BG99246A - Молекули на рекомбинантна дезоксирибонуклеинова киселина (днк), кодиращи ензими аминопептидаза,и приложението им за получаването на ваксини против хелминтни инфекции - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до молекули на нуклеиновакиселина, съдържащи нуклеотидни секвенции, кодиращи хелминтни аминопептидазни ензими, и антигенни фрагменти и функционално-еквивалентни варианти, и до тяхното приложение за получаването на ваксини против хелминтни паразити и кодирани от тях синтетични полипептиди.

Description

• ·

• « * ·· ·· МОЛЕКУЛИ НА РЕКОМБИНАНТНА ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА :::::::::::::::::: :::::::::::: :::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ™:::::::::::::::::::::: :: и:::::: :::: :::: :::::::: :::::::::::::::: :::::::: (Д Η К), КОДИРАЩИ ЕНЗИМИ АМИНОПЕПТИДАЗА И ПРИЛОЖЕНИЕТО :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ИМ ЗА ПОЛУЧАВАНЕТО НА ВАКСИНИ ПРОТИВ ХЕЛМИНТНИ ИНФЕКЦИИ ::::::::::::::::::и:::::::::::::::::::::::::::: :::: и:::::: Представяното изобретение е за получаването на защитни антигени посредством технология за рекомбинантнз дезоксирибонуклеиноба киселина (ДНК) за използване като антихелминтни средства и като защитни иманогени при контрола на заболявзнията, причинени от хелминтни паразити. Хелминтните паразити са причинители на широк кръг заболябания и опаразитябания на домашни животни, които водят до големи загуби на продукция от животновъдството, както и до висока смъртност при животните и имат голямо икономическо значение. Така например, хранещият се с кръв глист • · НАЕ Μ Ο N с Η и 3 гастроинтестиналния инфектира покривния епител на животни, на преживните тр а к т причинявайки анемия и загуба на тегло и ако последните небъдат лекувани, често причинява смърт» Животни, заразени със сродния нематод 05ТЕЕТАС11А, са със забавен растеж и ако не се лекувани, умират. Друг род хелминти, както и метили, с икономическо значение включва ΤΕΙ0Η03ΤΕ0Ν0ΥΙ..113 и ΝΕΜΑΤ0ϋΙΕυ3 които причиняват ентерити в различни животни. Много проблеми създават също така и нематоди като а нкилос томите (напр. ΝΕΟАТОН, ΑΝ0ΥΙ_05Τ0ΜΑ, ΟΝΟΙΝΑΕΙΑ и вимозтомим ЗЕР') и метили (напр. ЕАЗСЮЕА, РАЕАМРНIЗТОМиМ и ГНСНОСОЕсШМ) и техните сродни паразити, които освен преживните и домашните животни, заразяват също и човека, често с Фатални последици. Профилактиката при хелминтните паразити понастоящем се обляга на първо място на използването на антихелминтни лекарства, комбинирано със строг контрол, на пасбищата Тази схема причинява много затруднения - честото даване на лекарства и контрола на пасбищата са трудно осъществими в практиката; все повече зачестява лекарствената резистентност на хелминтните колонии. Затова в тази област е налице необходимостта от ефективна антихелминтна ваксина и. много усилия се концентрират в тази насока през последните години. Обаче, засега няма ваксини на молекулярно или по-ниско ниво със комерсиална значимост за големите хелминтни видове, в частност за гастроинтестиналните нематоди на преживните животни, като ΚΑΕΜΟΝΟΗΟΕ и 03ΤΕΕΤΑ0ΙΑ. Най - обещаващи резултати са били получени с неизвестни до сега белтъци, изолирани от ΗΑΕΜ0Ν0ΗΙ.Ι3, които • · имат потенциални възможности на защитни антигени не само срещи ΗΑΕΜΟΝΟΗυδ, но и също срещи редица други хелминти.Например, протеиновият дублет ΗΙΙΟϋ, наскоро открит върху лименалната повърхност на червата на Н.С0№Т0Е'ТиЗ е показал, че създава защитен имунитет срещу хемонкозата при овцете. Белтъкът ΗΙΙΟϋ от Н. СОИТОЕТиЗ притежава приблизително молекулно тегло от 110 килодалтона ( кв) при редуцирани или нередуцирани условия, както е определено от 303-РА8Е, и описано в №088/00835 и №090/110860. Терминът ΗΙΙΟϋ, както е използван в изобретението, се отнася за протеиновият дублет ΗΙΙΟϋ, дефиниран в №088/00835 и №090/ 11086, Кореспондиращи белтъци са били установени напоследък в други хелминтни видове, напр. ΝΕΟΑΤΟΕ АМЕРХОиЗ.. Методите за пречистване на ΗΙΙΟϋ са били описани в №088/00835, което е достатъчно за характеризирането на белтъка и може да бъде осъществено извличане за да стане възможно получаването му в експериментални или промишлено значими количества. Възниква необходимост от подобрения, а също и намирането на подходящ източник, за да се получават не само ΗΙΙΟϋ, но и също антигенни протеини, специално за процес, основаващ се на рекомбинантна ДНК технология и експресия на белтъците? в подходящи трансформирани прокариотни и еукариотни организми. Представяното изобретение се стреми да осигури и подобрен способ за получаване. Детерминация на секвенция на клонирани ДНК (кДНК) за ΗΙΙΟϋ от ΗΑΕΜΟΝΟΗΟδ ΟΟΝΤΟΡΤΟΒ е била осъществена и предсказаните амцнокиселинни секвенции са проявили хомоложност по отношение на семейство от интегрални мембранни аминопептидази (системно наименование: • · · I · · • · · · · · · • · • · · α - а мино а цил об а пептид на х и д р о л а з а ( мик р озомна ) . Интегралните мембранни анинопептидази от бозайници са локализирани б много тъкани, например върху микробиларния епител на червата и бъбреците. Тяхната функция б бъбреците е неясна, но б чревния тракт те разцепват малките пептиди, които са крайни разградни продукти нз. храносмилането (за справка виж Кеппу & Магоих, 1782; Кеппу&Тигпег, 1787; Могеп а!., 1786:; Βοιίιβηζа,, 1786)., В един аспект, представяното изобретение осигурява молекули на нуклеинова киселина, включваща една или повече нуклеотидни секвенции, които кодират хелминтни аминопептидазни ензими или знтигенни участъци субстанциално кореспондиращи с всички или на част от нуклеотидните секвенции, както е показано във Шиг. 2, 3, 4 или 5 (8Е0 Ю N08: 1 до 15) или последователности, кодиращи за хелминтни аминопептидазни ензими, които са субстанциално хомоложни с или които хибридизират с всяка от упоменатите секвенции. Нуклеиновата киселина според изобретението може да бъде единична или с двуверижна ДНК, кДНК или РНК, Вариациите в секвенциите, кодиращи нуклеотида на аминопептидаза могат да се проявят през различни етапи от жизнения цикъл на хелминта (напр. между лавра и зряла Фаза), между сходни колонии от различни географски райони, а също и в един и същ хелминт. Различните вариации са включени в обхвата на това' изобретение. "Субстанционни хомолози", както се използва в заявката, включват тези секвенции, имащи секвенционна идентичност от приблизително 507. или повече, напр. 60% или повече и също функционално-еквивалентни алелни варианти и сродни секвенции, модифицирани посредством заместване, • · • · ’ • · · · • · · · * · · · • ♦ · · присъединяване или делеция с единична или множествена ваза. Чрез "функционален еквивалент" е обозначена секвенция на нуклеинова киселина, която кодира полипептиди, имащи аминопептидазни активности, които са със сходна имунореактивност т.е. които предизвикват защитни антитела в гостоприемнияа срещу хелминти. Молекули на нуклеинови киселини, които хибридизират със секвенциите, показани на Фиг. 2, 3 или 5 (съставени от 8Е(3 Ю N08: 1 до 15) или някой субстани,йонен хомолог или функционално-еквивалентни секвенции, както са дефинирани по-горе, са също включени в обхвата на изобретението, "Хибридизация" както е използвана тук, определя тези секвенции, свързани при неразгънато състояние (6 >; ЗЗС/507. формамид при стайна температура) и промити при условия на слабо разгъване (2 х 53С, стайна температура, за предпочитане 2 ;·; ЗСС, 42° С) или състояние на силно разгъване, нзпр. 2 83С, 65°С (където 83С = 0.15 М ИаС!, 0.015 М натриев цитрат, рН 7.2). Методи за продуциране на такива производно свързани секвенции, напр. чрез насочени към участък мутагенези, случайни мутагенези или ензимно разграждане и/или лигиране на нуклеинови киселини, са добре известни в науката, като методи за детерминираме на така модифицираните нуклеинови киселини, имащи, значима хомология към субекта на секвенци.ята например чрез хибридизация. Осигуряване на молекула на аминокиселина, според изобретението, дава възможност да бъдат получени рекомбинантни аминопептидазни ензими или имуногенни Фрагменти, в количества досега недостижими, при това позволяващи получаването на амтихелминтни ваксини. • · • · · · · · « синтетичен В друг аспект, представяното изобретение, осигурява молекули на нуклеинова киселина, включващи един или повече нуклеотидни секбенции, кодиращи един или повече полипептиди, способни да произведат защитни антитела срещу хелминтни паразити, чиито секвенции инкорпорират един или повече антигенни детерминзнт - кодиращи региони от аминопептидазни кодиращи секвенции, както е показано на Фиг. 2, 3, 4 или 5 (съставени от ЗЕО ΙΠ N03: 1 до 15). Представяното изобретение също се отнася и за синтетични полипептиди, включващи една или повече амино киселинни секвенции, конститутирани на базата на аминопептидазен ензим или антигенен участък, кореспондиращи с всички или с част от нуклеотидните секбенции, както е показано на Фиг. 2, 3, 4 или 5 (ЗЕО Ю N03: 1 до 15), или функционално-еквивалентен вариант вместо друг синтетичен полипептид, кореспондиращ с белтъчният дублет НИСШ, или кореспондиращ полипептид, от индивидуалните полипептидни секвенции, N0/11086,, Алтернативно погледнато, изобретението също предлага синтетични полипептиди, включващи зминокиселинна секвенция, конституираща ензима зминопептидаза или антигенна част, субстанционно кореспондиращи със всички или с част от нуклеотидните секбенции, както е показано на Фиг. 2, 3, 4 или 5 (ЗЕС! Ю N03: .1 до 15) или функционално-еквивалентен вариант вместо това, субстанционално свободен от други компоненти на ΗΑΕΜ0Ν0ΗΙΙ3 СОПТОКТиЗ. Представяното изобретение също се простира върху съставки на ваксина, стимулираща имунните отговори срещу хелминтни паразити при хора или при животни, включваща поне с някои посочени в ”6' един синтетичен полипептидР както е дефиниран по-горе? заедно с Фармацевтично подходящ носител. М0/11086 открива редица полипептидни или частично полипептидни секвенции, довити посредством протеолитично разграждане или химична разцепване на протеиновият давлет Н1100, както следва; (a) Метионин Глицин Тирозин Пролин Вали.н Валин Лизин Валин Глатаминова к-на Глатаминова к-на Фенилаланин (b) Метионин Глицин Фениаланин Пролин Валин Левцин Треонин Валин Глатаминова к-на Серин (c) Метионин Глицин/Фенилаланин Аспарагин Фенилаланин Лизин Изолевцин Глатаминова к-на/Валин Треонин/Тлатаминова к-на Аланин Глицин (в) Метионин Лизин Пролин/Глатаминова к-на Треонин/Валин Лизин Аспарагинова к-на/Аланин Треомин/Лизин Левцин - Изолевцин Треонин (е) Метионин Левцин Аланин Левцин Аспарагинова к-на Тирозин Хистидин Серин - Фенилаланин Валин (ί) Метионин Левцин Аланин Глатаминова к-на/Тирозин Аспарагинова к-на Глатамин/Аланин Глатаминова к-на Аспарагинова к-на Валин (д) Метионин Глицин Фенилаланин Пролин Левцин Валин Треонин Валин Глатаминова к-на Аланин Фенилаланин Тирозин (Ь) Метионин Лизин Треонин Пролин Глатаминова к-на Фенилаланин Аланин Валин/Левцин Глатамин Аланин Фенилаланин/Треонин Аланин Треонин Серин/Глицин Фенилаланин Пролин (ί) Лизин Хистидин/Тирозин Аспарагин/Валин Серин Пролин Аланин Аланин Глатаминова к-на Аспарагин/Левцин -7- Лебцин Аспарагин/Глицин О) Лизин - Треонин Серии Валин Аланин Глутаминоба к-на Аланин Фенилаланин Аспарагин (k) Лизин Аланин Аланин Глутаминоба κ-на Валин Аланин Глутаминоба κ-на Аланин Фенилаланин Аспарагиноба к-на - Изолебцин - - - Лизин Глицин (l) Лизин Аланин Валин Глутаминоба κ-на Валин/Пролин Аланин Глутаминоба κ-на Аланин ФенилалаНин Аспарагиноба κ-на Аспарагиноба κ-на Изолебцин Треонин? Тирозин - - Глицин Пролин Серии (т) Лизин - Глутаминоба к~на Глутаминоба κ-на Треонин Глутаминоба κ-на Изолебцин Фенилаланин Аспарагин Метионин (п) Лизин - - - Пролин Фенилаланин Аспарагин/Аспарагин Изолебцин Глутаминоба κ-на Аланин Лебцин (o) Аспарагиноба κ-на Глутамин Аланин Фенилаланин Серин Треонин Аспарагиноба κ-на Аланин Лизин (р) Метионин Глицин Тирозин Пролин Валин Валин Лизин Валин Глутаминоба κ-на Глутаминоба κ-на Фенилаланин - Аланин Треонин Аланин Лебцин (p) Метионин Глицин Фенилаланин Пролин Валин Лебцин Треонин Валин Глутаминоба κ-на Серин - Тирозин? - Треонин (г) Метионин Глутаминоба к-на/Фенилаланин Аспарагин Фенилаланин Лебцин Изолебцин Глутаминоба к-на/Валин Треонин/Глутаминоба κ-на Аланин Глицин Изолебцин Треонин (з) Метионин Глицин Фенилаланин Лебцин Валин Треонин Валин Глутаминоба κ-на Аланин Фенилаланин Тирозин Треонин Серин -8- • · · · • · · · • ♦ · · , · · · · с · · · • · · · (ί) Метионин Лизин Треонин Пролин Глутаминоба к-на Фенилаланин Аланин Валим/Лебцин Глутамин Аланин Фенилаланин/Треонин Аланин Треонин Серин/Глицин Фенилаланин Пролин (и) Метионин Лизин Пролин/Глутаминсзба к-на Треонин/Валин Лебцин Аспарагиноба к--на/Аланин Треонин/Лизин Лебцин Изолебцин Треонин - Глицин (ν) Метионин Лебцин Аланин Лебцин Аспарагиноба к-на Тирозин Хистидин Серии - Фенилаланин Валин Глицин? (м) Метионин Лебцин Аланин Глутаминоба к-на/Тирозин Аспарагиноба к-на Глутамин/Аланин Глутаминоба к-на Аспарагиноба к-на Валин ( к ) Лизин Хистидин/Тирозин Аспарагин/Валин Серин Пролин Аланин Аланин Глутаминоба к-на Аспарагин/Лебцин Лебцин Аспарагин/Глицин (у) Лизин - Треонин Серин Валин Аланин Глутаминоба к-на Аланин Фенилаланин Аспарагин (г) Лизин Аланин Аланин Глутаминоба к-на Валии Аланин Глутаминоба к-на Аланин Фенилаланин Аспарагиноба к-на - Изолебцин - - - Лизин Глицин (аа) Лизин Аланин Валин Глутаминоба к-на Валин/Пролин Аланин Глутаминоба к-на Аланин Фенилаланин Аспарагиноба к-на Аспарагиноба к-на Изолебцин Треонин? Тирозин - - Глицин Пролин Серин (ЬЬ) Лизин - Глутаминоба к-на Глутамин Треонин Глутаминоба к-на Изолебцин Фенилаланин Аспарагин Метионин (сс) Лизин - - - Пролин Фенилаланин Аспарагин/ Аспарагиноба к-на Изолебцин Глутаминоба к-на Аланин Лебцин (άβ) Аспарагин Глитамин Аланий (Пенила ланин Серин Треонин Аспарагиноба киселина Аланин Лизин Известна несигурност е показана при Формата Фенилаланин/Глицин, където кода от първите три букви представя най-вероятните коректни аминокиселини, базирани на силата на сигнала или от въпросителен знак; символът означава неизвестен остатък. Специфичните които са разкрити в индивидуални полипептидни секвениии, Μ0/Ό9/11086 са отказани като патентна претенция. Терминът "полипептид" както тук е използван, включва два протеина с пълна дължина и по-къси пептидни секвенции. "Функционален еквивалент" както е използван по-горе във връзка с полипептидната аминокиселинна секвенция, I- дефинира полипептиди, свързани или произлезли от гореспоменатите полипептидни секвенции, където аминокиселинната секвенция е била модифицирана чрез единично или множествено аминокиселинно заместване, прибавяне или делеция, и също секвенции, където аминокиселините са били химически модифицирани, включително посредством гликолизация или дегликолизация, но при запазена защитна антигенна (имуногенна) активност. Такива функционално-еквивалентни варианти могат да се явят като природни биологични вариации или да бъдат получени при използването на известни техники, например Фннкционално еквивалентни рекомбинантни полипептиди могат да бъдат получени с помощта на добре известните техники на насочени към участък мутагенези, случайни мутагенези или ензимно разграждане и/или лигация на а м и н ок ис елин и. Най - общо, с и н т е т и ч н и т е полипептиди, според 10·· изобретението представляват защитни антигенни секвенции. Терминът "защитен антиген", както е използван тик, дефинира тези способности на антигените да генерират б гостоприемника защитна (иманогенна) имунна реакция, т.е. отговор на гостоприемника, които боди до генериране? на имунни еФекторни молекули, антитела или клетки, които стерилизират оплодителната способност, или увреждат, инхибират или убиват паразитът и така предпазват гостоприемника от клинични или субклинични заболябания или загуба на продуктивност. Такъв защитен имунен отговор може? обичайно да бъде манифестиран чрез произвеждане на антитела, които са способни да подтискат метаболитните функции на паразита, водят до задръжка на растежа, спиране на продукцията на яйца и/или с мър т. Синтетичните полипептиди, според тази страна на и з о5р етението, мога т да б ъд а т πолуч аба ни експресия в клетки хазяи, рекомбинантна ДНК, която включва нуклеотидна секвенция като обширно описаното по ~ горе оперативно свързване към посредством съдържащи молекула. на експресионна контролна секвенция, или рекомбинантен ДНК клониран носител или вектор, съдържащ такава рекомбинантна ДНК молекула. Алтернативно, полипептидите могат да бъдат експресирани посредством директно инжектиране на непокрита молекула на ДНК, според изобретението в клетката хазяин. Синтетичният полипептид така експресиран може да синтетичен полипептид, включващ част, възпроизвеждаща имуногенността на всички или на част от аминопептидазен ензим й допълнителен полипептид, кодиран за ДНК от синтетична рекомбинантна молекула. Например, може да се иск а да се получи синтетичен протеин, съдържащ синтетична

аминопептидаза или друг полипептид, съгласно изобретението коплиран към протеин като (3-галактозидаза, фосфатаза, глутатион-З-трансФераза, уреаза, хепатит В антиген (Ргапсхз е1. а.1 . , .1989) и подобни. Повечето синтетични протеини' са Формирани посредством експресия на рекомбинантен ген Θ които две кодиращи секвенции са били съединени посредством разчитаща структура във Фаза. Алтернативно, полипептидази могат да бъдат свързани ίη νίί-го чрез химични способи. Всички такива синтетични или хибридни деривати на кодиращи аминопептидаза молекули на нуклеинова киселина и техните респективно аминокиселинни сек вени,ии са включени в представяното изобретение. Такава подходяща рекомбинантна ДНК. полипептидни експресионни техники са описани, напр „ , от ЗатЬгоок еб а1 , , 1989. Алтернативно, синтетичните полипептидази могат да бъдат получени посредством химични способи, като добре известната твърдоФазова синтезна процедура на Мегг1Ие1с1. По-нататъшните аспекти на изобретението включват използването на молекула на нуклеинова киселина или синтетичен пептид, или полипептид, както са дефинирани по-горе, за получаване на ваксинна композиция за стимулиране на имунните отговори при хора и при животни, предимно млекопитаещи, срещу инфекции от хелминтни паразити. Алтернативно погледнато, изобретението предлага и метод за стимулиране на имунния отговор при човека или при млекопитаещи животни, срещу хелминтни паразитни инфекции, включващ прилагането на споменатите животни на ваксинна композиция, включваща един или повече полипептиди, кодирани чрез нуклеотидна секвенция като дефинираната по - горе. Съставът на ваксината може да бъде приготвен според Г * · изобретението посредством методи добре известни при производството на ваксини. Традиционната ваксинна Формулировка може да включва един или повече синтетични полипептиди, според изобретението, заедно, където това е подходящо, с един или повече подобрители, напр. алуминиев хидроокис, сапонин, ΟυίΙΑ, или повече пречистени форми като мурамилен дипептид, минерални масла или Моуазотез, в присъствието на един или повече фармацевтично приемливи носители или разтворители. Подходящите носители включват течна среда като Физиологичен разтвор, подходящ за приложение като носител за вкарване на пептидите или полипептидите в тялото на пациент.Допълнителни компоненти като консерванти също могат да бъдат включени. Алтернативна ваксинна Формулировка може да съдържа вирус клетка гостоприемник, напр. микроорганизъм (уассхпха уггие, авепоуа.гие, 5а1топе11а) имащи инсертирана молекула нааминокиселина (Д Η К молекула), Според изобретението застимулиране на имунния отговор, насочен срещу полипептидазите, кодирани, посредством вмъкната молекула на н у к л е и н о в а к и с е л и н а . Прилагането на ваксинната композиция може да бъде осъществено посредством всеки от конвенционалните пътища, напр. орален или параентерален под Формата на интрамускулна инжекция, оптималното е на интервали, напр. две инжекции на интервал от 7 - 28 дни. Както бе споменато по - горе, аминокиселинната транслация на нуклеотидната секвенция изобразена на Фиг. 2, 3, 4 или 5 показва секвенционна хомология с род от интегрални мембранни аминопептидазни ензими. Това беше детерминирано посредством търсене на необходимите различни бази данни б СОМРиТЕК бРООР 8Е(ЗиЕ1\1СЕ апаПз зоТбмаге раскаде., уегвхоп 7..01., НеуетЬег 199:1. (Реиегеих еЬ а!.,,, 1934,, прилагайки транслациите на секбенциите, показани на Фиг. 2, 3, 4 или 5. Две такива сравнения са показани на Фиг. 6. Експресия на секбенциите, кодиращи аминопептидазата, според изобретението може, както бе споменато по-горе, да бъде изпълнена чрез прилагането на кръг от известни техники и експресионнц системи, включително експресия в прокариотни клетки като Е. со11 и еукариотни клетки като дрожди или бакзлобирусни клетъчни системи от насекоми или трансформирани клетки от бозайници в трансгенни животни или растения. Отчасти благоприятстващи, нуклеотидните секвенции могат да бъдат експресирани при използването на трансгеина нематодна система, като системата за нематодът 0ΑΕΝ0Ρ;ΗΑΒϋΙΤΙ3 описана напр. от Пге, 1986,; Ехге еб а1 . , 1989:; 8рхе16 е! а!.,., 1938:; Нап е! а!..., 1990,, В друг аспект, изобретението предлага метод за получаването на индентичен гюлипептид, като описания по - горе, който включва култивирани еукариотни. или прокариотни клетки, съдържащи молекула на нуклеинова киселина, като дефинираната по-горе, при които условията споменатия полипептид е експресиран и се получава възстановения вече споменат полипептид. Други страни на изобретението включват клониращи и експресионни вектори, съдържащи нуклеотидни секвенции от изобретението. Такива експресионни вектори включват подходящи контролни секвенции като напр. транслационни (напр. начални и стоп кодове) и транскрипционални контролни елементи (напр. промоторни-операторни области, рибозомми свързващи участъци, терминационни стоп секвенции) свързани в -14- съответстващи четящи структури с молекулите на нуклеиновата киселина от изобретението. Векторите от изобретението могат да включват плазмиди и вируси (включително и бактериофаг и еукариотни вируси), според добре известни и документирани технологии в науката, и могат да бъдат експресирани в много варианти на различни експресионни системи, също добре извесни и документирани. Подходящи вирусни вектори включват, както бе споменат по-горе, бакуловирус, аденовирус и вирусите νβοοϊηΐβ. Много други вирусни вектори са описани от на ук а та . Голям брой технологии са известни и могат да бъдат прилагани за въвеждането на такива вектори в прокариотни или еукариотни клетки за експресия, или в зародишна клетъчна линия или соматични клетки за да формират трзнсгенни животни. Подходящи трансформации или транфекционни технологии са подробно описани в научната литература. Трансформирани или трансфектирани еукариотни или прокариотни клетки гостоприемници или трансгенни организми, съдържащи молекула на нуклеинова киселини в съответствие с изобретението, както е описано по-горе, формират друг аспект на изобретението. Еукариотните експресионни системи най-общо, и немзтодна експресионна система в частност, имат предимството, че посттранслационния способ и особено гликозилация могат да се извършат в случая от трансгенната немзтодна система, а гликозилация, кореспондираща с тази, намерена-в естественият белтък, може да бъде очаквана. Това представлява важен аспект на изобретението, тъй като в много случай посттранслационния способ се изисква за може • · 15- рекомоинантният протеин да експресира оптимална биологична активност. Експресионни системи на клетка от млекопитаещо, също притежават редица предимства. Клетката хазяин от бозайник предлага добра репродуктивна способност на естествените? Форми и защитни епитипове на антигени, тъй като еукариотната експресивна система ще? даде увеличаване на повече подобни гликозилаи,йонни. Форми, дисулфидни връзки и други посттранслационни модификации, като Е. со1ί могат да продуцират изолиран белтък, изискваш, разгъване на веригата и имаш, лоши репродукционни възможности при природната форма. В допълнение гликозилацията при бозайници е неподходяща да индицира имунен отговор, който се отклонява от защитния антипротеинов отговор. За предпазване на хора и домашни животни е? за предпочитане? да бъдат използвани човешки или животински Фибробласт или миеломни клетъчни линии, такива като Нека - човешка клетъчна линия, ВНК - клетки от бъбрек на бебе-хамстер; МЕКО, клетъчна линия от бъбрек на маймуна; ЕРЗТЗ, фибробласти от плъх, ΝΙΗ3Τ3, фибробластна клетъчна линия от мишка; С1271, клетъчна линия от туморни клетки от гръдта на мишка; СУ-1, фибробласти от бъбрек на африкансказелена маймуна; ЗТ6, фибробласти от миши ембрион; I... клетки, миша клетъчна линия; СНО, клетъчна линия от яйчник на китайски хамстер; N30 N31, ЗР2 и други клетъчни линии от миша миелома и клетъчни линии, от плъша миелома, като ΥΒ2/0 и Υ 3., Вектори, подходящи за различни класове? клетъчни линии от бозайници, са добре известни в науката. Най-общо, те включват промотор и/или стимулатор, свързан с нуклеотидна секвенция, кодираща антиген или Фрагмент. • · Подходящи промотори включват 3940 ранен или късен промотор,напр. вектор Р 5 V 1_, промотор на цитомегалобирус (СМ9), промотор на ниши металотион I и ниши туморен вирус от яйчник. Векторът предпочитано включва подходящ маркер, като ген за дихидроФолат редуктаза или глутаминова синтетазз. Вектори от този тип са описани в №086/05807, №087/04462, №089/0.1036 и №089/10404 . Транслокащия на клетките гостоприемници може да бъде повлияна при използването на стандартни технологии, например чрез прилагане на калциев Фосфат, ΏΕΑΕ декстран, полибрен, синтетичен протопласт, липозоми, директно микроинжектиране, генен канон или елек тр опора и,ия. В по-късните техники се предпочитат и методи за трансфекция на клетъчни линии на млекопитаещи с използването на електропорация са описани от Апвгеазоп еО а!., 1980. Най-общо линейна ДНК е представена по-четливо от циркулярната. Е< случая при протеина Н110В, е било намерено, че има уникална и необичайна гликозилационна модел, които се счита за допринасящ за имуноактивността, тъй като много моноклонални антитела досега добити за Η.ΙΙΟϋ от НАЕМОМСНиЗ рекогнисцират карбохидратните епитопи, което може да е важно при по-нататъшното усъвършенствуване на ваксината. Подробно е демонстриран модела на гликозилация на Η110Ϊ) от НАЕМ01ЧСНи8: ΐ. около 65% от олигозахаридите за Ν-свързани, остатъка е 0-сбързан; ϋ. преобладаващата част (напр. около 48%) от Ν-свързаните олигозахариди е рт комплексен клас; ίϋ. всички (напр. повече? от 95%) от олигозахаридите? са разредени; ίν. относителното моларно съдържание на основните монозахариди е Ν-ацетилгалактозоамин 1.0, фукоза 3.6, галактоза 4.1, гликоза 4.4, маноза 6.2 и Ν-ацетилглнжозоаминв„2:; ν. олигозахаридите (олигозахариди ϋ) са в значителна степен резистентни на дехидратация от широк кръг е к с о - г л и к о з и д а з и (н а п р . а - П - м а нозидаза, β-ϋ-манозидаза, р-О-галактозидаза , <х-ϋ-талзктозидаза , β-0-ксилозидаза , (3|у..-цетилглюк озоа мина за ) . Такива олигозахариди и съдържащи ги глюкопротеини формират друг аспект на това изобретение. Олигозахарида Е) от НАЕМ01МСН1.13 ΗΙΙΟϋ глюкопротеин е от Ν-сбързан тип и има неизвестна досега структура, състояща се от два фукозни остатъка, прикрепени на <я-1,3 връзка и «- .1,2 връзка към маноза (Ν-ацетилглюкозоамин) . Друг аспект на изобретението предлага олигозахарид, имаш, с тр ук т ур а та ; М а н а 1

V Пан β-1,4 Глк: ΝΑοβ1,4 Глк МАс

Ман а 1 (Фук«1) и ос обено с тр ук т ур ата: Фук

«X

Ман а 1 I \ з ! Ман β 1------> 4 ΓλκΝΑο{31 —> 4 Глк МАс

Ман а 1 Фук :1.8 специално, където свързан към протеин, напр „ рекомбинантен протеин като хелминтен аминопептидазен пептид или антигенен Фрагмент, или когато да генерира антиидиотипни антигени за имунизирането специално на млади животни. Животински глюкопротеини най-общо имат фукоза а-1,6 свързване и фукоза <я-1,3 свързване на олигозахариди от представяното изобретение е необикновена особеност. Това изобретение ще бъде по-нататък описано с по-големи подробности, особено за протеина Η110Ι) от НАЕМОМСНСБ ΟΟΝΤΟΡΤυθ. Обаче, чрез голям брой технологии, такива като хистохимия и ДНК хибридизация, еквивалентите на Η110Ι) са били наблюдавани и в драги паразитни видове. Приема се, че протеинът НИСШ е малтигенен комплекс и още че наклеотидната секвенция кодираща го, може разкрие вариации на секвенции межда различни щамове и различни периоди от жизнения цикъл на хелминта. Нещо повече, може да съществуват множество ензимни Форми (изоензими), които могат да бъдат диференциално експресирани на различни етапи, или 6 различни щамове. В това изследване ДНК секвенции и така предсказани аминокиселинни секвенции, са били детерминирани от кДНК клонове и РСР; продукти, получени от матрична РНК (мРНК), кореспондираща с НИСШ ген чрез рекомбинантна ДНК технология от различни източници, и. на различни периоди от жизнения цикъл на НАЕМ01ЧСНиЗ СОИТОРТиз. - Секвенираните от кДНК и РСР продукти могат да ни дадат възможност да идентифицираме три близко свързани ΗΙΙΟϋ секвенции, които са конструирани в изобретението НИ-1, (8ЕС1 Ю N0: 19), Н11-2 (ЗЕ(3 Ю N0: 20 ) и НИ-3 (ЗЕС Ю N0: 21). НИ-1 включва три сближени и. препокриващи се секвенции, кДНК клон и на 3^' край РСР продукт 014 - 178 (5Е0 • · • · ΙΟ N0: .12); Η11 - 2 включва РСР продуктите А-6 50 и 2.5 к.Ь (ЗЕЙ 10 N08: 10 и 7, респективно); Н11 -· 3 включва РСР продуктите 3.5 к.Ь и А-649 (ЗЕЙ 10 N03: 8 и .11 респективно). Специфичните връзки между индивидуалните секвенирани кДНК и РСР продукти клонове и Н1.1 - .1, -2, -3 са обобщени на Фиг.1 и показани в детайли на Фиг. 3, 4 и 5. Различията и вариациите в секбенциите, получени откДНК клонове и РСР продукти са били наблюдавани, както може да бъде видяно на Фиг.2, 3, 4 и 5. (съставено от ЗЕЙ 10 N03: 1 до .15 и 19 до 21) и както е сумирано на Табл. 1. Таблица 1 Хомолозите от извлечените аминокиселинни секвенции са получени чрез транслация на нуклеотидните секвенции показани на Фиг.2 7. сходство 7. идентичност ни Н1: •1 к 1-111-2 •1 :: Н11-3 79 И? Разликите могат да бъдат отдадени на различни мРНК (от множество родове). В допълнение, те се дължат, поне частично, на различните варианти на кодиращата секвенция на Н1100, или на мРНК, представена на различни стадии от жизнения цикъл или на различията в щамовете. Таблица 2 допълнително показва нивата на идентичност и сходност между кореспондиращите предсказани аминокиселинни секвенции и две публикувани аминокиселинни секвенции от бозайници. —20- Таблица Хомолозите от аминокиселиннитв секвенции на ΗΙΙΟϋ с плъша аминопептидаза М (АрМ) и миша аминопептидаза А (АрА). 7. сходство 7. идентичност Н1.1-1 ! АрМ 55 111 :ι.-·:ΐ. ί( АрА 55 31 НИ-2 ! АрМ 52 31 1-111--2 II АрА 54 31 Н11-3 8 АрМ 53 •.οΖ. 1-111-3 АрА 52 30 ФИГУРА 1 показва карта на получените от Н. СОИТОРТиЗ НИСШ кДНК и РСР секвенирани клонови продукти и техните връзки и позиции по отношение на Н 1.1 Οϋ мРНК; ФИГУРА 2 показва Н1100 нуклеотидни секвенции, обозначени като Н11-3, (ЗЕЙ 10 N0: 21, производна от клонирани РСР продукти ЗЕЙ Ю N08! 8 и 11 и кДНК клон ΜΙΑ03, ЗЕЙ 10 N0: 5), Н11-2 (ЗЕЙ Ю N0: 20, производна от клонирани РСР продукти ЗЕЙ 10 N03: 7 и 10 и Н11-1 (ЗЕЙ 10 N0: 19, производна от клонирани РСР продукти ЗЕЙ Ю N03: 9 и 12 и кДНК клон АизКВ!, ЗЕЙ 10 N0: 6); ФИГУРА 3 показва секвенцията Н11-3 (ЗЕЙ Ю N0: 21) (показана на ФИГУРА 2) с подреждане от кДНК клони М1 и М1А03 (ЗЕЙ I0 N03: 1 и 5); ФИГУРА 4 показва секвенцията Н11 (ЗЕЙ I0 N0: 20) (показана на ФИГУРА 2) и подреждане от кДНК клон В2 (ЗЕЙ Ю N034 ) ФИГУРА 5 показва секвенцията Н11-1 (ЗЕЙ Ю N0: 19) (показана на ФИГУРА 2) и подреждане от кДНК клон В1А и • · • · Αυ.οΐ В1 (5ЕС! ΙΟ N05; 2 и ό респективно); ФИГУРА а показва а) предсказаните аминокиселинни секвенции (5ЕС1 10 N05; 22, 23 и 24) произлезли от Д Η К секвенции Н11-1, Н11-2 и Н11-3 показани на Фиг. 2; βί и ЬП показват предсказаната аминокиселинна секвенция на Н11--3 сравнена с публикуваните аминокиселинни секвенции на плъша микрозомална аминопептидаза Μ (МаН еЪ а1., .1989) и миша микрозомална аминопептидаза А (Ми е! а1 . , 1990) респективно; тъждествените са заградени в правоъгълници, защрихованите пространства показват максималното ниво на хомология межди сравняваните секвенции. Използван е конвенционалният еднобуквен код за аминокиселини. Хоризонталната линия над секвенцията показва позицията на трансмембранният регион и звездичките ($) показват позицията на свързаният с: цинк мотив. Нивата на сходност са показани в Таблици 1 и 2; ФИГУРА 7 показва подреждането на аминокиселинни секвенции (обозначени като Рер А, Рер В, Рер С, Рер В и Рер В) добити от ΓΝΒγ и Гуз-С Фрагменти на ΗΙΙΟϋ, както вече е описано (ΙηίθτηβΗοηβΙ раЪегтЬ арр! гса Ноп М0/11086 и както по-рано е регистрирано, полипептидни секвенции (а), (Ь), (е), (к) и <аа), респективно) и три нови секвенции (5ЕС1 Ю N05; 16, 17 и 18) добити от Н.1100, следващо разграждане чрез еластаза или термолизин с транслокации от а) НЦ-1, Ь) Н11-2 и Н11-3. В друг аспект, изобретението предлага молекули на аминокиселини, включващи една или повече нуклеотидни секвенции, които субстантно кореспондират или които са субстантно комплиментарни с една или повече секвенции, подбрани измежду секвенциите на клоните ΜΙ , В1А, В1А-3''·, В2, М.1АИ5, АизЬВ1, 014-015 (2.5РСН), 014-872 (3.5РСК клон 2),

А-648 (б"^ край на В1) , А-650 ( б"4' край на 2.5РСК), А-649 (5'- край на 3.5РСР), 014-178 (3"' край на АизСВ! кланове 3 &amp; 6),014 - 872 ((3.5РСР клон 10) и 014-^72 (3.5РСР к.1оп 19), Н11 1, Н11-2 и Н11-3, 5Е(3 Ю N08! 1 до 15 и от 19 до 21 респективно, както е показано на Фиг. 2, 3, 4 и 5 или секвенции, които са субстантно хомоложни или които хибридизират с всяка от споменатите секвенции. Както бе споменато по-горе, сравнение на секвенциите от различните клонове, упоменати вече, с компютърните бази данни от известни секвенции, разкри сибстантна хомология с род на микрозомални аминопептидазни ензими (ЕС. 3.4.11.-). Изследвания за ензимиологична и инхибиторна активност, извършени с протеина Н1100 и субфракциите, потвърдиха, че протеинът е всъщност микрозомална аминопептидаза (а-амино зцил пептидна хидролаза (микрозомна). Такива изследвания ПОК ίίαδ ха по-късно, че активностите и на аминопептидазата А-подобна и на аминопептидазата М-подобна са демонстрирани, и че всеки от компонентите на дублетът Н1100 показва ензимна ак тивност. Изследвания с протеолитично разграждане на Н1100 също са били проведени. С помощта на ензимна еластаза, беше установено, че Η110Ι) може да бъде частично разцепен, Формирайки две Фракции, детергент-разтворима Фракция (която остава с мембраната) и водноразтворима Фракция (която е конструирана Н115). Н115 се среща под Формата на протеин димер, който може да бъде редуциран до два компонента. По интересен начин е открито, че само аминопептидазна М-подобна активност е свързана с водноразтворимата Фракция Н115, докато аминопептидазна А-подобна активност е свързана само е детерген ί.....разтворимата Фр а к ция Следващият пример дава описание на изследванията, довели до детерминираното на секвенциите, показани на Фигури от 1 до 7 със справка към следващите допълнителни Фигури в които: ФИГУРА 8 показва НезСегп Ь1оГз на интегрални мембранни протеини, представени в детергентен екстракт на НАЕМОИСНОЗ СОИТОРТОЗ (зряла Форма), сондирани е афинитетни пречистени антитела елюирани от потенциални ΗΙΙΟϋ клонове; а) антигени в детергентен екстракт на НАЕМОИСНОЗ рекогнисциран посредством антисерум за екстракта; Ь) антитела елюирани от слои, както е показано в а) повторно тестуване срещу блот на детергираният екстракт потвърждаващо успеха на елюиционният етап; с) антитела както в Ь) които свързани към клонирания 141 експресиран протеин, отбелязват региона при 110 кс! (и относително отчетлива ивица от около 250 кв; с!) липсват свързани антитела, когато е използван нерекомбинант за да абсорбира серума; ФИГУРА 9 показва ИогСбегп Ь1оЪ на пречистена мРНК от 1.1, 15 и 23 ден от жизнения цикъл на НАЕМОИСНиЗ 00ΝΤ0ΡΪ03 сондиран с а) кДНК клон ΜΙ (ЗЕО Ю N0; 1); Ь) кДНК клон М1 Аиз (ЗЕО II) N0: 5); с) кДНК клон В1А (ЗЕО Ιϋ N03; 2 и 3); в) кДНК клон АизСВ.1 (ЗЕО ΙΒ N0; 6); е) клониран РСР продукт 014—015 (ЗЕО Ιϋ N0: 7). Цифрите 11, 15 и 23 показват възрастта на НАЕМОИСНОЗ С0ИТ0РТ03, от които беше добита мРНК; ФИГУРА 10 показва ЗоиСЬегп Ь1оСз на НАЕМОИСНОЗ С0ИТ0РТ03 геномна ДНК, сондирана с кДНК клонове М1А03 (ЗЕС! II) N0: 5), ΒΙΑ (ЗЕО II) N03: 2 и 3) и АизГВ1 (ЗЕО Ιϋ N0: ό) и РСР продукти 014-872 (3.5-2, ЗЕО ΙΒ N0: 8) и 014-015 (ЗЕО 10 N0: 7); блотовете бяха промити със умерена сила; за всяка • · •24·· сонда, писта 1 съдържа ΗίηβΙΙΙ, разграден от ДНК като маркерили беше оставена празна, писта 2 и 3 съдържат ЕсоР1 и ΗίηΰΙΙΙ, разградени респективно от геномна ДНК от НАЕМОИСНиЗ ФИГУРА 11 показва Иез-Ьегп Ь1оСз на рекомбината 63Τ-ΙΊ1 и С53Т-В1А протеина смес сондирана с пречистени / антитела за електроФорезно пречистен ΗΙΙΟϋ ΗΙΙϋϋΕ); ФИГУРА 12 показва НезРегп Ь1аС5 на СопА ΗΙΙΟϋ антиген сондирани с антисерум за СопА ΗΙΙΟϋ и за рекомбинантна (ЗЗТ-М1 65Т--М.1 протеинна смес; ФИГУРА 13 показва а) резултатите от анализа на ΗΙΙΟϋ протеин и активности на аминопептидазен ензим във фракции, добити посредством йонообменна хроматограФия от СопА ΗΙΙΟϋ на ΜοηοΩ колона; Ь) 3ϋ3-ΡΑ6Ε на Фракциите, показани на ФИГУРА 13а); ФИГУРА 14 показва а) стойностите на рН, при които бяха добити Фракциите в Фокусираш, експеримент при свободен поток на изолектричество; Ь) 5ϋ5.....РАБЕ при редуцираните условия на Фракциите от 14а) в които най-ниската ивица на дублета ΗΙΙΟϋ е намерена във Фракция 6 и най-висока във Фракция 16, при вариращи количества на всяка от намесените фракции; с) ИезСегп Ь1о1.з на Фракциите показани на Фиг. 14Ь) с о н д и р а н и е ί)моноклона лни а нти тела Т3 3/19.7 и ϋ ) афимирани пречистени поликлонални анти - М1 антитела; контролните антитела не дадоха реакция; ФИГУРА 15 показва а) стойностите на рН, при които бяха добити Фракциите в друг при свободен поток на изолек тричество Фок усиращ експеримент; Ь) 303-РА6Е при редуцираните условия на Фракциите от 15а), използвани в ензимен анализ при които най-ниската ивица на • · • · · · • · · · • · · · • * · · · • · · · ,..,,.. · · · · дублета ΗΙΙΟϋ е измерена бъб Фракции 4 - 6 и най-висока във Фракции 16 - 18, при. вариращи количества на всяка от намесените Фракции; е) микрозомални аминопептидазни специфични активности на фракциите, показани в 15Ь) ; ФИГУРА 16 показва предпазването на овца чрез ваксиниране със сепарирани най-висока (Ιί), най-ниска (I...) , рекамбицирана (И + 1_) и междинна (0) ивици от ΗΙΙΟϋ; а) отделени паразитни яйца, изразено като яйца на грам фекалии, Ь) хелминти роз!. тог^ет, в сравнение с контроли; ФИГУРА 17 показва предпазването на овца чрез ваксиниране с бодноразтборим Фрагмент (Н118) довит от ΗΙΙΟϋ чрез разграждане с еластаза и Н11.А, остатъчен, детерген ..... разтворим ΗΙΙΟϋ; а) отделени паразитни яйца, изразено като яйца на грам Фекалии, Ь) хелминти розФ тог!.ет, в сравнение с контроли (С); ФИГУРА 18 показва примери за близостта между инхибиране от Ах), Вх) аминопептидаза М-подобна и Ахх), Βϋ) зминопептидаза А-подобна активности от ΗΙΙΟϋ чрез антисерум от отделна овца, ваксинирана с ΗΙΙΟϋ с нива на защита, измерени посредством Ах, хх) на редукция на хелминти роеФ тог^ет и Вх , хх) 7. на редукция на брой на Фекални яйца п антиННОВ, п контролен конски феритин; ФИГУРА .19 показва хистохимичната локализация на аминопептидазни ензимни активности в зряла Форма на НАЕМОИСНиЗ СОИТОРТИЗ - графиите със светлинен микроскоп от крио - секции на зря.л мъжки НАЕМОИСНиЗ СОИТОРТиЗ показват аминопептидазна активност (червения реакционен продукт се явява като тъмна ивица (посочена) в чернобелите фотоснимки), асоциирани само с микробласинките (ιην) на червата ( х ) . Никоя от другите тъкани (напр. епидермис (с), хиподерма (ή), генитален тракт (дЪ), мускулна стена (ига) не показват активност. На а) с абстратът беше Е -· левцин 4-петакси-р-нафтиламид , на Ь) субстратът беше 1_-глутаминова к иселина а- (4-меток си- (3-на фтиламид ) ; ФИГУРА 20 показва карта на 3.5 РСР продукт (клон 2) (ЗЕО 10 N0: 8) субклониран в Ьаси1оУ1гиз експресионен вектор рВХиеВас!'1п ФИГУРА 21 показва НезЪегп Ь1оЪ от екстракти от инфектирано с Ьаси1оухгиз насекомо Зроворбега ΐηΑςϊρθΓββ (31) 9 клетки бяха сондирани с антиНИСФИ антитела. Два клона заразени, РЗА и Р4А експресират и,ялата дължина на имуногюзитивен Н1100 (посочен), контролите - не. МЕТОДИ СЪСТАВЯНЕ НА и.К. БИБЛИОТЕКА ЗА 1атбвадЪ11 Изолиране на информационна рибонуклеинова киселина (мРНК) Зряла Форма на НАЕМОИСНОЗ СОИТОРТОЗ (0,5 тд ) , добит в и.К., едномоментно замразен в течен азот, беше? раздробен в течен азот с помощта на чукало и хаванче. Р Η К беше екстрахирана от смляната смес с 10 обема 4 М гуанидинов хидрохлорид в 25 мМ натриев нитрат, съдържащ 0.57. тегловни обеми (м/ν) саркозил и 0.77. м/ν 2-меркаптоетанол, последвано от екстракция с Фенол и хлороформ, прилагайки метода на СЬотсгупзк! &amp; Зассх (1987). Информационна РНК (мРНК) беше приготвена посредством аФинитетна хроматография на олиго с!Т целулоза (двукратно), както е описано от МапхаЪхз еЪ а! (1932) и качеството беше оценено чрез 1п жхЪго транслатация, с използването на кит заешки ретикулоцитен лизат и3 5 8-мети.онин на Атегзбат 1пЪегпаЪхопа1 р1с, в съответствие? • · • · « • 2 7' · · · • · ·< • · · с инструкцията на Фирмата 120 1-:.(:1 Бяха открити полипептидази до Приготвяне на комплиментарна ДНК Първата верига комплиментарна ДНК (кДНК) беше синтезирана от 1 μις мРНК използвайки случайно иницииране и птича обратна транскриптаза, втората верига беше синтезирана използвайки заместителна реакция с РИазе Н и Е. со11 ДНК Полимераза I, последвано от възстановяне от З'4' прилагайки Т4 Полимераза, в съответствие с метода на 6иЬ1ег &amp; НоТТтап (1933). Добивът на двойноверижната (сЗз) кДНК беше приблизително 400 пд от .1 рд мРНК. Двойноверижната (с!б) кДНК беше изпитана чрез електрофореза в 17. агарозен гел, последвано от авторадиограФия. Двойноберижната (вз) кДНК беше с размер в обхвата 0.2 - 9.4 килобази (кЬ), най-много в обхвата 0.5 - 2.3 кЬ. Клониране на кДНК в 1атЬс1ад111 Неразмерна селектирана кДНК беше използвана за да се състави библиотека в ].атЬвадЬ11, като беше използвана Атегзбат οΟΝΚ клонираща система (кит Νο ΡΡΝ 1280, АтегзЬатХпКегпав. р1с) и ϊη νίΚτο раскхпд ехеЪгасЪз (кит Νο N334, АтегзНат 1п1егпа11опа1 рЗ. с), както е описано в съответните инструкции и ЕсоР! Ипкег олигоннклеотиди (б^ВВААТТСС). Получената библиотека беше посята на Е. со3.1 щам Υ1090 в присъствието на изопропилтио-р-О-галактозид (I Р Т В) и 5-бром, 4-хлор, 3-индолил β-П-галактозид (Х-гал), при които условия рекомбинанта 1атЬвад11 се явява като светли ("бели") петна и див тип нерекомбинанта 3. атЬбадИ, като сини петна. Библиотеката съдържа 907. оели петна и к лонир а ща та • · 23·· ефективност 'беше изчислена на 4 х 10'7 плаки Формиращи единици (рТи/рд) кДНК и библиотечен титър от 2 х 1О'"6 рТи/ш!. Анализът на ДНК от 20 рекомбинанти, подбрани случайно, разкри среден размер на инсерция от 0.51 кЬ. Обаче, това средно число беше деформирано от един клон с инсерция от 3,5 кЬ. Преобладаващите инсерции бяха >300 базови двойки. (Ьр). Тази неамплифицирана 1атЬвад(;1 библиотека произлязла от и.К. хелминтна мРНК, след това б еше им унос к р иинир а на. ПРИГОТВЯНЕ НА СОНДИ ЗА АНТИТЕЛА Антисерум за интегрални мембранни протеини Червата бяха десектирани от зряла форма на НАЕМОИСНОЗ СОНТОРТОЗ (от О.К.) и бяха хомогенизирани в леденостуден фосфатен буферен солеби разтвор (РВЗ), рН 7.4, съдържащ 1мМ етилендиаминтетраоцетна киселина (Е 0 Т А) и 1 мМ Фенилметилсулфонилоб флуорид (РМЗР). Хомогенатът беше центрифугиран за .10 минути с микрофуга и палетът беше ресуспендиран в същият буфер, съдържащ 0.17. м/ν Тмееп 20 (Тмееп 20 е запазена марка). След рецентрифугиране, пелетът беше ресуспендиран в същия буфер, съдържаш, 27. н/ν ТгхТоп Х--100 и екстрахиран за 2 часа при 4°С. Този екстракт беше центрифугиран както по-горе, за да се отдели на повърхността (супернатант), като съдържа интегрални мембранни протеини (ΙΜΡ). Беше хиперимунизирана овца с ΙΜΡ в РгеипсГз Сотр1еТеАсМиуапЬ (РСА) посредством интрамуск улни инжекции от 50^, 50,120 и 130 μςι от ΙΜΡ, давани на седмици 0, 7, 11 и 15. 6 седмици след последната инжекция, серумът беше събран и 1: « а 1' • « »* ;:?··· моделиран серумът ΕΕ--Ό68, Приготвяне на интегрални мембранни протеини чрездетергентна екстракция от НАЕМОИСНиЗ ΟΟΝΤΟΚΤΙΙδ Екстрактът беше приготвен чре^ хомогенизирани хелминт и в 5 - 10 обема на РВЗ, съдържащи .1 мМ ЕОТА и 1 мМ РМ5Р. Суспензията беше центрифугирана при 10 000 х д за 20 минути при 4°С и палетът промит в същият буфер, съдържащ 0.1’/. м/ν Тмееп 20 и след това екстрахиран с 5 обема 27. м/ν ТгЮоп Х-100, както е описано по ~ горе. Отделеното на повърхността (супернатант) беше рецентрифугирано при 100 000 х д за .1 час, и полученият супернатант, който беше обогатен в Н.1100, съдържащ друг ΙΜΡ, беше използван в експерименти с Мев^егп Ь1оЕ и за приготвянето на неденатуриран ΗΙΙΟϋ (виж по-горе). Получаване на ΗΙΙΟϋ и афинитетно пречистен анти-ΗΙΙΟϋΝ Екстрактът . пречистен за ΗΙΙΟϋ, беше подложен на афинитетна хроматография на СопА-агароза, последвана от йонообменна хроматография на МопоСЗ (как то е описано в 14088/00835 и 140090/11086) . Пречистеният Н.1.100 беше инжектиран интрамускулно в РСА на агнета. Три дози от 100 цд бяха поставени на интервали от три седмици. Серумът беше събран от агнетата 4 седмици след последната инжекция, беше афинитетно пречистен чрез абсорбционна колона, съдържаща пречистен ΗΙΙΟϋ, който е бил куплиран с активирана с цианен бромид Зербагозе (Рбагтасха). Куплиране на ΗΙΙΟϋ, свързване на антисерум и елюиране на антиНИОО антитела бяха според приложените от Рбагтасха инструкции. Тези афинитетно « « • · ····»·· ··· 3 ο ·· пречистени антитела бяха моделирани антиНИОИМ. "Ν” различава тези антитела от тези произведени за денатурация, електрофоретично пречистени Н1100, които са моделирани антиНИООЕ. Извършване на МезТегп βίοι МезТегп Ь1оТ. беше проведен с помощта на стандартни процедури (ОобпзТопе е£ а1 . , 1982). ИЗОЛИРАНЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ НА КЛОНИТЕ Имуноскрийнинг на О.К. библиотека от 1атЬс1ад1.11 Методът, използван за имуноскрийнинг на библиотеката беше проведен, по начина описан от Вомве11 ев а! (1986). Преди да бъде използван, серумът (ΕΈ-068) беше извлечен от анти-Е.соН антитела чрез адсорбция с лизати и цели клетки от Ε.οοίί Υ1090. Библиотеката беше посята на клетки от Е. соП Υ1090 при плътност от 10"'" 3 ρΐυ за петри е диаметър 90спм. Петритата бяха наслоени с нитроцелулозни Филтри, импрегнирани с ΙΡΤΟ и инкувирани за една нощ. Филтрите бяха мити с ТВ8Т (50 мМ Тг1з, рН 7.4, 150 мМ МаС1, 0.05% м/ν Тмееп 20) и след това блокирани с 57. м/ν конски серум в ТВ8Т за 2 часа. Серум ЕЕ-068, разреден 1 към 200 8 ТВ8Т съдържащ 57. конски серум беше прибавен и Филтрите инк увирани за 4 часа при леко разклащане. Филтрите бяха промити отново в ТВЗТ, след това инкувирани с пероксидаза от хрян (НРР) - конюгиран конски антиовчи 1д6 разтворен 1към 500 в ТВЗТ съдържащ 57. м/ν конски серум за 2 часа. (Антисерум за овчи 1дСЗ беше произведен в кон, антиовчи 1'дб пречистен посредством афинитетна хроматография на овча 1д6 Зербагове • · е · · • · · I · · » * в · • · * * · · · • · • · · колона и антителата конюгирани към НРР по метода на Макапе &amp; Камаох, 1974). Филтрите Гояха по-нататък филтрубани 6 ТВ5Т и плаки с бяха открити чрез 0.6 тд/т! 3.3"-- диаминобензидин (ϋϋΒ) и 0.17. м/ν водороден пероксид. Два десет и пет предполагаеми положителни култури бяха събрани и бяха рескрийнирани с афинитетно пречистен антиНИОВМ, както е описано по - горе. Следвайки това вторично скрийниране 5 рекомбинанти бяха вече позитивни, с клон моделиран като 141, давайки най-силен сигнал. Афинитетно пречистване от антитела на рек ом» пикантен Фаг Конфлуентни култури бяха приготвени на Е. со11 Υ1090 култури при 10'"'3 рти за всеки от антитяло-позитивните 1 а т Ь в а к л о н о в е и л и н е р е комби н а н т е н 1 а т Ь с:1 а д ί 1.1 н е г а т и в е н к онтролен Фаг. Културите бяха инк убирани за 4 часа при 42 °С след това наслоени с Филтри, импрегнирани с 1РТБ и отново инкувирани за една нощ при 37°С. Филтрите бяха отстранени от петритата и промити в ТВ5Т преди да бъдат блокирани с: 57. м/ν конски серум за 1 час. Филтрите бяха след това инкубирани с 1 към 100 разреден антисервм ЕЕ-068 за 6 часа, преди да бъдат щателно изплакнати с Т В 3 Т. Свързаните антитела бяха елюирани от филтрите чрез две апликации от по 2 т! елюиционен буфер (5 м14 глицин, 500 мМ Νβ01 , 0.2% Тмееп 20, рН 2.3) за 2 до 3 минути всеки, неутрализирани посредством прибавяне на 200 μΐ от 1 14 бг 1в~НС 1 , рН 7.4, разтворен 1 към 200 и използвани за да имуноскрийнира МеяСегп Ь1оС от Н1ΙΟϋ-обогатен екстракт. ДНК СЕКВЕНИРАНЕ ОТ 141 КЛОН СатЬваДНК беше изолирана от 14.1 клон в съответствие • · • · • · а1 (1982). Р гад тепЬу К К11 Фрагмент беше изолиран с помощта на СЕСКЕАН кит с методите, описани ο т 1*1 а η ί а Ί х з е 1. 2„38 кЬ ΚρηΙ-ЗеМ. , съдържаш, 300 Ьр чрез гел електрофореза, пречистен (ЗСгаКадепе) (СЕНЕСДЕАН е регистрирана търговска марка на В1010.1) и с убк лониран в рВ 1 иезсг х р (; 11 8КI ( 8ТРАТΑ6ΕΝΕ ) . Фрагментът ЕсоЕ1 беше пречистен с помощта на същите методи и реснбклониран бъб същият вектор. Киклеотидната сек вени,ия на 1*11 инсерцията беше детерминирана с помощта Т7 Секбеми,йонен кит (РЬагтасха, и.К.), използвайки и двата 1*113 преден и обратен инициатори. ПРИГОТВЯНЕ НА АВСТРАЛИЙСКИ БИБЛИОТЕКИ ОТ 1атЬс1а6Т11 И 1атЬе1а2АР кДНК Изолиране на мРНК 5 тд зряла Форма на ΗΑΕΜΟΝΟΗΟδ 00ΝΤ0ΡΤ08 (АизКга!хап МсМазКег чувствителен щат), едномоментно замразен в течен азот, бяха смлени в течен азот и РНК екстрахирана, посредством горещ Фенол с помощта на метода на СогсЦпд1еу е! а1. 1983). Добивът от цялата РНК беше 10.35 тд. 1.3 тд от тази РНК бяха използвани за да се? приготви мРНК посредством афинитетна хроматография на олиго сГГ целулоза (2 секвенциални пречиствания) прилагайки методът, описан от МапхаЬхз еС а1. (19Е32). Добивът от мРНК беше 21.5 μα. Качеството на мРНК беше оценено посредством χη νΙΚηο транслация в заешки ретикулоцитен лизат в присъствието на35 δ-метионин (АтегзКат) в съответствие с приложените Фирмени инструкции. Добитите транслационни продукти имаха ясно обособени връзки, включително връзки >200 к с! в размер как то бе демонстрирано чрез електрофореза на 808-полиак риламиден • · • · • · ; . . < . · · · ....... ..., . . : ......, ·· ·· ..··.·· ·· гел, последвана от ФлуорограФия. Синтеза на кДНК и приготвяне на библиотека 1 μςι тРНК беше използвана да се направи кДНК чрез иницииране с олиго сГГ или произволни инициатори, използвайки кДНК синтезен кит от АтегзЬат 1пСегпаСхопа1 р1с, следвайки Фирмените инструкции. Добивът беше 115 пд двойноверижна (бе) кДНК. Качеството на кДНК беше проверено32 посредством електрофореза на Р-маркирана ДНК на алкалинов агарозен гел, както е описано от нтегзЬап сОНК кхД инструкциите. Размерът на кДНК (чрез сравняване с: 1атбба--Нхпб 111 маркери, Нем Епд1апс1 Вхо1аЬз) беше от 150 Ьр до >10 кЬ, с най-голяма продуктивност в обхвата 0.6 - 5 кЬ. Олиго όΤ-инициирана и произволно инициирана вя кДНК бяха обединени във Фонд и лигирани към излишък ЕсоРЗ.' 8~мер линкер (5' 8СЗААТТССЗ' Нем Епд1апб ВхоХаЬз, СаСаХодие Νο 101,8), който е? бил обозначен с дагшпа- Р-АТФ и Т4 полиннклеотидна киназа. Свързаната кДНК беше разградена с ЕсоР! и излишните линкери бяха отстранени. посредством ЗерЬагозе 4В (РЬагтасха) хроматографски, в съответствие с методите, описано от МапхаЬхз еС а1. (1982), Фракциите от колоните бяха събрани 8 две партиди, една съдържаща кДНК по-голяма от 2 кЬ и друга кДНК, по-малка от 2 кЬ. Всеки. фонд след това беше лигиран поотделно с 1 μς) ЕсоР! сиС, фосфатизирани 1атбва2ар11 клони (ЗЬгаЬадепе) и. пакетирани разделно с помощта на бхдараск Бо1б (ЗСгаСадепе, запазена марка). Най-големият размер добита кДНК беше 1.3 х .10 5 рекомбинанта и най-малката кДНК - 1.4 х 10'ч5 рекомбинанта; бяха събрани във Фонд за да стане библиотека от 2.7 х 10 ’5. • · • · • « • · * 34- • · · · Библиотеката от 1атЬс1а£ар беше усилена посредствомпосяването на ХС1~В1ие клетки (5 Сга1адепе) при 2 ;·: 1'"4 ρΐυ на 135 мм петри. Титърът на усилената библиотека беше 7 х ΙΟ'4? ρ’ιΤί/ίΐϊΧ По-нататък, 2 рд мРНК беше използван за да направи кДНК, по начина описан по-горе, но използвайки само олиго сГГ като инициатор. Добивът от вз кДНК беше 740 пд. Тази кДНК беше третирана с ЕсоК! метилаза, както е описал Мап1а11з еС а! (1982) преди да се добавят ЕсоН! линкери, и в този случай 12-мер линкери (5'СС66ААТТСС663' Мем ЕпдЗапв В1о1аЬз, СабаХодие Мо 1019) бяха използвани. Следва разграждане на свързаната кДНК с ЕсоЕ1, всички Фракции от Зербагозе 4В колона, съдържащата се кДНК беше събрана във Фонд и лигирана с 2 рд ЕсоЯП сив, ФосФатизирани ХатЬвадСИ клони (5Сга1адепе). Яигационната смес беше разделена на две и пакетирана с две партиди бхдараск (ЗоХв (ЗСгаЬадепе) ; те бяха събрани във Фонд да даде ХатЬвадШ библиотека от 7 х 10"'6 ρΐυ. Библиотеката беше усилена чрез посяване на 5Т9 клетки при. 5 х 10л5 на 135 мм петри. Титърът на усилената 1атЬвад1:11 библиотека беше 4.5 х 10"11 р!и/т1 . Скрийнинг на Австралийска ХатЬвадСИ библиотека с а н т и с е р у м и д ο Η11Ο Ό Антисеруми бяха произведени чрез инжектиране? на овца с Н110Е) протеин (II. К. произход), който е бил електроелюиран от полиакриламид след електрофореза в 305, съгласно следният метод: СопА Н.110Е), получен и описан в 140 88/00835, и МО 90/11086 беше електрофорезиран на 803 полиакриламидвн гел (!_ает11 1970) за да се получи електроелюиран Н1100. След електрофореза, областта на полиакриламидния гел, съдържаща • · • · · · · · · И1.10С1 беше отрязана, поставена в електроелютор (АССо) и елюирана в продължение на 3 часа при 10 №а£. Електроелюирания Н1100 (моделиран Н1.100Е) беше концентриран на Сеп1.г1ргер 10 (Атхсоп) и сменен буфера на Р010 колона (Рбаглпасха) в 50 мМ амониев бикарбонат/0.077. 808, смесен с адюбанти и след това инжектиран на овца. Иммноглобилините от серумът бяха преципитирани с амониев сулфат (ЗоппеРопе апб ТЬогре, 1982). Преципитираните антитела бяха рееуспендирани на 60 тд/т! във Фосфатен буферен Физиологичен разтвор, диализиран срещу фосфатен буферен физиологичен разтвор и разреден .1:10 в Тг.1з буферен Физиологичен разтвор (ТВ8), съдържащ 57. ι^/ν мляко на прах с ниско съдържание на мазнини. 10 тд от СопА Н1100 беше направен до 0.57. 503, загрят до 100"С за 3 минути и изсушен на нитроцелулозен Филтърен буфер. Следва промиване с ТВ8, съдържащ 0.27 ν/ν "Гмееп 20 и 0.57 ТгНоп Х-100 (ТВ8ТТ), Филтърът беше инкубиран за 1 до 2 часа при стайна температура с антителата до Н110ВЕ. След измиване, Филтруване за 2 часа с ТВ5ТТ, свързаните антитела бяха елюирани с 3 т1 от 0.1 ΙΊ глицин, 0.15 М МаС1'> рН 2.6 за 2 минути и незабавно коригиран при неутрално рН чрез прибавяне на 75 μΐ от 1.5 М Тгхз рН 8.0. Тези афинитетно пречистени антитела, моделиран антиНИООЕ, бяха използвани за скрийниране 5 10''5 ρίυ на Австралийска 1атЬвад1.11 кДНК библиотека, както бе описано по-горе. 5 ;·; 10""5 рекомбинанти от 1атЬвадЪ11 библиотека произлезли от Аиз1гаНап НАЕМОНСНиЗ С01ЧТ0РТиЗ бяха имуноскрийнирани и три положителни култури взети. Следвайки по-нататъшно скрийниране, два от тези рекомбинанти бяха вече позитивни и бяха моделирани В1А и В2. • · • · · · ······· · » Секвениране на ΒΙΑ и В2 клони Двата клона вяха разградени с ЕсоК1, добивайкиединична прибавка от приблизително 500 Ьр за В1А и три фрагмента, В2А (около 400 Ьр). В2В (около .100 Ьр) и В2С (около 100 Ьр), за Б2. Те вяха сзбклонирани в рВ1иезсг1рЬ 8К* (ЗЬгаЬадепе) и секвенирани , използвайки Зециепазе 2,0 1-.-.3. 4: < υη :ί. 1ес1 ВхосЬхтх с:«ч.Ч. «>), ЕКСПРЕСИЯ НА М1 И В1А КЛОНОВЕ Приставките М1 (ЗЕ(3 10 N0: 1) и ΒΙΑ (ЗЕО 10 N05: 2 и 3) бяха експресирани в Е. со!х, използвайки рБЕХ вектор (ЗтхЬЬ а. η в ЛоЬпзоп, 1788). Този вектор експресира протеини на С-край на глУтатион-5-трансфераза (БЗТ) от ЗсЬхзЬозота .Заропхсит, Приставките М1 и В.1А ЕсоР1 бяха лигирани към ЕсоР1-сиЬ, ФосФатизиран рБЕХ1 и трансформиран 6 Е. соН щам 31*1101 6 съответствие с методите, описани от МапхаЬхе еЬ а1 . 1782. Осем вторични продукта вяха получени от всяка трансформация и 2 <п1 култури бяха прораснати за 6 часа при 37°С. ΙΡΤ6 беше прибавен за да индуцира сливане на белтъчен синтез и инкубацията продължи през цялата нощ. Клетките бяха отделени чрез центрофугиране, разцепени посредством изваряване в обикновен буфер (каетт1х, 1774) и екстрактите бяха анализирани, посредством 3ϋ5-ΡΑ3Ε и чрез МевЬегп Ь1оЬ, използвайки аФинитетно пречистени овчи антитела, специфични за ЗВЗ-денатуриран Н1100 дублет (антиНИОВЕ -· виж по-горе). Свързаните антитела бяха доказани, с помощта на алкално Фосфатазен конюгиран заешки антиовчи 1дБ алкално фосфатазен конюгат (васкзоп ЬшпипогезеагсЬ), последващо от цветно проявяване с 5-бром, 4-хлор, З-индолил ФосФатаза (ВС1Р) и нитросин тетразолон (ΝΒΤ). Култури на имунопозитивни клонове • · • * · • · • · ояха прораснати и индицирани, както по-горе и разцепени чрез ултразвук. Разделянето даде разтворими и неразтворими Фракции чрез центрофугиране (ЗогуаН БС-2В центрофуга), Н84 ротор, "700 грт, 30 минути, 4°С). Неразтворимите пелети вяха ресуспендирани в 8М уреа чрез ултразвуково въздействие, пробите от Фракциите вяха проверени чрез 8В8-РАБЕ. Слятите протеини вяха открити във неразтворимата фракцията. Всеки от тези препарати беше използван за ваксиниране на 2 овце три пъти при .150 цд протеин за доза в Егеипвз аЩиуапСв. Позитивни контролни овце вяха имунизирани с природен СопА ΗΙΙΟϋ протеин и негативни контролни овце вяха имунизирани с разтворен протеин от Е. соН, съдържаш, рВЕХ вектор без прибавка (инсерт) от НаетапсКиз. Серуми от ваксинирани овце вяха анализирани чрез Иез1егп Ь1о1 срещу ΗΙΙΟϋ. СКРИИНИНГ НА Аи5ТРАС1А1М ΙβωβββΖΑΡ БИБЛИОТЕКА ЧРЕЗ ХИБРИДИЗАЦИЯ С ПРИБАВКИ М1 И В1А М1 и В1А плазмидни ДНК (клонирани в рВ1иезсгΐρΕ) вяха разградени с ЕсоРГ и прибавките вяха изолирани посредством електрофореза в ТВЕ (Ъг1з-воратна-ЕДТА); 89 тМ £гз.з-борат, 89 мМ борова киселина, 2 мМ ЕВТА рН приблизително 8.3) буфер в 17. агарозен гел, последващо пречистване с помощта на 6ΕΝΕ8Ι_ΕΑΝ кИ. Изолацията и пречистването бяха повторени за да се избегне контаминация на сондата с плазмидни ДНК секвенции, които виха хивридизирани до 1атЬс1а2АР секвенции, причинявайки неприемливи нива на Фона. Пречистените прибавки ДНК бяха белязани с Р-вСТР, използвайки Νίοΐ. Тгапз1а11оп кИ на Рготева ВхоРесН, в съответствие с Фирмените' инструкции. Маркираната ДНК беше разделена от инкорпорираните маркери 38- • · · · • · · · • · · · • · · · • · » · • · · · • < · · ······· »····· ·· чрез колонна хроматография (Μβηίβίίδ е!: а1., 1982)- Осем 135 тгп петрита с ΙβωϋΰβΖΑΡ библиотека бяха посадени на 10л5 рТи/петри и плаките поставени на нитроцелулозни филтри (МапхаИв е£ а1 . , 1982). Следва изпичане във вакуумна пещ за 2 час-а при 80’С, филтрите бяха прехибридизирани за 2 часа, след това хибридизирани при 42° С за една нощ (като е описано по-горе при Мез-Ьегп Ь1о£ анализа). Четири Филтъра бяха скрийнирани с М1 сонда и четири с В1А сонда. Филтрите кяха промити двукратно в 2 53С съдържащ 0.57. 808, еднократно в 1 ;·: 88С съдържащ 0.57. 303 и еднократно в 0.5 ;·: при ЗЗС, съдържащ 0.57 308, всички авторадиографирани. Потенциалните позитивни плаки бяха рескрийнирани със сонди. Високо титрови Фагови стокси бяха приготвени от потвърдени позитивни култури (моделирани М1А08 за М1--хибридизиран клон и Аиз1;В1 за В1 А-хибридизиран клон) и клонове в рВ1_иЕ8СВ1РТ, 8 съответствие с фирмената инструкцията за работа с 1 ат Ма Ζ АР (ЗЪгаЪадепе), използвайки ВВ4 като гостоприемен щам Е. со11. Плазмидни ДНК минипрепарати от получените резултати бяха приготвени чрез алкално лизиране (МапхаИв е! а1., 1982) и разградени с ЕсоП! . Разградните продукти бяха анализирани чрез електрофореза на агарозен гел.' Секвениране на прибавката М1А08 Д Η К секвениране беше проведено на пречистена рВЕОЕЗСРЛРТ плазмидна Д Η К с приложението на υηίίεϋ ЗСаСез В1оспат1са1з уегзхоп 2.0 Зедиепазе Κίί, в съответствие с Фирмените инструкции. От първите секвенционни реакционни инициатори от краищата на векторната секвенция бяха използвани за да се иницират реакциите. Секвенционните • · данни, получени от тези реакции бяха използвани за конструиране? на втората двойка от инициатори и от данните, генерирани ' е тези вторични инициатори бе конструирана третата двойка. По този начин ДНК беше секвенирана чрез “маХкопд а!опд" и от б^-край и от З^-край. Секвениране на прибавката АиеВ1 Този процес бе извършен с помощта Зедиепазе 2.0 Т7 ро1утегага (и 5 В В±ос1ает1са15) , както е описана при секвенирането на прибавката М1Аи8. ПОЯИМЕРАЗНИ ВЕРИЖНИ РЕАКЦИИ Получаване на кДНК мРНК (1и.д) от 11 дни. след инфектирането И.К. Н. сопДогДиз, получена по описания по-горе начин, бяха смесени с Т17 адаптор-инициатор ( ВАСТСВАбТСВАСАТСВАТТТТТТТТТТТТТТТТТ 3'ν ) в диетилов пирокарбонат (ВЕРС) - третирана вода, след това загрята до 05” С за 5 минути и незабавно поставена върху лед. Метилживачен хидроксид беше прибавен към крайна концентрация на 28.6 мМ и сместа беше инкубирана при стайна температура за 3 минути. 2-меркаптоетанол беше прибавен към крайна концентрация на 14.2 мМ и сместа беше поставена върху лед. За да синтезира кДНК, КИаее биагв (РКагтасха) беше прибавена към >1 единица/μ]. Реуегзе ТгапзсгхрДазе ЬиТ^ег (Е ίΐθ Зсхепеев) към едновременна концентрация, вАТР, вбТР, вСТР и сГГТР всеки по 1мМ А МО Режегзе ТгапзсгцрДазе (1_11:е Зсхепзез) по 2 μΐ (всички давани като крайни концентрации). Реакцията беше инкубирана при 41°С за 75 минути, след това • · екстрахирана с Фенол и хлороформ и пречистени посредством колонна хроматография (ΜβηίβίίΒ е! а1, 1982). Пречистената реаки,йонна смес беше разредена 2.5 п и съхранявана при 4“С РСК (програмирани термални цикли) амплиФикация на кДНК с Ма и 5 - с η е и,и фи ч н и и н и и.и а т ор и Р С Р реакции бяха проведени с използването на програмирани термални цикли (М. в, РезеагсК 1пс. ). Реакционната смес съдържаше 1 μ1 от 250 μΐ разредена кДНК, получена според вече изложено по-горе описание, 25 рто1 от първата верига на Т17 адаптор-инициатор, 25 рто1 от втората верига на амплиФикационен инициатор (всеки от тях базиран на позиции 865 - 884 (в^АСВВбТВТТСеВВТТТССВТАТ 3~) или тези базирани на позиции 30 ·-- 39 (5'ν 6СТ6ААТСТААСТССААТСС 3~) на М1Аи5 секбенция (8Е0 10 N0: 5)), 1 ;·: Тад ЬиТТег (ΝογΦббитЬгаВ1о1од1са15 Ι_.ΐό) и 0.5 мМ за всеки от вАТР, вТТР, вбТР, ивСТР, и в .100 μΐ реакционен обем и покрити с 40 μ], минерално масло, за да предотврати евапорацця. Тази смес след това беше загрята в термален циклер до 95’ С за 2 минати, след това държана при 72*С. При 72°С 2 единици от Тад ро1утегазе (1ЧогХитЬг1а В1о1од1сае 1Фс1) бяха прибавени и плавно размесвани с другите реактанти. Последвалата програма беше изпълнена в термалният циклер; 1 етап Темпериране при 50° С за 5 минути 2 етап Удължаване при 72° С за 40 минути 3 Етап Денатуриране при 94° С за 40 секунди 4 етап Темпериране при. 50° с за 2 минути 5 етап удължаване при 72* С за 3 минати 6 етап 29 цикъла от етапи 3 до 5 7 етап Финално удължаване при 72° С за 15 минути • « • · • · · · · * * 4.1. • · · » • » · · • * · · • · · · • · * · 8 етап Държи се при 4° С. Тези състояния бяха установени от РгоЬтап е! а1. (1988) 1- Клониране на РСР продукти РСР продуктите от сепарирани пое р ед с тв ом Връзките от приблизително реакции ояха агарозен гел. гореописаните електрофореза в 2.5 и 3.5 кЬ бяха електроелюирани на стъклена нишка (МКаДтап), екстрахирана с Фенол и пречистена чрез 650 хроматография (Рагтасха) (ЗатЬгоо! еК а1 . , 1989). Пречистената ДНК. беше лигирана в р"Г7В1ие Т-вектор (Иожадепе), следвайки инструкциите? за употреба. Секвениране на 2.5 и 3.5 кЬ РСР продукти ДНК секвениране беше извършено със Зедиепаее 2.0 к!К (05 В1ос5ея11са1з) използвайки техниката на "о11допис1ео1.1с1е ма1к1пд", описана в раздела за секвениране на ΙΊ1Α05. ПОЛИМЕРАЗНИ ВЕРИЖНИ РЕАКЦИИ ЗА 5~ КРАИЩА Приготвяне на първата верига кДНК 1 рд от мРНК от 11 дни след инфектирането Н. сопКогЬиз, и.К., получена по описания по-горе начин, бяха смесени с константен инициатор (5^ АА16ААА6С66АТ66СТТ6А16С 3'·'-') построен на запазен регион в АизСВ! и 2.5 кЬ РСР и 3.5 кЬ РСР продукти (ЗЕО ΙΒ N03: 6, 7 и 8 респективно). Сместа беше загрята до 65° С за 5 минути, поставена върху лед и метилов живачен хидроксид беше добавен към крайна концентрация от 28.6 мМ. Сместа беше инкувирана при стайна температура за 5 минути, след това 2-меркаптоетанол беше • · ·42· I · · · · · • · · *• · · · · *» · · »·····« ·· прибавен към крайна концентрация от 14.2 мМ и сместа поставена на лед. Първата верига ДНК беше приготвена при ползването на реагенти от 5°° ΠΑΕΕΞ зузЬет (61Ьсо/ВП1_) при крайна концентрация от 20 тМ Ττίε/ΗΟΙ, рН Е!. 4, 50 тМ КС1 , 2.5 тМ МдС1, 100 цд/т1 , В5А, 0.5 тМ от вАТР, вСТР, сКЗТР, сПТР. 200 единици от ЗирегвсгжрЕ Рецегзе Тгапзсг1рбазе бяха прибавени и реакцията беше инкувирана при 42° С за 30 минути и след това загрети при 55° С. ПИазе Н беше прибавена към крайна концентрация на 100 11/<п1 и реакцията инк увирана при 55° С за 10 минути, след което поставена на лед. кДНК беше пречистена през 61аезтах зрт колона (61Ьсо/ВР1...) и съхранявана при -20° С. Образуване на С-опашка на кДНК 1/5 от първата верига на кДНК беше загрята при 70° С за 5 минути, след това охладени на лед за 1 минута. Реагентите от 5°·" ПАСЕ зузСет (С1Ько/ВП1_) бяха прибавени към крайна концентрация от .10 мМ Тг1з/НС1 рН 6.4, 25 тМ КС1 , 1 „25 т1’1 НдСХ,, 50 рд/т! В8А., 0„2 с:1СТР.. 500 и/т! Тегтжпа! ЕгапзТегазе бяха прибавени и реакцията инкувирана на 37° С за 10 минути, след това загрети на 70° С за 15 минути и съхранявани на лед. РСР амплификация с използването на АизСВ!, 2.5 кЬРСР и 3.5кЬРСР специфични инициатори Р С Р реакциите бяха изпълнени в програмиран Тегта1 Сус1ег (М.□.РезаегсК 1пс.). За З^край беше използван един от 3 инициатори. 1. Инициатор, специфичен за 2.5 кЬ РСТ продукт базиран на 374 до 394 (5^ ТеТТ6Т66СТААТТТС6ТССА 3~). позиции • · * · -43- 2. Инициатор, специфичен за 3.5 кЬ РСТ продукт базиран на позиции 1210 до 1299 ( 5"·' САТСТТIА6ТТАТСТ6АССА6 3"“) . 3. Инициатор, специфичен за кДНК клон АизбВ! базиран на позиции 357 до 377 (5'4" 6АССАТС6СТ6АТ6ААВТСВВ 3""·') . За 5''·' край на реакциите обикновен "АпсКог ргхтег" б'4' СиАСиАСиАСиАВбССАСВСбТСбАСТА6"ГАСВВВ IIВВВI1ВВВ11В л'3 ) беше използван. Всяка реакционна микстура съдържаше 4 μΐ от 50μ1 С-опашка кДНК, 25 рМо! от подходящите два инициатори, 1 ;·; Тад роХутегазе ЬиТТег (ВоеЬг1пдег/Мапп1яе1т) и 0.5 мМ всеки от с1АТР, <::1СТР, РВТР и вТТР краен обем от 100 μΧ. Тази смес беше покрита с 50 μΧ от минерално масло и загрята до 95° С в циклерът за 2 минути. Реакционната смес беше държана на 80’ С, докато 0.6 единици от Тад РоХутегазе бъдат прибавени и след това преминат през следната програма: 1. Темпериране при 50° С за 5 минути 2. Удължаване при 72° С за 10 минути 3. Денатуриране при 94° С за 45 секунди 4. Темпериране при 50° с за 1 минути 5. Удължаване при 72° С за 2.5 минути 6. 39 цикъла от етапи 3 до 5 7. Удължаване при 72° С за 15 минути 8. Държи се при 4’ С. Клониране на 5~ РСР продукти РСР продуктите бяха сепарирани посредствомелектрофореза на агарозен гел и връзки на очаквания размер,около 1.3 кЬ, бяха срязани, ДНК беше пречистена с използването на ΒΕΝΕΓΧΕΑΝ к!С и лигирани на РТ7В1ие Т-вектор(Иоцадепе), в съответствие с приложените фирмени инструкции. -44-- ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА 3"- КРАЙ НА А03ТВ1 Първата верига на кДНК беше използвана за получаването на кДНК, прилагайки инициаторите Μ1ΑΙ.Ι3. 1414 до 1435 от Специфич ния инициатор (5^ ТСТТТВААВАААТВААААВСТТ 3"Ό в АизбВ1 (5Е0 II) N0: 6) беше използван за ΜΙΑΙΙΒ РСР и реакциите извършени в термален циклер (М. □ . Резеагсб 1пс). Реакционната микстура се състоеше от 25 рМо1 от всеки инициатор, 2 μΐ от кДНК, 1 х "Гад РоХутега^е биТГег ( ΒοοΙίγ Хидег МатНчехт) ,, 0.5 ηιΓΙ <:ΙΑΤΡ,, вСТР, вВТР и сГГТР в .100 μΐ . Те бяха покрити, с 50 μΐ минерално масло и загрети до 95° С за 2 минути. 0.6 μΐ от "Гад ραΐ'/тегазе бяха прибавени .и същият програмен цикъл беше осъществен като за 5~ РСР (описан по-горе). Клониране и секвениране на 3~ продукти Продуктите на РСР бяха сепарирани посредством електрофореза в агарозен гел и връзките на очакваните размери, .1,3 кб срязани, и ДНК пречистена при използването на ВЕИЕССЕАГЧ ΚίΙ и лигирани в РСР-Всгхр! (ЗСгабадепе), според приложените фирмени инструкции. Секвениране на клонирани РСР продукти ДНК от РСР клонове беше секвенирана, при използването на Ведиепазе 2.0 к!б (11паЬев Вбабез В1осНет1са1 ) според приложените Фирмени инструкции. Олигонуклеотидните инициатори бяха приложени за "ма1к а1опд" клоновете от двата края, и 3~, респективно. на ДНК от • · АНАЛИЗ НА ВСИЧКИ ДНК СЕКВЕНЦИИ Секвени,иите бяха анализирани с помощта на СС6 < Сеп е Ή. с:<:·. СотриЕег бгоир) Зедиепзе АпаХузхз 8οίЧмаге 1::'акзде,, Юеиегеих е! а1„ ,, :1.984,, АНАЛИЗИ ΝΟΚΤΗΕΡΝ ВЬОТ И ЗОиТНЕРИ ВЬОТ Приготвяне на ИогЕНегп Ь1оСз ИогСКет Ь1бЕз бяха приготвени във Формалинови гелове, създадени по начина, описан от МапхаИз еЬ а1. (1982). мРНК проби (от 11-, 15-, и 23-дневни зрели Форми на Н. сопСогСиз) бяха третирани със 17.57. ν/ν Формалдехид и 507. ν/ν Формамид 6 1*1 0 Р 3 бафер (20 мМ 3 - 1Ч~морФолин)пропансалфонова киселина, рН 7.0, 8 тМ натриев аи,етат, 1 мМ ΕΠΤΑ) при 65°С за 15 минати и охладени на лед. Келовете бяха електрофорезирани в МОРЗ баФери и нанесени на ВигаХон мембрани посредством капилярен трансфер, по начина, описан от ЗатЬгоок еС а!., (1989). Приготвяне на ЗоиСЬегп Ь1оЕ: Два зрели хелминта от Неатопси1из согтЬогиз, които са били едномоментно замразени в течен азот, бяха стрити до полачаване на Фин прах в течен азот. Прахът беше прибавен бавно към 25 па 1 лизиран бафер (0.05 М Тг1з-НС1, рН 8.4,/ 0»1М Е Ϊ) Т А., :1.л1 ш/ν Загкозу 1,, 0.,05 тд/т! р|-о1ехпа«>е К (ВоеИПодег МаппЬехт) и инкабирани за два часа при 65°С. Саспенсията след това беше екстрахирана двакратмо с един обем от фенол и хлороформ, двакратно с два обема от хлороформ и преи,имитирана с етанол. Преципитираната гвномна ДНК беше ресаспендирана в 20 т1 от Тг1е, ЕВТА бафер (ТЕ, рН • · • · 46- 8) , оставена за една нощ при. 4вС на люлееща се маса, след това диализирана 8 един литър ТЕ. РНК беше отстранена чрез инкубиране с ВМазе-^гее Пкказе А Туре I (81дта) при крайнаконцентрация на 2О’рд/т1, при 37’С за един час, последваща една екстракция с Фенол-хлороформ и хлороформ и преципитация с етанол, както по-горе. Преципитираният геномен ДНК пелет беше промит двукратно с 707. м/ν етанол и ресуспендиран в един т.1 ТЕ, както по-горе. Геномна ДНК беше разградена с ЕсоР1 или ΗίηβΙΙΙ (25 цд от ДНК във всяко разграждане) за една нощ при 37°С, след това електрофорезирана при 5 рд за писта на 17. м/ν агарозен гел в Тг1з-ацетатен буфер. Гелът беше анализиран по ЗоиФКегп Ь1оТ посредством капилярен трансфер, както е описано от Мап1аФ1з еФ а1 . , (.1882) на НуЬопв-М мембрана (Атегебат 1ггЬегпа-Ь1опа1 ) . ДНК беше? Фиксирана на мембраната с помощта на ултравиолетова светлина, в съответствие с Фирмените рекомендации. Приготвяне на сонди рВ1„иЕЗСР1РТ плазмиди, съдържащи ΜΙΑυδ, В1А или АизФВ1 прибавки бяха разградени с ЕсоР!. рТ7В1ие плазмиди, съдържащи З.бкбРСР продукти прибавки, бяха разградени с ВатН! и тези съдържащи. 2.5кЬРСР продукт прибавки бяха разградени с ВатН1 и ХЬа1. Разградените продукти бяха е лек: т р ο Ф о р е з и. р а н и ; при б а в к и т е б я х а разграден и и р а д и о а к т и 6 н о обозначени с а- Р-вСТР чрез транслация, по начина вече ο п и сан по - г о р е п р и с к р и й н и р а н е на 1ат Ьв аΖАР б иб лиотека. Хибридизационни условия (За £· 'Ои-ЬЬегп Ь1оКз) Мембраните бяха отстранени и прехибридизирани в хибридизационен буфер, както бе вече описано, за 3 часа ο · при 28β С. Геномни Д Η К Зоивбегп Ь1оЬ ленти хибридизирани към всяка от горепосочените сонди за при 42°С, в 2 ;·; ЗЗС, съдържащи 0.17. м/ν а 8 тор а д иогр а Ψир а ни. Послед ва πр оявя9 а не авторадиографиите, лентите бяха отново промити (0. една нощ 303 и на ззс 0,1% м/ν 3ϋ3 при 65°С) и отново авторадиограФирани. За Να г С ή е г η Ь1 ο 1; 5 За сонди N1, М1АПЗ и ΒΙΑ (ЗЕО 10 N03; 1, 5 и 2 респективно) ΝογϊΙίογγί Ь1о1в от мРНК от 11, 15 и 23 дневни зрели Форми на Иеатопси1из сопбогиз бяха сондирани първо с М1 прибавка. Филтърът беше прехибридизиран за 2 часа при 42' С в 2 ЗЗС (където 20 ЗЗС ~~ 3 М МаС1 , 0.3 N натриев цитрат, рН 7.2) съдържащ 5 :·: ВеппагвСз (0.1% м/ν Рхсо11 400 (Рбагтасха), 0.1% поливинилпиролидон, 0,1% волски серумен албумин Фракция V (Зхдта СИетхса1 Согр)), 0.5% 8Ώ3 (натриев додецилсулфат) , 107, д екстра нов сулфат, 0.1 тд/т1 Д Η К от тестиси на сьомга и 507. деионизиран формамид» Хибридизацията към сондата беше извършена в същия буфер за една нощ при 42!'С. Филтрите? бяха промити двукратно за 30 минути в 2 ЗЗС съдържащ 0.5% 303 и 50% Формамид, двукратно за 30 минути в 2 ЗЗС, съдържащ 0.57. 303 и двукратно за 30 минути в 2 ЗЗС. Първото промиване беше при 42°С и. всички останали промивания бяха при 37вС. След авторадиография блотът беше? оЕзЕгапеп, посредством промиване в кипяща 0.1% 505 и реавторадиографиран до осигуряване на отстраняване? на сондата. Същият блот беше след това сондиран с М1А113 приставка, промит и. авторадиографиран. Блотът беше отново отделен и изпитан и след избистряме сондиран с В1А приставка. След нов стрипинг, блотът беше сондиран, както ···· · · · * * * • е а ·· · · « ······· ···· · · · * • · « · е······ · · · -48- 6 е ш е η от о р е ο η и. с а н о , За сонди ΑιαβΙΒΙ , 2.5кЬ и 3.5 кЬ РСР продукти (ЗЕО Ю N05: 6, 7 и 8. ΝοΓίΚβΓη Ь1оСз беше хибридизиран с йизЕВ1 приставка при използването на условията на умереност, както бе описано при ЗоиСИегп βίοι хибридизация. След авторадиография, блотът беше отделен с кипяща 303, в съответствие с Фирмените инструкции на АтегзИат., след това сондиран с 2.5 к.Ь РСК прибавка (клон 2), разделен отново отделен и сондиран с 3.5 кЬ РСР (клон 2) прибавка. РАЗГРАЖДАНЕ НА Н100 И АНАЛИЗИ НА ЕНЗИМНА АКТИВНОСТ Приготвяне на Н1100 Природен Н1100 (Η110ΏΝ) беше приготвен съгласно методите, описани в N088/00835 и N090/.1.1080. Приготвяне на еластазен Фрагмент (НИЗ) от Н110В Зрели Форми на Неатопси!из сопСогиз бяха хомогенизирани в 10 обема на ледено студен РВЗ/0.027. натриев азид и след това центрофугирани за 20 минути при 13000 ρδ./мин. Пелетът беше рееуспендиран в 10 обема на РВЗ/азид, рехомогенизиран и центрофугирането беше? повторено. Последва ресуспенсия в 50 мМ МОРЗ буфер, рН 7.4 (обемът за суспенсия е 1 ш1 за 30 минути, пелетът беше разграден с еластаза (800 μ1/20 т1 от суспенсия); 1 тд/т! пресен разтвор, приготвен в 2+ 1 мМ НС1/ 2 гпМ Са ) за един час. Разграждането беше пре ус т анов ено чрез приб ав я нето на 3,4 д ихлор изо к у м а рин (300 μΐ от 10 мМ 6 ВМ80/20 πιΐ от разградния продукт). Сместа беше центрофугирана при 13000 οδ./мин. за 20 минати и « · • · • » « · · · пелетирания материал запазен. Супернатантът беше ултрацентрофугиран. при 1СЮООО д за 1 час и 20 минути. Получената супернатантна течност беше приложена към Сопн колона и бяха получени свързани Фракции. За анализ, тази Фракция беше внесена на 303~-полиакриламиден гел и елек трофоретично трансфериране на поливинилиденова дифлуоридна мембрана (1ттоЬ1Ιοη-Ρ, МИИроге), оцветяване с с Соошаззге Ь1ие, връзката 105 кЬ беше ексцизирана и анализиране в газова Фаза на аминокиселинен секвенатор. За изследвания на ваксинация, свързващите Фракции СопА бяха пречистени, посредством концентриране и приложени на Зирегозе 12 (РЬагтасха) гел Филтрационна колона и получена колекция от тези Фракции, съдържащи аминопептидазна активност. Термолизно разграждане на Η110Ι) Дублетът Н110Е) беше? пречистен посредством електроелюция от подготвена скала на 87. ЗОЗтгалиакриламиден гел за да даде Н1100Е, както е описано в 1*1090/11086 и чрез електроелюция на димерна Форма, внасяна точно на 200 кр (които дава характереетичен дублет на 100 кв, когато повторно се внася на 305-РА6Е) за даде Н1100Е. Разтворите на ΗΙΙΟϋΕ бяха концентрирани до 200 μΐ , беше? добавен калциев хлорид до 5 мМ и. сместа беше затоплена до 37°С. Прясно приготвен разтвор от 1 тд/т1 ТЬегто1уз1п (8 1 мМ НС1, 2 тМ СаС1 ) бяха прибавени в отношение на 0,1 рд Тбегто1узхп на Ζ. рд ΗΙΙΟϋΕ. Сместа беше инкувирана при 37°С за 120 минути и след това реакцията беше спряна чрез прибавяне на 5рд от 0.5 πϊΜ ΕΠΤΑ. Протеинните Фрагменти бяха отделени посредством електрофореза на 157. 3153--полиакриламиден гел и • · * · • · · · • · * · • · · · е л е к т р ο Ф оре т и ч н о т р з. н с ф е р и р а н и н а полибинилиденоба диФлуоридна мембрана ( IттоЬх 1 оп-Р, МППроге). Следва оцветяване с Соотаззге ЬПе и най—интензивните дискретни връзки бяха ек си,изпрани и анализирани в газова фаза на аминокиселинен секбенатор. Приготвяне на Фракция Н110В (Н11А), обогатена за аминопептидазна А активност Пелетният материал, добит след третиране с еластаза посредством центрофугиране при 17000 д за 20 минути (виж по-горе) , беше рееуспендиран 6 17. Тмееп в РВ5/азид и оставен (при разбъркване) за един час. Суспенсията беше центрофугирана при 17000 д за 20 минути и супернатанта беше отстранен. Пелетът беше повторно екстрахиран с 17. Тбез11. в РВ5/азид. Супернатантите след центрофугирани при 17 000 д за 20 минути бяха комбинирани и ултрацентрофугирани за 1 час и 20 минати при 100 000 д. Супернатантът беше приложен към СопА афинитетна колона (АШде1, Вхогаб) и свързания материал елюиран и след това Фракциониран посредством йонообменна хроматография на МопоО колона. Анализи на ензимни активности а ци л η е п т и д н а х и д р о л а з а в Н.110В препарати бяха Активности на а-амино (мик розомална) аминопептидаза характеризирани чрез анализи, в разтвор, с използването на 1_ - л е в ци н, м е т и о н и н, Ф е н и л а л а н и н, , и - г л у т а м и н о в а к и с е л и н а и лизин р-нитроанилиди (ρΝΑ). Всички аминокиселинни р-нитроанилидни субстрати (с изключение на и-гл.утаминова киселина) бяха получени от Зхдта, Роо).е, Вогзе!, 1Ж, и-глутаминова киселина беше от Р1ика, ОогзеР, ПК. Единични • « -·5:ΐ.···· хидрофобни (леби.ии- или фенилзланин -) и заредени «--глутаминоба киселина·-) аминокиселинна ρΝΑ, известни като субстрати за аминопептидаза-М (АрМ) и -А (АрА) респективно от бозайници, бяха подбрани за измерване на ефективността на ензимни инхибитори и серумно инхибиране на Н1100 а минопептида зни а к тив нос ти л (а) Анализ на микропетри Гнезда на микро-ЕкЛЗА петрита (Оупа^есб 1тти1оп 1, 01гд1п1а, иЗА) бяха запълнени с 250 μΐ или от 50 мМ НЕРЕЗ или МОРЕ рН 7 и 1-10 μ1 от фракцията, подложена на анализ, Петритата бяха преинкубирзни при 37°С за 10 минути преди да бъдат прибавени към 10 μΐ от 25 мМ аминокиселинен р-нитроанилиден субстрат на гнездо. Началният момент на отчитане на оптична плътност (00) при 405 шп, беше измерен с помощта на четящо устройство за Е1_1ЕА петри и петритата след това бяха инкубирани при 37вС за 15 - 30 минути. Финалното разчитане на 00 беше проведено както преди и беше изчислена промяната на 00 за минута за милиграм от протеин. (Ь) Инхибитор на чувствителността Методът, използван описан в (а) по-горе, с изк бяха прибавени към 250 μΐ Η110Ώ и преинкубирзни за добавено от субстратите киселина-ρΝΑ. Процентът на за ензимният анализ беше този, лючение на това, че инхибиторите от буфер и 10 μΐ от 1 тд/т1 СопА 10 минути при 37’С преди да бъде (левцин-ρΝΑ или а-глатаминоба инхибиране беше изчислен, както следва х ···· у __________________ X 100 = процент на инхибиране, к ъдето ве11.а00/мин от ензима без прибавен инхибитор и • ·· · ··· · · ·· ···· · · · * * · • « « ·· · · I» ··«···· • · · · * · * « ...... ·· ·· ··«···· · · · ·" 52— у = с(е 1 ЬаОВ/ми.н от ензима и. прибавен инхибитор. Осем съединения от различен ензимен клас на инхибиране бяха тествани индивидуално: Атазбабхп , Вез-Ьа-Ьгп (металопротеаза , аминопептидаза), 1,10 фенантролин, ЕВТА (металопротеаза), ФосФорамидон (металопротеаза, термолизин, колагеназа) ΑρΓοϋηίη (серии протеаза), РерзСаНп (аспарагинова протеаза), ΡΙΊ5Ρ (серин и цистеин протеаза) и Е64 (цистеин протеаза). АтазбаИп, ЬезбасИп, 1,10 Фенантролин, РМ5Р и пепстатин бяха получени от 31дта, ОогзеР, ΙΙΚ. Всички други инхибитори бяха получени от Воебгхпдег-Маппвехт. Всеки инхибитор беше използван при две концентрации равни или по-големи от максималните концентрации, препоръчани от Воеб г :ί.η цег- •Папп Гюхгп (с) Анализ на антисерумна инхибиция на ензим Анализът беше като описаният в (а) по-горе, с изк лючение на това, че две микро-ΕΕΙΒΑ петрита бяха използвани, . В едното петри, 10 μΐ от СопА Η110Ι) (1тд/<п1) и 10 μΐ от антисерум от всяка овца за гнездо бяха инкувирани при 37“ С за .15 минути. Второто петри, с 250 μΐ от НЕРЕ5/бикарбонатен буфер и 10 μΐ от етерна фенилаланин-ρΝΑ или субстрат на <х-глитаминова киселина-ρΝΑ за гнездо, беше също преинкубиран при 37°С за 15 минути. Серумни смеси от СопА Н.110В бяха след това прибавени към буферно-субстратните смеси във второто петри с мултипипета. ве1РаСШ/мин беше определена, . За целите на корелациите, процентът на инхибиция беше изчислен с помощта на Формулата в (Ь) по-горе, където ;·; представлява средната ве]. (саОО/мин за гнездата, които съдържат ензим и серум от негативна контролна овца (ваксинирана е конски Феритин от слезка) и у = ве1баСВ/мин за гнездата, които съдържат ензим и серуми от • · • · « » · · · индивидуални овце, ваксинирани с Н1100. За целите на корелациите Фиг. 18), процентът на протекция веше изчислен с помощта на Формулата в (Ь) по-горе, където х представлява или средният брои на отделени фекални яйца за грам или средният товар на контролните хелминти, и у е или фекалния добив за грам през време на експеримента или товарът на хелминтите. от отделните овце, ваксинирани с Н11ОС. Локализация на ензимна активност чрез хистохимични способиАминопептидазна активност беше демонстрирана на 10 рм криостзтни секции от зряла форма на НаетопсКие сопСогЪиз, с помощта на С-левцин 4-метокси (3-нафтиламид и Ь-глУтаминоб а- 4- метокси-р-наФтилзмид като субстрати чрез методите на МгчсЪ1ае еЪ а1. (1957) , Макапе е£ а). . (1974) и Ьо„)ва е! а1 (1980)„ ЕКСПРЕСИЯ НА РЕКОМБИНАНТЕН Η110Ι) В ЕУКАРИОТНА КЛЕТЪЧНА СИСТЕМА НА В АС1Л..О91Р03-НАСЕК0М0 Конструиране на експресионни плазмиди Фрагментите 3.5К Р С Р, описани по-горе, бяха генерирани чрез амплиФикация на олиго сЗТ адаптер (които съдържа За3.1 участък) и олиго 872, които представя база Мое30 - 49 в М1А08 секвенция, и бяха клонирани във векторът рТ7В1ие. Клон рТ73.5-2 е ориентиран със векторен полилинкерен участък ВатН1 на неговия 5' край и участъците ΗίηΰΙΙΙ, ХЬа! и 5а11 на 3' край. Секвенцията на 5' край е следната; В а т ΗI % ! - - -олиго 872- — -1 - 3.5К — - -- в' 00 ΑΤΟ 00А ТТО СТО ААТ СТА АСТ ССА АТС С .............. 3' Лев Асп Лев Тр Про Иле . » ; ..... . -54- 36ездичк ата (Ж)

·««· · * ·· ·· ··«···· ·· · π о с о ч б а 3 а к з ч е н и я 3 " б Т / д а , използван за кдонирзнв във вектора рТ7 В1ие ОекЕог. 3.5 РСК клон 2 беше разграден с ΗϊηάΙΙΙ (единичен участък във векторна полилинкерна секвенция на 3' край на 3.5К ген) и краищата попълнени с деоксинаклвотиди, използв а ϋ.κ и ДНК π о л и ме р а за 1 (К1еη омζФрагмент), според Маη1аД1з еЬ СБ6АТСС6 3', к ъм Ь1 и η ί позволяваш, ексцизирана а! (1982). Беше селектиран линкер ВатН! (5' Мен Епд1апй ВхсПаЬе СаЕа1од Νο 1021), лигиран краища и клонове с допълнителен ВатН! участък, гвннз секвенция с пълна дължина Н110Е), да бъде като ВатН! Фрагмент. ВатН! Фрагмент беше изолиран посредством електрофореза на 0.6% и/ν згзрозвн гел в Егхз-ацетатен буфер, последващо пречистване с помощта на БЕМЕСЕЕАМ (В10101); Тази процедура беше проведена двукратно. Пречистения Фрагмент след това беше лигиран към ВатНГ--еи Ь, фосфатизиран рВ1иеВас 1.1. ( Ιηνί Ьгодеп Согр.) и клонове носещи фрагмент в правилната ориентация (напр. с 5' край на 3.5 ЕСЕ клон 2 поставен под контрол от полихедринният промотрр на ЬасиХоУхгие) детермирани чрез разграждане с МЕе! и ХЬа.1. Полученият плазмид беше? частично разграден с ВатН1 и краищата попълнени, както бе вече описана по-горе. Беше добавен Мсо! линкер, съдържащ АТБ (5' СССАТ6Б6 3'; Мем Епд1апе1 В1о1аЬз Са!:а1од Νο. 1040) и сместа беше ли тирана . Клонове, които имаха линкера, лигиран на 5' край ВатН! участък от 3.5 РСЕ клон 2, бяха детерминирани чрез разграждане с Мсо!. Полученият плазмид, моделиран рВВЗ.5 2(Ν) е изобразен, под Формата на диаграма на Фиг. 19. Тази. конструкция завършва в инсерцията на рамка АТ6 на 5' край на и.нсертът 2.5РСЕ клон 2, за да започне транслация. Секвенцията, заобикаляща тази инициирана АТБ е; • · • ·« · · · · · · · · • * * · · · ·>..'*· • ·« ·· » · · ··*········ · » » · ·· «· ·«· «··· ·· * ВатИ1—1Мсо1 връзк а~ВатН1---------Ж !------------олиго 972----------------! — 1.1' ОСА (СССС А ϊ ϋ βββ А”(’С ββΑ Ϊ Ϊ Β СТС ААА СТА АСП' ССА АТС С.. „ Мет Гли Иле Арг Лев Лев Асп Лев Тр Пра Иле... Ек. спресирания протеин ще бъде без аминокиселини 2 - 9 от кореспондиращата Н11ОВ и ще има 3 аминокиселини от линкерна сек вени,ия , незабавно следваш,а АТ6. Произвеждане на рекомбинантен ЬасиХоухгиз, съдържащ с е к в е н и, и и Η110 Е) Плазмидът рВВ ЗроворЕега Тги.дарегвз. и з π о л з в а и к и л и н е а р е н π о л и х е д р о з н а вирусна ,5-~2(Ν) беше трансфектиран в клетки на (3Ϊ9) (доставени от Ιηνί1годеп Согр.), А и Ь о д г аίί са с а 1ί ί огη ί са н укле а р на (АСПР9) ДНК и катионни липозоми. (ΙηνίЪгодеп Согр . трансфек и,йонен модул) в съответствие с Фирмените инструкции. Клетки бяха култивирани в средата ТС-1.00 (Ехдта), обогатена с Фетален телешки серум (С31_ Ι._ΐ.β; инактивиран при висока температура (56"С за 45 минути) и антибиотици ( репίοί 11 ίη/зЬгерСотуανίη , депСатусап ; С31_ ССР). Беше проведена също и контролна трансфекция, като се използва рВВЗ.5 (Ν) плазмид с АТС инсертиран на 3’ край на 3.5 РСР клон 2 секбенция. Бяха селектирани рекомбинантни плаки на базата, така че рВХиеВас II вектор също кодира {3-ралатозидаза ((3-да1) на Е. соН, чрез включване на Х~да1 в агарозно наслояване на препоръчаното ниво. Селекцията от Ь1и.е плаки беше взета и подложена на два по-нататъшни етапа на пр еч ис тв ане на' пла к ите, с л е д което инфектирани т е монослоеве не дадоха доказателства за контзминиран див тип вирус (което би било доказано чрез присъствието на ядрени полихедрони). Пречистените вируси бяха обозначени като 3.5-2-Р2А, РЗА и -Р4А, и бяха амплифицирани чрез две • * сек йени,пални инфекции от 8Г9 клетки, използвани преди. Пречистената от контролните трансфекции плака беше обозначена като 3.5-2-геу. Оценка на експресия на Н1100 б клетки на насекомо. инфектирани с рекомбинантен Ьаси1оу1гиз' Монослоеве от 8Ϊ9 клетки (1 10’ό клетки, 6 25 ст"’2 флакони) бяха инфектирани с 3.5-2 вируси., див тип ( и!) вирус, с контролен вирус експресиращ [З-даЗ. , или не бяха инфектирани. След 4 дневен растеж при 26"С, монослоевете сяха отделени чрез умерено р а з к л а ш,а н е, к л е т к и т е в ъ :з с т а н овен и чрез центр оФ угира ни (2000 οδ./мин, за 10 минути), и клетъчните пелети разрушени размразяване. Лизатите бяха ресуспендирани 25 μΐ кратни бяха анализирани за АрМ ттсго-ме!! анализ. 1.5 μΐ кратни (3 ;·; 10""'4 клетъчни лизатите от по-горе бяха електрофорезирани чрез о цикъла на в 500 μΐ РВЗ, и активност чрез еквиваленти) от на денатурирани 7.5'/. 303-полиак риламидни телове Един тел след това беше оцветен с Соошаззхв Ь1ие, за да даде оценка на нивата на експресия. Друг гел беше анализиран чрез Мез1егп βίοί, и след това сондиран с антиНИООМ (както бе описано по-горе). Р Е 3 У Л Т А Т И АНАЛИЗ НА ИМУН0П03ИТИВНИ КЛОНОВЕ Анализ на активност за антитела, пречистени на клон М1 АФинитетно-пречистени антитела, специфични за всеки от петте антитялопозитивни клонове, бяха приготвени и използвани за да сондират НезСегп Ь1о1. на обогатен с 01100 • · • · · ·· · · · ··*»*·· ·»». · * · · * ·· «· ······· ·· · .... 57- екстракт. Както е показано на Фиг·. 8, всички 5 клонове явно рекогнисцират дублетът Н1100. Обаче, реакцията с клон М1 даде най -силен сигнал (Шип. 86) в сравнение с 1 атЬбад 1:1.1. негативен контролен блот (Фиг. 8е) . Този клон следователно беше изследван по-нататък. АН£ из 1Мог1.Ьегп Ь1о1: с клон М1 Анализът НогЬЬегп βίοι от НаетопсЬиз согтЬогЬиз мРНК, сондирана с М1 приставка, е показан на Фиг. 9. Единична мРНК връзка беше рекогнисцирана, на приблизително 3.5 кЬ. Това е достатъчен размер да кодира за протеин от около :1.001<с1 Сек вени,йонен анализ на клон М.1 Анализът на рестрики.ионно разграждане на ДНК с ЕсоР1 показва,че приставката М1 е приблизително 300 Ьр.Секвенцията на ДНК на Фрагмент М1 беше детерминирана (8ЕС! П) N0: и е показана на Фиг. 3. Фрагментът включва 295 Ьр с отворена за четене рамка, започваш,а с основа номер 3. Анализ МогЬЬего Ь1о1: с клон В.1А Анализът МогЬЬегп Ь1оЬ от НаетопсЬиз сопЬогЬиз мРНК, сондирана с В.1.А приставка, е показан на Фиг. 9с. Както за 1*11, единична мРНК връзка беше рекогнисцирана на приблизително 3.5 к Ь. Секвениране на клонове В1А и В2 Клонове на В1А бяха секвенирани (8ЕС1 10 N08: 2 и 3) и пълната секвенция (ЗЕО 10 N0: 2) е показана подредено по Н11-1 (ЗЕО 10 N0: 19) и АизЬВ! (ЗЕО 10 N0: 6) на Фиг. 5. • · » -58-- Пристабката е 484 Ьр и има пълна ОРР от първата основа. Третите Фрагменти на В2, полачени чрез разграждане с ЕсоК! бяха секбенирани и пълната секбенция за В2 (ЗЕС1 10 N0: 4) е 581 Ьр. Тоба е показано подредено на Фиг. 4. Секбенцията има ОРР от позиция 3 до 213 Ьр,спиращ кодон и ултратранслаи,йонен регион, съотбетстбуващ на 2.5 к.Ь РСР: продукт секбенция (8Е(3 П> N0:: 7)., Експресия на М1 и ΒΙΑ б Е. соП Когато су&amp;клонирани на 68Т експресионен вектор, бяха получени клоновете, които експресират съединени протеини от 38- 40 кв, за ΙΊ1 и 45кв за В1А. Това съотбетстбуба с предсказаните размери за тези приставки, позволени за молекулното тегло на глататион.....3-трансфераза. Двата съединени протеина реагираха много силно на Иезвегп Ь1оЬз с афинитетно пречистени антитела до ΗΙΙΟϋΕ (Р1д. 11). Съединените протеини бяха експресирани като неразтворими к л етъчни в к люч б а ни я . Реакции на антитела в овца, ваксинирана с М1-Б5Т и В1А-БТЗ съединени протеини Антисеруми от овца, инфектирана със съединени протеини, бяха тествани чрез ИезЬегп Ь1оЬ срещу Н1100 препарати. И двата протеина Б8Т--М.1 и 63Р--В1А предизвикаха антитела, които специфично рекогнисцираха дублетът ΗΙΙΟϋ (Фиг. 12). Серуми от негативна контролна овца не рекогнисцираха дублета ΗΙΙΟϋ. ИЗОЛИРАНЕ И ХАРАКТЕРИЗИРАНЕ НА КЛ0НОВЕ, СЕЛЕКТИРАНИ ЧРЕЗ ХИБРИДИЗАЦИЯ С М1 ИЛИ В1А ДНК ПРИСТАВКА * · * »·«····> » · « ······· ·· · Потвърденият позитивен клон, хибридизиран до М1сонда, беше обозначен като М1А118 (ЗЕО 10 140: 5), и клонът хибридизиран до В1А бе обозначен като Аиз.ЬВ1 (8Е0 10 N0: ЬУ . Рее трик и,йонно разграждане на показа размер на приставка от 1.6КЬ за АизЬВ1. Както е ΝοτΊβετη Ь1оЬз, М1АС1Б и размер мРНК (около 3.5 кЬ) Секвенционен пречистен плазмид ВМАз с ЕсоР! около 900 Ьр за М1А115 и ок оло показано на Фиг.9Ь) и 9в ) , на АизЬВ1 хибридизираха на същият както го направиЬа и 1*11 и В1А. нализ на М1АП8 Пълно секвениране на Фрагментът М1АС18 беше проведено е помощта на синтетични олигонуклеотиди за да "ма1к а1опд" на ДНП от другия край. Анализ на получената секвенцията, разкри, че М1А05 приставка бе 948 Ьр, както е показано на Фиг» 3. Секвенцията (ЗЕО 10 N0; 5) започва с АТ6 (които кодира за метионин) и има отворена четяща рамка (ОРЕ) над и,ялата негова дължина. Секвенцията е с 19 основни двойки по-дълга от ГИ1 секвенцията па 5' край и с 634 Ьр по-дълга на 3" край. Секвенциите общо към двата клона (основи 20 до 314) бяха идентични, с изключение на две нуклеотидни разлики на третата кодонна позиция. Сравнение на всички възможни четящи рамки с различни база данни показа, че четящите рамки започващи с АТ6 на основа номер едно поделят хомология с членове на род от микрозомални аминопептидази. Сек. венция на АизЬВ! Пълно извършено при да "ма1к а1опд секвениране на Фрагментът АизЬВ! беше използването на синтетични олигонаклеотиди за на ДНК от другия край. ДНК секвенцията (5Е0 Ю N0: 6) е показана на Фиг Клонът е дълъг 1689 Ьр и

• · · · · · I • · · · · ~·60~· има ΟΡΕ от остатък 2. Тази секвенция формира част от Н.1.1-1, както е показано на Фиг. 1. Йминокиселинната транслация на тази сек венци я показа цинков свързваш, участъков мотив от а минопептида зи. РСР АМПЛИФИКАЦИЯ НА кДНК ОТ РСР НА Н1101) мРНК ПРИ ИЗПОЛЗВАНЕТО НА ΜΙ А05 ИНИЦИАТОРИ кДНК беше синтезирана от мРНК на НАЕМОИСНиз СОИТОРГиЗ, използвайки като инициатор олиго-вТ, съдържаш адаптерна секвенция &amp;&amp; да съдействува на последващо клониране и манипулация на ДНК. Тази кДНК беше след това използвана за да амплифицира М1А03 секвенция чрез РСР, използвайки за 5'край инициатор, синтетичен олигонаклеотид, основан на позиции 865-885. РСР Фрагмент от около 2.5 кЬ беше амплифицирана. Това е приблизително очаквания размер на Фрагмента, основан на известният размер на мРНК и на аминопептидазна кДНК секвенция от бозайници. Втора грипа от РСР реакции беше извършена, използвайки инициатор близо до 5 край на ΜΙΑΙΙδ (основи 30 - 49). Четири връзки бяха открити на агарозен гел. Най-голямата от тях. на 3.5 кЬ, кореспондира с предсказаният размер за РСР продукт. Клониране и секвениране на 2.5 кЬ и 3.5 кЬ РСР продукти от М1А08 инициатори 2.5 кЬ и 3.5 кЬ РСР продукти бяха клонирачи и обозначени като 2.5РСР (БЕО Ю N0: 7) и 3.5РСР (ЗЕО 10 N03:8, 14 и 1Ь за клони с номера 2, 10 и 19 респективно). НаМогРРегп Ь1оЪв 2.5РСР и 3.5РСР (клон 2, 3„5РСР-2) хибридизира с мРНК от около 3.5 к.Ь (Фиг. 9е) в същата • · насока (като се има получаване на м РН Ь предвид възрастта на използвания за НАЕМОМСНиЗ СОМТОРТиЗ), като N1, В1А, Μ1ΑΙΙ5 и Аиз ЬВ! . Пълни секбениране на клонове беше проведено чрез 'ο1хдопис1еоЬ1в маХкхпд'. Както е показано на Фиг. 1, секвенцията за 2.5 кЬ продукт (ЗЕО 10 МО: 7) е част от Н11--2 (ЗЕО 10 N0: 20) и. секвенцията за 3.5 кЬ продукт (ЗЕО II) N0; 8) е най-голяматз част от Н11--3 (ЗЕО 10 N0; 21). Аминокиселинните транслации на две от тези секбенции (показани на Фиг. 6) съдържат цинк свързаният мотив ΗΪ3 61и Хаа Хаа Шз Хаа Тгр (НЕХХНХМ) характеристики на м и к р о з о м а л н и а микопепти д а з и.. Секбениране на 5' край ЕСЕ; клонове кДНК беше синтезирана с използването като инициатор, подходящ да запази секбенция в кДНК клон АивЬВ!, 2.5РС-Р и 3.5РСР (ЗЕО 10 N03: 6, 7 и 8), който хивридизира с мРНК за тези секвенции около 1.3 кЬ от 5' край. кДНК вяха с Ί"-опашка на 5' край и след проведени РСР реакции с универсален АпсНог (А) фиксиращ инициатор за 5' край и три инициатора специфични за всеки от секвенциите Α03ΪΒ1, 2.5РСР и 3.5РСР-С1опе 2 (ЗЕО 10 N03; 6, 7, 8) за 3' край. Всяка от реакциите даде продукт с предполагаемия размер, точно под 1.3 кЬ: 1301 Ьр (ЗЕО 10 N0: 9), 1280 Ьр (ЗЕО 10 N0: 10) и 1292 Ьр (ЗЕО 10 N0: 1.1) респективно. И трите секвенции имат нетранслиран регион на 5' край (Фиг. ,2). Всички започват с една и. съща 22Ьр секбенция (5' 68ТТТААТТАСССАА6ТТТ0А0 3'), която е известна като снаждаща водещата секбенция - ЗрИсеб Ееавег Зециепсе .1. (ЗЕ1) и присъства в нетранслирания 5' много разновидности от нематоди, Ниапд еЬ а!.. регион • · * · ··« ·• * » * * ·• · ♦ « · · « • « » · « • · ♦ · ······· • · · • ♦ * » • * * · * ♦ · * «Ο • · · 1990„ В ' ЗЕО ΙΟ N03; преди инии,палната АТ6 икицизлнзта А Т 6. 9 и 10, 301 секбенция е непосредствено В ЗЕО 10 N0: 11 има 13Ьр межда 81_1 и N т р и те се к в е н ци и и м ат п ъ л н и 0 Е Е , Секбениране на АивОВ! З/край ЕСЕ клон И з π о л з вай к и с η е ци ф ич ен инициатор ч позиции. .1414-14: 38 в АизСВ! (ЗЕО I0 N0: 6), ЕСЕ връзк а, к а к то се предπолагаше? , от ок оло 1. ЗКЬ на клониранзта връзка даде секвенциите ЗЕО 10 подходящ за продакт даде . Секбениране N03: 12 и 13. Те дадоха ОРЕ форма от 1 - 61бЬр и съществен нетранлиран регион. Секбени,йонен анализ на клонирани ЕСЕ продукти Смеси от секвенциите, описани по-горе, обозначени като НИ —1, Н11-2 и Н11-3, са показани на Фиг. 2. Аминокиселинните секбени,ии, предсказани от тях са показани на Фиг. 6а. Валидността на предсказаните транслации на представяните ДНК секбени,ии е по същество потвърдена чрез сходството между аминокиселинните секбени,ии, детерминирани чрез разграждането по Евтап от СМВг и протеолитично разцепени Фрагменти (Фигура 7). Така 27 остатъка от 29-те остатъчни Ν-терминални секбенции на НИЗ (ЗЕС1 10 N0; 16) подхождат на Н11-2 от остатъци 61 - 90 (Фигура 7Ь). Съответствията на валин (V) на позиция 73 и глицин (6) на позиция 90 са характерни за Н.11-2, тъй като Н11-3 има аспарагин (Ν) на позиция 90 и Н11-1 има левцин (!_) на позиция 86 (която кореспондира на позиция 78 в Н.11-2. Два о с т а т ъ к а ο т Η11 £ N -· т е р м и н у с а м и н о к и с е л и н н а с е к в е н ци я (ЗЕО 10 N0: 16) не подхожда на никоя от трите Н1100 секбенции, представяни в изобретението. За по-голяма прецизност трябва да се отбележи, че сходството е голямо, но отличителните секвенции Нер А и В (предварително описани в М090/11086) с Н11-2 и Н11-1, респективно в региона на остатъците 540-555. Подобно на това, в остатъчните региони 450-470, Еер ϋ е точно сходим за Н11-2, докато подобния, но различаваш, се Кер Е е по-близко по сходимост до Н11-3. С цел да илюстрира, транслираната аминокиселинна секбенция на една от секвенциите с пълна дължина (611-3) е сравнена на Фиг. оЬ с две секвенции за микрозомални аминопептидази от бозайници. Хомологията на Н1101) транслация е тези аминопептидази е показана чрез заградените идентични аминокиселини. Характеристичен мотив на микрозомални аминопептидази е аминокиселинната секбенция НЕХХНХМ, която функционира като цинков свързан участък (вопдепее! еД а!,, 1989; Уа11ее еД а1., .1990); това е показано чрез звездички (*) на Фиг.6. Тази секбенция, която е показано, че присъствува в транслациите на Н11-1, Н1.1-2 и Н1.1-3, е запазена във всички микрозомални аминопептидази. Други отличителни черти, обши за микрозомални аминопептидази на бозайници и НаетопсЬиз, са наличието на сравнително къс интр а целула р ен регион , ед инична тр ансмембранна с ек в ени,ия , прилежаща към М-терминус и няколко потенциални глик осила ционни участък а. Нивата на хомология (сходимост от 52 - 557. и идентичност от 30 - 327.) на Н11-1, -2 и -3 по отношение на микрозомални аминопептидази на бозайници са ΐ' ΐ о к а з а н и н а Т а б л. 2 . Анализи 8ои 1.Кегп Ь1 οΐ. На Фиг. 10 са показани получените от Н.сопДогсиз геномни ДНК 'ВоиЬбегп Ь1оДз, сондирани с различни клонове на • · · · · • · • »• « • · -•64·- • · ···· * · а ·· » · » А • · · « · · ·*»»«»«· • · « 1· # ·· ······· « » « НИСШ кД Η К и Р С : р продукти. Всички сонди показват м ного ч и с л е н и η оло с: и н а >: и δ р и д и з а и.и я ; т о 6 а е т и п и ч н о з а малтигенни родове. Как то се. очаква, В.1 и АизСВ1 показват подобни хивридизаи,йонни форми, като и М1АЦ5 и З.вкЬРСг. □бачо, тези Форми значително се различават една от друга и от тези видени със сондата 2.5кЬРСК, дори при условия на умерено разпростиране (Фиг. 10а), рефлектирайки на различните нива на хомология между тези три кДНК. Демонстрация на аминопептидазни активности, асо и, и и р а н и с Η1.10 0 « Беше установено, че микрозомална аминопептидазна активност се асоциира с тези Фракции, съдържащи! НИСШ, които са супернатантите от ултрацентрофугиране на ТРеззД екстракти, СопА свързвана фракция (СопА НИОВ) и фракциите, съдържащи Н1100, получени чрез йонообменна хроматография на МопоО колона (Табл. 3). Специфичните активности с всички тествани субстрати нарастват с нарастването на чистотата на Таблица 3 ЕНЗИМНИ АКТИВНОСТИ НА ФРАКЦИИ ОТ А ТИПИЧНО ПОЛУЧЕНА ΗΙΙΟϋ ФРАКЦИЯ СПЕЦИФИЧНИ ЕНЗИМНИ АКТИВНОСТИ (ОП/мин/тдпротеин) Фенил- а ла нин -••ρΝΑ Левцин --ρΝΑ Лизин --ρΝΑ а-Глутаминнова к-на-ρΝΑ Метионин -ρΝΑ Фосфатен буферен Ф р . ( РВР:) 0.20 0.08 0.121 0.01 0.16 Тмееп 1У.20/РВЗ 0.15 0. .15 0.095 ........1 0'. 01 . .................’ 0.09 • · · ·· ·· • » » · • « · · • « * * · • * » · • » ·. * * β · •·· ···· Таблица 3 (продължение) ФРАКЦИЯ СПЕЦИФИЧНИ ЕНЗИМНИ АКТИВНОСТИ (Οϋ/мин/тд, протеин) Фенил- аланин -ρΝΑ Левцин -ρΝΑ Лизин -ρΝΑ «-Тлутаминнова к-на-ρΝΑ Метионин -ρΝΑ ..................... Т без ί С 17./РВ8 1.94 1.26 0.67 0.64 1.91 СопА ΗΙΙΟϋ 4.08 3 - 01 , . ί 1.434 2.09 3.84 .1 СатО ΗΙΙΟϋ 6.56 6.01 3.01 3.90 6.419 Ефекти на инхибитори на зминопептидази от бозайници върху Н.11.ОП аминопептидазни активности Прибавяне на инхибитора Ьезбабап (който инхибирЬ микрозомални зминопептидази от бозайници) към СопА ΗΙΙΟϋ при концентрации, препоръчани от производителя (Воебгтдег МаппКеат) редуцира активността срещу левцин-р-нитроанилид, приблизително 707.. Серии от експерименти бяха проведени за да бъде тествано инхибирзне на активността на обхват от протеазни инхибитори. Тези инхибитори, които бяха неспецифични за металопротеази или зминопептидази, нямаха инхибиращи ефекти на величината на реакцията. Инхибитори, които са известни, че въздействуват на металопротеази или зминопептидази, въздействуваха на величината на реакцията. Най-ефективен се оказа инхибитора 5 мМ фенантролин. • · • · • · · · « · · · • · · · • · · · • · · · -•Об- Таблица 4 1 Инхибиране иа Н1100 аминопептидазии активности с различни проть азни инхибитори ИНХИБИТОР КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРОЦЕНТ ΗΑИНХИБИРАНЕ ПРОЦЕНТ НАИНХИБИРАНЕ 1 и г λ у τ а μ и н ο б аκ иселина-ρ- н и τ р о а н и л и д е нсубстрат 1) Лебцин-р-нитроанилиден субстрат 2) Атаебабхп 10 μΜ ,ι 0 6.1 60 μ Μ 0 66 Βθ5ί3ίίη 50 μ Μ 23 63 ................. ............„............4 100 μ Μ 1 35 663 Е.П 1 А •................ """ ......1 1 μ 14 1 I'"-------------------------- " ............. .17 ... .... 8 - -.............. “"· “I .10 μ!4 21 1 о 1,10 рбепап- ϊΤίγοΙ ϊγίο 1 μΜ 78 7ЕЗ .10 μΜ 85 87’ РбозрЬог- 10 μ 1 0.8 ат Шоп ................ · Π 50 μ Μ .1 7 1 А субстрат на аминопептидаза-Й от бозайник А субстрат на аминопептидаза-М от бозайник • · • · • · • · · · ··· ·• » · · · ·• · · · · · · • · · · » * ·· · · ······· С убφρ а κционира не на Η1100 Разпределението на активностите, асоциирани е Фракции от Сдоноовменна хроматография на СопАНПСШ на МопО е показано на Фиг. 13а и ЕШЗ-РА6Е на Фракциите, на Фиг. 13Ь. По-нататък, ензимни активности вяха асоциирани с субфракции на НИСШ, сепарирани посредством рецикличен изоелектрично Фокусиран свободен поток, (Фиг·. 14 и 15). При по-ниски стойности. на р1 (рН 4.5), тези субфракции съдържат само по-голямзта от полосите, което замества дублетът НИСШ видян на ЗБЗ-РАде, а при по-високи стойности (рН 6.5) те съдържат само по-малката от полосите, което замества дублетът НИСШ. Междинни Фракции съдържат и двете полоси. По-малката полоса може също да се получи, като се раздели фракция посредством ионообменна хроматография на МопС!, използвайки апарата на РМагтасха 5ΜΑΡΪ. Всички тези субфракции свързват овчи. антитела към НИСШ афинитетно пречистен на протеин, експреси.ран чрез 1атЬс1адП1 клон М1, където антителата елюират от 1атЬс1адИ1 без да свързват прибавка (Фиг. 14с). Всички субфракции показват микрозомална аминопептидазна активност (Фиг. 16с), въпреки че тази активност е сравнително ниска във Фракциите, добити при иаи-високите и най-ниските стойности на р!. Тази ниска активност може да бъде отдадена на понижени концентрации на протеин, ефекти от крайности на рН по време на субфракциониране или на по-малките полоси за максимална активност. Е< а к с и н а ци я с ъ с разделени компоненти на НИСФ Р а з д е л е н и т е в и с. о к и и ниски полоси получени чрез • · • · Σ Σ · * · * - · . :: : · : .......... .............’ : изоелектрично Фокусиране на свободен поток или чрез ионообменна хроматограФия индицират Формирането на защитни антитела, когото са инжектират на овца, както е илюстрирано в следващият експеримент. Тридесет овце, приблизително на шест месечна възраст, вяха разпределени на 5 грипи по 6, така че, всяка грипа веше от сходни по тегло овце. Всяко животно веше инжектирано с общо .150 μα протеин, дадени на три равни дози, както е описано от Мипп ев а!., (1792) и Тажегпог ев а!. (1992а, в) за период от 54 дена. Животните от грипа 1_ вяха инжектирани с по-ниската (по-малката) полоса на дублета ΗΙΙΟϋ, тези в грипа и със по-високата полоса, (..) + в с: рекомвинирани по-висока и по.....ниска полоси, I) с двете (неразделени) полоси получени чрез изоелектрично Фокусиране на свободен поток при средни стойности на рН и като контролна грипа (грипа С) Феритин от конски далак (антигенно несвързан протеин). В овцете вяха въведени 10000 заразни лаври три седмици след третата инжекция и експериментът приключи 29 - 31 дни след инфектирането. Резултатът от експеримента е симиран на Шиг. 16. Инжектиране на всеки от сивФракциите редуцира отделянето на добива на паразитни яйца през времето на опита с 90% и редуцира общия брои на хелминтите с 63-84%, показвайки значителна разлика (рЗО.05) в сравнение с контролите, използвайки непараметрични статистически анализи. Намалението (70-88%) на броя на женските хелминти беше по-голямо, в сравнение с това на г мъжките, и (с изключение на намалението на броя на мъжките хелминти в овцете, инжектирани с рекомбинирани по-високи и по-ниски полоси, където р<0.07) за двата пола намалението беше значително (рЮ.05). • · • · • · Ваксинация е Н110В и. НИ А . С тβолова, водноразтворима Форма на Η110С (Η113, която запазва своята ензимна активност) може да бъде полачена от природна молекула чрез третиране с еластаза. Беше установено;, че тази Форма съдържа предоминантна АрМ-подобна ензимна активност и екстракт ТКезИ. от еластазно разграден пелет (Н11А) беше обогатен за АрА - подобна а к т и. в н о с т ( в и ж Т а б л и и, а 5 ') . Таблица 5 СЪОТНОШЕНИЕ Аминопептидаза—М (левцин-ΝΑ) н:поъ н ι.:ΐ. в Аминопептид а за --А(итлутаминова к-на-ρΝΑ) 1. „ 44 2ό „ Ο <)43 Следният експеримент показва, че баксинирането на овца с НИЗ или Н.11А дава защита срещу въвеждане на Наетопсбиз или инфекция. Осемнадесет овце с приблизителна възраст осем месеца бяха разделени на 3 групи по ό овце всяка, така че овцете от всяка група да са със сходно тегло. Всяко животно беше инжектирано с общо 100 цд протеин, дадени на две равни дози, както е описано от Мипп е! а!., (1992) и Тауегпог е!. а1 . (1992 а, Ь) за период от 23 дена. Животните от група А бяха инжектирани е Н11А, тези в грипа 5 с НИЙ и тези в грипа С с Феритин от конски далак (антигенно несвързан протеин) като негативна контролна група. В овцете? бяха въведени 10000 заразни лаври 26 дена втората инжекция и експериментът приключи 34 -· 36 дни. след инфектирането.

···· .··' > )·— Резултатът от експеримента е сумиран на Фиг. 17. Инжектиране на НИЗ редуцира отделянето на паразитни яйца през бремето на опита 89*/. и редуцира общия брои на хелминтите с 767. Инжектиране на Н11А редуцира отделянето на паразитни яйца през бремето на опита с 987. и редуцира общия брои на хелминтите с £347. Те показаха значителна разлика (р<0.05) в сравнение с контролите, използвайки непзраметрични статистически анализи. Инхибиране на Н1100 аминопептидазни активности чрез антитела Разтвори, съдържащи Н.1100 бяха инкубирани със серуми от отделни овце, инжектирана с Фракции, съдържащи Η110Ι) или от контролна овца. Разтворите бяха след това подложени. на анализ за аминопептидазни активности е помощта на Фениламин и а-глутаминова киселина-рМА, като субстрати. 0 т е пе н т а и а и н х и б и р а н е н а а к т и в н о с т (м а к с има лн о 8 0 7 ) корелираше с нивото на защита, показани от отделните овце. от която бяха получени серумите (виж Фиг-. 18). Локализация на ензимна активност Замразени секции от зряла Форма на Наетопсбиз сопЪогЪиз бяха изпитани за аминопептидазна активност. Както е показано на Фиг. 19, аминопептидазни ензимни активности са локализирани на лумена на червото. Протеин И.1100 също специфично е намерен на тази локализация. ЕКСПРЕСИЯ НА Н1100 (3.5 РСР КЛОН) С ПОМОЩТА НА КЛЕТЪЧНА СИСТЕМА НА ЕУКАРИОТЕН ВАСиЪОУIРОБ-НАСЕКОМО » · Експресиране на аминопептидаана активност в клетки от насекомо Инфектирани клетки бяха взети и анализирани за аминопептидазна активност с помощта на Фе--, леб~, мет™ и лиз-ρΝΑ като субстрати. Анализът беше усложнен чрез откритието, че насекомните клетки притежават аминопептидазна активност с маркирана преференция за лизин-свърззни амидни връзки. Обаче, клетъчните екстракти, съдържащи експресиран ΗΙΙΟϋ, допълнително разцепиха лев--, мет-- и Фе-ρΝΑ по този р е д н а η р е ф е р е н ци я. Молекулно тегло и имунореактивност на експресирания Η110Ι) (3.5 РСР клон 2) протеин Проби от инфектирани или контролни клетъчни екстракти Зяха електрофорезирани на 7.57. 503--поликриламиден гел, и след това оцветени с Соотаввхе В1ие. 3.5-2-Ρ3Α и 3.5-2-Р4А инфектирани клетъчни лизати имаха полоса със същия размер като на ΗΙΙΟϋ, 110кс:1, които мигрират напрабо под коекспресираната |3-~гал«, която има молекулно тегло от 120кв. Тази 1.20кв полоса не присъствува в нито един от негативните контролни лизати. Полосата също отсъствува при Р2А лизата, който не експресира ензимна активност. Двоен гел беше анализиран чрез МезЬегп Ь1об и сондиран с анти-ΉΙΙΟϋΝ (Фиг. 21). Мног-о силна, специфична пози т и в н а и м у н о р е а к ци я б е ш е η о л у ч ена на 110к в полос а, ек с пр ес ир а на чрез 3.5-2 -Р3а и 3.5—2-Р4 А и на п р и р однϋя Η11Ο1) дублет в контролен тракт, съдържаща СопА ΗΙΙΟϋ - контролен тра к т.

Claims (13)

1. • · • · «···*·'• · · »· · · · · Π Р Е Т Е Н Ц И И:

   1. Молекули на нуклеинова киселина, съдържащи една или \ повече нуклеотидни секвенции, които кодират хелминтни аминопептидазни ензими или антигенни участъци вместо това, кореспондиращи с всички или с част от нуклеотидните секвенции, както е показано на Фигури 2, 3, 4 или 5 (ЗЕО Ιϋ N08: от 1 до 15, рее п е к т и. в н о ) или се к в е н ци и, код и р а щи з а хелминтни аминопептидазни ензими, които имат секвенционна идентичност с тях 507. или повече или които хибридизират с някоя от споменатите секвенции при условията на 2 ;·; ЗЗС , стайна температура (където ЗСС = 0.15 М натриев хлорид, 0.0.15 М на тр и е в ци т р а т , р Н 7. 2) .
2. 2. Молекули на нуклеинова киселина, съдържащи. една или повече нуклеотидни секвенции, които кодират полипептид способен да произвежда защитни антитела срещу хелминтни паразити, чиито секвенции инкорпорират един или повече антигенни детерминант-кодиращи региони от секвенциите, кодиращи, аминопептидаза, както е показано на Фигури. 2, 3, 4, или 5 (съставени от ЗЕС! П) N08: 1 во 15),
3. 3. Молекули на нуклеинова киселина, съдържащи една или повече нуклеотидни секвенции, които кореспондират с или които са комплементарни с една или повече секвенции, селектирани от секвенциите на клонове, имащи секвенционна както е показано на идентичност с тях 507. или повече. Фигури 2, 3, 4 и 5 или секвенции, които имат секвенционна идентичност е тях 507. или повече или които хибридизират с някоя от споменатите секвенции при условия на 2 :·: ЗЗС, стайна температура (където ЗСС = 0.15 М натриев хлорид, 0.015 М натриев цитрат, рН 7.2) » ·· · ·· ··· ·· · · · · · · · · • · · · · ·*«· * * · · · · · ··«····♦ « · · · · •· ······· ·· ·
4. 4. Експресиране на клонирзн беи:тор, съдържаш, молекула на нуклеинова киселина, както е дефинирано във всяка една от претенции 1 до 3.
5. 5. Прокариотична или еукариотична клетка, или трзнсгенен организъм, съдържаш молекула на нуклеинова киселина, като е дефинирана във всяка една от претенции .1. до 3,
6. 6. Синтетични полипептиди, съдържащи аминокиселинна секвенция, конститвтирзща ензим аминопептидаза или антигенен участък, кореспондиращи с всички или с част от нуклеотидните секбенции, както е показано на Фигури 2, 3, 4, или 5 (5Е(3 П) N05: 1 до 15, респективно), или функционално-еквивалентен вариант, на драг синтетичен полипептид, кореспондиращ с протеиновият дублет Н1100, или синтетичен полипептид селектиран от: (a) Метионин Глицин Тирозин Пролин Валин Валин Лизин Валин Глутаминова к-на Глутаминова к-на Фенилаланин (b) Метионин Глицин Фениаланин Пролин Валин Левцин Треонин Валин Глутаминова к-на Серин (c) Метионин Глицин/Фенилаланин Аспарагин Фенилаланин Лизин Изолевцин Глутаминова к-на/Валин Треонин/Глутаминова к-на Аланин Глицин (в) Метионин Лизин Пролин/Глутаминова к-на Треонин/Валин Лизин Аспарагиноба к-на/Аланин Треонин/Лизин Левцин Изолевцин Треонин (е) Метионин Левцин Аланин Левцин Аспарагиноба к-на Тирозин Хистидцн Серин - Фенилаланин Валин (ί) Метионин Левцин Аланин Глутаминова к-на/Тирозин Аспарагиноба к-на Глутамин/Аланин Глутаминова к-на Ас па р а гиноба к-на Ва лин (д) Метионин Глицин Фенилаланин Пролин Левцин Валин » · · • · * • · а • · а Треонин Валин Глнтаминоба к-на Аланин Фенилаланин Тирозин (10 Метионин Яизин Треонин Пролин Глнтаминоба к-на Фенилаланин Аланин Валин/Яебцин Глнтамин Аланин Фенилаланин/Треонин Аланин Треонин Серин/Глицин Фенилаланин Пролин (ί') Яизин X и с т и д и н / Т и р о з и н Ас па р а гин/Ва лин Серин Пролин Аланин Аланин Глнтаминоба к-на Аспарагин/Яебцин Яебцин Аспарагин / Г л и и, и н (..ί) Яизин - Треонин Серин Валин Аланин Глнтаминоба к-на ί Аланин Фенилаланин Аспарагин (к) Яизин Аланин Аланин Глнтаминоба к-на Валин Аланин Глнтаминоба к-на Аланин Фенилаланин Аспарагиноба к-на Изолебцин - - - Яизин Глицин (1) Яизин Аланин Валин Глнтаминоба к-на Валин/Пролин Аланин Глнтаминоба к-на Аланин Фенилаланин Аспарагиноба к-на Аспарагиноба к-на Изолебцин Треонин? Тирозин - - Глицин Пролин Серин (т) Яизин - Глнтаминоба к-на Глнтаминоба к-на Треонин Глнтаминоба" к-на Изолебцин Фенилаланин Аспарагин Метионин , (η) Яизин - - - Пролин Фенилаланин Аспарагин/Аспарагин Изолебцин Глнтаминоба к-на Аланин Яебцин (o) Аспарагиноба к-на Глнтамин Аланин Фенилаланин Серин Треонин Аспарагиноба к-на Аланин Яизин (p) Метионин Глицин Тирозин Пролин Валин Валин Яизин Валин Глнтаминоба к-на Глнтаминоба к-на Фенилаланин Аланин Треонин Аланин Яебцин (д) Метионин Глицин Фенилаланин Пролин Валин Яебцин Треонин Валин Глнтаминоба к-на Серин - Тирозин? • · 4 · Треонин г) Метионин Глутаминоба к-на/Фенилаланин Аспарагин Фенилаланин Лебцин Изолебцин Глнтаминоба к-на/Валин Треонин/Глнтаминоба к-на Аланин Глицин Изолеб и,ин Тр еонин з-> Метионин Глицин Фенилаланин Лебцин Валин Треонин Валин Глнтаминоба к--на Аланин Фенилаланин Тирозин Треонин Серин 1.) Метионин Лизин Треонин Пролин Глнтаминоба к-на Фенилаланин Аланин Валин/Лебцин Глнтамин Аланин Фенилаланин/Треонин Аланин Треонин Серин/Глицин Фенилаланин Пролин и) Метионин Лизин Пролин/Глнтаминоба к-на Треонин/Валин Лебцин Аспарагиноба к-на/Аланин Треонин/Лизин Лебцин - Изолебцин Треонин - Глицин ν) Метионин Лебцин Аланин Лебцин Аспарагиноба к-на Тирозин Хистидин Серин - Фенилаланин Валин Глицин? и) Метионин Лебцин Аланин Глутаминоба к-на/Тирозин Ас:парагиноба к -на Г.лутамин/Аланин Глутаминоба к-на Ас па ра гиноб а к-на Ва лин х) Лизин Хистидин/Тирозин Аспарагин/Валин Серин Пролин Аланин Аланин Глутаминоба к-на Аспарагин/Лебцин Л е б ци н А с η а р а г и н / Г л и ци н Лизин - Треонин Серин Валин Аланин Глутаминоба к-на Аланин Фенилаланин Аспарагин Лизин Аланин Аланин Глутаминоба к-на Валин Аланин Глутаминоба к-на Аланин Фенилаланин Аспарагиноба к-на - Изолебцин - - - Лизин Глицин аа) Лизин Аланин Валин Глутаминоба к~на Валин/Пролин Аланин Глутаминоба к-на Аланин Фенилаланин • ·

   • · · · ······· · · · Аспарагиноба к-на Аспарагиноба к-на Изолебцин Треонин? Тирозин -· - Глицин Пролин Серин (ЬЬ) Лизин - Глутаминоба к-на Глутамин Треонин Глутаминоба к-на Изолебцин Шенилаланин Аспарагин Метионин (сс) Лизин - - - Пролин Шенилаланин Аспарагин/ Аспарагиноба к-на Изолебцин Глутаминоба к-на Аланин Левцин (с)с1) Аспарагин Глутамин Аланин Шенилаланин Серин Треонин Аспарагиноба киселина Аланин Лизин
7. 7. Синтетични полипептиди, как то 5я:ка предявени в претенция 6, съдържащи аминокиселинна секбенция, конститутираща ензим аминопептидаза или антигенен участък, кореспондиращ с всички или с част от нуклеотидните секвенции, както е показано на Фигури 2, 3, 4 или 5 (ЗЕО II) N03 8 1 до .15, или функционално - еквивалентен вариант, по същество други компоненти на НаетопсЬие сопТ.огГиз.
8. 8. Синтетични, полипептиди, както вяха предявени 6 или претенция 7, под формата на съединен свободен от 6 претенция полипептид, съдържащ допълнителен полипептид, съединен с споменатата аминокиселинна секбенция, както е дефинирана в претенция 6 или 7.
9. 9, Метод за получаване? на синтетичен полипептид, както е дефиниран във всяка една от патентни претенции 8 до 8, които в к л.№ч в а к у л ти в и р а не на π р о к а р и о тна и ли е у к а р и отна к л етк а , съдържаща молекула на нуклеинова киселина, като дефинираната във всяка една от претенции 1 до 3, при условия при които упоменатия полипептид е експресиран и възстановяване на получения по такъв начин полипептид. 1.0. Състав на ваксина за стимулиране на имунни отговори • · срещи хелминтни паразити в хора или животни, съдържаща поне един синтетичен полипептид, както е дефиниран във всяка една от патентни претенции 6 до 8,* или вирне или клетка гостоприемник, имаща инсертирана молекула на нуклеинова киселина, както е дефинирана във всяка една от патентни претенции 1 до 3, за стимулация на имунния отговор от πолипептиди, к одирани чрез инсертираната молек ула на нуклеинова киселина, заедно с Фармацевтично приемлив носител
10. 11. Използване на молекула на нуклеинова киселина, както е дефинирана във всяка една от патентни претенции 1 до 3, или синтетичен полипептид, както е дефиниран във всяка една от патентни претенции 6 до 8 за получаване на състав на ваксина за стимулиране на имунен отговор срещу хелминтни паразити в човек или животни,
11. 12. Метод за стимулиране на имунен отговор срещу хелминтни паразити в хора или животни, включващ прилагането на състав на ваксина, както е дефиниран 6 патентна претенция 10. .13 . 0 л и г о з а х а р и д , имащ с л е д н а т а с т р у к тира г 1*1 а н и 1 V 1*1ан (3-.1,4 Глк 1ЧАс|31,4 Глк Мас / · I 1*1 ан а 1 (Фук<з1) • · / 8 ·· • · · · ·
12. 14. Олигозахарид, както се претендира 8 патентна претенция 13, имаш, следната структура: ®ак «!. Ман <я 1 \ 3 Ман (3 1......™> 4 Глк1ЧАс(31 —4 Глк МАс /· Ман и 1. <7.1 Щук
13. 15. Олигозахарид, както се претендира б патентна претенция 13 или претенция 14, свързан с синтетичен полипептид, както е дефиниран 8 всяка една от патентна претенция ό до 8. /