘導体中に形質転換した。 ＲＥＮ３／ｐｃＯｃ１２及びＲＥＮ３／ｐｃＯｃ２０と
してここで記述する組換えＤＮＡ及び宿主微生物はメリ
ーランド州ロックビルのアメリカン基準培養収集社に預
託され、ＡＴＣＣの受は入れ番号がそれぞれ５３３１４
及び１３３１３とつけられた。これらはブタベスト条約
にもとづいて実施された。 クローン化した遺伝子生成物の発現及び分析ＤＣＯＣ１
２及びｐｃＯｃ２０ＤＮＡによりコード化されたタンパ
ク質を、事例１０に記述するとおり、電気泳動及びニト
ロセルロース紙への移動による分別法に従い免疫学的に
同定した。 ＲＥＮ３／ＤＣＯＣ１２及びＲＥＮ３／ｐｃＯｃ２０を
０．１％グルコース及び１００μ’Ｊ／ｄアンピシリン
を加えたし一ブイヨン中で３０℃１晩撮とうして飽和し
た。細胞を遠心分離により採取しＭ９塩で洗浄し、Ｌａ
ｅｌｌｌｌｌｌｉサンプル緩衝液に再懸濁した。サンプ
ルを１００℃で１０分加熱しＳＤＳ中で１０％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行い、記述どおりクーマシー
ブルーで染色するかまたはニトロセルロース紙に移して
免疫学的分析を行った。 トリトンに不溶性の物質は例１１に記述するとおり、Ｒ
ＥＮ３／ｐｃＯｃ１２及びＲＥＮ３／ｐｃＯｃ２０の培
養によって調整し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行った。 図１４に示した染色されたゲル及びウエスタンプロット
は、ｐｃＯｃｌ　２ＤＮＡが、予想分子量約６５．６０
０ドルトンの還元及び変性を受けたＥ、　　ｔｅｎｅｌ
ｌａ　Ｔ　Ａ　４抗原に対するマウス血清に免疫活性で
あるポリペプチドをコード化することを示している。予
想どおりタンパク質は細胞溶解質の不溶性分画中に存在
している。プラスミドｐＣＯＣ２０ＯＮＡ１．ｔｌｌｌ
ｉｉ５６．５００（７）免疫活性ポリペプチドをコード
化する。ｐｃｏｃ２０のＴＡ４タンパク質もまた１ａ胞
の不溶性分画中に存在する。 例１３ 不溶性状態からのＴＡ４タンパク質の抽出及びモノクロ
ーナル抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４との免疫活性の証明 プラスミドＤＤＥＴ１、ＤＤＥＴ２、ｏＢＧｃ２３、ｐ
ｃｏｃｉ２、ｐｃＯｃ２０で表わされるｔＥ、ｃｏｌｉ
の生成物は、すべて水にわずかしか溶けないかまったく
不溶性である。このプラスミドはすべてＬａｅｎｕ＋＋
　ｌ　ｉサンプル用緩衝液中でＳａさせると溶解し、１
７．０００ドルトンのＴＡ４抗原リブユニットに対して
隆起するマウス抗血精と反応するようになる。しかし、
この条件ではモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４
とはどれも反応しない。そのため、モノクローナル抗体
Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と反応する抗原を生成するためこ
れらのＥ、ｃｏｌｉの合成するタンパク質を可溶化及び
再生することが必要であった。その結果動物中のＥ、　
　ｔｅｎｅｌ＋ａに対して反応する中和及び防岨抗体の
隆起が可能となった。 細菌的に生成したＴＡ４タンパク質の抽出及び再生 最初にＤＣＯＣｌ　２タンパク質を活性酵素生成するた
めウシのプロキモシンの可溶化及び再生法として知られ
る方法により可溶化及び再生を行った（４７）。この方
法によりプロキモシン活性（キモシンに対する酸活性化
後のミルクの凝固）及びＰｔｎ７．２Ａ４／４免疫活性
の両方を持つ純粋で水溶性１）ＣＯＣｌ　２タンパク質
が生成された。免疫活性の回復条件が最適化されたので
下記のとおり記述する。 プラスミドｐｃＯｃ１２を上記のようにウシのプロキモ
シンのコード配列の３′末端とＴＡ４ポリペプチドのコ
ード配列の５′末端とを融合することにより構築した。 このプラスミドは標準的な手法を用いるＥ、ｃｏｌｔ菌
株ＲＥＮ３の形質転換に使用され、アンピシリン耐性コ
ロニーは精製されて培養に使われた。新たに溝をつけた
寒天プレートのアンピシリン耐性コロニーをＬ−ブイヨ
ン及び１００μｇ／ｒｄアンピシリンを含む液体培地５
ｄの接種に使用した。培養物をＩＢｌｒ！の濁りが目で
見えるようになるまで、３７℃で数時間振とうして生育
させた。培養物５成が０．１％グルコースを添加したし
一ブイヨン／アンピシリン溶液１１の入ったフラスコに
移された。この培養物を定常期に到達するまで３０℃で
撮とうじて生育させた。細胞を遠心分離により収集し、
−７０℃で冷凍保存した。ＤＣＯＣｌ２を含む旦、ｃｏ
ｌｉ菌株ＲＥＮ３の凍った細胞ペースト１０ｇを２５ｍ
Ｈトリス塩酸ｐ１ｌ８．１０ｍＨＥＤＴＡ、１１Ｉ！ｉ
Ｆ／ａｄリゾチームを含む溶液１００ａｄ！中に懸濁さ
せた。短時間インキュベートした後、溶解した細胞をさ
らに音波により粉砕した。旦、ｃｏｌｉ中で合成された
プロキモシンは１８胞膜及び膜タンパク質を溶かす非イ
オン性洗浄剤が存在していても細胞溶解質中では完全な
不溶性を示してきた。ｐｃＯｃｌ２によるコード化した
プロキモシン−ＴＡ４９合タンパク質の部分的な精製を
、細胞溶解質の１０゜０００ｇで１０分間の遠心分離に
より行い、次いで２％トリトンＸ−１００洗浄剤（シグ
マ化学社、ミズーリ州セントルイス）を含む緩衝液でベ
レット状の細胞の残屑の洗浄剤による抽出を１晩かけて
行った。不溶性のまま残った融合タンパク質を遠心分離
により収集した。 この精製法は２％ｌ−リドンＸ−１００を含む溶液で不
溶性物質を更に洗浄することにより若干改良された。ｐ
ｃＯｃ１２プロキモシン−ＴＡ４タンパク質をＤＩ＋７
．５の１０ｍＭリン酸す１−リウム緩衝液６３戒或いは
１２．６ｄ中に懸濁させた。この懸濁液に固体尿素を最
ｎ濃度がそれぞれ１０戒或は２Ｃ）ｎｅ中に６〜８Ｍと
なるように添加すると懸濁液が完全に溶解する。 このようにして生じた透明な溶液を最終体積が１０００
ｍ／ＳとなるようｐＨ１１，０に調製したリン酸す１〜
リウム緩衝液１０＃Ｉｉ！を加えて１００または５０侶
に希釈した。溶液を全て混合し１５〜２５℃で２０分放
置した。それから溶液のｐＨが８．３となるように０．
２Ｎ塩酸を３分以上にわたり添加した。 このようにして生じた溶液を分析または保管前に１時間
以上室温で放置した。この溶液には純度８０〜９０％の
分子量６５．６００ドルトンのタンパク質が約１００μ
９／ｒｄ含まれていた。サンプルのキモシン酵素活性ま
たはモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４に対する
免疫活性を以下詳述するとおり分析した。 キモシン活性の分析は適切に再生されたタンパク質の回
復をモニターする上で便利な方法であった。酸活性化に
続くミルク凝固の測定によるｐＣＯＣＩ　２タンパク質
のキモシン活性の回復とｐｔｎ７．２Δ４／４の免疫活
性の回復はよい相関がみられた。Ｃ）ＣＯＣｌ　２タン
パク質の免疫活性の回復については下記に記述し図１５
に示す。 以上記述したその他のタンパク質及びタンパク質融合は
同様または同一の方法により可溶化及び再生された。プ
ラスミドｐｃＯｃ２０は図１３に図示したようにｐｃＯ
ｃ１４融合タンパ融合タンパクモシン成分中の５ｐｈＩ
欠失により構築された。この欠失は遺伝子融合中の正し
い読み取り枠を保持しておりｐｃＯｃ２０融合タンパ融
合タンパ性質たはそれに続く可溶化または再生に何の影
響も与えなかった。一方ｐＣＯＣ２０＠合タンパク質は
そのＴＡ４エピドープの免疫活性を保持しており欠失含
有プロキモシン域はミルク凝固活性を持つ形には活性化
されなかった。プラスミドｐｃＯｃ２０は上述のとおり
培養された旦、ｃｏｌｉ菌株ＲＥＮ３の形質転換に使用
した。 不溶性ｐｃＯｃ２０プロキモシンＴＡ４タンパク質は上
記の方法でＲＥＮ３／ｐｃＯｃ２０の凍結細胞ペースト
１０ｇから分離、再生した。 プラスミドｐＢＧＯ２３は、図１０に図示したように旦
、ｃｏｌｔβ−ガラクトシダーゼのコード配列３′末端
をＴＡ４ポリペプチド誘導ｃＤＮＡのコード配列５′末
端に融合することによりそれを構築した。このプラスミ
ドはＥ、Ｃｏ　ｌ　ｉ菌株ＪＭ８３　（上述のとおり培
養したもの）の形質転換に用いた。β−ガラクトシダー
ゼ−ＴＡ４融合ポリペプチドは、細胞溶解質中では不溶
性であることがわかり、また上述の方法でＪＭ８３／ｐ
ＢＧＧ２３の凍結細胞ペースト１０ｆｆから、それを分
離再生した。プラスミドｏＤＥＴ２は上記に図示したと
おり、融合ポリペプチドとしてよりむしろＴＡ４タンパ
ク質を直接発現するものとして構築した。ＤＤＥＴ２の
最適数示が得られたのはプロテアーゼ欠失 旦、ＣＯ＋＋菌株ＭＴＭ６中からであった。この菌株は
次の例外を除いて上述の方法で培養された。 ３０℃で生育した培養細胞１．ｉ！が吸光度０．５（６
００ｎｍにおける吸光度）になった時、温度は１〜２時
間で３７℃まで上昇した。細胞を採集し、−７０℃で冷
凍保存した。 ＭＴＭ６／ＤＤＥＴ２の凍結細胞ペースト１０９を上ｊ
玉の方法を用いて溶解し、トリトン不溶性タンパク質を
分離して上述のとおり尿素に溶解した。可溶性タンパク
質はｐＨ８，５のリン酸ナトリウム緩衝液ｉＱｍＨに対
する過剰透析により再生した。 再生サンプルの免疫検つ法 モノクローナル抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４で再生された
ｐＣＯＣ１２、ｐｃＯｃ２０．ｐＤＥＴ２及びｐＢＧＧ
２３タンパク質をＥ、　　ｔｅｎｅｌｌａ　スポロシス
トから精製されたＴＡ４抗原に関して測定した。ミクロ
タイタープレートのそれぞれの井戸（イムロンエミクロ
エリサ平底井戸プレート、ダイナチック研究所（株）、
アレクサンドリア■）にｐＨ８，０，１０ｍＭリン酸水
素二ナトリウム、１５０１１１Ｈｊ！！化ナトリウム、
０．０１％ツビツタージエント０３−１２を含む溶液で
希釈した抗原１００μｍでコートした。再生サンプルと
して１：１０から１：１０００の割合に希釈した抗原に
ついて試験をした。精製したＥ、　　ｔｅｎｅｌｌａ抗
原を０．５〜１０ｎ（］／井戸で平行して試験した。プ
レートに室温で１時間次に４℃で１晩、抗原溶液とイン
キュベートすることにより抗原をコートした。 井戸は空にしてから０．０２％（ｖ／■）トウエーン２
０　（ＰＢＳＴ）を含むリン酸緩衝液でｐｌ＋７．２に
した生理食塩水で３回洗浄した。プレートは３％（ｗ／
ｖ）ゼラチン、１０１＋１Ｈトリス塩酸ｐＨ７，５，１
５０ｍＨ塩化ナトリウム、０．０５％（Ｗ／Ｖ）アジ化
ナトリウムを含む溶液で室温で３０分処理して残ってい
るタンパク質結合部位をブロックした。それからプレー
トをモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４　（３％
［Ｗ／■］ウシ血清アルブミン中で３０μｇ／Ｉｄｌ）
、１０１１Ｈトリス塩酸ｐ１１７．５．１５０１１１Ｈ
塩化ナトリウム、０．０５％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウ
ムを含む溶液で室温で２時間インキュベートした。井戸
をＰＢＳＴで３回洗浄後、結合モノクローナル抗体Ｐｔ
　ｎＡ４／４は、マウスＩａＧ用のベクタスティン１Ｈ
Ａ　Ｂ　Ｃキット（ベクター研究所（株）カリフォルニ
ア州バーリンガム）を用いて測定した。 プレートの各々のＩｒはそれぞれビオチン化したウマ抗
マウスＩ　ｑＧｌ　００μ℃で満たしくビオチン化抗マ
ウス抗体４０μ！及び正常なウマ血清８０１１１を１０
ｒｄＰＢＳＴ中に含む）、室温で３０分インキュベート
した。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。それからプ
レートにベクタスティン■△ＢＧ試薬１００μｌ／丼戸
加えて室温で３０分インキュベートした（ＰＢＳＴ中で
ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ８．０μｍと混
合したアビジンＤ　Ｉ−１試薬Ａ８０μｌをプレートに
加える前に３０分間ブレインキュベートした）。 ＰＢＳＴで５回洗浄してから結合した西洋ワサビペルオ
キシダーゼを１００μｌ基貿／井戸（ｐ１１５．３の５
Ｏｎ＋Ｈクエン酸／リン酸緩衝液中に０．１ｍｇ／ｄの
２．２’−７ジ）−シー（３−Ｉチル−ベンズチアゾリ
ン−６スルホン酸と０．０１５％（Ｖ／Ｖ）過酸化水素
を加えた溶液）を加えることにより測定した。プレート
を暗室で室温でインキュベートした。４１４ｎｍにおり
る吸光度を基質を加えてから１０〜６０分後にタイター
チックマルチスキャン■自動プレート読み取り器（フロ
ー研究所（株）、バージニア州マツクリーン）中で測定
した。 種々の再生抗原（たとえば、ｐＢＧｃ２３、ｐｃＯｃｌ
　２、ｐｃＯｃ２０及びｐＤＥＴ２によりコード化され
たもの）の相対的免疫活性をＬｔｅｎｅｌｌａオオシス
トから抽出したＴＡ４抗原のそれと比較した。それぞれ
のタンパク質の量の増加分をミクロタイタープレートの
井戸に加えそれぞれの井戸中の反応のｏＤ４１４を存在
する抗原型に対してプロットした（図１５）。細菌的に
生成された上述の変性／再生処理に従うタンパク質の免
疫活性は、モル平衡基準でＥ、　　ｔ［ｔｅｌｌａから
抽出されたタンパク質の活性の１０〜３０％の範囲であ
った。 バク質の抽出 大腸菌の産物である表現プラスミド、 ｐＤＥＴ　　、ｐＤＥＴ　　、ｐＢＧＣ２３、ｐｃＯｃ
ｌ２およびｐＣＯＣ２ｏは、全てほとんど、あるいは全
く不溶性である。これらは全て、Ｌａｅｍｍ　Ｉ　＋検
体緩衝液中で沸騰して可溶化でき、１７０００ダルトン
のＴＡ４抗体サブユニットに対して生成されたマウス抗
血清と反応する。しかしながら、これらの条件下では、
いずれも、モノクローナル抗体、ｐｔｎ７．２Ａ４／４
と反応しない。それ故、モノクローナル抗体ｐｔｎ７．
２Ａ４／４と反応し、その結果、動物で、Ｅｔｅｎｅｌ
ｌａに対して中和、保護作用を有する抗体反応を生じる
ような形で、抗原を生成するために、これらの大腸菌に
より合成されるタンパク質を可溶化し、復元することが
必要であった。 ＴＡ４抗原−プロキモシン融合ｐｃｏｃ１□の可溶化お
よび復元化が報告されている。 プラスミドｐＤＥＴ２は、上図に示されているように、
融合ポリペプチドとしてよりもむしろＴＡ４タンパク質
を直接的に表現できるように構成されている。ｐＤＥＴ
２の最適な収率は、プロテアーゼ欠乏症大腸菌ＭＴＭ６
および５Ｇ９３６で達成された。 抗原回収の培養条件を最適化させ、下記に記す。 ｐＤＥＴ２タンパク質は、ＴＡ４プロキモシン融合を可
溶化し、復元し、免疫反応抗原（例１３）を生成するこ
とが知られている方法により、可溶化、復元した。この
方法では、ｐｔｎ７．２Ａ４／４免疫反応性を有した純
粋な可溶性、ｐＤＥＴ２タンパク質を生成した。 プラスミドｐＤＥＴ２は、上述のようにＵ！Ｊ！ｊされ
た。このプラスミドを標準的な方法を用いて大腸菌５Ｇ
９３６株を変換させるために使用し、アンピシリン耐性
コロニーを精製し、培養のために用いた。新しく画線し
た寒天板からのアンピシリン耐性コロニーを、Ｌ−肉汁
およびアンピシリン１００μ９／ｄを含む１００量の液
体培遷の接種に用いた。培地は、振どう下で、３０℃、
−昼夜増殖させた。１００ｄの培地を、１１のし一肉汁
／アンピシリンを入れたフラスコ中段した。この培地を
３０℃、振とうしながら、ＯＤ６゜ｏが１．０になるま
で増殖させた。ｌ　ＰＴＧを２１１１８に加え、培地を
３０℃で、２〜３時間以上増殖させた。細胞は遠心分離
で集め、−７０℃で凍結貯蔵した。 ｐＤＥＴ　　を含む大腸菌５Ｇ９３６の凍結細胞ペース
ト５ｇを２５＋ｎＨのトリス−塩酸ｐＨ８，１０［１１
ＨのＥＤＴＡ、０．５ＩｙＪ／ｄのリゾチーム、４０ｄ
中に懸濁した。短いインキュベーション後、溶解細胞は
さらに音波処理により破壊した。大腸菌で合成されたｐ
ＤＥＴ２タンパク質が、細胞溶解物中に完全に不溶性で
あることが明らかにされているため、ｐＤＥＴ−２−デ
ィング化ＴＡ４タンパク質を１００．ＯＯＯＸｇで１時
間、細胞溶解物質を遠心分離し、その後、５％トリトン
Ｘ−１００洗浄液（Ｓｉｕａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
、、セントルイス。 Ｍｏ）　、２０ｍＨＥＤＴＡを含む緩衝液中で６０分間
、２５℃、ベレット化細胞屑を抽出して精製した。ｐＤ
ＥＴ２タンパク質は不溶状態にあり、１００．０ＯＯＸ
Ｑで遠心分離により集めた。 ｐＤＥＴ２不溶物質を１２量の１ＱｍＨ燐酸ナトリウム
（ｐｌ＋７．５）中に懸濁させ、残りの洗浄液を除くた
めに、遠心分離により集めた。 ｐＤＥＴ２ＴＡ４タンパク質を、１０１１１８燐酸ナト
リウム緩衝液（ａｌ１７．５）中に、最終量が７．７−
になるように懸濁した。懸濁液は、５．８ｇの固体尿素
を最終ｆｆ１１２００ａｌ！になるまで加えて、十分に
可溶化した。懸濁液は良く混合し、１０分間、１５℃で
放置する。容ｆｉｌ　Ｑｄ中８Ｍの溶液濃度のｐＨは、
その後、溶液を室温で１６時間混合した。 得られた透明な液は、１００容の１ＱＩｌｌＨリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ１１，０に調整）で希釈し、最終
容量が１２００−になるようにした。溶液をよく混合し
、１０分間、１５℃に放置した。溶液のｐＨは、０．５
Ｎの塩酸を５分間にわたって加え、８．５に調整した。 得られた液は、測定と貯蔵の前に、１時間以上室温に放
置した。この液には、５０−６０％純粋な２５，０００
グルトンのタンパク質、約１０μ’ｊ／／ｎ１が含まれ
た。例１３で詳述したように、モノクロナール抗体Ｐｔ
ｎ７．２Ａ４／４を用いて、検体の免疫反応性を測定し
た。検体は、上述のｐＢＧｃ２３およびｐｃＯｃ１２か
らの復元抗原と同程度の活性を有した。タンパク質は、
後述のワクチン接種研究のために、２■／ｄまで濃縮し
た。 例１５ ニワトリでＥ、　ｔｅｎｅｌｌａに対する保護反応およ
びスポロゾイト中和血清を誘発するためのＥ。 ｔｅｎｅｌｌａ　Ｔ　Ａ　４抗原および１１５００ダル
トンフラグメントの使用。 これらの実験で使用したＴＡ４抗原は非還元性ＴＡ４抗
原の調製のために例４で記載した方法により、スポロシ
ストから［１した。タンパク質の純度と同定は、ニワト
リで使用する前に、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびモノクロー
ナル抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４を用いた免疫反応性によ
りｂＴｌ　認した。 ワクチン製剤は、抗原１容に対し約５％Ａｒ１ａｃｅｌ
　Ａ　、　９４％　Ｄｒａｋｅｏｌ　６−　Ｖ　Ｒ、１
％Ｔｖｅｅｎ　８０から成る油状賦形剤３容とし、各０
．１ｄの用Ｍが約１５μ３のＴＡ４抗原を含むように調
製した。必要に応じて、抗原はＰＢＳ（ｐＨ７，２）で
製剤に望ましいレベルまで希釈した。ニワトリにｏ、　
ｉ＃Ｉｉ！を頚部筋肉用に投与した。 抗原は２週間隔で同ｍを同一の経路により、２回以上投
与した。 タンパク質の各投与前の３日問および最終投与後１１日
間、１・りを浮血させ、血液検体を採取した。熱不活性
化血清は、例２で報告したようにスポロゾイト微量中和
法で独立して試験した。血清による寄生虫の中和はミゾ
ントの発達を５０％阻害する最大血清希釈に基づき評価
した。 下記の表Ｉに記載した結果から、賦形剤のみを投与した
ワクチン非接種のトリでは、Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａスポ
ロゾイトに対する中和抗血清価が証明されてなく、抗原
の３用儂を投与したトリでは、中和抗血清価が証明され
たことが明らかにされた。表工。 ＴＡ４Ａ４抗原誘水スポロゾイト中和測定法−タ放血１
１１１　　　　　　　　　　Ｎ、Ｄ、ｂＮ、Ｄ、　　　
Ｎ、Ｄ。 非ワクチン接種対照 （ｎ＝９）　　　　　　　Ｎ、Ｄ、　　　Ｎ、Ｄ、　　
　Ｎ、Ｄ。 担体のみ（ｎ＝１４）　　　Ｎ、Ｄ、　　　Ｎ、Ｄ、　
　　Ｎ、Ｄ。 担体／タンパク ワクチン（ｎ＝１５）　　１：３２　　８．Ｄ、　　　
１：８免疫血清ｃ１：３２ （全スポロゾイト体ワクチン） ａ）各処理群のトリの血清をプールし、試験した。 ｂ）Ｎ、Ｄ、−中和が検出されていないＣ）数羽のトリ
からのプールした血清 ｄ）５０％中和用ｊ ＴΔ４抗原を用いたニワトリにおりる保−「の誘発 最終的なワクチン接種後６３（８２）日に数羽のトリに
１０００ケの胞子形成、Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａ卵母ｍ胞
を経口接種した。この後、翌日に胞子形成Ｅ。 ｔｅｎｅｌｌａ卵母ｉ胞を３０００ケ再び経口接種した
。 盲腸病変は＠終感染後５日に評価した。結果を下記の表
■に記載した。 ＠ｊｇ、　Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａコクシジオイデス症に
対するＴＡ４抗原ワクチン接種したトリの保護。 傷害者Ｘ＋：Ｓ、Ｄ 非ワクチン接種対照（ｎ＝１７）　　　　３．４　　±
０．６アジユバンドのみ接種　　　　　４．０　　＋　
０．０ＴＡ４抗原を用いたＥ、　ｔｅｎｅｌｌａに対す
るスポロゾイト中和血清反応の誘発 これらの実験で使用した免疫原は、例４で記載したよう
に、フェノール抽出法によりスポロシストから［１した
。タンパク質の純度と同定は、ニワトリに使用の前に、
５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．
２Ａ４／４との免疫反応性により確認した。 凍結乾燥した精製抗原は、０．１５Ｍの生理食塩水。燐
酸緩衝液中に溶解させ、約５％のＡｒ１ａｃｅｌ　Ａ　
、　９４％Ｄｒａｋｅｏｌ　６−　Ｖ　Ｒ、１％Ｔｗｅ
ｅｎ　２０から成る３容の賦形剤中に懸濁させ最終濃度
を７０Ｍｇ／ｄとした。ニワトリの頚部筋肉に、約１４
μグタンパク質１０．２ｃｃを筋肉的投与した。その後
、２週間後に等徂を同じ経路で投与した。 タンパク質の各投与の１日前、およびタンパク質の２回
目の投与後２３！１間にトリを浮血し、血清検体を集め
た。例２で記述したように、熱不活性化血清をスポロゾ
イト微量中和測定法で、別個に試験した。 表■に示した結果から賦形剤の４の投与のワクチン非接
種のトリでは、Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａスポロゾイトに対
する中和抗血清価が証明されないが、抗原を２回投与し
たトリでは、最大１：８１までの力価の中和抗血清の証
明されることが明らかにされた。 表■　区屯弐しロユ凹扉魁’ＩＣブヨ皇スポロゾイト中
和価（ＮＤ５０％）ａ 放血前　　　　　　　　　　　　０週　　　１：３　　
　１：３　　　１：３非ワクヂン接種　　　　　　　　
２週　　　１：３　　　１：３　　　１：３対照　　　
　　　　　　　　　　４週　　　１：３　　　１：３　
　　１：３担体のみ　　　　　　　　　　　　２週　　
　１：３　　　１：３　　　１：３４週　　　１：３　
　　１：３　　　１：３（１体／蛋白　　　　　　　　
　　２週　　　１＋３　　　１：３　　　１：３＊　各
群５羽のニワトリ 林　数羽のトリからのプールした血清 ８　５０％中和用量 ＴＡ４抗原の１１５００ダルトンフラグメントを用いた
ニワトリにおける保護反応の誘発ニワトリの頚部筋肉に
、前述の尾形剤中に懸濁さけた約３μ９の抗原を１回投
与した。第２の群に試形剤のみを投与した。ワクチンを
接種していないもう１つの群（見張り５ｅｎｔｉｎｅｌ
）のニワトリを前）ホの２群の各々と飼育した。トリを
Ｅ。 ｔｅｎｅｌｌａにより汚染されたケージで飼育し、コク
シジウムに接触させた。約２週間後、ニワトリを調べ、
Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａに感染していることが明らかにさ
れた。結果を、下記の表ＩＶに示す。 表　　■ Ｅ、　ｔ（！ｎｅｌｌａによるコクシジオイデス症に対
するワクチン接種したニワトリにおける保護処　＠　　
　　　　　傷害数Ｘ＋Ｓ、Ｄ、　　死亡数アジュバント
のみ　　　３．８±０．４２（ｎ＝５＞ 抗原ワクチン接種　　　１．０±０．８０（ｎ＝５） 見張り烏　　　　　　　　４．０±　０．０　　　　　
６（５ｅｎｔｉｎａｌ　Ｂｉｒｄｓ） （ｎ＝６） 上述の条件は、野外でのＥ、　ｔｅｎｅｌｌａへの自然
の寞露方法と非常に良く似ているため、ここで示したデ
ータは、Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａによるコクシジオイデス
症に対する保護方法が有用なことの明確な証凰となる。 の証明 ＴＡ４抗原の１７，０００ダルトンのポリペプチド成分
に対する血清抗体の特異性の分析は、Ｗｅｓｔｅｒｎプ
ロットを用いて実施した（７．５９）。 Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａスポロゾイトに対する中和価の証
明された全てのニワトリ抗血清は、ＴＡ４抗原の１７゜
ＯＯＯダルトンのペプチド成分へ特異性を有する免疫グ
ロブリンを含むことが明らかにされた。逆に、無反応あ
るいは対照のトリの血清は、１７゜０００ダルトンのポ
リペプチドや他のスポロゾイトタンパク質に、特異性を
示さなかった。 対応する対照血清と共に、Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａに対Ｊ
る中和抗体価の証明された、ワクチン接種トリ血清の、
スポロゾイト膜上の結合部位に対して、ｐｔｎ７．２Ａ
４／４抗体と競合する能力を調べた。ポリスチレン９６
ｗｅｌｌ　ｅｌｕｓｔｅｒｓ（Ｉｍｍｕｒｏｎ　ＩＩ　
）を、５０μｌのスポロゾイト膜タンパク質（１０ｍＨ
グリシン緩衝液。生理食塩水、ｐＨ９，６に溶解）で、
総タンパク質約１００μ９１ａｅのレベルで感作した。 血清の連続２倍希釈液を、ｐｔｎ７．２Ａ４／４に結合
させたアルカリ性ホスファターゼ１：８０希釈を含む、
０．０００５％　Ｔｗｅｅｎ　−２０添加の０．１５Ｍ
ｖＡ酸緩衝液−生液液塩水中で調製し、感作プレートに
、最終容伍が７５μｌ／ウエルになるように移した。３
７℃で３０分間インキュベーション後、プレートを、Ｐ
ＢＳ−ＴＷを用いて洗浄し、未反応物質を除いた。その
後、１Ｍのジェタノールアミノ緩衝液に溶解させたｐ−
ホスホントロフェノールナトリウム塩のディスクから成
る基質（１ｒＩｔｇ／ｄの濃度）を、プレートの各ウェ
ルに加え、最終量を１００μｌとした。生じた反応生成
物を、分光光度計により測定した。研究から、中和や免
疫斑により証明されるように、ワクチン接種に反応した
トリ血清がモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と
競合する抗体を含むことを証明することが可能であった
。 この実験は、モノクローナルｐｔｎ７．２Ａ４／４を用
いた免疫親和性クロマトグラフィーあるいは通常のクロ
マトグラフィーにより、スボＯシイ１〜膜からＩ＋ｉ製
した抗原が、ニワトリにおいてモノクローナルＰｔｎ７
．２Ａ４／４により決定されるエピドープに対する免疫
反応を促進するという直接的な証拠を供する。 例１６ ニワトリにおけるＥ、　ｎｅｃａｔｒｉｘに対するスポ
ロゾイト中和血清反応を誘発するためのＥ、　ｔｅｎｅ
ｌ　ｌａタンパク質の使用 ”１１．５００ダルトン成分を含むＥ、　ｔｃｎｅｌｌ
ａＴＡ４抗原製剤（実例４）で免疫したトリからの熱不
活性化血清をプールし、ブタ胚肺細胞に代用する中和測
定法（実例２）で試験した。結果を下記の表Ｖに示す。 表　　Ｖ 処　　　　置　　　　　　　　　　　　　　中和価非免
疫ニワトリ血清　　　　　１：６ ７Ａ４抗原免疫接種　　　　　１：２４Ｅ、　ｔｅｎｅ
＋＋ａ全スポロゾイト　　１：４８免疫血清 このデータはトリに、ＴＡ４抗原の精製した１１．５０
０ダルトンフラグメントを投与時にＥ、ｎｅｃａｔｒｉ
ｘに対する血清中和価の上昇していることを示す。これ
までにＴＡ４抗原の投与が、Ｅ。 ｔｅｎｃｌｌａに対する血清中和価を上昇させ、またＴ
Ａ４抗原の投与がε、　ｔｅｎｆｌｉｌｌａの感染に対
して保護効果を示すことが証明されており、また［、ｎ
ｅｃａｔ「ｉＸスポロゾイト中和価が、ＴＡ４抗原の投
与により上昇するためこの分野の熟練者は、Ｅ。 ｎ０ｃａｔｒｉＸに対する保護が、ＴＡ４抗原の投与に
よっても得られることが予想できるであろう。 例１７ Ｅ、　ＴＥＮＥＬＬ＾　ＴＡ４１７′原と　差　応　る
血−１′をマウスの体内で増殖させるための細菌により
産細菌から産生じたＴＡ４プロティンの抗原性はＣ６０
−Ｆｌマウスに皮下注射を行なう試験によって明らかと
なった。再形成されたｐｃｏ（，１２およびｐＢＧｃ２
３プロティンをこれらの構成体から、得られた不溶性プ
ロティンとともに試験した。 精製したＥ、ｔｅｎｅｌｌａ　Ｔ　Ａ　４抗原をポジテ
ィブコントロールとして、また、再形成されたプロキモ
シン（ｐＷＨＡ４９を含有するＲＥＮＳ株から得た）を
ネガティブコントロールとして使用した。一群５匹のマ
ウスにそれぞれの抗原を注射した。３５日の間隔をおい
てそれぞれのマウスに２回ずつ注則し、注ａＡ後１０日
日に採血を行なった。 Ｅ、Ｔｅｎｅｌｌａ　Ｔ　Ａ　４抗原の場合、抗原を含
む抗原溶液３容を、完全フロイント補助液５容と混合し
、１０マイクログラムをそれぞれのマウスに皮下注射し
た（最終容量は２００マイクロリツトル／注ｔＪ１）、
再形成シタｏ　ＣＯＣ１２オヨＵ　ｐ　Ｂ　Ｇ　Ｃ２３
プロテインまたはこれらのプラスミドから得られた不溶
性プロティンについても同様に注射を行なった。ただし
細菌から産生したＴＡ４プロティンの場合にはＥ、　ｔ
ｅｎｅｌ　Ｉａ抗原の場合の約２倍モル過剰量を注射し
た。それぞれの血清は例１３で述べたＥＬＩＳＡ法で効
力検定した。マイクロタイタープレートは、精製したＥ
、　ｔｅｎｅｌｌａ　Ｔ　Ａ　４抗原２　ｎｇ／穴で皮
膜をほどこしたものを使用した。二回目の採血で１ｑら
れた血清との効力検定の結果を下表■に示した。 友ｊ 再形成したｐｃＯｃｔ２プロティン　　　　　０．３１
　　±　０．０６不溶性ｐｃＯｃ１２プロテイン　　　
　　　　０．０１　　±　０．０１再形成したＤＢＧＣ
２３プ０ティン　　　　　０．２９　　±　０．０５不
溶性１１８Ｇ２３プロテイン　　　　　　　０．０３　
　土　０．０４Ｅ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａ精製ＴΔ４　　
　　　　　　０．３６　　±　０．１１本一群５四のマ
ウス；血清で１　：３０００に稀釈した血清に換筒した
賄これらの実験は再形成プロトコールで生成したｐｃＯ
ｃ１２またはｐＢＧＧ２３プロティンで免疫したマウス
の抗体レベルが向上し、この抗体が精製したＥ、　ｔｅ
ｎｅｔ　Ｉａ　Ｔ　Ａ抗原と交叉反応したことを示唆す
る結果を与えた。これらの血清は少なくとち１：３００
０の希釈濃度において、精製したＥ、ｔｅｎａｌｌａ　
Ｔ　Ａ　４抗原の存在下で強いポジティブシグナルを示
した。他方、不溶性ＣｌＣＯＣｌ２およびｐＢＧＣ２３
プロティンを注射したマウスから得られた血清中には、
たとえその血清の希釈率が１：３０のように低い場合で
あっても交叉反応した抗体は本質的に存在しなかった。 これらの実験結果から、精製しないプロティンまたは再
形成しない不溶性ｐｃＯｃ１２およびｐＢＧ２３プロテ
ィンは効果的なイミュノジエンではないことが示唆され
た。 例　　１８ ための細菌により産生されたＴＡ４プロティンの使用 すでにＥ、ｔｅｎｅｌｌａ　　（１５マイクログラム）
から精製したＴＡ４抗原の投与により血清抗体が生成し
、この抗体がｉｎ　ＶｉｔｒＯで胞子小体を中和し、Ｅ
、　ｔｅｎｅｔ　Ｉａの攻撃からニワトリを防御するこ
とを述べた。これらの性質に対して再形成したｐｃＯｃ
１２およびｐＢＧＣ２３プロティンがテストされた。コ
ントロールとしてベーターガラクトシダーゼおよび再形
成したブロキモンを使用した。再形成した。ＢＧｃ２３
プロティン、ρＣＯＣｌ２プロティンおよびプロキモシ
ンは、ポリエチレングリコールに対しであるいは空洞状
の繊維濾過器（Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ　Ｈ１Ｐ　１０〜２
０　。 Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＨＡ）によ
り透析され、最終濃度を０．５〜２．０１１１９／ｄと
したものを使用した。それぞれの抗原を濃縮されたタン
パク￥’ｊｌ容に対し、５％Ａｒ１ａｃｅ１．９４％Ｄ
ｒａｋｅｏｌ　６−　Ｖ　Ｒおよび１％丁Ｗｅｅｎ　８
０を含む３容のオイルキャリアーと混合した。使用した
それぞれの抗原の投与量を表Ｖｌに示した。選択した投
与量中にはおよそ０．５〜２倍モル母の精製Ｅ、ｔｅｎ
ｅｌｌａ　ｎａｔｉｖｅＴＡ４抗原が含まれている。こ
の世の抗原が免疫応召を誘発するのに効果的な量である
ことは前述したとおりである。 表　　■ 抗　　　　原　　　　　マイクログラム／投与旦 ベーターガラクトシダーゼ　　　　１３３再形成したｐ
ＢＧＣ２３プロティン　　　　８０再形成したｐＢＧＣ
２３プロティン　　　　１６０再形成したプロキモシン
　　　　　　５３実験１では前に述べたような混合法に
より調整されたワクチン０．２〜０．５５ＣＣをニワト
リの首に筋肉内注射した。更に２週間の間隔でニワトリ
に同様の投与法でワクチンを２回追加注射した。 実験２では前述のように調製されたワクチン０．２〜０
．４５ＣＣを十二指腸組織に注射した。 ニワトリには更に２週間後に同様の投与法でワクチンを
１回追加注射した。それぞれのプロティン投与の３日前
および最終投与の１１日後に血清サンプルの収集のため
採血を行なった。 Ｅ、ｔｌＪ１８１１８に対する胞子小体を中和する血清
応答の誘発 実験１および２ではニワトリから得られた血清を加熱に
より不活性化したものを使用してＥ。 ｔｅｎｅｌｌａ胞子小体の中和実験を行なった。−次の
ニワトリの腎臓細胞培養液を使用して次に述べる方法で
ミクロ中和法による効力検定を行なった。 １〜２３［ｉ齢のニワトリを殺し、防腐処理を行なった
後、腎臓を切除した。得られた腎臓の抗トリプシン性を
破壊し、腎細胞をウェル当たり１０４の濃度で、熱で不
活性化した子牛の退治の血清５％を添加したＥａｒｌｅ
ｓ　　Ｌ　Ａ　Ｈ培地中に、９６ウエル中に移植した。 培養は５％ＣＯ２雰囲気中で４１℃で行なった。培養し
た細胞がだいたい５０％合流するレベルに達した時、前
述の方法で希釈した試験用の血清をミクロプレートの各
穴に５０マイクロリツトルず加えた。次いで５０マイク
ロリツトルにつき２〜３Ｘ１０４コの胞子小体を会む［
ａｒｌｅｓｊ３’ｌ液５０マイクＤリットルをマイクロ
プレー１−の各穴に加えた０１２〜１６時間後、培養液
の上澄液を２％の加熱により不活性化した子牛の胎児の
血清を含む新しく調製したＥａｒｌｅ　ＬＡＨ溶液に交
換した。感染後４０〜４４時間経過した時点で培養を停
止した。この時点で培養の上澄液をプレートから取り除
いた。引き続きメタノールを加えて細胞をプレートに固
着させ、５％氷酢酸溶液で酸性化した。固着させた培養
物を０．１％１−ルイジンブルーで染色した後に観察を
行なった。 それぞれの穴ごとに複分裂増員の抑制のおよそのパーセ
ントにより評価した。繁殖体の増加を完全に抑制する事
のできる血清の希釈可能な最大希釈率を基準にして寄生
虫の中和の程度を採点した。 表■の結果は次のことを示唆している。すなわちトリに
ベーターガラクトシダーぜまたは再形成したプロキモシ
ンを注射してもＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａスポロゾイトを
中和する目立った抗血清力価は得られなかったが、ｐＢ
ＧＣ２３プロティンまたはｏｃＯｃ１２プロティンを筋
肉内に３回注射したトリはスポロゾイトを中和する顕著
な抗血清力価を示した。 表　　■ スポロゾイトを中 和する力価の相乗 血清ザンブル　　　　　　平均 実験１： 試験前採血　ＩＭ　　　　　　１：　　２．０アジユバ
ントのみ　　　　　１：　２．０ベーターガラクトシダ
ーゼ　１：　２．０再形成したｐＢＧＣ２３１：　３・
２ プロテイン （８０マイクログラム） 再形成した１）ＢＧＣ２３１：　２・６プロテイン （１６０マイクログラム） 再形成したプロキモシン　　１：２．０再形成した１）
ＣＯＣｌ２　　１：　　４．０プロテイン スポロゾイド免疫　　　　　１：１６．０Ｅ、Ｇｏ　ｌ
　ｉ産生ＴＡ４プロティンで免疫されたニワトリの中和
性血清とモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４との
競争についての実験トリにワクチンを注射し、Ｅ、ｔｅ
ｎｅｌｌａスポロゾイトに対して顕著な中和力価を有す
る血清を準備した。また、これに対応するコントロール
血清を準備した。これらの血清につき、スポロゾイトの
股上のパインディングサイトと結合する能力を抗体ｐｔ
ｎ７．２Ａ４／４の結合能力と競争させて比較した。ポ
リスチレンＩ！Ｉ９６穴プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ　Ｉ
Ｉ　）のそれぞれの穴に１０１１ＩＨグリシンでＷｌｆ
ｉさせ、ＤＩ＋を９．６とし、約１００マイクログラム
トータルプロテイン／威を含むスポロゾイト１１４％プ
ロティン５０マイクロリツトルを充てんし、３７℃で一
夜インキユベートした。プレートをＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅ
ｅｎ　（０、ＯＯ５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し
た侵、ＰＢＳに溶解した３％（Ｗ／Ｖ）子牛血清アルブ
ミン（ＲＩＡグレード、　ＳｉＯｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｎｏ）を添加し、１時間
インキュベートした。０．０００５％のＴｗｅｅｎ　−
２０を含む０．１５Ｍ　　リン酸塩緩衝血清中で血清を
１：２から１：２００に連続して２回希釈した溶液を調
製し、プレートに添加して３７℃で３＠間インキュベー
トした。その後プレートにアルカリ性フォスファターゼ
で共役したｐｔｎ７．２Ａ４／４モノクロ一ナル抗体を
添加し、３７℃で１時間インキュベートした。このプレ
ートから（０，０００５％）　Ｔｗｅｅｎ　−２０を含
む０．１５Ｍ　リンＩｆｌ塩緩函食塩水を用いて未反応
物質を完全に洗い流した。その後、それぞれの穴に１Ｍ
ジェタノールアミノｖ１％Ｉｉ液中に１■／ｄｐ−フォ
スフオニトロフェノールナトリウム塩を含有する基質溶
液１００マイクロリツトルを加えた。反応後生成した物
質を分光法により検出した。非経口的にワクチンを注射
するプログラムに応答したトリの血清にはスポロゾイト
の中和により確かめられた通り、モノクローナル抗体ｐ
ｔｎ７．２Ａ４／４（表ＩＸ　）と競争する抗体が含ま
れていた。この実験により、次の様な証拠が直接得られ
た。すなワチ、再形成したｐＢＧＣ２３および、ｐｃｏ
ｃ１２プロテインはニワ］〜りの体内でＴＡ４抗原のモ
ノクロ−プル抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４にＪ：り認識さ
れる免疫応答の領域を刺激する作用があることが明らか
となった。 表　　ｌＸ Ｐｔｎ７．２Ａ４／４競争力価（５０％抑制）実験１：
　　　　　　　　　　　逆力価試験前採血　　　　　　
　　　　　Ｏ ベーターガラクトシダーゼ　　　Ｏ 再形成したｐＢＧＣ２３プロティン　　　６．５（８０
マイクログラム） 再形成したｐＢＧＣ２３プロティン　　　６．５（１６
０マイクログラム） 再形成したプロキモシン　　　　０．６再形成したｐｃ
Ｏｃ１２プロティン　　１３゜１（８０マイクログラム
） 再形成したｐｃＯｃ１２プロティン　　９．９（４０マ
イクログラム） 天然　Ｔ△４　　　　　　　　　１４．６種々のＴＡ４
プロティンを用いてニワト体内でＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌ
ａにより感染の度合いを減少させる免疫法　最終のワク
ヂン注射後１１日経過後二ワ１−りに低儂度のｃｏｃｃ
ｉｄｉａ　（約３００〜５００卵母細胞）を注射して攻
撃させ、床付きのオリに入れた。卵母細胞の循環を最大
とするために布団はそのままオリに残した。最初の攻撃
力日ら１週間後に病巣の進行の均一性を最大とするため
に４０００〜５０００の卵母細胞をニワトリに注射して
第２の攻撃を行なった。ニワトリはその後６日日に殺し
て病巣の進行を評価した。病巣の採点はＪｏｈｎｓｏｎ
およびＲｅ１ｄ（３０）によりｍ１発されたパラメータ
ーによって行なわれた。 結果を表Ｘに示したように、再形成されたｐＢＧＧ２３
またはｐｃＯｃ１２プロティンをワクチン注射したニワ
トリの病巣を攻撃観察した結果、対応するコントロール
グループの病巣はどひどくないことが明らかとなった。 再形成したｐＢＧｃ２３または再形成したｐｃＯｃｌ　
２のいずれかのワクチン注射を行なったニワトリでは最
も重篤な病巣（レベル＝４）への進行が全く認められな
かったばかりでなく、病巣の程度の分布が全体的に軽度
の値に移行していた。ワクチン注射を行なったニワトリ
のおよそ５０〜７０％は病巣の程度が１〜２のレベルと
記録されたのに対し、コント［１−ルのニワトリの５０
〜７０％は３〜４のレベルの病巣であると採点された。 Ａ 実験１ べ一ターガラク１〜シダーピ　　ＯＯ２２，２５０，０
２７，８再形成したｐＢＧｃ２３プロティン　０　　１
３．８　３８．５　６１．５　０（８０マイクログラム
） 再形成したｐＢＧＣ２３プロティン　０　　３０．８　
３８．５　３０．８　０（１６０マイクログラム） 再形成したプロキモシン　　　０　　７．１　２１．４
　５７．１　１４．３再形成したｐｃＯｃ１２プロティ
ン　０　　１１．１　４４．４　４４．４　０ワクチン
注射なしの　　　　　ＯＯ１２，５６８，５１８，８コ
ントロール 表　Ｘ（続き） 実験　２ ベータガラクトシダーゼ　　　Ｏ８２７３７２８再形成
したｐＢＧＣ２３プロティン　。　　３４　　４４　　
２□　　０（１６０マイクログラム） 再形成したプロキモシン　　　ＯＯ２９２９４２再形成
したＤＣＯＣ１２７０ｙイン０　　４２　　１４　　１
４　　３０ワクチン注用なしの　　　　　ＯＯ０２０８
０コントロール 例１９ ｐＤＥＴをワクチン注射したニワトリのアイメリア属ｔ
ｅｎｅｌｌａ抗原への血清学的応答。スポロシストによ
り誘導された、アイメリアｆｉｔｏｎＱｌｌａの膜プロ
ティンに対するｐＤＥＴをワクチン注射されたニワトリ
の免疫反応性を調べるための実験を実施した。１つの実
験につき、１０羽のニワトリを使用してそれぞれに５０
マイクログラムのｐＤＥＴのワクチン注射を行ない、産
生じたプロティンの直接の表現を調べた。プロティンの
産生について例１０に述べた。このプロティンの免疫反
応性を力価検定し、実験に使用する前にモノクローナル
抗体Ｐｔｎ７．２Δ４／４を用いて確認し　ｌこ　。 ワクチンはｐＤＥＴに対して３：１の比の５％Ａｒ１ａ
ｃｅｌ−＾、９４％Ｄｒａｋｅｏｌ　６−　Ｖ　Ｒおよ
び１％Ｔｗｅｅｎ　８０を用いて調製し、０．０４マイ
クログラムのＬＰＳ　（３回投与の実験の場合）または
５０マイクログラムのＰＨＡ　（単回投与の実験の場合
）を添加した。次いで頭部後側の首に０．５ｄの皮下投
与を行なった。初回の実験では、２退会のｔｅｇｈｏｒ
ｎを用いて開始して、ワクチン注射規定食餌法を採用し
て１０日間隔で３回の投与を行なった。これと同じ間隔
でニワトリから採血を行ない、血清を収集して凍結保存
した。二番目の実験では４日令のｂｒｏｉｌｅｒを使用
し、ワクチン注射後５臼目に採血を行なった。両者の実
験には上記のキＡ７リアーに不活性なｐＤＥＴセメント
質／アジュバント；アジュバント／キャリアー；および
ワクチン注射しないコントロールを使用して行なった。 ワクチン注射した実験動物およびコントロールから採血
した血清の免疫反応性は例１３で述べたアイメリア族ｔ
ｅｎｅｌｌａスポロシストプロティンに対するウェスタ
ンブロン１−法で分析した。次表Ｍに示す実験結果から
、ｐＤＥＴ抗原をワクチン注射する３回投与の実験では
、１０羽のトリのうち９羽が最初の攻撃から１０日後に
該当する分子量バンドでポジティブな反応の応答があっ
た。その後の２回の連続した攻撃の後は１０羽のうち１
０羽すべてが反応した。第２回目の不溶性ｐＤＥＴの攻
撃の後、数羽のトリの血清がＴＡ４抗原に対して反応性
を示した。単回投与の実験では、ｐＤＥＴのワクチン注
射を行なった１０羽のトリのうち、１０羽すべてが５日
後に行なったウェスタンプロット分析の結果、血清の変
換を起こしたことが明らかとなった。ＬＰＳまたは攻撃
コントロールとしてのトリはどちらのテストにおいても
全くセロポジティブにならなかった。　　□表ＸＩ ワクチングループ　　　　　採血（１回目）　採血（２
回目）　採血（３回目）ｐ　Ｄ　Ｅ　Ｔ抗１京　　　　
　　　　　９／１０　　　　　　１０／１０　　　　　
１０／１０（ｎ−１０） 不溶性ｐＤ’−”　　　　　　　　　Ｏ／１０　　　　
　　８／１０　　　　　１０／１０（ｎ＝１０） アジ１′＼ント０ント”１″０／１０　　　　　　　０
／１０　　　　　　０／１０（ｎ−１０） 無ワクチ′″−１０″−／ト０”　　　　　Ｏ／１０　
　　　　　０／１０　　　　　　０／１０（ｎ＝１０） ｐｏＥｒ　（単回投与＞　　　　　　１０／１０　　　
　　　−　　　　　　−抗原（ｎ＝１０） アジュバン１へコントロール （単回投与）　　　　　　　　　Ｏ／１０　　　　　　
−　　　　　　−（ｎ−１０） ｐＤＥＴをワクチン注射したニワトリのアイメリア族ｔ
ｅｎｅ＋＋ａ卵母１Ｂ胞からの攻撃に対する防御。 ＩＥ要について前）ホしたワクチン３回投与Ｍ画にひき
つづいて１００回目ニワトリにＥｉｌｌｅｒａ　ｔｅｎ
ｅｌｌａの卵母ｉ胞を接種し、寄生虫に特有な症状の病
巣を観察した。最終のワクチン注射後１０８目に前述の
４つのグループ（ｐＤＥＴ抗原、不溶性ｐＤＥＴ、アジ
ュバントコントロール、ワクチンなしコントロール）は
６．０００の胞子を形成した卵母細胞を経口投与した。 接種物は実験に先立ち希望する程度に重篤となった病巣
が得られるように力価測定を行なった。この寄生虫特有
のＣａｅｃａ　ｌ性病巣を攻撃後５回目に例１８で述べ
た方法で採点した。この結果を次表■に示したが、ｐＤ
ＥＴｖｉ原投与群はコントロールと比較して病巣の型温
度の軽減および死亡数の減少を認めた。 表■ ｐＤ　Ｅ−ｒワクチン注射したニワトリをＥｉｎ＋ｅｒ
ｉａ　Ｔｅｎｅｌｌａ卵母細胞で攻撃して生じた病巣の
採点結果 処　　置　　　　　　　　病巣の採点Ｘ＋Ｓ、ｄ、　　
死亡数ＤＤＥＴ抗原（ｒｌ＝１０＞　　　　　　　　　
３．２＋０．４　　　　０不溶性ｐａｔｈＴ（ｎ−１０
）　　　　　　　　３．４±０．５１アジユバントコン
トロール　　　　　　　３．８±０．４３（ｎ＝１０） ワクチン注射なし　　　　　　　　　　　３．９±０．
３３コントロール（ｎ−１０＞ ｐＤＥＴ　　ＴＡ４抗原をワクチン注射したニワトリに
おけるスポロゾイトを中和する血清反応。 ワクチンを注射したトリから得られた血清の寄生虫中和
能力を検討することにより１）ＤＥＴの能力を検定する
ためにスポロゾイト中和効力検定法（ＳＮＡ）が適用さ
れた。例１８で設定されたＳＮＡプロトコールを用いて
前述の単回および３回投与実躾で採血した血清を力価検
定した。次表店に示したようにＤＤＥＴワクチン注射を
行なったトリは対応するコントロールと比較して血清の
スポロゾイト中和能力を有することが明らかとなった。 表店 ｐＤＴＥワクチン注射したトリに対するスポロゾイト中
和力価検定処置群　　＜１：４　１：４　１：１ｆ３　
１：１８　１：３２ｐＤＥＴ抗原　　　　　　　　　０
／８　　１／８　　３／８　　４／８　　−（３回投与
、ｎ＝８） 不溶性０ＤＥＴ　　　　　　　　　５／８　　１／８　
　２／ａ　　　−−（３回投与、ｎ−８） アジュバントコントロール　　　６／８　　２／８　　
−　　　−　　　−（３回投与、ｎ−８） Ｅ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａ スポロゾイト　　　　　　　　　・　　　・２／２免疫
は血清（ｎ＝２） ｐＤＥＴ抗原　　　　　　　　　−−２／４　　２／４
　　−（単回投与、ｎ＝４） アジュバントコン１−ロール　　　５１５　　−　　　
−　　　−　　　−例　　２０ Ｅ　ｉ　ｍｅｒ　ｉ　ａプロティンの　　１ラベル実験
。 Ｅ、　ｎｅＣａｔｒｉＸから得られた総計２×１０８コ
の卵母細胞のヨウ素化を行なった。それぞれの場合、ス
ポロシストを塩を浮かばせたハイポクロライドのナトリ
ウム塩で処理し、ガラス球で細胞膜を破壊し、ガラス綿
を充てんしたカラムを通して精製した。スポロシスト膜
をＩＩ製する場合、１．５倍容量のスポロシスト１ｄの
ＰＢＳおよびガラス球とともにプロテアーゼインヒビタ
ーの存在下で機械的に破壊した。プロテアーゼインヒビ
ターの組成は次のようである：０．１ｍＭフェニルメチ
ルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．１ｉＨＮ−
トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロルメチルケトン（Ｔ
ＰＣＫ＞、１ｉＨＮ−フルファーＰ−トシルーＬ−リジ
ンクロルメチルケトン（ＴＬＣＫ）および１０ＫＩＵ／
ｘｉ！アプロチニン。残存するスポロシストを更にトリ
プシンおよびタウロデオキシコリン酸（総容ｆｆ１−１
　ｄ）で処理してスポロゾイトの脱のうを行なった。両
者の調製液は４５分間４℃ｌ！ｈｉ心分ｍ　（４５，０
ＯＯＩｔＰＨ）　Ｌ、、、得られたペレットを１１Ｒｉ
！のリン酸塩で緩衝した食塩水（ＰＢＳ）で再けん濁し
た。操作上の注意点として超遠心分離を行なう前にＰＢ
Ｓおよび１ｉＨのＭＳＦで洗浄する際、スポロゾイトか
らすべてのトリプシン−デオキシコリン酸塩を完全に除
去することがあげられる。 １ｄのサンプルを４０マイクログラムのｌ０ＤＯＧＥＮ
■固相ヨウ素化試薬（２４，５４）を使用して窒素気流
下で乾燥し、ＰＢＳでリンスして得られた皮膜を容器内
壁に形成したガラス性シンチレーションバイアルに加え
た。それぞれの、１２５ バイアルに０．５ｍＣｌの　　Ｉを加え、サンプルを氷
上で２０分間インキュベートした。その俊、１００マイ
クロリツトルのＫＩ（ＩＭ）をそれぞれのバイアルに加
えて最終濃度を１００１１８とし、氷上で更に１５分間
反応を進行させた。スポロゾイトおよびスポロシスト調
製液を次いで５ｍ）ＩＫＩを含むＤＢＳで７厩に希釈し
、４℃で４５分間、超遠心分１！ｌｉｔ　（４５，０Ｏ
ＯＲＰＨ）によりベレットとした。 スポロシストおよびスポロゾイト膜プロティンの抽出。 前記の超遠心分離により得られた　　Ｉをｅ２識したス
ポロシストおよびスポロゾイトのベレットを１−のプロ
ティン抽出緩衝液中に再けん濁した。けん濁液は氷上で
時々渦状に振り混ぜながら３０分間インキュベートした
。不溶性の物質は４℃で１５分間ミクロ遠心分離装冒に
より界面活性剤に可溶な物質と分離された。この上澄液
は一７０℃で保存した。 １２５ＩプロテインのＴＣＡによる沈降。それぞれのサ
ンプルの１０マイクロリツトルを５１８ＫＩ溶液９０マ
イクロリツトルで希釈した。希釈したそれぞれのサンプ
ルを５％トリクロル酢酸（ＴＣＡ＞、２５マイクロリツ
トルのＢＳＡ　（１０ｍｇ／１ｔｄｌ）６３よび５ＩＩ
ＩＨのＫｌを含む溶液１ｄに加え、氷上で３０分間イン
キュベートした。沈殿したサンプルを、ガラス繊維フィ
ルターでろ過し、０℃で５−の５％ＴＣＡおよび５１１
１ＨＫＩで２回洗浄し、０℃で５−の９５％エタノール
で３回洗浄した後、液体シンチレーションカウンターで
１０分間計測した。 モノクローナル抗体との免疫沈殿。５０マイクロリツト
ルのモノクローナル抗体を２５マイクロリツトルのＭＡ
Ｂ−Ｄ　Ｉ　Ｌに加えた。２０マイク０リツトルの　　
ＩＦｔｌプロティンを次いで加え、かき混ぜた後、４℃
で一夜インキユベートした。 ウサギの抗−マウスＩＱ面清（ＩｏＡ、ＩｑＧ。 １　ｏＭ）をＭＡＢ−Ｄ　Ｉ　Ｌ中で１：２に希釈し、
その１０マイクロリツトルをそれぞれの免疫沈殿の試験
管に加え、４℃で１時間インキュベートした。１：４に
希釈したｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　　
（１０％Ｖ／Ｖ）を加え、試験管をゆるやかに振り混ぜ
ながら４℃で１時間インキュベートした。免疫沈殿生成
物を冷ＭＡＢＷで２回洗浄し、更に室温においてＭＡＢ
Ｗで２回洗浄した。ベレットを５０マイクロリツトルの
５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（３５）で再びけん濁
し、５分間沸騰させ、遠心分離によってＤｒＯｔｅｉｎ
　Ａ−３ｅｐｈａｒｏｓｅを分離した。上澄液を放射活
性計測し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。 Ｅ、ＮｅＣａｔｒｉＸプロティンの５Ｏ８−ポリアクリ
ル７ミドゲ／Ｉｚｆｆｉ気１ＡｖＪ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）、　免疫吸着された　　ＩＦＩＩスポロシストおよび
スポロゾイト膜プロティン、および免疫沈殿プロティン
のすべてを５〜２５％エキスボネンシャルまたは８〜２
０％リニアーグラジェント５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル（２５ａ＋Ａ）で分析した。ゲルを乾燥し、にｏｄ
ａｋＸＡＲ−５Ｘ線フイルム上へ一７０℃で一夜露出を
行なった。染色を目的としたゲルを製造元が添付した使
用説明ｉ　（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ）に従って
、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　　（２１）または銀染色を行な
って視覚化した。 Ｅ、ＮｅＩＣａｔｒｉＸ抗原とＰｔｎ７．２Ａ４／４モ
ノクロ一ナル抗体との免疫沈殿の結果。表面がＩｆＡ識
されたＥ、ｎｅＣａｔｒｉＸスポロゾイト標本は、２種
の多重にヨウ素化されたプロティンを含んでいた。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥの分析結果から判断して、これらのプ
ロティンの分子量は約６．５００および２５．０００と
推定された。このうち６，５００ダルトンのプロティン
はモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４により容易
にまた特異的に免疫させることができた。スポロシスト
の膜にも多重にヨウ素化されたプロティンが存在し、そ
れらの分子量は約１８．０００および２６．０００であ
った。また、これらのプロティン以外にも数種の少量の
ヨウ素化された種々の分子量を有するブロテインが検出
された。免疫沈殿された　　Ｉ標識スポロシス１〜膜プ
ロティンの場合、モノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４
／４との反応により沈殿した抗原は、減力した５ＤＳ−
ＰＡＧＥ分析の結果、分子量１８，０００ダルトンのプ
ロティンのみであることが確認された。 例　　２１ ＮＡ４抗原の精製および特性指摘。胞子形成したＥ、ｎ
ｅＣａｔｒｉＸの卵母細胞を１０９コの卵母細胞につき
１０ｄのＰＢＳに再びけん濁し、これと等容量のガラス
球を加えて振り混ぜることによって細胞を破壊した。膜
を遠心分離（１００，０００×９．６０分、４℃）によ
り単離し、プロティンを１％ＮＰ−４０，１０１１１Ｈ
トリス塩１！！（ｐＨ７，５）　、２５ｍＨＪｐ化ナト
リウム、１ｍＨＰＭＳＦ、１ｍＨＴＬＣＫ、０　、１　
ｍＨＴ　Ｐ　ＣＫおよび１０ＫＩＵ／ｍｉ！アプロチニ
ンに溶解した。不溶性物質は遠心分離（１００，０ＯＯ
ｘｚスピン、６０分、４℃）によりベレットとした。ス
ポロシスト膜プロティンは、２０１１１Ｈトリス塩酸（
ｐＨ８，１）および０．０５％　１ｗｉｔｔｅｒｇｅｎ
ｔ■３〜１２中で平衡化したＤＥＡＥ−ＨＰＬＣカラム
（Ｂｉｏ　ｌ１ａｄ　）　ニ吸着させた。この緩衝液に
０．１１Ｈのジチオスレイ１〜−ルを含む溶液および塩
化ナトリウムグラジェント（０−５００ｍＨ）でカラム
から溶出を行なった。ゲル電気泳動法の移動度により同
定されたＮＡ４抗原が約２７５ｆｆｌＨ塩化ナトリウム
で溶出した分画に含まれていることが明らかとなった。 ＮＡ４抗原を含む分画をプールし、 ＣｅｎｔｒｉｃｏｎｏｌＱ　ｍ１ｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔ
ｒａｔｏｒ　（ＡｍｉｃｏｎＣｏｒｐ、、　Ｄａｎｖｅ
ｒｓ、ＨＡ）を用いて濃縮した。濃縮物を約１０容の０
．０１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで希釈し、再び濃縮して食塩
およびジチオスレイ１ヘールレベルを低下させたサンプ
ルを緩衝液を含む６２．５ｍ）ｌトリス塩酸（ｐＨ６，
８）２％（ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム塩、１０％
（Ｗ／Ｖ）グリセロールおよび０．００１％（Ｗ／Ｖ）
ブロムフェノールブルーを加えて希釈し、沸騰させた後
、１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を
行なった。これらの減力しない条件では、およそ、２６
．０００ダルトンの分子量のＮ＾抗原がＫＣ１染色２１
により同定された。ゲルの該当する部分を切り取り、ゲ
ルを１１ｄのｉＱｍＨＮＨＨＣＯ，０，０２％（ｗ／ｖ
）ＳＯ３とともに室温で４時間１辰り混ぜ、プロティン
を溶出した。この方法で調製したＮＡ４抗原は本質的に
純粋であった。 このＮＡ４抗原を、減力した条件（すなわちサンプル緩
衝液に５％（Ｖ／Ｖ）ベーターメルカプトエタノールで
溶かした条件）で５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行なった結果
、ＮＡ４抗原、分子量１８゜ＯＯＯおよび約ｓ、ｏｏｏ
ダルトンの２種類のポリペプチドから成ることが明らか
となった。従って、スポロシスト膜の調製液中には分子
量１８゜０００ｊ５よび８．０００ダルトンのポリペプ
チドがジスルフィド結合と結合していることが明らかと
なった。 Ｉｎ　Ｖｉｖｏでの試験における免疫吸着技法によるＥ
、Ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原の精製。Ｋａｓｐｅｒらの免疫
吸着技法にいくつかの変法（３１）を加えた方法で［、
ｎｅＣａｔｒｉＸＮ　Ａ　４抗原の免疫吸着を行なった
。要約すれば、すべてのＥ、ｎｅＣａｔｒｉＸスポロシ
スト膜は本例初頭の部分で述べたように、Ｐｔｎ７．２
Ａ４／４モノクロ一ナル抗体の存在下で４℃で一夜イン
キユベートされた。その結果生成した反応混合物をこれ
らと同様の条件下でＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ−３ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　　（Ｓｉｏｍａ；Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＮＯ）に
より山羊の抗マウス抗血清の存在下で４℃で固化した。 このけん濁液をガラスカラムに流し込み、吸光度のベー
スラインが一定になるまでＰＢＳで結合していないプロ
ティンを洗浄により除去した。非特異的に結合したプロ
ティンをＰＢＳ　（ｐＨ８，０＞および酢酸塩緩衝液（
０，１Ｍ、ｐＨ４，Ｏ＞で交互に洗浄することにより除
去した。特異的に結合した抗原を２％ＳＤＳを含む６０
１Ｈトリス塩酸（ｐＨ６，８）でカラムから溶出した。 引き続いて、抗原を含むこの溶出液を同様の緩衝液で平
衡化した５ｅｐｈａｄｅｃＧ　−２００カラムを通過さ
せ、同様の緩衝液を溶出した。ドデシル硫酸ナトリウム
を除去するために、［ｘｔｒａｃｔｉ　Ｇｅｌ　Ｄ■カ
ラム（Ｐｉｅｒｃｅ　：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ　）を
通過させた。 例　　２２ のアミノ酸配列決定は、Ｎ末端アミノ酸をブロックする
段階で′ｆｉ雑になった（即ち、エドマン分解を受は難
かった（１４））。この問題を克服するために、ＮＡ４
抗原をＣＮＢｒで開裂さけ、約１６０００ダル１〜ンの
ＣＮＢｒ分画を逆相ＨＰＬＣで精製したく２６）。ＣＮ
Ｂｒ開裂を行うために、約１０マイクログラムの蛋白質
を、４℃で一夜かけて７０％ギ酸中２％ＣＮＢｒに溶解
させた。この試料を５ａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄｖａｃ遠
心分ｍ器で蒸発乾固し、０．１％ＴＦＡに再溶解した。 大ＣＮＢｒ分画をＶｙｄａｃ０４カラム（５ｅｐａｒａ
口ｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ。 １１ｃｓｐｅｒｉａ、　ＣＡ）で精製し、０−１００％
の０．１％ＴＦＡ中ＣＨ３ＣＮ：イソブロバノール２：
１グラジエントで溶出した。 気相配列決定ｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｎ＋ｅ、Ｉｎｃ、。 Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）を用い、１ｌｕｎｋａ
ｐ　ｉ　ｌ　ｌ　ｅｒら（２５）の方法に従ってアミノ
酸配列決定を行った。フェニルチオヒダントイン（Ｐ　
Ｔ　Ｈ）を結合させたアミノ酸をＨＰＬＣで解析した（
５Ｑ）。大ＣＮＢｒ分画の部分アミノ酸配列を以下に示
す。 ＮＨ２−ヱ　ヱ　　ｌｅｕ　　　ヱ　　ｌｊ／ｅ　　　
ＡｌａＡｌａ　　　Ｑ＋ｙ　　　Ｌｅｕ　　　ｐｒｏ　
　　Ｇｊ！ｕＰｈｅ　　　Ｇｌｙ　　　Ａｓｎ　　　Ａ
ｌａ　　　ＶａｔＧＩＶ　　　？　　　Ａｌａ　　　Ｖ
ａｔ　　　Ｖａｔ　　　ＬｅｕＰｒｏ　　　Ａｌａ　　
　Ｔｙｒ　　　Ｓｅｒのペプチド成分のＮ末端アミノ酸
配列は、直接ＮＡ４抗原の配列決定を行うことにより決
定できた。５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶出した精製ＮＡ
４抗原を、ＣｅｎｔｒｉＣＯｎ　ｉ　ｏマイクロ濃縮様
を用いて約６倍に濃縮した。ＳＯＳゲルから溶出した試
料中のグリシンを除去するために、２０倍容場の水を濃
縮物に２度添加し、この試料を再濃縮した。 濃縮した試料を、配列決定四に直）妄かけた。本ペプチ
ドのＮ末端部位の部分アミノ酸配列を以下に示す： Ｎ　ｌ−１２−△　ｌａ　　　Ａｌａ　　　？　　　Ｔ
ｈｒ　　　Ｔｈｒ？　　　Ａｓｐ　　　Ａｌａ　　　Ｖ
ａ　１　１　１　ｅ　　　ｃｙｓＬｅｕ　　　Ｔｈｒ　
　　Ａｓｎ　　　Ｐｒｏ　　　ＡｌａＰｒｏ　　　Ｌｅ
ｕ　　　Ａｌａ　　　ＡｌａＧｊ！ｙ　　　Ｓｅｒ　　
　Ｐｒｏ　　　Ｐｒｏ　　　？　　　Ｐｈｅ？　　　Ａ
Ｓ　ｐ　　ＧＪ２　ｕ　　　？　　　Ｔｒり例　　２３ 単離。　胞子形成オオシスト（５×１０８）を洗浄し、
例６において記述したように、スポロシストからＤＮＡ
を単離した。 バクテリオファージλ　ｇｔ　　ｗｅｓ　　λＢにおけ
るＥ、ｎｅＣａｔｒｉＸのゲノミツクＯＮ△ライブラリ
ー（２６）を、例６に記述したようにして構築した。 １５マイクログラムのＥｃｏＲＩで開裂させたＤＮＡア
ームをＴ４　　ＤＮＡリガーゼを用いて、３マイクログ
ラムのＥｃｏＲＩで開裂させたＥ、ｎｅＣａｔｒｉＸＤ
ＮＡに結合させた。１マイクログラムの結合ＤＮＡをｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏでファージ粒子に組み入れ、２×２０６
個の組み替えファージ粒子のライブラリーを産生じた。 Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘのゲノミツクＤＮＡライブラリー
のスクリーニング。　Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘのゲノミツ
クＤＮＡライブラリーの組み替えファージのニトロセル
ロースフィルター転写体について、［３２Ｐｌ−ｄＡＴ
Ｐを用いてニック翻訳を行ったｃ、ｔｅｎｅ＋＋ａのゲ
ノミツクローン１０８−１−２の７８５塩基対Ｓａｃ　
　Ｉ−ＰｖｕＩＩフラグメントを用いてスクリーニング
を行った。ニック翻訳された試料に混成されたポジティ
ブプラクを突き、精製したプラク及びＤＮＡを、前述の
ようにして調製した。 Ｅ、　ｎｅｃａ’ｔｒｉｘＤ　Ｎ　Ａ挿入体の精製及び
特性記述のために、ポジティブファージ７を大ＩＪＡ模
に培養した。 述−制限マツプ。　クローン７０３９００ｂｐＦｃｏＲ
Ｉフラグメント挿入体を、ファージベクターからプラス
ミドｐＵｃ９　（７８）へ細クローン化し、クローン７
−４９を産生じた。組み替えプラスミドを種々の限定エ
ンドヌクレアーゼで開裂させ、ゲノミツクＤＮＡクロー
ン中のキー限定部位の位置を決定した。ＤＮＡ中の限定
部位は、１８．０００ダルトンのペプチド遺伝子の位置
及び方向を決定するために必要であるし、またＥｃｏＲ
ＩゲノミツクＤＮＡフラグメントの配列決定のための策
略を開発するためにも必要とされる。定マツプを、図１
６に示す。１８．０００ダルトンペプチドの遺伝子の位
置及び方向はこのマツプに示されている。 細クローン７−４９のＤＮＡ配列　析 Ｅ、ｎＣＩＣａｔｒｉＸＮ　Ａ　４抗原の１８０００ダ
ルトンペプチド成分の遺伝子を含有するクローン７−４
９のフラグメントについて、種々の制限酵素フラグメン
トを用いる。Ｓａｎｇｅｒ　（６２）のジデオキシ法に
より配列決定を行った。ＤＮＡ合成のためのブライマー
には、他の合成オリゴヌクレオチドはもちろんのこと、
オリゴヌクレオチドＣ０Ｄ９２．９４及び１０８等があ
る。ＤＮＡ配列を図１７に示す。 Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘＮ　Ａ　４抗原をエンコーディン
グしている遺伝子の構造。　ＤＮＡ配列は、アミノ酸の
部分解析により予想されたものと一致している。 非還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動による
と、Ｅ、ｎｅＣａｔｒｉＸ及びＥ、ｔｅｎｅｌｌａの両
抗原は、明らかに２５−２６，０００ダルトンの分子但
を有する。還元条件下の電気泳動では、両抗原がジスル
フィド結合により結合した２種のポリペプチドで構成さ
れていることを証明した。 Ｅ、ｎ０ＣａｔｒｉＸ遺伝子とＥ、ｔｅｎｅｌｌａ　Ｍ
壬子との比較では、遺伝子構造が前に討論した３つの特
徴においてＥ、　ｔｅｎｅｔ　！ａ遺伝子に類似してい
ることを示唆している。即ち、（１）　　この遺伝子は
２３個のアミノ酸シグナルのペプチドをエンコードして
いる、（２）遺伝子内に３個のイントロンが存在する、
および（３）　　この遺伝子は、１８，０００及びｓ、
ｏｏ。 ダルトンペプチドを産生ずるための同一蛋白分解作用部
位（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ）を有する２６．０００ダ
ルトンペプチドをエンコードしている。Ｅ、ｔｅｎｅｌ
ｌａ　ｌｌｌ壬子比較したＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘ遺伝子
のＤＮＡ配列解析から、両ペプチド間の類似点及び相違
点が推定される。図１８は、Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　ｌａ及
びＥ、　ｎｅｃａｔｒｒｘ３１伝子と、予想されるアミ
ノ酸配列との整列を示している。３個のイントロンの入
口／出口は、両遺伝子に保存されている。２個のＡ４抗
原蛋白は、それらのアミノ酸配列に８６％の類似点を示
している。すべてのシスティンアミノ酸残塁及びおそら
くジスルフィド結合も保存されティる。Ｅ、ｎｅＣａｔ
ｒｉＸの蛋白は、Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　ｌａの蛋白の熟成
した１７．０００ダルトンのポリペプチドの２位と３位
の間に１個のアミノ酸が挿入されていることを示してい
る。さらに、Ｅ、　ｎｅＣａｔｒｉＸの蛋白は、Ｅ、ｔ
ｅｎｅｌｌａの蛋白の４５位に存在するセリン残基を欠
損しているし、また熟成した１ｔｅｎｅｔ！ａの蛋白中
の２２３番から２２８番までに相応するアミノ酸も欠損
している。図１９は、遺伝子内の３個のイントロンの整
列を示している。 イントロンＡは、両種内の１０１　ｂｐであり、８９％
の配列類似性を示している。イントロンＢは、Ｅ、　ｔ
ｅｎｅｔ　ｌａにおいては１１４ｂＤε、ｎｅｃａｔｒ
ｉｘにおいては１２２ｂｌ）であり、７４％の配列類似
性を示している。イントロンＣは、Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ
においては１２４　ｂｐ、　Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘにお
いては１１７ｂｐであり、７７％の配列類似性を示して
いる。このように、イントロンは、明らかに異なってい
る。 例　　２４ ＮＡ４抗原をエンコープイン　しているｍＲＮＡの単離
と同定 ＮＡ４抗原をエンコーディングするｃＤＮＡを合成する
前に、ＮＡ４抗原をエンコーディングするｍＲＮＡが、
胞子形成中のどの時期に現れるかを決定する必要があっ
た。２．５×１０８のオーシストを４０ｈ間軽く撹拌し
、３０℃で胞子を形成させた。胞子を形成するオーシス
トを、７−８００×グで１０分間遠心分離し、上清を除
去した。 小球を、ドライアイス／メタノール浴中で急速冷凍し、
ＲＮＡを単離するまで一７０℃で保存した。 各々の小球は、約１０容量の５Ｍのグアニジンチオシア
ナート、ｐＨ７，５の２０１１ＩＮのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
ｌｏｍＨのＥＤＴＡ、５％（Ｖ／Ｖ）ベータメルカプ１
−エタノール中で解凍し、オーシス１〜を、同容量の１
．０ａ量のガラスピーズを用いて１０分間激しく撹拌す
ることにより急激に破壊した。このサンプルを２％（ｗ
／ｖ　）　Ｎ−ラウロイルサルコシンに添加した後に、
約８０００ｘｇ、ｖ温で遠心分離して不溶物を除去した
。ＣｓＣ１クッションを通して沈殿させることにより上
清からＲＮＡを単離した（７６）。 ＲＮＡの小球を、ｐＨ７，５の２０１１ＨのＴｒｉｓ−
ＨＣＩ　　ｐ１１８．０の５ＱｎＨのＥＤＴＡ、０．２
％Ｓ　ＯＳ　、　１００ｕｎｉｔｓ／−のＲＮ　ａｓｉ
ｎ　（ＰｒｏｍｅｏａＢｉｏｔｅｃ、Ｈａｄｉｓｏｎ、
Ｗｌ、　１０　ｍＨベータメルカプトエタノール）中に
再ｌｉｄさせた。フェノール−クロロホルム：イソアミ
ルアルコール（２４：１）及びクロロホルム：イソアミ
ルアルコール（２４：１）の何れかを用いて抽出した後
に、ＲＮＡを沈殿させ、−２０℃でエタノール中に保存
した。約８５−１５０マイクログラムの総ＲＮＡを、（
０，５−１，０Ｘ１０９の）オーシストから１１離した
。 オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーにより、ポリ
八を含有するＲＮＡを単離した（２）。ｐＨ７，５の１
ＱｎＨのＴｒ　ｉ　５−１−ＩＣｊ！、１ｍＨのＥＤＴ
Ａ、０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．４ＭのしｉＣＪ！
を用い、総ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラム（Ｔｙ
ｐｅ　３　、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ。 Ｉｎｃ、　Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、　Ｈ＾〉にかけた。Ｌ
ｉＣＪ！を含まない同一緩衝液を用い、４℃でＲＮＡを
溶出した。 ５．０Ｘ１０８のオーシストから、約１０マイクログラ
ムのＡ”　ＲＮＡを単離した。 ポリＡ　　ＲＮＡが、ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用さ
れる前に、ＮＡ４抗原をエンコーディングするｍＲＮＡ
の存在を実証する必要があった。 ＮＡ４抗原ｍＲＮＡの存在は、充分に胞子形成を行った
（４０時間）オーシストから得たポリＡＲＮＡを、Ｔ△
４の蛋白をエンコーディングするクローンから得たＤＮ
Ａと混成することにより証明した。胞子形成オーシスト
から単離した１０マイクログラムのｍＲＮＡを、ホルム
アルデヒドを含むゲルを用いて電気泳動させた（４４）
。 ＲＮＡをナイロンフィルターに転移させて、Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎ　ｂｌｏｔ解析を行った。ナイロンフィルターは
、ＴＡ４　　ｃＤＮＡりＯ−ンの最初の約３００ｂｐか
らから成る、ＴＡ４　　ｃＤＮＡフラグメントの最初の
約３００ｂｐから構成されている、［３２Ｐ］でニック
翻訳された（４４）ＤＮＡフラグメントを用いて精査し
た。このフラグメントのＤＮＡ配列は、それに対応する
ＮＡ４遺伝子配列中の部位と８０％以上類似しているの
で、・適切な試料として選択される。ＮＡ４抗原をエン
コーディングするｍＲＮＡは、４０時間胞子形成したオ
ーシスト中に確かに存在した。これらの実験は、４０Ｒ
間胞子形成したオーシストから得られたｍＲＮＡを用い
ると、ＮＡ４抗原をエンコーディングするｃＤＮＡを産
生ずることを実証している。 例　　２５　　。 ＮＡ４抗原をエンコーディングするＣＯＮへクローンの
単離と特性記述 ＤＮＡ ＮＡ４抗原をエンコーディングするヌクレオチド配列を
、大腸菌のような容易に増殖する細胞中の遺伝子として
使用し、ある種のアイメリア属により引き起こされるコ
クシジウム症に対する鶏のワクチン接種のためのＮＡ４
蛋白を産生じた。 ＤＮＡ配列が蛋白配列と一致しない部位は、ＮＡ４遺伝
子（図１７）には３ケ所ある。これら３個の配列は、多
くの成熟核遺伝子のコーディング部位内に典型的に見出
されるイントロンである。しかしながら、イントロンを
含む遺伝子は、大腸菌において固有の蛋白を表わさない
と思われるので、ＮＡ４抗原をエンコーディングするｃ
ＤＮＡクローンを単離する必要があった。このクローン
は、ＮＡ４抗原に対して連続するコーディング配列を含
ｌυでいる。 ｃＤＮＡの合成 簡単に、例２４に記述したようにして単離した胞子形成
オーシストのｍＲＮＡを、＾ｍｅｒｓｈａｍ（八ｍｃｒ
ｓｈａｍ　　Ｃ０ｒｐＯｒａＮＯｎ、八ｒｌｉｎｇｔｏ
ｎ　　Ｈｅｉｇｈｔｓ、１１　　）から購入したｃＤＮ
△合成キットを用いてｃＤＮＡに転写し、それらの指針
に従って使用した。２マイクログラムのｍＲＮＡから、
約４００ｎｇのｃＤＮＡを得た。 Ｎ△４ｃＤＮＡライブラリーの構築 ｃＤＮＡを、２０マイクロリツターの６ｍＨＴｒ　ｉ　
５−ＨＣｊ！、　ｐＨ７、４の６ｍＨＭｑＣｊ！、６ｍ
Ｈベータメルカプトエタノール中に再懸濁した。ｃＤＮ
Ａをライブラリーにクローン化するために、ＮＡ４ゲノ
ミツククローンＤＮＡ配列から決定されたυｊ限部位を
使用した。３ａｃ１部位は、ＮＡ４抗原の熟成１８．０
００ダルトンのサブユニットのＮ−末端グルタミンの叩
上流にあり、第２の３８Ｃ１部位は、最初のものから６
０ｂｐＴ流にある。ｃＤＮＡを、５ｍＨＴｒｉｓ−トＩ
Ｃｊ！　（ｐ１１７．４＞、６ｎ＋Ｈｆｖｌｃｌ、及び
６ｍＨベータメルカプトエタノールの存在下、１２ユニ
ツトのＳａｃ　Ｉを用いて３７℃１５０分間消化させた
。 ｃＤＮＡの主要部位、即ち第２のＳａｃ　１部位から遺
伝子の末端までをクローニングするために、ｐｕｃｘ　
（（５６）を使用した。ベクターを５ａＣＩ及びＳｍａ
　ｌを用いて開裂させた。 ３ｍａｌは、ＣＤＩ’ＪＡの３′末端の結合に必要な鈍
い末端部位を与えた。結合反応は、約４００ｇのベクタ
ーＤＮＡと４０ｎりのｃＤＮＡを用いて行った。結合は
、１ユニツトのＴ４　　ＤＮＡリガーゼを用い６５０Ｉ
ＩＩＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣＪ！　（ＤＨ７，８）、１０
ｍＨＭＱＣｊ！　　、２０ｍＨジチＡトレイトール、１
、Ｏｎ＋ＨｒＡＴＰのリガーゼ緩衝液中で、１２℃−夜
かけて行った。 組み替えてＤＮＡ分子をその後、変換により大腸菌に一
１２株Ｍ＋−（１に導入した。変換された菌を５０マイ
クログラム／ｄの濃度の抗生物質アンピシリンを含む基
点平板培地に塗り広げた。プラスミドｐｌＪＣ，ｆ！８
　（５６）は、アンピシリン耐性遺伝子を含有するので
、組み替えプラスミドを獲得した菌のみが生存した。こ
れらの菌は、それぞれ増殖し分裂して菌コロニーを形成
する。コロニーのそれぞれの細胞は、オリジナルの親細
胞の子孫であり、同一の組み替えプラスミドを含有して
いる。、２０ナノグラムの３ａｃ　（で開裂したｃＤＮ
Ａから約２０．０００クローンを得、組み替えプラスミ
ドを作った。 Ｎへ４ｃＤＮＡクローンの同定 本ｃＤＮＡライブラリーを、ＧｒｕｎＳｔＱｉｎ及び１
１ｏｇｎｃｓｓ　　（２０）により記述された高密度ス
クリーニング法を用い、コロニー混成によりスクリーニ
ングを行った。前に記述した、ｍＲＮＡに対しでｄ成す
るために使用されたＴＡ４ｃＤＮＡＡ４−ンの同一３０
０　ｂｐフラグメントを精製し、ニック翻訳により３２
Ｐで標識した（４４）。ポジティブクローンを同定し、
精製し、さらに解析を行うために、プラスミドＤＮＡを
単離した。ポジティブｃＤＮＡクローンｐｓＭＡｃの限
定解析は、ＮＡ４ゲノミツククローンから予想されたマ
ツプと一致した。ｐｓＭＡｃと表わされるクローンのｃ
ＤＮＡ挿入体について、ゲノミツククローンに対応させ
るためのオリゴヌクレオチドブライマーを用いるジデオ
キシ配列決定により配列決定を行つた（６２〉。ｏＳＭ
ＡＣの構築を図２０に示す。 本ｃＤＮＡクローンを大腸菌ＪＭ８３株に変換し、ＪＭ
８３／ｐｓＭＡｃと表わされる菌株は、Ａｎ＋ｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。 ＨＤに寄託され、また、Ａ　Ｔ　ＣＣ八ｃｃｅｓｓｉｏ
ｎ　Ｎｏ。 ６７　２４１と指定された。この寄託はａｕｄａｐｅｓ
ｔｒｒｅａｔｙに従って作製した。 ＤＮＡ配列は、ゲノミツククローンから予想されたもの
に一致した。 プラスミドｐＳＭＡＣは、９０％以上のＮＡ４ｃＤＮＡ
をエンコードしているが、熟成ＮＡ４蛋白に対するｃＤ
ＮＡ配列の初めの６０ｂｐを欠１Ωしている。簡略化す
るために、我々は、Ｎ△４ゲノミツククローン７から予
想される配列を用いて、ｃＤＮＡのこれら６０ｂｌ’ｌ
を合成することを選択した。Ｃ０Ｄ３９１とＣ０Ｄ３９
２の２種のオリゴヌクレオチトヲ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ
　８　、６００　Ｄ　Ｎ　Ａ合成機（Ｂｉｏｓｃａｒｃ
ｈ、Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）
　Ｔ：合成し、ＨＰＬＣで精製し、等量に浪合し、５分
間で９０’まで加熱し、２２℃まで放冷した。これら２
種のオリゴヌクレオチドを焼きもとＪ−と、遺伝子の５
′末端近くの２つのＳａｃ　１部位の間のＮａ４遺伝子
の配列と同一の３ａｃ　Ｉ末端を有するＤＮＡフラグメ
ントを形成する。この合成フラグメントを、５ａＣＩで
消化させたｌ）ＳＭＡＣに結合させ、得られる組み替え
分子をＭ　Ｈ１に変換し、変換体をＤＮＡ配列決定によ
りスクリーニングし、何れのクローンが正しい方向に３
ａＣｌ−８ａｃ１６０ｂｐフラグメントを有し、世紀の
長さのＮＡ４ｃＤＮＡをエンコードしているかを決定し
た。ｐＳＳ３３が、このプラスミドである。 ｐＳＳ３３の構築は図２１に示しである。 ＮＡ４ｃＤＮＡ表現プラスミドの構築を促進するために
、正規の長さのＮＡ４ｃＤＮＡをエンコードしている第
２のプラスミドを構築した。このプラスミドがｐＮｃＤ
である。ＤＮＣＤは、ｐＳＳ３３中のＮＡ４ｃＤＮＡの
５′末端をマークしているＳａｃ　１部位の、ｐＵＣ１
８配列の即上流に挿入された、もう一つのヌクレオチド
塩基対を含有している。この塩基対を加えると解ＶＣ′
Ｒ構をシフトさせるので、牛プロキモシン（１）ＷＨＡ
９３）又は大腸菌ベータガラクトシダーゼ（ｐＤＫ２）
の何れかのＥｃｏＲＩの場合には、ｗ？読機構は維持さ
れるであろうし、プロキモシン−ＮＡ４、又は、ベータ
ガラクトシダーゼ−ＮＡ４の縮合蛋白が産生され得るの
である。 ｐｓｓ３３を創出するために使用した方法と同様にして
、ｐＳＭＡＣからｐＭＣＤを誘導した。合成オリゴヌク
レオチドＣ０Ｄ３９５とＣ０Ｄ３９６を作製し、精製し
、アニーリングした。アニーリングした時にそれらが形
成するＤＮＡフラグメントはＥｃｏＲＩ末端とＳａｃ　
Ｉ末端を有する。 このフラグメントを、ＥｃｏＲｌ−８ａｃ　Ｉ開裂させ
たｐＳＭＡＣに結合させ、得られる組み替えプラスミド
を大腸菌に一１２株Ｍｈ１に変換した。 ｐＮＣＤの構築は、ジデオキシ配列決定により証明した
。ｐＮｃＤの構築を図２２に示す。 ｐＮＣＤを大腸菌ホストＩＩｌ胞ＪＭ８３に変換し、八
ｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、　　６７２６６でＡＴＣＣに
寄託した。 例　　２６ 陽画におけるｃＤＮＡ由来のＮＡ４抗原遺伝ｃＤＮＡク
ローンは、菌においてＮＡ４蛋白合成のための遺伝子を
与える。しかしながら、ｃＤＮＡは、大腸菌において転
写及び翻訳を可能にするための固有のシグナルを含有し
てない。それゆえ、クローン化ｃＤＮＡを、ＲＮＡポリ
メラー１Ｆに対する強いプロモーターを含み、また大腸
菌の挿入ｃＤＮＡの上流において蛋白合成を開始するリ
ボゾーム結合部位も含む所の表現ベクターに挿入した。 ここにおいて使用する様に、ＮＡ４蛋白という語句は、
ｐｓｓ３３又はｐＮｃＤの何れかの誘導体、又は細菌ホ
スト細胞中で産生された何れかの組み替えＮＡ４−誘導
物質によりエンコードされたＮＡ４蛋白の表現産物に関
するものである。ＮＡ４抗原という語句は、胞子小体の
表面に存在する様な、又は胞子小体から除去された様な
ゲノミツクＮＡ４　　ＤＮＡにより表現される天然生成
物に関するものである。 ｐＷＨＡ９３とｐＤＫ２の表現ベクターに遺伝子を挿入
して大腸菌における表現を獲得出来るように、ＤＷＩ−
ＩＡ９３とｐＤＫ２の表現ベクターを構築した。技術に
熟練した人に知られている他の好適なプラスミドも使用
され得た。ｐＷＨＡ９３とｐＤＫ２のプラスミドは、好
適なプラスミドの２例である。ｐＷＨＡ９３プラスミド
は、１ａＣ及びｔａＣという２つのプロモーターを有し
くｔａｃプロモーターは、プラスミドｐＤＲ４５０山来
のものである：　３４　；　ＰｈａｒｍａｃｉａＨＯＩ
ｅＣｔｌｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｏｙ　ＤｉＶｉＳｉＯｎ、
Ｐｉ３Ｃａｔａｌ＃ａＶ、ＮＪ）、それぞれのものは、
押入された遺伝子の転写を方向付けることが出来る。プ
ラスミドｏＷｌ−ＩＡ９３の構造を図１２に示す。 類似（Ｄ　Ｅ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａ蛋白ＴＡ４の表現レ
ベルは、直接表現したものよりも縮合蛋白として表現さ
れた時の方がはるかに高いので、ＮＡ４蛋白は、他の蛋
白に縮合することにより安定化される。何れの好適な蛋
白も本蛋白縮合に利用出来る。以下の例は、好適な２つ
の蛋白のみについて、即ちべ−タガラクトシダーピとプ
ロキモシンについて説明する。 例　　２７ ドの構築。　ＮＡ４蛋白を大蛋白に結合さけると大腸菌
の中で安定化するので、ＮＡ４３ｆｔ伝子縮合プラスミ
ドを構築した。数種の成熟核蛋白は、縮合蛋白として細
菌中でより安定である（１７．２７）。組み替えプラス
ミドである１）ＴＤＳｌとｐＴＤｓ２は、ベータガラク
トシダーゼ−Ｎ△４抗原縮合蛋白の表現のために構築さ
れた混成体である。これらのものは、プラスミドＤＤＫ
２由来のちのであり、ｆｌａＧ調節部位を含有し、また
プラスミドｐＢＲ３２８のＥｃｏＲ［部位に押入された
うムダｐ１ａＧ　（２２，６３）由来の、及びｃＤＮＡ
クローンｐＳＭＡＣ及びｐＮｃＤ由来の総ベータガラク
トシダーゼ遺伝子も含有している。 ｐＤＫ２以外の好適なプラスミドも使用され１りる。 プラスミドｐＤＫ２は好適なプラスミドの一例である。 ｐｓＭＡｃ及びｐＮＣＤ由来の１．３ｋｂＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩフラグメントは、それぞれ９０％あるいは全
ＮＡ４ｃＤＮＡ配列を含有するが、このフラグメントを
、ＥＣＯＲＩ及び３ａｍＨＩで開裂させて、それぞれプ
ラスミドＤＴＤＳ１及びｐＴＤＳ２を産生させた所のｐ
ＤＫ２プラスミドＤＮＡにクローン化させた。 クローンＣ）ＴＤＳｌ及びｐＴＤｓ２は、９０％又は全
ＮＡ４ｃＤＮＡ配列が、解読ｔｉｌ構においてベータガ
ラクトシダーゼのコーディング配列のＣ末端部位に縮合
している所の期待されたプラスミドを含有していた。ｐ
ＴＤｓｌ及びｐＴＤＳ２の構築を図２３Ａ及び２３Ｂに
示す。 ここでＭＨ１／ｐＴＤｓ１及びＭＨＩ／ｐＴＤｓ２と記
述した組み替えＤＮＡとそのホスト微生物は、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ。 Ｒｏｃｋｓｖｉ　ｌ　Ｉｅ、　ＮＯに寄託され、それぞ
れＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎナンバー６７　２４０及
び６７２６ユと指定された。これらの寄託は、Ｂｕｄａ
ｐｅＳｔ丁ｒｅａｔｙに準じて行った。 ＤＴＤＳｌ及びＤＴＤＳ３２蛋白を大腸菌で高濃度に合
金したが、不溶性でありモノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２
Ａ４／４と反応しない。 例　　２８ ｐＴＤＳＩ及びｐＴＤＳ２を含有する細胞によって産生
された蛋白は、太いに又は全体的に不溶性であり、その
ために明らかにモノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４
との反応性はない。大腸菌において産生された、不溶性
で不活性な他の成熟核の蛋白を可溶化すると、その活性
が回復することが観察された。このような蛋白の一つは
生プロキモシンである。ＮＡ４ｃＤＮＡ配列を牛プロキ
モシン遺伝子に縮合させて、可溶化され１ｑる、またプ
ロキモシンそのものに対して開発された方法により活性
化される所の不溶性綜合蛋白を産生した。縮合蛋白の固
有再賦活の程度は、プレートＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａにおけ
るモノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４との免疫反応
性によりモニターされ得た。 プラスミドをエンコードしたプロキモシン−ＮＡ４縮合
蛋白は、ＮＡ４　　ｃＤＮＡ配列をクローン化したｐＷ
ＨＡ９３のプロキモシン遺伝子（例１２において記述し
た）に結合させることにより創出した。他のプラスミド
も利用され得る。 好適なプラスミドの一つは、ｌ）　Ｗ　ＨＡ　９３であ
る。 プロキモシン−ＮＡ４ｍ伝子縮壬子であるｐＤＤＳｌ及
びｐＤＤＳ２の構築において、約１，３ｋｂフラグメン
トを、醇素旦旦旦ＲＩ及び１−（ｉｎｄ）ＩＩを用いて
開裂させることにより、それぞれのｃＤＮＡクローンｐ
ｓＭＡｃ及びｐＮＣＤから取り除いた。プラスミドｐＷ
ＨＡ９３を同様にしてＥＣＯＲＩ及びＨｉ　ｎｄｌＩ［
を用いて開裂させ、その様にして産生した２つのフラグ
メントのうちの大きい方を、ＤＳＭＡＣ及びｐＮＣＤ由
来のＮＡ４　ｃＤＮ△配列を含有するそれぞれのＥｃｏ
ＲＩ　−１−１ｉ　ｎｄＩ［［７ラグメントと結合さセ
、それぞれの組み替えプラスミドｐＤＤｓ１とｐＤＤＳ
２を産生じた。ｐｏｏｓｉとｐａｌ）Ｓ２の構築を図２
４Ａと２４８に示ず。 ここでＭＨＩ／ｐＤＤｓ１及びＪＭ８３／ＰＤＰＳ２と
記述した組み替えＤＮＡ及びホスト微生物は、＾ｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ。 Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　ｌｅ、　ＨＤに寄託され、それぞれ
ＡＴＣＣ八ｃｃへｓｓｉｏｎナンバー６７　２４３及び
と指定された。これらの寄託は、ＢＩＪｄａＯｅＳｔ条
約に準じて行った。 例　　２９ 性の実証 表１１７ラスミドｐＴＤＳ１．ｐＴＤＳ２゜ｐＤＤｓｌ
、　及びｐＤＤＳ２＋７）大１１１国産生物は、すべて
大いに、又は全体的に不溶性である。すべとのプラスミ
ドは、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で煮沸すること
により可溶化することが出来るし、また、ＮＡ４抗原の
サブユニット部分に高度に一致する所の１７．０００ダ
ルトンのＴＡ４抗原のサブユニットに対して産生させた
マウスの抗血清と反応するであろう。しかしながら、こ
れらの条件下では何れのプラスミドも、モノクロナル抗
体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４とは反応しない。それゆえ、こ
れらの大腸菌で合成した蛋白を可溶化し再賦活して、モ
ノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と反応できる形で
、またそれゆえ動物においてＥ、　ｎｅｃａｔｒｉｘ及
びＦ、むｅｎｅｌｌａ　ニ対して中和し保護する抗体反
応を起し得る形で、抗原を産生することが必要である。 最初に、牛プロキモシンを可溶化し再賦活して活性酵素
を産生するための既知方法によって、ＮＡ４縮合蛋白を
可溶化し再賦活させた（４７）。 この方法により、Ｐｔｎ７．２Ａ４／４免疫反応性を有
する純粋な可溶性のＮＡ４綜合蛋白を産生じた。免疫反
応性を回復するための最適な条件を設定し、以下に記述
する。 上述のようにして、プラスミドＤＴＤＳ１、ｐＴＤＳ２
、ＤＤＤＳｌ、及びｐＤＤｓ２を構築した。これらのプ
ラスミドを用いて、標準法により大腸菌５Ｇ９３６株を
変換し、アンピシリン耐性のコロニーを精製し、培養に
供した。それぞれの場合、新たにしまを付けた基点平板
培地から採取したアンピシリン耐性コロニーを用いて、
し−ブロスとアンピシリンを１００マイクログラム／−
含む１００Ｉｄ、の液体培地に接種した。この培地を３
０℃で振とうさせて培養し、１．０の０Ｄ　　　とした
。Ｉ　ＰＴＧを２１１１８に添加し、培地を３０℃で２
−３時間以上培養した。遠心分離を行って細胞を収集し
、−７０°Ｃで冷凍して貯蔵した。それぞれＮＡ４表現
プラスミドの一つを含有する大腸菌５Ｇ９３６株のペー
スト状の冷凍細胞を、それぞれ４０威のｐ１１８の２５
ＩｌｌＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＨＥＤＴＡ、０．
５１ｒｒｇ／＃！ｉ！’Ｊゾチームに懸濁した。少時の
インキュベーションの後、溶解した細胞を音波撮動によ
りさらに崩壊さＶた。 大腸菌において合成されたＮＡ４縮合蛋白は、細胞溶解
質に全く不溶性であることが判っているので、プラスミ
ドをエンコードしたＮＡ４蛋白は、１００、ＯＯＯＸｇ
で１時間細胞溶解質を遠心分離し、その後５％Ｔｒｉｔ
ｉｎ　　Ｘ　−１００洗浄剤（Ｓｉａｍａ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ、ＮＯ）　、２０ｍ
ＨＥＤＴＡを含む緩衝液を用いて小球にしたＳｎｘ片を
２５℃６０分洗浄剤抽出することにより精製した。ＮＡ
４縮合蛋白は不溶のまま残り、２５℃であった。ＮＡ４
縮合蛋白は不溶のままであり、ｉｏｏ、ｏｏｏｘｇで遠
心分離して収集した。 不溶性物質を１２蛇の１０ｍＨリン酸ナトリウム（ｐ１
１７’、５）にけん濁し、遠心分離により収集し、残存
する洗浄剤を除去した。ＮＡ４縮合蛋白をｐｌ＋７．５
の１０ｍＨリン酸ナトリウム！ｌ衝液中に懸濁し、最終
容塔を７．７ｄとした。この懸濁液に５．８ｇの固体尿
素を添加することにより充分に可溶化し、最終濃度を容
ｆｆ１ｌ　２ｄ中８Ｍとし、その後室温で１６時間混合
した。 得られた澄明な液を、それぞれＤＨｌｌ、０に調節した
１００容のｌＱｍＨリン酸ナトリウム緩衝液に希釈し、
最終容はを１２００ｄとした。この溶液を完全に混合し
、１５℃で１０分放置した。この溶液のｔａｌｌを、０
．５Ｎ＋−１ｃｊ！を５分間にわたって添加することに
より滴定し、ｐＨ８，５とした。 得られた溶液は、検定又は貯蔵する前に室温で１時間以
上放置した。試料は、モノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ
４／４との免疫反応性について検定した。この試料は、
以下に記述するように、ｐＣＯＣ２０由来の際試活した
抗原に匹敵する活性を有していた。 再賦活化サンプルのイムノアッセイ 再賦活化したｐＴＤｓｌ、ｐＴＤｓ２．ｐＤＤｓｌ、及
びｐＤＤＳ２蛋白とモノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４
／４との免疫反応性を測定した。 マイクロ力価プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ　Ｉ　ｒａｉｃ
ｒｏ　ＥＬＩＳＡｒ＋ａｔ−ｂｏｔｔｏｍ　ｗｅｌｌ　
ｐｌａｔｅｓ、ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、Ｉｎｃ、、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ　ＶＡ）のそれ
ぞれのウェルを、１０ｍＨＮａ　　ＨＰｏ　　、１５０
ｍＭＮａＣ！、０．０１％（ｗ／ｖ　）　２ｗｉｔｔｅ
ｒｇｅｎｔ　３−１２、　ｐＨ８，０に希釈した１００
マイクロリツターの抗原で覆った。再賦活した試料に対
しては、１：１０〜１：１０００希釈の抗原についてア
ッセイを行った。プレー１〜を、抗原溶液で室温で１時
間、その後４℃で一夜インキュベー１〜することにより
抗原で被覆した。ウェルを空にした後に、０．０２％（
ｖハ）　Ｔｗｅｃｎ　−２０（ＰＢＳＴ）を含むｐＨ７
，２のリン酸緩衝生】１１！食塩液で３回洗浄した。プ
レー１−を３％（Ｗ／Ｖｌゼラチン、１）Ｈ７，５の１
０ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＨＮａＣ１，０，０
５％〈Ｗハ）ＮａＮ３で室温３０分間！ｌ！ｌ　１！ｌ
！Ｌ、残余の蛋白結合部位をブロックした。その後プレ
ー１−を、１００マイクロリツターのモノクロナル抗体
Ｐｔｎ７．２Ａ４／４　（３％［ｗ／ｖｌ牛血清アルブ
ミン中３０マイクログラム／ｓｊり　、ｐＨ７，５の１
０ｍＨＴｒ　ｉ　５−１−ＩＣ１，１５０ｍＨＮａＣ１
，０，０５％（ｗ／ｖ　）　ＮａＮ３　）で、室温で２
時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回１クエルを洗
浄した後、結合したモノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４
／４を、７１クスＩｇＧに対するＶｅｃｔａｓｔａＮｎ
　ＡＢＣＫｉｔ　　（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｂｕｒｌ　＋ｎｇａｍｅ、　
Ｃ＾）を用イテ定徂した。プレートのそれぞれのウェル
を、１００マイクロリツターのビオチニル化した馬抗マ
ウスＩ　ａＧ　（４０マイクロリツターのビオチニル化
抗マウス抗体、１０ｄＰＢＳＴ中８０マイクロリツター
の正常馬血清）で充填し、室温で３０分間インキュベー
１−シた。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。その後
、プレートを１００マイクロリツター／ウエルのＶｃｃ
ｔａｓｔａｉｎ　　Ａ　Ｂ　ＣＲｃａｇｃｎｔを用い室
温で３０分インキュベートした（プレートに添加１゛る
萌に３０分間、予めインキュベートしたＰＢＳＴ中８０
マイクロリッターのビオチニル化された西洋ワナどのパ
ーオキシダーゼｎｅａｇｅｎｔＢと混合した８０マイク
ロリツターのＡＶｉｄｉｎＤｌｌ　　Ｒｅａｇｅｎｔ　
　Ａ）　、　ＰＢＳＴで５回洗浄した後に、結合した西
洋ワザどのパーオキシダーゼについて、１００マイクロ
リツター基質／ウエル（５０１Ｍクエン酸塩／リン酸塩
緩衝液ｐ液液５．３゜０．０１５％（■ハ）過酸化水素
中０．１■／−の２．２′−アジノージ−（３−エチル
−ベンズデアゾリン）６−スルボンＦｌ！２）を添加す
ることにより測定した。プレートを室温で暗所でインキ
ュベートした。４　／　４　ｎ量の吸光度を、ｒ；ｔｅ
ｒｔｅｈＨｕｌｔｉｓｃａｎ自動プレートｒｅａｄｅｒ
　（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、
　Ｈｅ　Ｃ１ｅａｎ、　ＶＡ）中で基質添加を行って１
０−６０分後に測定した。 ＮＡ４縮合蛋白の免疫反応性は、ＴＡ４縮合蛋白ｐｃＯ
ｃ２０に匹敵することが判った。 これらの実験に使用した抗原は、例２１に述べたように
してスポロシストから作った。ひよこに使用する前に、
５ＤＳ−ＰＡＧＥならびにモノクローナル抗体Ｐｔｎ７
．２Ａ４／４による免疫反応性によって、この蛋白質の
同定と純度を確認した。 ０．１５Ｍリン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液に希釈シタ
精製抗原１、約５％へＩｒａｃｅｌ　Ａ　、　９４％Ｄ
ｒａｋｅｏｌ　６−ＶＲ，１％　ＴＷｅｅｎ　２０から
成るキャリア３部に乳化させ最終ｆｆ１１ｍとした。ひ
よこに、頚部へ１回ｆｆＮ３マイクログラム抗原１０．
２ＣＣを投与した。１４日間隔で更に２回、同じ投与径
路で抗原を投与した。 蛋白質各投与前３日と最終投与後１１日日日、血清試料
収集のためひよこから採血した。血清を熱により不活性
化さＶ、例２で述べたスホロゾイト微ｆｔ％中和定石法
にて別々に調べた。 Ｆの表１４に述べである結果によれば、ワクチン接種せ
ずキ＼７リアだけを投与したひよこは、Ｌｔｃｎｅｌｌ
ａスポロゾイトに対して明白な中和抗血清力価を示さな
いが、この抗原の３回投与を受けたひよこは中和抗血清
を示した。 表１４ Ｎ△４抗原誘起スポロシイ１〜中和定吊デ〜タワクチン
接秤していない 対照標準　　　　　　　　検出でさず　　　検出できず
　　　検出できずギヤリアのみ（口・１旬　　　　　１
：４　　　　　検出できず　　　検出できずキＡ７リア
／ＮＡ４　　　　　　１：３２　　　　　検出できず　
　　　　１：８蛋白質ワクチン（ｎ＝１５） 免疫血清ｂ） （仝スポロゾイト　　　　　　・・・　　　　　　　・
・・　　　　　　　１：３２ワクチン接種） ａ　各処置グループ内のひよこから１！７に血清を集め
て検査した。 ｂ、　数羽のひよこから集めた血清 Ｃ，５０％中和１ｄ 例　　３１ ｔｃ　６／）（７）　Ｅ、ＮＥＣＡＴＲＩＸ　　Ｎ　Ａ
　４蛋白質の使用。 ４週令白色レグボンひよこに、頚部筋肉へ筋肉内径路に
より、免疫親和力を利用して精製したＮＡ４蛋白ｖ１１
５マイクログラム１０．２ＣＣの一回岱を１４日間隔で
３回投与した。この抗原はＰＢＳ中に調製され、前述の
キャリア３部に乳化させて６０マイクログラム／ｄで最
終号とした。第２グループのひよこにはキャリア基質の
みを投与した。 第３グループはワクチン接種しなかった。第４グループ
の、ＮＡ４ワクチン接種したひよこと同じケージ中で飼
った接種していないひよこは、前哨として役立った。ひ
よこをＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａで汚染させた一群の中に
無作為に入れた。Ｅ、ｔｅｎＯＩｌａに触れさせてから
１０日後に、ひよこを１Ｘ１０４Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａオ
ーシスト経口投与盪で攻撃した。２４時間後再び、ひよ
こに３×１０４オーシストを経口的に与えた。Ｅ、　ｔ
ｅｎｅｌ　Ｉａの最終経口吊を与えてから５日後に、す
べてのひよこを殺し、病巣を評価した。下の表１５にそ
の結果を示す。 表　　１５ 処置グループ　　　　　病巣評価 （Ｘ＋標準偏差） キャリアのみ　　　　　４．０＋０．０キヤリア／蛋白
質　　　　２．４＋１．３ワクチン接種なしの 対照群　　　　　　　　　３．４＋０．６当該分野熟知
の人には、この結果は、ＮＡ４蛋白質を投与されたひよ
こが、Ｅ、ｔｅｎＯＩｌａの苛酷な攻撃による疾患に対
して、ある程度防御されたことを示唆している。ＮＡ４
蛋白質を投与されたグループの病巣評価は各々の対照標
準グループより低かった。 例　　３２ 組換えＥＩＨＥＩｔｌＡ　ＮＥＣＡＴＲＩＸ　（Ｎ　Ａ
　４　）　抗Ｆｊｋ：す’）　サれたひよこの反応およ
びＥ、　ＴＥＮＥＬＬ＾との交差反応性 ワクチン接種ひよこの特異反応。　Ｅ、ｎｃｃａｔｒｉ
ｘとＥ、ｔｅｎｅｌｌａのスポロシストから誘導した膜
蛋白質に対するＮ△４ワクチン接種ひよこの免疫反応性
を証明し、又それらを同じ奇生原虫に対するＴＡ４ワク
ヂン接種ひよこの反応と比較する実験を行なった。この
実験では、１０羽のひよこをＰＴＤＳｌ　（ベータガラ
ク１〜シダーゼ／ＮＡ４融合生成物、例２７参照）のワ
クチン接種を行い、１０羽には、ＰＤＤＳｌ　（プロキ
モシン／ＮＡ４融合生成物、例２８参照）のワクチン接
種した。 これらを１０羽のｐｃＯｃ２０　（プロキモシン／ＮＡ
４融合生成物、例１２参照）のワクチン接種したひよこ
と比較した。これらの蛋白質の免疫反応性は、実験に参
加する前に、モノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４
を用いて定出し確認した。 抗原は、５％＾ｒｌａｃｅｌ　−Ａ　、　９４％Ｄｒａ
ｋｅＯ１６−Ｖｒ、１％Ｔｗｅｅｎ　　８０から成るキ
ャリアを、免疫強化因子としてＬＰ８４マイクログラム
を含む抗原５０マイクログラムに対して３：１の比にし
て調製した。この処方は、１回皮下投与伍を０．５−ｄ
として後頭部へ与えた。ワクチン接種方式は、１０日間
隔で３回投与し、各ワクチン接種時にひよこから採血し
、血清を集め、凍結保存した。実験の対照群は、ＤＣＯ
Ｃ２０ＴＡ４抗原／キャリア／ＬＰＳ；キャリア／ＬＰ
Ｓ　：ワクチン接種しない対照群から成り立っていた。 ワクチン接種群と対照群からの血清に対して、例１３で
述べたようにウェスタンプロットによってＦ、ｎｅＣａ
ｔｒｉＸとＥ、ｔｅｎｅｌｌａのスポロシス］へ蛋白質
に対する免疫反応性を定覆した。 下の表１６から分かるように、ひよこへのｐＤＤＳｌ、
ｐＴＤｓｌ、ＰＣＯＣ２０抗原のワクチン接種から均一
と不均一の寄生種に対する比血清反応性がわかる。 表１６ Ｅｉｍｅｒｉａ　　　　　Ｅｉｍｅｒｉａ　　　　　Ｅ
ｉｍｅｒｉａＴｅｎ、　　　Ｎｅｃ、　　　Ｔｅｎ、　
　　Ｎｅｃ、　　　Ｔｅｎ、　　　Ｎｅｃ。 ｐＤＤｓｌ（ｎ＝１０）　　　　２／８　　０／８　　
６／８　　７／８　　７／８　　　Ｂ／８ｐＴＤｓ１（
ｎ＝ｌＯ）　　　　１／６　　２／６　　１／８　　２
／８　　１／７　　３／８ｐｃＯｃ（ｎ＝１５）　　　
　　７／９　　５／９　　　Ｇ／６　　４／６　　６／
６　　６／６補助対照群（ｎ＝１ｏ）　　　　Ｏ１５０
１５０１５０１５０１５０／５方式を施行してから１０
日後、ひよこにＥ、ｎ（ＩＣａｔｒｉＸまたはＥ、　ｔ
ｃｎｅｌ　Ｉａミオ−シスト接種し、それら寄生虫に特
徴的な病巣について調べた。接種の処置群のひよこに、
Ｅ、　ｔｅｎ１３＋　１ａの胞子化オーシスト５．００
０個とＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘ＋７）　、ｔ　−シスｌ−
６ｏ、ｏｏｏ個を接種した。接種物は、予め、望ましい
病巣重症度になるように調節し、例１８の如く、攻撃５
８侵に病巣を評価した。 次の表１７に示しである結果は、対照群と比較して、ワ
クチン接種群における病巣重症度の減少を示している。 表　　１７ 病巣評価 病巣評価（Ｘ十標準偏差） 処置群（ｎ＝５）　　Ｅ、Ｎｅｃａｔｒｉｘ　　　Ｅ、
ｔｅｎｅｌｌａ攻　　撃　　　　　　　攻　　撃 ＤＤＤＳＩ　　２．０±０．８３．４±０．９Ｄ　　Ｔ
　　Ｄ　　３　１　　　　　１．７５　　±　０．９　
　　２．８：ヒ　０，６ｐｃＯｃ２０２．２±０．４３
．０±０．５補助対照群　　２．６　　±０．７　　検
出できず攻撃対照群　　２．８　　±０．８　３．８±
０．６１１Ｌ又戊エバエｌユユエλ且亘旦亙旦主二工１
けるスポロゾイト中和血清反応性。 ならびにｐＴＤｓｌの、ワクチン接種ひよこの血清へ奇
牛虫中和能を付与するＰＤＤＳｌとＰＴＤＳｌの能力を
判定するためにスポロゾイト中相定量法（ＳＮＡ）を利
用した。例１８において確立させたＳＮＡプロトコール
を用いて、前述したワクチン接種群と対照群の血清につ
いて、スポロゾイト中和能を定量した。 下記の表１８に示すように、ｐＴＤＳｌとｏＤＤｓｌの
ワクチン接種したひよこから、三回目のワクチン接ｆ！
ｉ後に集めた血清は、−次ｍｃｒｏｎｔｓの発生阻止に
有効であった。 表１８ 組換えＮＡ４ワクチン接種したひよこに対するｃ、　ｔ
ｅｎｅｔ　Ｉａスポロゾイト中和定品。 スポロゾイト中和希釈倍数 処置群　１：４　１：４　１：８　１：１６　１：３２
ｐＤＤｓ１（ｎ＝１０）　　’　６／１０　３／１０　
１／１０−・・・−ｐＴＤＳｌ（ｎ−１０）　　　２／
１０−４／１０　４／１０　　　・・・ｐＣＯＣ２０（
ｎ＝１０１　１／１０　　　・１／１０　２／１０　　
−・・補助剤対照（ｎ−ｔＯ）　　　　９／１０　　１
／１０　　　　・・・　　　・・・　　　・・・スポロ
ゾイト 免疫血清（ｎ＝２）　　　　　　・・・　　　・・・　
　　・・・　　２／２　　　　・・・例　　３３ 分野体を、最初はアラバーン大のアレンイガ−博士から
購入した。この分離体の各々の純度はオーシストの特徴
、感染腸組織の組織学を使用して確かめられた。オーシ
ストの大きさ・形の指数はＥ、ｍａｘｉｍａの範囲内に
あった。 ジョンソンとライド法によって病巣を評価した。 感染ひよこの病巣はこの分離体に典型的なものであった
。病理学は腸中間部に限られ、粘液様滲出物と壊死性陽
炎があった。感染後４日目の組織検査から、腸中間部上
皮に小さな３代・４伏目のスキゾントが見い出された。 ａ度感染中（１，００ｏ、ｏｏｏオーシストまｒ　）　
、Ｅ、ｍａＸｉｍａニよッテ死にはいたらなかった。分
離体各々の純度を確保するため、オーシストの一回クロ
ーニングを定期的に行なった。 オーシストの増殖。　一般的には、２から６退会ＳＰＦ
白色レグホンひよこに、分離体各々の純培養液を通過さ
せた。外部からのコクシジュム感染を避Ｇプるため、ひ
よこを生後１日からプレキシガラス製隔離室で飼育した
。感染から８日後に免便中からオーシストを採集した。 胞子化したオーシストを、一般的には、２％ｗ／ｖ　Ｋ
２Ｃｒ２Ｏ７中２４℃で保存した。 区」１）ニヱ」二ｍ望、１４退会ブロイラーひよこ５羽
にＥ、ｍａＸｉ＋ｎａの胞子化オーシスト１Ｘ１０６個
を経口的に接種した。接種してから４日後に、ひよこを
殺した。腸中間部を取り出し、ＰＢＳを急激に流し、切
開した。上皮層をガラススライドで剥離し、１％ヒアル
ロニダーぜＰＢＳの入いっているビーカーに入れた。室
温にて１／２時間培養後、その消化物質を粗目の布に通
した。懸濁液を５０ＩＩｉ管に入れ、１００ＯＩＩＰＨ
で１０分間遠心分離した。上澄液を取っておき、沈澱物
を２度洗浄した。 上澄液を合わせ、３０００　ＩＩＰＭで１０分間遠心分
離した。沈澱物を再懸濁し、ガラスウールカラムに通し
た。この懸濁液を遠心分離による収集をする前に２度洗
浄した（１０００１ｔＰＨ１４分間）。 Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｅ、Ｈａｘｉｍａメロゾイト中和、酊
Ｅ、Ｈａｘｉｍａメロゾイト中和定量のため、メロゾイ
トを数え、処置群１グループ当り、ひよこ１羽当り１×
１０７メロゾイトになるよう希釈液を調整した。各処置
群は３羽の１退会ブロイラーひよこから構成されている
。各処置群用のプールメロゾイ１・は、遠沈させてから
、熱で不活性にした試験、Ｌ′ｆｒｉ液または血清（５
６℃、３０分間）３−に再懸濁させた。メロゾイトを接
種前に３７℃にて３０分間１８養した。接種のため十二
指腸を外科的に露出させ、メロゾイトを含む試験上澄液
又は血清１戒を内腔へ注入した。切開部を閉じ、ひよこ
を処ｄに従って隔離ケージに隔離した。攻撃後１日から
４日間、ロング等（１９７６）（４２）により記述され
た方法を用いて、オーシスト産生数を数え　Ｉこ　。 例　　３４ Ｅ、ＨＡＸＩＨ＾に対するハイブリドーマの゛　　ｉ］
！特徴。 （１１−クローン性抗体。　ヴアンドイセン、ウニトス
トン法（７７）を使用して開発したハイブリドーマから
単一クローン性抗体を誘導した。ｒｆ！Ａｔ１１に述べ
ると、Ｂａ１ｂ／ＣＢｙＪｖウスを、１０６１０７無欠
Ｅ、　ｍａｘ　ｉｍａメロゾイテで繰返し免疫にした。 無欠メロゾイテの最終静脈内性用から３日後に、無差別
に選んだマウスを殺し、牌臓を摘出した。５牌細胞を器
管の線維組織から分離し、洗浄してからネズミの形質細
胞腫細胞系（ｓｐ２１０Ｍ＞と融合させた。 Ｅ、Ｈａｘｉｍａメロゾイトー特異性ひよこ抗血清ＳＰ
Ｆ白色レグホン型ひよこにおいて、［ｉｍｅｒｉａｍａ
ｘｉｍａメロゾイトに対して免疫性のひよこ血清を調整
した。簡単に述べると、１〜２週令のひよこに、１４日
毎に、凍結／溶融したメロシイ１−を四回注射した。各
々のひよこに、−回目の注射では４Ｘ１０’メロゾイト
を、次に１．４Ｘ１０７メロゾイ１へを含む注射液を更
に４−５回与えた。Ｒ終接腫後５日日に６蔵穿刺によっ
て血液を得た。 血清を集め一２０℃で保存した。 間接蛍光抗体スクリーニング。　Ｅ、ｍａｘｉｍａのメ
ロゾイド（約１×１０６／容器）を用いてＩＦＡスライ
ドを作製した。スライドを数時間から一夜風乾し、次に
１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１０マイクロリツトル
を各々の容器に加えた。ＢＳＡ添加から５分後に、試験
上澄液２０マイクロリツトルを加えた。上澄液を３７℃
、２０分間培養し、次に、０．０５％ツイーン−２０を
含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ツイーン）で三回洗浄した。蛍光
結合ウサギ抗体（ＰＢＳで１：４０に希釈）を試料に加
え、３７°Ｃにて２０分間培養した。その結合体をＰＢ
Ｓ−ツイーンで３回洗浄したのち、スライド液とカバー
グラスを載せた。 結果。　Ｅ、ｍａｘｉｍａメロゾイトに対して開発され
た多くのハイブリドーマのうち、８種がこの寄生虫のメ
ロゾイト段階に対する中和抗体を産生することが判明し
た。研究したハイブリドーマすべては、膜結合抗原を認
識する抗体を産生じた。バイブリド−７１胞系ＡＴＣＣ
Ｎｏ、１−ＩＳ　　８９４６が産生し、Ｐｍｘ４７．８
Ｂ５と表わされる単一クローン性抗体はＥ、ｍａｘｉｍ
ａオーシスト産生を減少させる傾向を持つため選訳され
た。 例　　３５ 分裂小体膜タンパク質（例３６の記載に従って化溶化し
た洗剤）を−次元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドスラブゲル（３５）を用いて還元或は非還元条件
で分離し、電気泳動によりニトロセルロース紙への移動
を行った（５）。電気泳動プロットはＳｈａｒｍａらの
方法（６４）で作製したが、例外として血清、モノクロ
ーナル抗体及び特定の抱合体（ヤギ抗ニワトリ［ＦＧと
接合したペルオキシダーゼ（にｉ　ｒｋｅｇａａｒｄと
Ｐｅｒｒｙによる）、ウサギ抗マウスＩｇＧと接合した
ペルオキシダーゼ（Ｃａｐｐｅｌによる））を用いた。 プロットはこれらを４−クロロ−１−ナフトール（シグ
マ社；６６Ｃ１ｌ／＋ｎｅ）及びＨ２Ｏ２（０，１７％
）と反応させて展開した。 のＥ、ｍａｘｉｍａ分裂小体タ分裂小体タンパクセて調
製したモノクローナル抗体は、１つはみかけの分子分が
５５，０００ドルトンであり、もう１つはみかけの分子
団が４２．０００ドルトンである（還元或は非遷元の条
件での５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて）。しかし、Ｐｍｘ４
７．８Ｂ５がいくつかのアイメリア抗原に共通のエピド
ープを認識すると思はれている。 例　　３６ アイメリアＭＡＸＩＭＡ８Ｂ５抗原の精製及び特性 モノクローナル抗体Ｐｍｘ４７．追Ｊトカ」久Ｍ判エア
フイニテイークロマトグラフィー用の固相にＰｍｘ４７
．８Ｂ５モノクロ一ナル抗体を結合させる前にＨＢＩＯ
Ｉ無血清培地中にみられる汚染成分及びタンパク質（す
なわち、Ｂ５Ａ１トランスフェリン、インスリン、成長
因子等）を取り除くための精製を行った。この精製機構
の第一段階は製造者の示す使用方法に塁づき上澄に含ま
れるＰｍｘ４７．８Ｂ５から過剰のＢＳＡを取り除くた
めにＤＥＡＥ−Ａｆｆｉゲルブルーカラム（ＢＩＯ−Ｒ
ＡＤ）を通すことであった。この後で次に示す陰イオン
或は陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行っ
た。部分的に精製された抗体をｐＨ１８，０の２０ｍＨ
リン酸ナトリウム緩削液でＤＥＡＥ−セファデックスカ
ラムに乗せ、同じ緩衝液中で塩化ナトリウム濃度をＯ〜
５００　ｍＨにグラジェントさせて流出させた。陽イオ
ン交換方法は、Ｃａｒｌｓｓｏｎらの方法（６）に基づ
いたが、ＳＰ−セファデックスの代わりにリン酸セルロ
ース樹脂（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。流出分画中の抗
体の位置はＥＬＩＳ△により測定し、純度は５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより決定した。 Ｐｍｘ４７．８Ｂ５アフイニテイー樹脂の作製。 精製復、Ｐｍｘ４７．８Ｂ５モノクロ一ナル抗体を製造
者の示す方法に基づき、ＣＮＢｒ活性化セファロース４
Ｂ（ファルマシア社）或はベックマンＵＬＴＲへＦＦ、
ＩＮＴＴＹ　Ｏ−Ｅ　Ｐカラム（ベックマン社）と連鎖
させた。 分子ｆｌ？１５５．０００ドルトンの８Ｂ５抗原の精り
、　　Ｅ、ＨＡＸＩＨＡ：Ｆ）裂小体を２０ｍＭｔ−リ
ス塩！＜１１１＋７．５＞、２５ｍＨ塩化ナトリウム、
５０ｍＨＷ化マグネシウム、１％（■ハ）トリトンＸ−
１００゜１＋ｎＨＰＭＳＦ、１ｎ＋ＨＴＬＣＫ、０．１
ｍＨＴＰＣＫ及びｌ０ＫＩＵ／ｄアプロチニンを含む溶
液中に再懸濁させ、最終的な濃度を１０８分裂小体／Ｉ
ｄとした。１時間インキュベート後、２８．０００Ｕで
回転（１０分４℃）させると不溶性物質がペレット状と
なった。 ザンブルをへＧ５０ｌ−Ｘ８混合ヘッド樹脂を含むＰＢ
Ｓ　（ｐ１１７．２）に対して広範囲の透析を行った。 分子量５５，０００ドルトンの８Ｂ５抗原をＰｍｘ４７
．８Ｂ５モノクロ一ナル抗体を用いて上澄から免疫吸着
させた。非特異結合タンパク質はｐＨ７、、５（高）或
はｐｌ＋４．０（低）の洗浄により取り除いた。結合分
画は５００ｍＨ水酸化ナトリウム１ｄ中にグリシン（ｐ
Ｈ３ＩＩ’　Ｏ）をＯから１Ｍまで増加させて１ｄずつ
の分画として流出させた。精製されたポリベブヂドは、
ミクロタイタープＬ’−１−ＥＬＩＳＡにより、Ｐｍｘ
４７．８Ｂ５モノクロ一ナル抗体との反応性があること
を示した。 ＰＪ３７ Ｅ　、　’ＣＯＬ　Ｉ　中（７）　Ｅ、）ＩＡＸＩＨＡ
　　λｇｔｌｌゲ／ム表記ライブラリーの構成 本研究に用いられた組換え体ＤＮＡライブラリーは脱リ
ン酸化されたλｇｔ＋＋アーム中に連結された（ベクタ
ークローニングシステム）　Ｅ、ｍａｘｉｍａの完全な
ＥＣ０ＲＩ消化によって作られた。アームは０〜７　ｋ
ｂｐの長さの部位に挿入できる。 Ｅ、１ａＸｉｎｌａ　　Ｄ　Ｎ　Ａは次の手法を用いて
３．６×１０７の胞子形成されたオオシストから精製さ
れたものであった。胞子形成されたオオシストを洗浄し
、スポロシストは前に述べた方法で分離した。 分離したスポロシストを０，１Ｍｔ−リス塩１ｍ（ｐＨ
１８，５）、０．２Ｍ塩化ナトリウム、１ＱｍＨＥＤＴ
Ａを用いて２回洗浄した。スポロシストを０．１Ｍトリ
ス塩酸（ｐＨ１８，５）　、０．２Ｍ塩化ナトリウム、
５０ｍＨＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１５０μｆｆ／ｄプロ
テイナーゼＫを含む溶液中で６５℃３０分インキュベー
トして溶解した。室温まで冷却歪、ＤＮＡを同体積の液
化フェノールを用いて１時間かｔプて徐々に抽出した。 ３０００　ｒｐｍで１０分間遠心分離後、水相を取り除
き、境界面及びフェノールを１０１１１Ｈトリス塩Ｒ（
ｐＨ８）　、１　ｍＨＥＤＴＡを用いて再抽出した。水
相を混合しフェノールで１回及びクロロホルム：イリア
ミルアルコール（２４：１）で２回抽出した。ＤＮＡを
エタノール分画法により分離した。ＤＮＡベレットを１
０ｍＨトリス塩Ｍ　（ｐ］１８）　、１ｍＨＥＤＴＡに
再溶解し、３７°Ｃで１時間０．１５η／ｄのＤＮアー
ゼＥ！１ｆｆｌ１１ｉＲＮアーピＡを用いて処理した。 ＲＮファーの消化後、υンブルをフェノールで１回、ク
ロロホルム・イソアミルアルコール混液で１回それぞれ
抽出してからエタノールで沈澱させた。 ＥＣ０ＲＩ−切断Ｅ、ｍａｘｉｍａ　　ＤＮＡ　（０，
４μ９）をＴ４ＤＮＡ連結酵素（ＩＢＩ、０．５ユニツ
ト）を５μｌの総体積に含むインターナショナルバイオ
テクノロジー社（［ＢＩ）製のＴ４ＤＮＡ連結緩！ｌｉ
液中の脱リン酸化λ３ｔ１１アーム（２，Ｏμｇ）を用
いて１２℃で１５時間インキュベートした。この反応混
合物４μｌをベクタークローニングシステム（ギガバッ
クＧＰ１０）から使用方法のとおりに凍結溶解及び音波
パッケージング抽出法を用いてランダブラーク形成単位
（ｐｆｕ）中に組み合わせた。反応をＣｌ−Ｉ　ＣＩ　
３の添加ににり停止させ、８Ｍ溶液で希釈した。ＳＭの
組成は０．５８％塩化ナトリウム：（０，１Ｍ）０．２
％硫酸マグネシウム・７Ｈ２０ ５０１Ｈｔ−リス７．５ ０．０１％ゼラチン ライブラリー中の組換えファージの数を査定するため組
み合わせたＤＮＡの一部を旦、Ｃｏ１１菌株Ｙ１０９０
．ｒ　（プロメガ、バイオチク：旦、Ｃｏ１１　　Ｌａ
ｃ　　Ｕ１６９　　Δ１ｏｎａｒａ　　Ｄ１３９　５ｔ
ｒＡ　　５ｕｐＦ［ｔｒｐＣ２２：：Ｔｎ１０］ｈｓｄ
　　Ｒ（ＰＭＣ９−一））の後１１］　［：］グ培養２
００１１１に吸着させた。 これらの培養物は５ｍＨＩＰＴＧを含むＭＺＣＹＭ上層
寒天（４４）の中のＸ−ガルアンピシリン（１００μｙ
／ｄ）（Ｄプレート上（５５）にうえつけた。組換え体
はこの方法では無色のプラークを形成し一方非組換え体
は青いプラークを形成した。このライブラリーはこの方
法では９５％以上の組換えを示し、１０°ｐｆｕを含ん
でいることを示したくこれは非拡大ライブラリーである
）。 イブラリ−はＮＺＹアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）
上層寒天（４４）中の５×１０４ｐｆｕ／１６０　ｔｒ
ｙ　Ｌ−アンピシリン寒天プレートにうえつけた。 プレートを上むきにして４２℃で３．５時間インキュベ
ー１〜した後、ｌＱｍＨのＩ　ＰＴＧで飽和して空気乾
燥させたＢＡ８５ニトロセルロ一ス濾紙（Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｎｅｌｌ）を用いて過剰に乗せた
。 プレートを次にさらに４時間３８℃でインキュベ−１〜
した。′ａ紙を取り除きＴＢＳＴ（５０ｍＨトリスｐＨ
８，０，１５０ｍＨ塩化ナトリウム、０．０５％　Ｔｗ
ｅｅｎ　２０　＞溶液を用いて洗浄した。 濾紙を−ｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液（３％
ゼラチン、１０ｍＨトリス　０．９％塩化ナトリウム、
０．０５％アジ化物）中で１５〜３０分間インキュベー
トした。ブロッキング緩衝液を除き、濾紙を最初（−次
）の抗体として１０−４パーツの８Ｂ５腹水液を含む最
初の抗体緩衝液（３％ＢＳＡ、１０、ｍＨｔ−リス、０
．９％塩化ナトリウム、０．０５％アジ化物）中に置い
た。濾紙をこの溶液中で２２℃で４時間或は４℃で１晩
インキユベートした。それから濾紙を二次抗体としてビ
オチン化したウマ抗マウス、アビジン共役ペルオキシダ
ーゼ及び発色剤として４−クロロ−１−ナフトールを用
いて（ベクタスティンキット試薬及び標準手法）展開し
た。 １０個のプレートから作成された５Ｘ１０５ｐｆｕに等
しい濾紙は、以上の方法でスクリーニングされＰｍＸ４
７．８Ｂ５に特異的に反応する２３　ｐｆｕが同定され
た。 例　　３８ Ｐｍｘ４７．８Ｂ５と反応する２３個のクローンはそれ
ぞれプラーク精製であった。クローンを次に培養して、
ＤＮＡをＨｆ３＋１１１Ｓら（２３）の方法によってこ
れらのクローンから精製した。ＤＮＡをＥＣ０ＲＩで消
化し、それぞれのクローンに挿入したＥＣ０ＲＩの大き
さをアガロース或はアクリルアミドゲル（表ＸＩＸ　１
行目）による電気泳動によって同定した。 それに加えて、それぞれの２ｇ　ｔ　ｌ　Ｉ　Ｅ、ｍａ
ｘｉｍａクローンの溶原をＥ、ｃｏｚ菌株Ｙ１０８Ｂ（
Ｙ１０９０に対する溶原、Ｙ２Ｏ２ＳはｈｆｌＡ及び１
−Ｉ　Ｓ　ｄ＋であることは例外）を用いて作成した。 それぞれの溶原の誘導培養物が成長してから、凍結溶解
により細胞抽出を行った。これらの抽出は重複還元ＳＤ
Ｓアクリルアミドゲル（１０％或は５％のアクリルアミ
ド）による電気泳動により分画された。次に、これらは
、ファージ表現ベクトルλｇｔｊ！ｉ（表ＸＩＸ、第２
１第３段目）テコードされたβガラクトシダーゼを含む
タンパク質融合として組換え抗原が表現されているか否
かを調べるために、最初の抗体として８Ｂ５腹水液或は
ウサギ抗β−ガラクトシダーゼを使用するウェスタンプ
ロット法により分析した。これらうち、２つのＰｍｘ４
７．８Ｂ５りＯ−ンハ４５にｄ−２２０ｋｄのタンパク
質と反応した。プロットの重複セットのための最初の抗
体として使用されたウサギ抗β−ガラクトシダーゼは、
Ｐｍｘ４７．８Ｂ５により同定されたものと同じタンパ
ク質バンド或は１１６ｋｄタンパク質、β−ガラクトシ
ダーゼのＭ、Ｗ、のいずれかと反応した。前者の反応パ
ターンによれば、問題のクローンがハイブリッド或は融
合タンパク質をコードすることを示している（　Ｅ、　
１ｍａＸｉｌａタンパク質はＣ−末端に近０ところでβ
−ガラクトシダーゼと融合した）。後者の反応パターン
によれば、分析されたクローンがλｇｔｚのβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子と融合しないＥ、　ｍａｘｉｎ＋ａタ
ンパク質をコードすることを示している。このようにウ
ェスタンプロット分析により２３個のクローンが融合及
び非融合のカテゴリーにグループ分けされる。 上述のウニタンプ０ット分析によるデータとそれぞれの
クローンに挿入されたＥＣ０ＲＩ　　Ｅ。 ｍａｘｉｍａの大きさについての知見とを組み合わせる
ことで２３個のクローン間の同胞グループを同定するこ
とが可能になった。この分析結果より、もとの２３個の
クローン中１３個の中から独立（非同胞）クローンを同
定した。これらの１３のうち７個がβ−ガラクトシダー
ゼ−Ｅ、　ｍａｘｉｍａ融合タンパク質にコードされる
。この中には、クローン５，１１及び１３が含まれてい
る（表ＸＩＸ　４段目）。一方、他の６個はクローン４
及び１８が含まれており非融合タンパク質にコードされ
る。 ｐ１４−９と呼ばれる付加的サブクローンも、Ｐｍｘ４
７．４Ｂ５に免疫反応性を持つβ−ガラクトシダーゼ−
ｃ、　ｍａｙ：ｉｍａ融合タンパク質を生成するものと
して同定された。このサブクローンはサブクローンｐＢ
−８と同様のＥ、　ｌ１ａＸｉｌｌａ構造を持つ独立分
離であると考えられる。 クローン５．１１及び１３は融合タンパク質をコードす
るクローンの例である。クローン５，１１及び１３の溶
原はそれぞれ約１２０．１６０及び１８０ｋｄのＰｍｘ
４７．８Ｂ５−免疫反応性を持つタンパク質を表現して
いる。Ｅ、ｍａｘｉｍａのｐｍｘ４７．８Ｂ５−標的抗
原を表わすβ−がラフ１ヘシダーゼとも反応するタンパ
ク質はλｇｔ＋＋のβ−ガラクトシダーゼにより融合さ
れる。 λｇｔ＋＋クローン５，１１及び１３（それぞれ約０．
２４，０．８及び３，８ｋｂ）から挿入されるＥｃｏＲ
Ｉは、旦、Ｃｏ１１からβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
挿入されたＤＢＲ３２２から誘導されたプラスミドＰＤ
Ｋ２中にサブクローンされた。サブクローンｐ５−３、
ｐｌｌ−２及びｐ１３−８（旦、Ｃｏ１１を宿主とする
ＤＩ２１０）はＰｍｘ４７．８Ｂ５及びウサギ抗−β−
ガラクトシダーぜの両方に免疫反応性を持つタンパク質
１２０．１６０及び１８０ｋｄをそれぞれ表現していた
。 サブクローン０１２１０／ｐ５−３、Ｄ１２１０／ｐ１
１−２及びＤＩ　２１０／ｐｉ　３−８からのミニスク
リーンＤＮＡはＥ、　Ｃｏ　Ｉ　＋を宿主とするＭＨ’
、（１−（ｓｄ　　Ｒ−Ｍ”　）に形質転換され、次い
でラクトースプロモーター及びオペ−レータ−の制御下
で組換え体抗原の表記を特に調製するリプレッサー分子
をコードするのを助けるプラスミドボルネＬ　ａ　ｃ　
＋−を含むｌ−ｏ　ｎ−及び１−ｏｎ＋宿主へと形質転
換された。遺伝子の表現はＩ　ＰＴＧの添加によりこれ
らの培養物中に誘導された。またそれぞれの宿主により
生成された組換え体抗原のレベルは７．５％５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを用いた電気泳動による１１Ｍ及び分画されたセ
ル抽出物によって決定された。 対照的に、２ｇ　ｔ　ｌ　Ｉ−ｍａｘｉｍａクローン１
８の溶比はβ−ガラクトシダーゼ抗体とは反応しない約
１００ｋｄのＰｍｘ４７．８Ｂ５との反応性を持つタン
パク質を表現していた。このように、クローン１８はλ
９ｔｌ＋のβ−ガラクトシダーゼタンパク質と融合しな
いＰｍｘ４７．８Ｂ５に反応性を持つタンパク質をコー
ドする。 クローン１８のＤＮＡを精製し、ＥＣ０ＲＩで消化しプ
ラスミドベクトルＣｌＣ１８中にサブクローンさせた。 旦、ｃｏｌｉ菌株ＪＭ８３　（ａｒａ−Δ− （ａｍ）　　　　　（ｆａｃ　　ｐｒｏ）ｓｔｒＡｔｈ
　ｉ　（−８０ｄ　　Ｉａｃ　ｉｏ−６７Ｍ１５））の
白色コロニー形成の質転換細胞をＸ−ガル−アンピシリ
ンプレートから取り出し、ミニスクリーンＤＮＡを１２
のこのような候補から調製した。ミニスクリーンＤＮＡ
＠ＥＣ０ＲＩで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳
動により分画した。１ｄの培養物をλ９ｔ１１クローン
１８中に存在すルＥｃｏＲＩ−１ｉｆｉ人（３，６ｋｂ
）　ｆｉｌ！：同ｆｆｉヲ含むこれらのサブクローンか
ら生育させた。これらの培養物の［ｌ胞溶解質はＰｍｘ
４７．８Ｂ５を用いたウェスタンプロット法で分析した
。分析した培養物の約半分はおよそ１００ｋｄのＰｍｘ
４７．４Ｂ５−反応性を持つタンパク質であり残りはそ
うではなかった。この結果は、クローン１８中に挿入さ
れたＥＣ０ＲＩによりコードされたＥ、ｍａｘｉ請ａタ
ンパク質の表現はｏｕｃｌ　８プラスミド内への挿入の
定位に依存していることを示していた。おそら＜　Ｅ、
ｎ＋ａｘｉｍａＤ　Ｎ　Ａは翻訳開始の信号を含んでい
るが抗原の符号づけの続発の転写はλ９ｔ１１−β−ガ
ラクトシダーゼプロモーターによる読み取り転写に依存
している。 サブクローンｐ１８−３９　（Ｐｍｘ４７．８Ｂ５反応
性を持つタンパク質）のミニスクリーンＤＮＡはＪＭ８
３及び５Ｇ９３６　（テキスト中の他の場所の遺伝子型
を見よ）に形質転換された。 組換え体抗原の表現レベルは５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェ
スタンプロットを用いた電気泳動による分画細胞抽出に
より測定した。この条件の下での、表現レベルは総細胞
タンパク黄の１％以下であった。 λｇｔｌｌＥ、ｍａｘｉａ＋ａクローン４をクローン１
８と平行して分析を行った。この結果は検査されたクロ
ーン４のサブクローン１８個すべてがＰｍｘ４７．８Ｂ
５＝反応性を持つタンパク質（この場合は約５０ｋｄ）
を表現したという点で異っていた。 サブクローンの制限マツピングによればＥＣ０ＲＩ挿入
の可能な２つの定位は検査した１８の中に示されている
ことを示していた。これらの結果はλｇｔｌ＋クローン
４中でクローンされたＥｃｏＲＩ−Ｅ、ｍａｘｉｍａＤ
ＮＡは翻訳及び転写開始の信号を備えていて、この信号
はＥ。 ｃｏｌｉを宿主とするＪＭ８３中でも確認されること（
すなわち表現が定位に依存していないこと）を示してい
る。 Ｐ５−３、Ｐｌｌ−２、Ｐ１３−８と指定されるλｇｔ
ｌｌ−Ｅ、ｍａｘｉｍａクローン５，１１．１３のプラ
スミドＰ［）Ｋ２中のサブクローンは、Ｐｍｘ４７．８
Ｂ５及びベーターガラクトシダーゼに対するウサギの波
射により免疫反応を起こすベータガラクトシダーゼ−Ｅ
、　　ｎ＋ａｘｉｍａ＠合蛋白質をコード化している。 この融合蛋白質を精製するめに、これら３個のサブクロ
ーンからなるＤＮＡを重要な濃度の融合蛋白質が発現す
る旦。 Ｃ０１１菌株５Ｇ９３６　（Ｆ−１ａｃ　（ａｍ）ｔｒ
ｐ　（ａｍ）　　ｐｈｏ　（ａｍ）　　ｆｉｃ（ｔＳ）
　　ｒｐｓｌ−ｍａｌ　（ａｍ）　　江ｆｆＲ（ａｍ＞
　　ｔｓｘ：：Ｔｎ　　１０　１ｏｎＲ９）に形質変換
した。 ５Ｇ９３６中のサブクローンｐ５−３、Ｄｌｌ−２、ｐ
ｌ３−８の培養液１リツトルを、し−アンピシリン肉汁
中３０℃でＯ，Ｄ、６００が約１．５まで増殖した。無
効用誘導物？ｔｌＰＴＧを添加して１ｍＨにし培養液を
３０℃でさらに２時間培養した。４℃、６０００ｒｐｍ
　、１５分間遠心分Ｍ　（Ｓｏｒｖａｌｌ、Ｇ　Ｓ　３
０−ター）して細胞を集めた。ベレットを１×Ｍ９塩（
５５）中で洗浄し、−２０℃で凍結した。次にベレット
を溶かし、１ＱｍＨリン酸緩衝液、ｐｌｌ７．５及び０
．５η／Ｉｄリゾチーム４０ａｔｉ！に再懸濁し、室温
で３０分間培養した。この懸濁液を、サンプルの粘度が
有意に減少するまで超音波処理（３０秒の破裂）した。 サンプルヲ、ＡＨ６４１ロー１−’Ｔ’、３０．０００
ｒｐｍ　、　４℃、６０分間、遠心分離した。ベレット
をピペットで取り、超音波処理して、１０１１８リン［
衝液４０ｄ！、ｐｌｌ５、中’ｒ＋ｔｉ懸濁シ、次にＥ
ＤＴＡ（２Ｏｎ＋Ｈ）とＴｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１００
（５％）を加えた。サンプルを室温で１時間穏やかに混
合し、次にＴ８６５０−ターで４℃、３０．０００ｒｐ
ｍで６０分間遠心分離した。このように調製したベレッ
トは、サブクローンｐ５−３、ｐｌｌ−２及びｐｌ３−
８の純度がそれぞれ約７０％、２０％及び３０％である
所望の出発蛋白質の約６０％を含有していた。 表ＸＩＸ コード化されている　　８Ｂ５− ＤＮＡ挿入　蛋白質（Ｆ）の融合また　反応蛋白質（Ｋ
Ｏ）　　控除子孫１　　　　　３　　　　　　　Ｆ　　
　　　　　　　　−２００１２３Ｎ　　　　　　　　　
　１００　　　　　２３　　　　　３　　　　　　　Ｆ
　　　　　　　　　　１２００　　　　　１４　　　　
　４　　　　　　　Ｎ　　　　　　　　　４５−５０　
　　　　　特殊５　　　　　０．２４　　　　　Ｆ　　
　　　　　　　　１２０　　　　　３６３　　　　　　
　　　　　　　Ｆ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　率２００　　　　　　　　　　１７　　　　　３　
　　　　　　Ｎ　　　　　　　　　　１００　　　　　
２９　　　　　２　　　　　　　Ｆ　　　　　　　　　
　１４０　　　　　￥ｒ殊１１　　　　　０．８　　　
　　　Ｆ　　　　　　　　　　１６０　　　　　４１４
　　　　　３．８　　　　　　Ｆ　　　　　　　　　　
１８０　　　　　５１６　　　　　３．８　　　　　　
Ｆ　　　　　　　　　　１８０　　　　　５１７　　　
　　０．８　　　　　　Ｆ　　　　　　　　　　１６０
　　　　　４１８　　　　　３．６　　　　　　Ｎ　　
　　　　　　　　　９７　　　　　６２０　　　　　３
．２　　　　　　Ｆ？　　　　　　　　　　？　　　　
　　特殊２１　　　　　３．８　　　　　　Ｆ　　　　
　　　　　　１８０　　　　　５２２　　　　　０．２
４　　　　　Ｆ　　　　　　　　　　１２０　　　　　
３２４　　　　　３．６　　　　　　Ｎ　　　　　　　
　　　　’１７　　　　　６２５　　　　　２．５　　
　　　　Ｎ？　　　　　　　　　　？　　　　　　特殊
２６　　　　　３．８　　　　　　Ｎ？　　　　　　　
　　　？　　　　　　特殊例　　４０ 使用する８Ｂ５は、実施例３６に記載されている還元さ
れていないそのままの８Ｂ５抗原の調製の方法によって
、メロゾイトから調製した。この蛋白質の純度と同一性
は、ひな鶏で使用する前に、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びモノ
クローナル抗体Ｐｔｎ４７．８Ｂ５との免疫反応によっ
て確かめた。 ワクチン製剤は、規定方式に従って、投与量０．２Ｉｎ
１につき約５０マイクログラムの８Ｂ５抗源が含有され
るように、波源１容量に対して５％Ａｒ１ａｃｅｌ　Ａ
　、　９４％　Ｄｒａｋｅｏｌ　　６−　Ｖ　Ｒ、１％
Ｔｗｅｃｎから成るオイルキャリアー３容吊の濃度で調
製した。必要な場合は、波源をＰ８Ｓ（ｐｌ（７，２）
で希釈して規定方式に所望される温度にした。ひな鶏の
頚の筋肉に０．２ａｅを筋肉内投与した。波源を同量、
同じ経路で２週間間隔でさらに２回投与した。 蛋白質をそれぞれ投与する３日前及び最終投与の１１日
後に、血清サンプルを採取するために鶏を脱血した。心
臓の不活性化した血清をメロゾイトマイクロ中和検定（
実施例３３）で別々に試験した。代表的なものとしては
、３×１０７の新たに調製した　Ｅ、　ｍａｘｉｍａの
メロゾイトを試験血清１．５Ｉｄｌ中で室温で１５−３
０分間培養した。培養後、１Ｘ１０７のメロゾイト（０
，ＦＭ）を、２週齢の焼肉用の鶏の外科的に露出した十
二指腸に接種した。鶏を個別ケージに収容し、卵母ＳＵ
ａの産生量を、感染後１−４日に収集した糞便を十分混
合して、各処方群ごとに計った。ＨＣＨａＳｔｅｒ血球
計算板を用いて卵母細胞を数えた。下の表ｘｘに示した
結果は、キャリアーを投与されワクチン処理をされてい
ない鶏にはＥ、　ｍａｘｉｍａメロシイ１−に対するは
っきりとして中和抗血清力価がなかったが、波源を３回
投与された鶏にははっきりとした中和抗血清力価があっ
たことを示している。 表ＸＸ Ｂ’ｔｌｔＪ清　　　　　　　１．４Ｘ１０　　　５．
０ＸＩＯ８，２Ｘ１０５キヤリーのみ（ｎ＝１４）　　
１．７刈０６　５．０ＸＩＯ５１，２５刈０６キヤリア
ー／蛋白質 ワクチン（ｎ＝１５）　　　　　２Ｘ１０５　　　　　
　０　　　　　４．７ｘｌＯ３免疫血清　　　　　　　
　　０　　　　　　　　　０　　　　　　　　　Ｑ（全
てのメロゾイト ワクチン接種） ８Ｂ５蛋白　を使用したびな鶏における防御反応の誘発
　最終ワクチン接種の６週間後に、なん匹かの鶏に、４
０，０００の胞子に変態させたＥ、　ｍａｘｉｍａ卵母
細胞を経口試用投与した。投与の５日後から１０ＥＩ後
の間に産生じた卵母細胞を数えた。この細果は、下の表
ＸＸＩに示した。 表　　ＸＸＩ Ｅ、ｍａｘｉｍａ胞子虫症に対する８Ｂ５　　　ワクチ
ン種鶏の防御 ワクチン接柱群　　　　　監１１１立亘ユワクチン接種
していない対照　　２９．ＯＸ　１０’（ｎ−１７） アジュバントのみ（ｎ−５）　　　２２．５ｘ１０６８
Ｂ５ＥＩ／７ジユバンド　　　１５．１ｘｔ０６ワクチ
ン接種（ｎ−８） 実施例　４１ ひな鶏においてメロゾイトを中和する血清反応及びＥ、
　ＭＡＸＩ）Ｉ八に対する防御反応を誘発させるための
非−再生組模型（７）　Ｅｌ）ｌＥｌｔｌＡ　ＭＡＸＩ
ＭＡ　（８Ｂ　５　）波源の使用 らの実験に用いられた３個の８日５組換型の波源は、実
施例３６に記載されている方法によって組換型の細菌か
ら調製した。この蛋白質の純度と同一性は、ひな鶏に用
いる前に、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びモノクロナール抗体Ｐ
ｍｘ４７．８Ｂ５との免疫は反応性によって確認した。 波源のｖＡ製試料は、各０．２ｔｄの投与量に約１００
マイクログラムの組換型の８Ｂ５抗源と０．０４１１９
のＬＰＳが含有されるように、波源１容呈に対して、５
％＾ｒｌａｃｅｌ−Ａ　１９４％０ｒａｋｅｏ１６−Ｖ
Ｒ１１％Ｔｗｅｅｎ８０から成るオイシャヤ１，１アー
３容伍の濃度で規定方式に従って調製した。 必要な場合は、波源をＰＢＳ　（ｐＨ７，２）で希釈し
て規定方式で調製するに必要な濃度にした。ひな鶏に、
０．５ｄを２週間間隔でさらに３回同経路で同量ずつ投
与した。 蛋白質をそれぞれ投与する１日前及び最終投与の１４日
後に血清サンプルを採取するために鶏を脱血した。放血
の群と時間との関連においてプールされた２回目、３回
目及び４回目の放血で得られた血清を、実施例３３に記
載されているようにｉｎ　ｖｉｖｏのメロゾイトの中和
検定で試験した。２回目の放血でプールされた血清を熱
不活性化し、一方、３．４回目の放血で得られた血清は
熱不活性化しなかった。 下の表ＸＸＩＩに示した結果は、キャリアー及びアジュ
バントのみを投与された鶏の血清はＥ、ｍａｘｉｍａメ
ロゾイトを中和しなかったことを示している。 しかしながら、波源を投与されたいく羽かの鶏の血清は
メロゾイトを中和した。 ２回目の放血に関しては、実施例４０に記載されている
ように５Ｇ９３６／ｐ５−３組換型波源又は可溶化した
Ｅ、ｍａｘｉｍａメロゾイト蛋白質をワクチン接種した
群の血清で処理したメロゾイトを投与された鶏にだけ、
卵母細胞産生の減少が起った。 ３．４回目のワクチン接種の後に、ほかのワクチン群の
血清が卵母細胞の中和を示した。これらの群の中で、卵
母細胞の産生の減少が最も一定した群は５Ｇ９３６１５
−３であった。 ８Ｂ５１１換型抗源を投与された鶏に関するｉｎ　ｖｉ
ｖｏのＥｉｍｅｒｉａ　　ｍａｘｉｍａメロゾイト中和
検定表ＸＸｌｌ ５Ｇ　９３６／ｐ１３−８ワクチン接種　　　３１９　
　　　　　　１２　　　　　　　２８ＳＧ　９３６／ｒ
ｌ　５−３ワクチン接種　　　　３８　　　　　　　８
　　　　　　　１５ＳＧ　９３６／＋１１１−２ワクチ
ン接種　　　１１９　　　　　　　１５　　　　　　　
９４アジユバントワクチン接種　　　１００１００１０
０メロゾイトワクチン接種９　　　　０　　　　　　５
　　　　　　４対照の鶏　　　　　　　　　　　１１９
　　　　　　１０１　　　　　　５５最終ワクチン接種
の１４日後に、鶏に２０．０００個の胞子に変体させた
Ｅ、　ｍａｘｉｍａを経口投与した。糞便を、投与の５
日後と１０日後の間に収集した。各処１１！　ｎＹごと
の卵母ＩＱ＋泡の全産生量を、実施例４０に記載した方
法を用いて求めた。下記の表ＸＸＩＩＩの結果は、卵母
細胞の全産生数の減少は８Ｂ５組換型の波源をワクチン
接種した鶏に？１３！察されたことを示している。 ８Ｂ５組換型抗源のワクチン接種をした鶏のＥ、ｍａｘ
ｉｍａにもとづく胞子虫症に対する防御表ＸＸｌｌｌ ５Ｇ　９３Ｇ　／ｐ１３−８　　　　２．３±０．３３
　　　　　　６６ＳＧ　９３０　／Ｄ　５−３　　　　
２．０＋　０．１２　　　　　　５７３Ｇ　９３６　／
ｒ＋１１−２　　　　２．８±０．４２　　　　　　８
０八ａｊ、Ｃ０ｎｔｒＯＩ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ｓ、ｓ±　０．１４　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１００可溶したＥ、　ｍａＸｉｌｌｌ
ａ　　　　　　２．３±０．１５　　　　　　　　　　
６６メロゾイト蛋白質（ＳＱ） 例　　４２ ユ、　ｔｅｎｅｌｌａ及びＥ、　ｍａｘｉｍａ等の多く
のＥｉｍｅｒｉａ工種によって引き起される胞子虫症に
対して鶏を免疫化するためのワクチンは、遺伝子工学的
に処理したＥ、　ｔｅｎｃｌ　Ｉａ　Ｔ　Ａ　４胞子虫
の膜蛋白質及びモノクローナル抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５
または任意のこれに類似した組成をもつものによって同
定される元の分子Ｒが５５，０００の１・ｍａｘｉｍａ
８　Ｂ　５抗源から調製される。波源の適当なキャリア
ーは、５％　へｒｌａｃｅｌ　Ａ　、　９４％Ｄｒａｋ
ｅｏｌ　　６−　Ｖ　Ｒ、１％ＴＷｅＯｎ　−８０であ
る。 ワクチンの￥Ａ製は、波源水溶液１部と＾ｒｌａｃｅｌ
　Ａ１０ｒａｋｅｏｌ　６−　Ｖ　Ｒ３部を用いて投与
量あたり各抗原が１０から２００マイクログラムの最終
濃度に形成するごとく行なう。各投与量には、Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ　　ｍ；ｎｎｅｓｏｔａ　　ｔｐｓ等の免
疫増強剤も１０マイクログラム／投与ｍ含めることがで
きる。 ワクチンは、どのような年齢の鶏にも、またどのような
経路ににつても、たとえば筋肉内経路、投与してよい。 適切にワクチン接種した鶏は、ワクチンに含まれている
種を野外投与することによって引き起される活動の低下
や死を含む病気から守られる。 例　　４３ 胞子虫症や他の病源物質に対して鶏を免疫化するための
ワクチンは、遺伝子工学的に処理したＬｔ１３ｎ（！ｌ
ｌａ　Ｔ＾４胞子虫の膜蛋白質と鳥類のパイアル抗原、
即ち、感染性の滑液包ｎの病原ウィルス、から調製して
もよい。この組合わせの抗原の適切す”Ｆ　”＋”Ｊ　
７−ハ、５％八へｌａｃｅｌ　Ａ、　９４％Ｄｒａｋｅ
ｏｌ　　６−　Ｖ　Ｒ、１％　Ｔｗｅｃｎ　８０である
。 このワクチンの調製は、抗原水溶液１部とＡｒ１ａｃｅ
ｌ　Ａ　／　Ｄｒａｋｅｏｌ　６−　Ｖ　Ｒ３部を用い
て投与用あたり各抗原が１０から２００マイクログラム
の最終濃度に形成するごとく行なう。ワクチンは、どの
ような年齢の鶏にも又どのような経路によっても、たと
えば筋肉内経路で投与してよい、。適切にワクチン接種
した鶏は、少なくとも１個のＥｉｉｅｒｉａ抗源エピト
ー波源あるワクチンに含まれる種を野外試用投与するこ
とによって引き起される病気（活動の低下や死を含む）
から守られる。 下記の記述部分は主張所見の形で提出される好ましい形
体で１〜２４９にわたるものである。 例　　４４ Ｅ、ｔｅｒｅｌｌａ　　（ｐＣＯＣ２０＞及びＥ、ｍａ
ｘｉｍａ組換え抗原（ｐ５−３、ｐｌ４−９、又はｐｌ
　１−２）を用いてワクチン投与したトリの免疫活性を
証明するために実験を行なった。トリは次の如くグルー
プ分けした。 処理グループ　　　　　　抗　原　　　　　　抗　原　
吊Ｉ　　　　　　　　ｐｃＯｃ　２０　　　　　　　　
５０　ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓｌ［Ｄ５−３　　　　　　
　　　５０　ｉｉｃｒｏｇｒａｍｓｏｉ　　　　　　　
　ｐｌ４−９　　　　　　　　５０　ｍｔｃｒｏａｒａ
ｍｓＩＶ　　　　　　　ｐｌｌ−２５０ｍｉｃｒｏｇｒ
ａｍｓＶ　　　　　　　１）ＣＯＣ２２＆　Ｉ）５−３
　　　　　１００１１ｉｃｒ０１Ｊｒａｌｌｓ（５０１
ＲｉＣｒ（ＸｌｒａｆｆｌＳ　ｅａＣｈ）Ｖｔ　　　　
　　　　国耽０　＆　ｐｌ４−９　　　　１００　ｍｉ
ｃｒｏａｒａｍｓ（５０ａ＋ｉｃｒｏａｒａｍｓ　ｅａ
ｃｈ）Ｖｌｌ　　　　　　　　Ｄ５−３　＆　ｐｌ４−
９　　　　　　５０１１ｔＣｒ（ＸｌｒａｌｉＳ（２５
ｍｉｃｒｏｏｒａｍｓ　ｅａｃｈ）ＶＩＩＩ　　　　　
　　Ａｃｊｕｖａｎｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　　　　　　　
　−・・ＩＸ　　　　　　　Ｕｎｖａｃｃｉｎａｔｅｄ
　　　　　　　　　・・・ワクチンを例４２及び４３と
同様にして、担体と抗原の比３：１（ｖ／ｖ）で製剤化
した。 ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｌｌ１ｉｎｎｃｓｏｔａ　Ｌ
　Ｐ　Ｓを加えて終濃度８１１１ｉＣｒＯ（Ｉｒａｎｓ
／　ｄとし、全抗原濃度は、１−当り、１０　Ｑ　ｍｉ
ｃｒｏｇｒａｍ又は２００　ｍｉｃｒｏｇｒａｉとした
。 この製剤は、頭の後へ０．５１ｄ皮下投与するのに供し
た。ワクチン投与を２退会のレグホンに行ない、１０日
間の間隔で３回投与を行ない、ワクチン後、血清を採取
し凍結した。コントロールは、担体／ＬＰＳを用いた場
合を使用した。ワクチン化したニワトリ及びコントロー
ル投与のニワトリからの血清について、膜蛋白から得ら
れるＥ、　ｔｅｎｃ＋＋ａスポロシスト及びＥ、　　ｍ
ａｘｉｍａ全メロゾイト蛋白に対する免疫活性を、ウェ
スタンプロット分析及び直接蛍光抗体染色により評価し
た。 最後のワクチン投与１０日後、すべてのグループについ
て、５００　Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａ及び／又ハ１００Ｅ
、　　ｍａｘｉｍａ感染オオシストを接種し、次いて５
日後に、２回目の４０００　Ｅ、　　ｔｅｎｅｌｌａ及
び４０゜０００　Ｅ、　　ｍａｘｉｍａ感染オオシスト
の接種を行なつた。Ｅ、　　ｔｅｎｅ＋＋ａによる盲腸
の病変、Ｅ、　　ｍａｘｉｍａによる一二指腸の病変、
それぞれの病原体に対する特徴点を、２回目の接種５日
後に記録した。Ｌｔｅｎｅｌｌａ及びＥ、　　ｍａｘｉ
ｍａの粗換え抗原によりワクチン投与したトリの血清応
答を評価するため、寄生生物中和化分析を用いた。Ｅ、
　　ｍａｘｉｍａに対する活性は、例３３で記述したｉ
ｎ　　ｖｉｖｏ中和化分析を用いて評価した。得られた
結果は、表ＸＸＩＶ、　ＸＸＶ　。 ＸＸＶＩ及ヒＸＸＶＩＩ　ＩＣ！　、！：　６／）　ｔ
ｃ。 表　　ＸＸＩＶ Ｅ、　　ｎ＋ａｘｉｍａオオシスト（４０，０００）”
にさらした時の、組換えＴＡ４及び組換え８Ｂ５免疫活
性抗原でワクチン投与したトリの病変記録処理グループ
　　　　　　Ｅ、　　ｍａｘｉｍａ色ｌ呈Ｉ ＩＩ　　　　　　　　２．２　　±０．６２ＩＩＩ　　
　　　　　　２．５６±０．４２ＩＶ　　　　　　　　
２．５　　＋　０．４２ＶＩＩ　　　　　　　　２．３
９　＋　０．４２■　　　　　　　２．８　±０．２７ ＶＴＩＩ　　　　　　　　２．７５±０．３５ＩＸ　　
　　　　　　２．７５±０．３８表　　ＸＸＶ Ｅ、　　ｔｅｎｃｌｌａ　　（４，０００）及びＥ、　
　ｍａｘｉｍａオオシスト（４０，０００＞”にさらし
た時の、組換えＴＡ４及び組換８Ｂ５免疫活性抗原でワ
クチン投与したトリの病変記録 Ｖｌ　　　　　２．５６　＋　０．８２　　２．３７±
０．５０Ｖ　　　　　２．８３±０．６６　　２．２８
±０．３６ＶＩＩＩ　　　　　３．７５±０．３５　　
３．５　　＋　ＯＩＸ　　　　　２．８７　＋　０．６
３　　２．５　　＋　０．７１表　　ＸＸＶＩ Ｅ、　　ｔｅｎｅｌｌａオオシス１−（４，０００）”
にさらした時の、組換えＴＡ４及び組換８Ｂ５免疫活性
抗原でワクチン投与したトリの病変記録Ｅ、　　ｔｅｎ
ｅｌｌａ 処理グループ　　　　　病変記録 １２．５±０．８４ ＶＴＩＩ　　　　　　　　３．５＋＝　０．５ＩＸ　　
　　　　　　３．Ｏ＋　１．０８本ニトリは、ｌ　Ｑ　
Ｑ　Ｅ、　　ｍａｘｉｍａオオシスト、５００　Ｅ、　
　ｔｅｎｃｌｌａオオシストであらかじめさらした。あ
るいはまたトリを、実験４日前に、両者でさらした。 表　　ＸＸＶＩＩ 変性組換え８５５免疫活性抗原及び組換えＴＡ４抗原ワ
クチン投与したトリについての、ｉｎ　　ｖｉｖ。 Ｅ、　　ｍａｘｉｍａメロザイ１−中和化分析ＩＩ　　
　　　　６±　０．３７　　　　　　　　　　２３ＩＩ
　　　　　　１０＋：　０．３６　　　　　　　　　　
３８ＩＩＩ　　　　　　　７±　０．２６　　　　　　
　　　　　２７ＩＶ　　　　　　３０±　０．５９１１
５Ｖ　　　　　　１５＋０．７１　　　　　　　　　　
５８ｖ　　　　　　Ｏ＋：Ｏ。 ＶＩＩ　　　　　　２７＋：　　０．４１　　　　　　
　　　　１０４Ｖｌ　　　　８ｆ０．５　　　　　　　
３１１　　　２６±０．５　　　　　　１００ＶＩＩＩ
　　　　３９＋　０．６５　　　　　　１５０ＩＸ　　
　　Ｏ±００ 例４５ ｐｃＯｃ２０でワクチンＨのニワトリの体重■ ｐｃＯｃ２０　（ＴＡ４）抗原の３つの異なるＯットに
ついて、単回投与ワクチン／チャレンジ研究にて評価し
た。ブロイラーに、ＰＨＡ　（５０ｍｉｃｒｏｇｒａｍ
）とともに抗原（１００ｍｉｃｒｏｏｒａｍ）を、首の
優に皮下投与して接種した。ワクチン化は５−６日令に
ついて行なった。１４日シンリを生育し、体重をはかり
、担汁を採取し、次いで５゜ＯＯｏの胞子形成したＥ、
　　ｔｅｎｅｌｌａオオシストを接種した。接種材料は
、あらかじめ滴定し、重い病変が生じることを確認した
。チャシン２６日後、トリを育て、再び体重を測って、
２，３の１・りを殺し、病変を記録した。残りのトリに
ついて、チャレンジ後１０日日で再び体重を計った。ワ
クチン投与したトリの病変は、非ワクチン投与のトリの
それと有意差はなかった。体重増加を表ＸＸＶＩＩＩに
示した。 表　　ＸＸＶＩＨ 与したトリの体重 体重増加％Ｘ＋ｅ、ｄ。 非チャレンジ（ｎ−１９）　　　５２±５２９±８９６
±１０非ワクチン投与（ｎ−１９）　　３９±６２８±
８７８±１０アジユバント（ｎ−２０）　　　３９±６
２８±７７７±９キモシン（ｎ−１９）　　　　　４０
±８２８±７７９±１３１）ＣＯＣ２０（ｎ−１７）　
　　　　　４１±　５３２±５８６±０ｐｃＯｃ２０（
ｎ−１６）　　　　　　４３±１０３２±８Ｂ８±１５
１）ＣＯＣ２０（ｎ−１５）　　　　　　４１±６３５
±９　９０±１１ｐＤ［Ｔ（ｎ＝１３）　　　　　　　
４３±３３５±　７９３±１１１０日間チャレンジ後の
体重増加％から、ｐｃＯｃ２０でワクチン投与した場合
に、チャレンジに対する保護の程度が分かる。キモシン
／アジュバント及びアジュバントのみのグループは、非
ワクチン投与チャレンジグルートと相異はなかった。 以下に本発明の好ましい態様１〜２４７項を示す。 （１）第５図に示す核酸配列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａｔ
ｅｎＱＩＩａから誘導される、分子量約２５，０００ダ
ルトン、ジスルフィド結合で結合した２個のポリペプチ
ドから構成され、一方のポリペプチドは分子量約１７．
０００でＮ末端が鴻閉されていることを特徴として第５
図に示すアミノ酸配列を有し、他方のポリペプチドは分
子量約８，０００ダルトンで第５図に示すアミノ酸配列
を有する抗原性蛋白質をコードする単離ゲノムＤＮ△（
２）分子量約２５．０００ダルトンで第７図に示ず連続
アミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコードする
核酸分子 （３）第２項に記載のｃＤＮＡ （４）第２項に記載のｍＲＮＡ （５）分子量約２５，０００ダルトン未満で、第１項に
記載のＤＮＡによってコードされる蛋白質のアミノ酸′
Ｍ１列内に包含されるアミノ酸配列の抗原性ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ分子（６）第５項に記載のＤＮＡ
分子と他のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるＤ
ＮＡ分子（７）約２５．０００ダルトン以上の分子量を
有する抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子であ
って、第１項に記載のＤＮＡ分子および他のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ分子 （８）約２５．０００ダルトン未満の分子量を有する抗
原性ポリペプチドと、第２項に記載の核酸配列によって
コードされるポリペプチド内に包含されるアミノ酸配列
とをコードするＤＮＡ分子（９）第８項に記載のＤＮＡ
分子と他のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるＤ
ＮＡ分子（１０）約２５，０００ダルトン以上の分子ｍ
を有する抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子で
あって、第２項に記載の核酸分子と他のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡからなるＤＮＡ分子（１１）クローニ
ングビークルＤＮＡと第３項記載のｃＤＮＡからなり、
クローニングビークルＤＮＡには第１および第２の制限
酵素部位が存在し、ｃＤＮＡはこの部位にクローン化さ
れる組換えクローニングビークル （１２）第１１項記載のクローニングビークルをもつ細
菌宿主細胞 （１３）名称ＪＭ８３／ｐＴｃＤ２６．ＡＴＣＣ登録番
号第５３３１５号である第１２項記載の大腸菌宿主細胞 （１４）適当なキャリアーＤＮＡおよび第１項記載のゲ
ノムＤＮＡからなり、適当な宿主細胞中に導入すると２
５，０００ダルトン抗原性蛋白質を発現できる発現ベク
ター （１５）適当なキアリアーＤＮＡおよび第５項記載のＤ
ＮＡからなり、適当な宿主細胞中に導入すると、分子量
約２５．０００未満の抗原性ポリペプチドを発現できる
発現ベクター （１６）適当な宿主細胞に導入すると、適当なキャリア
ーＤＮＡおよび第６項記載のＤＮＡからなる抗原性ポリ
ペプチドを発現できる発現ベクター（１１）適当な宿主
細胞に導入すると、適当なキャリアーＤＮＡと第７項記
載のＤＮＡからなる分子量２５．０００ダルトン以上の
抗原性ポリペプチドを発現できる発現ベクター （１８）プラスミドＤＮＡと第３項記載のｃＤＮＡから
なり、適当な細菌性宿主細胞に導入すると分子ｆａ２５
，０００ダルトンの抗原性ポリペプチドを発現できる細
菌性発現ベクター （１９）　　ｐＤ　Ｅ　Ｔ　１と命名された第１８項記
載のベクター （２０）　　ｐＤ　Ｔ　Ｅ　２と命名された第１８項記
載のベクター （２１）プラスミドＤＮＡは、５′から３′の順序に、 プロモーターまたはプロモーターとオペレーターのいず
れかを含むＤＮＡ配列、 所望の遺伝子のｍＲＮＡを宿主細胞内のリポソームに結
合できるようにするリポソーム結合部位を含むＤＮＡ配
列、 ＡＴＧ　　開始コドン、 所望の遺伝子をＡＴＧ開始コドンと同相に挿入できる制
限酵素部位、 宿主細胞内で自動Ｗｉ製できる、細菌プラスミドからの
複製オリジンを含むＤＮＡ配列、ベクターが宿主細胞内
にあると表現される、選択または同定可能な表現型特性
を伴う遺伝子を含むＤＮＡ配列、 を包含する二本鎖ＤＮＡからなる第１８項記載のベクタ
ー （２２）適当な細菌宿主細胞内に導入すると分子量約２
５．０００ダルトン未満の抗原性ポリペプチドを発現で
きる、プラスミドＤＮＡと第８項記載のＤＮＡからなる
細菌性発現ベクター （２３）適当な細菌宿主細胞内に導入すると抗原性ポリ
ペプチドを発現できる、プラスミドＤＮＡと第９項記載
のＤＮＡからなる細菌性発現ベクター（２４）適当な宿
主１Ｂｒａ内に導入すると、２５．ＯＯＯダルトンのポ
リペプチドが他のアミノ酸配列に融合した融合ポリペプ
チドを発現できる、プラスミドＤＮＡと第１０項記載の
ＤＮＡからなる細菌性発現ベクター （２５）他のアミノ酸配列をコードするＤＮＡはβ−ガ
ラクトシダーゼをコードし、融合ポリペプチドの分子量
は約１３５．０００ダルトンである第２４項記載のベク
ター （２６）　　ｐＢ　Ｇ　Ｃ２３と命名された第２５項記
載のベクター （２７）他のアミノ酸配列をコードするＤＮＡはプロキ
モシンをコードし、融合ポリペプチドの分子量は約６５
．６００ダルトンである第２４項記載のベクター （２８）　　ｐＣＯＣ１２と命名された第２７項記載の
ベクター （２９）他のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、５ｐ
ｈＩ消化によって修飾され、その結果２４９ｂｐの欠失
を生じたプロキモシンをコードし、融合ポリペプチドの
分子量は約５６．５００ダルトンである第２４項記載の
ベクター （３０）　　ｐＣＯＣ２０と命名された第２９項記載の
ベクター （３１）第１４項記載の発現ベクターを含む宿主細胞 （３２）第１８項記載の発現ベクターを含む宿主細胞 （３３）第３２項記載の大腸菌宿主細胞（３４）　　ベ
クターｐＢＧｃ２３を含有し、ＡＴＣＣ登録番号５３３
１７号の、ＲＥＮ３／ｐＢＧｃ２３大腸菌宿主細胞 （３５）’　　ベクター１）ＣＯＣｌ　２を含有し、Ａ
ＴＣＣ登録番号５３３１４号の、ＲＥＮ３／ｐｃＯｃ１
２大腸菌宿主細胞 （３６）ベクターｐｃＯｃ２０を含有し、ＡＴＣＣ登録
番Ｑ５３３１３＠（７）、ＲＥＮ３／ｐＣＯｃ２０大腸
菌宿主細胞 （３７）ベクターｐＤＥＴ１を含有し、ＡＴＣＣ登録番
号５３３’１６号の、ＲＥＮ３／ＤＤＥＴｌ大腸菌宿主
細胞 （３８）ベクターｐＤＥＴ２を含有し、ＡＴＣＣ登録番
号５３３１８号の、ＲＥＮ３／ｐＤＥＴ２大腸菌宿主ｔ
ＩＡ胞 （３９）分子量約２５．０００ダルトンで、第７図に示
すアミノ酸配列を有する抗原性蛋白質（４０）分子量約
２５，０００ダルトン未満で、第７図のアミノ酸配列内
に含有されるアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチド （４１）第７図に示すアミノ酸配列からなり、その配列
のアミノ末端に付加的アミノ酸を有する抗原性ポリペプ
チド （４２）第７図に示すアミノ酸配列内に包含されるアミ
ノ酸配列と付加的アミノ酸からなる抗原性ポリペプチド （４３）分子量約１３５，０００ダルトンで、第７図に
示すアミノ酸配列からなり、その配列のアミノ末端にβ
−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を有する抗原性ポリ
ペプチド （４４）分子量約６５．６００ダルトンで、第７図に示
すアミノ酸配列からなり、その配列のアミノ末端にプロ
キモシンのアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチド （４５）分子量約５６，５００ダルトンで、第７図に示
すアミノ酸配列からなり、その配列のアミノ末端に、プ
ロキモシンの天然配列から８３個のアミノ酸を欠失させ
たアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチド （４６）第３４項から第３８項までに記載のいずれかの
宿主細胞をＤＮＡ発現およびポリペプチド産生を可能に
する適当な条件下に生育させ、生成したポリペプチドを
適当な条件下に回収する抗原性ポリペプチドの製造方法 （４７）回収は、 ａ）宿主ＩＩＩｖｉからのポリペプチドの分離、ｂ）ポ
リペプチドの精製、 Ｃ）ポリペプチドの可溶化、 ｄ）ポリペプチドの再生、および ｅ）精製、可溶化、再生された抗原性ポリペプチドの回
収 の各工程からなる第４６項記載の方法 （４８）第３９項から第４５項までのいずれかに記載の
ポリペプチドの免疫感作有効量を鶏に投与する、Ｅｉｍ
ｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能動免疫を鶏に
付与する方法 （４９）第３９項から第４５項までのいずれかに記載の
ポリペプチド２種またはそれ以上の免疫感作有効量を鶏
に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅ＋＋ａ感染に対
する能動免疫を鶏に付与する方法 （５０）免疫感作有効量は約０．１μ３〜約１．０ηで
ある第４８項記載の方法 （５１）免疫感作有効量は約０．１μ３〜約１．０ｍｇ
である第４９項記載の方法 （５２）第３９項から第・４５項までに記載のポリペプ
チドの１種の免疫感作有効量と医薬的に許容される担体
を１用伍とした、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ感染
に対する能動免疫を鶏に付与するワクチン（５３）第３
９項から第４５項までに記載のポリペプチドの２種また
はそれ以上の免疫感作有効量と医薬的に許容される担体
を１用量とした、Ｅｉｌｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ感染
に対する能動免疫を鶏に付与するワクチン （５４）第４３項に記載の抗原性ポリペプチドの免疫感
作有効量と医薬的に許容される担体からなる、Ｅｉａ＋
ｅｒｉａ　ｔｅｎｅ＋＋ａ感染に対する能動免疫を鶏に
付与するワクチン （５５）第４４項に記載の抗原性ポリペプチドの免疫感
作有効ｍと医薬的に許容される担体からなる、Ｅｉｍｅ
ｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能動免疫を鶏に付
与するワクチン （５Ｇ）免疫感作有効量は、鶏の体重Ｉ　Ｋｇあたり約
０．１η９以上とする第５２項記載のワクチン（５７）
免疫感作有効量は、鶏の体重１　Ｋｇあたり約０．１η
９以上とする第２３項記載のワクチン（５８）第５２項
記載のワクチンの適当用ａを鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒ
ｉａ　ｔｅｎｅｌｌａの感染に対する防御方法 （５９）第５３項に記載のワクチンの適当用ｍを鶏ニ１
９与する、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｏｌｌａの感染に対
する防御方法 （６０）第５４項に記載のワクチンの適当用倒を鶏に投
与する、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｆ３ｎｅｌｌａの感染に対
する防御方法 （６１）第５５項に記載のワクチンの適当用値を鶏に投
与する、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａの感染に対す
る防御方法 （６２）　　投与は慣用の任意の形の経口投与である第
５８項記載の方法 （６３）投与は注射によって行われ、ポリペプチドは医
薬的に許容される担体中に加える、第５８項記載の方法 （６４）分子量約２６．０（ＬＯダ／ｌｚトンで、ジス
ルフィド結合で結合した２個のポリペプチドから構成さ
れ、一方のポリペプチドは分子量約１８，０００、Ｎ末
端が遮閉されていることを特徴とし、他方のポリペプチ
ドは分子量約ｓ、ｏｏｏであり、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅ
ＣａｔｒｉＸまたはＥｉｌｌｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ
の感染に対する防’ａｎｍ構を付与する免疫応答を鶏に
誘導できる、精製、抗原性蛋白質 （６５）　　（ａ）　　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒ
ｉｘのスポロシストを、適当な非還元条件下、プロテア
ーゼ阻害剤の存在下に界面活性剤と接触させて、スポロ
シスト膜蛋白質を可溶化し、０　可溶化されたスポロシ
スト膜蛋白質から適当な非還元性条件下に蛋白質を分離
回収する、第６４項記載の蛋白質の製造方法（６６）分
離回収は、非還元性条件下にお【ノるＤＥＡＥ　−１−
Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃついでブレバラ°テイブＳＤＳゲル電気
泳動による、可溶化されたスポロシスト膜蛋白質の部分
精製からなる第６５項記載の方法（６７）分離回収は、
モノクローナル抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４　（ΔＴＣＣ
Ｎｏ、ＨＢ８５６１）による免疫沈殿または免疫アフィ
ニティークロマトグラフィーによって行われる第６５項
記載の方法 （６８）　　＠　　ＥｉＩ！１ｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒ
ｉｘのスポロシストをプロテアーゼ阻害剤の存在下適当
な条件で界面活性剤と接触させて、スポロシストの膜蛋
白質を可溶化し、υ　可溶化したスポロシストの膜蛋白
質から適当な条件下にポリペプチドを分離回収する、第
６４項記載のｉｓ、ｏｏｏダルトンポリペプチド成分の
製造方法 （６９）分離回収は、可溶化したスポロシストの膜蛋白
質を適当な還元性条件下に、ＤＥＡＥ−ＨＰ　Ｌ　Ｃ上
りＯマドグラフィー、ついでプレパラテイブＳＤＳゲル
電気泳肋により部分精製することからなる第６８項記載
の方法 （７０）第６４項記載の蛋白質を製造するにあたり、そ
の蛋白質をコードするＤＮＡ分子を製造し、このＤＮＡ
分子を適当な発現ベクターに挿入し、得られた発現ベク
ターをＤＮＡの発現および蛋白質の産生を可能にする適
当な条件下に適当な宿主中に導入し、生成した蛋白質を
回収する方法（７１）第６４項記載のｉｓ、ｏｏｏダル
トンポリペプチド成分を製造するにあたり、そのポリペ
プチドをコードするＤＮＡ分子を製造し、このＤＮＡ分
子を適当な発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクタ
ーをＤＮＡの発現およびポリペプチドの産生を可能にす
る適当な条件下に適当な宿主中に導入し、生成したポリ
ペプチドを回収する方法。 （７２）第６４項記載の蛋白質の免疫感作有効量を鶏に
投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉＸの感染に
対する能動免疫を鶏に付与する方法 （７３）第６４項記載の蛋白質の免疫感作有効量を鶏に
投与する、Ｅｉｌｅｒｉａ　ｔｅｎＱｌｌａの感染に対
する能動免疫を鶏に付与する方法 （７４）第６４項記載のポリペプチドの免疫感作有効量
を鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｃｃａｔｒｉｘお
よびＥｉｎ＋ｃｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａの感染に対する
能動免疫を鶏に付与する方法 （７５）免疫感作有効量は約０．１μ９〜約１．０■で
ある第７２項記載の方法 （７６）・　免疫感作有効ａは約０．１μ９〜約１．０
ηである第７３ｒＫ！４記載の方法 （７７）免疫感作有効量は約０．１μ９〜約１．０ｍぴ
である第７４項記載の方法 （７８）第６４項記載の蛋白質の免疫感作有効量と医薬
的に許容される担体を１用伍としたＥｉｍｒｉａｎｅｃ
ａｔｒｉｘの感染に対する能動免疫を鶏に付与するワク
チン （７９）第６４項記載の蛋白質の免疫感作有効量と医薬
的に許容される担体を１用伍としたＥｉｍｅｒｉａｔｆ
３ｎｅｌｌａの感染に対する能動免疫を鶏に付与するワ
クチン （８０）第６４項記載のポリペプチドの免疫感作有効量
と医薬的に許容される担体を１用けとしたＥｔｍｅｒｉ
ａ　ｎｅｃａｔｒｉＸまたはＥｉｍｅｒｉｃａ　ｔｅｎ
ｅｌｌａの感染に対する能動免疫を鶏に付与するワクチ
ン（８１）免疫感作有効量は、鶏の体重１　Ｋｇあたり
約０．１μ３である第７８項記載のワクチン（８２）免
疫感作有効量は、鶏の体ｆｆｌ　１　Ｋｇあたり約０．
１μ９である第７９項記載のワクチン（８３）免疫感作
有効量は、鶏の体重１　Ｋｇあたり約０．１μびである
第８０項記載のワクチン（８４）第７８項記載のワクチ
ン適当用量を鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ’　ｎｅｃ
ａｔｒｉｘの感染から鶏を予防する方法 （８５）第７９項記載のワクチン適当用ｍを鶏に投与す
る、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎＮＩ８の感染から鶏を予防
する方法 （８６）第８０項記載のワクチン適当用昂を鶏に投与す
る、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉＸおよびＥｉｍｅ
ｒｉａｔｅｎｃｌｌａの感染から鶏を予防する方法（８
７）第６４項記載の蛋白質の少なくとも部分をコードす
る核酸分子 （８Ｂ）第８７項記載の単離ゲノムＤＮＡ（８９）第１
７図に示した核酸配列の少なくとも部分である第８７項
記載の核酸分子 （９０）他のアミノ酸配列をコードする核酸配列を包含
する第８９項記載の核酸分子 （９１）第８７項記載のｃＤＮＡ分子 （９２）第８７項記載のｍＲＮＡ分子 （９３）クローニングベクターＤＮＡおよび第９１項記
載のｃＤＮＡからなり、クローニングベクターＤＮＡは
第１および第２の制限酵素部位が存在し、ｃＤＮＡはこ
の部位にクローン化された組換えクローニングベクター （９４）クローニングベクターＤＮＡはプラスミドＤＮ
Ａからなる第９３項記載の組換えクローニングベクター （９５）第９３項記載のクローニゲベクターを含有する
宿主細胞 （９Ｇ）第９５項記載の細菌宿主 （９７）プラスミドｌ）ＳＭＡＣからなる第９４項記載
の組換えクローニングベクター （９８）第９７項記載のクローニンベクターを含有する
細菌宿主細胞 （９９）名称ＪＭ８３／ｐＳＭＡＣ，ＡＴＣＣ登録番号
６７　２４１号である第９８項記載の大腸菌宿主細胞 （１００）　　プラスミドｐｓｓ３３からなる第９４項
記載の組換えクローニングベクター （１０１）　　第１００項記載のクローニングベクター
を含有する細菌宿主細胞 （１０２）　　名称ＪＭ８３／ｐＳＳ３３、ＡＴＣＣ登
録番号６７　２４２号である第１０１項記載の大腸菌宿
主１１Ｉ胞 （１０３）　　プラスミドｐＮＣＤからなる第９４項記
載の組換えクローニングベクター （１０４）　　第１０３項記載のクローニングベクター
を含有する細菌宿主ｍ胞 （１０５）　　名称ＪＭ８３／１）ＮＣＤＳＡＴＣＣ登
録番号６７　２６６号である第１０４項記載の大腸菌宿
主細胞 （１０６）　　クローニングベクターＤＮＡと第９０項
記載のＦＩＡＢ配列からなり、クローニングベクターＤ
ＮＡは第１および第２の制限酵素部位を有し、第９０項
記載の核酸配列はこの部位にクローン化された組換え発
現ベクター （１０７）　　適当な宿主細胞に導入すると、融合ポリ
ペプチドを発現できる第１０６項記載の組換え発現ベク
ター （ｉｏａ）　　名称はｐＴＤｓｌである第１０７項記載
の組換え発現ベクター （１０９）第１０８項記載の発現ベクターを含有する細
菌宿主細胞 （１１０）　　名称ＭＨＩ／ｐＴＤＳ１、ＡＴＣＣ登録
番号６７　２４０号である第１０９項記載の大腸菌宿主
細胞 （１１１）　　名称はｐＴＤＳ２である第１０７項記載
の組換え発現ベクター （１１２）　　第１１１項記載の発現ベクターを含有す
る細菌宿主細胞 （１１３）　　名称Ｍ　ｌ−１１／　ｌ）　Ｔ　Ｄ　Ｓ
　２、ＡＴＣＣ登録番号６７　２６４号である第１１２
項記載の大腸菌宿主細胞 （１１４）　　名称はｐＤＤｓ２である第１０７項記載
の組換え発現ベクター （１１５）　　第１１４項記載の発現ベクターを含有す
る細菌宿主ａ胞 （１１６）　　名称ＪＭ８３／ｐＤＤＳ２、ＡＴＣＣ登
録番号６７　２６５Ｎである第１１５項記載の大腸菌宿
主細胞 （１１７）　　名称はｐＤＤｓｌである第１０７項記載
の組換え発現ベクター （１１８）　　第１１７項記載の発現ベクターを含有す
る細菌宿主細胞 （１１９）　　名称ＭＨ１／ｐＤＤｓ１、ＡＴＣＣ登録
番号６７　２４３Ｎである第１１８項記載の大腸菌宿主
細胞 （１２０）　　第９５項記載の宿主細胞を蛋白質の産生
を可能にする適当な条件下に生育させ、生成した蛋白質
を回収する、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅＣａｔｒｉＸおよび
［１１１１Ｏｒｉａ　ｔｅｎｃｌｌａの感染に対する防
御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる蛋白質の製
造方法（１２１）　　はぼ同一の配列を有するが細菌宿
主内での発現のために異なる第６４項記載の蛋白質（１
２２）　　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘから全ゲ
ノムＤＮＡを単離し、単離したゲノムＤＮＡからＤＮＡ
フラグメントを調製し、得られたフラグメントを適当な
クローニングベクターにリゲートし、生成したクローン
のＤＮＡを第１７図に示した核酸配列内に存在する核酸
配列を含むかまたはそれと相補性のオリゴヌクレオチド
とハイブリダイゼーションさせて適当なクローンを同定
し、ついで、適当なクローンから第１７図に示した核酸
配列を有し、蛋白質をコードするＤＮＡを単離する、第
８９項記載のＤＮＡを得る方法 （１２３）　　分子量約２６．０００未満で、第６４項
記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるアミノ酸配
列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘおよびド （１２４）　　分子量約２６．０００以上で、第６４項
記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるアミノ酸配
列と付加的アミノ酸配列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅ
ｃａｔｒｉＸおよびＥｉｎ＋ｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ
の感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発
できる抗原性ポリペプチド （１２５）　　第６４項記載の蛋白質の類縁体である抗
原性ポリペプチド （１２６）　　第１２３項記載のポリペプチドの類縁体
である抗原性ポリペプチド （１２７）　　第１２４項記載のポリペプチドの類縁体
である抗原性ポリペプチド （１２８）　　第６４項記載の蛋白質のｉｓ、ｏｏｏダ
ルトンポリペプチド成分のアミノ酸配列を有し、分子量
は１８，０００ダルトンであって、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎ
ｅＣａｔｒｉＸおよびＥｉｍｅｒｔａ　ｔｅｎｅｌｌａ
の感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発
できる抗原性ポリペプチド （１２９）　　第６４項記載の蛋白質のｓ、ｏｏｏダル
トンポリペプチド成分のアミノ酸配列を有し、分子量は
、８．０００ダルトンであって、Ｅｉｍｒｉａｎｅｃａ
ｔｒｉｘおよびＥｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎＮｌａの感染に
対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる抗
原性ポリペプチド （１３０）　　分子量約１８．０００ダルトン未満で、
第１２８項記載のポリペプナトガアミノ酸配列内に包含
されるアミノ酸配列と付加的アミノ酸配列を有し、Ｅｉ
ｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉＸおよびＥｉｍｅｒｉａｔ
ｅｎｅｌｌａ感染に対する防御機構を付与する免疫応答
を鶏に誘発できる抗原性ポリペプチド（１３１）　　分
子１約１８．０００ダルトン以上で、第１２８項記載の
ポリペプチドのアミノ酸配列と付加的アミノ酸配列を有
し、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒ＋ｘおよびＥｉｍｅ
ｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する防御機構を付与す
る免疫応答を鶏に誘発できる抗原性ポリペプチド （１３２）　　第１２８項記載のポリペプチドの類縁体
である抗原性ポリペプチド （１３３）　　第１３０項記載のポリペプチドの類縁体
である抗原性ポリペプチド （１３４）　　第１３１項記載のポリペプチドの類縁体
である抗原性ポリペプチド （１３５）　　分子予約８．０００未満で、第１２９項
記載のポリペプチドのアミノ酸配列内に包含されるアミ
ノ酸配列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅＣａｔｒｉＸお
よびＥｉｎ＋ｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する防
御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる抗原性ポリ
ペプチド（１３６）　　分子量約８．０００以上で、第
１２９項記載のポリペプチドのアミノ酸配列と付加的ア
ミノ酸配列を有し、Ｅｉｌｌｌｅｒｉａ　ｎｅＣａｔｒ
ｉＸおよびＥｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ感染に対す
る防ｔＩ１ｍ横を付与する免疫応答を鶏に誘発できる抗
原性ポリペプチド（１３７）　　第１２９項記載のポリ
ペプチドの類縁体である抗原性ポリペプチド （１３８）　　第１３５項記載のポリペプチドの類縁体
である抗原性ポリペプチド （１３９）　　第１３６項記載のポリペプチドの類縁体
である抗原性ポリペプチド （１４０）　　第１２３．１２４．１２８〜１３１．１
３５または１３６項記載の任意の１種のポリペプチドの
免疫感作有効量と医薬的に許容される担体を１川■とし
てＥｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥｉｍｅｒ
ｉａ　ｔｃｎｅｌｌａ感染に対する能動免疫を鶏に付与
するワクチン （１４１）　　第１２３，１２４，１２８〜１３１，１
３５または１３６項記載のポリペプチド２種または３種
以上の免疫感作有効量と医薬的に許容される担体を１用
最としたＥｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥｉ
ｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能動免疫を鶏
に付与するワクチン （１４２）　　免疫感作有効■は鶏の体重１　Ｋｇあた
り約０．１Ｂ３以上である第１４０項記載のワクチン（
１４３）　　免疫感作有効量は、鶏の体重１　Ｋｇあた
り約０．１Ｂ３以上である第１４１項記載のワクチン （１４４）　　第１４０項記載のワクチンの適当ｍｍを
鶏に１９与する、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｔｘお
よびｌＥｉｍｅｒｉａｔｃｎｅｌｌａ感染から鶏を予防
する方法（１４５）　　第１４１項記載のワクチンの適
当用Ｒを鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒ
ｉＸおよびＥｉｍｅｒｉａｔｅｎｅ＋＋ａ感染から鶏を
予防する方法（１４６）　　第６４項記載の蛋白質に対
するモノクローナル抗体 （１４７）　　第１４６項記載のモノクロナール抗体に
対する抗−イディオタイプ抗体 （１４８）　　分子量は約５５．０００ダルトンで、Ｅ
ｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ感染に対する防ｔｉｎ構を
付与する免疫応答を鶏に誘発できる精製抗原性蛋白質（
１４９）　　分子量約５５，０００ダルトン未満で、第
１４８項記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるア
ミノ酸配列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ感染
に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる
抗原性ポリペプチド （１５０）　　第１４９項記載の抗原性ポリペプチドか
らなる、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉＩｌａ感染に対する
防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる抗原（１
５１）　　第１４８項記載の蛋白質を製造するにあたり
、（＠）　　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａのメロゾイ
トをプロテアーゼ阻害剤の存在下、適当な非還元性条件
で、界面活性剤と接触させて、メロゾイトの膜蛋白質を
可溶化し、（ハ）　可溶化されたメロゾイトの膜蛋白質
から適当な非還元性条件下に蛋白質を分離回収する方法 （１５２）　　分離回収は、イオン交換クロマトグラフ
ィーによる可溶化メロシイｌ−１ｆ！ｉｌ蛋白質の部分
Ｍ製からなる第１５１項記載の方法 （１５３）　　分離回収は、モノクロナール抗体Ｐｍｘ
４７．８Ｂ５による免疫沈殿または免疫アフィニティー
クロマ１−グラフィーからなる第１５１４記級の方法 （１５４）　　第１４８項記載の蛋白質を製造するにあ
たり、その蛋白質をコードするＤＮＡ分子を製造し、そ
のＤＮＡ分子を適当な発現ベクターに挿入し、得られた
発現ベクターをＤＮＡの発現および蛋白質の産生を可能
にする適当な条件下に適当な宿主に導入し、生成した蛋
白質を回収する方法（１５５）　　第１４９項記載のポ
リペプチドを製造するにあたり、そのポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ分子と製造し、そのＤＮＡ分子を適当な
発現ベクターに挿入し、１すられた発現ベクターをＤＮ
Ａの発現およびポリペプチドの産生を可能にする適当な
条件下に適当な宿主に導入し、生成したポリペプチドを
回収する方法 （１５６）　　第１４８項記載の蛋白質の免疫感作有効
量を鶏に投与するＥｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ感染に
対する能動免疫を鶏に付与する方法 （１５７）　　第１４９項記載のポリペプチドの免疫感
作有効量を鶏に投与するＥｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ
感染に対する能動免疫を鶏に付与する方法 （１５８）　　第１５０項記載のポリペプチドの免疫感
作有効量を鶏に投与するＥｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ
感染に対する能動免疫を鶏に付与する方法 （１５９）　　免疫感作有効量は約０．１μ９〜約１．
０ｆｆｉ４Ｆである第１５６項記載の方法（１６０）　
　第１４８項記載の蛋白質の免疫感作有効量と医薬的に
許容される担体を１用■とじた、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａ
ｘｉｍａ感染に対する能動免疫ヲ鶏ニ付与するワクチン （ＩＧＩ）　　第１４９項記載のポリペプチドの免疫感
作有効量と医薬的に許容される担体を１用安とした、Ｅ
ｉｍｅｒｉａｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫を鶏に
付与するワクチン （１６２）　　第１５０項記載のポリペプチドの免疫感
作有効量と医薬的に許容される担体を１用」ｄとした、
Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫を
鶏に付与するワクチン （１６３）　　７疫感作有効ｍは鶏の体重１　Ｋｇあた
り約０．１μびである第１６０項記載のワクチン（１６
４３免疫感作有効量は鶏の体重Ｉ　Ｋｇあたり約０．１
μ７である第１６１項記載のワクチン（１６５）　　第
１６１項記載のワクチン適当用量を鶏に投与する、Ｅｉ
ｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ感染から鶏を予防する方法 （１ｆ３Ｇ）　　第１４８項記載の蛋白質に対するモノ
クロナール抗体 （１６７）　　第１４９項記載のポリペプチドに対する
モノクロナール抗体 （１６８）　　ハイブリドーマ細胞系Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ
。 ＨＢ８９４６によって産生されるモノクロナール抗体Ｐ
ｍｘ４７．８Ｂ５ （１６９）　　第１６６．１６７または１６８項記載の
抗体の予防有効層を鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａｍａ
ｘｉｍａ感染に対する受動免疫を付与する方法（１７０
）　　第１６６．１６７または１６８項記載のモノクロ
ナール抗体の予防有効層と医薬的に許容される担体から
なるＥｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ感染に対する受動免
疫を鶏に付与するための組成物（１７１）　　第１７０
項記載の組成物の適当用量を鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒ
ｉａ　ｍａｘｉｍａ感染に対する受動免疫を鶏に付与す
る方法 （１７２）　　第１６８項記載のモノクロナール抗体に
対する抗−イディオタイプ抗体 （１７３）　　（ａ）　　Ａイブリドーマ細胞系（ＡＴ
ＣＣＮｏ、ＨＢ　　８９４６）からモノクロナール抗体
Ｐｍｘ４７．８Ｂ５を回収し、υ　モノクロナール抗体
を精製し、（へ）　精製モノクロナール抗体を適当なア
ジュバントとともに適当な動物に注射し、鋳　注射した
動物から血清を採取し、（ｅ）　　その血清から抗−イ
ディオタイプ抗体を回収する、第１７２項記載の抗−イ
ディオタイプ抗体の１！造方法（１７４）　　第１７２
項記載の抗−イディオタイプ抗体の免疫感作有効量を鶏
に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａｍａｘｉｍａ感染に対する
能動免疫を鶏に付与する方法 （１７５）　　第１７２項記載の抗イデイオタイプ抗体
の免疫感作有効量と医薬的に許容される担体からなる、
Ｅｉｉｅｒｉａ　ｍａｘｉａ＋ａ感染に対する能動免疫
を鶏に付与するためのワクチン （１７６）　　第１７５項記載のワクチンの適当用量を
鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉａ＋ａ感染か
ら鶏を予防する方法 （１７７）　　モノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５
によって認識されるエピドープからなる蛋白質をコード
する核酸分子 （１７８）　　他のアミノ酸配列をコードする核酸配列
を包含する第１７７項記載の核酸分子 （１７９）　　第１７７項記載のｃＤＮＡ分子（１８０
）　　第１７７項記載のｍＲＮＡ分子（１８１）　　第
１４９項または第１５０項のいずれかに記載のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ分子（１８２）　　第１７７項
記載の核酸分子を含有するクローニングベクター （１８３）　　第１８２項記載のりＯ−ニングベクター
を含有する宿主細胞 （１８４）　　Ｉ菌宿主である第１８３項記載の宿主細
胞 （１８５）　　クローニングベクターＤＮＡと第１７７
項記載の核酸配列からなり、クローニングベクターＤＮ
Ａには第１および第２のｔ、ＩＩ限酵素部位が存在し、
第１７７項記載のＰＡ酸配列はその部位にクローン化さ
れた組換え発現ベクター （１８６）　　適当な宿主内に導入すると、融合ポリペ
プチドを発現できる第１８５項記載の組換え発現ベクタ
ー （１８７）　　名称がｐ５−３である第１８６項記載の
組換え発現ベクター （１８Ｂ）　　第１８７項記載の発現ベクターを含有す
る細菌宿主ｉｌｌ胞 （１８９）　　名称が５Ｇ９３６１０５−３であり、Ａ
ＴＣＣ登録番号が６７　２５３号である第１８Ｂ項記載
の大腸菌宿主細胞 （１９０）　　名称がｃｌｌ−２である第１８６項記載
の粗換え発現ベクター （１９１）　　第１９０項記載の発現ベクターを含有す
る細菌宿主細胞 （Ｈ）２）　　名称が５Ｇ９３６／ｐ１１−２、ＡＴＣ
Ｃ登録番号が６７　２５１号である第１９１項記載の大
腸菌宿主細胞 （１９３）　　名称がｐ１３−８である第１８６項記載
の組換え発現ベクター （１９４）　　第１９３項記載の発現ベクターを含有す
る細菌宿主細胞 （１９５）　　名称が５Ｇ９３６／Ｄ１３−８、ＡＴＣ
Ｃ登録番号が６７　２５２号である第１９４項記載の大
腸菌宿主細胞 （１９（ｉ）　　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ感染に
対する防ａｍ横を付与する免疫応答を鶏に誘発できる抗
原性蛋白質を製造するにあたり、第１８３項記載の宿主
細胞を上記蛋白質の産生を可能にする適当な条件下に生
育させ、生成した蛋白質を回収する方法（１９７）　　
はぼ同一の配列を有するが、細菌宿主内での発現のため
に異なる第１４８項記載の蛋白質（１９８）　　第１７
７項記載のＤＮＡを１１するにあたり、Ｅｉｍｅｒｉａ
　ｍａｘｉｍａの卵母細胞から全ゲノムＤＮＡを単離し
、単離されたゲノムＤＮＡからＤＮＡフラグメントを製
造し、得られたフラグメントを存在する核酸配列を含有
するかまたはそれと相補性を示すオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイぜ−ションによってリゲートして適当なク
ローンを同定し、適当なクローンから蛋白質をコードす
るＤＮＡを単離する方法 （１９９）　　分子量５５，０００ダル１−ン以上で、
第１４８項記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含される
アミノ酸配列と付加的アミノ酸を有し、Ｅｉｌｅｒｉａ
　ｍａｘｉｉａ感染に対する防ａｍ構を付与する免疫応
答を鶏に誘発できる抗原性ポリペプチド（２００）　　
付加的アミノ酸配列はβ−ガラクトシダーピのアミノ酸
配列からなる第１９９項記載のポリペプチド （２０１）　　第１９９項記載のポリペプチドをコード
するＤＮＡ分子 （２０２）　　第２０１項記載のＤＮＡを含有するクロ
ーニングベクター （２０３）　　第１９９項記載のポリペプチドの免疫感
作有効遣を鶏に投与するＥｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ
感染に対する能動免疫を鶏に付与する方法 （２０４）　　第１９９項記載のポリペプチドの免疫感
作右効洛と医薬的に許容される担体からなるＥｉｍｅｒ
ｉａ　ｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫を鶏に付与す
るワクチン （２０５）　　ワクチン投与動物にＥｉｉｅｒｉａ抗原
に対する抗体の産生を誘発するのに有効な凶のＥｉｍｅ
ｒｉａ抗原またはエピドープの混合物と医薬的に許容さ
れる担体を１用ｍとした、Ｅｉｍｅｒｉａによって惹起
される疾患に対する多成分ワクチン （２０６）　　疾患はコクシジウム症である第２０５項
記載のワクチン （２０７）　　ｆＪ＋物は鶏である第２０５項記載のワ
クチン （２０８）　　Ｅｉｍｅｒｉａ抗原はＥ、ｔａｎｅｌｌ
ａ　、　Ｅ、ｍａｘｉｍａ。 Ｅ、ｎｅＣａｔｒｉＸまたは他のＥｉｌｅｒｉａ種の抗
原である第２０５項記載のワクチン （２０９）　　Ｅｉｍｅｒｉａ抗原は、Ｅｉｍｅｒｉａ
　エピドープ少なくとも１個を含有し、遺伝子操作によ
る抗原性融合ポリペプチド１種または２種以上からなる
第２０５項記載のワクチン （２１０）　　１用伍あたりの各抗原の量は約１０μり
から約２００μびである第２０５項記載のワクチン （２１１）　　医薬的に許容される担体は、約５％のＡ
ｒ１ａｃｅｌ　　Ａ、約９４％のＤｒａｋｅｏｌ　６−
　Ｖ　Ｒおよび約１％のＴｗｅｅｎ　−８０からなる第
２０５項記載のワクチン （２１２）　　医薬的に許容される担体は、約１部の抗
原水溶液と、約５％のＡｒ１ａｃｃｌ＾、約９４％のＤ
ｒａｋｅｏｌ　＆−ＶＲおよび約１％のＴｗａｅｎ　８
０を含む溶液約３部からなる第２０５項記載のワクチン
（２１３）　　医薬的に許容される担体は免疫増強剤を
含有する第２０５項記載のワクチン （２１４）　　免疫増強剤はＳａｌｍｏｎｅｌｌ　　ｍ
１ｎｎａｓｏｔａＬＰＳである第２１１項記載のワクチ
ン（２１５）　　医薬的に許容される但体は１用酒あた
りＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｃｓｏｔａ　ＬＰＳ
、　　１０　μ’Ｊを含有する第２１１項記載のワクチ
ン （２１６）　　ワクチン混合物はＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌ
ａ抗原と他の［！ｍｅｒ！ａ抗原からなる第２０５項記
載のワクチン（２１７）　　他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は
２５キロダルトンＥ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａ抗原でからな
る第２１６項記載のワクチン （２１８）　　他の［１ｌｅｒｉａ抗原は任意の［、ｎ
ｅｃａｔｒｉｘ抗原からなる第２１６項記載のワクチン （２１９）　　他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は２６キロダル
トンＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原からなる第２１６項記載
のワクチン （２２０）　　他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は任意のＥ、ｌ
ｌ１ａＸ！ｌ１ｌａ抗原からなる第２１６項記載のワク
チン （２２１）　　他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は５５キロダル
トンＥ、ｍａｘｉｍａ抗原からなる第２１６項記載のワ
クチン （２２２）　　混合物は２５キロダルトンＥ、　ｔｅｎ
ｅｔ　Ｉａ抗原と任意の他のＥｉｍｅｒｉａ抗原の組合
せである第２０５項記載のワクチン （２２３）　　他（７）　Ｅｉｍｅｒｉａ抗原は任への
Ｅ、　ｎｅＣａｔｒｉＸ抗原からなる第２２２項記載の
ワクチン（２２４）　　他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は、２
６キロダルトンＥ、ｎ０ＣａｔｒｉＸ抗原からなる第２
２２項記載のワクチン （２２５）　　他の［ｉｍｅｒｉａ抗原は任意のＥ、ｍ
ａｘ＋ｍａ抗原である第２２２項記載のワクチン （２２Ｇ）　　他のＥｉｌｉｅｒ！ａ　広原は５５キロ
ダルトンＥ、ｍａＸｉｍａ抗原である１２２２項記載ワ
クチン（２２７）　　混合物はＥ、　ｎｅｃａｔｒｉＸ
抗原と他の任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原との組合せである
第２０５項記載のワクチン （２２８）　　他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は２６キロダル
トンＥ、ｎｅｃａｔｒｔｘ抗原からなる第２２７項記載
のワクチン （２２９）　　ワクチンはＥ、ｎｅｃａｔｒｔｘ抗原の
混合物と他の任意のＥ、ｍａｘｉｍａ抗原の組合せなる
第２２７項記載のワクチン （２３０）　　他の［ｉｍｅｒｉａ抗原は５５キロダル
トンＥ、ｍａｘｉＩａ抗原からなる第２２７項記載のワ
クチ（２３１）　　混合物は２６キロダルトンＥ、ｎ０
ＣａｔｒｉＸ抗原と他の任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原の組
合せである第２０５項記載のワクチン （２３２）　　他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は任意のＥ、ｍ
ａｘｉｍａ抗原からなる第２３１項記載のワクチン （２３３）他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は５５キロダルトン
Ｅ、ｍａｘｉｍａ抗原からなる第２３１項記載のワクチ
ン （２３４）　　ワクチンは任意のＥ、ｍａｘｉｍａ抗原
の混合物と他の任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原の組合せから
なる第２０５項記載のワクチン （２３５）　　他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は５５キロダル
トン［、ｍａｘｔｍａ抗原からなる第２３４項記載のワ
クチン（２３６）　　ワクチンは任意のＥｉｍｅｒｉａ
抗原の混合物と任意のトリウィルス蛋白質の組合せから
なる第２０５項記載のワクチン （２３７）　　トリウィルス蛋白質はマレック病ウィル
スまたはそのエピドープである第２３６項記載のワクチ
ン （２３８）　　トリウィルス蛋白質は感染性バーサル疾
患ウィルスまたはそのエピドープである第２３６項記載
のワクチン （２３９）　　ｔ−リウイルス蛋白質は七面鳥ヘルペス
ウィルスまたはそのエピドープである第２３６項記載の
ワクチン （２４０）　　混合物は任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原と抗
原性融合ポリペプチドの組合せであり、ポリペプチドは
少なくとも１国のＥｉｍｅｒｉａエピドープが少なくと
も１個の他のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも
部分と融合してなる、第２０５項記載のワクチン （２４１）　　他のポリペプチドはβ−ガラクトシダー
ぜである第２４０項記載のワクチン （２４２）　　ポリペプチドはプロキモシンである第２
４０項記載のワクチン （２４３）　　抗原性融合ポリペプチドはベクターｐＢ
ＧＧ２３によってコードされるポリペプチドである第２
４０項記載の方法 （２４４）　　抗原性融合ポリペプチドはベクターｐｃ
Ｏｃｌ　２によってコードされるポリペプチドである第
２４０項記載の方法 （２４５）　　抗原性融合ポリペプチドはベクターｐｃ
Ｏｃ２０によってコードされるポリペプチドである第２
４０項記載の方法 （２４Ｇ）　　ワクチンは任意の抗原性融合ポリペプチ
ドであり、ポリペプチドは少なくとも１個のＥｉｍｅｒ
ｉａエピドープが少なくとも１個の他のポリペプチドの
アミノ酸配列の少なくとも部分と融合してなる第２０５
項記載のワクチン （２４７）　　ワクチンは、少なくとも１個Ｅｉｍｅｒ
ｉａエピドープを包含する任意の抗原性融合ポリペプチ
ドの混合物である第２４８項記載のワクチン文−が １、　Ａｌｉ、　Ｎ、Ｓｌ、　Ｂｉｎｎｅｒｔｓ、　Ｗ
、Ｔ、　ａｎｄ　Ｋｌｉｍａｓ、　Ｂ、　（１９７２）
。 Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　（ｓｉｃ）　１ｒｒ
ａｄｉａｔｅｄ　Ｅｉｍｅｒｉａ　ａｃｃｒｖｕｌｉ−
ｎａ、　　Ｊ、　　Ｐｒｏｔ、　　１９．　１７７゜２
、　　＾ｖｉｖ、　　Ｈ，ａｎｄ　　Ｌｅｄｅｒ、　　
Ｐ、　　　（１９７２）、　　　　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ　　ｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖ
ｅ　ｇｌｏｂｉｎ　ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ　ｂｙ
　ｃｈｒｏ−ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｎ　０１ｉ（１
０ｔｈ’／ｌｌ１ｉｄｙ１ｉＣａｃｉｄ　ｃｅｌｌｕｌ
ｏｓｅ。 Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、
　　６９．　１４０８゜３、　Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ、Ｄ
、　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　Ｉｌ、Ｗ、　　（ｔ９７７
）、　　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇλｇｔ　ｒｅｃｏａｂｉｎ
ａｎｔ　ｃｌｏｎｅｓ　ｂｙ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ　ｔ。 ｓｉｎｇｌｅ　ｐｌａｑｕｅｓ　ｉｎ　５ｉｔｕ、　　
５ｃｉｅｎｃｅ　１９６．１８０−１８２゜４、　Ｂｌ
ｏｂｃｌ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｄｏｂｂｃｒｓｔｅｉｎ、
　Ｂ、　（１９７５）、　Ｔｒａｎｓ４ｅｒ　ｏｆｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ　ａｃｒｏｓｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　１
．　Ｐｒａｓｃｎｃｃ　ｏｆ　ｐｒｏ℃ｅｏｌｙ−ｔｉ
ｃａｌｌｙ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ　ａｎｄ　ｕｎｐｒｐ
ｏｃｅｓｓｅｄ　ｎａｓｃｅｎｔｉｍｍｕｎｏａｌｏｂ
ｕｌｉｎ　ｌ１ｏｈｔ　ｃｈａｉｎｓ　ｏｎ　ｎ＋ｅｍ
ｂｒａｎａ−ｂｏｕｎｄｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｏｆ　ｍｕ
ｒｉｎｅ　ｍｙｅｌｏｍａ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ
ｌ、　６７、８３５−８５１゜ ５、　Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｗ、Ｈ，（１９８１）、　
”Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ”：Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒｃｔｉｃ　ｔｒａｎｓｒｃｒ　Ｏｆ　ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ　ｒｒｏｉ　５Ｏｄｉｕｌｌｄｏｄｅｃｙｌ
　５ｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｉｉｄｅ　ｇ
ｅｔｓ　ｔｏ　ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄｎｉｔｒｏ−ｃｅ
ｌｌｕｌｏｓｅ　ａｎｄ　ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ　
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｎ
ｄ　ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　
Ａ　、　Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｃｍ、　　１１２．　１９５゜６、　Ｃａｒ
ｌｓｓｏｎ、　Ｈ，；　ｔｌｅｄｉｎ、　Ａ、；　Ｉｎ
ｇａｎａｃｓ、　Ｈ，；　Ｈａｅｒｆａｓｔ。 Ｂ、；　ａｎｄ　ＢｌｏＩｌｌｂｅｒｇ、　Ｆ、　（１
９８５）、　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　１ｎｖ
ｉｔｒｏ　　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　　ｉ＋ｏｕｓｅ　　ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　　八
　ｔｗｏ−ｓｔａｐｐｒｐｏｃｃｄｕｒｅ　ｕｓｉｎａ
　ｃａｔｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎａｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏ
−ｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ｇｅｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏ
ｎ、　Ｊ、　Ｉｕｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　７９（
１）：８９−９８ ７、　Ｃｈｕｎｇ、　　Ｃ，ｔｌ、　　ａｎｄ　Ｇｏｌ
ｄｂｅｒｏ、　Ａ、Ｌ、　　（ｔ９８１）、　Ｔｈｅ　
ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｏｎ（ｃａｐｌｔ）　
ａｅｎｅ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
　１ｓｔｈｅ　　Ａ丁Ｐ　　ｄｅＥ）１３ｎｄｏｎｔ　
　ｐｒｏｔｅａｓｅ、　　ｐｒｏｔｅａｓｅ　　＋−ａ
、　　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　υＳ八　７８
．　４９３１゜８、　　Ｃｏｈｅｎ、　　Ｓ、Ａ、、　
　丁ａｒＶｉｎ、　　Ｔ、Ｌ、　　ａｎｄ　　Ｂｉｄｌ
ｉｎｇｍｅｙｅｒ、　　Ｂ、Ａ。 （１９８４）、　　八ｎａｌｙｓｉｓ　　ｏｆ　　ａｍ
ｉｎｏ　　ａｃｉｄｓ　　ｕｓｉｎｏ　　ｐｒｃｃｏｌ
ｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　　ｗｉｔｈ　　
ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、　　八ｍ
ｅｒｉｃａｎｃａｂｏｒａｔｏｒｙ　１６．４８−５９
゜９、　０ａｎ４ｏｒｔｈ、　１１．０．　　（１９８
２）、　　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｒ　ｈｙｂｒｉ
ｄｏＩａ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　
ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｅｉｍｅｒｉａｔ
ｅｎｅｔ　Ｉａ　ａｎｄ　Ｕ、山、　Ｊ、　Ｐａｒａｓ
ｉｔｏｌ、　６８．３９２゜１０、０ａｎｆｏｒｔｈ、
　ｔｌ、０．　（１９８２）、　ｔｌｓｅ　ｏｆ　１ｏ
ｎｏｃｌｏｎｅｌ　ａｎｔｉｂｏｄ−ｉｅｓ　ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅ
ｌｌａ　５ｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓｔｏ　ｄｅｔｅｒａ＋
ｉｎｃ　ｓｔａｇｅ　５ｐｅｃ＋ｒ＋ｃ；ｔｙ　ａｎｄ
　ｉｎ　ＶｉｔｒＯｅｒｒｃｃｔＯｎ　ｐａｒａｓｉｔ
ｅ　ｐｅｎｅｔｒａｔｔｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ、＾ｍＪ。 Ｖｅｔ、　ＲｅＳ旦、　１７２２゜ １１、０ａｎｆｏｒｔｈ、　Ｈ，Ｄ、　ａｎｄ　Ａｕａ
ｕｓｔｉｎｅ　Ｐ、Ｃ，（１９８３）、　５ｐｃｃｉ−
ｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉ
ｔｙ　ｏｒ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｎｄｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ　ａｎｔｉｂｏｄｉ（３３ｔｏ　Ｖａｒｉ
ＯｔｌＳ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ａｖｉａｎｃｏｃｃ
ｉｃｉａ、　Ｐｏｕｌｔｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　６２．
２１４５゜１２、０ａｖｉｓ、　Ｐ、Ｊ、、　Ｐａｒｒ
ｙ、　Ｓ、１１．　ａｎｄ　ｐｏｒｔｅｒ、　Ｐ、（１
９７８）。 Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｒ　５ｅｃｒｃｔｏｒｙ　Ｉ（Ｉ
Ａ　ｉｎ　ａｎｔｉ−ｃｏｃｃｉｄｉａｌｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｉｃｋｅｎ、　Ｉｕｕｎｏｌ
ｏｇｙ　３４．８７９゜１３、　０ａｖｉｓ、　　Ｐ、
Ｊ、　　ａｎｄ　　Ｐｏｒｔｅｒ、　　Ｐ、　　（１９
７９）、　　八ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　　ｆｏｒＳ（ＩＣ
ｒｅｔＯｒＶ　ＩｇＡ　１ｌＱｄｉａｔｅｄ　１ｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌＤｅｎ（３ｔｒ
ａｔｉＯｎ　ａｎｄ　１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆＥｉｎ＋ｅｒｉａ　ｔｃｎ
ｅｌｌａ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　３Ｇ、　４７１゜
１４、　Ｅｄｍａｎ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｂａｇｇ、　Ｇ
、　（１９６７）、　Ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｃｑｕｅ
ｎａ−ｔＯｒ、　ＡｕｔＯｌｌｌａｔｅｄ　Ｅｑｕｉｐ
ｍｅｎｔ　ｆｏｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｃｔｃｒｍｉ
ｎａ−ｔｉｏｎ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　
１．８０゜１５、　Ｇｉａｍｂｒｏｎｅ、　　Ｊ、Ｊ、
、　　に１ｃｓｉｕｓ、　　Ｐ、Ｈ，ａｎｄ　Ｅｄｇａ
ｒ　Ｓ、＾。 （１９８０）　　　八ｖｉａｎ　　Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓ
ｉｓ：　　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　　ｆｏｒ　　ａ　　ｃｃ
ｌｌ−ａ＋ｅｄｉａｔｃｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏ
ｎｓｅ、　Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃｉ、　５９．３８゜１
６、　　Ｇｉｂｂｏｎｓ、　　Ｒ，Ａ、、　　Ｓｅｌｌ
ｗｏｏｄ、　　Ｒ，、Ｂｕｒｒｏｗ、　　Ｈ，ａｎｄ　
Ｈｕｎｔ　−ｃｒ、　　Ｐ、八、　　（１９７７）、　
　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　　ｏｆ　　ｒｅｓｉｓｔａ
ｎｃｅ　　ｔ。 ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｅ、　ｃｏｌｔ　ｄｉａｒｒｈｅａ
　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｉｇ：　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏ
ｒ　ｔｈｅ　ｇｃｎｅｔｔｃ　５ｙｓｔｃｔ　Ｔｈｅｏ
ｒ、　Ａｐｐｌ、　ｃｅｎａｔ、　５１．６５゜１７、
　Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ、、　　にＩｅｉｄ、　Ｄ
、Ｇ、、　Ｂｏｌｉｖａｒ、　　Ｆ、、　Ｈｅｙｎｅｋ
ｃｒ。 １１、Ｌ、、　　Ｙａｎｓｕｒａ、　　Ｄ、Ｇ、、　　
Ｃｒｅａ、　　Ｒ，、１ｌｉｒｏｓｅ、　　Ｔ、、　　
Ｋｒａｓ−ｚｅｖｓｋｉ、　　八、、　　［ｔａｋｕｒ
ａ、　　に、　　ａｎｄ　　Ｒｉｇｇｓ、　　Ａ、Ｄ、
　　（１９７９）。 ［ｘｐｒｃｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ　ｏｆ　ｃｈｅｎ＋１ｃａｌｌｙ　５ｙｎ−
ｔｈｃｓｉｚｅｄ　　ｇｅｎｅｓ　　ｒｏｒ　　ｈｕｍ
ａｎ　　１ｎｓｕｌｉｎ、　　Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔ、　　
八ｃａｄ。 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６、　１０６−１１０゜１８、　
ＧＯｆｆ、　Ｓ、＾、　ａｎｄ　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　
Ａ、Ｌ、　　（１９８５）、　　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
Ｏ［＾ｂｎｏｒｍａｌ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　ｉｎ　
　Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ　　丁ｒ
ａｎｓ−ｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　　Ｉｏｎ　ａｎｄ　
０ｔｈｅｒ　Ｈｅａｔ　５ｈｏｃｋ　Ｇｅｎｅｓ、　　
Ｃｅ１１４１、　５８７−５９５゜ １９、　ＧＯｒｅ、　　Ｔ、Ｃ，、Ｌｏｎｇ、　　Ｐ、
Ｌ、、　　ＫＯ（ｌｔｌｔ、　Ｈ，ａｎｄ　ＪＯｈｎＳ
Ｏｎ、　Ｊ。 （１９８３）、　　Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅ
ｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘ　ａｎｄ　Ｅ。 ｔＱｎｅｌｌａ　ｏｆυ、Ｓ、　ｏｒｉｇｉｎ　ｂｙ　
５ｅｒｉａｌ　ｅｍｂｒｙｏ　ｐａｓｓａｇｅ。 Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ　２７．５６９゜２０、　
Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　　Ｈ，ａｎｄ　ｌｌｏｇｎｅｓ
ｓ、　　Ｄ、　Ｓ、　　（１９７５）、　Ｃｏ１ｏｎｙ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：　Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆ
ｏｒ　ｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆｃｌｏｎｅｄ
　ＤＮＡ５　ｔｈａｔ　ｃｏｎｔａｉｎ　ａ　５ｐｅｃ
ｉｆｉｃ　ｇｅｎｅ、　　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　７
２．３９６１　。 ２１、１１ａ（Ｊａｒ、　　Ｄ、＾、　　ａｎｄ　Ｂｕ
ｒｇｅｓｓ、　　Ｒ，Ｒ，（１９８０）、　　［Ｉｕｔ
ｉｏｎ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｓｏｄｉｕ
ｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒ
ｙｌａ−ｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ、　　ｒｅｍｏｖａｌ　ｏ
ｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆａｔｅ、
　ａｎｄｒＱｎａｔｌＪｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　０ｎＺｌ
／１Ｉｌａｔｉｃ　ａｃｔｉＶｉｔＶ：　Ｒｅ５ｕｌｔ
ｓ　ｗｉｔｈＳｉｇｎ＋ａ　　ｕｎｉｔｓ　　ｏｆ　　
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　曲へ　ｐｏ＋
ｙｍｅｒａｓｅ。 ｗｈｅａｔ　ｇｅｒｌｌ　ｔＯｐｏｉｓＯｌｏｒａｓ（
！、　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　０ｎＺＶＩｅＳ、　Δｎａ
ｌ。 Ｂｉｏｃｈｃｍ、　　１０９：　　７６゜２２、　Ｈｅ
１ｌｉｎａ、　　Ｒ，Ｂ、、　Ｇｏｏｃｈ＋＋ａｎ、　
１１．Ｈ，ａｎｄ　Ｂｏｙｅｒ、　１１．１４．　　（
１９７４）Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌ
ｃａｓｅ　ＥｃｏＲＩ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｄ
ＮＡｆｒｏｍ　　Ｌａｍｂｄｏｉｄ　　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｐｈａｇｅｓ　　ａｎｄ　　ｏｔｈｅｒ　　ｖｉｒｕ
ｓｅｓ　　ｂｙａａａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｃｃｔｒ
ｏｐｈｏｒｃｓｅｓ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１４．１
２３５−１２４４゜ ２３、　１Ｉｅｌｎ＋ｓ　ｅｔ　ａｌ、　　（１９８５
）、　　ＤＮＡ　４：　３９−４９゜２４、　ｌｌｏｗ
ａｒｄ、　　Ｒ，Ｊ、、　　にｏｕｓｈａｌ、　Ｄ、Ｃ
，ａｎｄ　Ｃａ５ｔｅｒ、　　Ｒ，（１９８２）。 Ｒａｄｉｏ−ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｒａｓ
ｉｔｅ　ａｎｔｉｇｃｎ　ｗｉｔｈ　１，３，４．６−
ｔｃｔｒａｃｈｌｏｒｏ−３，ａｌｐｈａ−６，ａｌｐ
ｈａ−ｄｉｐｈｅｎｙｌ　ｇｌｙｃｏｕｒｉｌ（１００
０−ＧＥＮ”）　５ｔｕｄｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｚｙｇｏ
ｔｅｓ　ｏｆ　ＰＩａｓｍｏｄｉｕａ＋ｇａｌｌｉｎａ
ｒｕｔ　Ｊ、　Ｐｒｏｔｏｚｏｌ、　２９：　１１４゜
２５、　ｌ１ｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｈ，Ｗ、、　ｌ
ｌｅｗｉｃｋ、　Ｉｔ、　Ｈ，、Ｄｒｅｙｅｒ、　Ｗ、
Ｊ、　ａｎｄ＋１００（１，Ｌ、Ｅ、　（１９８３）、
　Ｈｉｇｈ　５ＯｎＳｉｔｉＶｉｔＶ　ＳＯＱｔｌｅｎ
ＣｉｎＣｌｗｉｔｈ　ａ　ｇａＳ　ｐｈａｓｅ　５ｅｑ
ｕｅｎａｔｏｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏ−（ＪＶ　９１．　ＡＣａｄｅｌｌｌｉＣｐｒｅ
ｓｓ、　Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、　３９９−４１３゜２６、
１ｌｕｎｋａｏｉｌｌｅｒ、　Ｈ，Ｗ、、　５ｔｒｉｃ
ｋｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｗｉｌｓｏｎ、に、Ｊ
。 （１９８４）、　Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ　Ｍｅｔｈ
ｏｄｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒＵＣｔ
Ｕｒ’ｅ　Ｄｅｔｃｒｍｉｒｉａｔｉｏｎ、　５ｃｔｅ
ｎｃｅ　２２６．３ｏ４−３ｔ１゜２７、　Ｉｔａｋｕ
ｒａ、　Ｋ、、　Ｈｉｒｏｓｅ、　Ｔ、、　Ｃｒｅａ　
、　Ｒ，、１１１ｇｇ５．　Ａ、Ｄ、。 １１ｃｙｎｃｃｈｋｅｒ、　１１．Ｌ、、　Ｂｏｌｉｖ
ａｒ、　ｒ、　ａｎｄ　Ｂｏｙｅｒ、　Ｈ，Ｗ。 （１９７７）、　Ｅｘｏｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｏｒ　ａ　ｃｈｅｍ−ｒ
ｃａ＋＋ｙ　　５ＶｎｔｈｅＳｉＺｅｄ　　ＱｅｎＱ　
　ｆｏｒ　　ｔｈｃ　ｈＯｒｌｌ＋０１１ｅ　　ＳＯｍ
ａｔＯ８ｔ−ａｔｉｏｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８．
　１０５６−１０６３゜２８、　Ｊｅｆｆａｒｓ、　Ｔ
、に、　（７９７５）、　Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ　ｏ
ｒ　Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａ　ｔｈｒｏｕｑｈ　
５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｏｒａｃｏｃｉｏｕｓｎ
ｅｓｓ、　Ｊ。 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　６１．１０８３゜２９、　　Ｊ
ｅｒｒｅｒｓ、　　Ｔ、に、　　　（１９７６）、　　
Ｇｅｎｅむｉｃ　　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　　ｏ
ｆｉ）ｒＱｃＯｃｉｏｔｌｓｎＱｓｓ　ａｎｄ　ａｌｌ
ｔｉｃＯｃｃｉｄｉａｌ　ｄｒ（ＪＱ　ｒｅｓｉｓｔａ
ｆｌｃｅｏｎ　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ、　　
Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　ｆｕｒ　Ｐａｒａｓｉｔｅｎ
ｋｕｎｄｅ５０、　２５１゜ ３０、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｒａ１ｄ、
　Ｗ、Ｈ，（１９７０）、　Ａｎｔｉｃｏｃｃｉｄｉａ
ｌＤｒｕｇｓ：　Ｌｅｓｉｏｎ　ｓｃｏｒｉｎｇ　ｔｅ
ｃｈｎｉｇｕｅｓ　ｉｎ　ｂａｔｔｅｒｙ　ａｎｄｆｌ
ｏｏｒ　ｐｅｎ　ｅｘｐｅｒｉｎ＋ｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ
　ｃｈｉｃｋｅｎｓ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｒａｓｉ−ｔＯ
ＩＯ！ＪＶ並、３６゜ ３１、にａｓｐｅｒ、　　Ｌ、ｆｌ、、　Ｃｒａｂｂ、
　Ｊ、Ｈ，、ａｎｄ　Ｐｆｃｆｆｅｒｋｏｒｎ、　Ｅ、
Ｉｔ。 （１９８３）、　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　ａ
　ｍａｊｏｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎＯｆ
　ＴＯＸＯｐｌａＳＩｉｌａ　ｇｏｎｄｉｉ　ｂｙ　１
１ｍ１ｌｌＬＩｎＯａｂＳＯｒｐｔｉＯｎ　ｗｉｔｈ　
ａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、　Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３０．２４０７゜３２、　　Ｋｅ
ｕｓｃｈ、　　Ｇ、■、　　（１９７９）、　　５ｐｅ
ｃｉｆｉｃ　　ＩＩｌｅｍｂｒａｎｅ　　ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ａｎｄ　ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　１ｎｆ
ｃｃ−ｔｉｏｕｓ　ｄｉｓｅａｓｅｓ、　　Ｒｅｖ、　
　１１１１．　０ｉｓ、　　１．　５１７゜３３、　に
１ａｉｄ　　ｌ）、Ｇ、、　　Ｙａｎｓｕｒａ、　　Ｄ
、、　　Ｓｍａｌｌ　　Ｂ、、　　Ｄｏｗｂｅｎｋｏ、
　　ロ、。 Ｈｏｏｒｅ、　　Ｄ、Ｈ，、Ｇｒｕｂａ＋ａｎ、　　Ｈ
，Ｊ、、　１４ｃＫｅｒｃｈｅｒ、　　Ｐ、Ｄ、、　　
Ｈｏｒ−ｇａｎ、　　０．０．、　　Ｒｏｂｃｒｔｓｏ
ｎ、　　Ｂ、Ｉｌ、　　ａｎｄ　Ｂａｃｈｒａｃｈ、　
　１１．Ｌ。 （１９８１）、　　Ｃ１ｏｎｅｄ　ｖｉｒａｌ　ｐｒｏ
ｔｅｉｎ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｆｏｒ　ｆｏｏｔ　ａｎｄ
ｍｏｕｔｈ　　ｄｉｓＣａｓｅ：　　ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓ　　ｉｎ　　ｃａｔｔｌｅ　　ａｎｄ　　５ｈｉｎｅ
、５ｃｉｅｎｃｅ　２１４．　１１２５゜３４、Ｋｒ１
ｃｌ、　Ｇ、　　（１９８１）、　　Ｔｒａｎｓｐｏｒ
ｔ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｃｒｏｓｓｍｅｍｂｒ
ａｎｅｓ、　　Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ、　　Ｂｉｏｃｈｃ
ｍ、　　５０．　３１７−３４８．３５．　　Ｌａｅ＋
＋＋ｍｌｉ、　　Ｕ、に、　　（１９７０）、　Ｃｌｅ
ａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｏｆ
　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｂａｃｔｅ−ｒｉｏｐｈａ
ｇｅ　Ｔ４．　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．　（ｉ８０゜３
６、　　Ｌｅｄｅｒ、　　Ｐ、、　　Ｔｉｃｍｅｉｅｒ
、　　Ｄ、　　ａｎｄ　　Ｅｎｇｕｉｓｔ、　　Ｌ、　
　（１９７７）。 ［Ｋ２　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｐｈａｇｅ　ｌａｍｂｄａ　ｕｓｅ４ｕｌ　　ｉｎ
ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｈｉｇｈｅ
ｒ　ｏｒｇａｎｉｓｍｓ：　ｔｈｅ　ｇｔ　ｗｅｓｓｙ
ｓｔｅｍ、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６．１７５−１７７
゜３７、　Ｌｏｎａ、　Ｐ、　Ｌ、　（１９７２）　Ｅ
ｉｍｅｒｉａ　ｎ＋１ｖａｔｉ：　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ。 Ｄａ［ｔｌＯ＋ＪＯｎＩＣ！１ｙａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏ
ｇｅｎｉｃｉｔｙ　Ｏｆ　ａ　５ｊｒａ！ｎ　ｍａ！ｎ
−ｔａｉｎｅｄ　　ｉｎ　ｃｈｉｃｋ　ｃ＋＋＋ｂｒｙ
ｏｓ　ｂｙ　５ｅｒｉａｌ　ｐａｓｓａｇｅ、　　Ｊ。 Ｃｏ１ｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、　８２．８３９゜３８、　
　ｌ−ｏｎｇ、　ｐ、　　ｔ、　　（１９７４）、　　
Ｆｕｒｔｈｅｒ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐａ
ｔｈｏ−（］ｅｎｉＣｉｔｌ／　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏ
ｇｅｎｔｃ＋ｔｙ　ｏｒ　ａｎ　ｅｍｂｒｙｏ　ａｄａ
ｐｔｅｄｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎ
ｅｌｌａ、　　Ａｖｉａｎ　ＰａｔｈＯＩＯ（１１７３
，２５５゜３９、　　Ｌｏｎｇ、　　Ｐ、Ｌ、　　（１
９８２）、　　Ｔｈｅ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　ｏｆ　　
ｔｈｅ　　Ｃｏｃｃｉｄｉａ。 Ｕｎｉｖｃｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｂａ
ｌｔｉｍｏｒｅ、　　Ｐｇ、　４４゜４０、　　Ｌｏｎ
ｇ、　　Ｐ、Ｌ。、　　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　　Ｊ、、　
　ａｎｄ　　Ｇｏｒｅ、　　丁、Ｃ，（１９８２）。 ＡｔｔｅｎｔｌａｔｉＯｎ　ｏｆ　ａ　５ｔｒａｉｎ　
ｏｆ　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｌｌ１ｉＶａｔｉ　　ｏｆ　ｕ
、ｓ。 ｏｒｉｇｉｎ　ｂｙ　５ｅｒｉａｌ　ｅｍｂｒｙｏ　ｐ
ａｓｓａｇｅ、　　Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ。 ２６．３０５゜ ４１、　　Ｌｏｎｇ、　　Ｐ、Ｌ、　　ａｎｄ　　Ｒｏ
ｓｅ、　　Ｈ，Ｅ、　　（１９６５）、　八ｃｔｉｖｅ
　　ａｎｄｐａｓｓｉｖｅ　１ｕｕｎｉｚａ口ｏｎ　ｏ
ｆ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　ａｇａｉｎｓｔ　１ｎｄｕｃｅ
ｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｅｉｎ＋ｅｒｉａ　ｔ
ｅｎｅｌｌａ　、　Ｅｘｐ、　Ｐａｒａｓｉｔ、　１６
゜１゜ ４２、　　Ｌｏｎｇ、　　Ｐ、Ｌ、、　Ｈｉｌｌａｒｅ
ｄ、　　Ｂ、Ｊ、、　Ｊｏｙｎｅｒ、　　Ｌ、Ｐ　、　
ａｎｄＮｏｒｔｏｎ、　　Ｃ，Ｃ，（１９７６）、　　
＾ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　５ｔｕｄｙ　ａ
ｎｄ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆａｖｉａｎ　ｃｏｃｃ
ｃｉｄｉｏｓｉｓ、　　Ｆｏｌｉａ　Ｖｅｔ、　　Ｌａ
ｔ、　　６．　２０１゜４３、　　Ｌｏｖｄｅｒ、　　
Ｌ、Ｊ、　　（ｔ９ＧＧ）、　Ａｒｔ４ｉｃｉａｌ　ａ
ｃｑｕｉｒｅｄ　　ｉｉｍｕｎｉｔｙｔｏ　Ｅｉｍｅｒ
ｉａ　ｂｏｖｉｓ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｃａ
ｔｔｌｅ、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｉｎｔ。 Ｃｏｎｇｒ、　　Ｐａｒａｓｉｔ、　　１．　１０６゜
４４、　Ｈａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　　Ｆｒ１ｔｓｃ
ｈ、　Ｅ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ。 （１９８２）、　　Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ−八　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ。 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　ＮＣｗ　Ｙｏｒｋ。 ４５、　Ｈａｒｇｕａｒｄｔ、　Ｗ、Ｃ，（１９８０）
、　ｔｌｏｓｔ　ａｎｄ　５ｉｔｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｔｙｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏｃｃｉｄｉａ；　ａ　ｐｅｒ
ｓｐｅｃｔｉｖｅ、　Ｊ、Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ、　２６
゜２４３゜ ４６、　Ｈａｘａｍ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ
、　Ｈ，（１９８０）、　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｃｎ
ｄ−１ａｂｅｌｌｅｄ　ＤＮＡ　Ｗｉｔｈ　ｂａｓｅ−
ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｉ
ｎ：　Ｈｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｑ　、
　Ｖｏｌ、　６５．　　ｐａｒｔ　１゜Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　　ｐｐ、　　
４９９−５９９゜４７、　）ｌｃｃａｍａｎ、　Ｈ，Ｔ
、、　Ａｎｄｒｅｗｓ、　Ｗ、ｔｌ、　ａｎｄ　Ｆｉｌ
ｅｓ、　Ｊ、Ｇ。 （１９８５）、　ＥｎｚｙｌＩｌａｔｉｃ　ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓｓ　　ａｎｄ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｏ　ｏｆ
ｂｏｖｉｎｅ　ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ　５ｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｄ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、
　　Ｊ、　　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　　２．　１７７４８、
　　ＨｃＤｏｎａｌｄ、　　ｖ、　　ａｎｄ　　Ｂａｌ
ｌｉｎｇａｌｌ、　　ｓ、　　（１９８２）、　　八ｔ
ｔｅｎｕａ−ｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍ１ｖ
ａｔｉ　（：　１ｉｔｉｓ）　ｂｙ　５ｅｌｅｃｔｉｏ
ｎ　ｆｏｒｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｎ＋
ｅｎｔ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏａｙ　８６．３７１゜
４９、　ＨｃＤｏｎａｌｄ、　Ｖ、　ａｎｄ　Ｂａｌｌ
ｉｎｇａｌｌ、　Ｓ、　　（１９８２）、　Ｆｕｒｔｈ
ｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａ
ｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ、　　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ
ｉｔｙａｎｄ　５ｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｅｃｏ
ｃｉｏｕｓ　ＩＥｉｍｅｒｉａ　ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ
。 Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　８６．３６１゜５０、　Ｈ
ｃＤｏｎａｌｄ、　Ｖ、　ａｎｄ　Ｂａｌｌｉｎｇａｌ
ｌ、　Ｓ、　ａｎｄ　５ｈｉｒｌｃｙ、　Ｈ，Ｗ。 （１９８２）、　　八　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　　５
ｔｕｄｙ　　ｏｒ　　ｔｈｅ　　ｎａｔｕｒｅ　　ｏｆ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ
　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　ｇｉｖｅｎ　ａｎ　ａＬｔｅｎ−
ｕａ（ｅｄ　１ｉｎｅ　ｏｆ　Ｅｉｍｅｒｉａ　ａｃｅ
ｒｖｕｌｉｎａ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　８４゜
５１、　ＨｃＤｏｕｇａｌｄ、　Ｌ、Ｒ，５ｔａｔｕｓ
　ｏｆ　ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ：　Ｎｃｖ　ｐｒｏｄ
−ｕｃｔｓ　ｏｎ　ｗａｙ、　　Ｐｏｕｌｔ、　　Ｄｉ
ｇｅｓｔ、　　Ｏｃｔ、、　　１９８１゜５２、　　Ｈ
ｃＤｏｕｇａｌｄ、　　Ｌ、Ｒ，Ｎｅｗ　ａｎｔｉｃｏ
ｃｃｉｄｉａｌ　ｄｒｕｇｓ：　Ｂｅｔｔｅｒｔｈｉｎ
ｇｓ　ｔｏ　ｃｏｍｅ　ｏｒ　”ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ
　５ｐｅｃｉｅｓ？”　Ｆｅｅｄ−ｓｔｕｒｒｓ　Ａｕ
ｇ、　　１５．　１９８３゜５３、　Ｈｉｌｌａｒ、　
Ｗ、Ｔ、　　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｊ、Ｆ、Ｂ　、　
　（１９８３）、　　Ｐｒｏｔｅｉｎｉｏｄｉｎａｔｉ
ｏｎ　　ｕｓｉｎｇ　　　１０００−ＧＥＮ”、　　Ｉ
ｎｔ、　　Ｊ、　　八ｐｐ１．　　Ｉｔａｄｉｏｔ。 ｌ５ｏ１．３４：　　６３９゜ ５４、　　Ｈｉｌｌａｒ、　　Ｌ、Ｈ，、Ｍａｓｏｎ、
　　Ｓ、Ｊ、、　　Ｄｖｏｒａｋ、　　Ｊ、八、、　　
ＨｃＧｉｎｎｉ５ｓ。 Ｈ，Ｈ，、ａｎｄ　Ｒｏｔｈｍａｎ、　　１．に、　　
（１９７５）　Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｒｅｃｅｐｔｏ
ｒｓ　ｏｆ　（Ｐｌａｍｏｄｉｕｍ　ｋｎｏｗｌｅｓｉ
）　Ｍａｌａｒｉａ：　Ｄｕｆｆｙｂｌｏｏｄ　ｇｒｏ
ｕｐ　ｄｅｔｅｒｌｉｎａｎｔｓ、　５ｃｉａｎｃａ　
１８９．５６１゜５５、　Ｈｉｌｌａｒ、　Ｊ、Ｈ，ｅ
ｄ、　　（１９７２）、　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　
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ｄ　５ｐｒｉｎＯＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ、　ｐａｇｅｓ　５４　ａｎｄ　４３１゜５
６、　　Ｎｏｒｒａｎｄｃｒ、　　Ｊ、、　　Ｋｅｍｐ
ｅ、　　丁、　　ａｎｄ　　）ｌｅｓｓｉｎｇ、　　Ｊ
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ｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、　Ｇａｎａ　２１３゜１０１゜ ５７、　　Ｒａ１ｄ、　　Ｗ、Ｈ，（１９７８）、　　
ｐｒｏｔｏｚｏａ、　　Ｉｎ：　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏ
ｒｑ、　７ｔｈ　ｃｄ、　Ｈ，Ｓ、　ｌ１ｏｆｓｔａｄ
　、　ｃｄ、　Ｉｏｗａ　５ｔａｔｅ１１ｎｉｖ、　　
Ｐｒｅｓｓ、　　ｐｐ、　　９４２−１０５４゜５８、
　　Ｒ１１（！Ｖ、　　Ｊ、Ｆ、　　　（１９８（＋）
、　　５ＣｒＯｅｎｒｎＱ　　ｒＯｒ　　ａｎｄ　　ｅ
ＶａｌＬｌａｔｉＯｎｏｆ　ａｎｔｉｃｏｃｃｉｄｉａ
ｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ、　Ａｄｖ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｃ
ｈｅｍｏ、　ｔ７゜１゜ ５９、　　Ｉｔｏｓｃ、　Ｈ，Ｅ、　　（１９７４）、
　　Ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ
Ｅｉｍｅｒｉａ：　Ｒｅｃｅｎｔ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉ
ｏｎｓ、　Ｓｙｍｐｏ、　Ｃｏｃｃｉｄｉａａｎｄ　Ｒ
ｅ１ａｔｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ、　ｐｐ、　９２−
１１８．　ｌ１ｎｉｖ、　Ｇｕｃｌｐｈ。 ０ｎｔａｒｉｏ。 ６０、　Ｒｏｓｅ、　Ｈ，Ｅ、　ａｎｄ　１ｌｅｓｋｅ
ｔｈ　（１９７６）、　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｔ。 Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ：　Ｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈ
ｅ　１ｉｆｅ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　Ｅｉｍｃｒａｍａｘ
ｉｍａ　ｗｈｉｃｈ　１ｎｄｕｃｅ　ａｎｄ　ａｒｅ　
ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ。 ＰａｒａＳｉｔＯｌｏｏＶ　２７：　２５−３７゜６１
、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ、　　Ｄ、Ｒ，ａｎｄ　Ｂｅｎｎｅ
ｔｔ、　Ｇ、　Ｎ、　　（１９８２）、　Ｃｏｎ５ｔｒ
ｕｃ−ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉ
ｎ　ｖｉｖｏ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｅ、　ｃｏｏ
ｆ）ｒｏｌｌｏｔｏｒ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ａｎｄ　ｐｒ
ｏｍｏｔ（！ｒ　ＩＩＩｕｔａｎｔＳ　ｔｈａｔ　ａｌ
ｔｅｒｔｈｅ　−３５ｔｏ　−１０ｓｐａｃｉｎｇ、　
Ｇｅｎｅ　２０．２３１−２４３０２、　Ｓａｎｇｅｒ
、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、Δ、ｎ、　　（１
９７８）、　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆｔｈｉｎ　　ｐｏｌ
ｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　　ｇｅｌｓ　　ｆｏｒ　　Ｄ
ＮＡ　　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、　　ｒＥｒ３ｓしｅｔ
ｔ、　　８７．　　１０７−１１０゜６３、５ｈａｐｉ
ｒｏ、　Ｊ、、　ＨａｃＨａｔ口ｅ、　Ｌ、、　Ｅｒｏ
ｎ、　Ｌ、、　　Ｉｈ１ｅｒ、　Ｇ、。 Ｉｐｐｅｎ、　Ｋ、　Ｂｅｃｋｗｉｔｈ、　Ｊ、、Δｒ
ｄｉｔｔｉ、　Ｒ，、ＲｅｚｎｉｋｏＮ、　Ｗ、。 ａｎｄ　）ｌａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ、　　Ｉｌ、　　
（１９６９）、　　Ｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ
　ｐｕｒｅＩａｃ　　ｏｐｅｒｏｎ　　ＤＮＡ、　　Ｎ
ａｔｕｒｅ　　２２４．　７６８−１１４゜６４、　　
Ｓｈａｒｍａ、　　Ｓ、Ｄ、、　　Ｈｕｌｌｅｒｉａｘ
、　　Ｊ、、　　Ａｒａｕｊｏ、Ｆ、Ｇ、、　　［ｒｌ
ｉｃｈ。 Ｈ，Ａ、　　ａｎｄ　Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、　Ｊ、Ｓ、
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　　ｏｒ　　Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　　ｇｏｎｄｉｉｒ
ｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＨａｎｄ
　［ｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｊ。 １１１１！１ＬｌｎＯＩＯ（ＩＶ　１３１．９７７６５
、　５ｈａｒｐ、　　Ｐ、Ａ、　　（１９ｇ？）、　　
５ｐｅｃｕｌａｔｉｏｎｓ　　ｏｎ　　ＲＮＡ　　ｓｐ
ｌｉｃｉｎｇ、Ｃｅ１ｌ　２３．　６４３−６４６゜ ６６、　５ｈｉｒｌｅｙ、　　Ｈ，Ｗ、　　（１９８０
）　　Ｅｉｍｅｒｉａ　　ｎｅｃａｔｒｉｘ：　　丁ｈ
ｅ　　ｄｃｖｅｌ−０１）ｌｆｌｎｔ　ａｎｄ　Ｃｈａ
ｒａＣｔ（３ｒｉＳｔｉＣ３ｏｆ　ａｎ　ｅ（１！ＩＩ
−ａｄａｌ）ｔｅｄ　（ａｔ−ｔｅｎｕａｔｅｄ）　１
ｉｎｅ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　８１．５２５゜
６７、　５ｈｉｒｌｅｙ、　Ｈ，Ｗ、　　（１９８２）
、　　Ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ａｎ　ａｔｔｅｎｕａ
ｔｅｄｌｉｎｅ　ｏｒ　Ｅｉｍｅｒｉａ　Ｉ）ｒａｅｃ
ＯＸ、　　ＰａｒａＳｉｔＯＩＯａｙ、　　ＰｒＯｃｃ
Ｏｄ−ｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｂｅ　８ｒｉｔｉｓｈ　Ｓｏ
ｃ、　ｆｏｒ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　８１．５２
５゜６８、　５ｈｉｒｌｅｙ、　　Ｈ，Ｗ、、　　Ｂｅ
１ｌａｔｔｉ、　　Ｈ，Ａ、　　ａｎｄ　Ｈｉｌｌａｒ
ｄ、　　８．Ｊ。 （１９８２）、　　Ａｎ　ｅｇｇ−ｓｈａｐｅｄ　（ａ
ｔｔｅｎｕａｔｅｄ）　　１ｉｎｅ　ｏｆ　［ｉｍｅｒ
ｉａｎｅｃａｔｒｉＸ：　　ｒｕｒｔｈｅｒ　５ｔＵｄ
ｉＯ３Ｏｎ　ｉｔｓ　ｒＯＤｒｏｄＵｃｔｉｏｎｐａｔ
ｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉ
ｃｉｔｙ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ８４、　２１５
゜ ｆ３９．　５ｐｅａｒ、　　Ｃ，八、、　　Ｗｏｎｇ、
　　Ｒ，Ｂ、　　ａｎｄ　　５ｃｈｃｎｋｃｌ、　　Ｒ
，Ｉｌ、　　（１９８３）。 ＥＮｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ＩｇＧ
　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｅｉｍｅｒｉａｔｃｒ
＋ｅｌｌａ　（ｃｏｃｃｉｄｉａ）　５ｐｏｒｏｚｏｉ
ｔｅｓ、　Ｊ、　Ｐａｒａｓｔｔｏｌ、　６９゜７７５
゜ ７０、５ｐｅｅｒ、　Ｃ，Ａ、、　Ｗｏｎｇ、　Ｉｔ、
Ｂ、　ａｎｄ　５ｃｈｅｎｋｅｌ、　Ｒ，Ｈ，（１９８
３）。 Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　　Ｉｏｃａｌｉｚａ
ｔｉｏｎ　　ｏｒ　　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ＩｇＧ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　
５ｉｔｅｓ　ｏｆ　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔａｎｃｌｌａｏ
ｏｃｙｓｔｓ、　　５ｐｏｒｏｃｙｓｔｓ　ａｒ＋ｄｓ
ｐｏｒｏｚｏｔｔｅｓ、　　Ｊ、　　Ｐｒ０ｔＯ−ｚｏ
ａｌ、　　３０．　５４８゜ ７１、　５ｔｃｉｎｅｒ、　　Ｄ、Ｆ、、　　Ｑｕｉｎ
ｎ、　　Ｐ、Ｓ、、　　Ｃｈａｎ、　　Ｓ、Ｊ、、　　
Ｍａｒｓハ、　Ｊ。 ａｎｄ　Ｔａｇｃｒ、、　Ｈ，Ｓ、　　（１９８０）、
　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　１ｎ
ｔｈｅ　　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　　ｏｆ　　１）
ｒｏｔｅｉｎｓ、　　Ａｎｎａｌｓ　　Ｎ、Ｙ、　　八
ｃａｄ。 ｓｃｉ、　　３４３．　１−１６゜ ７２、５ｔｏｔｉｓｈ、　Ｒ，Ｌ、、　Ｗａｎｇ、　Ｃ
，Ｃ，、Ｈｉｃｈｅｎｓ、　Ｈ，、Ｖａｎｄｃｎ−！Ｉ
ｅｕｖｅｌ、　Ｈ，Ｊ、Ａ、　ａｎｄ　Ｇａ１ｅ、　Ｐ
、（１９７６）、　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ａｇｌｙｃ
ｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｏｃｙｓｔｓ　ｏ
ｒ’　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ、　Ｊ。 Ｂｉｏｌ、　ＣｈＱｒｆ＋、　２５１．３０２゜７３、
５ｔｏｔｉｓｈ、　Ｒ，Ｌ、、　Ｐｒｏｆｏｕｓ−Ｊｕ
ｉｃｈｅｌｋａ、　Ｉｌ、　ａｎｄ　Ｄｕｌｓｋｉ。 Ｐ、）１．　　（１９８５）、　　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ
　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
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、、　　Ｌａｎｇｅ、　　Ｓ、　　ａｎｄ　　ｔｌｏｌ
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ｔｉｎａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ　ｉｕｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ａ　ａｎｄ　ｐｒｏ
ｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ　ｃｈｏｌｅｒａ　ｉｎ　ｍ１ｃｅ、　Ｉｎｒ、　
１ｍｍ、　２１．１゜７５、　　Ｔｏｗｂｉｎ、　　Ｈ
，、■、　　５ｔａｅｈｅｌｉｎ　　ａｎｄ　　Ｊ、　
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−ｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｔｓ　ｔｏ　ｎ１ｔｒＯｃ
ｅｌｌｕｌＯ３ｅ　５ｈｅｅｔｓ：　Ｐｒｏｃｅ−ｄｕ
ｒｅ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、
　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　Ｉｉ：　４３５０゜ ７６、　　Ｕｌｌｒｉｃｈ、　　八、Ｊ、、　　５ｈｉ
ｎｅ、　　Ｊ、、　　Ｃｈｉｒｇｖｉｎ、　　Ｊ、、　
　Ｐｉｃｔｅｃ、　　Ｒ，。 Ｔｉ５ｃｈｅｒ、　Ｅ、、　Ｉｔｕｔｔｅｒ、　１４．
Ｊ、　ａｎｄ　Ｇｏｏｄｍａｎ、　Ｈ，Ｈ，（１９７７
）。 Ｒａｔ　１ｎｓｕｌｉｎ　ｇｅｎｅｓ：　Ｃｏｎ５ｔｒ
ｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄｓｃｏｎｔａｉｎ
ｉｎ（ｌ　ｔｈｅ　ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ
、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６゜１３１３゜ ７７、　　Ｖａｎ　　Ｄｃｕｓｃｎ、　　Ｉｔ、八、　
　ａｎｄ　　Ｗｈｅｔｓｔｏｎｅ、　　Ｃ，Ａ、　　（
１９８１）、　　Ｐｒａｃ−ｔｉｃａｌ　ａｓｐｅｃｔ
ｓ　ｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ
　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ａｓ
　　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　　ｒｅａｇｃｎｔｓ、　　
Ｐｒｏｃ、　　八ｍａｒ。 ＾ｓｓｎ、　　Ｖｅｔ、　　Ｌａｂ、　　ロｉａｇｎｏ
ｓｔ、　　２４．　２１１゜７８、　Ｖｉｅｒａ、　Ｊ
、　ａｎｄ　Ｈｅ５ｓｉｎａ、　Ｊ、　　（１９８２）
、　Ｔｈｅ　ｐＵｃｐｌａｓｍｉｄｓ、　ａｎ　Ｈ１３
＋＋ｐ７−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｉ
ｎｓｅｒｔｉｏｎｍｕｔａａｃｎｃｓ＊ｓ　ａｎａ　５
ｃｑｕｃｎｃｉｎｏ　ｗｉｔｈ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　
ｕｎｉｖｅｒ−ｓａｌ　　ｐｒｉｍｅｒｓ；　Ｇｅｎｅ
　１９．　２５９−２６８゜７９、　Ｗａｎｇ、　Ｃ，
Ｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏ
ｌｏｇｙ　ｏｒ　Ｃｏｃｃｉ−ｄｉａ、　Ｉｎ　Ｔｈｅ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｏｃｃｉｄｉａ、
　Ｌｏｎｇ、　Ｐ、Ｌ、。 ｃｄ、、　　（１９８２）、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　
Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。 ｎｏ、　　１６７−２２８゜ ８０、　Ｗａｎｇ、　ｃ、ｃ、　ａｎｄ　５ｔｏｔｉｓ
ｈ、　Ｉｔ、Ｌ、　　（１９７５）、　Ｃｈａｎｇｅｓ
　１ｎｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｏｃｙｓｔｓ　ｏｆＥｉｍ
ｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ　ｄｕｒｉｎｇ　５ｐｏｒｕ
ｌａｔｉｏｎ、　Ｊ、　Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ。 ２２（３）、　　４３８゜ ８１、　Ｗｉｓｈｅｒ、　Ｈ，ｔｌ、　　（１９８３）
、　５ｐｏｒｏｚｏｉｔｃ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　
Ｃｏｃｃ−ｉｄｉａ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、　５ｕｐｐ、　７Ａ、　Ａｂｓｔｒａｃ
ｔ００５９゜ ８２、　Ｗｏｎｇ、　Ｒ，Ｂ、　ａｎｄ　５ｃｈｅｎｋ
ｅ１．　Ｒ，１１，（ｔ９８４）、　Ｈｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｒ　
Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｃｎｅｌｌａ　ｓｐｏｒｏｚｏｉｔ
ｅａｎｔｉｇｅｎｓ、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　１８４
．４３　（６）、　１（ｉ３０゜８３、　ｗｒｒｇｈｔ
、　　１．Ｇ、、　Ｗｈｉｔｅ、　Ｆ４’＋　ｒｒａｃ
ｃｙ−ｐａｔｔｃ、　Ｐ、Ｄ、。 ＤＯｎａｌｄＳＯｎ、　Ｒ，Δ、　Ｇｏｏｄｇｅｒ、　
Ｂ、Ｖ　、、　Ｗａｌｔｉｓｂｕｈｌ、　Ｏ，Ｊ。 ａｎｄ　　Ｈａｈｏｎｅｙ、　　Ｄ、Ｆ、　　　（１９
８３）、　　Ｂａｂｅｓｉａ　　ｂｏｖｉｓ：　　ｌ５
ｏｌａ−ｔｉｏｎ　ｏｒ　ａ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　
ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌａｎｔｉｂｏｄｙ、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ
　ｌｍ１ｕｎｉｔｙ　４１．２４４゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、微小配列決定法により決定したＥ、ｔｅｎｅ
ｌｌａ　　（Ｔ　Ａ　４　）抗原の１７．０００ダルト
ンポリペプチドのアミノ酸配列である。第１図はまた種
々の化学的および酵素的消化により生成したｍ？Ｑベブ
ヂドも示している。図中、〉はペプチド配列は連続して
いるかもしれないが、追跡するには弱ずぎることを、）
はペプチドのＣ末端を示している。０はＤＮＡ配列によ
って確認された考えられるアミノ酸である。′は二次配
列を示す。 ＣＮはシアノゲンブロミドフラグメント、ＣＨはカイモ
トリブシンフラグメント、ＲはＡｒｇ−Ｃフラグメント
、■はｖ８フラグメント、ＰＡＲはピログルタメートア
ミノペプチダーゼ処理１７ｋｄ蛋白質である。 第２図は、ＴＡ４抗原をコードするＥ、ｔｅｎｅｌｌａ
ゲノムクローン１０８−１の制限酵素地図である。 第２図はまた、５　、５００　ｂｐ　　Ｅ、ｔｅｎｅｌ
ｌａＥＣＯＲＩ　　ＤＮＡフラグメント内のＴＡ４抗原
遺伝子の位置および方向性も示している。示されたＰｓ
ｔＩおよび３ａｉｌＩ部位は最も右側の部位であるが、
唯一の部位ではない、ＢａｍＨＩ、ＥＣ０ＲＶ、Ｎｒｕ
工、５ａｉＩ、Ｓｍａ　Ｉおよびｐｖｕ　工の部位はな
い。 第３図は、第２図に示したゲノムクローン１０８−１の
ＢＱｊ！Ｉ［−ＥＣＯＲＩ　　ＤＮＡ７ラグメントのＤ
ＮＡヌクレオチド配列である。さらに第３図には、シグ
ナルペプチドならびにＴＡ４抗原の１７，０００ダルト
ンおよびｓ、ｏｏｏダルトンポリペプチドのアミノ酸配
列も示す。第３図には、遺伝子内のイントロンも示す。 図中、傘は１７．０００ダルトンペプチドの最先アミノ
酸を、中本は１７，０００ダルトンペプチドの最終アミ
ノ酸を、＋は８．０００ダルトンペプチドの最先アミノ
酸を、＋＋はｓ、ｏｏｏダルトンペプチドのｎ終アミノ
酸を示す。不明確な塩基については、３゜４．５．６は
それぞれＣ，Ｔ、Ａ、Ｇと考えられるニア、８，９．０
はそれぞれ多分Ｃ，Ｔ、Ａ。 Ｇ；ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＪはＣまたはＡ
、ＫまたはＴまたはＧ、ＬはＴまたはＡ。 ＭはＣまたはＧを意味する。 第４図は、モノクロナール抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ１２と免
疫反応性を示す１７．０００ダルトンサブユニツトの出
現によって測定した、胞子形成時のＴＡ４抗原の出現を
示している。 第５図は、ＴＡ４ｒＪｉ白質をコードするＥ、ｔｅｎｅ
ｌｌａゲノムクローン１０８−１の１且ユ■−ＥｃｏＲ
Ｉ　　ＤＮＡフラグメントのＤＮＡ：ｉ（クレオチド配
列である。シグナルペプチドならびに胞子小体の膜中に
生じるＴＡ４抗原の１７．０００および８．０００ダル
トンポリペプチド成分のアミノ酸配列も示す。また、遺
伝子内のイントロンならびにハイブリダイゼーションに
よりｍＲＮＡを同定するために用いられる３ａｃＩ−Ｐ
ｖｕＩＩ　　ＤＮＡおよびＴＡ４蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡクローンも示す。図中の記号および不明確な塩基
の表示は第３図の場合と同じである。 第６図は、ＴＡ４遺伝子のゲノムクローンからの内部制
限フラグメントのハイブリダイゼーションにより測定し
た、胞子形成時におけるＴＡ４抗原ｍＲＮＡの出現を示
す。 第７図は、ＴＡ４抗原をコードするｃＤＮＡクローンｐ
ＴＣＤ２６のＤＮＡ配列を示す。 第８図は、発現ベクターｐＷ）−ＩＡ６３の構築、なら
びに発現ベクター１）ＤＥＴｌおよびｐＤＥＴ２を生成
するためのｃＤＮＡクローンｐＴＣＤ２６からのＤＮＡ
の発現ベクターｐＷＨＡ６３への挿入を図式的に示した
ものである。 第９図は、大腸菌の１−ｏｎ＋対１−ｏｎ−プロテアー
ゼ欠損株内でのｐＤＥＴ１／ｐＤＥＴ２蛋白質の産生を
示す、ｐＯＥＴｌおよび１ＥＴ２蛋白質の分析図である
。ＡはｐＤＥＴｌの染色ゲル法、ＢはｐＤＥＴｌの免疫
プロット法、ＣはｐＤＥＴ２の染色ゲル法により分析結
果である。 第１０図は、ｃＤＮＡ誘導抗原性ポリペブチ１：をコー
ドする配列の５′末端に１ａＣＺ遺伝子の３′末端を融
合した発現ベクターｐＢＧｃ２３の構築を図式的に示し
たものである。 第１１図は、大腸菌内でのｐＢＧＧ２３蛋白質の産生を
示す図である。ｐＢＧＣ蛋白質の、ｌよ染色ゲル法、Ｂ
は免疫プロット法による分析結果を示す。 第１２図は、ウシ　プロキモシン発現ベクター１）ＷＨ
Ａ９３の構築を図式的に示したものである。 第１３図は、ｃＤＮＡ誘導抗原性ポリペプチドをコード
する配列の５′末端に、ウシプロキモシンをコードする
配列の３′末端を融合させることによるｐｃＯｃ：１２
の構築を図式的に示したものである。第１３図には、ｐ
ｃＯｃｌ　２からのｐｃＯｃ２０の誘導も示す。 第１４図は、大腸菌内でのＥＣ０Ｃ１２およびｐＣＯＣ
２０蛋白質の産生を示す。Ａは染色ゲル法、Ｂは免疫プ
ロット法によるＰＣＯＣ１２蛋白質の、Ｃは染色ゲル法
によるＰＣＯＣ２０蛋白質の分析結果を示す。 第１５図は、ＴＡ４抗原および再正富化細菌ＴＡ４蛋白
質のモノクロナール抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４との免疫
反応性をＥＬ［ＳＡで測定した結果である。 第１６図は、ＮＡ４抗原をコードする Ｅ、　ｎｅｃａｔｒｉｘゲノムクローン７−４９の１Ｉ
ｉ１１限酵素地図、ならびにＮＡ４抗原の遺伝子の３９
００ｂｐＥ、ｎｅＣａｔｒｉＸ　　Ｅ　ＣＯＲＩ　　Ｄ
　Ｎ　Ａフラグメント内における位置および方向性を示
す。 第１７図は、第１６図に示したゲノムクローン７−４９
の２４４０ｍ基のＤＮＡヌクレオチド配列を示す。この
配列は、第１６図に示した全ＬＬｉ！！ｖｉ−１立１■
領域を包含する。また、Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘ　　Ｎ　
Ａ　４抗原について推測されるアミノ酸配列も示す。図
中、シトシン、チミン、アデニン、グアニンは、それぞ
れ確定的なものをＣ２Ｔ、Ａ、Ｇで、考えられるものを
３．４．５．６で、不明のものはＮで、ＣまたはＡはＪ
で、ＴまたはＡはしで表示した。率は１８．０００ダル
トンペプチドの最先アミノ酸と考えられるものを、本章
は１８，０００ダルトンペプチドの最終アミノ酸と考え
られるものを、＋は８．０００ダルトンペプチドの最先
アミノ酸と考えられるものを表示している。 第１８図は、ＴＡ４およびＮＡ４抗原門のアミノ酸配列
の相同性を示す図である。図中、本は相同Ｕ）７ミ／１
１を、＋ハＥ、ｔｅｎｅｌｌａ　Ａ　４抗原の１７゜Ｏ
ＯＯダルトンポリペプチド成分の最初を、９はＥ、　ｔ
Ｑｎｅｌ　ｌａ△４抗原の８．０００ダルトンボリベブ
ヂド成分の最初を表示している。ｃ−ｃｙｓ。 Ｈ＝Ｈｉｓ、ｌ−１１ｅ、Ｍ＝Ｍｅｔ、５＝Ｓｃｒ、Ｖ
−Ｖａｊ！、Ａ＝Ａｊ！ａ、Ｇ＝Ｇｊ！ｙ。 し−１ｅｕ、Ｐ＝Ｐｒｏ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｆ−Ｐｈｅ、Ｒ
−Ａｒｃ、　Ｙ−Ｔｙｒ、Ｗ＝ＴｒＤ。 Ｄ−ＡＳｐ、Ｎ＝Ａｓｎ、Ｂ−Ａｓｘ、Ｅ−Ｇｌｕ、Ｑ
−Ｇｉｎ、Ｚ＝Ｇｊ！ｘ、に＝Ｌｙｓである。Ｅ、ｔｅ
ｎｅｌｌａアミノ酸配列中のス代配列中Ｅ、ｔｃｎｃｌ
ｌａ配列に比べてＥ、　ｎｅｃａｔｒ＋ｘ配列中に付加
的アミノ酸があることを、Ｅ、　ｎｅｃａｔｒ＋Ｘアミ
ノ酸配列中のスペースは、Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ配列に比
べてＥ、ｎｅｃａｔｒｉｘ配列中にはそのアミノ酸がな
いことを示す。 第１９図は、それぞれＴＡ４およびＮＡ４抗原をコード
するＥ、　ｔｅｎｅｔ　ＩａおよびＥ、ｒｌｅＣａｔｒ
ｉＸ遺伝子内の３個ののイントロンの相同性を示す図で
ある。 図中、本は相同の塩基を示す。Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ　Ｄ
　Ｎ　Ａ配列中のスペースはＥ、　ｔｅｎｏｌ　Ｉａ配
列に比べてＥ９口ｅｃａｔｒｉＸ配列中に付加的塩基が
あることを、Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘ　　Ｄ　Ｎ　Ａ配列
中のスペースはＥ、ｔｅｎｅｌｌａ配列に比べてＥ、　
ｎｅＣａｔｒｉＸ配列中にそのアミノ酸がないことを示
す。不用確な塩基について、４は王とにえられる、７は
多分Ｃ，ＬはＴまたは八を表示する。 第２０図は、紺換えベクターＣ）ＳＭＡＣの構築を図式
的に示している。 第２１図は、組換えベクターｐＳＳ３３の構築を図式的
に示している。 第２２図は、組換えベクター１）ＮＣＤの構築を図式的
に示している。 第２３図は、発現ベクターｐＴＤｓ１　（Ａ）およびｐ
ＴＤｓ２　（Ｂ）の構築を図式的に示している。 第２４図は、発現ベクターｐＤＤｓ１　（△）およびｏ
ＤＤｓ２　（Ｂ）の構築を、図式的に示している。 Ｗｌ１ｗ＋＋＋冒１１１１１ ０１會＝−一、＋＋ｇｌ’ｌ＋ｔａｌ□ｗ　　＋　　ｒ
　　＋＋　　＋　　　　　＋ｖ＋　　Ｉ　　＋　　　　
　　Ｗ　　Ｉ　　Ｔ　　ｌ　　　　　　　　ｌｔｌ　　
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　　口　　ｕｕｈ第６図 肥子形瓜の峙聞 第９図 ＋　　　　　　９１１１ Ｗ３１１０／ρＤＥＴＩ ＴＭ６ ミ ＼　　　！ １ＡＩ３１１０／ｐＤＥＴＩ ＴＭ６ ｆｖＩＴＭ６／ｐＤＥＴＩ Ｆ？ＥＮ３／ｐＢＧＧ２３ 一一一一一□ 、−１１５Ｋｄ−・　・−１−・ −一□ 一− 第１４図 ↑ 西　　　　　。 臣 ｊ 令） （３発　明　者　パージニア　エム、ブラザ゛−ズ ［株］、発明　　者　　マイクル　ティー、マツキャマ
ン ［相］発　明　者　　ジェームス　ジー、フイルズ ０発　明　者　　ステイシイ　アール。 ジアス ０発　明　者　　アール、エム、ノードグレン ０発　明　者　　イー、エイ、ドラボンアメリカ合衆国
カリフォルニア州アルバニイ、ベラルタアベニュー　９
８Ｂ アメリカ合衆国カリフォルニア用サン　プルノ、テエリ
イアベニュー　７４６ アメリカ合衆国カリフォルニア州ベルモント、リヨン　
アベニュー　１９１１ アメリカ合衆国カリフォルニア用サン　アンセルモ、カ
ールンン　コート３７ アメリカ合衆国アイオワ州チャールズ　シティ、ルーク
ルルート　　１ アメリカ合衆国カリフォルニア州オリンダ、パーク　レ
ーン　ドライブ　４２ 手続補正書（睦） 昭和６２年１　月１３日

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. （１）￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ￥から誘導さ
   れる抗原性蛋白質、すなわち分子量約２５，０００ダル
   トンであつて、ジスルフィド結合により結合した２個の
   ポリペプチドから構成され、その一方のポリペプチドは
   分子量約１７，０００ダルトンでＮ末端アミノ酸が遮閉
   されていることを特徴として第５図に示すアミノ酸配列
   を有し、他方のポリペプチドは分子量約８，０００ダル
   トンで第５図に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコー
   ドし、第５図に示す核酸配列を有する単離ゲノムＤＮＡ
2. （２）分子量約２５，０００ダルトンで、第７図に示す
   連続アミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコード
   するｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子のような核酸分子
3. （３）分子量約２６，０００ダルトンで、ジスルフィド
   結合により結合した２個のポリペプチドから構成され、
   その一方のポリペプチドは分子量約１８，０００ダルト
   ンでＮ末端アミノ酸が遮閉されていることを特徴とし、
   他方のポリペプチドは分子量約８，０００ダルトンであ
   り、￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘ￥または￥Ｅ
   ｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ￥の感染に対する防御機
   構を付与する免疫応答を鶏に誘導することができる精製
   抗原性蛋白質
4. （４）分子量約２５，０００ダルトンで、第７図に示す
   アミノ酸配列を有する抗原性蛋白質
5. （５）分子量約２５，０００ダルトン未満で、第７図に
   示すアミノ酸配列内に包含されるアミノ酸配列を有する
   抗原性ポリペプチド
6. （６）第７図に示すアミノ酸配列およびその配列のアミ
   ノ末端における付加的アミノ酸配列から構成される抗原
   性ポリペプチド
7. （７）第７図のアミノ酸配列に包含されるアミノ酸配列
   および付加的アミノ酸配列から構成される抗原性ポリペ
   プチド
8. （８）第７図に示すアミノ酸配列およびその配列のアミ
   ノ末端におけるβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列か
   ら構成される分子量約１３５，０００ダルトンの抗原性
   ポリペプチド
9. （９）第７図に示すアミノ酸配列およびその配列のアミ
   ノ末端におけるプロキモシンのアミノ酸配列から構成さ
   れる分子量約６５，６００ダルトンの抗原性ポリペプチ
   ド
10. （１０）第７図に示すアミノ酸配列およびその配列のア
    ミノ末端におけるプロキモシンのアミノ酸配列から構成
    されるが、プロキモシンの天然配列から８３個のアミノ
    酸が欠失している分子量約５６，５００の抗原性ポリペ
    プチド
11. （１１）分子量約２６，０００未満で、特許請求の範囲
    第３項に記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるア
    ミノ酸配列を有し、￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉ
    ｘ￥および￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ￥の感染
    に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘導可能な
    抗原性ポリペプチド
12. （１２）分子量約２６，０００以上で、特許請求の範囲
    第３項に記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるア
    ミノ酸配列と付加的アミノ酸配列を有し、￥Ｅｉｍｅｒ
    ｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘ￥および￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔ
    ｅｎｅｌｌａ￥の感染に対する防御機構を付与する免疫
    応答を鶏に誘導可能な抗原性ポリペプチド
13. （１３）特許請求の範囲第３項に記載の蛋白質または特
    許請求の範囲第１２項もしくは第１３項に記載のポリペ
    プチドの類縁体である抗原性ポリペプチド
14. （１４）分子量約５５，０００ダルトンで、￥Ｅｉｌａ
    ｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ￥の感染に対する防御機構を付
    与する免疫応答を鶏に誘導することが可能な精製抗原性
    蛋白質
15. （１５）分子量約５５，０００ダルトン未満で、特許請
    求の範囲第１４項に記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包
    含されるアミノ酸配列を有し、 ￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ￥の感染に対する防御
    機構を付与する免疫応答を鶏に誘導可能な抗原性ポリペ
    プチド
16. （１６）特許請求の範囲第１５項に記載の抗原性ポリペ
    プチドから構成される￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ
    ￥の感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘
    導可能な抗原性ポリペプチド
17. （１７）分子量５５，０００ダルトン以上で、特許請求
    の範囲第１４項に記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含
    されるアミノ酸配列および付加的アミノ酸配列を有し、
    ￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ￥の感染に対する防御
    機構を付与する免疫応答を鶏に誘導可能な抗原性ポリペ
    プチド
18. （１８）特許請求の範囲第３項に記載の蛋白質の少なく
    とも部分をコードするｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子
    のような核酸分子
19. （１９）モノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５によつ
    て認識されるエピドープから構成される特許請求の範囲
    第１４項に記載の蛋白質をコードするｃＤＮＡ分子また
    はｍＲＮＡ分子のような核酸分子
20. （２０）特許請求の範囲第３項から第１７項までに記載
    のポリペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡ分子
21. （２１）特許請求の範囲第２項、第１８項、第１９項ま
    たは第２０項に記載のクローニングビークルＤＮＡおよ
    びｃＤＮＡから構成され、クローニングビークルＤＮＡ
    は第１および第２の制限酵素部位が存在することを特徴
    とし、ｃＤＮＡは上記部位中にクローン化される組換え
    クローニングビークル
22. （２２）特許請求の範囲第２１項に記載のクローニング
    ビークルを有する細菌宿主細胞
23. （２３）クローニングベクターＤＮＡおよび特許請求の
    範囲第１８項または第１９項に記載の核酸配列からなり
    、クローニングベクターＤＮＡは第１および第２の制限
    酵素部位が存在することを特徴とし、特許請求の範囲１
    ８項または第１９項に記載の核酸配列は上記部位中にク
    ローン化される組換え発現ベクター
24. （２４）適当な宿主内に導入した場合、融合ポリペプチ
    ドまたは蛋白質を発現可能な特許請求の範囲第２３項記
    載の組換え発現ベクター
25. （２５）適当なキャリアーＤＮＡおよび特許請求の範囲
    第１項または第２項に記載のＤＮＡからなり、適当な宿
    主内に導入した場合、抗原性蛋白質またはポリペプチド
    を発現可能な発現ベクター
26. （２６）特許請求の範囲第３項または第１４項に記載の
    蛋白質に対するモノクロナール抗体
27. （２７）特許請求の範囲第１５項に記載のポリペプチド
    に対するモノクロナール抗体
28. （２８）特許請求の範囲第２６項または第２７項に記載
    のモノクロナール抗体に対する抗イデイオタイプ抗体
29. （２９）特許請求の範囲第３項から第１７項までに記載
    のポリペプチドまたは蛋白質の１種または２種以上の免
    疫感作有効量を鶏に投与することを特徴とする￥Ｅｉｍ
    ｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ￥、￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅ
    ｃａｔｒｉｘ￥および／または￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａ
    ｘｉｍａ￥の感染に対する能動免疫を鶏に付与する方法
30. （３０）特許請求の範囲第３項から第１７項までに記載
    の蛋白質またはポリペプチドの１種または２種以上の免
    疫感作有効量と医薬的に許容される担体を１回用量とし
    た￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ￥、￥Ｅｉｍｅｒ
    ｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘ￥および／または￥Ｅｉｍｅｒ
    ｉａ　ｍａｘｉｍａ￥の感染に対する能動免疫を鶏に付
    与するワクチン
31. （３１）特許請求の範囲第３０項記載のワクチンの適当
    量を鶏に投与することを特徴とする￥Ｅｉｍｅｒｉａ　
    ｔｅｎｅｌｌａ￥、￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉ
    ｘ￥および／または￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ￥
    の感染から鶏を防御する方法
32. （３２）特許請求の範囲第２２項記載の宿主細胞をＤＮ
    Ａ発現およびポリペプチドまたは蛋白質の産生を可能に
    する適当な条件下に生育させ、生成したポリペプチドま
    たは蛋白質を適当な条件下に回収することを特徴とする
    抗原性ポリペプチドまたは蛋白質の製造方法
33. （３３）回収操作は、ａ）ポリペプチドまたは蛋白質の
    宿主細胞からの分離、ｂ）ポリペプチドまたは蛋白質の
    精製、ｃ）ポリペプチドまたは蛋白質の可溶化、ｄ）ポ
    リペプチドまたは蛋白質の再生、およびｅ）精製、可溶
    化、再生ポリペプチドまたは蛋白質の回収の各工程から
    なる特許請求の範囲第３２項記載の製造方法
34. （３４）ａ）￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘ￥の
    スポロシストをプロテアーゼ阻害剤の存在下、スポロシ
    スト膜蛋白質を可溶化させることができる適当な条件下
    に界面活性剤と接触させ、ｂ）可溶化されたスポロシス
    ト膜蛋白質から適当な還元条件下にポリペプチドを別個
    に回収することを特徴とする特許請求の範囲第３項に記
    載の１８，０００ダルトンポリペプチド成分を製造する
    方法
35. （３５）ａ）￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘ￥の
    スポロシストをプロテアーゼ阻害剤の存在下、スポロシ
    スト膜蛋白質を可溶化させることができる適当な非還元
    条件下に界面活性剤と接触させ、ｂ）可溶化されたスポ
    ロシスト膜蛋白質から適当な非還元条件下に蛋白質を別
    個に回収することを特徴とする特許請求の範囲第３項に
    記載の蛋白質を製造する方法
36. （３６）特許請求の範囲第３項および第１４項に記載の
    蛋白質またはポリペプチドを製造するにあたり、その蛋
    白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を製造
    し、ＤＮＡ分子を適当な発現ベクター中に挿入し、生成
    した発現ベクタ−を適当な宿主内にＤＮＡの発現、蛋白
    質またはポリペプチドの産生を可能にする適当な条件下
    に導入し、生成した蛋白質またはポリペプチドを回収す
    ることを特徴とする蛋白質またはポリペプチドの製造方
    法
37. （３７）特許請求の範囲第２２項に記載の宿主細胞を適
    当な条件下に生育させることを特徴とする￥Ｅｉｍｅｒ
    ｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘ￥、￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎ
    ｅｌｌａ￥または￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ￥の
    感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘導可
    能な蛋白質の製造方法
38. （３８）特許請求の範囲第３項に記載の蛋白質の少なく
    とも部分をコードし、第１７図に示す核酸配列の少なく
    とも部分からなるＤＮＡを得るにあたり、￥Ｅｉｍｒｉ
    ａ　ｎｅｃａｔｒｉｘ￥の卵母細胞から全ゲノムＤＮＡ
    を単離し、単離されたゲノムＤＮＡからＤＮＡフラグメ
    ントを調製し、調製されたフラグメントを適当なクロー
    ニングベクター中にリゲートし、得られたクローンのＤ
    ＮＡを第１７図に示した核酸配列内に存在し、適当なク
    ローンを同定するための核酸配列を含有するか、または
    それと相補性のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼー
    ションさせ、適当なクローンから蛋白質をコードし、第
    １７図に示した核酸配列を有するＤＮＡを単離すること
    を特徴とする方法
39. （３９）特許請求の範囲第１９項に記載のＤＮＡを得る
    にあたり、￥Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ￥の卵母細
    胞から全ゲノムＤＮＡを単離し、単離されたゲノムＤＮ
    ＡからＤＮＡフラグメントを調製し、調製されたフラグ
    メントを適当なクローンを同定するために存在する核酸
    配列を含有するか、またはそれと相補性のオリゴヌクレ
    オチドとのハイブリダイゼーションによりリゲートし、
    蛋白質をコードする適当なＤＮＡクローンから単離する
    ことを特徴とする方法
40. （４０）投与動物に￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥（アイメリア属
    ）抗原に対する抗体の産生を誘発するのに有効な量の任
    意の￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥抗原またはエピドープの混合物
    を医薬的に許容される担体とともに１回用量とした￥Ｅ
    ｉｍｅｒｉａ￥が原因となる疾患に対するワクチン
41. （４１）疾患はコクシジウム症である特許請求の範囲第
    ４０項記載のワクチン
42. （４２）￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥抗原は、￥Ｅ．ｔｅｎｅｌ
    ｌａ￥、￥Ｅ．ｍａｘｉｍａ￥、￥Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉ
    ｘ￥または他の任意の￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥の種の抗原で
    ある特許請求の範囲第４０項記載のワクチン
43. （４３）￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥抗原は、少なくとも１種の
    ￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥エピドープからなる１種または２種
    以上の遺伝子操作抗原性融合ポリペプチドである特許請
    求の範囲第４０項記載のワクチン
44. （４４）医薬的に許容される担体は免疫増強剤を含有す
    る特許請求の範囲第４０項記載のワクチン