JPS60500215A - 保護ペプチド抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 保穫ペプチド抗原 政府は保健及びヒーマンサービス省力・らのＮｎ５ＲＯ１−Ａｉ１７４２９−０ ３及ヒ省ノア際開発ａ２カラノ阻ｈ　ｒ　Ｄ　−Ｄ　Ｐ　Ｅ−０４５３−ｃ−０ ０−２００２−００の交付により支持さ扛た研冗にもとづ〈発明に権利を有する ものである。

この出願はアメリカ特許出願番号２３４，０９６の一部紅、視出願であり、ヌセ ンッパイク　アル、ニス、　、　（Ｎｕｓｓｅｎｚ−ｗｅｉｇ。

Ｒ，Ｓ、）ヌセンッパイク　グイ、　（ＩＪｕｓｓｅｎｚｖｙｅｉｇＶ、）、ゴ ドンン　エヌ、ジ、　（Ｇｏｄｓｏｎ　’Ｎ、Ｇ、）　により、１９８１年２ハ １２日に出願され、普通に譲よされ、現在許可されているっ発明の背景 本発明はワクチンを具体化するときにマラリアに対するｆｅｄ免疫を与えるのに 適した抗原の分野に関するものである。マツリャは非常に大きな経済的及び医学 的重要性を有し、全世界的に公衆保健の危険性を構成している。マツリャは本質 的には地方的な区域において幼児死亡率の一因となり、成年首でマツリャになや まされたこれらの人々には激しく衰弱さぜる病を８とに残している。双をムクさ せる技術の進歩２よび公衆保ｍ６置の改善にもかかわらず、その病気が地方的と 考えられる狽域は面積として増加しつつある。さらにマツリャ寄生虫の岩ｆ脱薬 剤にさする抵抗性のある菌株の発生のために世界の成る部分では寅眞的にみ染の 危険が１１７茄してきたのである。

マツリャの原因となる主体はプラスモディウム属、マラリャ原虫のグロトゾアン 、原生動物である。属のなかでの個々の徳は動物がマツリャに感染するのにある 限定された範囲の宿主を有す“るように思われる。たとえば、プラスモディウム 　バーヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇ−ｈθ１）やプラスモディム　ヨエリ（ｐ、ｙｏｅｌ ｉ）はＨａ類に感染し、グラスモディウム　ナウレシ（Ｐ、ｋｎｏｗｌｅｓｉ） やプラスモデイウＡ　シノモルギ（Ｐ、Ｃ７ｎ０ｍ０１ｇ１）は主にサルに感染 し、一方グラスモディウム　７アルシバリウム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）　 、　７’ラスモデイウ１５　ビバックス（Ｐ、ｖｉｖａｘ、）、プラスモディウ Ａオパレ（ｐ、ｏｖａｌｅ）　、プラスモディウ４　マラリャエ（Ｐ、ｍａｌａ −ｒｉａｅ）は主としてヒトに感染する種である。宿主範囲が異なる柚、属にも かかわらず、生活環、感染の方法９種々のプラスモディクム位の生化学及び遺伝 学は著しく類似ている。

マラリャ原虫丁なわらグラスモディウムの生活環は複碓であり、生物は若干の区 別できる形態学的変化を行い、肩乳類の宿主と媒介体の双に関係がある。寄生虫 はスポロゾイト形で、媒介体蚊の刺咬により、宿主の呻乳頓に導入される。スポ ロゾイト（胞子小体）は急速に血液の流れから消失し、つぎに肝臓　丈質性ＮＩ Ｂ胞の細胞内寄生虫として発見される。血故感染は複離な連続する形態学的及び 生化学的遍移の後にマツリャの公知の臨床症状により特徴があり、生じる寄生虫 は赤血球に発見され、そこで成長はつづけられる。寄生虫の不質的な量は感呆忠 首の赤血球から得ることができる。

マラリャ感呆に対する保繰免投を与えるためのワクチンの開発は寄生虫の生活環 が宿主の覗乳急のなかで王として細胞内でらるということによって邪魔されてき た。時間的に短い期間を除いて、寄生虫は免疫系との接触から保護されている。

免疫系に対し主として露出されるようになる間の寄生虫の生活環における２つの 段階は１）肝臓の細胞にスポロゾイトが成功的に侵入する前の次の最初の感染の 間隔及び２）メロゾイト（分裂小体）が赤血球に残され、未感染の赤血球に入る 間の間隔である。細胞外の環況でのメロフィト形の遷移的露出が、寄生虫の血液 形に対して宿主に免疫性を発生するために従来後前の試みに根拠を提供してきた 。ヨーロッパ特許出願公開公報６２９２４は寄生虫のメロフィト形に対して免疫 性を与えるワクチンの製造に有用な抗原性蛋白を開示しているっそのようなワク チンの有用性は恐らく確立されたマツリャ感染の経過を抑え、制限することにな るであろう。

スポロゾイト抗原に基礎をおく択一的な方法は最初の感染に対してワクチンとし て投薬されるときに保護免疫性を与える舵力のあるスポロゾイトの抗原性および 免疫性蛋白の発見にみちびいた。カックラン、エイ、エチ、（ＯＯ’Ｃｈｒａｎ ｅ、Ａ、Ｈ，）等は、マクリヤ４３誉（ジエ、クレイヤ、秦果）アカデミプレス 　ニューヨーク（１９８０）１６３−２０２頁：ヌッセンッバイク、アル、ニス （Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、Ｒ，Ｓ、）　ヒト及び動物の血液寄生虫に対する免 疫性（エル、ミラー、ジエ、ピノ及びジエ、マツケルペイ、編集）ブレニウム（ Ｐｌｅｎｕｍ）、　二：”−、ヨーク（１９７７）７５−８７頁、ヨーク　アル 、ダプリュ、　（（）ｗａｄｚ、Ｒ，Ｗ、）らの国際法８！愼閑報舌＋１４ｉｆ ｆｉ　（Ｂｕｌｌ、Ｗ、Ｈ，Ｏ，５ｕｐｐ１．）　１　、５７　、１６５頁（１ ９７９）；クリデ、デエ、エフ、（ｃｌｙａｅ、：ｏ−Ｆ、）、等のＡｍ、Ｊ、 ＴｒＯｐ、Ｍｅｄ、ａｎｄ　Ｈｙｇ、２４，３９７頁（１９７５）；マツカシ　 グイ（Ｍｃｃａｒｔｈｙ、ｖ、）等の実鋏寄生虫学（ＫＸＰ、Ｐａｒａ−ｓｉｔ ｏｌ、）４１　１６７頁（１９７７）。

これらの蛋白は各マラリャ原虫椋にとって抗原的に区別し得るものであるが、ク ロマトグラフ挙動２筈電点、電気泳動移動度を含む多くの構造的性質を有してい る。スポロゾイト抗原は分子量にして約４０，０００ダルトンから７０．ｃｊｏ ｏダルトンの範囲で、低い等世点を有している。サントロ　エフ等、Ｊ　、Ｂ１ １１　Ｃ’ｈｅｍ、２５８３３４１　．１９８３　。

異なったプラスモデイウム種の純砕化されたスポロゾイト抗原蛋白のトリプシン 消化物の比較は若干のトリプシンのペプチドが逆相高性能液相クロマトグラフに おいて同一な保時時間を有することを示しことなった種の抗原性蛋白のあいだで 高度の一致があることを示している。

スポロシト抗原はスポロゾイト表面膜の成分である。スポロゾイト抗り、の存在 は周囲スポロゾイト（Ｃｌｒｃｕｍ８ｐＯｒＯ２Ｏ１ｔ８　）反応として刈られ ている特徴ある免疫反応によって示され、免疫螢光検丘法により確められた。ヴ アンデルペルグ、ジエ、ビ０等のＭｉｌ、Ｍｅａ、（Ｓｕｐｐｌ、）１３４．１ １８３（１９６９）；及びナルディン、イ、ら　ネチャ（ｎａｔｕｒｅ　）２７ ４．５５（１９７８）を見よ。

これらの反応は、生体内試験での時間−消費にたよらないで与えられたプラスモ デイウム独がスポロゾイト抗原を特異的に夜却できるようにした。このことはス プロゾイト抗原が特異的な放射性同位元紫漂誠免疫沃定法の発達で可能となり、 究極的にはマツリャ抗体の製造のためにプラスモデイウムイエのスプロゾイト抗 原に対して回けられてきた。

スポロゾイト抗原に対する抗体は醤ｒｉ１類、サル及びヒトの志願省から得られ る。スプロゾイト保護抗原蛋白はここではａＳ蛋白。

周曲スポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｒｏｚｏｉｔｅ　）蛋白、又はスポロゾイ トＯ８蛋白とよばれ、これらの術語は均等と思われる。共同−懸案のアメリカ出 願番号２３４０９６は１９８１年２月１２日に出願されているが純粋にされたａ Ｓ蛋申に基づいたワクチンを開示して提出されている。上記出願は（ここで付録 Ａとして、添付の印刷：２Ｊ）充分に説明のため参照してここに挿入される。

ここに開示された結果は免疫学の分野の技術と概念にもとづいている。便宜的に 、通常の技術分野で使用されている術語をここで定義している。「免疫化学反応 」とは測定方法を無視して抗原とその相当する抗体とのあいだに生起する特異的 な相互作用を意味するのに用いている。そのような反応は１つ又はそれ以上の抗 原分子に対して、１つ又はそれ以上の抗体分子の非−共有結合的な頑合によって 特徴づけられている。免疫化学反応は公知の多種類の完投検定法によって検印す ることかできる。［免疫抗原性の（ｉｍｍｕｎｏｇθ−ｎｉｃ）Ｊ又は［抗原性 の（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　）Ｊとはその物質が抗体製造の導出のため、公印の条 件の下で適当な動物実験に投薬されるときにその物質に特異的な免疫反応的な抗 体製造を例数するだめの与えられた物質の能力を記述するのに用いられるであろ う。「保護抗原（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）Ｊなる術語は与えら れた病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）に対して、適当な宿主に抵抗性を与えるために 与えられた免役抗原の能力を示す。「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）Ｊなる術語 は抗原上の場所に結合する特異性の抗体を示す。蛋白のような巨大分子抗原は特 異悴をもって結合するを殊な抗体をもついくつかのエピトープを代表的に有して いるう同一の抗原の異なるエピドーグは高度の特殊性により単一なエピトープに 対して向けられているので、単クローン抗体の助けをもって区別するどとができ る。

同一の抗原の上の異なったエピトープに対して向けられた２つの異なった単クロ ーン抗体は、一つの結合が・西の結合を立体的に妨害するようにエピトープが接 近しないかぎり、１徂のものに干渉することなしに抗原に結合できるのである５ 　［免疫変性部分（ｉｍｍｕｎｏａａ−ｍｉｎａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ）Ｊなる術 語は主にその抗原性に応答可能な抗原分子の地域を意味するものである。

−エピトープの繰返しからなる単一な免疫変性部分を有するという発見にもとづ いている。プラスモディウム　ナクレシ（Ｐ、ｋｎｏｗ：Ｌｅｓｉ）にとって、 エピトープは、ドデカペプチドであることが示されてきた。その連頭はａＳ蛋白 の構造の内に幾度か繰返しされている。、繰返しペプチドは単量体形又は二世体 形の両方とも化学的に合成されてきた。合ｉｎ返しペプチドはピ、ナウレシに対 して多クローン抗体製造に対して免疫化学的に反応性である。さらに、ａＳ蛋白 に対するすべての単クローン抗体は生体内でスポロゾイトの感染性を無効するも のであるが、また合成ペプチドと反応する。それ故に、合成繰返しペプチドはビ 、ナウレシの自然に発生するスポロゾイト保護抗原によって示さるすべての免役 抗原性活性を不質的に構成している。

プラスモデイウム楓のＯ８蛋白は、ヒト、サル及び協囚類に、謳架するが侮造的 に同じであるということかいくつかの証拠により示されている。すべては同じ繰 返しエピトープからなる免疫凝性部分を有している。各種属について、スポロゾ イトＯ８蛋白の繰返しペプチドか合成されるっａＳ蛋白の繰返しペプチドは一つ の組成のなかに施薬されるときに免疫原性でるり、施薬方法により抗体製造をも たらす技術において公印である。ことに記述した技術と発見の根拠についてはあ るプラスモディム種のスポロゾイトに相当する呟返しペプチドの合成及び構造決 定は、そして、上記ペプチドに取り入れられるワクチン組成物の製法及び上記種 属に対する保護免役性の引き出し可能は当業者にとって現在オリ用可能である。

さらにａＳ蛋白の密接な関連性のさらの確認として、異なったプラス干ディウム 種ビ、ナウレシ　スポロゾイトに対する単クローン抗体は、ヒトに感染する種、 ピ、ファルシバリウム抗原とダメ反応することが示されてきた。それ故にヒトの マツリャ種に関しさらに特異的に反応する１己の合成ペプチドは当業苔の手のと どく範囲におり次にこれについて詳しく説明するっ発明の詳細な説明 次の説明において使用された原料は１氾に特記しないかぎり商菓的に入手できる 。クローン製造に使用された酵素類は商業的源から人手された。抑制エンドヌク レアーゼ反応は央造苔の（目示により行われた。佃に特記しないかぎり、西の酵 素反応の反応条件はたとえば＃素手の方法（ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ）６０＠（アル。

ウー（Ｒ，Ｗｕ）歯采）　アカデミイク　プレス（１９８０）に記載されたよう にこの分野で使用されている標準な条件で行ったっ圏に特記しないかぎり、ここ での省略はここに引用したように、結果を発表するためにこの分野の当莱百か普 通に使用しているもので、科学雑誌での発表においても認められている標準的な 省略である。

一般的砥説として、得られた実験と結論が説明されている。スポロゾイト抗原蛋 白に対するデオキシリポ核９（ＤＮＡ　）断片遺伝暗号を無性的に増殖さぜる（ 　ｃｌｏｎｅ　）ために行われた方法は感染した奴より得たｍＲＮＡからつくら れるｃ’ＤＮＡを無性的に増殖することであった５　ｃＤＮＡ方法はイントロン （土ｎｔｒｏｎ　）を含んでいるプラスモディウム遺伝子（ｇｅｎｏｍｉｃ）Ｄ ＮＡがどぅが刈られてなかったので、それは、抗原性的に同一化し得るスポロゾ イト蛋白の表現をさまたげるかもしれないが、最初のクローン研究にはこのまし かったつエピトープの短い、繰返しの性質が公」であること　遺伝子プラスモデ ィウムＤＮＡのライブラリ（１ｉｂｒａｒｙ）からエピトープをＤＮＡ遺＝ｉ号 に対して迅訳することは実行可能である。最初の実験は感染双のｍＲＮＡがらＣ ＤＮＡをもって行われた。というのはその段階ではただプラスモディウムがスポ ロゾイト抗原を表現すると知られていたからである５　ｃＤＮＡライブラリはビ 、ナウレシ感染蚊から誘導されたポ！ｊ（Ａ）　ＲＮＡがら構成された。二Ｍ鎖 （！　Ｄ　Ｎ　Ａはポリｃ−残基をつないでいるが、プレスミドｐＢＲ３２２に 挿入され、前のＰｓｔ　１で切断されポリ０でつないでいるっテトラサイクリン 抵抗性に対する形質転換する宿主細胞が５択され、形質転換細胞の単−集洛（ｃ ｏ１０ｎ７　）は、−７０’Ｃ，でマイクロタイター（ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ） 皿に貯蔵された。

ｃＤＮＡクローンは、スポロゾイトＯ８蛋白の免役化学的に反応部分を含むとこ ろの蛋白を表現させるためにその能力が検討された。スポロゾイト抗原のｃＤＮ Ａ遺伝暗号は同一化されると、１己のものは容易に　試料（ｐｒｏｂｅ　）とし て、最初に無性的に増殖させたｃＤＮＡを使用して交雑により検印することがで きた。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ又は遺伝子ＤＮＡライブラリのいずれかから６導されたク ローンはこの方法で異なったプラスモデイウム桓のスポロゾイト抗原のＤＮＡセ グメントａ伝暗号間の一致にもとづいて同一化することができた。

免役活性蛋白を表現するクローンの同一化（１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は 、クローンｃＤＮＡをもって上のように形質転換した細胞の果落の溶解産物（１ ７Ｓａｔｅ）を検討することにより行った。４８集壱のプール（ｐｏｏｌ）は敏 感な２つの場所での放射性同位元素標識免疫検定法を使用して単クローン抗体に ついて検討された。このことは形質転換細胞に２けるａＳＳ自白検知を可能とし た。

要するに、ビ、ノウレジａＳ蛋白に対する単クローン抗体はマイクロタイクー板 のウェル（ｗｅｌｌ）に吸着された。４８果石のプールからの溶解産物は、各ウ ェルに加えられ、充分な時間にわたって、溶解産物中に存在する免疫反応は蛋白 が吸着された単クローン抗体に結合させるために＝９された。ウェルはそこであ る汚架蛋白をとりのぞくため洗浄され、ビ、ナウレシａＳ蛋白に同位元素で標識 した第２の単クローン抗体が加えられた。標識された第２の単クローン抗体は第 １の単クローン抗体によりマイクロタイターウェルの光面にすでに結合している 抗原性蛋白に接臆さぜる。もし４８集浴のプールがポジティブであることがわか るとその集洛は同じ方法で個々に検査された。この方法においてボジテブなりロ ーンは同一化された。

免役反応性クローンが＋ｐＬ昶される時にはいつもプラスミドＤＮＡかそれから 遊離され、イ、コリ（］Ｄ、ｃｏ１１）　Ｈ’３　１　’ＯＩ又は、イ。

コリＲＲＩのように氾の宿主ね胞ｌ体を形質転換するのに使用された。テトラサ イクリン抵抗性によって検印される、被形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ 　）はその表現が、ａＳヌクレオチド遅填を含んでいるプラスミドＤＮＡクロー ンの性質を確認するために免疫化学的に反応性蛋白を表現する側力について再検 討された。適当なプラスミドのＤＮＡがポジディプなり口・−ンから得られると 、すくなくとも免疫反応性の部分のＣＥＩ蛋白のｃＤＮＡ挿入遣休暗号体ヌクレ オチド連鎖がＭ１３の上に無性的に増殖（ｃｌｏｎｉｎｇ）によって得られた。

ヌクレオチドＭＳ分析の方法はマキシム及びギルバート（ｍａｘａｍ　ａｎｄ　 Ｇ１１ｂｅｒｔ）の方法Ｗ、ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ７４，５６０（１９７７）及びサンガー（Ｓａｎｇｅｒ。

Ｆ、ｅｔ　ａＪらの方法である。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ７４．５４６３（１９７７）、ｉ首の方法を本研究は用いた。免役化学的に反 応性場所を含むビ、ナウレシシＣ８！白遺仏子の断片の完全なヌクレオチド連鎖 は第１図に示した。

ヌクレオチド連鎖のゑ３くべ１特徴はそれが繰返しされたものであるということ である。ビ、ナウレシにおいて連鎖は３６の塩基の対のｍＭしからなり、そのう ちの８の完全な単位は、いずれの端で部分的単位と共に一つのクローン（２４− 量体）を表現していた。

Ｉ）　Ｎ　Ａによりアミノ酸連鎖遺伝暗号を導きだすために遺伝暗号類をそして 、頭のなかで正しい読みの骨ｍ（ｒｅａａｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を同一化するこ とは必要なことであった。この情況でサンガーとコールソンの前述の連鎖方法を 使用する使；ｆすさは明らかになった。連鎖媒介体（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｖｅ ｃｔｏｒ）のバクテリオファージＭ１３ｍｐＰｓｔｌＱ（ｉをもつ　ベータガラ クトシダーゼ遺式子を言んでいる。

読み骨組は公印である末７端化反応（ｔａｉ’ｌｉｎｇ　ｒｅｏｃｔｉｏｎ　） の間に加えられるデオキシＣ−残基の数を導きだすことができ、連鎖媒介体はａ Ｓ蛋白の免疫化学的に反応性部分からなるベーターガラクトシダーゼ１８合蛋白 を表現できる。それ故２つの異ったＭ１３ｍｐ９の組換型が対間配位に挿入され た３６８ｂｐビ、ナクレシＤＮＡ破片を得た。２つの組換型のうちの１つは、上 述した同位元素標識免役検定法により測定され、免疫化学的に反応性のベータガ ラクトシダーゼ融合蛋白を製造したつ免役反応性蛋白を製造するクローンは、ピ 、ナクレシ遺伝子破片の遺伝暗号類と転写の方間を同一化するのに用いた。

正しい読み骨組はまた免疫学方法を用いて導びかれた。これらは単クローン抗体 により定義されるエピトープがエラスターゼによって破壊されるが、しかしトリ プシンによっても、還元ハ１」によっても破壊されず、エピトープかりシン、ア ルギニン又は二蛇化吻結合を含まず、だがアラニン残基を含むことを示している 。

そのような実験の根拠により１２のアミノ酸を含んでいる繰返しペプチドのアミ ノ酸部クリはＨＥＮ−（）Ｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　ＡｓｐＧ１７　Ａｌ ａ　ＡＳｎ　Ａｌａ　（［ｙ　Ｇ’ｉｎ　Ｐｒｏ−ｃｏｏＨであるように拙論さ れた。

その推論されたアミノ酸配り１ｊと上述配列の免疫化学的反応性を錐痣するため に同じアミノ酸配グＩＪのドデカペプチドとその２重体が自Ｇ同相ペプチド合成 システムを使用して合成された。

単量体及び２友体の合成ペプチドは最初にＱＤＮＡライブラリを調査するのに使 用したように同じ型の同恒元素標戚免投恢定法にお、いて兎没化学的油性度を別 々に試験した。この試験で２つの抗体結合位置は抗原のなかに存在しなければな らない。第１の単クローンに対する結合の第１はマイクロタイターウェルに結合 し、頑合の第２は、加えられた標識化抗体に結合する。単量体のベブ笑ドが標識 化抗体に結合しないとはいえ２量体のペプチドは反応性であり、２量体は２つの 完全、またほぼ完全な抗体結合位置を含むことを示している。さらに、同じ検定 法は、単量体が第１の単りローン抗体′？：持つマイクロタイターウェルに対し てピ、ナウレシのｃｓ膜蛋白結合を特異的に妨げ、完全にすることができること を示した。したがって、上に示された配列はスポロゾイト抗原のエピトープを含 んでいる。そのほかの重要な覗祭は照射されたスポロゾイトによって免役された サルから得られたすべての多クローン抗体と同様にその日付で得られたピ、ナウ レシに対するすべての単クローン抗体は合成ペプチドと反応することであった。

＄実、スポロゾイトに対して７０チ以上の抗体は免疫されたサルの皿ｔｇのなか に見いだされ、これは率−のエピトープと認められている。（ザバラ、Ｚａｖａ ｌａ　。

ａｔ　ａｌ、Ｊ、ＫＸＰ、Ｍｅｄ、１５７：１９４７　１９８３）。

それ故化学的に合成されたスポロゾイト膜蛋白のなかに繰返し配列と同一のアミ ノ酸配列を持つドデカペプチドは自然に発生するＯ８蛋白の抗原性のすべてを本 質的に含んでいる。免疫学の原則にもとづき、当業者にとって公仰である次の技 術と方法にもとづき、スポロゾイトＯ８蛋白の公知のアミノ改配タリにもとづく 合逗ペプチドはペプチドの配グリが訪導されるものからプラスモデイクム桓に対 して影響を受けやすい値上生物に保護免役性を与えることのできるワクチン組成 にとり入れることができる３次の実験は一般的に記述樵のスポロゾイトａｓ蛋白 の間での本質的な構造および機能的類似性を示している。これらの類似性はとく にヒトに対して感染するこ成及び同一化に利用できる。あるプラスモデイウム種 の繰返しペプチドの合成及び構造決定はここに記載された方法によって行うこと ができ、または公印の等価の方法によって、または最初の実速の顕雅な説明と時 間−節約のために本発明の教示及び開示を利用する公知の技術により行うことが できろう異なったプラスチックム揮のａＳ蛋白に対する単クローン抗体の間で交 差（ｃｒｏθ６）反応性がｄｉされたことは重要なことである。たとえば、ピ、 ナウレシのａＳａＳ蛋白と又差反応し、ビ、シノモルギのａＳ蛋白に対する抗体 はりエンシス（ｎｉｇθｒ１θｎ５ｉｓ）のＣＥ３蛋白に対する抗体はビ、バし ては後右の極のスポロゾイトの感染性を完全に無効にする。（ｎｅ−ｕｔｒａｌ ｉｚθ） 付加的、免疫化学的根拠はすべてのスポロゾイトＯ８蛋白が削るザバラ等の年− 兜役筺性部分及び繰返しエピトープを持つこと証明し引用されてきた。同じスポ ロゾイトＯ８蛋白に対してむけられた若干の異なった単クローン抗体の結合は１ つのものが１己のものに関して有することのできる抑制効果を測足し試験された 。抗原のなかの異なった配グ１ｊに対して向けられた単クローン抗体はそれぞれ の結合能力と干渉しないでろろう。もしも逆に単クローンが同じエピトープまた は地形図的に密接するエピトープに対して向けられているならば彼等は互に抑制 する。ビ、ナウレシの場合には使用された６つの単クローンのすべては、抗原に 対して他のものとの結合を強力に抑制したつ に対する単クローンを用いて実施され、同じ結果を得た。それ故にこれらのすべ てのスポロゾイトＯ８蛋白が単一の免疫凝性部分を有することは特徴的である。

廁され、保麺されるヒトの血清のなかの抗体はスポロゾイトａｓ蛋白の同じ免疫 浸住部分に回けられているという仮察である。同じ楓のスポロゾイト抗原に対し てひけられた年−の単クローン抗体によるいずれかの種のスポロゾイトの＠抽出 物のη１■処理はほとんど完全に前掲サバラ等の予防接種されたヒトβ万有の血 清から遊離されたポリクローン抗体に対してスポロゾイト抽出物のなかの抗原の 後の側合を完全に抑制した。

ａＳ蛋白の免疫没性部分が禰返しエピトープを含むという事災は同相での２つの 位置での同但元素標識免役検定法によって説明さした。その検定法において単ク ローン抗体がマイクロタイターウェルのグラスチック表面に顔会し、抗原が■見 られ、その抗原が固定された抗体に発見された。そのウェルはそこである未枯合 物質を除去するために洗浄され、おそらく同じ抗原の異なったエピトープに対し て向けられている第２の単クローン抗体が茄見られた。第２の抗体は第２の抗体 の結合を計測するためラジオアイソトープによって標識をつけられた。第２の抗 体の結合はウェルのなかで結合した抗原の量に比例する。この免授検定法はただ もし抗原がすくなくとも２つのエピトープを含むならば実施可能である。第１の エピトープは板のプラスチックに固定化された抗体に結合する。第２のエピトー プはラジオアイソトープにより標識された抗体にえ合するう唐〈ことにはすべて のａＳ蛋白の場合において２つの位置での同位元素標識免疫検定法は単一の単ク ローン抗体を使用して実施することかできた。その検定法は第１の単クローンと してｍｄｔしない単クローン抗体Ａを使用し、そして、第２の単クローンとして 同じ単クローン抗体Ａを使用して実施することができた。この結果はスポロシイ １−ａｓ膜蛋がすくなくとも２つの同一のエピトープを持つことを説明している 。

対照実験はその結果がスポロゾイト抗原蛋白の凝集によって人造産物を生じなか ったことを示した。ピ、ナウレシスポロゾイトの抽出物は２．０％（Ｗ／Ｖ　） 、ドデシル硫敵ナトリウムと６Ｍの尿累のなかに溶解され、潔、糖勾配中で超遠 心分離により分別された。

２つのエピトープの存在はａＳ蛋白単量体の大きさに相当する分子１ｃ４０，０ ００の蛋白を含む勾配の画分のなかに示された。さらにＣも同じ結果が得られた 。

すべてのスポロゾイトＯ８蛋白が蛋白のなかで多回繰返されたペプチドからなる 単一の免役脆性部分を待つことは明白でおる。繰返しペプチドはエピトープを含 み、各スポロゾイトＯ８蛋白はそのように１祐返しペプチドのエピトープの複数 から構成されている。これらのエピトープはヒトを含むすべての動物種に対して 非常に兜反注があるう与えられたスポロゾイトＯ８蛋白のエピトープを含む合成 ペプチドは自然に生ずるスポロゾイト抗原に対して同°じ分子に関し２つのエピ トープを要求する。）２つの位置の同位元素顔識免疫検定法の自明な例外として 機能的に同一である２つの位置での検定法における機能的挙動は楳返しペプチド の合成２蛍体によって再生産される。

単景体形または多量体形におけるスポロゾイトＯ８蛋白のエピトープに相当する アミノ酸配タリからなる合成ペプチドは、たとえばビ、ファルシパリクム、ビ、 ビバックス及びビ、マツリャエのマツリャ寄生虫のスポロゾイトに対して保護免 疫を誘起する可能性のあるワクチンにくみこむことができる。そのような繰返し ペプチドの抗原性を高めるための技術は多量体構造へのくみこみを含み、高度に 免役原蛋白運搬体に結合し、たとえばキーボール　リンベットヘモシアニン（ｋ ｅｙｈｏｌｓ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）又はジフテリア毒素及び 感染応答のある旧の増大又は佐剤との組み合せにおける施楽である。さらに、複 数のプラスモディウム段階及び棟の特異性のペプチドは、多願値のワクチンを与 えるために同じワクチン組成にくみこみできる。つけ加えて、ワクチン組成はマ ツリャに追加して個の病気に対し免疫性を与える抗原を含み得ることは理解され る。

アミノ酸配列はａＳ蛋白（繰返しペプチド）のエピトープに相当して合成化学的 方法で得られるが、または珊養薗または遺伝的に変性された政生物を含む生物学 的源がら純粋にして得られる。繰返しペプチドは圏の蛋白の断片を含ｔｒ他のペ プチドと共にアミノ敵配タリのなかに結合することができ、たとえば２合蛋白と して合成されるときに合成的または生物学的起原の他の遺伝的または非遺伝的ペ プチドに結合している。ｒｃｓ蛋白のエピトープに相当する」という術語は、成 る場合には自然に生起する上返しペプチドのアミノ酸配夕１」の変化が抗原性で あり、マンリヤスポロゾイト感染に対して保護免疫性を与えるという実際上の可 能性を含むことと理解されるであろう。可能な配グリの変化は、限定なしにアミ ノ酸の置換、延長、削除、挿入及びそれらの結合を含んでいるっぞのような変化 は本発明の範囲内にあり、本発明はアミノ酸を含むペプチドがワクチンとして投 薬されるときに保護免疫性を与えるに充分な程度に、ａＳ蛋白の非−変形繰返し ペプチド又は自然に生起するａＳ蛋白とそのようなペプチドが交差反応すること により引きだされ抗原及び抗体であることを提供するっそのようなワクチン組成 は、生物学的に受け入れられる媒体と結合されるであろう。投薬の方法、抗原服 用量、注射の数と頻度は当粟者にとっては籍に不活性化のスポロゾイトの注射に よる保護免疫性を与えるために分野の経験があるという事実の観点においてすべ て最適化の問題である。スポロゾイトｍ染に対して免疫性を与えるだめの原則的 な意味はマツリャに前もってさらされなかった個人にとってたとえば特定の地方 又はそれにつぐ特定の地方に住む幼児、子供または特定地方を旅行するマツリャ にさらされてない成人でめるだろうというととは予想し得る。また幼児のだめの 一時的免役性は妊Ｈ期間千の母親の免疫性により得られるということも予想され る。以下詳訓に本発明の実施例について説明する。

実施例１ スポロゾイト抗原蛋白をＣＤＮＡクローン遺伝暗号でぶ定すること組換型デオキ シリポ該醒（Ｄ　Ｎ　Ａ　）科学技術は酵素触媒反応を広汎に使用している。不 発明で実際に使用された純粋な酵素は最近開業的に入手でき、これらの酵素及び 試薬が他に特記しないかぎり使用された。限定エンドヌクレアーゼ、その命名及 び位置の明記はロバ−ツウアル、ジエ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｒ，、ｒ）のＮｕｃｌ 、Ａｃ１ｄｓＲｅｖ８．６３頁（１９８’０年）に詳しく述べられている。この 研兄に使用された限定酵素は各酵素のために製造によって明記された反応条件の 下でそして量で使用された。

約１０００のど、ナウレシ（Ｐ、Ｋｎｏｗｌｅｓｉ）感染した成長蚊はコーチラ ン等（Ｃｏｃｈｒａｎｅ　ｅｔａｌ、　）のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａａ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ７９：５６５１−５６５５頁の記載により集められ、養われたも のであり、詳細な吟味が完結されるまで氷に貯蔵された。

ｂｉａ部断片を得るためにとり入れられ、詳細に吟味された。ＲＮＡはシーブル グ、ピ、エッチら（Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ）：の細胞（ＣｏＩ２ ）１２巻１５７頁（１９７７年）、及びチャーウィン、ジエ、エムら（Ｃｈｉｒ ｇｗｉｎ、Ｊ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ）；生化学（Ｂｉｒｃｈ−ｅｍｉｓｔｒｙ）２ ４巻、５２９４頁（１９７９年）にて記載されたように実質的に胸部から製造さ 扛た。ｆｆｉ蛾は５Ｍのグアニジン　チオシアナートの１０ゴ、ｐＨ５，０，ｌ ０ｍＭのエチレンジアミンテトラ訃酸（ＥＤＴＡ）及び０．１Ｍの２−メルカプ トエタノールのなかですべての組成が分散されるまで均一化された。浴液は１０ 分間、１０，０００甲で遠心分離された。上澄液は２％（Ｗ／Ｖ　）のすｙコシ ル（ＳａｒｋＯｓ７１）（Ｆｍａ　＋アイシェヌ　ハルマツティカルス、プレイ ンビニ。ニューヨーク、工ＯＮ　ＰｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＰｌａｉｎｖｉ ｅｗ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｌｃ）　で調整され、２分間６５℃で２１１Ｏ熱された。

塩化セシウムはそこで加えられ（ｏ、　１ｇ　／ｍｌ　Ｂ　液）及び生じた浴液 は５Ｗ４１（ｉ標　ペックマン　インストルーメンツ、）／Ｌ′ルトン　カリフ ・Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｔｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　ＦｕｌｌｅｒｔＯｎＣａｌｉｆ、 ）　ニトロセルローズ管のなかで１　ｏｍＭのＥＤＴＡに半姥４０塩化セシウム の２彪緩衝液でノｖ状に分離した５２０℃で約２０時間、２８，００（ｌｒＦで 遠心分離した。ＲＮＡベレットは５ｍＶのＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ　）のサ ルコサイルと５％（ｗ／ｖ）Ｑ）２−メルカプトエタノールに俗解され、クロロ ホルムとフェノールによって抽出され、エタノールにより沈澱さぜた。通常、０ ．５−１ｍ９のＲ１（Ａ′ｂ″−組、誠のＩ当り得られた。ＲＮＡはそこでオリ ゴ（ａＴ）−セルローズ　カラム（Ａｖｉｖ、Ｈ，ｅｔａ’ｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６９　１４０ｇ（１９７２））の上に通過させポリアデニレー トの分画を増大させた。ＲＮＡは蚊の胸部からリュ　シ。

ピ１等（Ｌｉｕ、Ｏ，Ｐ、ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ７６４５０３頁　１９７９年）によりの変形された方法により製造することがで きる。この方法によれば、組織は４Ｍのグアニジン　チオイソシアナートの８− １０　ｖｏｗとｐＨ５−Ｑ（氷酢哉によって）０．１Ｍの２−メルカプトエタノ ールのなかで組織が分散されるまで均一化された。３分間、９０００ｒｌ”’で 遠心分離され、上澄奴は５Ｗ４１のニトロセルローズ管のなかで０．１０Ｍ　Ｅ ＤＴＡ（ＰＨ６，５）の５．７Ｍの塩化セシウムの０．２　ｖｏｌで層に分けら れ、２０℃、１６−２０時間、３５，０００甲で遠心分離した。豹０．５−１■ のＲＮＡがｉ域のｇ当り得られた。ボ！Ｊ（Ａ）＋ＲＮＡは上述したように送択 されたオリゴ−ａＴであった。記述したように遊離されたｍＲＮＡの拭科は小麦 麦芽から製造された転す系を使用して生体外（試訣管内で）で転移された。（ロ バーツ、ビ、イ、（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｂ、に、）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｕ　ＳＡ　、　７０　、２３３０頁’（’１９７３年）弐荻管内の秘伝 によって製造された蛋白は実施例　２に記載したように免疫沈澱した。択一的に ゴールドマン、ビ、エム、及びプロベル、ジ、（Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｂ、Ｍ　ａｎ ｄ　Ｂｌｏｂｅｌ、Ｇ、）Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７５　５０６６頁（１９７８年）、ヨシダ等に より記述されたように５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル（ｓＤＳ−Ｐａｇｅ） で分別した。（Ｊ、Ｂｘｐ、Ｍｅａ１５４　１２２５頁（１９８１年））、及び 文献としてここにとり入れられたアメリカ特許用Ｆｊｂｋ１２３４　、０９６の 実施例２にて分別した。ＣＳ−蛋白のための配列遺伝暗号を含んでいる！ｌｌＲ ＮＡはこの方法によって同一化できる。

製造のためのｃＤＮＡ合既に１べてのポリアデニレートのｍＲＨＡ（約２０μ、 ９）が１０μｌ’６’ｉＡの１ｍＭメチル水銀（以下ＭｅＨｇとする）（アルド リイチ　ケミカル　ミルオーキ、ヴイスコンシン）により室温で５分向処理され たつその処理は９．５％（０５μＩｔ　ｐｅｒ１００μｌ）の未希釈のβ−メル カプトエタノールを添加することにより停止され、５分間、室温で培養した。メ チル水Ｍ（Ｍｅｌｌｇ）で処理されたポリアデニレートのｍＲＮＡは５０ｍＭの トリス−ＭＣＩ、　ｐＨ８，３、１０７７１ＭのＭｇＯ１２，２０ｍＭのＫＯＩ 、５ｍＭのジチオスレイト−７１／（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ’ｌ）２ｙｒ Ｍの各ｄ−アデノシン３リン敵（ＬＡＴＰ、ｄシチジン３リンばａａＴｐ、ａ− グアノシン３リン改ｄＧＴＰ、ｄ−チミジン３リン藏ｄＴＴＰ、５０μＣ１の” ｐａｃＴｐ（比ｒ５ａ度、　８００　”７ｍ、ｍｏｌ）、　４μＪのオリゴ（ａ ｔ）１２−１８（共同研究所、ワルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）マサチュセツツ（Ｍ ａｓｓａｃｈｕＳｅｔｔｓ　））　５　ＡＩのＲＮａｅｓｉｎ（バイオチク、マ ジソン、ビスコンシン（３丁０ＴＥＯＨ，Ｍａｄｉｓｏｎ。

Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　）及び約２００単位の逆性トランスフェラ−ゼ（ｒｅｖｅ ｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を含むＢｅａｒｄ、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、 。

ｓｔ　Ｐｅｔｅｒｅｆｕｒｇ、Ｆｉｌａ、）、反応２００μｌのなかで培養した 。

培養は４２℃で６０分間であった。

その反応は石炭酸及びクロロホルム（１：１）による抽出により停止された。そ こでクロロホルムの等量をもって、エタノールにより沈澱させた。エタノール沈 澱物は５０μｌの１０７７１Ｍのトリス−ＨＣｌ、１７１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８ のなかに溶解した。七ノ・デクスＧ−７５０カラム（商標、ハルマシア　インコ ボレーション　ウプサラ　スエーデン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｔ　ｎｃ　、 　、　Ｕｐａｓａｌａ　、　Ｓｗｅａｅｎ）で１ゴのフルコン　プラスティク　 ピペット（西銀、フルコン　プラスティクス　オクスナルド　力リホルニア（Ｆ ａｌｃｏｎ、Ｐ’１ａｓｔ−ｉｃｓ、０ｘｎａｒｄ、Ｃａ１ｉｆＯｒｎｉａ）） 　のなかで１０μｌＭトリスーＭｏｌ、ｐＨ７，４及びランニング緩衝液として １ｍ１ｄのＫＤＴＡを使用して分別した。取り隙かれてない　３２Ｐカウントの リーディングビークの約３００μｊが集められた。

０．３ＭのＮａＯＨと１ｍＭのＥＤＴＡで調量され、室温で、−夜間培養シた。

つづいて５Ｍの酢叡ナトリウムｐＨ３，８で中浦化し、ＨＥのｐＨを６．０にし て、エタノールで沈澱させた。第２のＤＮＡ頌は前に記載したように３００μＭ の各のｄ−アデノシン３リン鐵（（ＩＡＴＰ）、（１−シチジン３リン酸（ａａ Ｔ：ｐ）、ａ−グアノシン３リン眩（ａＧＴＰ）、チミジン３リン酸（ｄＴＴＰ ）、１２５μＣ１の３２ｐ　ａ　ＯＴ　ｐ　（８００ｃｉ／ｍｍｏ１ｅ）と５０ 単位逆性トランスクリプターゼ　の同じ緩衝液を含む５０μｌの反応により合成 した。培養は３７℃で、９０分間行った３反応生底物は石炭酸／クロロホルムで 抽出された。上述したようにセファデクスＧ−７５刀ラムを通過させた。取り除 いた３２ＰのピークはＳ、ヌクレアーゼで処理して処置の前にエタノールで沈澱 させた。

セファデクスＧ−７５による分別の後に第２のｃＤＮＡｇの合成は５０ｍＭのト リス−ＨＣｌ　、　ｐＩ（８，０、７ｍ？！のＭｇＯ１２と１ｍＭのジチオスレ イトールの存在においてＤＮＡポリメラーゼ１（ボエリンガーマンハイム（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）　の断片 を使用することで完結された。反応混合物は１５℃で、４時間、培養されたつ石 炭酸−クロロホルム（ｌ：ｌ）で抽出し、上述したようにエタノールで沈澱させ た。

二重鎖のｃＤＮＡは２４μｌの０．３ｙ＋＋Ｍの塩化ナトリウム、３０ｍＭの酢 酸ナトリウム　ｐＨが４．５で３ｍＭの塩化亜鉛のなかで４１℃で、５分間、Ｓ １ヌクレアーゼ（ボエリンゲルーマーンハイム。

インデアナポリス、インデアナ）の３００単位をもって培養した。

反応は１０ＨＭのＦｉＤＴＡを添加して停止させ、トリス塩基で中相化された。

　３２Ｐ−でｂＸ　戚したＣＤＮＡは１ｒＬｌのフルコン　プラスチック　ピペ ットの中につくられたセファローズｃＬ　−４Ｂ　＜　藺標。

ハラマシア　インコポレーション　ウプサラ　スエーデン）のカラムを用いて大 きさを分別し、０．３Ｍの塩化ナトリウム、１０μｌＭのトリス−ＨＣｌ　、　 ｐＨ８，０、１ｆｉＭのＥＤＴＡからの緩衝液を追刀口した。撞々の犬ぎさの級 別さられた２重　瑣のＣＤＮＡはエタノールによって沈讃さぜた。仔うしの胸腺 のターミナル　トランスフェラーゼ（エンソハイオケミカル　インコーポレーシ ョン、ニューヨーク、ニューヨーク）を使用して１００μｌ容債のなかで１分間 、３７℃で、１００ｍλ（Ｋのカコジ／Ｉ／叡塩、　ｐＨ７−６、ｌ　７ＨＭの 塩化コバルト、０．１１１ＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのｄｃ！ＴＰ、４μＣ１の３ Ｈ−ａＯＴＰ　、（２４ａ１／ｍｍｏ１ｅ）及び約２０単位のターミナル　トラ ンスフェラーゼ／μｍのａｓ　−ｃＤＮＡを含んだ緩衝液中で末端処理した。反 応は０．５Ｍの塩化ナトリウム、１０μｌＭのＫＤＴＡの溶液を調整して停止さ せた。、６５℃で５分間培養した。１−５マイクログラムの酵母＋ＲＮＡかクロ ロホルム二石炭酸による伸出前に加えられ、皿回エタノールにより沈澱さ？た。

末端処理反応は一般にＲｏｙｃｈｏｕｃＬｈｕｒｙ、Ｒ，笠によって記載されて いる。　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、３　１０１（１９７６）５択一的方法としてランド、エ ッチ等によって記載された。（Ｌａｎｄ、Ｈ，、ｅｔａ’ｌ　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ａｓ、Ｒｅｓ、９　２２５１頁　１９８１年）、約１７の１Ａｚ＝がこれ らの条件の下に３一端に加えられた。プラスミドｐＢＲ３２２はＰｓｔ　１エン ドヌクレアーゼにより開裂され、ｄＧ！１５．基で末端処理されたものが開業的 な源にューイングランド　スクレア、ボストンマサチューセッツ）から得られた 。ａＣ末端処理されたｃＤＮＡとｄＧ末端処理されたｐＢＲ３２２の等モル量は ＝１２℃、３０℃。

１４℃と、連続的２時間、培養し、１重ｇ／筋の一及でアニールされた。バイブ リド　プラスミドＤＮＡはエタノールでｆＪ７６された。

アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉ’１１ｉｎ　）抵抗性に対してイーコリＲＲＩ細胞 （Ｆｆ、ｃｏｌｉ　ＲＲＩ　ｃｅｌｌｓ　）を形質変換に使用したつ単クローン のライブラリが発生し、マイクロタイター皿に一７０℃で訂蔵した。

沢−開方法によれば１５−３０デオキシｃ−ｉ基がｃＤＮＡに加えられたのらに ｄＧ−末端処理したｐ　ＢＨ３２２の等モル濃度でアニーリングが行われた（２ ５０ｎｇのＶｅｃｔｏｒ／ゴにて）。アニーリング低合物は５分間、６８℃で、 ２時間、４２℃で培養された。つづいて、２時間ゆっくりと室温に冷却した。バ イブリドのプラスミドＤＮＡはダゲルトエム等（Ｄａｇｅｒｔ　Ｍ、ｅｔａｌ、 Ｇｅｎｅ６．２３頁　１９７９年）によって記載されたようにテトラサイクリン −抵抗性（ｔｅｔ−ｒｅｓｉＢｔａｎｃｅ）に対してイ、コリＲＲ”　細胞に形 質変換するのに用いれた。ライブラリが発生し、−７０℃でマイクロタイター皿 のなかで１５％のグリセリンをもってルリアスープイｍ（Ｌｕｒｉａ　ｆｒｏｔ ｈ）のなかに蘭々のクローンとして貯威したつ ３００−２０００ｂＰのｃＤＮＡ断片のライブラリはスプロゾイト表面抗原蛋白 の免役化学問反応部分に含まれる蛋白を表現する果洛のために検五された。、４ ８果済は叫別的にベトリー皿の上でＳ−球入培養基（３２Ｆ／リツトルのトリプ トン、５ｇ／リットルの塩化ナトリウム、２０ｊ；／／リットルの酵母抽出”５ １．１５ｇ／リットルのデフコ（Ｄｉｆｃｏ）寒天培養基、０．２９／）ツｌ− ／しの水酸化ナトリウム、及び２０ダ／リットルのテトラサイクリン）生長さぎ た。

七の板は２Ｍの０．０５Ｍのトリス−ＭＣＩ　、ｐＨ７，５でＱ、５ダの卵白リ ソチーム（シグマ（ｓｔｇｍａ、）セント　ルイス、Ｍｏ）でめふれさせた。１ ５ｄのポリプロピレン賃（フイシャ　サイエンチフィ７サプライ）のなかに殺凶 スパテユシでもってけずりとった。３０分間、工温で培養したのら、６０分間水 冷ａ上で９５条のエタノールとドライアイス（−８０℃）で３回椿かすことをつ づけた。さらに１０分間３７℃に培養し、粗細胞抽出物は、ＤＮＡ５ｅ　１　（ ｌａ夕／−）、４ｍＭのＪ：Ａ化刀ルシウム、４ｍＭの塩化マグネシウムでもっ て室温、３０分間、処理し、将来の使用のために一７０’Ｃで好酸した。

クローン抗体を使用して同位元素標識免疫検定法により判別横置した。この方法 において、マイクロタイター皿のウェルに吸看された抗−Ｐ、六つレシの単クロ ーン抗体は細胞溶解産物のなかに存在する純粋な免疫反応性蛋白に対する類似に 使用された。免疫反応性蛋白を含有する溶解並物は洗浄されたマイクロタイター のウェルで第て検印した。これを行なうために、マイクロタイター板は４°Ｃで 仇坏（５０Ｍｇ／疵）で被復され、全体にわたり、ｌチ（Ｗ／’Ｖ）のＢｓＡ− ＊塩訂液でもって洗浄し、５０　ｔｌｌの細胞抽出でもって４℃、４〜１７時間 、培養した。洗浄ののら、第２の１２５１−標識したビ、ノウレジ単クローン抗 体か各ウェルに加えられ、２時間、室温で、培養された。洗浄されたウェルはそ こで放射性の活性を個別的に試験された。プールの４８集卒がポジティブでめる と見出されたときにプールにつくり上げられた最初の早−の巣浴は１画々に検査 さ石、免疫性クローンは同一化され、遊離され、遺伝的に、泥枠にされた。

プラスミドＤＮＡは！Ｉｒ！、疫反応・註クローン（グラスミドｐＥＧ８１）を 含む１リツトルの細胞から純粋にされた。そのｈ”Ｊ　Ｉｊｅｌは３７℃でルリ ア　スープ権のなかで約５ｘｌＯ／ｍＪ当りの練胞に対して１５Ｍｇ／祷のテト ラサイクリンをもって生長させ、プラスミドＤＮＡはクロラムフェニコールの１ ７５μｊ９／ＴＬＡを加えろことにより増幅させ、−夜間、培養した。（りＶウ ェル及びヘリンスキ（ａ１θｗｅｌｌａｎｄ　Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ）　Ｊ　、　Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、１１０　１１３５頁（１９７２年））プラスミドＤ　Ｎ　Ａ はドデシ／ｌ／硫散ナトリウム（Ｓｐｓ）３用いたｉ曲胞から抽出された。（グ ドソンとバフネク（Ｇｏｄｅｏｎ　ａｎａ　Ｖａｐｎａｋ）、Ｂｉｏｃｈｉｍ、 ＢｉｏｐｈｙＩｌ］、Ａｃｔａ２９９．５１６頁（１９７３年）） ５−２０％（ｗ／ｖ）蔗抛密度勾配を用いて純粋にされた。このことは５００− １０００μｙのプラスミドＲＦＩＤＮＡを生じた。

このもののｌμｇはテトラサイクリン抵抗性に対する他のイ、コリー細Ｉ＠（Ｈ ＢＩＯｌ）を形質変換するために用いられ、免疫反応性蛋白を社現する能力が再 検丘された。

ｐＥＧ８１　ＤＮＡはＴ、ＤＮＡリガーゼをもってしばられているＰｓｔ　”拘 束工／ドヌクレアーゼでもってＱ、５μｇのｐｓｔ　１　ｃｕｔのｃｌｏｎｉｎ ｇ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｍ　１３　ｍｐ　９に対してｌ：１ モル比で１′日化し、す／ガーのジデオキシ須末端方法を用いて配列しくサンガ ー及びクールソン　前掲）、［ユニバーサル（ｕｎｉ−ｖｅｒｓａｌ）」　合成 プライマー５’−ｄ　［ＧＴＡＡＡＡＣ！ＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ：］　−３’（ ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｅ、から購入し た。）免役反応性位置を含んだピ、ナクレシａＳ蛋白遺伝子のこの断片の完全な ヌクレオチド配列は第１図に示す。

ビ、ｆレシイＤＮＡのｐＥ（）８１断片の期待しえない態碌は全外的に３６の塩 基の対の繰返しく８光全早位プラスいずれの木胸に部分的単位）から成っている 。ヌクレオチド配列の遺伝暗号類と正しい読み骨組は次のごとくであるっ （ａｉＭ１３ｍｐ９β−ガラクトシダーゼ遺伝子及びｐＢＲ３２２アムビシリナ ーゼ遺体子のＰｆ］ｔ１の開裂位置の読み骨組は（５’ＩＣ！Ｔａ　ｃ　Ａ　Ｇ ｘ　ｘ　３’　）に同じでおることが苅られているうＭｅｔ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　 丁１ｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａ’ｌａ　ＡｌａＧ：Ｌ７　Ｍ１３ ｍｐ９　ＡＴＧ　ＡＯＯＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　０ＯＡＡ、（）ＣＧＯＴ　（ ）ＣＡ　（）ＧＴ　Ｐｓｔ　１開裂位置元素諒識免疫検定法により測定するよう にして免役反応性β−ガラクトシダーゼ融合蛋白（Ｍｌ　３ｍｐ　９／ｐｘｌ　 １　）を製造した。他のクローンは作られないっしたがって、Ｍ１３ｍｐ　’Ｊ ／ＰＫＩＩの配夕１ｊはＤＮＡの遺伝暗号類と同一化された。

（ｂ＋　読み骨組はまたａｃ１７残基はベータ　ガル遣ム子（β−ｇａ１ｇｅｎ ｅ）とビ、ノウレジ遺体子断片との間に挿入されるいう事実からひきだされた。

（Ｃ）１つの可丁氾な院み骨組はアラニン豊１のペプチドをｉ色暗号で（ｉ定し た。アラニンをおそらく含むエビドーグはアラニン残基でペプチドを面裂するこ とが知られているう豚のエラスターゼとともに真正なピ、ノウレスａＳ衣面蛋白 乞処理″′ｆることにより形質変換した。（パワース、ジエ、シ　等　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　、Ａｃｔａ。

４８５　１５６−１６６（１９７７）。０．００２単位の豚のエラスターゼ（Ｗ ｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｅｎｚｙｍｅｓ以下に）をもって、１０６のスポロゾイ トの抽出物の培養はトリス−援倒淑の９．０５Ｍ、ｐＨ８，６のなかで６０分間 、３７℃で行われ、”ＡＭ例４に記姦したように２つの位置の同位元素標識免役 検討法により決定された単クローン抗体をもってＣＳ蛋白の反応性を完全に停止 した。エラスターゼによるＯ８蛋白の不活性化は合成抑′１ｆ１１−子００（！ −Ａｌａ　、Ａｌａ　Ｐｒ。

Ａｌａ　（パワース青　前田）によって転換さぎた。

他の可能なＷｅみ骨組は柚々の理由で除去されたペプチドを遺伝暗号で３ｅ足し た。彼等は非常に疎水性であり、仮等は若干のシスチン、リジン及びアルギニン の残基を含んでいる。そのようなアミノ峨残基の不在はエピトープがＣＳ蛋白の 完全還元の後トリプシンに抵抗性があるの玄実駁において示すことにより決定さ れてさた。３０分間、３７℃で、Ｔ　Ｐ　ＯＫ　−）リプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎ ｇｔｏｎ　Ｅｎｚ−ｙｍｅｓ、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｏｙ）の１ ■と共に同じスポロゾイトａ出物の他の部分標本を培養し、つづいて完全還元及 びアルキル化が行われ、Ｃ８蛋白は単クローン抗体と充分に反応した。

誘導されたアミノ酸配夕ｕ（１２のアミノ酸識返し）はつぎのような正しい読み 骨組でヌクレオチド配タリの翻訳にもとづいている。

Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇ１７−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａ（３ｎ−Ａｌａ −Ｇ１３’−〇１ｎ−Ｐｒｏ　（すべての配夕１」はオ端の最も近くにある左の 上のＮＨ，−末端基から右の末端の最も近くにるる一〇〇ＯＨ末端基にまで衣わ されている。ビ、ノウレジ蛋白の免疫反応性蛋白はそれ故１２のアミノ叡■返し に言まｎるっ 前のアミノば配列が免疫反応性の場所ン含んでいることを確めるためにドデカペ プチド（上に示したようなアミノ戚の同じ順序をもっている）とドデカペプチド の２量体が同相樹脂合成を使用して甘酸された。（マーグリン、エッチ、アンド 　メリフィールド　アル、ビ（’Ｍａｒｇｌｉｎ、Ｈ，ａｎａ　ｕｅｒｒｉｆｌ ｅｌａ、Ｒ，Ｂ、、）　Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、３９　８４］−８６６（１９７０）。

自動化エドマン分解法により行われた配タリの分析はそのペプチドが正しく合成 されていることを確認した。これが正しいエピコートでるるという最終証明が得 られた。ウサギは媒介体（牛のガンマグロブリンで完全７０イトス佐ＭＩＪ（ｂ ｏｖｉｎｅ　ｇａｍｍａ　ｇｌｏｂｕｌｉｎｉｎ　ＣＯｍｐｌ、ｅｔｅ　Ｆｒｅ ｕｎｄ日　ａａ、１Ｉｕｖａｎｔ）に結合するドデカペプチドにより免役された つ注射後２週間、ウサギはｂｌｅａＬ、血清はスポロゾイトの抽出物に灼してド デカペプチドに抗体の存在を検査された。その結果寄生虫抽出物のなかに生れつ きのＣ８蛋白に対する抗体の１：ｌ０００以上の旨いタイターを生ずる動吻か存 在していることを示した。

一度、免疫化学的に反応性のある蛋白を表現するクローンが同一化されたら、挿 入ｃ　Ｄ　Ｍ　Ａ７配列は他のプラスモデイム種からスズロゾイト抗原蛋白の遺 伝暗号のｃＤＮＡを同一化するために祿α形式試料として使用することかできる 。またｃＤＮＡクローンはたとえばメロゾイトから得られたプラスモデイム遺伝 子ＤＮＡな沃食するのに使用でき、スプロゾイト抗原蛋白の遺伝暗号ＤＮＡ配列 を検査するためである。したがってスポロゾイト仇Ｐ、又はその断片の遺情暗号 の第１のｃＤＮＡ配タリか無性的に増殖されると他の、１童のｃＤＮＡの後の遊 離及び梢衾はかなり簡単になる。

実施例　２ 特異性抗原のための単クローン間の競合抗原分子の明白な区域に結合する単クロ ーン抗体は互に干渉しない。一方に２いて、単クローン抗体は同−又は位相規何 学的に関係するエピトープ又は抗原決定群に回けられ、谷の他の宿性を妨害する 。かくして抗原分子の抗原決定話地図をつくること可能である。

半クローン抗体と反応するＯ８蛋白の多数のエピトープは、仄のようにし１行わ れる同位元素ゐ識免役＠定法により決定された。

により記載された感染蚊の凄液ｊ以から桔製された１、スポロゾイトは１０７厄 の濃度で虐酸塩援伽食虐水（５ａｔｉｎθ）ＰＢＳのなかに懸ン濁した。超音波 処理（１００ｗ　３分間）をうけた。さらにＰＢＳに２０回希釈する。そこで） 臀濁液の５０μｌはファルコｙｌ”３９１Ｊのマイクロタイター板（Ｆａｌｃｏ ｎ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ　０ｘｎａｒ４．（！ａｌ−ｉｆｏｒｎｉａで製造された ）にとりあげられた。これらは４℃で一夜間培養した：１ＰＢＳで洗浄した。ウ ェルは注意してＴｗｅｅｎ−２０（商ｊ　アトラス　ヨーロボール　エスビエイ 　チルナート　イタリー　Ａｔ１ａｓ　ｇｕｒｏｐｏ：ｔ　ＳｐＡ、Ｔｅｒｎａ ｔｅ　Ｔｔａｌｙ）の０．０５％Ｖ／Ｖでもって洗浄し、ＰＢＳを含んだ０，５ ％Ｗ　／　Ｖの牛の血清アルブミｙ（ＢｓＡ）のなかでグラスチックの疎水性の 位置を飽浦さぜるために瑞養したつ Ｂ）＃−クローン抗体の製法 阜クローン抗体はヨシダＲ（前出）及びＰＯｔＯＣｎｊａｋ、Ｐ、。

ＲＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５１　１５０４（１９８０）に記載されたようにして 異なったｄのスポロゾイトに対して養った。抗体はマウスの腹水液体から４４ク ロマトグラフ法（イオン１保クロマトグラフ及びσ代はセハンテクスＧ２００） によりバイブリドマス（ｈ７ｂ−ｒｉａｏｍａｓ）によって注射して遊離された 。抗体の純粋化には５ＤＳ−ＰＡＧＥにより確められ、抗体は１２５１　をもっ てｒｏａｏｇ−ｅｎ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆ ｏｒｄ　丁１１）を使用して、去造側の縮図により同位元素で諒識した。比活性 度は１Ｏ−３ｘｌＯ（！ｐｍ　ｐｅｒ　ｔｔ＆　Ｎ白の間を変化した。

Ｃ）早クローン抗体のγ比定 マイクロタイター板のウェルの底の抗原場所に飽４日単りローン抗体の最小一度 は次のようにして決定された。ＰＢＳ−ＢＳＡのなかの希釈した同位元素標識の 単クローン抗体の一定４ｉ（０，５ｎｇ　）を含む管に対して冷抗体の量を増加 させて加え一定の全容量に保持させた。同じカウント数を含み、しかし異なった 抗体の濃度を含む裡々の眠合物の３０μｌの部分標本は、特異性抗原をもって創 もって被覆されたマイクロタイター板の悶々のウェルの底に放出した。

１時間、室温で培養したのちにウェルはＰＢＳ−ＢｓＡで洗汐され、体の最大濃 度は単クローン抗体の飽、ｆｌＩう全を聚わしている。

された。単クローン抗体は山■出した文献に記載されたように決定された謙量で 飽涌され、　１で標識された。交差−滴定（ｃｒｏｓｓｔｉｔｒａｔｉ○ｎ）は 各今年クローン抗体のどれか同相抗原に対しである他の標識した単クローン抗体 の結合を妨害するかを決定するために行われた。

−れんの抗原−言んだウェルに刈して、ＰＢＳ−ＢＳＡのなかに希釈した柚々の 今年クローンの異った一度の５０μノが加えれた。

板は１時間、室温で培養された。そこで５０μノの１つの同位元素で標識した単 クローン（たとえば２Ｇ３）の２匿の飽・…一度は丁べてのウェルに加えられた 。１時間追加して培養したのちにウェルは洗捗され計数された。抗原に結合する 性別な計測数は飽４０線蛍の１０ｆ！５度で冷２Ｇ３の存在で２０３をもって培 養したウェルのなかに結合した計測数を差し引いて飽’ＦＱＪ量で２０３のみで 培養したウェルに結合する蛍として計５さ・れたっ均一な冷抗体によって妨害す ることのできないところの計鑓は非特異的結合を表わす。これらの数から他の単 クローン抗体によって２０３の結合の耐暑百分率が計算された５衣１に滴定が示 されているっ丁べての単クローン抗体はビ、ナウレシに対して互に強く阻害し、 密に関連して又は同一のエピトープに結合しなければならないことを示している のが理解で７２リヤエとピ、ヘル４工は示されてないが単クローン抗体の特異性 を研究するために同一化の方法が行われた。全般的結果はすべてのｃｓｇ白にお ける簡単な免役す性部分があることを示している。

実施例　３ であったっそのことはマイクロタイター板のウェルがスポロゾイトの徂袈物の超 音反処理した抽出物で核仮された。Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄され、ＰＢＳ−ＢＳ Ａで飽イＩされた。ユコーなスポロゾイト檀に対する多クローン抗体のＰＢＳ− ＢＢＡにおける運就布択で製造され部分標本の３０μｌがｉ面々のマイクロタイ ターのウェルの低に放ｆｆｌされた。ウェルからなる河照（ｃｏｎｔｒｏｌ）は 、関連のない抗原に（３３） 対して多クローンの抗体の希釈ｆ６　ｊＹｊで培１した。室温で４時間の培女後 、ウェルは洗浄された。ウェルにおける抗体の存在は第２の抗体（１２５１−標 識され、親和性−純粋化された）をもって適切な槙の免役グロブリンに対して検 １した。例えばヒトの多クローン抗体の場合において美へ２の抗体は５０μｌ（ μｇ／ゴ）の親７田性−純枠化されたウサギの抗−ヒト免役グロブリン（ａｎｔ ｉ−ｈｕｍａｎ　Ｔｇ）からなる。ウサギの抗体は多特異注でヒトのカッ・＜、 ガンマ及びミュ頌と反応しマウスの免役グロブリンで前吸収された。この吸収は 以下記載される抑制分析検定法に使用されるマウスの単クローン抗体をもって成 長試薬の干渉を防ぐために必要である。サルの多クローン抗体が使用された時に は成長試薬は同じように七てサルの免役グロブリンに対してウサギの抗血清から 製造された。

Ｂ、羊クローン抗体による多クローン抗体の結合の抑制スポロゾイトａ出物をも って′ａ覆したウニ〃は、はじめ細枠にされた単クロール抗体と共にａｓ−ｉ白 の、−ａ返しエピトープに対して飽和線−の決定に対しては実施例２を参照し飽 Ｑ水準にて培養した。室直で１時間の坩誉故に、多クローン抗体の希釈浴液が加 えられ、検定が上述したように行われた。抑制定量法は次の系において実施され た。

１、　ビ、ナウレシスボロゾイトはＸ−照射ピナクレシスボロゾイトに対して、 サルの抗血（Ｉと反応さ「て抽出した。抑制単クローン抗体２　Ｇ　３　’（Ｃ ｏｃｈｒａｎｅ、Ａ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒ０ｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ。

−感朶蚊の刺収により独痘したヒトの血清と反応さぜ抽出させた。

仰制因子単クローン抗体２Ｆ２．ナールデン等（ＮａｒｄｉＪＢ、Ｈ。

ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｆ：ｘｐ、Ｍｅａ、１５６：２０（１９８２））。

した。抑制因子率クローン抗体２　Ａ　１０．　（Ｎａｒｄｉｎ、Ｅ、Ｈ，ｅｔ 　ａｌ。

前掲） これらの夜定法の代衣的な結果は第２図に示すっすべての場合、単クローン抗体 は抽出物と多クローン抗体との相互作用の７０チ以上を抑制された同相抗原が全 スポロゾイトの超音波処理によって製造され、恐らくプラズマ膜蛋白と同じよう に細胞間に含まれる。これらの結果は多クローン血清の免疫応答の大きな比率が ＣＳ蛋白の免疫凝性部分の繰返しエピトープに向けられている（以下を見よ）。

実施例　４ 実施例２及び３における実験はプラスモデイウムの４つの推のＣＳ蛋白が単一な 兎疫曖性部分を含むことを示した。この節での表示は ｌ）すべての免役凝性部分が社返エピトープを含み、２）すべての羊りローン免 ＆ｌｆ性部分に存在する。沫返エビドーグと反工δするという確証である。

Ｏ８蛋白の繰返しエピトープの存在はＣＳ蛋白を測定するため２つの位置の同位 元素標識免役検定法が簡単な単クローン抗体によって実施することができるとい うｍＭを基堤としている。このことＣＳ蛋白について第３図に示されている５同 じ結果は、ピ、バヘイヤエのＣＳ蛋白についても得られた。測定は次のように行 われた。

マイクロタイター版（Ｆａｌｃｏｎ３９１１　）のウェルは、単クローン抗体の 燐酸埴緩衝食塩水（：ｐ：ａｓ）の１０μｇ／継Ｚ液の５０μｌと共に４℃で一 夜間培女された。ウェルはＰＢＳでもって洗浄され、２時間、室温でＰＢＳ−Ｔ ｗｅｅｎ２０（０，０５％ｖ／ｖ　）でｉｚされ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２０− ＢｓＡ（ｌｓｗ／Ｖ）でもって室温で培養されたつスポロゾイト抽出物の連続希 釈浴液の３０μノがウェルの底に放出され、そこで板は１夜間、冷凍機のなかで 増養された。抽出物はＰＢＳのなかのｚ％（ｖ／ｖ）Ｎｐ−４０（！ｍ、Ｐａｒ ｔｉｃｌｅ　Ｄａｔａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｋｌｍｈｕｒｓｔ、工１１ ）Ｙもって２時間、室温で純粋化された陸液腺スポロゾイトを反応さ？、そのの ら、１時向、１００，０００，９で遠心分よして裏道した。抽出力の希釈浴液は ｏ、ｉ％（ｖ／ｖ）Ｎｐ−４０を含むＰＢＳ−ＢＳＡのなかで調整された。培養 の後、ウェルはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２Ｏ−ＢＳＡでもって洗浄した。５０μｌ （約５〜１０ｎｇ）の同じ　１−標識率クローン抗体をＰＢＳ−ＢＳＡ−Ｔｗθ ｅｎ２０に希釈したものを加え、追加して１時間’ＭＬ＆Ａで、培養をつづけた つウェルはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２Ｏ−ＢＳＡでもって洗浄し、計測した。刈照 は十血清アルブミン（ＢＳＡ）のみで被覆したウェルからなっている。

第３図に示すように特有な積台はすべての場合に均一な抗原を使用することにお いて観察された。これらの冥現はヌボロゾイトの檀々の抽出物がＣＳ蛋白を含み 、少くとも単一な単りローン抗俸の２分子を箱合できるので２ｉＩＩｉｌでめる ことを示している。）同相の抗体の１つはプラスティクに接融して、他のものは 液相で同位元素で’Ａ　ＡＦＩされた。しかしながら、抽出物が凝集ＣＳ蛋白を 含んでいる。この可能性は以下に記述するように実験によりのぞかれ、直接的に 抽出物のなかに分子量が２１面または多価の抗体であるＣＳ蛋白の単」ま体の分 子量にＡ’Ａ”ｒしていることを示している０７抽出物は５ＤＳ−２％（ｗ／ｖ ）−６Ｍ尿素でもって処理され、上に記載したように製造された。５％（ｗ／ｖ ）−２０％（Ｖ／Ｖ　）蔗糖勾配のなかで超遠心分離をうけた。実験はベンクマ ン５Ｗ−２０５０，１（面積、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、 、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を使用して回転数４６０００　 Ｅ−で２０時間、超遠心分離器のなかで行われた。遠心分層の後、管の底に穴を ｈけて滴が分服管に集められた５分画はＯ８蛋白の存在について２つの方法によ り分析された。

１）２つのＳ所での同位元素標識免疫検定法による分画の分析こ扛は治干の半ク ローン抗体について各抽ｌ１ｌＬｌ物ごとにこの節ですでに記載したように実施 した。検定法の結果は各分画のなかに存在する東咲の同じ日付で得られた標準曲 線から計算されるようにしてスズロゾイト等盆の叔として表わされた。

２）抗原位楓板に対する単クローンの結合の抑制による分画の分析、勾配分画は ＣＳ蛋白に関して牢−エピトープを検印する検定法により分析されたつこの検定 法は次のようにして行われた：仇涼−被後板は炸裂され同位元素で標識した単ク ローン抗体の動吻飽罪廐誼は実施ｔｄ　２に記載されたように決定した。勾配分 画の部分標本は昆龜で、１時間、同位元素で標識をつけた抗体と共に混された。

そこで４０μｌ　Ｏ）混合物は面相抗原を含むウェルに対して放出された。時間 乞追加して培養した後、ウェルは洗浄し、計測した。紬合の抑制はまた標準ＩＦ ＩＩ　＆から計算されるように分画中に在任する等量のスポロゾイトの叔として 衣現された。

これらの実験結果は第４図、第５区に示されている：ｌ涼識蛋白の分画における 場所をしめしている。結果はビ、ビバックス及びビナウレシのａＳ抗原は両側定 法によって検討され、標識したオバルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）　とウシ皿 （＃アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ　５ｕｒ−ｕｎ　ａｌｂｕｍｉｎ）との間の単一 のピークに沈降していることを示している。このピークに見られるＣＳ蛋白の量 は最初の投入量の９５チ以舌）をあられしている。ＣＳ蛋白及びその前駆体は分 子量として４０．０００から６０　、０００間にあるのでこれらの結果は抽出物 が専らこれらの分子の単量体を含んでいることを強力に示している。さらにすべ ての試験された単クローン抗体はＯ８蛋白に関しｄ返しエピトープと判別した。

この発明に対する簡単な説明は彼等のすべてが同じエピトープと共に反応すると いうことでおるっ性的に現在の結果とこれらの前の実施例はヒトのマラリャ寄生 の場合と同様に含むことを証明している。

実施例　５ スポロゾイトの袖の間の交差反応性 プラスモデイウムの異なる鴇からのＯ８蛋白の単クローン抗体間の交差反応は、 周囲スポロゾイト（ａｓｐ）反応により快食され、又は直接兜役螢元試鋏によっ て横置された。これらの試ｆＬｉはＭａｒ−４ｉｎ、Ｆｉ、Ｈｅｔ　ａｌ、ｎａ ｔｕｒｅ　２７４．５５（１９７８）及びＤａｎｆｏｒｔｈ　Ｈ，Ｄ　ａｔ　ａ ｌ　Ｊ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、６４．１１２３（１９７８）に記載され単クロー ン抗体について行われた３例としてｃｐｓ反応は、室温で朧粋にされた発貸しつ る唾液課スポロゾイトをもってＰＢＳ−ＢＳＡのなかで希釈血清の培・養により 行われ、１０分以上の培養の後、スポロゾイトは位相差額ａｈ）により試験され た。ポジティブな反応は寄牢虫の佼端部で形成される糸込沈Ｃ佼からなっている っそのＣ１２反応は冷所では起らないっ又はホルムアルデヒドで同定した寄生虫 では起らない、Ｐｏｔｏｃｎｊａｋ　ら（ＡＵ掲）によって証明されているよう にａｓｐ反応は抗体によりｃｓｉ白の架構によって生起する。、螢元抗体間接法 はグルタルアルデヒドで固定したスポロゾイトにより行われた。寄生風は燐酸塩 ＰＢＳ緩備ス項水０°Ｃ１３０分間のなか１％（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒド 浴液で処理された。寄生虫はＰＢＳのなかで洗浄され、水のなかでｏ、１％　（ ｗ／ｖ　）グリシンをもって一夜間培養した：、遠心分離して洗浄後再び懸−し たスポロゾイトは３微鋭スライド上で２Ｘ１０／石の縫度の１０μｌの小滴のな かに析出する。小滴は空気中で乾床され一７０℃に保った。検定法は室温で２時 間、免役血清の希釈浴液をもってスポロゾイトの培養によって行われた。つづい てアＢｅで洗浄し、第２の抗体でもって２時間灯しい培俣を行い螢光標識され、 第１の免役血清の免役グロブリン（ｒｇ）　に対して向けられた。

第２の抗体く例えばウサギ抗ヒト免疫グロブリン（ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉｈｕ ｍａｎ　工ｇ）は商栗的諒より得た（　Ｃ！ａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ。

Ｃｏｃｈｒａｎｖｉｌｌｅ、Ｐａ、）、洗浄の後、スライドは螢元顕微銑で観涙 された。

両方法乞使用して次の交差反応がＣＳ蛋白のＩ繰返エピトープに対する単クロー ン抗体間で観察された。

Ａ）抗−ピ、ナウレシはビ、ファルシバリウム及び＜、シノモルギと反応した。

この場合、交差反応率クローン抗体は異形禅の感架を無効にした。

Ｄ）抗−ビ、マラリャエはビ、ブラシリアニウムと反応した。

実施例　６ ２つの合成ペプチド（￥施例１に記載された）がこの研究に用いられた。その１ つは１２のアミノ１冥配りＩ」から成って諭る。Ｈ，Ｎ−Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌ ｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇａｙ　Ａ’ｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ＧｌｙＧｌｎ　Ｐｒ ｏ−Ｃ０ＯＨ（１２量体）と他のものは同じ配り１ｊ（２４ｉ体）の２量体であ った。２４菫坏（しかし１２食体ではない）は直接にビ、ナウレシのＣ８蓋白の ２つのエピトープを含むことは１町位元素標眞兇疫検定法により示された。その 検定法は次のようにして／−浴液の５０μｌをもって４℃でｌ佼＋＝＋培書した 。ウェルはＰＢＳをもって洗浄した。そこで室温で２時間ＰＢＳ−Ｔｗθｅｎ２ ０（Ｏ，ＯＳ％（Ｗ／Ｖ　）をもって培養した。そこで３時間追那してＰＢＳ− ＢＳＡ（１％（Ｗ／Ｖ　）　）で培養した。合成ペプチドは遵伏的にＰＢＳ−Ｂ ＳＡ−Ｔｗｅｅｎ２０中に検水さｎ１＊釈浴取の３０μノの部分標本は各々のウ ェルの底に放出された。板は冷還愼のなかで１夜間放田された。ＰＢＳ−ＢＳＡ −Ｔｗｅｅｎ　２０で洗浄され、ＰＢＳ−ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ　２０　（ｉＧ９ １００，０００ｃｐｍ　）に希釈された１２５１　で標−された単クローン抗体 ２Ｇ３の５．０μｌによって培養された。幼魚は２Ｇ３として同じアイソトープ の関係のない単りローン仇体で枝槍した板からなつくいる。その藷果は表４に示 された。

特有なカウントはシェルに加えたペプチドの線量に比例し、２４−置体をもって 用萎したウェルのみ発見された。

２４量体の特有でないカウントはウェルに結合していた。そのウェルは同相抗体 が単クローン３Ｄ１１であり、それはｅ　、−ご辷−仝イのＣＳ蛋白に河してむ けられている。これらの結果ば２４−量体が阜クローン２Ｇ３により判別される ２つの同じエピコートを含み、１２ｉｊｔ体は１つのエピコートか又はそうでな いいずれかを含むことを強く示している。これらの可能性の間を区別することに 対して、侠定法はビ、ナウレシのＯ８蛋白と単クローン抗体２Ｇ、３との間の札 互作用を抑制するために１２拭体の可能性を決定するために行われた。抑制検定 法は次のようにして行われた。

Ａ）セハローズ−４Ｂ（商標、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、工ｎｃ、ＵｐｐｓａｌａＳ ｗｅｄｅｎ）の製法はビ、ナウレシ及びビ、バーヘイそれぞれのＣＳ蛋白に回灯 ら肚、半クローン抗体５ＨＢと３Ｄ１１に結合された。

抗体は裟造百のブ１図によりＣＮＢｒ　セノ・ローズビーズに（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｕｐｐｓａｌａ　、Ｓｗｅｄ、ｅｎ）ｉ合 されたつ冷却汝、ビーズ（１０■の抗体／１％を含む）は１時間尾鉱で０．５襲 のグルタルアルデヒド（蛋白の開裂を防ぐために）で処理された。そこで１０ｍ り／Ｍ□のグリシンのＰＢＳのＢＷをもって処理し、最終的にＰＢＣ−ＢＳＡ（ １％（Ｗ／Ｖ））Ｔｗｅｅｎ２０（０，０５％（Ｖ／Ｖ））のなかの２０％容量 に再懸濁さビた。セハローズにえ合した単クローンはそれぞれセハローズ５ｇ８ 及びセハローズ３Ｄ１１と名付けられた。

Ｂ）２４量体の放射性同位元素鍬識化は　ｌをもってボ〃トンープンターＫｉ（ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｂｕｎｔｅｒ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ａｍｅｒｓｈａｍ工ｎｔｅｒｎ ａｔｉｏｎａｌ　Ｌｔｄ、、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｕ、Ｋ）を用いて裏造百の３１ 図により１０μｌの２４量体溶液（ｌＯｍり／ゴ）とボルトンーブンタ試薬のＱ 、１ミリキユリーを用いて行った。ペプチドはＰＢＳ−ケラチン（０，２％（Ｗ ／Ｖ））において均衡させているセハドックスＧＩＯ管のなかで標識化した後に 純粋化したペプチドの１００チが回収されたことを確認し、特異活性度は蛋白の １０　ｃｐｍ／μｌであった。

Ｃ）放射性同位元素で標識化した２４量体のセハローズ５ＨＨに対する特異性の 結合 ２０％（ｗ／ｖ　）のセ／Ｓｏ−ズー５　ＨＢ　ｃＩ）＋’Ｂ　翫液の４つの２ ００μノの部分標本はＰＢＳ−ＢｓＡ−Ｔｗｅｅｎ　２０　、（４５，０００ｃ ｐｍ）のなかに原識した２４址体の希釈浴液の１５０μノを含んだ管に加えた、 ２つの管に希釈液の５０μｌを加えた。他の２つの管にＰＢ（！−ＢＳＡ−Ｔｗ ｅｅｎ　２０のなかに希釈され冷却された２４量体（５００μＩ）の５０μｌを 加えた。ビーズは遠心分離により況浄され計叙された。対照として同じ混合物が セハローズー３Ｄ１１を含む管のなかで製造された。その結果は永６に示した。

これらの結果は放射性同位元素で標識したペプチドが脣にビ、ナウレシ早クロー ン抗体５）ｉＢ仇−ａＳ蛋白に結合することン証明している。つけ加えて、３Ｄ ｌｌ抗体により２４重体は弱く相互作用していることを示している。このことは すべてのｃｓｉ白か構造的に関連している証拠を考ｊし、これらの実表がリガン ドペプチドに対する抗体のモル比が全く高いことを考えるとおどろくにはあたら ない３呆施例　７ ビ、ナウレシ（２４霊体）の合成繰返しエピトープによる免役システィン残基が Ｎ−末端に付加することを除いて合成２４量体は実施例１に記載したように合成 されるうその合成が正しく行われたかどうかを決定するために部分標本は戚圧で （６ＭＨＯ１゜１１０°Ｃ２７２時間）酸部水分解をうけ、アミノ酸組成は決定 された。ペプチドは纜合割として（Ｌｉｎｇ、Ｆ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉ−ｓｔｒｙ１８　６９０（１９７９））ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ− ヒドロキシーサクシニイミドエステル（ＭＢＳ）を使用してそ（７）Ｎ−末端シ スティン残基を通してキーホール　リムベットヘモシアニ／又はテタナストキン イド（ｔｅｔａｎｕ日　ｔｏｘｉａｅ）のいずれかを運搬物質蛋白に結合される 。これは２官能性試楽であり過当な条件で特殊的に一方では運搬′７！］質のア ミン基と反応し、他方ではペプチドのチオール基と反応する。

０．０５ＭのＰＯ４緩衝液の０．２５４のｐＨ７，２のなかで４■の連条物質蛋 白はジメチルホルムアミドのなかに溶解した０、７１ｎ９ＭＢＳと藺下して反応 させた。呈−で３０分間１覚拌した。生成物はＭＢ−運搬ｗ質であり、未反応の 薬品からｐＨ６，０の９．０５Ｍ　ＰＯ。

緩備ス・区のなかに部分像不化されたセハデックスＧ−２５管のなかに通過さぜ 分離した。ＭＢ−運娘劇勿質はＰＢＳ（ｐＨ７−４）のなかに６＝したシスティ ンを含む２４−量体の５ダと反応さげた。混合物は室温で、３時間撹拌した５結 合効率は放射性のペプチドにより監視した。このことは　１　で標識した２４量 体の痕跡量が合成のあいだ冷ペプチドと重合され対になった透析に組み入れられ た標識の割合の借切を与えた。

５のアカゲサルは、水散化アルミニウムゲルに吸着された共役結合蛋白の２００ 　ｍ９により免役した。彼等の血清は放射性回位元素’ＣＡＧ＆免疫検定法によ りビ、ナウレシａＳ蛋白に対する抗体の存在を実施例３に記載したようにして監 視した。血清希釈浴液はマイクロタイター板の抗原Ｆｉ＆ウェルで培養した。固 相抗原に結合するサル抗体の存在は　１で標識化した親和性−純化つサギー抗− ヒト免投グロブリンそれはアカゲザルの免疫グロブリンと交差反応するのである が−ともに培ｌし監視された。

３０日後、サルの血清力１１１ｉ］（ｔｘｔｅｒ）は１／１０００より大きい力 価に上昇しこのときこれらのサル（５つの他の対照サルと同様、水酸化アルミニ ウムを吸収した非共役運搬蛋白をもって注射した）は２．ｏｏｏの発育し得るビ 、ナウＶシサプロゾイト乞もって刺激した。感染は日ごとに全３０日間血液塗布 標本の頭微規試験によって冨生虫の予防接極の後１週間で開始して監視されたつ 煩釆はワクチン（共役蛋白）で免疫した５つのサルは全部感染を防いだことを示 した。即ち寄生虫はサルの固成のなかに発見されなかった。対照サルは刺戟袋７ 〜１２日の循順でビ、ナウレシのトロホゾイト（ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ）を持 った。

実施例　８ ビ、ピバックス及びビ、ファルシバリウムの繰返しエピトープに相当する合成配 列は実施例７に記載したようなＮ−末端にシスティン残基を付加している点をの ぞいて実施例１に記載したように実質的に合成した。合成が正確に行われたかど うかを決壷するために部分標本は減圧で（６Ｍａｃ１，１１０℃、７２時間）酸 加水分解をうけ、アミノ酸１組成が決定された。ペプチドはキーホールリンベッ ト　ヘモシアニンか又は破傷風トキシドのいずれかの運搬蛋白に実施例７に記載 したようにそのＮ−末端Ｌｉ５．基を通して結合拭薬としてＭＢＳを用いること によって結合された。

ジメチルホルムアミドに溶がしたＭＢＳ０．７■をもって、４ηノａｉ蓋白ハｐ Ｈ７，２，０，０５ＭのｐｏＪ衝液の０．２５ｄのなかで繰下して反応させた。

室温で３０分間攪拌した。生成物はＭＢ運運搬負負あるがｐＨ６，０の０．０５ ＭのＰＯ，緩＠液のなかで均衡を保ったセハデツクスＧ−２５管を通過させ未反 応の薬品から分離した。

ＭＢ−這え’ｒ７１Ｊ賀はＰＢＳ（１）ｌ（７，４）に溶解したシスティンを含 む各ペプチドの５〜と反応さぜた。結合効率は放射性宿性のペプチドにより監視 された。それは痕跡量の　１で標識化したものを合成のあいた冷ペプチドと混合 し、対となった透析は組み込まれた標識の割合の解明を与えた。　１００，００ ０　Ｍ　、　Ｗ　（分子量）の運搬物質について合成ペプチドの数は約１０−１ ４であると見挾れている。

５つのチンパンジーは水成化アルミニウムゲルに吸着した共役蛋白の各々２００ μｇにより免役した。？＆寺の血清を実施例３に記載したように免役放射性足置 法によってピ、ピハックス及びビ、ファルシパリクムのａＳ蛋白に対して抗体の 存在を監視した。血清希釈浴液はマイクロタイター板の抗原彼覆したフェルに培 萎した。チンパンジー抗体の存在は　１で標識化されｊこ親、ｒＬｌ性−眺化ウ サギ−抗−ヒト免疫グロブリン（それはチンパンジーの免疫グロブリンと烈しく 交差反応するが）と共に培養され監視された。

３０日後、チンパンジーの血清力価ば１／１０００以上の力価に上昇する。この 時にこれらのチンパンジー（水酸化アルミニウムに吸収された非−共役−運搬物 質を注射した５つの他の対照チンパンジーと同様に）は２０００の生育し得るビ 、ビバックススプロゾイトをもって刺激した。感染は日毎寄生虫の予防接穂の後 −週間で開始し、血液塗布標不を顕ａ鏡による試験によって全３０日にわたって 監視した。その結果共役蛋白のワクチンによって免疫された５つのチンパンジー は全体的に感染から防がれた。寄生虫は彼等の血液のなかに発見されなかった。

逆に対照チンパンジーは刺激後１０−１２日の循環でビ、ビバックスの計ロホゾ イドを持った。

−）ｆｆＫ１０，０００のビ、７アルシバリウムスポロゾイトをもって刺激した 第２のものは同じチンパンジーに与えられる　再び接硼した尾のみじかいサル（ ａｐｅ）は感染をまぬがれたが、一方対照はすべて感染した。

ヒト及びチンパンジーの完投応答の密接な同一性にもとづいてそして感染防御の 免疫性がピ、ファルシバリウム及びビ、ピノ１ツクという事央に関して、記載さ れた合成ペプチドをもってチンノくンジーを免疫にして得られた結果はヒトの患 者に対しても同じ処置で得られるでろろう。

免疫凝性部分のさらに正確な同一化はそれ自身免疫虎性エピトープの事実におい て若干の理由のためのぞましいことである：１つはそのような同一化はａＳ蛋白 の免役原性の１解をさらに与えるのに有効であるであろうつ他はエピトープのア ミノ酸配列に関連するか又は同じでより短いアミノ酸部クリを有するペプチドが より容易に通常のペプチド合成又は組換型ＤＮＡ孜術のいずれかを用いて構造さ れ、純粋化されることである。そのような一つのペプチドはもしも抗ａＳ結合活 性ドデカペプチドめ結合活性と同じように示すならば有効であるであろう。さら により興味あることはエピトープがドデカペプチドにおけるアミノ酸の非組み入 れ配列をもって代表されるか又はそれは配置的であるのかを証明することである うたとえばドデカペプチド（１２のペプチド）のより高度の順序の構造のおかげ で並置される残基により構成されるのである。ａＳ蛋白に対して若干の単クロー ン（及びφクローン）抗体がスポロゾイトの感染性を無効にするので、もしもそ のエピトープが邪魔をしない配列を表示するならば比較的短い配列が形成される ならばこのペプチドは合成ワクチンの開発の基鑓を従供するであろう。

炭水化物抗原に発見されているエピトープの大きさと形状は広汎に研究されてき た。しかし蛋白分子からのエピトープの構造について知られているところはすく ない。蛋白抗原のあるエピトープは彼等の３Ｄ構造の水準で規限されてきた。す べての場合、そのエピトープは第１の配置１ｊのみによって形成されなかった自 然のままの分子のポリペプチド鎖のおりたたみにより　もたらされる残基の並置 により形成される。たとえば単クローン抗体はマツコラクジラ（Ｓｐｅｒｍ　Ｗ ｈａｌｅ）ミオグロブリンに対して、３つのＯＮ　Ｂｒ開裂断片のいずれも反応 しなかった。０ＮＢｒ　開裂断片はヘモグロビンの全部グリを巣めてとりかこん でいるっ　（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、Ｊ、Ａ　ｅｔＲθｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｂｙ　 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ｓｐｅｒｍＷｈａｌｅ　 Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ　（１９８２）Ｊ、Ｂ１０１．Ｃｈｅｍ、２５７　：３１８ ９−３１９８：イースト　アイ、ジェ２等　”Ａｎｔｉｇｅｎｉ（！５ｐｅｃｉ ｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔ。

Ｈｕｍａｎ　Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ　（１９８２）Ｊ、Ｂ１０１．Ｏｈｅｍ、２」 −７：３１９９）。リソチウムにおいてエピトープに結合する単クローン抗体は 接触場所に隣接するところのＡｒｇ　６８−Ａｒｇ　４５コンプレツクスを含む 部分を含むことが発見された。（Ｓｍ１ｔｈ−Ｇｉｌｌ。

ｆｏｒ　ａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎｔｉｂｏｃＬｙ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｌ ｙｓｏｚｙｍｅ／：（１９８２）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、↓２８．３１４Ｌ単クロ ーン抗体はインシュリン（１ｎｓｕｌｉｎ）のＡ−鎖ループ（Ａ８−１０）と認 められているが遊離へ−鎖に又は合成ペプチドに結合さ亡ることに失販した。（ Ｓｈｒｏｅｒ　Ｊ−Ａ、ｅｔ　ａｌ、、（１９８３）Ｅｕｒ、Ｊ。

工ｍｍｕｎｏ１．す：６９３）。

ここに用いられる研究はスポロゾイトＯ８蛋白繰返しペプチドのアミノ酸配り１ 」をもって出発した。プラスモジウムノウレジのそれのようにアミノ酸の数の２ 倍を縦方向に結合した橡返しペプチドを合成した。その類似体ペプチドは累進的 により小さい配列を有している（不端アミノ酸を、省略することによって）５類 似体の各々及びそのようなペプチドに対するａＳ蛋白（単りローン抗−シス）に 対する単クローン抗体の反応性を決定する５対尿吻は高い抗体反応性をもって最 も短い同類物を見出すことでゎる。同時にドデカペプチドのなかでエピトープの 位置な同一化することでらり（もしもそのようなエピトープの場所が第１級アミ ノ葭の配置１」にあるならば）ドデカペプチドの配列と同じように向い合ってい る（ｖｉｓ−ａ−ｖｉｓ）準りローン抗ａＳの免疫化学的反応性を有するペプチ ドを同一化することである。以下記載される実鮎的研究に選ばれた持重な縦１り りに配される繰返しポリペプチドはビ、ナウレシ蛋白のそれであった。

この繰返しポリペプチドはドデカペプチドであり、アミノ酸配列（Ｎからｃｉで 末端基）を有す。

（Ｇｘｎ４−Ａ１ａ２−Ｇｌｎ３−Ｇ１ｙ４−Ａｓ、ｐ、　−Ｇｌｙ６−Ａ１ａ ７−ＡｓＪ　−Ａｌａｇ−Ｇ１７１０−ＧｌｎＨ−Ｐｒｏ、２）。

若干の単りローン抗ａＳはピ、ｆウレシｃｓｉ白（特許出願２３４０９６に記載 されたように）に対して提起され、ここに合成されたペプチドの免疫反応性を試 験するために用いられた。しがし社を限定するｔのでない。云烈な証拠は個のプ ラスミゾイム独のＣ８蛋白またはタンデム（傘−夕１」に連結）像返しペプチド を含み蛋白の構成はビ、ナウレシＣ８蛋白（彼等のアミノ酸部夕１」は同じでな いかもしれないが）に関連するという事実がある。たとえば免疫学的区域のみが すべての単りローン抗ａＳ（同じ池のａＳ蛋白から提起された）によって認めら れていることを示す。さらに、又差反応性は異ったプラスモジウム柚のｃｓ蛋白 とビナレジイー仇−ＣＳとの間に報告されている。（０ｏｃｈｒａｎｅ　ｅｔ　 ａｌ、　（１９８２）　。

Ｐｒ０ｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９　：　５６５１　）　 、さらにサントロ寺のＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８　：３３４１　（１９８ ２）は異なったマラリャ遣のａＳ蛋白が構造的に関連する分子のＷ、Ｑの１貝で あるということを報告した。本発明は若干のプラスモデイウム柚に対して適用で きるでおろう。

合成ドデカペプチド（ビ、カウレシＣＢ蛋白通返しペプチド配夕りに相当するが ）及び上記ドデカペプチドのタンデム繰返しからなるテトラエイコサ（ｔｅｔｒ ａｅｉｃｏｓａ）ペプチドが合成され、６つの抗−Ｃ８により抗−ｃｓ、４合活 性をＸ放した６つの抗−Ｃ８は完全なスポロゾイトをもってマウスの免疫処理に 提起されたがしかし６つの抗−Ｃ８は単一分子のｃｓｉ白と反応することを示し た。

ａｏｃｈｒａｎｅ　Ａ、Ｈら「グラスモデイムナクレシスブロゾイドの保―抗原 の単クローン抗体の同一化Ｊ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、。

Ｕｓｃ７９．５６５１　（１９８２）、ｃｓ蛋白はＪ９４（ｆ３ｔａｇｅ）　− 脣異江９棟−特異性である。ファンデルベル等　Ｍｉｌｉｔａｒ７ｍｅｄｉｃｉ ｎｅ　３０４．１１８３（１９６９）、Ｃ！ｏｃｈｒａｎｅＡ。

Ｈ等のマラリャスポロゾイドの「抗体誘起の超ヤイ造変化Ｊ　（１９６９）Ｊ６ エｍｍｕｎｏ１．　１１６　８５９　）は完全スポロゾイト表面にわたって均一 に分布され、抗体により又差結合するときには与えられる。

Ｐｏｔｏｃｎｊａｋ、Ｐ　ｅｔ　ａ］、ｒスポロゾイト表面抗面に対する単クロ ーン抗体の１１曲の断片（ｐａｂ）」　（１９８０）Ｊ、Ｋｘｐ、Ｍｅｄ、。

１５１．１ｆｉ０５．若干の廊のａＳ分子の１つの置板のみがすべての均一な単 りローン仇−Ｃ８によって、この兜疫瀝性部分は準−なエピトープ゛の衣ｍ（Ｗ ｘｐｒθ５ｓｉｏｎ）に関しては多重画であることか認められた。ザラバ　エフ 等、（１９８３）Ｊ、］ｉ：ｘｐ、Ｍｅａ、１５７：１９４７ ＤＮＡ解析はビ、ナウレシｃｓｉ白の免役抗原性の部分が１２単位の１２のアミ ノ酸の各々によって（ペプチド抗体応用を見よ）、クンデムｋｎしからなること を示した。さらに１つの単りローン抗Ｃ３（２０３）によって認められるエピト ープが単一のサブユニットのなかに含まれていた。合成ドデカペプチドは２４／ 量体が２つの２Ｇ３分子と同時に相互作用するので抗−ａ　ｓ　／　ｃ　ｓ反応 を非常に効果的に抑制した。

不研究は５つの他の単りローン抗−ＣＳと反応するエピトープまたは２４／量体 のなかに表わされることを示した。このことはどのエピトープが２４のアミノ酸 部クリのなかに置かれるかいずれのエピトープが１２のアミノ眩配列のなかに含 まれたかを試験する前に決定するのに効果的である。

４つの単クローン抗体（２Ｇ３．５Ｈ８，８３３Ｂそして８呂１１）は合成され た同類のより短い長さの１２のペプチドを免疫性を試験するにめに用いらｚした 。その目的はさらにここに含まれるエビ）−プの同一化と位置確認であった。

１１−アミノ１亥類似物が主としてＮ末端Ｇ　１　ｎ　残基のｌ況洛によって類 似化合物（２−１２）か最初合成された。、（２−１２）の反応性を工（１−１ ２）の反応性と比較された（衣９をみよ）。本質的に等しいことが理解される。

そのＡｕ来３−１２．４−１２および５−１２の反応性が決定され、１−１２の 反応性と本質的に同一であることが見いだされた。しかしながら−５番目のアミ ノ酸の腕洛残基Ａｌｐは、反応性において可成減少する。ｌから３、そしてでき れば４のアミノ酸残基は１２−ペプチドの免役反応性に寄与しないことが顔諭さ れる。

Ｃ−床端から出発して類似化合物（１−１１）（２−１１）および（３−１１） は、アミノ酸１．２．３が免疫反応性に寄与しないという仮設を、眼拠にして合 成しなかった。（４−１１）は（５−１２）の免疫反応性よりも（事実上わずか に高い）が、本質的には号しい免疫反応性を有した。しかしながら（５−１１） は（５−１２）から（６−１２）までに観察されたものに釣り合って反応性は低 下するのが示された。

より短い長さのペプチドは反応性を示さなかった。かくして（４−１１）と（５ −１２）のペプチドは高い反応性を有し、最も短い長さを有するものであること か確められた。

１つの末端アミノ酸を１蒔的に睨洛させ上の方法及び生成したペプチドの反応性 を試験する方法はｉセ小数段階におけるエピトープの分離に導く。アミノ酸残基 がエピトープのなかで沈ルしないことか示されるとさらに試験から除くことがで きる。

衣９に果約されたようにドデカペプチドの　Ｈ，Ｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ− Ｇａｙ−Ａｓｐ−Ｇａｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｈａ−Ｇａｙ−Ｇ’１ｎ−Ｐｒｏ −ｃＯＮＨ２（１−１２）。

同様にペプチド（２−１２）、（３−１２）、（４−１２）及び（５−１２）は 非常に効果的な抑制因子であった。しかしながらＡ１１１ｐ又はＡ８ｐとＧ１７ （５と６の２置）の除去は反応性の８夏が可反り低下したつこのことはペプチド か５−１２より短いと反応しないという仮設と一双している。（１−１２）のＯ −，７端からのアミノ酸の役割が試験された。

８８図は柚々のペプチドのａ夏乞増加し存在させてビ、ナウレシａＳ蛋白に対し 同位元素で似鐵した単クローン抗体５Ｈδの結合の抑制を表現する図である。上 記ペプチドは第２図のように明示されたものであるっ第８図のＢに示すようにド デカペプチドのＰｒ。

（１２０２０位置はＧｉｎ（１１０位置）の末錫基は単クローン５ＨＢとその反 応性において可成り効果を有するがしかし単クローン２Ｇ３及び８Ｂ８にとって ４−１２又は４−１１との反応性はほとんど同じであり、４−１０は全く反応し なかじた。（パネルＢ、第７図及び第９図） 第７図はＯ８蛋白ｉａ返しペプチドの類似化合物であるペプチドによりビ、ナウ レシａＳ蛋白に対する単クローン抗体２Ｇ３の結合のＵｐ　’＋！Ｉｊを示す図 である。上記ペプチドはドデカペプチド配列における木４アミノ酸の位置により 名づけられている。

レジＣ８蛋白を同位元素で標識した単クローン抗体８Ｂ８の結合の抑制を示し１ いる。前面に示したようにドデカペプチドのなかの彼等の位置によって名づけら れているう ドデカペプチドは１つのプロリン（Ｃ−末端基）のみを含みこの残基は２つの単 クローン抗体との反応性は実質的にない。

上の結果から、 ｔａｒ　他の多くの抗体に関する研究の結果とは逆にビ、ナウレシのＯ８蛋白に おいて単一の兜疫憂性部分があり、エピトープは４−１２２２基の１わりに１２ のアミノ酸の第ｌの配列のなかに位置している。

（ｂｌ１２残基配列よりもむしろ８残基のみを有するペプチドから実買旧に等１ １ｊｊの免役反応性を倚ることかできる。すなわち、繰返し単位（ドデカペプチ ド）自オより短い最少のアミノ酸の長さをもつ免疫反応性のペプチドを得る可能 性があるという結論がでてくる。

上述より単クローンがｆｉ、＋（４−１１）のアミノ酸部夕１ｊと反応すること は明らかである。

第６図はドデカペプチド（ビ、ナウンシａＳ蛋白の繰返しペプチドの繰返し単位 を構成しているが）と２４−ペプチド（上記ドデカペプチドのタンデム１凍返し からなる）との間の活性をピ、ナウレＺａＳ蛋白に対する異なる単クローン抗体 の結合の抑制との関係で示した図である。第６図は８Ｅ１１の特異性が明らかに 他の単クローン抗体の特異性と異なること、８Ｅ１１のａＳ蛋白との相互作用は ただ（１−２４）によってのみ抑制され、（１−１２）によっては抑制されない ことを示している５８Ｅ１１が２つのタンデムのドデカペプチド１−１２間に重 り合う配置１ｊに名づけられる可能性を試験するのに若干の他のペプチドが合成 され、抑制活動が検定されたが負の結果であった。このことは８Ｂ１１が２つの ドデカ量体に結合により形成された位相幾何学的配置のエピトープと反応するこ とを示している。

１２−ペプチドの免疫活性度試験に用いられた４つの単クロー／抗体のうちの３ つは２４−ペプチド及び合成同類化合吻（２Ｇ３゜５Ｈ８及び８Ｅ８）が最小長 の反応性のより短い同類体をもって、名づけられた。エピトープが２４の構成ア ミノ酸配り１」のなかで２回繰返されるので結合位置が第２．第３のポリペプチ ド鎖と名づけられることはありそうなことでない。このエビトートの患くほどの 免疫原注は、ａＳ蛋白の通冨の構造の反転である。その手分は、１２のアミノ酸 のタンデム繰返しからなり、各々繰返しは可能性のあるエピトープを含んでいる 。連鎖法１注Ｍ蛋白型２４がまた様返しペプチドサブ単位を含み、それは免疫ヒ を性エピトープを含むということは注目にイ直いする。（Ｂｅａｃｈｅｙ、Ｆｉ 、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、「運Ｍｆｆ＠性Ｍ蛋白２４型の保獲抗原の第１￥＃造Ｊ 　（１９８０）Ｊ、Ｂ１０１゜Ｃｈｅｍ、２５５　６２８４−６２８９．Ｌがし ながら、ｃｓ蛋白はＭ−蛋白に対して何ら構造的又は他同類性を持つことは九ら れてない。

池の研究において、単クロ、−ン抗体２０３と８ｇ１ｌ（又は相当するＦａｂ　 ｍ片）はビ６ナウレシ蛋白に結合するばかりでなく、またスポロゾイトの感染性 を無効にした。）（Ｃｏｃｈｒａｎｅ、Ａ、Ｈ，。

ｅｔ　ａｌ、、前掲）　本結果からみて、ビ、ナウレシのｃｓＨ白の繰返しエビ ドブを表わす合成ペプチドに対する多クロール抗体は同じように生物学的な活性 を有することが可能であるように思われる。

事実、ウサギ及びマウスは運搬物質蛋白に接合するテトラエイコサペプチド（１ −２４）をもってビ、ナウレシを成功的に免役されてさた。若干の動物はスポロ ゾイト族と反応し、ａＳ−蛋白を免疫性沈澱させるところの抗体を作った。免役 ウサギの血清のなかで堵饗するときにスポロゾイトは感染性を′消失したつこれ らの一祭はもしもヒトのマラリャ寄生虫のａｓ−ｉ白からの等価のペプチドが生 体円で免疫原注であること見出されるならば、ヒトに対するワクチンの製剤に用 いることができるという希望を提起した。

ここに使用されたペプチド合成技術の一般的工程はよくしられている。特異的変 形は本発明省によってなされ、不ペプチドの合成に対するそのような孜何の適応 は実施ｆｌ］に記載されている。

合成、開裂、ｚｓ表の後、ペプチドは恐らく部分的に純粋にさｎた単りローン抗 −ａＳとの反応性を試験さｚした。これらの試験に使用した抗ａＳはＣｏｃｈｒ ａｎｅ、Ａ、Ｈ，等の記載のように、マラリャワクチンの特許出願に曲水された ように寄生虫で免疫したマウスのｎ＋′ｇ細胞をもって形質細胞血（Ｐ’ｌａ日 ｍａｃｙｆｏｍａ）の刊施の融合から形成された。

合成ペプチドの免投活曲は単りローン抗ａＳ及び抗ｐ（ｃｓ−蛋白）との間の反 応を抑制する能力を測定し解明した。抗原はマラリャワクチンの特許出願、パン デルベルブ（前出）に記二戊されたようにスポロゾイトから純粋にされた。ザバ ラ　エフ１．等（前出）（１９８２）は　ｌ　−ｆｉ識した抗体を使用した。

本発明は、さらに次の実施例において説明するがその範囲を限尾するものでない っ 原料と源 誘導アミノ酸（及び保護基）及びベンツヒドリルアミン樹脂：ベツクマン　イン ストルメンツ、パロ　ア／ｌ／　ト、　ｃａｌｉｆ、ヒドロキシベンゾトリアシ ー／Ｌ／：シグマ　ケミカル　ＣＯｏ、工ｎｃ、ｓｔ。

ＬＯｕｉｓ　Ｍｏ、セハデツクスＧ−２５及びＧ−２００：／−ルマシアファイ ン　ケミカルス　ＣＯ，、Ｐｉｅｃａｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、牛血ζｄアルブミン ：シグマ　ケミカル　Ｃ！ｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ヨードゲン（Ｉｏａ ｏｇｅｎ）：　ピアス　ケミカル　ＣｕＯ、、ＲＯＣｋｆＯｒｄ　、工１１゜ポ ルトン−フンター試薬（Ｂｏｕｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ　Ｒｅａｇｅｎｔ）：ア メルシャム　コーポレーション、、ＡｒｌｉＡｒ１１ｎ］　Ｈｇｔｓ　Ｉｌｌ。

芙施例　９ 合成はベンツヒドリルアミン（ＢＨＡ　）樹脂（０，６５４ｍｅｇ／ｇｍ）　を 用いてベカモデル２５０　Ｃ（Ｖｅｇａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ’ｌｓ。

Ｉｎｃ、Ｔｕｓｃｏｎ、Ａｒ１ｚｏｎａ）自動合ａｍによりメリフイルド　アル 、ビ、にもとづくプログラムによりモトロラの計算機により制御して行った。Ｍ ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　Ｒ，Ｂ、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、２１　：　４１２１にドデカ ペプチドの　Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇ］、７−Ａ５ｐ−Ｇ４７−１１ａ−Ａ ｅｎ−Ａｌａ−Ｇａｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ　はベンツヒドリルアミン樹脂の３．０ 〜に記文られ、合成器のなかでメチレンクロライド（ＣＨ２Ｃ！１□）に懸滴さ れ、ＣＨ，ＣＩ２　と共に３回洗浄したつエタノールで３回、ＣＨ２Ｃｌ、で３ 回洗浄した。その樹脂は全体で２分間′＆、ｉ？され、そこでＣ！Ｈ，（’！１ ．中の１０俤アニソールを含む５０チのトリフッ素匪酸で３０分間処理したつ０ Ｈ２０１□　で１０回洗浄し、ＯＨ，Ｃ１，、中で１０％のジイソプロピルエチ レンアミンでもって２回洗浄することにより中和した。第１のＢＯＣ−アミノ酸 （第３級ブチロキシカルビノールのＢｏｃｆｉ）はヒドロキシベンゾトリアゾー ルと３モル過剰のＣＨ２Ｏ１，の存在で３倍モル過剰のＢＯＣアミノ談ジフジシ クロシル　カルボジイミドを用いてベンツヒドリルアミンａｌ（脂に１時間結合 させた。１つのヒドロキシベンゾトリアゾールと１つのジインプロピルエテルア ミンの追加的部分標本は、３１＠モル過剰のＢｏｏアミノ醒に１時ｉｌｌ追加し て加えた。そこで樹脂は３回ＣＨ，ＣＩ、　で洗浄された。、走水エタノールで ３回、ＯＨ２Ｃ１゜で３回流、争された。混合物の部分標本をカイゲニンヒドリ ン法（Ｋａｉｓｅｒ、に、ｅｔ　ａｌ、、（１９７０）Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ。

３４：５９５）を用いて拭馴した。生じたペプチドはＢＯＣ！−Ｇｌｎ（ＮＰＥ ）−Ａｌａ−Ｇｌｎ（ＮｐＥ）−Ｇｌｙ−Ａ８ｐ（ＯＢＺ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ− Ａｓｎ（ＮＰＫ）−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ＮＰＫ）−Ｐｒｏ−Ｃｏ−ＢＨＡ 　（ｃこでＮＰ１％はニトロフェニルエステル、ＯＢＺ頚ば〇−ペンチルである ）であった。

合成におけるこの点において、５０％の保護ペプチド樹脂は除去され、フッ化水 素開裂及び純砕化して保護された。

タンデム繰返：すなわち、テトラエイコサペプチド（１−２４）は上に記載した 方法を用いてドデカペプチドと同じ順で保護されたアミノ酸の連続的付加より組 立られた。

次に合成、２．０ｍｇ５　の各々の（１−１２）及び（１−２４）保護ペプチド 樹脂は以下記載されるようにフッ化水素で処理をうけ脱保護開裂ペプチドは無水 エーテルで分離し洗浄した。氷ｂｅと水で交互に洗浄し抽出した。

ペプチド樹脂（各：　２ｍｇｍ）の開裂はペンニンスラ　エッチエフ装置（Ｐｅ ｎｎ１ｓｕｒａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ　Ｇａｒ’ｌＯｓ。

ｃａｌｔｆ、）　のなかでアニソール（１，２ｍｌ　／ｍｙ樹脂）とメチルエチ ルス／ｌ／フィト（１祷／η）の存在で０℃で１時間行い、その仮、汎合吻は完 全に高真空下で乾探した。混合′＠はぞとで冷５７Ｘエーテルで洗浄し、交互に 水と氷酢故で抽出し凍結乾先した。

粗ペプチドはセハデツクスＧ−２５（１２０ｘ　２．０儂）２００■の部分標本 でゲルｆ′過によって脱塩された。カラムは０．１　ＭＮＨ，Ｈ（！Ｏ，、ｐＨ ｓ、ｏで均衡され試料緩衝液として用いられた。カラム液出液はＬＫＢＵＵ−Ｃ ａｒｄ田モニターにより２５４と２５０ｎｍでの紫外線吸光度（壮り監視した。

かくして合成されたペプチドは分析され、次のように特徴づけられた。

試料は、５．７Ｎ塩酸のなかで２２時間、１１０℃で茄水分屏し、乾燥し、０． ２Ｎのクエン酸ナトリウムｐＨ２，２で再構成されスパック？７（Ｓｐａｃｋｍ ａｎ）方法によりアミン敵分析器（Ｌｉｑｕｉｍａｔｌｌｌ）にかけたｏＳｐａ ｃｋｍａｎ　Ｄ、Ｈｅｔ　ａｌ、Ａｎａｌ、ｃｈｅｍ、、３０二１１９０、（１ ９５８）。

合成の間の選択された工程での部分標本のペプチド樹脂番１ガラスピーズをもっ て混合された合成器の反応容器から除去され、自動固相エドマン崩’Ｊｌ（ａｅ ｇｒａａａｔｉｏｎ）の゛（Ｉ＋ａｕｒｓｅｎ、Ｒ−（１９７１）、Ｋｕｒ、Ｊ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０　：　８９　）セキュマットミニ１５ペプチド　シクエ ンサ−（Ｅｔｅｑｕｅｍａｔ　Ｔｎｃ、Ｗａｌｔｈａｍ。

Ｍａｓｓ）にかけた。その樹脂からペプチドの開裂につづいて、粗製と純砕化さ れた合成ペプチドは、ベックマン（モデル８ｇｏ）シクエンサーで（Ｅｄｍａｎ 　Ｐ、ａｎａ　ＢｅｇｇＧ−、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１：８Ｏ−９０（１９５７））　失敗配列の存在を検知するためにＤＭＡＡ　（ ジメチル　了りル　アミン）ペプチド　プログラムを用いて自動液相配列分析器 にかけた。ペプチドの上の側鎖保磯基はフッ化水素による開裂で除外されないっ 誤ペプチドの量の定量と側頭保護基は配夕１」分析器により評価した。ひきつづ きＰＴＨアミノ葭の同一化と測量を高性能液相クロマトグラフで行い、Ｎ１ａｌ ｌ、Ｈ，Ｄ、。

ｅｔ　ａ１記載され、よく受け入れられている「プリビュ（Ｐｒθｖｉｅｗ）Ｊ 分析にかけた。「ポリペプチドの化学及び生物学」　；第３圓アメリ刀ヘプチド シンポジクムの議事録（１９７２）（Ｊ、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒａｄ、）　Ａｎ ｎ　Ａｒすｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂ、、６９５　１９７２：トレギャ　ジ 、ダブリウ、によって変形された。［ペプチド二［第３　回ヨーｏ　ツパペプチ ドシンボジクム議事録Ｊ　（Ｙ、ＷＯｌｍａｎ、ｅｄ、）（１９７４；及びトレ ギャ、ジ、ダプリク、２等　Ｊｒ、ＢｉＯｃｈｅｍ。

（１９７７）月６：２８１７；さらに変形されて（シモンス、ジエ。

及びシュレシンガー、ディ、エッチ、＋　Ｉ”Ｍｌ蹟保麟アミノ虚フェニルチオ ビドラントイン（ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｈｙａｒａｎｔｏｉｎ）　の高性能液相 クロマトグラフＪ　（１９８０）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０４゜２５４ ＝及びシュレシンガー、ディ、エッチ、　、　（１９８３）　Ｍｅｔｈ。

ＢｎＺ３’ｍＯ１，９１、４９４。

ドデカペプチド及び２４−ペプチドにつけ加えて、ドデカペプチドのペプチド同 類物の４つのグループが合成された。Ｃ−末端アミノ酸として各々の占有はＰｒ ｏ、Ｇｌｎ、Ｇ４７．又はＡｈａ　のいずれかでありそれらはドデカマー（表７ ）の１２．１１．１０及び９の位置に相当している。七〇Ｃ−末九のＰｒｏ　を 占有するペプチド同類物は乾燥された保護ペプチド樹脂（約各段階にて１０係） を上に記載したようにドデカペプチドの合成のあいだ１０．８．７．６゜５．４ ．３及び２の位置において除去して合成された。この方法は９保護ペプチド樹月 旨を得た。

回分に、２つのペプチドはＣ−床堀アミノ酸のＧｉｎ　を宮−丁なわら、ドデカ マーの５−１１及び５−１４の位置に残基を含むポリペプチドを合成した。Ｃ− 末端にＧａｙ　を含む１つのペプチドＱま合成され、ドデカマーの４−１Ｏ位置 に相当している。最終的にＣ−末端（ドデカペプチドの７−９　、６−９　、５ −９及び４−９の位置）にＡ’ｌ＆　を占有する４つのペプチドが同じ方法で合 成された。

２つのエピトープの部分を架橋している１つのペプチドすなわちＡ’ｌａ７　＊ ｓｎ８　Ａｌａｇ−（）１７１０　（）１ｎＢ　ＰｒＯ１２ｅｌｎｌ　−ＡｌＢ ２　Ｇ１ｎ３　Ｇ１ｙ４　ＡＳＩ）Ｓ　Ｇ１７６　もしもドデカペプチド又は個 の上の同類体に認められないような単クローン抗体が２つのタンデム繰返しの部 分ン含んだ配りりに対して向けられるならば決定のために合成された。

これらの保護ペプチド−樹脂はそこで開裂し、フッ化水素により玩保画されセハ テツクスＧ−２５の上で脱塩され、アミノ酸の組成及び配置１」のプリビュ分析 （以下表７をみよ）によって特徴づけた。

ペプチドはさらに綿粋にすることなしに免疫学的検討に使用した。

実施例　１０ テトラエイコサペプチドによる単クローン抗体の反応類へｍ（Ｓｉｍｉａｎ）マ ラリャ寄生虫プラスモデイウム　ナウレ−ａｎｅら（前出）（１９８２）及びす でに詳細にマラリャワクｔン特許出願に記載されたように寄生虫をもって免疫し たマウスの脛臓細胞と共にプラスマ細胞膝の細胞の様式により生成された。単ク ローン抗体（４つのアイデオタイプス（１ａｉｏｔ７ｐθａ）：　２Ｇ３．８Ｂ ８，５Ｈ８及び８Ｅ１１）は分子ふるいクロマトグラフのセハデックス（）’− ２００で５０％のＩＡ（Ｉｙ、アンモンニウム沈澱によってバイブリドマス（ｈ ７ｂｒｉａｏＢａ日）を持つマウスの腹水から部分的に、匪枠にされた。

ピ、ナウレシに提起され、寄生虫（Ｃｏｃｈｒａｎｅ等　１９８２）の衣面膜と の反応性を選択されたすべてのタイプの単クローン抗体はテトラエイコサペプチ ドと反応した。

これらの合成ペプチドによる抗原−抗体反応の競合的抑制は次の放射性同位元素 標識免役検定法により測定した。ビ、ナウレシスポロゾイトのａＳ蛋白が抗体と して用いられた。

ａ）抗原の製法ニブロチアーゼ抑制因子を含んだ５０μノの燐敵緩衝食塩水（Ｐ ＢＸ）のなかで３．ｏｏｏ純枠純粋てビ、ナウレシスポロゾイド（パンデンベル グ等、陸軍医学１３４：１１８３．１９６９）はポリスチレン（ファルコン３９ １１板、Ｂ−Ｄ及びＣｏ　、　Ｃ１ｘｎａｒｄ。

Ｏａ’１ｉｆ）　のマイクロタイター板の底にすくなくともパラヒンで田浦し一 ７０℃ですくなくとも１０分凍結して放出させた。その板はそこでゆっくりと室 温に解凍さげた。そこでその板は４℃で一夜間そして５６℃で５分間培養した。

ビ、ナウレシ抽出物はウェルからとりのぞかれ１％の牛皿清アルブミン（ＢＳＡ ）と０．１％ナトリウムアジド（ＮａＮ、）を含むＰＢＳをもって３回洗浄した 。ウェルはそこでＰＢＳ−ＢＳＡ−ＮａＮ３で満され室温で数時間培養した。

ｂ）ペプチドの製法と同類物の抑制油性を決定するため２つの場所での放射性同 位元素標識免疫検定法。

（１）合成ペプチドのすべては１　ｏ７ｎＭの濃、要のＰＢＳのなかに浴かし、 次に連成的にＰＢＳ−１％Ｂ５Ａ１０．Ｉ　ＮａＮ３に希釈した、各ペプチドの 逐ａ希釈液２０−５μノを抗体で核包したウェルに加えた。対照ウェルはただ希 釈剤のみである。そこで　１で原２した単クローン抗体（約５５−１Ｏｎ、１０ 　ｃｐｍ）の２５μｌがウェルに加えられマイクロタイター板は４℃で１８時間 培養された。ＰＢＳ−Ｂ・８Ａ−ＮａＮ１をもって５回洗浄した。そこでウェル はウェルに結合した抗体について計数された。

上の抗体と下のペプチドは、１で標識された。こｎは製造有の指図によりヨード ゲン又はポルトン−フンター試薬を用いた。

２４ペプチドがすべての単クローン抗体によって認められるかどうかを決定する ために５■のいろいろのタイプの純粋羊クローン抗体は製造首の指図により１ｍ ｏｌのＣ！ＮＢｒＧ性化セノ・アローゼ４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ｐｉｓｃａｔ−ａｗａｙＮｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　Ｕ８Ａ 、）に精舎した。２４アミノ酸ペプチドはブルトンーフンタ試薬によって１２５ １でもって特別な油性的１０’ｃｐｍ／μ、９にアイソトープで標識された。、 ２０μｌの異なった抗体を有するビーズは６０分間室温で１μｇのアイ”ソトー ブで標識したべｆチトのみか又は冷テトラエイコサペプチドの２００μｙの存在 でアイソトープで標識したペプチドのいずれがを含むＰＢＳ−ＢＳＡの１００１ の存在で培妥した。ヒーズはそこでＰＢＢ−ＢＳＡをもって遠心分離により洗浄 し、ガンマ−カンタ−で計数された。

表５はセハローゼビーズに結合した単クローン抗体２Ｇ３　、５Ｈ８，８Ｂ８及 び５Ａｓ（％異的に結合した放射性同位元素標識した）を示す。結合は全体的に 培養晶合物に対する冷（１−２４）の過剰を加えることにより抑制された。同様 な結果はここに図示していないが、単クローン抗体８Ｅ１１と６Ｂ８を用いたと きにも得られた。

実施例　１１ ４Ｎ例１０に記載したように抽出ビ、ナウレシスボロゾイトＯ８蛋白に対してア イソトープ標識抗体の結合に関しく１−１２）と（１−２４）の抑制活性が横討 された。抗原はマイクロタイターウェルの上で固定された。第１図は３のなかの ２つの単クローン抗体（２Ｇ３．’５Ｈ８）が試験された。エピトープは（１− １２）のなかに含有することを示している。白いシンボルは殆ど同じであること を示し、同行な結果は図示してないが８Ｂ８についても得られた。

抗体８Ｅ１１の結合は（１−２４）によってのみ抑制された。

実施例　１２ 早りローン抗４２Ｇ３．５ｕ８及び８Ｂ８によるエピトープのｒｔ識 より短い連続する同族体及び表７に示された２つのエピトープ（７−ｊ）を重複 をしているが１つのペプチドは実施例１０と１１に記載され抑制免疫測定法を用 いて２Ｇ３．５Ｈ８及びｓＢａ抗体の特異性を解析するのに用いたう第７図、第 ８図、第９図及び表９に集約して示したようにこれらの抗体の反応性のパターン は篤＜ハど同一である。ペプチド（１−１２）、（２−１２）、（３−１２）。

（４−１２）　、　（５−１２）　、は強力に抑制性であった５　（１−２４） と同じように効果的でめった。モル基ｆｉ（ｍｏｌａｒ　ｂａ８１日）について 、彼等の活性は同一でめった。成る場合にはより大きなペプチドがわずかに良い 抑制因子であるように思われた。しかしながら活性のかなりの低下が（５−１２ ）に比較して（６−１２）と（７−１２）で観察された。これらの結果は断片の ”Ｐ５　Ｇｌｙ−Ａ’１ａ−Ａｓｎ−−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇ’１ｎ−Ｐｒｏ、２ 　の免疫慢性なエビトニグの存在を示す５Ｃ−末端アミノ酸の関与を決定するた めに（４−１０）と（４−１１）の活性は（４−１２）の宿性と比較された。ま た第７図、第８図、第９図に示したようにプロリンの睨洛（ペプチド４−１１） は単クローン抗体２（）３と８Ｂ８に関して反応性はわずかな効果であった。一 方、グルタミンとプロリン（４−１０）の両方を戎４することは抗原とすべての ３つの抗体との反応を抑制する能力をいらぢるしく消失させる。より短いペプチ ドの（４−９）、（５−９）、（６−９）、（７−９）、（８−１２）。

（９−１２）及び（１０−１２）は事質上不活性だった。

実施例　１３ 上述したようにビ、ナウレシのＯ８蛋白により抗体８Ｅ１１の反応は（１−２４ ）により抑制された。ａＳ蛋白に対する放射性同（１−２４）の一度について戴 京された。逆に（１−１２）はｉｏ　−２Ｍ（第６図をみよ）の限度家は抑制効 呆を■しなかった。

冥赤例　１４ ペプチド：　Ａ’ｌａ７−Ａ８Ｊ−Ａｌａ、−Ｇ１７１０−ＧｌｎＢ　−ＰｒＯ １２−Ｇｌｎ、　−Ａｌａ、　−Ｇ１ｎ３−Ｇ１７４−ＡＢｐ％　−Ｇｌｙ６は 上述したように合成した。上の災匙例のようにＭ７ＦＩされたがこのペプチドは 不油性でみることが見出された。

表　１ ピ、ナウレシイのＣ８蛋白に関する免疫優性部分の存在のための証拠 表　２ ピ、ビバックス、ｕＩＣＳ蛋白に関する免疫優性部分の存在に対する証拠 表　３ ビ、ナウルンバリウム′ＤＯ８蛋白ｊＣ関する免疫源゛生部分の存在のための証 拠 表　４ 単クローン抗体２Ｇ３及び合成ペプチドによって行われた２−サイドの放射性同 位元素で標識免疫検定の結果 ５０、　１０３　２０５６ ．０５　３５ 表　５ ピ、ナウレノのＣ８蛋白（′ｃ対する単クローン抗体（２Ｇ３）の結合を抑制す る合成トテカベブチド１０　６　５５８２　３８９０　３０１８　１０９９１０ ５　４３９０　１２２１　７８１　３６１表　６ クローン抗体 ２４量体　２．５ 表　７ （、ナウレンＣ８蛋白の合成ペプチドセグメントのアミノ酸組成と試みの分析 １４２　１．８４℃２）　０．９５　ｆｌ）　３．００　（３１３，０Ｏ＋３１ ２．９７ｉ３１　１．４係２４２　２．２１ｔ２］　０．８５＋１１　２．１５ （２１３，００（３１３，０２３１Ｎ、Ｒ。

３−１２　２．１８＋２）　１．０７（１１２，０Ｏｆ２１　２．７７（３）１ ．８８！２）　Ｎ、Ｒ。

４−１２　２．０１２）　１．１０ｆｌｌ　Ｏ，８８（１）　２．８４（３］１ ．９７（２）　Ｎ、Ｒ。

５−１２　２．１８　＋２１　１．１７　ＩＩＩ　１゜００　ＦＩ＋　２．００ 　ｆ２］　１．９３Ｆ２＋　Ｎ、化６−１２　０．９３１１］　１．００　ｉｌ ｌ　Ｏ，９７＋１１　２．１３　＋２）　２．１６ｆ２１　Ｎ、Ｒ。

７−１２　０．９０ｔｌ＋　１．１４（１１１，０３（１１１，００Ｆ１１２． ０α２）　Ｎ、Ｒ。

８−１２　０．９２Ｆ１１　１．０５（１１１，０１ｆ１．１　１．０Ｏｆ１． ＋１．Ｏα１１Ｎ、Ｌｌｏ−１２−−１，１０（１１１，０１１１１１，０Ｏｆ １．１−−　Ｎ、Ｒ。

４−２４　４．１５ｊ４）　１．９７ｆ２）　６．１４　＋６）　６．０５　＋ ６）　５．９５ｆ６１　２．１係４−１１　２．１６＋２１　−−　０．８８（ ］］　３．４０（３１２・０Ｑ２１　Ｎ、ル５−１０　２．０６Ｌ２１−−０． ９５ｆ１．］２．２１ｔ２１２．０１１２１Ｎ、Ｒ。

４−１１　１．８８Ｆ２）　−−−−３，００（３１１，７５＋２）　Ｎ、Ｒ。

４−９　２．０Ｏｆ２）　−−−−２，１８＋２１１．９７Ｆ２）　Ｎ、Ｒ。

５−９　２．０Ｑ（２］　−−−−０，８１（１，１２，１４ｆ２ＩＮ、Ｌ６− ９　１．００（ｌｌ　−−−−０，７５（１１２，１道２）Ｎ、Ｒ。

７−９　１．００（１’ｌ　−−−−−−２，２１ｔ２）Ｎ、Ｒ。

７−６×１．９４ｔ２１　ｏ、−ｓα（１１３，０６ｉ３ｉ　２．９５　（３） 　２．９１（３１Ｎ、Ｒ。

×　２つのエピトープの架橋したペプチドＧｔｙ４Ａｓｐ５Ｇｔｙ６ 表　８ ピ、ナウレシのスポロゾイト表面蛋白に対して生起した異なった単クローン抗体 て対する１２５■−標識テトラエイコサ−ペプチド（２４アミノ酸）の結合・う ２Ｇ３　２２９２（２５−８）　２５　（０，２）５Ｈ８２３３２（１９，７＋ 　２０　（０，２）８Ｂ８　３１５５　（２７，８）　２０（０，２）８Ａ　８ 　１０９３　（１０，３１２５（０，２）対照　２５（０，２）　０ 表　９ ピ、ナウレシｃｓ蛋白に対する放射性元素で標識した単クローン抗体の結合に関 する合成ペプチドの抑制効果 ８　Ｂ　８　２　Ｇ　３　５　Ｈ８ ４−１１１０−１２１ｏ−１２１０−１０ｏ　ｅ　ロ　ロ　ロ　ｏ　Ｏロ　ロ　 ０　ロ　ロ０　ロ　Ｃ００ＣＯＯＯＣ＋０ ＋　ＮＭ　＋Ｆ　１．１１　＜　１＋　中　小　ロ　−　〜１０−１３１０−１ １１０−９１０−７１０−５べ７°１５−￥のモ）Ｖ′：／展度　（×５）ＦＩ Ｇ、６ （９−○ＬＸ）　−Ｒ４しく、マ冬 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，４識別記号　庁内整理番号＠発明者　エリス、ジョアン　７ ０発　明　者　ゴツドソン、ジー　ニーゲル　ア＠１発明者　ヌツセンツバイグ 、ルース　エ　ア＠発明者　ヌツセンツバイグ、ビクター　７０発　明　者　シ ュレジンガー、ディピッド　アエツチ　イノ ○発明者　スペック、パメラ　ニス　ア＠発明者　ザバラ、フイデル　ア１ メリカ合衆国　ニューヨーク　１００２２　ニューヨーク　イーストツイツチイ ーサード　ストリート　３３３メリ力合衆国　ニューヨーク　１００１２　ニュ ーヨーク　ブリーカストリート　１１０ メリカ合衆国　ニューヨーク　１００１２　ニューヨーク　ブリーカストリート 　１１０ メリカ合衆国　ニューヨーク　１００１２　ニューヨーク　ブリーカストリート 　１１０ メリカ合衆国　ニュージャージ　０８５３６　プレインズポロークワ□し　リッ ジ　６０１ メリカ合衆国　ニューヨーク　１００１２　ニューヨーク　ワシントスクウエア 　ビイレッジ　１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　プラスモチイウム属の１員のスポロゾイト保護抗原蛋白のエピトープから 成るポリペプチド。 ２、アミノ酸配列の繰返しペプチドに一致して、上記繰返しペプチドがプラスモ チイウム属の１員のスポロゾイト保護抗原蛋白の免疫優性部分とからなることを 特徴とする特許請求の範囲第１項記載のペプチド。 ３、　プラスモチイウム属の１員がヒ、ファルシバリウム、ピ　ビバックス、ビ 、ナウレン、ピ、マラリアエ、ピ、ンノチルジ、ピ。 バーヘイ、ピ、ヨエリ、ニゲリエンンスの群つ・らえらば拝ることを特徴とする 特許請求の範囲第１項のペプチド。 ４、アミノ酸配り１ｊ（ａｔｎ　Ａｔａａｔｎ　ａｔｙ　ＡＳｌ［）　−ａｔｙ 　Ａｔａ　Ａｓｒ＋Ａｔａ　Ｇａｙ　Ｇｔｎ　ｐｒｏ　）からなることを特徴と する特許請求の範囲第１項から第２項記載のいすｎか１つによるペプチド。 ５、活２性成分としてのプラスモチイウム属の１員のスポロゾイト保護抗原蛋白 のエビ−ドブのペプチドと担体とからなることを特徴とする抗マラリアワクチン 。 ６、上記合成ペプチドは蛋白担体に吸着又・は共有結合的に付加することを特徴 とする特許請求の範囲第５項記載のワクチン。 ７、プラスモチイウム属の１員のスポロゾイトの保護抗原Ｃ８蛋白のエビ、トー プに一致するアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチド。 ８、　保護抗原Ｃ８蛋白のエビ・トープに一致するアミノ酸酢ケリば１ヒ学的に 合成さεることを特徴とする特許請求、Ｄ範囲第７項記載のペプチド。 ９、プラスモチイウム属の１員がピ、ファルンバリウム、ピ、ビババーヘイ、ピ 、ヨエリ　ニゲリエン／スの群つらえらば才りることを特徴とする特許請求の範 囲第７項記載のペプチド。 １０、　上記アミノ酸配列は（Ｇｉｎ　ＡＡａ　Ｇｌｒ＋　Ｇｔｙ　Ａｓｐ　Ｇ ｌｙ　ＡＡａ　−Ａｓｎ　Ａｔａ　Ｇｌｙ　Ｇｔｎ　Ｐｒｏ　）であることを特 徴とする特許請求の範囲第９項記載のペプチド。 １１、生理的に受け人ｎらｎる媒質に特許請求の範囲第８項又は第９項によるペ プチドからなる抗マラリャ、ワクチン。 １２、生理的に受け人訛られる媒質中に蛋白担体に共有結合的に付加され、又は 吸着さｎる特許請求の範囲第７項記載によるプラスモディム属の１勇の原調抗原 蛋白のエピトープに一致するアミノ酸配り１１のペプチドからなる抗　マラリャ 哨乳り動物免疫用ワクチン。 １３、上記ペプチドがプラスモチイウム属のスポロゾイト保護抗原Ｃ８蛋白（Ｃ 対する単クローン抗体又はポリクローン抗体に免疫化学的に反応性であることを 特徴とする特許請求の範囲第１２項記載のワクチン。 １４゜（ａ）　プラスモチイウム属の１員のスポロゾイト保護抗原Ｃ８蛋白のエ ピトープからなる繰返しペプチドと（ｂ）　微生物の原核生物蛋白の部分とから 実質的になる微生物によって製造さｎる融合蛋白。 １５、　上記プラスモチイウム属の１員がピ、ファルシバリウム、ピ。 ビバソクス、ビ、ナウレン、ピ、マラリアエ、ピ、シノモルジ。 ピ、バーヘイ、ピ、ヨエリ　ニゲリエン／スの群がらえらばｎることを特徴とす る特許請求の範囲第１４項の融合蛋白。 上記ペプチドはアミノ酸配列の（Ｇｔｎ　Ａｔａ　Ｇｔｎ　Ｇｔｙ　ＡｓｐＧｔ ｙ　Ａ／−ａ　Ａｓｎ　Ａｔａ　Ｇｌｎ　ｐｒｏ　）からなることを特徴とする 特許請求の範囲第１５項記載の融合蛋白。 特許請求の範囲第１項から第４項、第７項、第９項及び第１０項のペプチドが純 粋にさｆた形であることを特徴とするペプチド。 特許請求の範囲第１項、第２項及び第３項のペプチドのチオギンヌクレオチド配 列遺伝暗号から実質的になるチオキー′リボ核酸鎖。 アミノ酸配列（Ｇｌｎ　Ａｔａ　Ｇｔｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｔａ　Ａ ｓｎ　ＡｔａＧｔｙ　Ｇｔｎ　ｐｒｏ　）のチオギンヌクレオチド配列遺伝暗号 から実質的になるチオキシリボ核酸鎖。 特許請求の範囲第１項、第２項、第３項及び第４項のペプチドのチオギンヌクレ オチド配列遺伝暗号から実質的になる挿入チオキシリポ核酸−を含むチオキシリ ボ核酸運搬媒介体。 アミノ酸配列（Ｇｉｎ　ＡＡａ、　Ｇｔｎ　ＧＡＹ　Ａｓｐ　Ｇｔｙ　Ａ／ｉａ 　−Ａｓｒ＋　Ａ、ｅ８Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　）のチオギンヌクレオチド配 列遺伝暗号から実質的になる挿入デオク／リボ核酸鎖を含むチオキシリボ核酸運 搬媒介体。 上記デオギンリボ核酸籟が直接的に又は融合蛋白としてのｌｚ）すれかで遺伝暗 号配列の表現に適している場所に挿入さｆＬ　４．ことを特徴とする特許請求の 範囲第２Ｊ−項のチオキシリボ核酸運搬媒介体。 特許請求の範囲第２２項による挿入チオキシリポ核酸領からなる表現媒介体によ り形質転換さｎることを特徴とする微生物。 特許請求の範囲第２１項による挿入デオギノリボ核酸鎖からなる表現媒介体によ り形質転換さ、！′Ｌることを特徴とする微生物。 アミノ酸配列（Ｇ４ｎ　Ａｔａ　ＧｔｒｖＧＬｙ　ＡＳＩ）Ｇｌｙ　−Ａ／−ａ Ａｓｒ＋　Ａｔａ　Ｇ４ｙ　Ｇｔｎ　Ｐｒｏ　）なることを特徴とする合成’； ”ブチド。 プラスモチイウム、罵の１員の保護抗原蛋白のエピト、−ブからなることを特徴 とする縦一列の繰返しベブチＩ・。 実質的にアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を治するペプチドであって、」二記 配列はプラスモディウム周囲スポロゾイト蛋白の縦１列に虜返さ１．ろポリペプ チドの繰返し単位の免疫優訃なエピトープを限定ｊ−１上記ペプチドは上記繰返 しくＦ位より短い長さてあ乙ことを特徴とずろアミノ酸配列を有するペプチド。 上記周囲スポロゾイト蛋白がプラスモティウムナウレシからなることを特徴とす る特許請求の範囲第２８項記載のペプチド。 上記ポリペフチドツト上記ポＩＪ−、プチドのＮ末端からＣ末端外でにアミノ酸 配列［Ｇｔｎ、　−Ａｈａ、、　−Ｑ７ｎ３−　Ｇｔｙ４−　Ａｓｐ５　’−Ｇ ｌｙ６−　ＡＡａ７−　Ａ−ｎＢ　−Ａｌａ、−ｃｔｙｌｏ　−Ｇ１ｎ１１−　 ｐｒｏ＋２　）を有することを特徴とする特許１清求の範囲第２９項記載の一ブ チド０ アミノ酸配列がアミノ酸残基５−１１を含み、アミ７ノ酸残基１−３を取り除き 、すくなくとも４及び１２０１つを含むことを特徴とする特許請求の範囲第３０ 項記載のペプチド。 上記配列のアミ、ノ酸残基５かし１２のものからなることを特徴とする特許請求 の範囲第３０項記載のペプチド。 上記配列のアミノ酸残基４がら１１のものからなることを特徴とする特許請求の 範囲第３０項記載のペプチド。 化学的に合成さ１．たことを特徴とする特許請求の範囲第３０項記載のペプチド 。 化学的に合成さｎ−’ｃことを特徴とする特許ｄ請求の範囲第２９項記載のペプ チド。 アミノ酸配列ＡＳＴ）　−Ｇｔｙ　−Ａｔａ　−Ａｓｎ　−Ａｔａ　−Ａｔａ　 −Ｇｌｙ　−Ｇｔｎ　−ｐｒ、ｏを有することを特徴とするペプチド。 アミノ酸配列Ｇｔｙ−Ａｓｐ　−Ｇｔｙ　−ＡムーＡｓｎ　−Ａｔａ　−Ｇｌｙ −Ｇｌｎ　を有することを特徴とするペプチド。 上記ペプチドが上記周囲スブロゾイト蛋白に対して少くなくと、も２つの単クロ ーン抗体と免疫化学的に反応性であることを特徴とする特許請求の範囲第２８項 記載のペプチド。 実質的に純粋にさ几た形であることを特徴とするプラスモチイウム種のスポロゾ イトの抗原蛋白。 プラスモチイウム属の１員の周囲スプロゾイト蛋白からなることを特徴とする特 許請求の範囲第３９項記載の抗原蛋白。 プラスモチイウム　ファルシパ’Ｕウムの周囲スブロゾイト蛋白からなることを 特徴とする特許請求の範囲第３９項記載の抗原蛋白。 ピロ　ビバックスの周囲スプロゾイト蛋白からなることを特徴とする特許請求の 範囲第３９項記載の抗原蛋白。 微生物によって製造されるプラスモチイウム種のスポロゾイトの抗原蛋白であり 、上記微生物が上記蛋白のそこに挿入さユるデスキ７・　ヌクレオナト配列遺伝 暗号ｊイ１ずろ表現媒介体（・（＝より形質変換され、形質変戻さｎだ微生物は Ｌ置市白土製造するｆ指刀があることを特徴とする抗原蛋白。 プラス士ディウム属の１員・Ｄ周囲ス−ド口、〕〕゛イｌ−蛋しなることを特徴 とする特許請求の範、間第４３項記載の蛋白。 フラスモテ１ウム　ファル／バリウムの周囲スボロノ・１ト蛋白からなることを 特徴とする特許晶求の範囲第４３項記載の蛋白。 プラスモチイウム　ピ・くノ５スの周囲：２１：ｏヅ１１・蛋白からなることを 特徴とする特許請求の範囲第４３項記載の蛋白。 そのアミノ酸、連鎖の炭素−末端部分としてプラスモチイウム種のスポロゾイト の抗原蛋白とその一アミノ酸連鎖の窒素−末端部分として微生物の原核生物蛋白 の部分とからなる（−とを特徴とする微生物により製造さｎる融合蛋白。 抗原蛋白がプラスモチイウム　ファル７）°リウムの周囲スポロゾイト蛋白から なることを特徴とする特許請求の範囲第４７項記載の融合冠白。 抗原蛋白−ウ；プラスモチイウム　ビバノクスの周囲スポロゾイト蛋白つ・らな ることを特徴とする特許請求の範囲第・１７項記載の融合蛋白。 抗原蛋白がプラスモチイウム属の１負の周囲スポロノ゛イト蛋白刃・らなること を特徴とする特許請求の範囲第４７項記載の融合蛋白。