RO117709B1

RO117709B1 - Polipeptide sintetice avand activitate de enzima aminopeptidazica, molecule de acid nucleic ce le codifica, procedeu de preparare si compozitie de vaccin cu aceste polipeptide

Info

Publication number: RO117709B1
Application number: RO94-01794A
Authority: RO
Inventors: Margaret Graham; Trevor Stanley Smith; Edward Albert Munn; David Patrick Knox; Joanna Jane Oliver; Susan Elizabeth Newton
Original assignee: Agricultural & Food Res
Priority date: 1992-05-08
Filing date: 1993-05-07
Publication date: 2002-06-28
Also published as: NO944245D0; NZ252221A; AU4077593A; BG62700B1; FI945221A; DK0640133T3; HUT71847A; HU218041B; PL175900B1; ZA933216B; CN1053699C; US20030078398A1; CA2134326A1; FI945221A0; US20080145379A1; JPH07508879A; ES2151506T3; EP0640133B1; BG99246A; ATE195346T1

Abstract

Inventia se refera la polipeptide sintetice care contin o secventa de aminoacizi avand activitate de enzima aminopeptidazica sau o portiune antigenica a acesteia, la molecule de acid nucleic care codifica polipeptidele, la un procedeu de preparare a polipeptidelor sintetice si la o compozitie de vaccin pentru stimularea raspunsurilor imune impotriva parazitilor helmintici.

Description

Invenția de față se referă la polipeptide sintetice având activitate de enzimă aminopeptidazică, la molecule de acid nucleic ce le codifică, la un procedeu de preparare a acestor polipeptide sintetice și la o compoziție de vaccin cu acestea, destinată stimulării răspunsurilor imune împotriva infestării cu paraziți helmintici și tratării bolilor date de aceștia.

Este cunoscut că helminții sunt responsabili pentru o gamă largă de boli și infestări ale animalelor domestice, ducând la pierderi de producție și chiar la mortalitatea animalelor, având astfel o importanță economică considerabilă. Astfel, de exemplu, hematodul Haemonchus, care se hrănește cu sânge, infectează mucoasa tractului gastrointestinal al rumegătoarelor, producând anemie și pierdere de greutate, și dacă nu este tratat, duce frecvent la moarte. Animalele infectate cu hematodul înrudit Ostertacia, care nu se hrănește cu sânge, în mod similar, își pierd condiția bună și pot muri dacă nu sunt tratate.

Alte genuri de helminți de importanță economică includ Trichostrongylus și Nematodirus, care produc enterite la diverse animate și trematodele.

De asememea, cauzează probleme nematodele precum, de exemplu. Necator, Ancylostoma, Uncinaria și Bunostomum sp. și gălbezele (de exemplu, Fasciola, Paramphistomum și Dicrocoelium), care pe lângă rumegătoare și câini domestici, infectează oameni, adesea cu rezultate fatale.

Combaterea paraziților helminți în prezent, apelează inițial la utilizarea medicamentelor antihelmintice combinată cu pășunatul dirijat. Astfel de tehnici au totuși numeroase dezavantaje. Administrarea medicamentelor și pășunatul dirijat sunt adesea nepractice și au determinat apariția și răspândirea de helminți rezistenți la medicamente.

în acest domeniu există necesitatea unui vaccin antihelmintic eficient, depunându-se numeroase eforturi în acest sens în anii din urmă. Cu toate acestea, încă nu sunt accesibile comercial vaccinuri moleculare sau sub-elemente pentru majoritatea speciilor de helminți în special pentru nematodele gastrointestinale ale rumegătoarelor, precum Haemonchus și Ostertagia.

Cele mai promițătoare rezultate până în prezent, s-au obținut cu proteine noi, izolate de la Haemonchus,care au potențial ca antigeni de protecție nu numai față de Haemonchus, ci, de asemenea, împotriva unei game de alți helminți.

în particular, proteina dublez H110D, găsită la suprafața lumenului intestinal la H. contortus, s-a dovedit a conferi imunitate protectoare contra hemoncozei la oi.

H110D de la H.contortus are o greutate moleculară aproximativă de 110 kilodaltoni (kD) în condiții reduse sau nereduse, cum s-a definit prin SDS-PAGE și este descrisă în WO 88/00835 și 90/11086. Termenul “H110D”, așa cum s-a folosit aici, se referă la proteina dublet H 11 OD, cum s-a definit în WO 88/00835 și 90/11086.

Proteine corespunzătoare au fost recent găsite în alte specii de helminți, de exemplu, Necator americanus.

Pentru purificarea de H110D, în WO 88/00835 au fost descrise un număr de metode care pot fi considerate suficiente pentru caracterizarea proteinei și pot fi apreciate ca permițând producerea proteinei în cantități utile experimental și comercial. Totuși, există posibilitatea unei îmbunătățiri și a unei surse convenabile de la care să se prepare nu numai H110D ci, de asemenea, proteina antigenică înrudită, în special nevoia pentru un procedeu bazat pe tehnologia ADN recombinant și expresia proteinei în organisme procariote sau eucariote, transferate corespunzător.

Polipeptidele sintetice având activitate de enzimă aminopeptidazică sau o porțiune antigenică a acesteia, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că acestea corespund total sau parțial secvențelor nucleotidice conform fig. 2, 3. 4 sau 5 ( Secv. ID Nr. 1 la 15 și respectiv 19 la 21), sau unei variante echivalente funcțional a

RO 117709 Β1 acestora, alta decât o polipeptidă sintetică corespunzătoare dubletului proteic H11D, sau unei polipeptide sintetice, aleasă dintre: 50

a) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu Glu Phe

b) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser

c) Met Gly/Phe Asn Phe Lys Ile Glu/Val Thr/Glu Ala Gly

d) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Lys Asp/Ala Thr/Lys Leu - Ile Thr

e) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser-Phe Val 55

f) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gln/Ala Glu Asp Val

g) Met Gly Phe Pro Leu Val Thr Val Glu Ala Phe Tyr

h) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu Gin Ala Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro

i) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pro Al Ala Glu Asn/Leu Leu Asn/Gly

j) Lys-Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn 60

k) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp - Ile - - Lys Gly

l) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala Phe Asp Asp Ile Thr Tyr - - Gly Pro Ser

m) Lys - Glu Glu Thr Glu Ile Phe Asn Met

n) Lys — Pro Phe Asn/Asp Ile Glu Ala Leu

o) Asp Gin Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys 65

p) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu Glu Phe - Ala Thr Ala Leu

q) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser - Tyr? - Thr

r) Met Glu/Phe Asn Phe Leu Ile Glu/Val Thr/Glu Ala Gly - Ile Thr

s) Met Gly Phe Leu Val Thr Val Glu Ala Phe Tyr - Thr Ser

t) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu Gin Ala Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro 70

u) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Leu Asp/Ala Thr/Lys Leu - Ile Thr - Gly

v) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser - Phe Val Gly?

w) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gln/Ala Glu Asp Val

x) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pro Ala Ala glu Asn/Leu Leu Asn/Gly

y) Lys - Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn 75

z) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp - Ile - - Lys Gly aa) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala Phe Asp Asp Ile Thr? Tyr - - Gly Pro Ser bb) Lys - Glu Glu Thr Glu Ile Phe Asn Met cc) Lys — Pro Phe Asn/Asp Ile Glu Ala Leu dd) Asp Gin Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys 80

Moleculele de acid nucleic, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că acestea cuprind una sau mai multe secvențe nucleotidice, care codifică enzime aminopeptidazice helmintice sau porțiuni antigenice ale acestora, corespunzătoare secvențelor nucleotidice din fig. 2, 3, 4 sau 5 (Secv. ID. Nr. 1 la 15 și 19 la 21, respectiv) sau unei 85 porțiuni a acestora, sau secvențe care codifică enzime aminopeptidazice helmintice care au o identitate de secvențe de 50% sau mai mult, cu acestea, sau care hibridizează cu oricare dintre secvențele menționate, în condiții de 2x(0,15M NaCI, 0,015M citrat de sodiu, pH 7,2) la temperatura camerei.

Procedeul de preparare a polipeptidelor sintetice, conform invenției, înlătură dezavan- 90 tajele de mai sus prin aceea că acesta cuprinde:

- donarea vectorilor care conțin secvențele nucelotidice conform invenției, împreună cu un promotor și/sau amplificator și, eventual, un marker potrivit, cum ar fi o genă care codifică pentru dihidrofolat-reductaza sau glutamin-sintetaza;

- introducerea vectorilor în celule gazdă procariote sau eucariote, preferabil în 95 sisteme de expresie eucariote nematodice sau mamaliene, folosind fosfat de calciu, dextran DEAE, polipren, prin fuziune protoplastică, cu lipozomi, prin microinjectarea directă, țintirea genei sau electroporarea, preferabil prin electroporare;

RO 117709 Β1

- cultivarea sistemului procariot sau eucariot astfel obținut, în condiții care permit expresia polipeptidelor;

- recuperarea polipeptidelor astfel produse.

Compoziția de vaccin pentru stimularea răspunsurilor imune împotriva paraziților helmintici, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că aceasta cuprinde cel puțin o polipeptidă sintetică, ce cuprinde o secvență a aminoacizilor care constituie o enzimă aminopeptidazică sau o porțiune antigenică a acesteia, sau un virus sau o celulă gazdă având inserată o moleculă de acid împreună cu un purtător acceptabil farmaceutic.

Prezenta invenție are următoarele avantaje:

- polipeptidele sintetice care cuprind secvența de amînoacizi ce constituie o enzimă aminopeptidazică sau o porțiune a acesteia reprezintă secvențe antigenice protectoare, prin generarea anticorpilor care sunt capabili să inhibe funcția metabolică a parazitului;

- se asigură o reducere a formei native a epitopilor protectori ai antigenului.

Invenția prezentă încearcă să asigure o astfel de procedură, îmbunătățită. S-a realizat determinarea secvenței pentru cADN-urile pentru H110D de la Haemonchus contortus, și s-a constatat că secvențele aminoadde prezintă omologie cu o familie de aminopeptidaze de membrană integrală (nume sistematic: aminoacilpeptidhidrolaza (microzomală)).

Aminopeptidazele de membrană integrală sunt localizate la mamifere în câteva țesuturi, de exemplu, pe microvilozitățile marginale ale intestinelor și rinichilor. Rolul lor în rinichi este neclar, dar în intestin, funcția lor este de a diva peptidele mici, care sunt produse finale ale digestiei (vezi, Kennry & Maroux, 1982; Kenny & Turner, 1987; Noren și colab., 1986; Semenza, 1986).

într-unul din aspectele invenției de față, se asigură moleculele de acid nucleic care conțin una sau mai multe secvențe nucleotidice care codifică enzime aminopeptidaze helmintice sau porțiuni antigenice ale acestora, corespunzând substanțial secvențelor nucleotidice integrate sau unei porțiuni a lor, așa cum se arată în fig. 2, 3, 4, sau 5 (Secv. ID Nr.1 la 15), sau secvențele care codifică pentru enzime aminopeptidaze helmintice, care sunt substanțial omoloage cu, sau care hibridizează cu oricare dintre numitele secvențe.

Variații din secvențele nucleotidice care codifică aminopeptidaza se pot întâlni în cadrul unei specii, în diferite stadii ale ciclului de viață al unui helmint (de exemplu, stadiul larvar și de adult), între tulpini similare, de origine geografică diferită, și, de asemenea, în același helmint. Asemenea variații sunt incluse în cuprinsul acestei invenții.

Substanțial omolog, așa cum s-a folosit aici, include acele secvențe care au o identitate de secvență de aproximativ 50% sau mai mare, de exemplu, 60% sau mai mare și, de asemenea, variante alelice echivalente funcțional și secvențe înrudite, modificate prin substituții, adiții și/sau deleții de o bază sau de multiple baze. Prin echivalent funcțional” se înțeleg secvențe se acid nucleic care codifică polipeptidele cu activități aminopeptidazice, care sunt imunoreactive în mod similar, respectiv cele care provoacă la gazdă anticorpi de protecție împotriva helminților.

Molecule de acid nucleic, care hibridizează cu secvențele prezentate în fig. 2, 3, 4 sau 5 (compuși ai Secv. ID Nr: 1 la 15), sau oricare altele substanțial omoloage, sau secvențe echivalente funcțional cum s-a definit mai sus, sunt, de asemenea, incluse în cuprinsul invenției.

Termenul “hibridizare, așa cum s-a folosit aici, definește acele secvențe care se leagă în condiții de nonstringență (6 x SSC/50% formamidă, la temperatura camerei) și s-au spălat în condiții de joasă stringență, de exemplu, 2 x SSC, 42°C) sau condiții de înaltă stringență, de exemplu, 2 x SSC, 65°C (unde SSC=0,15M, NaCI, 0,015 M citrat de sodiu, pH 7,2).

RO 117709 Β1

Metode pentru producerea de astfel de secvențe derivate înrudite, de exemplu, mutageneza direct în sit, mutageneza aleatorie sau clivaj enzimatic și/sau ligare de acizi nucleici, sunt binecunoscute în domeniu, ca și metodele pentru a determina când acidul 150 nucleic astfel modificat are omologie semnificativă, de exemplu, prin hibridizare.

Prevederea unei molecule de acid nucleic, conform invenției, permite astfel să se obțină, în cantități pânâ acum inaccesibile, enzime aminopeptidazice recombinate, sau fragmente imunogene ale acestora, permițând prin urmare dezvoltarea vaccinurilor antihelmint.

într-un alt aspect al invenției de față, se asigură molecule de acid nucleic care conțin 155 una sau mai multe secvențe nucleotidice care codifică una sau mai multe polipeptide capabile să provoace anticorpi de protecție împotriva paraziților helminți, secvențe care încorporează una sau mai multe regiuni care codifică aminopeptidaze, cum sunt cele din fig. 2, 3, 4 sau 5 (compuse la Secv. ID Nr 1 la 15).

Prezenta invenție se extinde, de asemenea, la polipeptide sintetice, care cuprind una 160 sau mai multe secvențe aminoacide, care constituie o enzima aminopeptidazică sau porțiuni antigenice ale acesteia, substanțial corespunzătoare secvențelor nucleotidice în întregime sau unei porțiuni a secvențelor precum cele arătate în fig. 2, 3,4 sau 5 (Secv. ID Nr. 1 la 15), sau unei variante funcțional echivalente a acestora, alta decât o polipeptidă corespunzătoare proteinei dublet H 11 OD sau o polipeptidă sintetică, corespunzătoare oricăreia dintre sec- 165 vențele polipeptidice individuale, descrise în WO 90/11086.

Alternativ, invenția asigură, de asemenea, polipeptide sintetice care conțin o secvență aminoacidă care constituie o enzimă aminopeptidazică sau o porțiune antigenică a acesteia, corespunzătoare, în principal, unor secvențe nucleotidice în totalitate sau unei porțiuni a acestor secvențe, precum cele prezentate în fig. 2, 3, 4 sau 5 (Secv. ID Nr.: 1 la 170 15) sau unei variante echivalent funcționale a acestora, în principal fără alte componente, de la Haemonchus contortus.

în plus, invenția se extinde la compoziții de vaccinuri pentru stimularea răspunsurilor imune împotriva paraziților helminți la om sau animal, cuprinzând cel puțin o polipeptidă sintetică cum s-a definit mai sus, împreună cu un purtător farmaceutic acceptabil. 175

Publicația WO 90/11086 dezvăluie un număr de secvențe polipeptidice obținute prin digestie proteolitică sau clivaj chimic al proteinei dublet H110D, care urmează:

a) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu Glu Phe

b) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser

c) Met Gly/Phe Asn, Phe, Lys, Ile, Glu/Val, Thr/Glu Ala Gly 180

d) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Lys Asp/Ala Thr/Lys Leu - Ile Thr

e) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser-Phe Val

f) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gln/Ala Glu Asp Val

g) Met Gly Phe Pro Leu Val Thr Val Glu Ala Phe Tyr

h) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu Gin Ala Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro 185

i) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pro Ala Ala Glu Asn/Leu Leu Asn/Gly

j) Lys-Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn

k) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp - Ile — Lys Gly

l) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala Phe Asp Asp Ile Thr? Tyr - - Gly Pro Ser

m) Lys - Glu Glu Thr Glu Ile Phe Asn Met 190

n) Lys — Pro Phe Asn/Asp Ile Glu Ala Leu

o) Asp Gin Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys

p) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu Glu Phe-Ala Thr Ala Leu

q) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser - Tyr? - Thr

r) Met Glu/Phe Asn Phe Leu Ile Glu/Val Thr/Glu Ala Gly - Ile Thr

s) Met Gly Phe Leu Val Thr Val Glu Ala Phe Tyr - Thr Ser

195

RO 117709 Β1

t) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu Gin Ala Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro

u) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Leu Asp/Ala Thr/Lys Leu - lle Thr - Gly

v) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser - Phe Gly?

w) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gln/Ala Glu Asp Val

x) Lys His/Tyr Asn/Val, Ser Pro Ala Ala Glu Asn/Leu Leu Asn/Gly

y) Lys - Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn

z) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp - lle — Lys Gly aa) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala Phe Asp Asp lle Thr? Tyr - - Gly Pro Ser bb) Lys - Glu Gin Thr Glu lle Phe Asn Met cc) Lys — Pro Phe Asn/Asp lle Glu Ala Leu dd) Asp Gin Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys

Incertitudinile sunt prezentate sub forma Phe/Gly, unde primul cod de trei litere reprezintă cel mai corect aminoacid bazat pe lungimea semnalului, sau printr-un semn de întrebare; un semn semnifică un rest necunoscut.

Secvențele polipeptidice individuale, specifice, care sunt descrise în WO 90/11086, nu sunt revendicate.

Termenul “polipeptidă, așa cum s-a folosit aici, include atât proteina cu lungime completă, cât și secvențele peptidice mai scurte.

“Echivalentul funcțional”, cum s-a folosit mai sus în legătură cu secvențele aminoacide polipeptidice, definește polipeptide înrudite la, sau derivate de la secvențele polipeptidice menționate mai sus, unde secvența aminoacidă a fost modificată prin substituție, adiție sau deleție a unui singur sau mai multor aminoacizi și, de asemenea, secvențele unde aminoacizii au fost modificați chimic, inclusiv prin glicozilare sau deglicozilare, dar care, cu toate acestea, mențin activitatea antigenică protectoare (imunogenitatea). Asemenea variații echivalente funcțional pot fi întâlnite ca variații biologice naturale sau pot fi preparate folosind tehnici cunoscute, de exemplu, polipeptide recombinate, echivalente funcțional, pot fi preparate prin tehnici cunoscute de mutageneză direct in situs, mutageneze aleatorii sau clivaj enzimatic și/sau ligare de aminoacizi.

în general, polipeptidele sintetice, conform invenției, reprezintă secvențe antigenice protectoare. Termenul “antigen protector”, cum s-a folosit aici, definește acei antigeni capabili să genereze un răspuns imun, de protejare a gazdei (imunogenic), adică un răspuns al gazdei la generarea de molecule producătoare de imunitate, anticorpi sau celule care sterilizează fecunditatea, dăunează, inhibă sau omoară și, ca urmare, “protejează gazda de boală clinică sau subclinică și inhibă producerea ouălor. Un astfel de răspuns imun se poate manifesta de obicei prin generarea anticorpilor care sunt capabili să inhibe funcția metabolică a parazitului, ducând la împiedicarea producerii de ouă și/sau moarte.

Polipeptidele sintetice, conform acestui aspect al invenției, pot fi preparate prin expresie într-o celulă gazdă care conține o moleculă de ADN recombinant care cuprinde o secvență nucleotidică cum a fost descrisă mai sus, legată opțional la o secvență de control al expresiei, sau un vehicul care donează ADN recombinant sau un vector conținând o astfel de moleculă ADN recombinant.

Alternativ, polipeptidele pot fi exprimate prin injectarea directă a moleculei de ADN neacoperit, conform invenției, într-o celula gazdă.

Polipeptidă sintetică astfel exprimată poate fi o fuziune polipeptidică cuprinzând o porțiune care prezintă imunogenitatea unei enzime aminopeptidazice în totalitate, sau a unei porțiuni a ei, și o polipeptidă suplimentară, codificată de către ADN-ul moleculei recombinante, fuzionată cu aceasta. De exemplu, este de dorit să se producă o fuziune proteică care să cuprindă o aminopeptidază sintetică sau altă polipeptidă conform invenției, cuplată la o

RO 117709 Β1 proteină precum β-galactozidaza, fosfataza, glutation-S-transferaza, ureează corpul central al antigenului hapatitei B (Francis și colab. 1989) și altele asemenea. Majoritatea fuziunilor proteice sunt formate prin expresia unei gene recombinante, în care două secvențe de codare au fost legate împreună cu cadrele de citire în fază. Alternativ, polipeptidele pot fi legate in vitro, prin mijloace chimice. Toate aceste fuziuni sau hibrizi derivați ai moleculelor 250 de acid nucleic, care codifică aminopeptidază, și secvențele lor aminoacide respective sunt cuprinse în invenția de față. Astfel, tehnici corespunzătoare expresiei ADN-ului recombinat și polipeptidelor sunt descrise, de exemplu, în Sambrook și colab., 1989. Alternativ, polipeptidele sintetice pot fi produse prin mijloace chimice, precum binecunoscuta procedură de sinteză în fază solidă, Merrifield. 255

Un aspect în plus al invenției include utilizarea unei compoziții de vaccin pentru stimularea răspunsurilor imune la om sau. de preferință, la un animal mamifer, împotriva infecției cu parazit helmint.

Privind alternativ, invenția asigură, de asemenea, o metodă de stimulare a unui răspuns imun, la un om sau animal, de preferință mamifer, împotriva unei infecții cu parazit 260 helmint, cuprinzând administrarea, la animalul menționat, a compoziției de vaccin care conține una sau mai multe polipeptide codificate de către o secvență nucleotidică, cum s-a definit mai sus.

compoziție de vaccin poate fi preparată, conform invenției, prin metode bine cunoscute în domeniul producerii vaccinurilor. 265

Formulări tradiționale de vaccin pot cuprinde una sau mai multe polipeptide sintetice, conform invenției, împreună, când este necesar, cu unul sau mai mulți adjuvanți corespunzători, de exemplu, hidroxid de aluminiu, saponină, QuilA, sau mai multe forme purificate ale acestora, dipeptidă muramil, uleiuri minerale sau Novasomes, în prezența unuia sau a mai multor purtători sau diluanți acceptabili farmaceutic. Purtătorii adecvați includ medii lichide, 270 precum soluție salină corespunzătoare utilizării ca vehicule pentru introducerea peptidelor sau poliepetidelor la un pacient. Pot fi incluși componenți suplimentari, precum conservanți.

formulare alternativă de vaccin poate cuprinde un virus sau o celulă gazdă, de exemplu, un microorganism (de exemplu, virusul vaccinia, adenovirus, Salmonella) având inserată o moleculă de acid nucleic (de exemplu, o moleculă de ADN) conform acestei inven- 275 ții, pentru stimularea unui răspuns imun orientat împotriva polipeptidelor codificate de către molecula inserată de acid nucleic.

Administrarea compoziției de vaccin se poate face prin oricare din căile convenționale, de exemplu oral sau parenteral, cum ar fi injecție intramusculară, opțional, la intervale, de exemplu, două injecții la un interval de 7...28 zile. 280

Așa cum s-a menționat mai sus, translarea aminoacizilor secvențelor nucleotidice figurate în fig. 2, 3, 4 sau 5 arată omologie de secvență cu o familie de enzime membranare aminoeptidaze integrate. Aceasta s-a determinat prin cercetarea a diferite baze de date accesibile în Genetics Computer Grups Sequence analisys software package, versiunea 7.01 noiembrie 1991 (Devereaux și colab., 1984), folosind translările secvențelor din fig. 2, 285

3, 4 sau 5. în fig. 6 s-au prezentat două astfel de comparații.

Expresia secvențelor care codifică aminopeptidaza conform invenției, așa cum s-a menționat mai sus, poate fi realizată folosind o gamă de tehnici și sisteme de expresie cunoscute, incluzând expresia în celule procariote ca E.coli și celule eucariote, precum drojdii sau sistemul celulă de insectă-baculovirus, sau celule transformate de mamifere și 290 în animale și plante transgenice. Secvențele nucleotidice pot fi exprimate în mod deosebit de avantajos, folosind sistemul nematodei transgenice, cum ar fi sistemul pentru nematodă, Caenortiadbditis descrise în exemplul în Fire, (1986); Fire și colab., (1989); Spieth și colab., (1988); Han și colab., (1990).

RO 117709 Β1

Un aspect suplimentar al invenției asigură o metodă pentru prepararea unei polipeptide sintetice, cum s-a definit mai sus, care cuprinde cultivarea unei celule eucariote sau procariote care conține o moleculă de acid nucleic, cum s-a definit mai sus, în condiții în care polipeptidă menționată este exprimată, și recuperarea polipeptidei astfel produsă.

Aspecte în plus ale invenției includ astfel donarea și expresia vectorilor care conțin secvențele nucleotidice conform invenției. Astfel de vectori de expresie includ secvențe de control corespunzătoare, precum elemente de control al translației (de exemplu, codoni de start și stop) și transcripției (de exemplu, regiuni promotor-operator, situri ribozomale de legare, secvențe stop de terminare) legate în împerecherea cadrului de citire cu molecule de acid nucleic, ale invenției.

Conform invenției, vectorii pot să includă plasmizi și virusuri (atât bacteriofagi, cât și virusuri eucariote) conform tehnicilor binecunoscute și documentate în domeniu, și pot fi exprimați într-o diversitate de diferite sisteme de expresie, de asemenea binecunoscute în domeniu. Vectorii virali corespunzători includ, așa cum s-a menționat mai sus. virusurile bacilovirus și, de asemenea, adenovirusul și virusul vaccinae. în domeniu s-au descris numeroși alți vectori virali.

Pentru a introduce astfel de vectori în celule pentru expresie, procariote sau eucariote, sau în linii germinate sau celule somatice pentru formarea de animale transgenice, sunt cunoscute și pot fi folosite diverse tehnici. Tehnici adecvate pentru transformare sau transfecție sunt bine descrise în literatură.

Celule gazdă eucariote sau procariote, sau organisme transgenice sau transfectate, conțin o moleculă de acid nucleic conform invenției.

Sistemele de expresie, în general, și sistemul de expresie nematod, în particular, au avantajul că prelucrarea post-transcripțională și, în special, glicozilarea, se pot întâlni în cazul sistemului transgenic nematod, o glicozilare corespunzând celei găsite în proteina nativă. Aceasta reprezintă un aspect important al invenției, deoarece, în numeroase cazuri, este necesară prelucrarea posttranscripțională a proteinei recombinante, pentru a exprima optimum de activitate biologică.

Sistemele de expresie celulară de mamifere au, de asemenea, un număr de avantaje. Celulele gazdă de mamifere asigură reproducerea bună a formei native a epitopilor protectori ai antigenului, deoarece un sistem de expresie eucariot va provoca, la mai multe copii, glicozilare similară, legare disulfidică și alte modificări post-translaționale decât E.coli, care poate produce o proteină insolubilă, necesară de mai multe ori și care are o reproducere săracă a formei native. în plus, glicozilarea la mamifere este puțin probabil să inducă un răspuns imun, care să devieze de la un răspuns de protecție anti-proteină. Pentru protejarea oamenilor și animalelor domestice, este preferabil să se folosească linii celulare umane sau animale fibroblastoide sau mielomice precum HeLa - o linie celulară umană; BHK celule de rinichi de hamster pui; VERO - o linie de celule de rinichi de maimuță; FR3T3 -fibroblaste Fisherde șobolan; NIH3T3, o linie celulară fibroblastică de șoarece; C1271, o linie celulară de tumoare mamară de șoarece; CV-1, fibroblaste din rinichi de maimuță africană verde; 3T6, fibroblaste embrionare de șoarece; celule L, o linie celulară de șoarece; precum YB210 și Y3.

în domeniu, sunt binecunoscut vectorii corespunzători pentru diferite clase de linii celulare de mamifere. în general, acestea vor cuprinde un promotor și/sau amplificator conectat operațional la o secvență nucleotidică care codifică antigenul sau fragmentul acestuia. Promotorii adecvați includ promotorul SV40 timpuriu sau târziu, de exemplu vectorul PSVL, promotorul citomegalovirus (CMV), promotorul metalotioninei I de șoarece și o repetiție virală lungă, în cazul tumorii mamare, la șoarece. Vectorul include, de preferință, un marker corespunzător, precum o genă pentru dihidrofolat reductaza sau glutaminsistetaza. Vectori ai acestor tipuri sunt descriși în WO 86/05807; 87/04462; 89/01036 și 89/10404.

RO 117709 Β1

Transfecția celulelor gazdă poate fi efectuată folosind tehnici standard, de exemplu, folosind fosfat de calciu, dextran, DEAE, polibren, fuziunea de protoplaști, lipozomi, microinjectarea directă, țintirea genei sau electroporarea. Se preferă ultima tehnică, metodele de transfecție a liniilor celulare de mamifere care folosesc electroporarea fiind descrise de către Anderson și colab., 1980; în general, ADN-ul liniar este introdus mai ușor decât ADN-ul 350 circular.

în cazul proteinei H110D, s-a dovedit a avea un tip de glicozilare unic și neobișnuit, care s-a presupus a contribui la imunoreactivitate, deoarece numeroși anticorpi monoclonali, care s-au obținut în continuare pentru H110D de la Haemonchus, recunosc epitopii carbohidrați, care pot fi importanți în dezvoltarea unor vaccinuri utile. 355

S-a demonstrat în special umătorul tip de glicozilare pentru H110D de la Haemonchus:

i) aproximativ 65% din oligozaharide sunt N-legate, ceea ce rămâne 0-legate;

ii) partea principală (aproximativ 48%) din oligozaharidele N-legate este de clasa complexă; 360 iii) substanțial, toate (peste 95%) dintre oligozaharide sunt fără sarcină;

iv) conținutul molar relativ al monozaharidelor constituente este N-acetilgalactozamina 0,1, fucoza 3,6, galactoza4,1, glucoza 4,4, manoza 6,2 și N-acetilglucozamina 5,2;

v) oligozaharidele, altele decât oligozaharida principală (desemnată oligozaharida D), sunt substanțial rezistente la degradare de către o gamă largă de exoglicozidaze (de exem- 365 piu, a-D-manozidază, β-D-manozidază, β-Dglucozidază, β-D-galactozidază, a-D-galactozidază, a-D-xiloxidază, β-D-xiloxidazdă, β-D-N-acetilglucozaminidază).

Asemenea oligozaharide și glicoproteinele care le conțin formează încă un aspect al acestei invenții.

Oligozaharida D, a glicoproteinei Haemonchus H110D, este tipul N-legată și are o 370 structură nouă, constând din două resturi de fucoză atașate printr-o legătură a-1.3 și una a-

1,2 la miezul unei manoze (N-acetilglucozamina^.

Mânai

375

Man β-1,4 Glc ΝΑοβ1,4 Glc Nac

Mânai

(Fucal )₂

380

Mânai

Fuc a1 3 Man β1—>4Glc Nacpi —>4GlcNac 2 a1

Fuc

385

390 în special, când s-a legat la o proteină, de exemplu, o proteină recombinantă, ca o proteină aminopeptidază de helmint sau un fragment antigenic al acesteia, sau când s-a folosit pentru generarea antigenilor anti-idiotipici pentru imunizarea, în special, a animalelor foarte tinere.

Glicoproteine animate având, în general, legături fucoză a-1,6 și a-1,3 de oligozaharide, con- 395 form prezentei invenții, sunt considerate ca neobișnuite.

RO 117709 Β1

Această invenție va fi descrisă acum în detaliu, cu referire, în special, la proteina H 11 OD de la Haemonchus contortus. S-a observat, totuși, prin diferite tehnici cum ar fi histochimia și hibridizare ADN, că echivalenți ai H 11 OD există și în alte specii de paraziți. Se crede că proteina H 11 OD este un complex multigenic și că, în plus, secvențele nucleotidice care o codifică pot prezenta variații de secvență între diferite tulpini și diferite stadii ale ciclului de viață al helmintului. Mai mult, pot exista forme enzimatice multiple (izoenzime), care pot fi exprimate diferit în diferite stadii, sau în tulpini diferite. în acest studiu, secvențele ADN și altfel, secvențele aminoacide propuse, s-au determinat de la clone cADN și produse PCR obținute din ARN-ul corespondent genelor H110D, prin tehnologia ADN-ului recombinant din surse diferite și în diferite stadii ale ciclului de viață ale parazitului H.contortus.

Secvențarea cADN și a produselor PCR a permis să se identifice trei secvențe H110D strâns înrudite, care sunt desemnate aici H11-1, (Secv. ID Nr.: 19), H11-2 (Secv. ID Nr.: 20), și H11-3 (Secv. ID.: 21). H11-1 cuprinde trei secvențe continue și suprapuse, clona cADN, Aust B1 (Secv. ID Nr.: 6), produsul PCR A-648 (Secv. ID.: 9) și terminația 3' a produsului PCR 014-178 (Secv.lD NR. 12); 11-2 conține produsele PCR A-650 și 2,5 kb (Secv. ID.: 10) și respectiv 7); H11-3 conține produsele PCR 3,5 kb și A-649 (Secv. ID. Nr.:8 și respectiv 11). Relațiile specifice dintre clonele cADN și produsul PCR secvențiat individual și H11-1, -2, -3 sunt prezentate pe scurt în fig. 1 și respectiv detaliat, în fig. 3, 4. 5.

Diferențele și variațiile observate între secvențele obținute de la clonele cADN și produsele PCR pot fi văzute în special în fig. 2, 3, 4 și 5 (compuse din Secv. ID NR.: de la 1 la 15 și de la 19 la 21) și prezentate pe scurt în tabelul 1.

Omologiile secvențelor aminoacide deduse, obținute prin traslarea secvențelor nucleotidice arătate în fig. 2

Tabelul 1

	Similaritate %	Identitate %
H11-1:H11-2	77	63
H11-T.H11-3	79	65
H11-2:H11-3	82	69

Diferențele pot fi atribuite mARN-urilor diferite (ale familiilor multigenice). Suplimentar, se pot datora, cel puțin în parte, variantelor diferite ale secvenței care codifică H 11 OD, sau mARN-ului prezent în diferite stadii ale ciclului de viață sau tulpinilor cu diferite origini geografice.

Omologiile secvențelor aminoacide ale H 11 OD cu aminopeptidaza M de la șobolan (ApM) aminopeptidaza A de la șoarece A (ApA)

Tabelul 2

	Similaritate %	Identitate %
H11-1:ApM	55	32
H11-1:ApM	55	31
H11-2:ApM	52	31
H11-2:ApM	54	31
H11-3:ApM	53	32
H11-3:ApM	52	30

i

RO 117709 Β1 în continuare, se prezintă un exemplu de realizare a invenției, în legătură cu cele 21 de figuri care reprezintă:

- fig. 1:o hartă a clonelor a cADN și produsului PCR al H 11 OD H.contortus secvențate, relațiile lor și pozițiile relative de-a lungul mARN H 11 OD;

- fig. 2: secvențe nucleotidice H 11 OD desemnate H11-3, (Secv. ID Nr.: 21) derivate de la produsele PCR donate Secv. ID Nr. 8 și 11 și clona cADN M1AUS, Secv. ID NR.: 5), H11-2 (Secv. ID. Nr.:20, derivate de la produsele PCR donate Secv.

ID NR.: 7 și 10) și H11-1 (Secv. ID. NR.:19, derivate de la produsele PCR donate, Secv. ID. Nr.:9 și 12 și clona cADN Aust B1, Secv. ID Nr.: 6);

-fig. 3: secvența H11-3 (Secv. ID Nr.: 21) (prezentată în fig. 2) cu alinierea clonelor cADN M1 și M1AUS (Secv. ID Nr.:1 și 5);

- fig. 4: secvența H11-2 (Secv. ID Nr.: 20) (prezentată în fig. 2) cu alinierea clonelor cADN B2 (Secv. ID Nr.:4);

- fig. 5: secvența H11-1 (Secv. ID Nr.: 19) cu alinierea cADN B1A și B1 (Secv. ID Nr.:2, și respectiv, 6);

- fig. 6: a) secvențele aminoacide presupuse (Secv. ID Nr: 22, 23 și 24) derivate de la secvențele ADN H11-1, H11-2 și H11-3 prezentate în fig. 2;

bi) și ii) arată secvența aminoacidă prezisă a H11-3 comparată cu secvențele aminoacide publicate ale aminopeptidazei microzomale M de la șobolan (Watt și colab., 1989) și respectiv, aminopeptidaza microzomală A de la șoarece (Wu și colab., 1990); identitățile sunt închise în căsuțe, intervalele indică spațiile introduse pentru a maximiza nivelul de omologie dintre secvențele comparate. Pentru aminoacizi s-a folosit convențional o singură literă. Linia orizontală de deasupra secvenței indică poziția regiunii transmembranare și asteriscurile arată poziția motivului legare-zinc. Nivelurile de similaritate sunt prezentate în tabelele 1 și 2.

- fig.7: alinierile secvențelor aminoacide (desemnate PepA, PepB, PepC, PepD și PepE) obținute de la fragmente CNBr și Lys-CAIe H 11 OD cum au fost descrise anterior (Publicația internațională a cererii de brevet WO 90/11086 și, cum s-au enumerat mai devreme, secvențele polipeptidice (a), (b), (e), (k) și respectiv (aa)) și trei secvențe noi (Secv. ID Nr.: 16, 17 și 18) obținute de la H 11 OD după digestie prin elastază sau termoliză cu translările aa) H11-1, b) H11-2 și c) H11-3.

într-un aspect suplimentar invenția asigură, de asemenea, molecule de acid nucleic care conțin una sau mai multe secvențe nucleotidice, care corespund, în principal, sau care sunt, în principal, complementare uneia sau mai multor secvențe alese de la secvențele clonelor Ml, B1A, B1A-3, B2, M1AUS, Aust B1,014-015 (2,5 PCR), 014-872 (3,5 PCR Clona 2), A-648 (terminația 5' a B1), A-650 (terminația 5' a 2,5 PCR), A-649 (terminația 5' a 3,5 PCR), 014-178 (terminația 3' a Aust B1, clona 2), 014-178 (terminația 3' a Aust B1, clonele 3 &6), 014-872 (3,5 PCR, clona 10) și 014-872 (3,5 PCR, clona 19), H11-1, H11-2 și H11-3, Secv. ID Nr.. la 15 și respectiv, 19 la 21, cum s-a prezentat în fig. 2, 3, 4 și 5, sau secvențe care sunt, în principal, omoloage, cu sau care hibridizează cu oricare dintre secvențele amintite.

Așa cum s-a menționat mai sus, compararea secvențelor diverselor clone menționate mai sus, față de bazele de date din computer ale secvențelor cunoscute, relevă omologie substanțială cu familia de enzime aminopeptidazice microzomale (E.C.3.4.11-). Activitatea enzimatică a studiilor de inhibitor realizate cu H 11 OD și subfracțiunile acesteia confirmă că proteina este de fapt aminopeptidaza microzomală (α-aminoacilpeptidhidrolaza (microzomală)). Astfel de studii au arătat, în continuare, că sunt prezente ambele activități asemenea -aminopeptidazei M și că fiecare dintre componentele H 11 OD, prezintă, individual, o activitate enzimatică.

445

450

455

460

465

470

475

480

485

490

RO 117709 Β1

De asemenea, au fost realizate studii de digestie proteolitică a H 11 OD. Folosind enzimă elastază, s-a găsit ca H 11 OD poate fi parțial clivată, formând două fracțiuni, o secvența detergent-solubilă (care rămâne cu membrana) și o fracțiune solubilă în apă (care este, de asemenea, H 11 OD). H11S se întâlnește sub forma unei proteine dimere care poate fi redusă la două componente. S-a găsit interesant că numai activitatea asemenea aminopeptidazei-M este asociată cu fracțiunea H11S solubilă în apă, în timp ce activitatea asemenea aminopeptidazei-A este asociată numai cu fracțiunea detergent - solubilă.

Exemplul următor asigură o descriere a studiilor care duc la determinarea secvențelor prezentate în fig. de la 1 la 7, cu referire la următoarele figuri suplimentare, în care:

- fig. 8: prezintă pete Western ale proteinelor membranare integrate prezente în extract în detergent de la adulți Haemonchus contortus, testate cu afinitate de anticorpi purificați, eluați de la clonele potențiale H 11 OD;

a) antigeni într-un extract de Haemonchus în detergent recunoscuți prin antiserul la extract;

b) anticorpi eluați dintr-un extract precum cel prezentat în a) retestat contra unei pete a extractului în detergent confirmă realizarea cu succes a etapei de elutie;

c) anticorpi ca în b) care se leagă la clona M1 proteina exprimată puternic, care recunoaște o regiune la 110 kb (și o bandă relativ îngustă la aproximativ 205 kd1);

d) nu există nici un anticorp de legare când se folosește pentru adsorbția serului un nou-recombinant;

- fig. 9: arată o pată Northern a m-ARN-ului purificat de la Haemonchus contortus, în vârstă de 11, 15 și 23 zile, sondat cu

a) cADN clona M1 (Secv. ID Nr.:1);

b) cADN clona M1AUS (Secv. ID NR.: 5);

c) cADN clona B1A (Secv. ID Nr.:2 și 3);

d) cADN clona Aust B1 (Secv ID NR.: 6);

e) produs PCR donat 014-872 (3,5-2, Secv. ID Nr.: 8);și

f) produs donat 014-015 (Secv. ID Nr.:7), Numerele 11, 15 și 23 indică vârsta pentru Haemonchus de la care s-a obținut mARN;

- fig. 10: pete Southern ale ADN-ului genomic de la Haemonchus contortus sondat cu cADN-ul clonelor M1AUS (Secv. ID Nr.: 5), BIA (Secv. ID NR.: 2 și 3) și Aust B1 (Secv. ID Nr.: 6) și produsele PCR 014-872 (3,5-2, Secv. ID. Nr.: 8) și 014-015 (Secv. ID. Nr.: 7);

a) petele s-au spălat la o stringență moderată,

b) petele s-au spălat la stringență ridicată; pentru fiecare sondă, traseul 1 a conținut un digerat Hindi11 al ADN-ului ca marker sau s-a lăsat ca blanc, traseele 2 și 3 au conținut digerate EcoRI și respectiv, Hindlll ale ADN-ului genomic de la Haemonchus;

- fig. 11: pete Western ale fuziunilor proteice recombinante GST-ML și GST-B1A, sondate cu anticorpi de afinitate purificați la H 11 OD (H 11 OD) purificată prin electroforeză;

- fig. 12: pete Western ale antigenului ConAH110D testat cu antiser ConAHI 10D și la fuziunile proteice recombinante GTS-M1 și GTS-B1A;

- fig. 13: a) rezultatele analizelor proteinei H110D și activităților enzimei aminopeptidază în funcțiunile obținute prin cromatografia schimbătoare de ioni a ConAHI 10D, pe o coloană MonoQ;

b) SDS-PAGE a fracțiunilor arătate în fig. 13 a);

- fig. 14: a) valorile pH-ului la care s-au obținut fracțiunile într-un experiment de focalizare izoelectrică în curgere-liberâ;

b) SDS-PAGE în condițiile de reducere a fracțiunilor de la 14a) în care banda mai groasă a dubletului H110D s-a găsit în fracțiunea 6 și banda mai înaltă în fracțiunea 16, cu cantități variabile ale fiecăreia dintre fracțiunile care intervin;

RO 117709 Β1

c) pete Western ale fracțiunilor prezentate în 14 b), testate cu i) anticorpi monoclonali desemnați TS3/19.7 și ii) anticorpii policlonali anti-M1 purificați prin afinitate; anticorpii de control nu au dat reacție detectabilă;

- fig. 15: a) valorile pH-ului la care s-au obținut fracțiuni în alt experiment de focalizare izoelectrică în curgere liberă;

b) SDS-PAGE în condițiile reducerii fracțiunilor de la 15a) folosite în cercetările enzimei, în care banda mai joasă a dubletului H110D s-a găsit în fracțiunile 4-6 și banda mai înaltă în fracțiunile 16-18, cu cantităti variabile ale fiecăreia dintre fracțiunile care intervin;

c) activități specifice aminopeptidazei microzomale a fracțiunilor din 15b);

- fig. 16: protecția oilor prin vaccinare cu benzile separate (U) superioară, (L) joasă, recombinantă (U+L) și dubletul intermediar (D) de la H 11 OD;

a) productivitatea de ou parazit, exprimată ca ou per gram de materii fecale;

b) încărcarea cu viermi, postmortem, relativ la controale;

- fig. 17: protecția oilor prin vaccinare cu un fragment șolubil în apă (H 11 OD), obținut de la H110D prin digestie cu elastază și H11A, H110D rezidual, detergent-solubil;

a) productivitatea de ou parazit, exprimată ca ou per gram de materii fecale;

b) încărcarea cu viermi, postmortem, relativ la controale (C);

- fig. 18: exemple ale relației între inhibiția de Ai), Bi) activități asemenea aminopeptidazei M și Aii), Bii) asemenea aminopeptidaze-A ale H 11 OD prin antiser individual de oaie vaccinată cu H 11 OD, cu niveluri de protejare măsurate prin Ai, ii) reducerea % a încărcării cu viermi după moarte și bi, ii) reducerea % a numărului de ouă fecale: anti-H110D, control anti-colferitină;

- fig. 19: localizarea histochimică a activității enzimei aminopeptidază în adult de Haemonchus confortus-micrografiile deschise ale crio-secțiunilor de femelă adult de Haemonchus contortus arată activitate aminopeptidazică asociată doar cu microvilozitățile (mv) intestinale (I). Nici un alt țesut, de exemplu, cuticula (c), hipodermul (h), tradusul genital (tg) și peretele muscular (wm) nu prezintă activitate. în a) substratul a fost L-leucină 4metoxi-P-naftilamidă, în b) substratul a fost L-acid a glutamic-(4-metoxi-Ș-naftiamidă);

- fig. 20: harta produsului 3,5 PCR (clona 2) (Secv. ID NR.: 8) subclonat în vectorul de expresie baculovirus pBlueBacll;

- fig. 21: o pată Western a extractelor de la celule de insectă Spodoptera frugiperda (Sf)9 infectate baculovirus, sondate cu anticorpi anti-H 11 OD. Două plăci donate, P3A și P4A au exprimat H 11 OD de lungime integrală, imunopozitivă, iar controalele nu.

Exemplul 1. Construcția băncii AAGT11

Izolarea mARN-ului

Haemonchus consort, adulți (0,5 g) de origine din Regatul Unit, congelați brusc în lichid, se mojarează în azot lichid, folosind un mojar prerăcit și un pistil. ARN-ul se extrage din mojar cu 10 volume de hidroclorură de guanidină 4M în citrat de sodiu 25 mM conținând 0,5% sarcozil (g/v) și 0,7% 2-metcaptoetanol (g/v), urmat de extracție cu fenol și cloroform folosind metoda lui Chomezynski și Sacchi (1987). Se prepară ARN mesager (mARN) de la acesta prin cromatografie de afinitate pe celuloză oligo dT (de două ori) cum este descris în Manitis et al., (1982) și se testează calitatea prin translație in vitro, folosind o trusă de lizat reticulocitar de șoarece și meționând -³⁵S de la Amersham Internațional pic, conform instrucțiunilor fabricantului. S-au detectat polipeptide până la 120 kda.

Prepararea ADN-ului complementar

Primul filament ADN complementar (cADN) se sintetizează de la 1 pg mADN, folosind inițierea la întâmplare a acestuia și transcriptaza inversă aviară, și cel de-al doilea filament se sintetizează folosind o reacție de înlocuire a ADN-ului complementar cu RN-ază H și ADN polimerază I E.coli, urmată de repararea proeminențelor 3' folosind ADN polimeraza

545

550

555

560

565

570

575

580

585

RO 117709 Β1

T4, conform metodei lui Gubler & Hoffman (1983). Randamentul cADN dublu catenar (ds) este de aproximativ 400 ng de la 1 pm ARN. mADN (ds) se examinează prin electroforeză într-un gel de agaroză 1%, urmată de autoradiografie. cADN-ul ds este în domeniul de mărime 0,2-9,4 kb, cu majoritatea în domeniul 0,5-2,3 Kb.

Clonarea cADN-ului în Agt11 cADN-ul neselectat după mărime se folosește pentru a construi o bancă în Ăgt 11, folosind sistemul de donare cADN Amrsham (trusa nr. RPN 1280, Amersham Internațional pic) și plierea extractelor în vitro (Trusa nr. N334, Amersham Internațional pic), cum este descris în instrucțiunile fabricantului, și oligonucleotidele linker EcoRI (5'GGAATTCC). Banca rezultată se depune pe E.coli tulpina Y1090, în prezență de izopropiltio-p-D-galactozidă (IPTG) și 5-brom, 4-clor, 3-indolil β-D-galactozidă (X-gal), în condițiile în care recombinantul Ăgt11 apare ca plăci clare (White) și tipul sălbatic Ăgt 11 nerecombinant, ca plăd albastre. Banca a conținut 90% plăci albe și efidența donării se calculează a fi 4 x 10⁷ unități formatoare de plăci (pfu)/pg cADN și un titru al băncii de 2 x 10⁶ unități formatoare de placă per ml. Analiza ADN-ului de la 20 recombinanți culeși la întâmplare arată un insert mediu, de mărime 0,51 kb. Totuși, această medie a fost perturbată de o clonă cu un insert de 3,5 Kb. Majoritatea inserțiilor sunt mai mari de 300 baze pereche (bp). Aceasta bancă Ăgt11 derivată de la mARN de vierme din Regatul Unit a fost cercetată imunologic.

Prepararea sondelor de anticorp

Antiser pentru proteinele membranare integrate

Se disecă intestine de la adult Haemonchus contortus (de origine din Regatul Unit) și se omogenizează în fosfat salin tamponat (PBS) răcit pe gheață, pH 7,4, conținând 1 mM acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) și 1 ml florură fenilmetilsulfonică (PMSF). Omogenatul se concentrează timp de 10 min, folosind o microcentrifugă, și peleta se resuspendă în același tampon, care conține 0,1% (v/v). Tween este o marcă comercială. După recentrifugare, peleta se resuspendă în același tampon conținând 2% v/v Triton X-100 și se extrage 2 h la 40°C. Acest extract se centrifughează ca mai sus, pentru a obține un supematant care conține proteinele membranare integrate (IMP).

Se hiperimunizează o oaie IMP în Adjuvantul Complet al lui Freund (FCA), prin injectare intramusculară a 50, 50,120 și 130 pg de IMP dat în săptămânile 0, 7,11 și 15. La șase săptămâni după injecția finală, se recoltează serul și se desemnează ser EE - 068

Prepararea proteinelor membranare integrate de Haemonchus contortus prin entracție cu detergent

Se prepară un extract, prin omogenizarea viermilor în 5...10 volume de PBS conținând 1 mM EDTA și 1 mM PMSF. Suspensia se centrifughează la 10000 x g timp de 20 min, la 4°C, și peleta se spală în același tampon conținând 0,1% v/v Tween 20, apoi se extrage cu 5 volume 2% v/v Triton-x-100 cum se descrie mai sus. Supernatantul se recentrifughează a 100000 x g timp de 1 h, și supernatantul rezultat, care s-a îmbogățit în H110D, dar a continuat și în alte probe de IMP, se folosește în experimente de pătare Western și pentru prepararea H110D ne-denaturate (vezi mai jos).

Prepararea H110D și Anti-H110D purificat prin afinitate

Extractul îmbogățit în H110D se supune cromatografiei schimbătoare de ioni pe MonoQ (așa cum s-a descris în WO 88/00835 și 90/11086) H110D purificat se reia în FCA și se injectează intramuscular la miei. Se dau trei doze de 100 pg la trei săptămâni. Serul colectat de la miei de 4 săptămâni, după injecția finală, se purifică prin afinitate, prin absorbție la o coloană conținând H110D purificată, care este cuplată la sefaroza activată bromură de cian (Pharmacia). Cuplarea H110D la sefaroză, legarea de antiser și elutia anticorpilor anti-H110D se fac conform instrucțiunilor furnizate de către Pharmacia. Acești anticorpi purificați prin afinitate se desemnează anti-H110D. N-ul deosebește acești anticorpi de cei provocați la H110D denaturată, purificată electroforetic, care sunt desemnați antiH110D.

RO 117709 Β1

Pătarea Western

Pătarea se realizează folosind proceduri standard (Johnstone et al., 1982)

Izolarea și caracterizarea clonelor

Imunocercetarea băncii Agt11 (origine Regatul Unit)

Metoda folosită pentru cercetarea imunologică a băncii este în esență precum cea descrisă de către Bowtell et al., (1986). înainte de folosire, serul (EE-068) eliberat de anticorpi anti-E. co//prin absorbție cu lizate și celule întregi de E.coli Y1090. Banca s-a etalat pe celule E.coli Y1090 la o densitate de 10³ pfu pe placa de 90 mm în diametru. Plăcile se acoperă cu filtre nitrocelulozice impregnate cu IPTG și se incubează peste noapte. Se spală filtrele cu TBST (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCI, 0,05% v/v Tween 20) și apoi se blochează cu 5% v/v ser de cal în TBST timp de 2 h. Se adaugă ser EE-068 diluat 1 la 20 în TBST conținând 5% ser de cal, și filtrele se incubează timp de 4 h, clătindu-se ușor. Filtrele se spală din nou în TBST, apoi se incubează cu peroxidază de hrean (HRP)-conjugată cal anti-oaie IgG diluată 1 la 500 în TBST conținând 5% v/v ser de cal, timp de 2 h. (Anti-ser pentru IgG de oaie se induce unui cal, IgG anti-oaie purificați prin cromatografie de afinitate pe o coloană sefaroză IgG de oaie și anticorpii s-au conjugat la HRP prin metoda Nakane & Kawaoi, 1974). Filtrele se spală suplimentar în TBST, și plăcile pozitive se detectează folosind 0,6 mg/ml 3,3-diaminobenzidină (DAB) și 0,1% v/v apă oxigenată. Se culeg 25 de pozitive prealabile și se recercetează cu anti-H110DN purificată prin afinitate, cum este descris mai sus. După această cercetare secundară, sunt recombinate încă 5 probe, dând, cu clona desemnată Ml, cel mai puternic semnal.

Purificarea prin afinitate, a anticorpului pe fag recombinant

Se prepară clone confluente pe suprafața Eco//Y1090 prin întinderea de 10³ pfu ale fiecărei dintre λ clonele anticorp pozitive sau fagul de control Ăgt11 negativ nerecombinant. Suprafețele se incubează timp de 4 h la 42°C, apoi se acoperă cu filtre impregnate cu IPTG și, în continuare, se incubează peste noapte la 37°C. Se îndepărtează filtrele de la plăci și se spală în TBST înainte de a se bloca cu 5% v/v ser de cal, timp de 1 h. Filtrele se incubează apoi cu o diluție 1 la 100 de antiser EE-068 timp de 6 h, înainte fiind limpezite perfect cu TBST. Anticorpii legați se eluează de pe filtre prin două aplicări a 2 ml tampon de eluție (5 mM glicină, 500 mM NaCI, 0,2% Tween 20, pH 2,3) timp de 2 până la 5 min fiecare, neutralizare prin adăugare de 200 pl de 1M Tris-HCI, pH 7,4, diluat 1 la 200 și se folosesc pentru cercetarea imunologică a unei pete Western a unui extract îmbogățit în H110D.

Secvențerea ADN-ulul clonei M1

Se izolează ADN din clona M1, conform metodelor descrise în Maniatid și colab., (1982). Fragmentul Kpnl-Sstl de 2,38 kb conținând fragmentul M1 de 300 bp se izolează prin electroforeză în gel, se purifică folosind un kit GENECLEAN (Stratagene) (GENECLEAN este o marcă comercială înregistrată a BIO 101) și se subclonează în pBluescript II SK⁺(Stratagene). Fragmentul EcoRI se purifică folosind aceleași metode și se resubclonează în același vector.

Secvența nucleotidică a insertului M1 se determină folosind kitul de secvențiere T7 (Pharmacia, U.K.), folosind primeri M13 atât din față, cât și reverși.

Prepararea băncilor cADN Agt11 și ĂXZAP australiene

Izolarea mARN

Se congelează brusc 5 g adulți Haemonchus contortus (tulpina susceptibilă australiană McMaster) în azot lichid, se triturează în azot lichid și se extrag mARN-ul folosind fenol fierbinte, prin metoda Cordingley și colab., (1983). Randamentul ARN-ului total este 10,35. Se folosesc 1,3 mg din acest ARN, pentru a prepara mARN prin cromatografie de afinitate pe celuloză oligo-dT (două purificări secvențiale), folosind metoda descrisă de Maniatis et al., (1982). Randamentul mARN-ului este de 21,6 pg. Cantitatea de mARN se testează prin

645

650

655

660

665

670

675

680

685

RO 117709 Β1 translarea in vitro în lizat reticulocitar de iepure, în prezență de metionină-35S (Amsterdam), conform instrucțiunilor furnizorului. Produsele de translare obținute au benzi clar distinse, inclusiv benzi mai mari de 200 kb în mărime, așa cum se demonstrează prin electroforeză pe geluri de poliacrilamidă SDS, urmată de fluorografie.

Sinteza cADN și prepararea băncii

Se folosește 1 pg mARN pentru a face cADN prin inițiere cu oligodT sau primeri oarecare, folosind o trusă de sinteză cADN de la Amersham Internațional pic, urmând instrucțiunile fabricantului. Randamentul este 115 ng cADN dublu catenar (ds). Cantitatea cADN-ului se examinează prin electroforeză ADN-ului marcat -³²p pe un gel de agaroză alcalină, cum se descrie în instrucțiunile kit ADN, Amsterdam. Mărimea cADNului (prin comparație cu markeri λ-Hindlll, New England Biolabs) este de la 150 bp până la mai mult de 10 kb, majoritatea produselor fiind în domeniul de mărime 0,6-5 kb. cADN-urile (ds) inițiate oligo-dt și inițiate la întâmplare se depozitează și este ligat la linkeri EcoRI 8-mer (5GGAATTCC 3') New England Biolabs. Catalog nr. 1018) în exces, care se marchează cu γ-³²ρ-ΑΤΡ și polinucleotidkinază T4. cADN-ul se digeră cu EcoRI și excesul de linker se îndepărtează prin cromatografie pe sefaroza 4B (Pharmacia) conform metodelor descrise de Maniatis et al., (1982). Fracțiunile din coloană se strâng în două loturi, unul care conține cADN mai mare de 2 Kb și unul de cADN mai mic decât 2 Kb. Fiecare depozit este ligat apoi separat la un 1 pg tăiat EcoRI, brațe fosfatate ĂZapll (Stratagene) și pliat separat folosind Gigapack Gold (Stratagene, marcă înregistrată). cADN-ul de mărime mai mare da 1,3x10⁵recombinați și cADN-ul mai mic, 1,4x10⁵ recombinanți; aceștia se depozitează pentru a obține o bandă de 2,7x10⁵. Banca ĂZap se amplifică prin depunere pe celule XL1-Blue (Stratagene) la 2x10⁴ pfu pe placa de 135 mm. Titrul băncii amplificate este 7x10⁷ pfu/ml.

în continuare, se folosesc 2 pg mARN pentru a face cADN, cum este descris mai sus, dar folosind ca inițiator numai oligo-dT. Randamentul cADN ds este 740 ng. Acest cADN se tratează cu EcoRI metilaza cum este descris în Maniatis și colab., (1982) înaintea adăugării de linkeri EcoRI, și, în acest caz, se folosesc linkeri 12-mer (5'-CCGGAATTCCGG 3' New England Biolabs) Catalog nr. 1019). După digestia cADN-ului ligat cu EcoRI, toate fracțiunile dintr-o coloană sefaroză 4B care au conținut cADN se depozitează și sunt ligate la 2 pg tăiat EcoRI, brațe fosfatate Ăgt11 (Stratagene). Amestecul de ligare este împărțit în două și se pliază cu două loturi de Gigapack Gold) Stratagene); acestea se stochează pentru a obține o bancă Ăgt11 de 7x10^£ pfu. Banca este amplificată prin depunere pe celule ST9 la 5x10⁵ pfu pe placa de 135 mm. Titlul băncii Agt11 amplificate este 4,5x10¹¹ pfu/ml.

Cercetarea băncii Agt11 australian cu anti-ser pentru H110D

Prin injectarea oilor cu proteina H110D (de origine U.K.), care este electroeluată de pe poliacrilamida după electroforeză în SDS, se induc antiseruri, conform următoarei metode:

ConAHUOD preparat cum este descris în WO 88/00835 și 90/11086 este supus electroforezei pe geluri poliacrilamidice SDS (Laemli, 1970), pentru a obține electroeluantul H110D. După electroforeză, suprafața gelului poliacriamidic, care conține H110D, se decupează, se plasează într-un electroeluter (Atto) și eluția se realizează timp de 3 h la 1OW.

Electroeluantul H110D (denumit H110DE) se concentrează pe un Centriprep 10 (Amico) și tampon schimbat pe o coloană PD10 (Pharmacia) în 50 ml bicarbonat de amoniu per 0,07% SDS, se amestecă cu adjuvanți și apoi se injectrează la oi. Imunoglobulinele din ser se precipită cu sulfat de amoniu (Johnstone și Thorpe; 1982). Anticorpii precipitați se resuspendă la 60 mg/ml în fosfat salin tamponat, se dializează contra fosfat salin tamponat și se diluează 1:10 în Tris salin tamponat (TBS) care conține 5% g/v lapte praf degresat. Se prepară 10 mg ConA H110D pentru 0,5% SDS, se încălzește la 100°C timp de 3 min și se usucă pe un filtru de nitroceluloză. După spălări cu TBS care conține 0,2% v/v Tween 20 și

RO 117709 Β1

0,5% Triton-X-100 (TBSTT) filtrul este incubat timp de 1 până la 2 h la temperatura camarei, cu antcorpi pentru H110D. După spălarea filtrului 2 h cu TBSTT, anticorpii legați sunt eluați 740 cu 3 ml de 0,1 M glicină, 0,15M NaCI, pH 2,6, timp de 2 min și imediat pH-ul este ajustat la pH neutru, prin adăugarea de 75 μΙ de 1,5 M Tris pH 8,0. Acești anticorpi purificați prin afinitate, desemnați anti-H110D, sunt folosiți pentru cercetarea a 5x10⁵ pfu a băncii cADN Ăgt 11 australiene, cum s-a descris mai sus.

Se recombină 5x10^s recombinanți de la banca Ăgt11 derivată de la Haemonchus 745 contortus australian și se colectează 3 pozitivi, după cercetarea ulterioară, și se desemnează B1Ași B2.

Secvențarea clonelor pe B1A și B22

Cele două clone se digeră cu EcoRI, dând un singur insert de aproximativ 500 bp pentru B1A și 3 fragmente, B2A (aproximativ 400 bp), B2B (aproximativ 100 bp) și B2C 750 (aproximativ 100 bp), pentru B2. Acestea se subclonează în pBluescript SK⁺ (Stratagene) și se secvențializează folosind un Kit Sequenase 2,0 (United States Biochemicals).

Expresia clonelor M1 și B1A

Inserțiile M1 (Secv. ID. Nr.:1) și B1A( Secv. ID.Nr.: 2 și 3) se exprimă în E.coli, folosind un vector pGex (Smith și Johnson, 1988). Acest vector exprimă proteine la 755 terminusul C al glutation-S-transferazei (GST) de la Schistosoma japonicum. Inserțiile M1 EcoRI și B1A EcoRI sunt ligate la EcoRI tăiat, s-au folosit pGeX1 și se transformă în E.coli tulpina JM 101 conform metodelor descrise în Maniatis și colab., 1982. De la fiecare transformare se colectează 8 descendenți și se crește 2 ml de culturi timp de 6 h la 37°C.

Se adaugă IPTG pentru inducerea sintezei fuziunii proteinei și se continuă, peste noapte, 760 incubarea. Se recoltează celule prin centrifugare, se distruge prin fierbere în tampon probă Laemli, 1974) și extractele se analizează prin SDS-PAGE și prin pătare Western, folosind anticorpii de oaie purificați prin afinitate specifică pentru dubletul H110D denaturat SDS (antiH110D, vezi mai sus). Anticorpii legați se detectează folosind conjugat fosfataza alcalină anti-oaie IgG de iepure conjugat fosfataza alcalină (Jackson Immunoresearch), urmată de 765 dezvoltare de culoare cu 5-brom, 4-clor, 3-indolilfosfat (BCIP) și tetrazoliu nitroblue (NBT). Culturile clonelor imunopozitive se dezvoltă, induc un răspuns ca mai înainte și se distrug prin sonicare. Sonicatele se separă în fracțiuni solubile și insolubile prin centrifugare (centrifuga Sorvall RC-2B, rotor HS4, 7000 rpm, 30 min, 4°C). Peletele insolubile se resuspendă în 8M uree prin sonicare. iar probele fracțiunilor se examinează prin SDS-PAGE. 770 Fuziunea proteinelor se va găsi a fi în corpul incluzionat insolubil. Fiecare din aceste preparate se folosesc pentru a vaccina două oi la 150 pg fuziune proteică per doza în adjuvanți Freuds. Oile control pozitiv sunt imunizate cu proteina ConA H110D nativă și oile control negativ sunt imunizate cu proteina solubilizată de la E.coli care conține vectorul pGex fără un insert Haemonchus. Serurile de la oi vaccinate se analizează prin pătări Western 775 contra H110D.

Cercetarea băncii AZAP australiene prin hibridizare ADN cu inserții MHși B1A

Plasmizii ADN M1 și B1A (donați în pBluescript) se digeră cu EcoRI și se izolează inserții prin electroforeză în tampon TBE (Tris-Borat-EDTA; 89mM Tris-Borat, 89 mM acid boric, 2 mM EDTA, pH aproximativ 8,3) în gel agaroza 1%, urmată de purificare, folosind o 780 trusă GENECLEAN. Se repetă izolarea și purificarea pentru a evita contaminarea sondei cu secvențele plasmidului ADN, care ar hibridiza la secvența ĂZAP, producând nivele inacceptabile ale fondului. Inserțiile ADN purificate sunt marcate CU a-³²P-dCTP, folosind o trusă Nick Translation de la Promega Biotech, conform instrucțiunilor fabricantului. ADN-ul marcat este separat de marcajul neîncorporat prin spin cromatografie în coloană (Maniatis și colab., 785 1982). Se depune banca ĂZAP pe 8 plăci de 135 mm la 10⁵ pfu/placă, și plăale care au realizat ridicări, pe filtre nitrocelulozice (Maniatis și colab., 1982). După coacere într-un cuptor cu vid timp de 2 h, la 80°C, filtrele se prehibridizează timp de 2 h, apoi se hibridizează

RO 117709 Β1 peste noapte la 42°C (cum s-a descris mai jos în secțiunea de pată Southen). Patru filtre se cercetează cu sonda M1 și patru cu sonda B1A. Filtrele se spală de două ori în 2xSSC conținând 0,5% SDS, o dată în 1xSSC conținând 0,5% SDS și o dată în O,5XSSC conținând 0,5% SDS, toate la 50°C și se autoradiografiază. Plăcile potențial pozitive se colectează și se recercetează cu sondele. Se prepară stocuri cu fag cu titru înalt de la pozitivi confirmați (denumiți M1AUS pentru clona care hibridizează M1 și AustBI pentru clona care hibridizează B1A), și clonele se salvează în pBLUESCRIPT pentru ΛΖΑΡ conform manualului de instrucțiuni ale fabricantului (Stratagene), folosind ca gazdă tulpina BB4 de E.coii. Plasmizii ADN minipreparați ai descendentilor rezultați se prepară prin liza alcalină (Maniatis și colab., 1982) și se digeră cu EcoRI. Digeratele se analizează prin electroforeză în gel de agaroză.

Secvențarea inserției M1AUS

Secvențarea ADN se realizează pe plasmidul ADN pBLUESCRIPT folosind trusa Sequenase versiunea 2.0, United States Biochemicals, conform instrucțiunilor fabricantului. Pentru prima secvențare se folosesc. în vederea inițierii reacțiilor, primerii reacțiilor de la capetele secvenței vector. Datele secvențării, obținute de la aceste reacții, sunt folosite pentru a desemna o a doua pereche de primeri și, de la datele generate cu aceasta, a doua pereche de primeri se desemnează a treia pereche de primeri. în acest mod, ADN-ul s-a secvențat prin “walking along de la ambele terminații 5' și 3'.

Secvențarea insertulul AustBI

Aceasta se realizează folosind 2.0 polimeraza T7 (USB Biochemicals) așa cum este descris pentru secvențarea insertului M1AUS.

Reacții polimerazice de lanț

Prepararea cADN-ulul

Se prepară așa cum s-a descris pentru viermii adulți (U.K.), MARN (Ipg) de la H.contortus (U.K.) La 11 zile postinfecție, și se amestecă cu primer-adaptor T17 (5' GACTCGAGTCGACATCGATI I I I I l l I l l I l l ITT 3') dietilpirocarbonat (depc) tratat cu apă, apoi se încălzește la 65°C timp de 5 min și se plasează imediat pe gheață. Se adaugă hidroxid de metil mercuric până la o concentrație finală de 28,6 mM, și amestecul este incubat la temperatura camerei 3 min. Se adaugă 2-mercaptoetanol până la o concentrație finală de 14,2 mM, și amestecul se plasează pe gheață. Pentru sintetizarea cADN, se adaugă RNază Guard (Pharmacia) până la 1 unitate/μΙ, tampon Reverse Trancriptase (Life Sciences) până la 2 unități/μΙ (toate date concentrații finale). Reacția se incubează la 41 °C timp de 75 min, apoi se extrage cu fenol și cloroform și se purifică printr-o coloană de spin cromatografie (Maniatis și colab., 1982). Amestecul de reacție purificat se diluează de 2,5 ori și se depoziteză la 4°C.

Amplificarea PCR a cADN-ului folosind primeri M1 AUS specifici

Reacțiile PCR se realizează folosind un cicler termic programabil (M. J. Research Ing.). Amestecul de reacție conține în afară de 1 μΙ de cADN diluat 250 μΙ, preparat cum s-a descris mai sus, 25 pmoli din prima bandă a primerului adaptor T17, 25 pmoli din primerul de amplificare pentru a doua bandă, fie cel bazat pe pozițiile 865-884 (5' ACGGGTGTTCGGTTCCGTAT 3') sau cel bazat pe pozițiile 30-49 (5' GCTGAATC TAACTCCAATCC 3') ale secvenței M1AUS (Secv. ID Nr.: 5), tampon 1xTaq (Notddumria Biologicals Ltd.) și 0,5 mM de fiecare dATP, dTTP, dGTP și dCTP, într-un volum de reacție de 100 μΙ și se acoperă cu 40 μΙ ulei mineral pentru prevenirea evaporării. Acest amestec este încălzit apoi în ciclerul termic la 95°C, 2 min apoi este ținut la 72°C. în acest timp se adaugă 2 unități de polimerază Taq și se amestecă cu blândețe cu ceilalți reactanți. S-a realizat apoi în ciclerul termic următorul program:

Etapa 1 Normalizarea la 5O°C timp de 5 min

Etapa 2 Extinderea la 72°C timp de 40 min.

RO 117709 Β1

Etapa 3 Denaturare la 94°C timp de 40 secunde

Etapa 4 Normalizare la 50°C timp de 2 min

Etapa 5 Extinderea la 72°C timp de 3 min

Etapa 6 39 cicluri de etape 3 la 5

Etapa 7 Extindere finala la 72°C timp de 15 min

Etapa 8 Păstrare la 40°C

Aceste condiții au fost stabilite de Frohman și colab., 1988.

Clonarea produselor PCR

Produsele PCR din reacțiile de mai sus se separă prin electroforeză în gel de agaroză. Benzile de ADN de aproximativ 2,5 și 3,5 kb se electroeluează pe fibre de sticlă (Whatman) se extrage cu fenol și se purifică prin cromatografie G50 (Pharmacia Sambrok și colab., 1989), ADN-ul purificat este ligat în vectorul pT7BlueT (Novagene) urmând instrucțiunile fabricantului.

Secvențarea produselor PCR de 2,5 kb și 3,5 kb

Secvențarea ADN-ului se realizează cu o trusă Sequenase 2,0 (US Biochemicals) folosind tehnica Oligonucleotide walking” descrisă în secțiunea privind secvențarea M1AUS.

Reacții de polimeraze în lanț pentru terminațiile 5'

Prepararea primei benzi cADN

Se amestecă 1 pg de mARN la 11 zile post-infecție Haemonchus contortus (U.K.) preparat așa cum s-a descris pentru viermi adulți, cu un primer constant (5' AATGAAAG CGGATGGCTTGATGC 3' desemnat de la o regiune conservată din AustBI și produsele 2,5 kb PCT și 3,5 kb PCR (Secvențe ID Nr.: 6, 7 și respectiv 8). Amestecul se încălzește la 65°C timp de 5 min, se plasează pe gheață și se adaugă hidroxidul mercuric până la o concentrație finală de 28,6 mM. Amestecul este incubat la temperatura camerei timp de 5 min, se adaugă 2-mercaptoetanol până la o concentrație finală de 14,2 mM și amestecul se plasează pe gheață. Prima bandă ADN se prepară folosind reactivul din sistemul 5'RACE (Gibco/BRL) la o concentrație finală de 20 mM Tris/HCI, pH 8,4, 50 mM KCI, 2,5 mM MgCI₂, 100 pg/ml BSA, 0,5 mM de dATP, dCTP, dGTT, dTTP. Se adaugă 200 unități Superscript Reverse Transcriptase și reacția se incubează la 42°C timp de 30 min și apoi se încălzește la 55°C timp de 5 min. Se adaugă RN-aza H până la o concentrație finală de 100 unități/ml, se incubează reacția la 55°C, 10 min și apoi se plasează pe gheață. cADN-ul se purifică printr-o coloană Glassmax spin (Gibco/BRL) și se depozitează la -20°C.

Prelucrarea cozii C a cADN-ulul

Se încălzește 1/5 din prima bandă cADN la 70°C timp de 5 min, apoi se răcește pe gheță 1 min. Se adaugă reactivii din sistemul 5' RACE (Gibco/BRL) până la o concentrație finală de 10mM Tris/HCI pH 8,4, 25 mM Kcl, 1,25 mM MgCI₂, 50 pg/ml BSA, 0,2 mM dCTP. Se adaugă 500 unități/ml Terminal Transferase și reacția se incubează la 37°C timp de 30 min, apoi se încălzește la 70°C timp de 15 min și se depozitează pe gheață.

Amplificarea PCR folosindprimeri specifici AustBI, 2,5 kb PCR și 3,5 PCR

Reacțiile PCR se realizează într-un Thermal Cycler programabil (M. J. Research Inc.). Pentru terminația 3' se folosește unul dintre următorii primeri.

1. Un primer specific pentru produsul PCR 2,5 kb pe pozițiile 374 la 394 (5'TGTTGTGGCTAATTTCGTCCA 3').

2. Un primer specific pentru produsul 3,5 kb bazat pe pozițiile 1210 la 1229 (5' GACCATCGCTGATGAAGTCGG 3').

3. Un primer specific pentru clona cADN austbl bazat pe pozițiile 357 la 377 (5' GACCATCGCTGATGAAGTCGC 3’).

Pentru terminația 5' a reacțiilor se folosește un primer comun (“Anchor primer”) (5' CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGTTGGGTTGGGTTG 3'). Fiecare

840

845

850

855

860

865

870

875

880

885

RO 117709 Β1 amestec de reacție conține 4 pl din primeri corespunzători, tampos Ixpolimeraza Taq (Boehringer Mannhein) și 0,5 mM fiecare dintre dATP, dCTP.dGTP și dTTP, până la un volum final de 100 μΙ. Acest amestec se acoperă cu 50 μΙ ulei mineral și se încălzește până la 95°C în cicler timp de 2 min. Amestecul de reacție se menține la 80°C, adăugându-se în acest timp 0,6 unități polimerază Taq, și apoi este trecut în următorul program:

1. Normalizarea la 50°C timp de 50 min.

2. Extinderea la 72°C timp de 10 min.

3. Denaturare la 94°C timp de 45 sec.

4. Normalizare la 50°C timp de 1 min.

5. Extinderea la 72°C timp de 2,5 min.

6. 39 cicluri conform etapelor 3 la 5.

7. Extindere la 72°C timp de 15 min.

8. Menținere la 4°C.

Clonarea produselor PCR 5'

Produsele PCR se separă prin electroforeză pe un gel de agaroză, și benzile de mărime așteptată, circa 1,3 kb, se decupează. ADN-ul se purifică folosind o trusă GENECLEAN și este ligat în vectorul pT7Blue (Novagene) conform instrucțiunilor fabricantului.

Reacția polimerazică de lanț pentru producerea terminației 3' a AUSTB1

Prima bandă de ADN folosită este cea descrisă pentru producerea cADN pentru utilizare cu primeri M1 AUS. Se folosește un primer specific de la 1414 la 1435 (5' TCTTGAAGAAATGAAAAAAGCTT 3') din AustBI (Secv. ID Nr. 6) cu primerul adaptor T17 folosit pentru PCR M1AUS și reacțiile se realizează într-un cicler termic (M.J.Research Inc.). Amestecul se reacție a constat din 255 moli de fiecare primer, 2 μΙ cADN, tampon Ixrazaq (Boehringer Manhain), 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP și dTTP în 100 μΙ). Acestea se acoperă cu 50 μΙ ulei mineral și se încălzește la 95°C timp de 2 min, se adaugă 0,6 μΙ de polimerază Taq și se realizează același ciclu de program ca pentru PCT 5' descrisă mai sus.

Clonarea și secvențarea produselor 3'

Produsele PCR se separă prin electroforeză într-un gel de agaroză, se decupează banda de mărime așteptată, 1,4 kb, și ADN-ul purificat cu un kit GENECLEAN și este ligat într-un PCR-Script (Stratagene) conform instrucțiunilor fabricantului.

Secvențarea produselor PCR donate

ADN-ul de la clonele PCR se secvențiază folosind un kit Sequenase 2,0 (United States Biochemicals) conform instrucțiunilor fabricantului. Primerii oligonucleotidici se folosesc pentru Walk along, a ADN-ului clonelor de la ambele terminații 5' și 3'.

Analiza secvențelor ADN integrate

Secvențele se analizează folosind GCG-ul (Genetics Computer Group) Sequence Analysis Software Package, Devereuxși colab., 1984.

Analiza Blot Northern și Southem

Prepararea petelor Northern

Petele Northern se realizează în geluri de formaldehidă, în special cum se descrie în Manitia și colab., 1982. Probele de mARN (de la H.contortusîn vârstă de 11,15 și 23 zile) se tratează cu 17,5% v/v formaldehidă și 50% formamidă în tampon MOPS (20 mM acid 3(N-morfolin)propansulfonic, pH 7,0, 8mM acetat de sodiu, 1 mM EDTA, la 65°C, 15 min și se răcește pe gheță. Gelurile se supun electroforezei în tampon MOPS și se pătează pe membrane Duralon prin transfer capilar, cum se descrie în Sambrook și colab., 1989.

Prepararea petelor Southern

Se triturează în azot lichid 2 g adulți Haemonchus contortus care anterior este înghețat brusc în azot lichid, până la o pulbere fină. Pudra se adaugă ușor la 25 ml tampon de liză (0,05 M Tris/HCI, pH 8, 0,1 EDTA, 1% g/v sarcozil, 0,05 mg/ml proteinază K (Boehringer

RO 117709 Β1

Mannheim) și se incubează 2 h la 65°C. Suspensia se extrage apoi de 2 ori cu un volum de fenol+cloroform, de două ori cu două volume de cloroform și se precipită cu etanol, ADN-ul genomic precipitat se resuspendă în 20 ml Tris, tampon EDTA (TE, pH 8), peste noapte la 4°C pe un suport cu balansare, apoi se dializează contra câte unui litru TE (21). ARN-ul se îndepărtează prin incubare cu DN-ază lipsită de RN-ază A Tip (Sigma) la o concentrație finală de 20 pg/ml, la 37°C timp de 1 h, a urmat o extracției cu fenol-cloroform, o extracție cu cloroform și precipitare cu etanol ca mai sus. Peleta de ADN genomic precipitat se spală de două ori cu 70% v/v etanol, și resuspendat într-un ml TE, ca mai sus.

ADN-ul genomic se digera cu EcoRI sau HindiII (25 pg de ADN în fiecare digerat) peste noapte, la 37°C apoi se supune electroforezei la 5 pg per traseu pe un gel 1% agaroză în tampon Tris-acetat. Gelul se pătează Soutern prin transfer capital cum se descrie în Maniatis și colab., (1982) pe membrana Hybond-N (Amersham Internațional). ADN-ul se fixează pe membrane folosind lumina ultraviolet, conform recomandărilor fabricantului.

Prepararea sondelor

Plasmidele pBLUESCRIPT, care conțin inserțiile M1AUS, B1A sau AustBI, se digeră cu EcoRU. Plasmidele pT7 Blue conținând inserțiile produsului 3,5 kb PCR se digeră cu BamHI și cei conținând inserțiile produsului 2,5 Kb PCR se digeră cu BamHI și Xbal. Digeratele se supun electroforezei, se recuperează inserțiile și se marchează radioactiv prin Nick Translare cu a-³²P-dCTP, așa cum se descrie mai sus la cercetarea băncii ĂZAP.

Condiții de hibridizare

Pentru pete Southem

Membranele se taie în fâșii și se prehibridizează în tampon cum s-a descris mai devreme, timp de 3 h la 28°C. Fâșiile ADN genomic pătate Southem se hibridizează peste noapte la fiecare din sondele de mai sus la 29°C, se spală de două ori la temperatura camarei (24°C apoi de două ori la 42°C, în 2xSSC conținând 0,1% SDS stringent moderată) și se autoradiografiază. După dezvoltarea autoradiografiilor, fâșiile se spală din nou la o stringență înaltă (0,1xSSC, 0,1% g/v SDS la 65°C) și se reautografiază.

Pentru pete Northem

Pentru Sonde M1, M1AUS și B1A (Secv. ID Nr. 1,5 și respectiv 2)

Pata Northem a mARN-ului de la Haemonchus contortus în vârstă de 11, 15 și 23 zile se sondează inițial cu inserția M1. Filtratul se prehibridizează pentru 2 h la 48°C în 2xSSC (unde 2OxSSC este egal 3M NaCI, 0,3M citrat de sodiu, pH 7,2) conținând 5xDenhardt (0,1% g/v Ficoll 400 (Pharmacia), 0,1% polivinipirolidonă, 0,1% albumină serică bovină fracțiunea V (Sigma Chemical Corp.)), 0,5% SDS (dodecilsulfat de sodiu), 10% dextran sulfat, 0,1 mg/ml ADN din icre de somon și 50% formamidă deionozată. Hibridizarea la sondă se realizează peste noapte la 42°C în același tampon. Filtrele se spală de două ori timp de 30 min în 2xSSC conținând 0,5% SDS și 50% formamidă, de două ori timp de 30 min, în 2xSSC, conținând, 0, 5% SDS și de două ori timp de 30 min în 2xSSC. Prima spălare este la 42°C, și toate celelalte care urmează, la 37°C. După autoradiografiere, pata se desprinde prin spălare în 0,1% SDS fierbinte și se reautografiază până la asigurarea îndepărtării sondei. Aceeași pată este sondată apoi cu insertul M1AUS, spalată și autoradiografiată. Pata este din nou desprinsă și păstrată până a devenit clară, și se testează cu inserția B1A. După ce se desprinde din nou, pata se sondează cum se descrie mai jos.

Pentru sonde AustBI se produce PCR 2,5 kb și 3,5 kb (Secv. ID Nr.: 6, 7 și 8).

Pata Northern se hibridizează cu insertul AustBI, folosind condiții de stringent moderată, cum se descrie pentru hibridizarea petei Southem. După autoradiografiere, pata se desprinde cu 0,1% SDS fierbinte conform instrucțiunilor fabricantului membranei (Amersham), apoi se sondează cu inserția 2,5 kb PCR (clona 2), se desprinde și se sondează cu insertul 3,5 kb PCR (clona 2).

940

945

950

955

960

965

970

975

980

RO 117709 Β1

Digestia H110D și cercetarea activității enzimatice

Prepararea H110D

Se prepară H110D nativă (H110DN) conform metodelor descrise în W088/00835 și

90/11086.

Prepararea unui fragment elastază (h11s) al H110D

Se omogenizează adulți Haemonchus în volume de gheață PBS rece/0,02% azidă de sodiu și apoi se centrifughează timp de 20 min la 13000 rpm. Peleta se resuspendă în 10 volume de PBS per azidă, reomogenizat, și se repetă centrifugarea. După resuspendare, în 50mM tampon MOPS, pH 7,4 (volumul pentru suspensie este 1 ml pentru fiecare 0,17 g viermi) și preîncălzire la 37°C timp de 30 min, materialul peletei se digeră cu elastază (800 μΙ/20 ml suspensie; 1 mg/ml soluție stoc proaspătă adusă la 1 mm HCI/2mMCa²⁺) pentru 1 h. Digestia se oprește prin adăugarea de 3,4-diclorrizocumarină (300 μΙ de stoc 10 mM în DMSO/20 ml de digerat). Amestecul se centrifughează la 13000 rpm timp de 20 min și se reține peleta. Supernatantul se ultracentrifughează la 100000 g timp de 1 h și 20 min. Lichidul supematat obținut se aplică la o coloană ConA și se obțin fracțiunile legate. Pentru analiză, această fracțiune este pusă pe un gel SDS-poliacrilamidă și se transferă electroforetic la o membrană difluorură de poliviniliden (Immobilon P, Millipore), colorată cu Coomassie blue, se excizează banda de 105 kg și se analizează într-un secvențator de aminoacizi, în fază gazoasă. Pentru studiul de vaccinare ConA, sunt purificate prin concentrare și aplicare la o coloană de filtrare cu gel Sepharose 12 (Pharmacia) și colectarea acelor fracțiuni care conțin activitate aminopeptidazică.

Digestia H110D cu termolizină

Dubletul H110D se purifică prin electroeluție de la un gel preparat 8% SDS-poliacrilamidă pentru a obține H110D, așa cum este descris în WO 90/11086, și prin eluția unei forme dimere, începând exact peste 200 kd, (care a dat dubletul caracteristic la 110 kd, când se repune pe SDS-PAGE) pentru a obține H110D. Soluțiile de H110D se concentrează până la 200 μΙ, se adaugă clorură de calciu până la 5 mM și amestecul se încălzește la 37°C. Se adaugă o soluție proaspăt preparată de termoliză per 1 mh/ml (în 1 mM HCI, 2 mm CaCIJ în raport de 0,1 pg H110D. Amestecul se incubează la 37°C timp de 120 min.

Fragmentele proteice se separă prin electroforeză la gel 15% SDS-acrilamidă și se transferă electroforetic la membrană difluorură de poliviliden (Immobilon-P, Millipore). După colorare cu Coomasie blue, benzile discrete cele mai intens colorate se excizează și se analizează într-un secvențiator de aminoacizi în fază gazoasă.

Prepararea unei fracțiuni H110D (H11A), îmbogățită pentru activitatea aminopeptidazică A

Materialul peletat, obținut după tratament cu elastază prin centrifugare la 17000 g, timp de 20 min (vezi mai sus) se resuspendă în PBS la 4°C și se repeletează prin centrifugare, se resuspendă în 1% Tween în PBS/azidă și lăsat (cu agitare) 1 h. Suspensia se centrifughează la 17000 g, 20 min și se îndepărtează supernatantul. Peleta este extrasă repetat cu 1% Thesit în PBS/azidă. Supernatantele, după centrifugare la 17000g, 20 min se combină și ultracentrifughează timp de 1 h 20 min, la 100000 g. Supernatantul se aplică la o coloană de afinitate ConA (Affigel, Biorad) și materialul legat se eluează ulterior, fracționându-se prin cromatografie de schimb ionic pe o coloană MonoQ.

Cercetări ale activității enzimatice

Activitățile aminopeptidazei α-aminopeptidhidrolazei (microzomale) din preparatele H110D se caracterizează prin cercetări, în soluție, folosind 1-leucină, metionină, fenilalanină, acid α-glutamic și lizin-p-nitroanilină (pNA). Toate substraturile aminoacide-nitroanilină (cu excepția acidului α-glutamic) se obțin de la Sigma, Poole, Doset U.K., iar acidul a-glutamic

RO 117709 Β1 de la Fluka, Dorset U.K. Pentru măsura efectului inhibitorilor enzimatici și inhibiția serului asupra activităților aminopeptidazice H110D, se aleg doar aminoacizi hidrofobi (leucina sau fenilalanina) și încărcați (acid α-glutamic) pNA cunoscuți a fi substraturi pentru aminopeptidazele -M(ApM) și respectiv -A(ApA) de mamifere.

(a) Cercetare pe microplacă

Microplăci ELISA (Dynatech Immulon 1, Virginia, SUA) scobite se umple fiecare cu 250 pl din fracțiunea de cercetat. Plăcile sunt apoi preincubate la 37°C timp de 10 min înainte de a adăuga 10 pl de 25 mM substrat aminoacid p-nitroamilidă per godeu. Se măsoară apoi momentul zero al densității optice (OD) la 405 nm folosind un cititor de placă ELISA, și plăcile se incubează apoi la 37°C, 15...30 min. Se citește apoi OD finale, ca înainte, și se calculează schimbarea OD per minut per mg de proteină.

(b) Sensibilitate la inhibitori

Metoda folosită pentru cercetarea enzimei este ca cea descrisă mai sus, la (a), cu excepția faptului că inhibitorii se adaugă la 250 μΙ tampon + 10 μΙ de ConA H110D 1 mg/ml, și se preincubează 10 min la 37°C înainte de adăugarea substraturilor (leucină-pNA sau acid α-glutamic-pNA). Procentul de inhibare se calculează după cum urmează:

x-y

--------_x 1OO = procentul de inhibare x

unde y=AOD/min de enzimă cu inhibitor și x=AOD/min de enzimă fără adaugare de inhibitor.

Se testează individual 9 compuși cu diferite clase de enzime de inhibare: Amastatin, Bestatin, (metalprotează aminopeptidază), 1,1+-fenantrolină, EDTA (metalprotează), fosforamidon, (metalprotează, termolizină. colagenază), aprotinin, (serinprotează), pepstatin, (protează aspartică), PMSF (serin și cisteinproteaza) și E64 (cistein proteaza). Amastatin, Bestatin, 1,10-fenantrolină, PMSF și pepstatin se obțin de la Boehringer-Mannhein. Fiecare inhibitor se folosește la două concentrații egale, sau mai mari decât maximul concentrațiilor recomandate de către BoehringerMannhein.

(c) Cercetarea antiserului inhibitor al enzimei

Testul se face cum este descris mai sus la (a), cu excepția faptului că se pregătesc două plăci micro-ELISA. într-o placă preincubată la 37°C timp de 15 min, 10 μΙ ConA H110D (1 mg/ml) plus 10 μΙ antiser de la fiecare oaie per godeu. A doua placă, cu 250 μΙ HEPES/bicarbonat plus 10 μΙ de fie fenilalanină-pNA, fie acid a-glutamic-pNA drept substrat pe godeu se preincubează, de asemenea, la 35°C timp de 15 min. Se adaugă apoi amestecurile ConA H110D-ser la amestecurile tampon substrat din cea de-a doua placă, cu ajutorul unei pipete multiple, se determină AOD/min. în vederea cercetărilor, se calculează procentul de inhibare folosind formula din (b) de mai sus, unde:

x reprezintă media AOD/min pentru godeurile care conțin enzima plus ser de la oile de control negative (vaccinate cu feritină splenică de la cal) și y reprezintă AOD/min pentru godeurile care conțin enzima plus ser de la oi individuale vaccinate cu H110D. în vederea corelării (fig. 18), procentul de protecție se calculează folosind formula din (b) de mai sus, unde x= fie medie de ouă eliminate prin fecale/g, fie media încărcării cu viermi paraziți a controalelor și y=ouă din fecale/g, eliminate în timpul experimentului sau încărcarea cu viermi paraziți a oilor individuale vaccinate cu H110D.

Localizarea activității enzimatice prin histochimie

Activitatea aminopeptidază se demonstrează pe 10 pg de secțiuni criostatate de adult Haemonchus contortus folosind L-leucină 4-metoxi-Ș-naftalină și acid 1-a-glutamic 4-metoxi β-naftilamidă ca substraturi, prin metodele lui Nachlas și colab., 1957, Nakane și colab., (1974) și Lojda și colab., (1980).

1035

1040

1045

1050

1055

1060

1065

1070

1075

1080

Expresia recombinantulul H110D în sistemul eucariot baculovirus celule de insectă

Construcția plasmidelor de expresie

Fragmentele 3,5 k PCR descrise mai sus, se generează prin amplificare între un adaptor oligo dT (care a conținut un sit SAII) și oligo 872, care reprezintă bazele numerele

30...49 din secvența M1AUS, și se donează în vectorul pT7 Blue. Clona pT7 3,5...2 este orientată cu situl BamHI al vectorului polilinker la terminația sa 5' și siturile Hindlll, Xbal și Sall la terminația 3'.

Secvența la terminația 5' este:

BAMHI x!-----oligop 872------!-3,5K------5' GG ATC CGA TTG CTG AAT CTA ACT CCA ATC C.......3'

Leu Asn Leu Thr Pro lle............

Asterixul indică proeminența 3' dT/dA folosită pentru donare în vectorul pT7Blue.

Clona 2 3,5 PCR se digeră cu Hindlll (unicul sit în secvența vector polilinker la căpătui 3' al genei 3,5 k) și capetele sunt umplute cu deoxinucleotide folosind ADNpolimeraza I (fragment Kleonow), conform cu Maniatis și colab., (1982). Un linker BamHI (5'CGCATCCG 3', New England Biolabs Catalog nr. 1021) este ligat la capetele teșite, și se aleg clone cu un extras sit BamHI, care permit ca o secvență a genei H110D cu lungimea integrală să fie excizată ca un fragment BamHI. Fragmentul BamHI se izolează prin electroforeză pe un gel de agaroză 6% g/v în tampon Tris-acetat, și se purifică ulterior folosind GENECLEANT (BIO 101); această procedură se realizează de două ori. Fragmentul purificat este apoi ligat la tăiatul-BamHI, pBlueBacll fosfat (Invitrogen Corp.) și clonele purtătoare ale fragmentului orientat corect (adică cu capătul 5' al clonei 2 3,5 PCR plasat sub controlul promotorului poliedrinei baculovirale se determină prin digestia cu Nhel si Xbal. Plasmidul rezultat se digeră parțial cu BamHI, și capetele se completează cum se descrie mai sus. Se adaugă un linker Ncol, conținând un ATG (5' CCCATGGG 3' New England Biolabs Catalog Nr. 1040) și amestecul este ligat. Clonele care au avut linkerul ligat la capătul 5' sit BamHI al clonei 2 3,5 PCR, mai degrabă la căpătui 3‘, se determină prin digestie Ncol. Plasmidul rezultat, desemnat pBB3,5-2(N), este prezentat ca diagramă în fig. 19.

Această construcție rezultă din inserția unui ATG în cadru la căpătui 5' al insertului clonă 2 3,5 PCR pentru inițierea translării. Secvența încurajatoare a acestui ATG de inițiere este

BamHI-Ncol link-BaMHI------*!-------oligo 872-------! —

5' GGATCCCC ATG GGG ATC CGA TTG CTG AAT CTA ACT CCA ATC CMet Gly lle Arg Leu Leu Asn Leu Thr Pro lle

Proteina exprimată va fi lipsită de aminoacizii 2...9 ai secvenței H110D corespunzătoare, și va avea 3 aminoacizi ai secvenței linker imediat următori ATG-ului.

Generarea baculovirusului recombinat care conține secvențe H110D > >

Plasmidul pBB3,5-2(N) este transfectat în celule (sf9 Spodoptera frugiperda (de la Invitrogen Corp.), folosind virusul ADN liniar al poliedrozei nucleare la Autographica califomica (ACNPV) și lipozomi cationici (Invitrogen Corp.). Modul de transfecție este conform instrucțiunilor fabricantului. Celulele se cultivă în mediu TC-100 (Sigma) suplimentat cu un ser fetal de vițel (CSL Ltd.; inactivat termic la 56°C, 45 de min și antibiotice (penicilină/streptomicină, gentamicină: CSL Ltd.). Se realizează, de asemenea, un control de transfecție folosind un plasmid pBB 3,5-2(N) cu ATG-ul inserat la căpătui 3' al secvenței clonă 2 3,5 PCR. Plăcile recombinante se selectează pe baza faptului că vectorul pBlueBacll

1130 codifică și β-galactozidază E.coli (-gal), și se include x-gal în agaroza de acoperire la nivelul

RO 117709 Β1 recomandat. Se culege o selecție de plăci albastre și se supune la două runde ulterioare de purificare de placă, după care, în momentul infectării monostraturilor, se observă că nu au prezentat nici un fel de contaminare cu virusul de tip sălbatic care ar putea fi evidențiat prin prezența unor poliedre nucleare. Virusurile purificate se desemnează 3.5-2-P2A, P3A și P4A și se amplifică prin două infecții secvențiale ale celulelor sf9 utilizate mai înainte. 0 placă purificată de la controlul de transfecție se desemnează 3,5-2-rev.

Cercetarea expresiei H110D în celulele de insecte infectate cu baculovirus recombinant

Se infectează monostraturi de celule sf9 (1X10⁶ celule în vase de 25 cm²) cu virusuri 3,5-2, virusul de tip sălbatic (wt), cu un virus de control care exprimă β-gal, sau nu a fost infectate. După patru zile creșterea, la 26°C, se detașează monostraturile prin scuturare ușoară, se recuperează celulele prin centrifugare (2000 rpm, 10 min), și peletele celulare se distrug prin trei cicluri înghețare-dezghețare. Lizatele se resuspendă în 500 μΙ PBS și se cercetează prin activitate ApM, alicoți de 25 μΙ prin testare pe microgodeu.

Se supune electroforezei pe geluri SDS-poliacrilamidă 7% denaturate alicoți de 15 μΙ (echivalenți 3 x 10⁴ celule) din lizatele de mai sus. Unul dintre geluri se colorează apoi cu Coomasie Blue pentru testarea nivelurilor de expresie. Alt gel se pătează Western și pata se sondează cu anti-H110D (cum se descrie mai sus).

Rezultate

Analiza clonelor imunopozitive

Analiza anticorpilor purificați prin afinitate asupra M1

Se prepară și folosește pentru a sonda o pată Western a extractului H110D îmbogățit cu anticorpi specifici purificați prin afinitate pentru fiecare din cele cinci clone anticorppozitive. Așa cum se arată în fig. 8, toate 5 clonele par a recunoaște dubletul H110D. Totuși, reacția cu clona Ml a dat cel mai puternic semnal (fig. 8d) comparativ cu pata de control negative Ăgt 11 (fig. 8e). De aceea, această clonă a fost investigată în continuare.

Analiza petei Northem Blot cu clona M1

Analiza petei Northem a mARN-ului de Haemonchus contortus sondat cu insertul Ml se prezintă în fig. 9. Se recunoaște o singură bandă MARN, la aproximativ 3,5kb. Aceasta este de mărime suficientă pentru a codifica o proteină de aproximativ 110 kd.

Analiza secvenței clonei M1

Analiza digeratelor de restricție ale ADN-ului cu EcoRI arată insetul M1 de aproximativ 300 bp. Secvența ADN a fragmentului M1 se determină și este arătat în fig. 3. Fragmentul conține 295 bp, cu un cadru deschis de citire începând la baza nr. 3.

Analiza Northern Blot cu clona B1A

Analiza petei Northem a mARN-ului Haemonhus contortus s-a sondat cu inserul BIA și este prezentată în fig. 9e. Ca și pentru M1, s-a recunoscut o singură bandă mARN, la aproximativ 3,5 Kb.

Secvențarea clonelor B1A și B2

Clonele B1A se secvențează (Secv. ID Nr. 2 și 3) și secvența întreagă (Secv. ID. 2) se prezintă aliniată la H11-1 (Secv. ID. Nr 19) și AustBI (Secv. ID. Nr. 6) în fig. 5. Insertul este de 484 bp și are un ORF întreg de la prima bază. Cele 3 fragmente ale B2 care rezultă din digestie cu EcoRI se secvențează, și secvența completă pentru H11-2 este prezentată în fig. 4. Secvența are un ORF de la poziția 3 până la 213 bp, codonul stoc și regiunea netranslată care împerechează pe cea a secvenței produsului 2,5 kb PCR (Secv. ID Nr. 7).

Expresia M1 și B1A în E.coli

Când se donează într-un vector de expresie GST, se obțin clone care exprimă fuziunea proteinelor de 38-40 Kd pentru M1 și 45 kb pentru B1A. Acestea concordă cu mărimea presupusă pentru acești inserți, permițând greutatea moleculară a glutation-S-transferazei.

1135

1140

1145

1150

1155

1160

1165

1170

1175

RO 117709 Β1

Ambele fuziuni proteice reacționează foarte puternic pe pete Western cu anticorpi purificați prin afinitate pentru H110DE (fig. 11). Fuziunea proteinelor se exprimă sub formă de corpuri de incluziune insolubile.

Răspunsuri ale anticorpilor în oi vaccinate cu fuziuni proteice M1-GST și B1A GST.

Se testează antiseruri de la oi injectate cu fuziuni proteice prin pătare Western contra preparate H110D. Atât GST-M1 cât și GST-B1A provoacă anticorpi care recunosc specific dubletul H110D (fig. 12). Seruri de oi de control negative nu recunosc dubletul H110D.

Izolarea și caracterizarea clonelor selectate prin hibridizare cu insertul ADN M1 sau B1A

Clona confirmată pozitivă care hibridizează la sonda M1 se desemnează M1AUS (Secv. ID Nr. 5), Aust B1 (Secv. ID Nr. 6). Digestia de restricție a ADN-urilor plasmidice cu EcoRI indică un insert de mărime de aproximativ 900 bp pentru M1AUS și de aproximativ

1,6 kb pentru AustBI. Așa cum se arată în fig. 9b) și 9d), pe pete Northern, M1AUS și AustBI hibridizează la mARN-ul de aceeași mărime (aproximativ 3,5 kb) cum au făcut M1 și B1A.

Analiza secvenței M1AUS

Secvențarea întregului fragment M1AUS se realizează folosind oligonucleotide sintetice pentru walk along ADN-ului de la fiecare capăt. Analizele secvenței obținute arată că insertul M1AUS este de 948 bp, cum se arată în fig. 3. Secvența (Secv. ID Nr. 5) începe cu ATG (care codifică metionina) și are un cadru deschis de citire (ORF) pe întreaga sa lungime. Secvența este cu 19 baze perechi mai mare decât secvența M1 la capătul 5' și cu 634 bp mai lungă la căpătui 3'. Secvența comună pentru cele două clone (bazele 20 la 314) este identică exceptând două diferențe nucleotidice în poziția celui de-al lll-lea codon. Comparația tuturor cadrelor de citire posibile la diveme baze arată că începând cu ATG-ul de la baza nr. 1, cadrul de citire prezintă omologie cu membrii unei familii de aminopeptidaze microzomale.

Secvența lui AustBI

Secvențarea integrală a fragmentului AustBI se realizează folosind oligonucleotide sintetice pentru “plimbare de-a lungul· ADN-ului de la fiecare capăt. Secvența ADN (Secv. ID. Nr 6) este arătată în fig. 5. Clona de 1689 bp lungime și are un ORF de la restul 2. Această secvență formează partea lui H11-1, precum cea arătată în fig. 1. Translarea aminoacidă a acestei secvențe prezintă motivul sitului de legare a zincului caracteristic aminopeptidazelor.

Amplificarea PCR a cADN-ului. mARN-urilor PCR H110D folosind primeri M1AUS

Se sintetizează cARN Haemonchus contortus folosind ca primeri oligo-dT conținând o secvență adaptor care facilitează donarea și manipularea ulterioară a ADN-ului. Acest cADN se folosește apoi pentru a amplifica secvența M1AUS prin PCR, folosind ca primeri de terminare 5' o oligonucleotidă sintetică bazată pe pozițiile 865-885. Se amplifică un fragment PCR de aproximativ 2,5 kb. Aceasta este mărimea aproximativă, așteptată, a fragmentului, bazat pe mărimea cunoscută a mARN-ului și pe secvențele cADN ale aminopeptidazei de la mamifere.

Un al doilea set de reacții PCR se realizează folosind un primer lângă capătul 5' al M1AUS (bazele 30-49). Se detectează 4 benzi pe un gel de agazoză. Cel mai mare dintre acestea, la 3,5 kb, corespunde mărimii presupuse pentru produsul PCR:

donarea și secvențarea produselor PCR de 2,5 kb și 3,5 kb de la primeri M1AUS

Se donează produsele PCR 2,5 kb și 3,5 kb și sunt destinate 2,5 PCR (Secv. ID. Nr. 7) și 3,5kb (Secv. ID. Nr. 8, 14 și 15 pentru clonele 2, 10 și respectiv 19). Pe peretele Northern 2, 5 PCR și 3,5 PCR (Clona 2, 3,5 PCR-2) hibridizează cu mARN de aproximativ

3,5 kb (fig. 9 e, f) în aceeași origine (respectând vârsta pentru Haemonchus care se folosește pentru obținerea de mARN) ca M1, B1A, M1AUS și AustBI.

RO 117709 Β1

Secvențarea integrală a clonelor se realizează prin “oligonucleotide walking. Așa cum se arată în fig. 1, secvența pentru produsul 2,5 kb (Secv. ID. Nr.7) este parte a H11-2 (Secv. ID Nr. 20) și secvența pentru produsul 3,5kb (Secv. ID. Nr. 8) este partea principală a H11-3 (Secv. ID. Nr. 21). Translațiile aminoacide ale ambelor aceste secvențe (arătate în fig. 6) motivul de legare a zincului His Glu Xaa Xaa His Xaa Trp (HEXXHXW) caracteristic aminopeptidazelor microzomale.

Secvențarea clonelor PCR ale capătului 5'

Se sintetizează cADN folosind un primer care împerechează o secvență conservată din clona cADN AustBI, 2,5 PCR și 3,5 PCR (Secv. ID. Nr. 6, 7 și 8) care hibridizează cu mARM-ul pentru aceste secvențe aproximativ 1,3 de la capătul 5'. cADN-urile se prelucrează la capătul C de la capătul 5' și apoi se realizează reacții PCR cu un primer universal Anchor (A) pentru capătul 5' și trei primeri specifici pentru fiecare dintre secvențele AustBI 2,5 PCR și 3,5 PCR - clona 2 (Secv. ID Nr. 6. 7, 8) pentru capătul 3'. Fiecare reacție dă un produs de mărime presupusă, chiar sub 1,3 kb: 1301 bp (Secv. ID. Nr. 9), 1280 bp (Secv. ID. Nr. 10) și 1292 bp (respectiv Secv. ID. Nr. 11). Toate trei secvențele au o regiune netranslată la căpătui 5' (fig. 2).Toate încep cu aceeași secvență de 22 bp (5' GGTTTAATTACC C AAG I l I GAG 3') care este cunoscută ca Spliced Leader Sequence 1 (SL1) și este prezentă în regiunea 5' netranslată a unei varietăți extinse de nematode Huang și colab., 1990. în secv. ID. Nr. 9 și 10, secvența SL1 este imediat înaintea ATG-ului de inițiere. în Secv. ID. Nr. 11 există 13 bp între SL 1 și ATG-ul de inițiere. Toate trei secvențele au ORF-uri complete.

Secvențarea clonei PCR Aust B1 capăt 3'

Folosind un primer specific care împerechează pozițiile 1414-1438 din Aust B1 (Secv. ID. Nr. 6), produsul PCR dă o bandă precum cea presupusă de aproximativ 1,4 kb. Secvențarea bandei donate dă secvențele Secv. ID. Nr. 12 și 13. Ele dau un ORF de la 1-615 bp și o regiune netranslată substanțial.

Analiza secvenței produselor PCR donate în fig. 2 sunt prezentate compozite ale secvențelor descrise mai sus. desemnate H11-1, H11-2 și H11-3. Secvențele aminoacide presupuse de la acestea sunt cele din fig. 6a. Validitatea translărilor presupuse, ale secvențelor ADN prezentate, este confirmată, în principal, prin împerecherea cu secvențele aminoacide determinate prin degradare Edmond de la fragmente de clivaj CNBr și proteolitic (fig. 7). Astfel, 27 de resturi ale secvenței N-terminale de 29 resturi a H11S (Secv. ID Nr. 16) împerechează Hii-2 de la resturile 61-90 (fig. 7b). împerecherea valinei (V) la poziția 78 și glicinei (G) la poziția 90 sunt caracteristice H112 deoarece H11-3 are asparagina (N) la poziția 90 si H11-1 are leucină (L) la poziția 86 (care corespunde poziției 78 din H11-2). Două resturi ale secvenței aminoacide N-terminale a H11s (Secv. ID. 16) nu împerechează nici una dintre cele trei secvențe H110D prezentate aici. Sunt de remarcat, în special împerecherile exacte ale secvențelor PepA și B, foarte asemănătoare, dar distincte (descrise anterior în WO 90/11086) cu H11-2 și respectiv H11-1 în regiunea resturilor 540-555. în mod similar, în regiunea resturilor 450-470, PepD este o pereche exactă pentru H11-2, în timp ce asemănătoarea dar distincta Pep E împerechează mai strâns H11-3.

Prin exemplificare, secvența aminoacidă translatată, a uneia dintre secvențele de lungime integrală (H11-3), este comparată în fig. 6b cu două secvențe pentru aminopeptidaze microzomale, de mamifere. Omologia translației H110D cu aceste aminoptidaze este prezentată prin încercuirea aminoacizilor identici. Un motiv caracteristic al aminoeptidazelor microzomale este secvența aminoacidă HEXXHXW, care funcționează ca sit de legare pentru zinc (Jongeneel și colab., 1898; Vallee și colab., 1990); aceasta este arătată în fig. 6 prin asterixuri. Această secvență, care este prezentată, se află în translațiile H11-1, H11-2 și

1230

1235

1240

1245

1250

1255

1260

1265

1270

1275

RO 117709 Β1

H11-3 și este conservată în toate aminopeptidazele cromozomale. Alte trăsături pentru aminopeptidazele microzomale mamifere și Haemonchus sunt prezente într-o regiune intracelulară comparativ scurtă, o singură secvență transmembranară adiacentă la capătul N-terminal și câteva situri potențiale de glicozilare. Nivelurile de omologie (similarități de 52...55% și identității de 30...32%) ale H11-1. -2 și -3 față de aminopeptidazele microzomale de mamifere sunt prezentate în tabelul 2.

Analiza de pată Southern

Rezultatele petelor Southern ale ADN-ului genomic H.contortus, sondate cu diferite clone cADN H110D și produse PCR, sunt prezentate în fig. 10. Toate sondele prezintă benzi de hibridizare multiple, tipic pentru o familie multigenică. Cum era de așteptat, B1A și AustBI prezintă origini de hibridizare similare pentru fiecare altă clonă, ca în cazul M1AUS de 3,5 kb PCR. Totuși, aceste origini sunt diferite notabil una de cealaltă și de aceea s-a văzut că sonda 2,5 kb PCR, chiar în condiții de stringență moderată (fig. 10 a), reflectă niveluri diferite de omologie între aceste trei cADN-uri.

Demonstrarea activitităților aminopeptidazice asociate cu H11OD

Activitatea aminopeptidazică microzomală, asociată cu H110D sau cu acele fracțiuni care conțin H110D, este prezentă în supernatantele de la ultracentrifugarea extractelor Thesit, în fracțiunea care leagă ConA (ConAHI 10D) și fracțiunile conținând H110D. obținute prin cromatografie de schimb ionic pe o coloană MonoQ (tabel 3).

Activitățile specifice, cu toate substratele testate, au crescut o dată cu creșterea purității H110D.

Activități enzimatice ale fracțiunilor de la o preparare tipică H110D

Tabelul 3

Fracțiune	Activități enzimatice specifice (O.D./min/mg/proteină)
fenilalaninăpNA	leucină-pNA	lizină-pNA	avid alfa glutamicpNA	metionină- pNA
Fosfat salin tamponat (PBS)	0,20	0,80	0,12	0,01	0,16
1%Tween 20/PBS	0,15	0,15	0,09	0,01	0,09
1% Thesit/PBS	1,94	1,25	0,57	0,54	1,91
ConA H110D	4,08	3,01	1,43	2,09	3,84
CamQ H110D	6,55	5,01	3,01	3,90	6,41

Efectele inhibitorilor aminopeptidazelor de mamifere asupra activităților aminopeptidazei H110D

Adăugarea inhibitorului bestatin (care inhibă aminopeptidaza microzoinală de mamifere) pentru ConA H110D la concentrația recomandată de către furnizor (BoehringerMannheim) a redus activitatea împotriva leucin-p-nitroanilidă cu aproximativ 70%. Acei inhibitori nu sunt specifici pentru metal protează sau aminopeptidaze ce nu au efecte inhibitoare asupra ratei de reacție. Inhibitorii cunoscuți că efectuează metalprotreinazele sau aminopeptidazele au avut efect asupra ratelor de reacție, așa cum este prezentat în tabelul 4. Cel mai eficient inhibitor este fenantrolina 5mM.

RO 117709 Β1

Tabelul 4

Inhibarea activităților aminopeptidazice ale H110D folosind diferiți inhibitori de protează

Inhibitor	Procent de inhibiție
concentrație	substrat acid alfa glutamic-p-nitroanilină¹	substrat leucină-pnitroanilină²
Amastatin	10M	0	61
50M	0	66
Bestatin	50M	23	63
100mM	35	68
EDTA	1mM	17	8
10mM	21	16
1,10 fenantrolină	1mM	78	78
10mM	85	87
Fosfoamidon	10M	1	0.8
50M	1	7

’un substrat de aminopeptidază-A de mamifer ²un substrat de aminopeptidază-M de mamifer

1325

1330

1335

Subfracționarea H110D

Distribuția activităților asociate cu fracțiunile de la cromatografia de schimb ionic a ConA H110D pe MonoQ este prezentată în fig. 13a și SDS-PAGE fracțiunilor în fig. 13b.

Ulterior, activitatea enzimatică se asociază cu subfracțiunile H110D, separate prin recircularea focalizării izoelectrice în curgere liberă (fig. 14 și 15). La valori pt (pH 4,5) aceste subfracțiuni conțin numai benzile mai mari care completează dubletul H110D. Fracțiunile intermediare conțin ambele benzi. Banda mai mică poate fi obținută, de asemenea, ca o fracțiune separată, prin cromatografie de schimb ionic pe MonoQ, folosind instalația Pharmacia SMART*. Toate aceste subfracțiuni leagă anticorpii de oaie la H110D purificată prin afinitate de proteină exprimată prin clonă Ăgt11 M1, în timp ce anticorpii eluați de la Ăgt11 fără nici un insert nu se leagă, (fig. 14c). Toate subfracțiunile leagă anticorpi monoclonali de șoarece, desemnați TS 3/19,7 (fig. 14 c) care se leagă, de asemenea, la proteina recombinantă, exprimată de către clona M1. Toate sub-fracțiunile arată activitate aminopeptidazică microzomală (fig. 15c), deși această activitate este comparativ scăzută la fracțiunile obținute la cele mai ridicate și cele mai scăzute pl-uri. Această activitate mai scăzută poate fi atribuită concentrațiilor mai scăzute de proteină, efectelor extremelor de pH în timpul subfracționării, sau unei necesități de a fi prezente, pentru activitate maximă, atât benzile mai mari, cât și cele mai mici.

Vaccinarea cu componente separate de H11OD

Benzile separate, superioare, și mai joase, obținute prin focalizare izoelectrică în curgere liberă sau prin cromatografie de schimb ionic, induc formarea anticorpilor protectori când se injectează la oi, așa cum se exemplifică în următorul experiment. Componentele separate de H11OD se atribuie la 30 de oi în vârstă de aproximativ 6 luni, la 5 grupuri de câte 6, astfel încât fiecare grup se asociază după domeniul de greutate al oilor. Fiecare animal se injectează cu un total de 150 pg proteină dată în 3 doze egale, cum este descris

1340

1345

1350

1355

1360

RO 117709 Β1 în Munn și colab., (1992) și Tavemor și colab., (1992 a, b) pe o perioadă de 54 zile. Animalele din grupul L se injectează cu banda mai joasă (mai mică) a dubletului H110D, acelea din grupul U cu banda superioară, U+L cu recombinantul benzilor superioare și mai joase, D cu două benzi (neseparate) obținute prin focalizare izoelectrică la valori de pH intermediare și drept control (grupul C) feritină splenică de cal (o proteină antigenică neînrudită). Oile sunt injectate cu 10000 larve infecțioase, la 3 săptămâni după cea de-a treia injecție. Desfășurarea experimentului este prezentată pe scurt în fig. 16. Injectarea oricăreia dintre cele trei subfracțiuni a redus complet eliminarea de ouă în 90% din încercări și a redus numărul total de viermi cu 63...84%, toate prezentând o diferență semnificativă (p<0,05) față de controale, folosind analize statistice non-parametrice. Reducerea (70...80%) numărului de viermi femele a fost mai mare decât reducerea numărului de viermi masculi, exceptând reducerea numărului de viermi masculi la oile injectate cu recombinantul benzilor superioare și mai joase, unde la p<0,07 pentru ambele sexe, reducerile au fost simplificate (p<0,05).

Vaccinarea cu H110D și Η11A forma scurtată, solubilă în apă a H110D (H11S; care păstrează activitatea sa enzimatică) se poate obține de la molecula nativă prin tratament cu elastază. Această formă se dovedește a conține activitate enzimatică asemenea ApM și se îmbogățește pentru activitate asemenea ApA, un extract Thesit al peletei digerate cu elastază (H11 A) (Vezi tabelul 5)

Tabelul 5

Raport
Aminopeptidază-M (leucină-pNA)	Aminopeptidază-A (Acid alfa-glutamic-pNA)
H11OD	1,44:1
H11S	26,0:1
H11A	0,48:1

Experimentul arată că vaccinarea oilor atât cu H11S, cât și cu Η11A, asigură protecție împotriva provocării sau infecției cu Haemonchus. H11S și Η11A se atribuie la 3 grupuri de câte 6, 18 oi cu vârsta de aproximativ 8 luni, gruparea făcându-se după domeniul de greutate a oilor. Fiecare animal se injectează cu un total de 100 pg proteină dată în 2 doze egale, cum este descris în Munn și colab., (1992) și Tavemor și colab., (1992 a, b) peste o perioadă de 23 de zile. Animalele din grupul A se injectează cu Η11A, cele din grupul S cu H11S și cele din grupul C cu feritină splenică de cal (o proteină antigenică neînrucită) drept control negativ. Oile sunt apoi injectate cu 10000 larve infecțioase, 25 zile după cea de-a doua injectare și experimentul se termină la 34...36 zile postinfecție. Desfășurarea experimentului este prezentată pe scurt în fig. 17. Injectarea de H11S reduce complet, prin încercări, cu 89% eliminarea de ouă, și numărul total de viermi, cu 76%. Injectarea de H11A reduce complet, prin încercări, 98% din eliminarea de ouă, și reduce numărul total de viermi cu 84%. Aceste rezultate arată o diferență semnificativă (p<0,05) față de controale, folosind analize statistice nonparametrice.

Inhibarea activităților aminopeptidazice a H110D de către anticorpi

Soluții conținând H110D se incubează cu seruri de la oi individuale injectate cu fracțiuni conținând H110D sau de la oile control. Soluțiile se cercetează apoi pentru activități aminopeptidazice folosind ca substrat fenilalanina-pNA sau acid α-glutamic-pNA. Gradul de inhibare al activității (maximum 80%) se corelează cu nivelul protecției arătat de către fiecare oaie individual de la care s-a obținut ser. (Vezi fig. 18).

RO 117709 Β1

Localizarea activității enzimei

Se examinează activitatea aminopeptidazică pe secțiuni înghețate de adulți Haemonchus contortus. Așa cum se arată în fig. 19, activitățile enzimatice aminopeptidazice sunt localizate la suprafața lumenului intestinal. Proteina H110D este, de asemenea, găsită în mod specific în această localizare.

Expresia de H110D (3,5 PCR clona 2) folosind sistemul eucariot baculovirus-celule de insecte

Se recoltează celule infectate și se cercetează activități aminopeptidazice folosind ca substraturi fenilalanina, leucina. metionină și lizina, toate pNA. Cercetarea este complicată prin observația că celulele de insecte posedă o activitate aminopeptidazică cu o preferință marcată pentru lizină amidă-legată. Cu toate acestea, extractele celulare conțin exprimat H110D suplimentar clivată, leucina, metionină și fenilalanina -pNA, în ordinea preferinței.

Greutatea moleculară imunoreactivitatea proteinei H110D (3,5 PCR clona 2) exprimate

Probe de extracte celulare infectate sau de control se supun electroforezei pe un gel poliacriamidă 7,5%, care apoi se colorează cu Coomasie Blue. Lizatele celulare infectate

3.5- 2-p3A și 3.5-2-P4A, au amândouă o bandă la aceeași mărime ca H110D, care a migrat direct sub β-gal co-exprimată, care are greutate moleculară de 120 kb. Această bandă nu este prezentată în nici un lizat de control negativ. (Ea este, de asemenea, absentă din lizatul P2A, care nu exprimă activitate enzimatică).

Se pătează Western un duplicat de gel și se sondează cu anti-H110D. (fig. 21). Se obține o imunoreacție pozitivă foarte puternică pentru banda de 110 kb, exprimată de către

3.5- 2-P3A și 3.5-2-P4A, și pentru dubletul nativ H110D într-un traseu de control care conține ConAHI 10D și, în același timp, nu se vede nici o reacție în oricare din traseele de control negative.

LISTA DE SECVENȚE (1) INFORMAȚIE GENERALĂ:

(i) SOLICITANT:

(A) NUME: AGRICULTURAL AND FOOD RESEARCH COUNCIL (B) STRADA: BABRAHAM HALL (C) ORAȘ: BABRAHAM (D) STAT SAU PROVINCIE: CAMBRIDGESHIRE (E) ȚARĂ: REGATUL UNIT (F) COD POȘTAL: 2B2 4AT

TELEFON: 223 - 832312 TELEX. 223 - 837952 (ii) TITLUL INVENȚIEI: POLIPEPTIDE AVÂND ACTIVITATE DE ENZIMA AMINOPEPTIDAZICĂ HELMINTICĂ. MOLECULE DE ACID NUCLEIC CE LE CODIFICĂ,PROCEDEU DE PRODUCERE Șl COMPOZIȚIE DE VACCIN CU ACESTE POLIPEPTIDE.

(iii) NUMĂR DE SECVENȚE: 24 (v) FORMA CITIBILĂ PE COMPUTER :

(A) TIP MEDIU: dischetă (B) COMPUTER: PC compatibil IBM (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE:

1415

1420

1425

1430

1435

1440

1445

1450

1455

1460

RO 117709 Β1

Informația pentru Secv.10 Nr.l

Caracteristici de secvență:

Lungimie; 295 baze perechi Tip: acid nucleic împletire; dublă Topologie; lineară

Descrierea secvenței :Secv.iD Nr.l

CGCGGACATT CTGCAGTCGG CAGAAAAGCC CGGAACTACT ATCTACCTGG

GCTGAATCTA CCTCTCTATT AGGGAAGGAT TCTTCCAAGT TTATGTGGAC

ACTCCAATCC GGTCTCACCT GATACTGGTG AATATAAAAC TTCCCACCGG

GTCTTATTGT ATTACTTTAC GCAAGGACAA CATTGTCTTA AGAAAAACCT

CGCATTATTT TCGCAAAGCG AGACAATTCT CGACTTGACG CACATTCGAC

CTAGTAGCTG TTCGATACCT CCCTCTGCGG ATCAAAACAT GGGCG

120

180 o

295

GCAATATCAG GCTTCGGAAT ATAGCGGAGA ATTGACACAT GACAAGGAGG GCTCCTCTCC GACAAGGTGA GAAGCATTGG GATC

GATTCAATAC ACATGCGAAA ACTACAAAAA ACTGTGGTCT TCATGAAATG GAAAAACTGT TGGAACTATA GATGCCATAA

AATTTTGGAC ACTGATGAAG AGATTCGCTT TGGAGGCAAA TCAACCTGGT TTACTGCTAT TAATGCGGAA AGACGTTACA

TTTTTCGGCA CCAATTTATG TTCTTCAAAA GAATGTCTTG CAGCAAGCGA GGGGTCCAGG CAAGTGCAGT GCTCTAAAGG

GCGAACCCGA ACAAGAGTAG ATAATCTCCA AAGAAATGAA CCGACTGCGT AAGGCGGTGA TGGAGAAAGA GACTTCTTAT

ATCTCAATGG CATCAAGTTT AATAGCTGTT AAAGCTTTTT AAAGGTAACT TGAGGCATTC CAGTCTACGT GCTGGCTTTG

120

180

240

300

360

420

480

484

Informație pentru Secv.lD Nr. 3

Caracteristici de secvență:

Lungime ; 216 baze perechi Tip: acid nucleic împletire: dublă Topologie; lineară

Secv.iD,Nr.3

ACCTGGTCAG

CAAGCGACCG ACTGCGTAAA GGTAACTGCT CCTCTCAAAA CTGTTTACTG

CTATGGGGTC GGAACAAGTG TACAGCTCTA

CAGGAAGGCG CAGTTGGAGA AAGGGACTTC

GTGATGAGGC AAGACAGTCT TTATGCTGGC

ATTCGACAAG ACGTGAAGCA TTTGGA

GTGATGGAAC TTGGGATGCC

TATATAATGC ATAAAGACGT

120

180

216

Informația pentru

Secv.IO Nr.

Caracteristici de secvență:

Lungime; 581 baze perechi Tip: acid nucleic împletire; dublă Topologie; lineară

RO 117709 Β1 □escrierea secvenței: Secv.IO Nr. 4

GGGAGGAAAT CACTGCGAGC TTGGAAACAG AACACAGAGC CTTGTTGCAC AGGAATTCGC TCCCAACAAC AAATAGATCA AGAACAATGC GCAGGCTAAG AAGTTCCATA AAATTGCCTG GATTATCGGA ATTCTTCAAG AGAGCAAGAT CATAGCTTTT ACGTCTTCAA ACTAGGAGAC AGTTTTGCTG AAAAGTCAGT GCCATCCATT CGAATACAAC CAACCCCATT TTAAGTACCT AATTTCGAAT ATATTATGAA GCTTGTATCT TGAACGTTAT TAGAGCTCAC TCTCCATTTT GTAGCTGTGA TGACTTGCAT GCCTATAATC TTTCCCCAAT ACATTCCAAA CTCCGATCAC AGATTTGTTT CTTTGTCTGC TATCCATCTA ACTGTTTCGA

AGTTGATAAA	GTGGTCGGCG	60	1505
GCTGAAGAAG	AATCTACAGA	120
GATCAAGAAA	CATTTTCACA	180
CACACTGAGC	TCCAATTTTA	24 0
TTCACATTTT	CCGTTTGAAT	300
TTCATTCACA	GTGATTACTA	360
GÂTCGGTGAC	TTTCAATTTA	420
TTAAGACCCA	CCATTTACCA	480
CTCCACCGCT	GACAATGCCC	540	1510
T		S81

informație pentru

Secv.lD Nr.

Caracteristici de secven tă;

Lungime; 948 baze perechi Tip; acid nucleic împletire; dublă Topologie; lineară

1515 uesc rie rea secvenței; Secv.lD K'r.5

ATGACGTCGC GCATTATTTC CGCAAAGCGT GACAATTCTC GACTTGACGA ACATTCGATG CTCAATTCAA AAATTCGAAA AAAAGCCAAC AGCAACAGCC ATCGCTGCAG GAACCGAAAT GTCTCGAATG AAGTTCTTGA GAATACATCG GCAAAGAAGA

AGGGGAGAAC GCGGACATTG TAGTAGCTGC TGCAGTCGGC TCGATACCTC AGAAAAGCCA CCTCTGCGGC GGAACTACTC TCAAAACATA TCTACCTGGT GGCGTGTGGA AATATCAATG AGAAGATCTC TGTAATACCC TTGAAAGTGT AAAGGAGCAC TGGAAAAAGA TTCACAAATC TTGGTGGAAT CTACCAGACC TTTCACAAAA TGAGCCCATA ACAAAGCAAA CTGGACCGTT GAATCGAAGT GAACGGAGAT CTACTCCACG GATGTCATCC AAGGTGAAAC AAAGACGGGT TGACACAATA TGCTCTGCAA

CTGAATCTAA CTCCAATCCG CTCTCTATTG GTCTCACCTA GGGAAGGATG ATACTGGTGG CTTCCAAGTA ATATAAAACC TATGTGGACT TCCCACCGGA GTTGTAATTG AGCCAACAAA CAAGAATGTG AACTGGTATC CCAAGACTGG AAAAGGTTGA TTGCTCAAGT CGGCTTACAT ACTTATACCA CCCCGGATGG GATGCTCGTC GAATGGTACC ACTGTCATTC ATCCAAAAGG GGAGAGAȚCA GTGGTGATTG TACTTGTTGG CAGTTATGGT GTTCGGTTCC GTATATGGTC TCTGGTATCA AGTGCATA

TCTTATTGTC TTACTTTACT CAAGGACAAA ATTGTCTTAC GAAAAACCTC GAGTATCGTA GGGCGATAAA GTTTCTTATC CGGTCTCATC CACCCCTAAG ATGCATGGAT CACCAAAGCC GATCACATCG TTCAGAATTT ACGCCCAGAG

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

8

1520

1525

1530

RO 117709 Β1

Informația pentru Secv. Nr. 6

Caracteristici de secvență:

Lungime; 1689 baze perechi

Tip: acid nucleic

ImpLetire; dublă

Topologie; lineară

Descrierea secvenței; Secv.lD Nr.6 aattccggct ATGTTTGGAT GGTTGCTCTT GGAGGGTTCC AGAAGTGATC GTGGGATAAC CTTCATCAGC TGGTATTACG TGCAGATGTA AATGCTATTG GAAGTTTTCA CCAAGGTATA GACAACTCAG AGTCACCGAA TCCAACTTAT GAAAAGAACT GTCAGTTGTG TTGGAGGAAC AAACGCTCTC CGTATTTGAA AATATCAGGA TTCGGAATAC AGCGGAGAAC TGACACATAC CAAGGAGGTC TCCTCTCCGA CAAGGTGATG AGCATTGGGA TCGGAATTC

CGTCCGGAAG TACTATGAGG CCTGACTTCT GTGCTCTACG GCGCACGAAC CTATGGCTGA GATGGTCTAT GCTGATGCAG TCAGAAGCGT AATTTAGTTG TATGATAATG ACCGGACCTA ATGGGGTTCC AAACGATACA GGGTTCAAAT TGGTTAAAAA GTGAATGCCG ATTATGAGAA ATAAGTGATG ATGCTCAAAT TTCAATACAA ATGCGAAAAC TACAAAAAAG TGTGGTCTTG ATGAAATGTC AAAACTGTTT GAACTATATA TGCCATAAAG

CTATGAAGAT ACTTCTTCGG CATCTGGTGC ATGAAAACCT TTGCACATCA ACGAAGGATT GGGAAATGAA TAGCTTCAAG TCGATGATAT GGGACGAAAA CGGCTGCTGA ATGGTGGACC CTGTTCTTAC GGGAGAACAA GGGATGTTCC GAGAGGAACC AACGTCGTCC GACTCAAGCA CGTTTGCAGC ACACCGTGAA TTTTGGACTT TGATGAAGCC ATTCGCTTT GAGGCAAAGA AACCTGGTCA ACTGCTATGG ATGCGGAACA ACGTTACAGC

GACAGAATAT GATCAAATTC TATGGAGAAC CTACGGACCA GTGGTTCGGT CGCGTCATTC AGATTTCTTC CCATCCGCTT CACATACCGT TTTCAAGCAG AGATTTATGG ATTGAAAATG TGTCGAGTCG GGATGCAAAG TCTGTGCTAT GCTCTATTTC TTTTTGCCGA GAATCATAAG AGCTGCAGTT AGAAGAGGAT TTTCGGCAGC AATTTATGAC CTTCAAAAAT ATGTCTTGAA GCAAGCGACC GGTCCAGGAA AGTGCAGTTG TCTAAAGGGA

GCCATGATAG CCACTTCCAA TGGGGTCTCA ATGAATAAGG AATTTGGTCA GTGGAATACA CTGCTGGCAC TCCTTCAGAA AAAGGAGCAT TCTGTTTCGC GCAGCATTCG TCCGAGTTTG GTTAACGCAA GAACCAGAGA CAGGAAGATG CATGTAAGCA TCAAACTATG GTCTATGGTC GAGGAAATGA TACTTACCAT GAACCCGAAT AAGAGTAGCA AATCTCCAAA GAAATGAAAA GACTGCGTAA GGCGGTGATG GAGAAAGACA CTTCTTATGC

CTGGAATCAA AACAAGATAT TCACATACAG AGCGGGTTGC CGATGAAGTG TCGGAGCCGA CGTACACAAG TAGATAAGGC CCGTTCTTCA GTTACCTCAA ACGAAACCGT CGCCACAATG CGACTTTGAA AGTACCGTCA AACAGCAAGT ATTCTGATTC ACGCTAACGG CACGAACAAG ATTACGAGAC GGAAGGAGGC CTCAATGGGC TCAAGTTTAT TAGCTGTTAT AGCTTTTTGA AGGTAACTGC AGGCATTCGA GTCTACGTGA TGGCTTTGGA

120

180

240 300 360

420

480

540

600 660 720 7Θ0 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380

1440

1500 1560 1620 1680 1689

Informație pentru Secv.lD Nr. 7

Caracteristici de secvență;

Lungime; 2472 baze perechi Tip; acid nucleic împletire; dublă Topologie; lineară

Secv.Iu Nr. 7

ACGGGTGTTC TTGGATGCTG CTGGAAAAAC GGCCTTATCA AATAAACAGC CTGGTCACAC GAGTATCTTG CTCGATGGAA TTTAGGATTG GGAGCGTCAG GTTGTGCAAT GTCTTCAATG CAATTTACCG AATGCGACCG

GGTTCCGTAT GCATCAGATG AAGATATGAT CTTATAGAGA GGGTTGCTCT TGAAGTGGTG GAATGGACGA TGGATCGCGG ACAAAGCGGC TTCTCACTAT ACCTCAAGAA AAGTTCTCAA ATCAGTGGAC CCCTAAAGGT

ATGGTCTCGA CCTGGAGTTC TGCTCTTCCT GGATTCTCTC CGTAGTTGCT GGATGATACG AATTAGCCAC AATGAGAGCT AGAAGTTGCC GCTACGGGCT GTTCTCCTAC AGCTGTTAAC CTATCAGATC TACGCAGACC

CCAGAGGCGA TATGAGAAGT GATTTCACCG CTATACGATG CACGAGCTTG TGGTTGAACG AACAATTTCA GACTCGCCAG GAAGCC111G TTGATTGGAG AGCAATGCAC CGTCCTGACG GGTTATCCTG CGGTACAAGA

AACGAATGAC TCTTTGACAT CTGGTGCCAT AAAAAATTTA CTCATCAGTG AAGGTTTTGC GAACGCAAGA CATCGAGCCA ACGATATTTC AGGACAATTA AAGCAGCCGA GCAACGTCAT TGGTTAAAGT CAAATAAAGA

GGCATACGCT AAAATTCCCT GGAAAACTGG TGCACCGATG GTTCGGCAAT AACATTTGTT TTTCTTCTTG TCCGCTTTCG ATACGCCAAG CAGGAATGCT TCTGTGGAAC GAAAATCGAC AGAAGAATTT CCCCTTGGAA

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

0

RO 117709 Β1

CCAGAGAAAT GAAGGCAATA AACGTCAACA CAAAACTATG GTCTTCGGTC GACGCAATCG TTCTTGCCTT GAGCCGGAGA AAGAGCAGCA AATACTCAAA CAATATAAGG ACCAAATGCG GAAGGTGGTG CTGGAGAAGG GAACTTCTTT ACCGCTTTCC ATGGAGAGAT GTGGTCGGCG CTACAGAAGA GGAGAACATA AGAGCAAGAT AGTTTTGCTG CAATAATACC GAAGCTTGTA TTTGTAGCTG AATACATTCC TGCTATCCAT TGACGTTGGT

ATCGTAATCC GCAAAGAGGT ATCGGGATAC ATGCCAACGG CAAGGACAAG ACTATGAAAC GGAAGGAAGC CAAAACCAGC TTGATTACAT AGGATATCAT ATATCTTCTA TTAAGGTTTC AAGAAGCTTT GTATCCTGTT TGCGAGCCCT GTGCTGTATC GGGAGGAAAT CTTGTTGCAC ACAATGCGCA AAATTGCCTG CATAGCTTTT AAAAGTCAGT ATTTTAAGTA TCTTGAACGT TGATGACTTG AAACTCCGAT CTAACTGTTT GT

AAAATACGCG GAAGCGAACA ATCCCTTGTG TTGGAAAAAG GAACGCTATC TGTATTCGAA TCTGTCCGGC TAGAGCTTAC CGTCAAGAAT TGATGCATAT CGATGAGG7T CGCTCCTCTT TGAAAAGGTG CAAAGCCTTG GGACCGTAAA TGAAAACCCT CACTGCGAGC AGGAATTCGC GGCTAAGAAG GATCAAGAAA CACAC7GAGC TTCACAT7TT CCTTTCATTC TATGATCGGT CATT7A.AGAC CACCTCCACC CGATCGCCGG

TTCAAGTGGG TGGCTAAAAA GTGAACGCTG ATAATCAAGC ATAAGCGATG CTACTTGAAT ATGTTCGCAG ATGATGAGCA TATTTGGATG TGTTCCCTTG ATGCCCAAGT CGAGCCAATG ATGGGGCTGT GCATGCCACA TCGTCGTTTG GTGGGCGAAG TTGGAAACAG TCCCAACAAC TTCGGCTCAT CATTTTCACA TCCAATTTTA CCGTTTGAAT ACAGTGATTA GACTTTCAAT CCACCATTTA GCTGACAATG TTGTTTGTCA

ATGTTCCCCT GAGATGAACC ATCGACATGG AGCTCAAGAA CATTTGCTGC ATGCCAAAAA TTTTAAAGTT TATTAGAACC ATACGTTATT GATCAAAGGA GTAAGGCCGG TTTACTGTTA ATCTAGCAGA AAGATGTTAC TGCGTCTTCA AATTCATGTT AACACAGAGC AAATAGATCA TCACCCAGGA GATTATCGGA ACGTCTTCAA GCCATCCATT CTGAATTTCG TTATAGAGCT CCAGCCTAGA CCCAGATTTG ATTGCTTATC

ATGGTATCAG GCTGTACTTG ATTTTATCGA AGATCACAAG AGCTACGATT TGAAGAGGAA CTTCGGTAAT GATGTATAAT CACAAAAATT CTGTATAAAG GGAAGCAGCA TGGTGTACAG AGATGTTCAA AGCTCTAAAA GGATGTCCCT CAATTTCCTA AGTTGATAAA GCTGAAGAAT AATCGAAAAA ATTCTTCAAG ACTAGGAGAC CGAATACAAC AATATATCAT CACTCTCCAT ATCTTTCCCC TTTTTTTGTC TGATAAATAT

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 24 6 0 2472

1580

1585

1590

1595

Informație pentru Secv.lO Nr. 8

Caracteristici de secvență;

Lungime; 33o5 baze perechi Tip: acid nucleic împletire; dublă iopologie; lineară

1600 uescrierea secvenței;

Secv.iD Nr.8

GCTGAATCTA ACTCCAATCC CCTCTCTATT GGTCTCACCT AGGGAAGGAT GATACTGGTG CCTTCCAAGT AATATAAAAC TTATGTGGAC TTCCCACCGG GGTTGTAATT GAGCCAACAA CCAAGAATGT GAACTGGTAT CCCAAGACTG GAAAAGGTTG CTTGCTCAAG GTCGGCTACA CACTTATACC ACCCCGGATG AGATGCTCGT CGAATGGTAC TACTGTCATT CATCCAAAAG TGGAGAGATC AGTGGTGATT CTACTTGTTG GCAGTTATGG TGTTCGGTTC CGTATATGGT ATCTGGTATC AAGTGCATAG GAAACAAGAT ATGATTGCCC CATCACTTAC AGGGAAAACT ACAGCGAATT GCTCGCATTG TACGATGAAG TGGTGGGATA TATTGGAGCT GGTCAGATAA TGTACTTGAA CGCGCTTTGA AATCGACAAA GCTGCAGAAG TTCTGTTCTT ACTATGCTGA GCAGTACCTC AAGAAGTTCT TGATGAAGTT GTCACTGACG

GTCT7ATTGT CGCATTATTT ATTACTTTAC TCGCAAAGCG GCAAGGACAA AGACAATTCT CATTGTCTTA CGACTTGACG AGAAAAACCT CACATTCGAT AGAG7ATCGT ACTCAATTCA CGGGCGATAA AAAACTCGAA AGTTTCTTAT CAAAAGCCAA TCGGTCTCAT CAGCAACAGC GCACCCCTAA GATCGCTGCA CATGCATGGA TGAACCGAAA GCACCAAAGC CGTCTCGAAT GGATCACATC GAAGTTCTTG TTTCAGAATT TGAATACATC CACGCCCAGA GGCAAAGAAG AATTCTACGA AGATTTCTTT TTCCTGATTT CTCTGCCGGT CTTTGTTGTA CGATGACAGA TTGCTCATGA GCTTGCTCAT ATTTGTGGTT GAATGAAGGT CTCAAGATGA CGCCAGAATG AAGCTGATTC GGTAGCGTCA TTGAAGAAGC CTTTGATGAT GACCCTTGAT TGGAGAAGAA CGTATAGCAA TGCAGAAGCG TCGAAGGTCC AGACGGCAAA

CTAGTAGCTG CTGCAGTCGG TTCGATACCT CAGAAAAGCC CCCTCTGCGG CGGAACTACT ATCAAAACAT ATCTACCTGG GGGCGTGTGG AAATATCAAT AAGAAGATCT CTGTAATACC ATTGAAAGTG TAAAGGAGCA CTGGAAAAAG ATCAACAAAT TTTGGTGGAA TCTACCAGAC GTTTCACAAA ATGAGCCCAT TACAAAGCAA ACTGGACCGT GGAATCGAAG TGAACGGAGA ACTACTCCAC GGATGTCATC GAAGGTGAAA CAAAGACGGG ATGACACAAT ATGCTCTGCA GATATCAGAT TCCCTCTGAA GCCATGGAGA ATTGGGGCCT TTCTATGCAC CGATGAATAA CAGTGGTTCG GCGACTTGGT TTTGCAAGAT TCACAGAATT AGGAACTACT TCCTGATTGA AGCCATCCAC TTTCCTTCAG ATCACATACG CCAAAGGAGC AAACATAAGC ATGCAGTATC ACTGATCTAT GGGCAGTTTT CCTATGAAAA CCACAGAGTT

120

180

0

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1605

1610

1615

1620

RO 117709 Β1

TCCAACTCAG GACTACTTTG GAAGTACCGT CGATAAGAAG TAGTGATGCT TCATGACGCT CAGTCCCCGG AATTGAGTAT ACCATTAGAA AGAGGCAAAG CAGTATCGAC CCAAAAAGAT TAAAAAACTT ATGCGTAAGA CGGTGATTAT AAAAGACTTC TCTCTTGCGG TTTCAACGAT GAGATGGCCA ACCAGCCTGC GAAAAATGGC AAATAGGGTG CACCTTGTAA GACAGGGAAC AATTTTTATC AAAGCTCAGT CCCTATACCC CTCAGAACAC TTTACAATTG AAAAA

TGGACGACTC AAATTAACGC CACCCGAAAT GAGATAAAGC GGCGCTCCCT AATGGTTGGA ACAAGGAATG GAGACTGTAT ATCGCAATGT CCAGCTCAAA TTCATTGCCA GTCATTGATA TTCGATGACG ATCGCCGCTC GCTTCCGACA CTACGCCTAG GCTCTGGACA GTAGCAGCAA GATATCATTG ACTTCAGGAA ATGAACGCTC GATTGGATTA TTCGAATTAC TGACTGTCTG GTTATATTTG ATTGGCAACC TCTTCCTAAC TTTCTCCTCA TATAGATTAG

AGATGGGCTT AAAGTCGATA ACGGATTTAA GAACATGGTT TTGTGGTGAA AAAAGATAAT TCATCATTAG TTGAAGTTCT CCGGGATCTC CATACATGAT ATAACTACAG TGTTCTGCGC AAGTCATGAA CTCTCCGATC AGGTGATGGA CATTGGGATG GGAATTCGTC ATCCTATTGG AAAGTATAGG TCGGCTCACA GTCAATTCGG AAAAACAT7T ATTGCCAG7A TTGGTCACTG CCTTCCGTGA GTAGAACAAT TGAATTCGGA ATAGCTTCTT TTATCTTA7A

CCCAGTTATT TGAGGCGAAT ATGGGATATT GAGAAGAGAT CGCAGACCGC CAAGCAGCTC CGATGCGTTT GAATTATGCC TTCGATTTTG GAACATATTG AAATGACAAG CCTCGGATCG CAAATGCAGG AAGTGTTTAT GCTTTATACG TCATAAAGAT GTTCGTACGT CGAAGAATTC AACGAAGCAC ACAGCAGATT TGCATTCGAT CCAAAAATTA ATCCAGATCT TTCCACTGAA GGGGTCATTG ATTACTTTCG AATTTGTTCA GTTTGTTTTT AATATTGATG

TCCGTAGCAG AAAGACGCTG CCACTGTGGT GAACCGCTTT TATGGATTTT AAGGATAATC GCTGCGGCTG GAAAAAGAAA AAATACTTCC AAACCGATGT CTGTTTTTCC CAAGACTGCA GATGGTCAAG TGTTATGGTG GCCGAAACAC GTTACTGCTT ATGCAGGATA ATTTTCAATT ACATATGTTG GACCAGCTGA AAAGCAATCG GCGGCTTTCT TAAAGTTCAT TGGAAGTTTT TTGTCACTTG CTTCATCAAA TATTCGTTTG TTTTTGATTG GTTAAAAAAA

AGTTTAACTC TGGAGAAAGA ATCAGGAAGG ACTTGCATGT ATCGACAAAA ATGAGGTTTA CAACTGACGC CGGAATATCT CTACCGAGCC ATGAAAAAAG AAATCAACCT GGAAGAAATA CAGCAACCGA TGAAGGAAGG TCGCCCTAGA TGAAAGGACT TCCCAAGTGC TCCTTATTGA AGAAAGTGAT AGAATCTGCA AACGAGCACA TCAAGAAAGC GAAGGAATAT TACCTACAAA AATAGTAAAC TTGTTATCTT TAGTCTGTTG TATTGATCGT AAAAAAAAAA

1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 27 00 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3305

Informație pentru Secv.IO Nr. 9

Ca racterisuici de secvență:

Lungime: 13o 1 baze perecni Tip: acid nucleic împletire; dublă Topologie· lineară

Secv.10 Nr. 9

GGTTTAATTA ACCACGAAAA GGTAGCTGCT TGATACTACT AGCTGAAGAA AACGTATCTG TGTGGTGATT TATTCCTGTA AAAGGTTGTG GAAGAATCAG AGGACTTTAT TCATATGGAA GGCAAACTGG AGAAAAGGGA GCGAATGCCT TACGAAAAGC ATATGCCATG ATTCCCTCTT GAACTGGGGT ACCAATGAAT CGGTAATTTG ATTCGTAGAA

CCCAAGTTTG AATACAGTGC GCCGTCGGCC GGCGGAAATG TTACGTCTCC CCAAACTATG GCTATGGAAG ATTGCAGACC GATCAGCCAA AAAATCACGC CGAACAACCT CCGACGGACG ACTGTGACTG GAAGGAGAAG TCGTATTTGA GGTGTTCGAT GTAGCTGGAA CCAAAACAAG CTCATCACAT AAGGAGCGGG GTCACGATGA TACATTGGAG

AGATGACAGC TACGGCTCAC TCTCAATCGG GAAAAGGGGA CAACAACCAT TAAACTATCC TTGTGGAGCC AGTGCGAACT GGCTGGAGAA TCAAGATTGT ACACGGATAA CCCGTCTTAT TGATTCATCC TCTCTGGCGA TTGCTCTTGT TCCGAATATG TCAAATGCTT ATATGGTTGC ACAGGGAGGG TTGCAGAAGT AGTGGTGGGA CCGACTTCAT

AGAGGAGAGT CCCAATCAAG TCTCACCTAT TCAACCTATT AAAACCTTTG ACCTGAGAAA AACAAAGTCT GTTTTCTAAC AGTCGAATTC ATACATTGGC AGATGGTACA GGTCCCCTGT GAAGGGCACC TTGGGTCACA GATTTCCGAA GGCTCGTCCG GGATTACTAT TCTTCCTGAC TTCCGTACTA GATTGCACAC TAACCTATGG CAGCGATGGT

CAGGAGCAGG TCTCTCTTTG TACTTTACAA GTCGATGATA ACATACGACT GATTTCGCTA ATTGTGCTCA AACCAAAAAC GTTTTGAAGA CTTATCAACG ACCAAGATTG TTCGACGAGC AGTGCCGTGT ACCAGATTCG TTTAAGTACA GAAGCTATGA GAGGACTTCT TTCTCATCTG TACGATGAAA GAGCTTGCAC CTAAACGAAG C

AGACGCAGCA CTTTGTTAGT GGAAAGCTTT ATTCCCCATC TAGTAATCAA TTGATGGGAC ACTCGAAAAA TCGACATCGA AAAAGCTGGA ACATGCTTGG CTGCATGCAC CGACGTTTAA CGAATGGAAT ATCCAACCCC TTGAAAATTA AGATGACAGA TCGGGATCAA GTGCTATGGA ACCTCTATGG ATCAGTGGTT GATTCGCGTC

120

180

240

300

360

420

480

0

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200 1260 1301

RO 117709 Β1

Informație pentru Secv.io Nr. Io

Caracteristici ae secvență;

Lungime; 128o baze perechi lip: acid nucleic împletire; dublă Topologie; lineară

Descrierea secventei;Seuv.ID Nr.lo

1670

GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AGATGACGGC CTCACCTATC AGCCTACTTT GTACATTATT TGGTCTTACC TATTACTTCA CTCGTAAAGC TGACAGTGGT GGTAAAGAAA AGGATAATTC GAACATAAAA CCAGTCTCGT ACGACTTGAA CTTTCCACCA GAAAAGAATC TCACATTTGA TGAGCCTACA AATAGTATTG TGCTGAACTC CGAACTGTTC TCAGGTAATC AGAAACTTGA TGACAAGCTT GAGATTACCC TCAAAAATCA GATCACTTAC ACCGGCCTTA TTAGCGACAC TGATAAGGAC GGAAAAACTA AGATCGTTGC TCGTATAGCG CCATGCTTTG ACGAACCGAA TCATCCCAAA GGTACAAAGG CTGCATCGAA CAAGGGTGAT TGGATAACGT CTAAATTTAA GGCTATTATT GTTTGTGAAT TTGAATACAT CCGTATATGG TCTCGACCAG AGGCGATGGC CAGATGTCTG GAGTTCTATG AGAGATTCTT TATGATTGCT CTACCTGATT TCACCGCTGG CAGAGAGGAT TCTCTTCTAT ACGATGAGAA TGCTCTCGTA GTTGCACACG AGCTTGCTCA GTGGTGGGAT GATACGTGGT TGAACGAAGG GGACGAAATT AGCCACAACA

GGAGTGGCAG AAGCGTCGAA TCTTGGGCTT TGTATTAGCT GCTGCCGTTG GACTCTCCAT ATTCGATACC ACACAAAAAG AACAGAAGGA TCCTTCTGCA GAAGAACTAC TTCTTCCAAC CATCAAAACA TATCTACCGG GTTACGTGAA TGCCCATGTG GAGATTGCTA TGGTTGTGGT GAAGAAAATC ACTTTGGCAC AAGGAGGATG CATCGAAAGT GTAAAGATGC AGGAAAGACT GCTGCAAAAA GATCTGAAAA TCCTGCTCAA TCTCGGTGGG CTCTACCAGT CCATCTACAC TGTTTCACAA AATGAACCAT CAGACGCTCG GTACAAGGCA ACATGGACTG TCACCGTCGT CGGCATTGAA GCAAATGGAA AAGGGGAGCT AACTACCCCA CCGATGTCGT CCTATTTATT TGAAGGATTT ACAAAAACAG GTGTACGGTT AATGACGGGA TATGCCCTGG ATGCTGGCAT TGACATCAAA TTCCCTCTGG AAAAACAAGA TGCTATGGAA AACTGGGGTC TTATCACTTA AATTTATGCG CCGATGAATA AGCAGCGGGT TCAGTGGTTC GGCAATCTGG TCACATTGAA TTTTGCGACA TTTGTTGAAT ATCTTGGAAT

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1280

1675

1680

1685

Informație pentru secv.iD Nr. 11

Caracteristici oe secvență;

1690

Lungim^.; 1293 baze perechi Ții-P; acid nucleic Im.pletire.; dublă Topologie; lineară

Secv.ID Nr.ll

1695

GGTTTAATTA CCCAAGTTTG CATTGCTGAA TCTAACTCCA TCGGCCTCTC TATTGGTCTC AGCCAGGGAA GGATGATACT TACTCCTTCC AAGTAATATA CTGGTTATGT GGACTTCCCA CAATGGTTGT AATTGAGCCA TACCCCAAGA ATGTGAACTG AGCACCCAAG ACTGGAAAAG AAATCTTGCT CAAGGTCGGC AGACCACTTA TACCACCCCG CCATAGATGC TCGTCGAATG CCGTTACTGT CATTCATCCA GAGATGGAGA GATCAGTGGT CATCCTACTT GTTGGCAGTT CGGGTGTTCG GTTCCGTATA TGCAATCTGG TATCAAGTGC TGAAGAAACA AGATATGATT GCCTCATCAC TTACAGGGAA ATAAACAGCG AATTGCTCGC TGGTTACGAT CAAGTGGTGG AATTCACTGG AGCTGGTCAG

AGGGTCTCCA TCTAGATGAC ATCCGTCTTA TTGTCGCATT ACCTATTACT TTACTCGCAA GGTGGCAAGG ACAAAGACAA AAACCATTGT CTTACGACTT CCGGAGAAAA ACCTCACATT ACAAAGAGTA TCGTACTCAA GTATCGGGCG ATAAAAAACT GTTGAGTTTC TTATCAAAAG TACATCGGTC TCATCAGCAA GATGGCACCC CTAAGATCGC GTACCATGCA TGGATGAACC AAAGGCACCA AAGCCGTCTC GATTGGATCA CATCGAAGTT ATGGTTTCAG AATTTGAATA TGGTCACGCC CAGAGGCAAA ATAGAATTCT ACGAAGATTT GCCCTTCCTG ATTTCTCTGC AACTCTTTGT TGTACGATGA ATTGTTGCTC ATGAGCTTGC GATAATTTGT CCTTGAATGA ATAACTCAAG ATG

GTCGCAGGGG AGAACGCGGA ATTTCTAGTA GCTGCTGCAG AGCGTTCGAT ACCTCAGAAA TTCTCCCTCT GCGGCGGAAC GACGATCAAA ACATATCTAC CGATGGGCGT GTGGAAATAT TTCAAAGAAG ATCTCTGTAA CGAAATTGAA AGTGTAAAGG CCAACTGGAA AAAGATCAAC CAGCCTTGGT GGAATCTACC TGCAGTTTCA CAAAATGAGC GAAATACAAA GCAAACTGGA GAATGGAATC GAAGTGAACG CTTGACTACT CCACGGATGT CATCGAAGGT GAAACAAAGA GAAGATGĂCA CAATATGCTC CTTTGATATC AGATTCCCTC CGGTGCCATG GAGAATTGGG CAGATTCTAT GCACCGATGA TCATCAGTGG TTCGGCGACT AGCTTTTGCA AGATTCACAG

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

126 0 ] 293

1700

1705

1710

RO 117709 Β1 informație pentru secv.lD Nr.

Caracteristici o_c secven tă:

Lungime; 746 baze perechi Tip: acid nucleic împletire; dublă Topologie: lineară

Dese rie rea secvenței;

Secv.LD Nr. 12

CTTGAAGAAA GCGACCGACT CAGGAAGGCG CAGTTGGAGA AAGGGACTTC CATGATGTGT CTCACAGAGC CGAGTGATCA AATCTATACA AGATCGGAAC AAAAAATCTA ATCATCCAAA TGTCATCGAT

TGAAAAAGCT GCGCGAAGGT GTGATGAGGC AAGACAGTCT TTATGCTGGC TTAACATTGT GATGGGAAGA AAGCCTGTAC AAAATGACAA ACAGAGTCAA ATTCATAATT AAGATTAATG TCAAGTGTCT

TTTTGACAAG AACTGCTCC7 ATTCGACAAG ACGTGAAGCA GTTGGATCGG ATCCAGAAAT GATACTTGAA TCGAGGACTA GCGTGCTCGC ATGGATTGAG CTGAAATGGC

GTATTG

GAGGTCATGA CTCCGAAAAA GTGATGGAAC TTGGGATGTC AATTCGTCAT CCTGTTGGAA AGTTTGTCAA CGATCCAGGG GAATACGGTG AAACATTTCC TATAACTAGC ACTAGATAAT

AATGTCAACC CTGTTTACTG TATATAATGC ATAAAGACGT TTGTGCGTCT ACGAACTGCT TACGACACAG AACAAGTACA CATTTGGTGG GAAAACTAGC ACACTGGATA ATGGAGATAT

TGGTCAGCAA CTATGGGGTC GGAACAAGTC TACTGCTCTA TCAAGATGCT GTTCAATTTC ATCAGTTGAT ACAGTTGAAG GGCAATAGAA AGCTTTCTTC GTTGTCTCGA TCTGTAAATT

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

746

Informație pentru Secv.ID N.r. 13

Caracteristici de secvență;

Lungime; 1274 baze perechi

Tip: acid nucleic

împletire;	dublă
Topologie;	1 in ea ră
Descrie rea	secvenței; Secv.io. Nr.13

TCTTGAAGAA GCAAGCGACC GGTCCAGGAA AGTCCAATTG TCTAAAGGGA TGCTCATGAT TTTCCTCACA TGATCGAGTG GAAGAATCTA AGAAAGATCG CTTCAAAAAA TCGAATCATC AATTTGTCAT GAATTTTTGA ACCAATCTTT TTTCATTATT GTGATTTACT AGACTTTGTA GTGATGAACT TCTTCATGCC AATGGAATTC AAAAAAAAAA

ATGAAAAAGC GACTGCGTAA GGCGGTGATG GAGAAAGACA CTTCTTATGC GTGTTTAACA GAGCGATGGG ATCAAAGCCT TACAAAAATG GAACACAGAG TCTAATTCAT CAAAAAGATT CGATTCAAGT TGGAATTATT GAGAGAAATC GTAATTTTTG CGAGTAATTT GCTCAACTGT TACCTGAAGT ATTGTTCTTT TAATTTTCGT AAAA

TTTTCGACGA AGGTAACTGC AGGCATTCGA GTCTACGTGA TGGCTTTGGA TTGTATCCAG AAGAGATACT GTACTCGAGG ACAAGCGTGC TCAAATGGAT AATTCTGAAA AATGATGTTT GTCTGTATTG TTCTCCTCAA TTTTGCAATA TACTCTTCAA TATTCTTCTC TTTCTGCCCT TGTAGGTTTT GGACTTTCTC TTACTTACAT

AGAGGTCATG TCCTCTCCGA CAAGGTGATG AGCATTGGGA TCGGAATTCG AAATCCTGTT TGAAAGTTTG ACTACGATCC TCGCGAATAC TGAGAAACAT TGGCTATAAC TTTTACTAGA CAGCCACATT AATAGACACT TACCCTAAAT ATGACGTATT AATTGCAGTG GCTGTCTTCT AAGAAAGAAA ATGCTTCACA AAAAATCACT

AAAAAATCTA AAAACTGTTT GAACTATATA TGTCATAAAG TCATTTGTGC GGAAACGAAC TCAATACGAC AGGGAACAAG GCTGCATTTG TTCCGAAAAC TAGCACACTG TAATATGGAG ACATATCTCG ATGCGCTAAC AGCCCTTGGG TCCAACATGA CCTTATTGTT TCTCTTTATC TAACTATTTT TTGTAGAGAT TATTGCCTAA

GACCTGGTCA ACTGCTATGG ATGCGGAACA ACGTTACTGC GTCTTCAAGA TGCTGTTCAA ACAGATCAGT TACAACAGTT GTGGGGCAAT TAGCAGCTTT GATAGTTGTC ATATTCTGTA ATGGTTCTGT TCCCATTATT AACTAGCTTT CACATTCTCA ATTCGCTTTG TACTACTTCA CCATAACTCA ATTTACTAAA AAAAAAAAAA

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1274

RO 117709 Β1

Informație pentru Secv.ID Nr. 14

Caracteristici de secvență;

Lungime; 3296 baze perechi Tip: acid nucleic împletire; dublă Topologie;linea ră

Descrierea secvenței; Secv.IO Nr. 14

1750

1755

GCTGAATCTA CCTCTCTATT AGGGAAGGAT TCTTCCAACC TTATGTGAAC GGTTGTAATT CCAAGAATGT CCCAAGACTG CTTGCTCAAG CACTTACACC AGATGCTCGT TACTGTCATT TGGAGAGATC CTACTTGTTG TGTCCGGTTC TTATGGTATC AAAACAAGAT TATCACTTAC ACAGCGAATT TACAATGAAG CATTGGAGCT TGTACTTGAA AATCGACAAA TTCTGTTCTT GCAGTACCTC CGATGAAGTT TGCAAGTCAG GACTACTTTG GAAGTACCGT CGATAAGAAG TAGTAATCCT TCATGACGCT TAGTCCTCGG AATTGAGTAT ACCGTTGGAA GGAAGCAAAG CAGTATCGAG CCAAAAGGAT TAAAAAACTT ATGCGTGAGA CGGTGATTAT AAAAGACTTC TCTCTTGCGG TTTCAACGAT GAGATGGCCA ACCAGCCTGC GAAAAATGGC AAATAGGGTG CACCTTGTAG GTGGGAACTG TTTTTACCAT AGTATTAGGA CCCTCTTCCT CACTTTCTCC TTGTATAGAT

ACTCCAATCC GGTCTCACCT GATACTGGTG AATATAAAAC TTCCCACCGG GAGCCAACAA GAACTGGTAT GAAAAGGTCG GTCGGCTATA ACCCCGAATG CGAATGGTAC CATCCAAAAG AGTGGTGATT GCAGTTATGG CGCATATGGT AAATGCATAG ATGATCGCCC AGGGAAAACT GCTCGCATTG TGGTGGGATA GGTCAGATAA CGCGCTTTGA GCTGCAGAAG ACTATGTTGA AAGAAGTTCT GTCACTGACG TGGACGACTC AAATTAACGC CATCCGAAAT GAGATAAAGC GGTGCTCCAT AATGGTTGGA ACAAGGAATG GAGACTGTTT ATAGCAATGT CCAGCTCAAG TTCATTACCA GTCGTTGATA TTCGATGACG ATCGCCGCTC GCTTTCGACA CTACGCCTAG GCTCTGGACA GTAGCAGCAA GATATCATTG ACTTCAGGAA ATAAATGCTC GATTGGATTA TTTGAATTAC ACTGTGTGTT TTGCCTTCCA CCCAGTGATC ACCTGAATTC TCGATAGCTT TAGTTATCTG

GTCTAATTTT ATTACTTTAC GCAAGGGCAA CATTGTCTTA AGAAGAATCT AGAGTATCGT CGGGCGATAA AGTTTCTTCT TCGGCCTCAT GCACCCCTAA CATGCATGGA GCACCAAAGC GGATCACATC TTTCAGAATT CACGCCCAGA AGTTCTACGA TTCCTGATTT CTTTGTTGTA TTGCTCATGA ATCTGTGGTT CTAAAGATGA AAGCTGATTC TTGAAGAAGC GAGCCTTGAT CGTATAGCAA TCGAAGGTCC AGATGGGCTT AAAGTCGATA ACGGAT7TAA GAACATGGCT TTGTGGTGAA AAAAGATAAT TCATCATTAG TTGAACTTCT CCGGGATCTC TGTACA7GAT ATAACTACAG TGTTCTGCGC AAGTCATGGC CTCTCCGATC AGGTGATGGA CATTAGGATG GGAATTCGTC ATCCTATTGG AAAGTATAGG TCCGCTCACA GTCAATTTGG AAAAACATTT GTCGCCATTA GGTTACTGTT TGAGGGGTCA AATATTACTT AGAAATTTGT TTTGTTTGTT ATAAATATTG

TGCATTATTT TCGCAAAGCG AGACAATTCT CGATTTGACG CACATTCGAT GCTCAATTCA AAAACACGAA TAAGAACCAA CAGCAACAGT GATCGCTGCA CGAACCGAAA CGTCTCGAAT GAAGTTCTTG TGAATACATT GGCCAAGAAG AGATTTCTTT fTCAGCAGGA CGATGACAGA GCTTGCCCAT GAATGAAGGT CGCCAGAATG GGTAGCGTCA CTTTGATGAT TGGAGAAGAA TGCAGAAGCG AGACGGCAAA CCGAGTTATT TAAGGCGAAT ATGGGATATT GAGAAGAGAT CGCAGACCGC CAAGCAGCTC CGATGCGTTT GAAATATGCC TTCGATTTTG GAACATATTG AAACGACACG CCTTGGATCG GAAATGCAGG AAGTGTTTAT GCTTTATACG TCACAAAGAT ATTCGTACGT CGAAGAATTC AACGAAGCAC ACAGCAGATT TGCATTCGAT CCAAAAATTA ATCCAGATCT CCACTGAATG TTGTTGTCAC TTGCTTCATC TCATATTCGT TTTCTTTTGA ATGGCTAAAA

CTAGTAGCTG TTCGATACCT CCCTCTGCGG ATCAAAACAT GGGCGTGTGG AAGAAGATCT ATTGAAAGTG CTGGAAAAAG CTTGGAGGAA GTTTCACAAA TACAAAGCAA GGAATCGAAG ACTACTCCAC GAAGGTGAAA ATGACAAAAC GATATCAAAT GCCATGGAGA TTCTATGCAC CAGTGGTTTG TTTGCAAGAT AGGAACTACT AGCCATCCAC ATCACATACG AAACATAAGC ACTGATCTAT CCTATGAAAA TCCGTAGCAG AAAGACGCTG CCATTGTGGT GAACCGCTTT TATGGATTTT AAGGACAATC GCTGCAGCCG GAAAAAGAAA AAGTACTTCG AAGCCGATGT CTGTTTTTCC CAAGACTGCA GATGGTCAAG TGTTATGGTG GCCGAAACAC GTTACTGCTT ATGCAGGATA ATTTTCAATT ACATATGTTG GACCAGCTGA AAAGCAATCG GCGGCTTTCT TAAAGCTCGC GAAGTTTTTA TTGAATAGTA AAATTGTTAC TTGTAGTCTG TTGTATTGAT AAAAAAAAAA

CTGCAGTCGG CAGAAAAGCC CGGAACTACT ATCTACCTGG AAATATCAAT CTGTGATACC TAAAGGAGCA ATCAACAAAT TCTACCAGAC ATGAGCCCAT ACTGGACCGT TGAACGGAGA GGATGTCATC CAAGGACGGG TTGCTTTGGA TCCCTCTGAA ACTGGGGTCT CGATGAATAA GGGACTTGGT TCACGGAATT TTCTGATTGA TTTCCTTCAG CCAAAGGAGC ATGCAGTATC GGGCAGTTTT CCACGGAATT AGTTTAAC7C TGGAGAAAGA ATCAGGAAGG ACTTGCATGT ATCGACAAAA ATGAGGTTTA CAACTGACGC CGGAATACCT GTACCGAGCC ATGAAAAAAG AAATCAACC7 GGCAGAAATA CAGCAACCGA TGAAGGAAGG TTGCCCTAGA TGAAAGGACT TCCCAAGTGC TCCTCATTGA AGAAAGTGAT AGAATCTGCA AACGAGCACA TCAAGAAAGC TAAGGAATAT CCCACAAAAA AACAAAGCTC CTTCTCTATA TTGCTCAGAA CGTTTTACAA AAAAAA

120 180 240 300 360

420 480 54 0 600 660 720 780 840 900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 27 00 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240

3296

1760

1765

1770

1775

1780

1785

1790

RO 117709 Β1

Informație pentru Secv.IO Nr, 15

Caracteristici de secvență:

Lungime: 3319 baze perechi Tip; acid nucleic împletire; dublă Topologie; lineară

Dese rierea secvenței:

Secv.IO Nr.15

GCTGAATCTA CCTCTCTATT AGGGAAAGAT TCTTCCAACC TTATGTGAAC GGTTGTCATT CCCTGAATGT CCCAAGACTG CTTGCTCAAG CACTTACACA AGATGCTCGT TACTGTCATT TGGAGAGATC CTACTTGTTG TGTTCGGTTC TTATGGTATC GAAACAAGAT TATCACTTAC ACAGCGAATT TACGATGAAG CATTGGAGCT TGTACTTGAA AATCGACAAA TTCTGTTCTT GCAGTATCTC CGATGAAGTT CGCAAGTCAG GACTACTCTG GAAATACCGT CGATAAGAAG GAGTGATCCT CCACGACACT CAGTCCCCGG GATTGAGTAC ACCGTTGGAA CGAGGCAAAG CGATATCGAC CCAAAAAGAT TAAAAAACTT ATGCGTGAAA CGGTGATTAT AAAAGACTTC TCTCCTGCGG TTTCAACGAT GAGATGGCCA ACCAGCTTGC GAAAAATGGC AAATAGGGTG CACCTTGTAA GTGGGAACTG TTTTTACCAT AGTATTGGAC CCTCCTCCTA ACTTTCTCTT TGTATAGATT AAAAAAAAAA

ACTCCAATCC < GGTCTCACCT ) GATACTGGTG < AACATAAAAC < TTCCCACCGG < GAGCCAACAA < GAACTGGTAT ( GAAAAGGTTG GTTGCCTACA ' ACCCCGGATG i CGGATGGTGC ' CATCCAAAAG < AGTGGTGATT < GCAGTTATGG CGTATATGGT AAATGCATAG ATGATCGCCC AGGGAAAACC GCTCGCATTG TGGTGGGATA GGTAAGATAA CGCGCGTTGA GCTGCAGAAG ACGATGCTGA AAGAAGTTCT GTCACTGATG TGGACAACTC AAACTAACGC CATCCGAAAT GAGGTAAAGC GGCGCTCCAT AATGGTTGGA ACAAGGAATG GAGACTGTAT ATAGCAATGT CCAGCTCAAA TTCATTGCCA GTCATTGATA TTCGATGACA ATCGCCGCTC GCTTTCGACA CTACGCCTAG GCTCTGGACA GTAGCAGCAA GATATCGTTG ACTTCAGGAA ATAAACGCTC GATTGGATTA TTCGTATTAC ACTGTCTGTT TTGCCTTCCG CCAGTGATCA CCTGAATTCA CGATAGCTTT AGTTATCTGA ΑΑΑΑΑΑΑΑΛ

GTCTAATTTT ' ATTACTTTAC ' GTAAAGACAA i CATTGTCTTA < AGAAGAATCT < AGAGTATCGT < CGGGCGGTAA , AGTTTCTTCT ' TCGGCCTCAT i GCACCCCCAA i CATGCATGGA ' GTACAAAAGC GGATTACGTC ' TATCAGAATT CACGCCCAGA AGTTCTACC-A TTCCTGATTT CTTTGTTGTA TTGCTCATGA ATCTGTGGTT CTGAAGATGA AAGCTGATTC TTGAAGAAGC GAGCGTTGAT CGTATAGCAA TCGAGGGTCC AGATGGGCTT AAAGTCGA7A ACGGATTCAA GAGCATGGTT TTGTGGTGAA AAAAGATAAT CCATCATTAG TCGAACTTCT CTGGAATCTC CATACATGAT AAAACTACAA . TGTTCTGCGC , AAGTCATGGC : ctctccgatc . AGGTGATGGA ; CATTAGGATG , GGAATTCGTC , ATCCTATTGG ; AAAGTATAGG i TCCGCTCACA : GTCAATTTGG k. AAAAACATTT : ATCACCATGA ' GCTTACTCTT ; TGAGGGGTCA < ATATTACTT7 < CACATTTGTT Γ TTGTTTGTTT \ TAAATATTCA

TGCATTATTT ( TCGCAAAGCG ' AGATAATTCT < CGATTTGACA i CACATTTGAT < GCTGAATTCA , AAAACTCGAA , TAAGAACCAA < CAGCAACAGC ' GATCGCTACA < TGAACGGAAA ‘ CGTCTCGAAT i GAAGTTCTTG . TGAATTTATC GGCCAAGAAG AGATTTCTTT CTCAGCAGGA CGATGACAGA GCTTGCCCAT GAATGAAGGT CGCCAGAATG CGTAGCGTCA GTTTGATGAT CGGAGAAGAA TGCAGAAGCG AGACGGCAAA TCCAGTAATT TAAGGCGAAT GTGGGATATT AAGAAGAGGT . TGCGGACCGC CAAGCAGCTC ; CGATGCGTTT ' GAAATATGCC : TTCGATTTTG GAACATATTG > GGACGACAAG : CCTTGGATCG : GAAATGCAGG : AAGTGTTTAT V GCTTTATACG ; TCACAAAGAT : GTTCGTACGA ; CGAAGAATTC ; AACGAAACAC < ACAACAGATT ; TGCATTCGAT ‘ CCAAAAATTA \ ATCCAGATCT Γ CCACTGAATG TTGTTGTCAC Γ CGCTTCATCG Γ CATATTTGTT Γ TTCTTTTGAT \ TGGCTAAGGA

CTAGTAGCCG < TTCGATACCT < CCCTCTGCGG ( ATCAAAACAT i GGGCGTGTCG . AAGAAGATCT 1 ATCGAAAATG ' CTGGAAAAAG . CTTGGCGGAA GTGTCACAAA . TACAAAGCGA GGCATCGAAA ACTACTCCGA GAGGGTAAAA ATGACAAAAC GATATCAGAT GCCATGGAGA TTCTATGCAC CAGTGGTTTG TTTGCAAGAT AGGAACTACT AGCCATCCAC ATCACATACG AAACATAAGC ACTGATCTAT CCTATGAAAA TCTGTGGCAG AAGGACGCTG CCATTGTGGT GAACCGCTTT TATGGATTTT AAGGATAATC GCTGCGGCTG GAAAAAGAAA AAGTACTTCG AAGCCGATGT CTGTTTTTCC CAAGACTGCA : GATGGCCAAG TGTTATGGTG ; GCCGAAACAC GTTACCGcrr . ATGCAGGATA . _ATTTTCAATT: ACATATGTTG ’ GACCAGCTGA ' AAAGCGATCG i GCGGCTTTCT ' TAAAACTCAC i GAAGTTTTTA : TTGAATAGTA ; AATTGTTACC ’ TGTAGTCTGT Γ TGTATTGATC \ AAAAAAAAAA

CTGCAGTCGG CAGAAAAGCC CGGAACTACT ATCTACCTGG AAATTTCAAC CAGTAATACC TAAAGGATCA ATCAACAAAT TCTACCAGAC ATGAGCCCAT ATTGGACCGT CGAACGGAGA GGATGTCATC CAAAGACAGA TTGCTTTGGA TCCCCTTAAA ACTGGGGTC? CGATGAATAA. GCGACTTGGT TCACAGAATT TCCTGATTGA TTTCCTTCAG CCAAAGGAGC ATGCGGTATC GGGCAGTTTT CCACGGAATT AGTTTAACTC TTGAGAAAGA ATCAGGAAGG ACTTGCATGT ACCGACAAAA ATGAGGTTTA CAACTGACGC CGGAATÂCCT GTACCGAGCC ATGAGAAAAG AAATCAACCT GGAAGAAATA i CAGCAACCGA : TGAAGGAAGG : TCGCCCTAGA ‘ TGAAAGGACT - TCCCAAGTGC ‘ TCCTTATTGA ! AAAAAGTGAT <. AGAATCTGCA : AACGAGCACA ’ TCAAGAAAGC : TAAGGAATG7 v CCCATAAAA.A < AACAAAGCTC : TTCTCTATAC ’ TGCTCAGAAC : GTTTTACAAT \ AAAAAAAAAA

120

180

240

300

360

420 4 80 540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820

2’80 29 10 3 0 00 3vt.O 3 120 3180 3240 3300 3319

RO 117709 Β1

Informație pentru Secv. ID Nr. 16

Caracteristici de secvență:

Lungime : 3o aminoacizi

Tip: peptidă

Descrierea secvenței: Secv.ID Nr. 16

1840

1845

Asp Asn Ser	Pro Ser Ala	Glu	Glu	Leu	Leu	Leu	Pro	Thr	Asn	Ile
1	5				1q					15
Lys Pro Val	Ser Tyr Asp	Leu	Lys	Ile	Ala	Thr	Tyr	Leu	Dro	Gly
	2o				25					3o
Informat ie	pentru Secv.	ID	Nr.	17

de secvență:

1850

Lungime; 15 amino	acizi
Tip: peptidă
Descrierea secvenței: Secv.	ID	Nr.	17
Leu Tvr Leu Ala Glu Asp	Val	Gin	Leu	Xaa	Lys	Ile	Leu	Phe
Ί X	5				lo				15
Informație pentru	Secv.	ID	Nr.	18
Lungime: 15 amino	acizi
Tip: peptidă
Descrierea secvenței: Secv.	ID	Nr.	18
Leu Ala Tyr Asp Glu Lvs	Se r	Tyr	Ala	Pro	ASp	Asn	Gin	Tv r
1	5				lo				15

1855

1860

1865

1870

RO 117709 Β1

Informație pentru Secv. IO Nr«19

Caracteristici de secvență;

Lungime; 3o84 baze perechi

Tip: acid nucleic împletire· dublă Topologie; lineară

Descrierea secvenței.; Secv.lD Nr.19

GGTTTAATTA < ACCACGAAAA 1 GGTAGCTGCT < TGATACTACT I AGCTGAAGAA ' AACGTATCTG ' TGTGGTGATT < TATTCCTGTA . AAAGGTTGTG GAAGAATCAG AGGACTTTAT TCATATGGAA GGCAAACTGG AGAAAAGGGA GCGAATGCCT TACGAAAAGC ATATGCCATG ATTCCCACTT GAACTGGGGT ACCAATGAAT CGGTAATTTG ATTCGTGGAA CTTCCTGCTG GCTTTCCTTC CCGTAAAGGA GCAGTCTGTT ATGGGCAGCA AATGTCCGAG GTCGGTTAAC AAAGGAACCA GTATCAGGAA TTTCCATGTA CCGATCAAAC TAAGGTCTAT AGTTGAGGAA GGATTACTTA CAGCGAACCC TGACAAGAGT AAATAATCTC TGAAGAAATG GACCGACTGC GGAAGGCGGT GTTGGAGAAA GGGACTTCTT TGATGTGTTT CACAGAGGGA AGTGATCAAA TCTATACAAA ATCGGAACAC AAAATCTAAT CATCCAAAAA TCATCGATTC

CCCAAGTTTG . AATACAGTGC ‘ GCCGTCGGCC ‘ GGCGGAAATG < TTACGTCTCC ¹CCAAACTATG GCTATGGAAG ATTGCAGACC GATCAGCCAA AAAATCACGC CGAACAACCT CCGACGGACG ACTGTGACTG GAAGGAGAAG TCGTATTTGA GGTGTTCGAT ATAGCTGGAA CCAAAACAAG CTCATCACAT AAGGAGCGGG GTCACGATGA TACATCGGAG GCACCGTACA AGAATAGATA GCATCCGTTC TCGCGTTACC TTCGACGAAA TTTGCGCCAC GCAACGACTT GAGAAGTACC GATGAACAGC AGCAATTCTG TATGACGCTA GGTCCACGAA ATGAATTACG CCATGGAAGG : GAATCTCAAT AGCATCAAGT CAAATAGCTG ; AAAAAGCTTT : GTAAAGGTAA ¹ GATGAGGCAT , GACAGTCTAC ' ATGCTGGCTT ‘ AACATTGTAT . TGGGAAGAGA GCCTGTACTC AATGACAAGC AGAGTCAAAT TCATAATTCT GATTAATGAT AAGTGTCTGT

AGATGACAGC . TACGGCTCAC < TCTCAATCGG ' GAAAAGGGGA ' CAACAACCAT . TAAACTATCC TTGTGGAGCC AGTGCGAACT GGCTGGAGAA TCAAGATTGT ACACGGATAA CCCGTCTTA7 TGATTCATCC TCTCTGGCGA TTGCTCTTGT TCCGAATTCC TCAAATGT7T ATATGGTTGC ACAGGGAGGG TTGCAGAAGT AGTGGTGGGA CCGACTTCA7 CAAGTGGTAT AGGCTGCAGA TTCAAATGCT TCAAGAAGTT CCGTCCAAGG : AATGGACAAC ' TGAAAGTCAC : GTCATCCAAC ; AAGTGAAAAG i ATTCGTCAGT > ACGGTTGGAG . CAAGAAACGC ; AGACCGTATT AGGCAATATC GGGCTTCGGA TTATAGCGGA TTATTGACAC TTGACAAGGA CTGCTCCTCT TCGACAAGGT GTGAAGCATT TGGATCGGAA CCAGAAATCC TACTTGAAAG GAGGACTACG GTGCTCGCGA GGATTGAGAA GAAATGGCTA ϋΤΓΤΤΤΤΤΑΟ ATTG

AGAGGAGAGT I CCCAATCAAG ' TCTCACCTAT · TCAACCTATT ( AAAACCTTTG . ACCTGAGAAA ' AACAAAGTCT GTTTTCTAAC AGTCGAATTC ATACATTGGC AGATGGTACA GGTCCCCTGT GAAGGGCACC TTGGGTCACA GATTTCCGAA GGCTCGTCCG GGATTACTAT TCTTCCTGAC TTCCGTGCTC GATCGCGCAC TAACCTATGG CAGCGATGGT TACGGCTGAT TGTATCAGAA ATTGAATTTA TTCATATGAT TATAACCGGA : TCAGATGGGG : CCAAAAACGA : TTATGGGTTC i AACTTGGTTA ' TGTGGTGAAT GAACATTATG TCTCATAAGT TGAAATGCTC AGGATTCAAT ATACATGCGA GAACTACAAA ATACTGTGGT GGTCATGAAA CCGAAAAACT GATGGAACTA GGGATGCCAT TTCGTCATTT TGTTGGAAAC TTTGTCAATA ATCCAGGGAA ATACGGTGCA ACATTTCCGA TAACTAGCAC TAGATAATAT

CAGGAGCAGG > TCTCTCTTTG i TACTTTACAA < GTCGATGATA . ACATACGACT ' GATTTCGCTA ATTGTGCTCA AACCAAAAAC gttttgaaga CTTATCAACG ACCAAGATTG TTCGACGAGC agtgccgtgt ACCAGATTCG TTTAAGTACA GAAGCTATGA GAGGACTTCT TTCTCATCTG TACGATGAAA GAACTTGCAC CTGAACGAAG CTATGGGAAA GCAGTAGCTT GCGTTCGATG GTTGGGGACG AATGCGGCTG CCTAATGGTG TTCCCTGTTC TACAGGCAGA : AAATGGGATG . AAAAGAGAGG ’ GCCGAACGTC ; AGAAGACTCA ¹ GATGCGTTTG : AAATACACCG • ACAATTTTGG AAACTGATGA AAAGATTCGC CTTGGAGGCA TGTCAACCTG GTTTACTGCT TATAATGCGG AAAGACGTTA GTGCGTCTTC GAACTGCTGT CGACACAGAT CAAGTACAAC TTTGGTGGGG AAACTAGCAG ACTGGATAGT GGAGATATTC

AGACGCAGCA CTTTGTTAGT GGAAAGCTTT ATTCCCCATC TAGTAATCAA TTGATGGGAC ACTCGAAAAA TCGACATCGA AAAAGCTGGA ACATGCTTGG CTGCATGCAC CGACGTTTAA CGAATGGAAT ATCCAACCCC TTGAAAATTA

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

AGATGACAGA	960
TCGGGATCAA	1020
GTGCTATGGA	1080
ACCTCTACGG	1140
ATCAGTGGTT	1200
GATTCGCGTC	1260
TGAAAGATTT	1320
CAAGCCATCC	1380
ATATCACATA	1440
AAAATTTCAA	1500
CTGAAGATTT	1560
GACCATTGAA	1620
TTACTGTCGA	1680
ACAAGGATGC	1740
TTCCTCTGTG	1800
AACCGCTCTA	1B60
GTGCTTTTTG	1920
AGCAGAATCA	1980
CAGCAGCTGC	2040
TGAAAGAAGA	2100
ACTTTTTCGG	2160
AGCCAATTTA	2220
TTTTCTTCAA.	2280
AAGAATGTCT	2340
GTCAGCAAGC	2400
ATGGGGTCCA	2460
AACAAGTGCA	2520
CAGCTCTAAA	2580
AAGATGCTCA	2640
TCAATTTCC7	2700
CAGTTGATCG	2760
AGTTGAAGAA	2820
CAATAGAAAG	2880
CTTTCTTCAA	2940
TGTCTCGAAT	3000
TGTAAATTTG	3060 3084

RO 117709 Β1

Informație pentru Secv.ID Nr. 2o

Caracteristici de secvență:

1915

Lungime: 3358 baze perechi Tipt acid nucleic împletire; dublă Topologie; lineara

Descrierea secven.tei; Secv.ID Nr.2o

1920

GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AGATGACGGC CTCACCTATC AGCCTACTTT GTACATTATT TGGTCTTACC TATTACTTCA CTCGTAAAGC TGACAGTGGT GGTAAAGAAA AGGATAATTC GAACATAAAA CCAGTCTCGT ACGACTTGAA CTTTCCACCA GAAAAGAATC TCACATTTGA TGAGCCTACA AATAGTATTG TGCTGAACTC CGAACTGTTC TCAGGTAATC AGAAACTTGA TGACAAGCTT GAGATTACCC TCAAAAATCA GATCACTTAC ACCGGCCTTA TTAGCGACAC TGATAAGGAC GGAAAAACTA AGATCGTTGC TCGTATAGCG CCATGCTTTG ACGAACCGAA TCATCCCAAA GGTACAAAGG CTGCATCGAA CAAGGGTGAT TGGATAACGT CTAAATTTAA GGCTATTATT GTTTGTGAAT TTGAATACAT CCGTATATGG TCTCGACCAG AGGCGAAACG CAGATGCCTG GAGTTCTATG AGAAGTTCTT TATGATTGCT CTTCCTGATT TCACCGCTGG TAGAGAGGAT TCTCTCCTAT ACGATGAAAA TGGTCTCGTA GTTGCTCACG AGCTTGCTCA GTGGTGGGAT GATACGTGGT TGAACGAAGG GGACGAAATT AGCCACAACA ATTTCAGAAC TCGCGGAATG AGAGCTGACT CGGCAGCATC AGCGGCAGAA GTTGCCGAAG CCTTTGACGA CACTATGCTA CGGGCTTTGA TTGGAGAGGA CAAGAAGTTC TCCTACAGCA ATGCACAAGC TGTCAAAGGT GTTAAGGGTC CTGACGGCAA GTGGACGTAT CAGATGGGTT ATCCTGTGGT AAAGGTTACG CAGAGCCGGT ACAAGACAAA TAATCCAAAA TACGGGTTCA AGTGGGATGT AGAGGTGAAG CGAACATGGC TAAAAAGAGA GGATACATCC CTTGTGGTGA ACGCTGATCG CAACGGTTGG AAAAAGATAA TCAAGCAGCT GACAAGGAAC GCTATCATAA GCGATGCATT TGAAACTGTA TTCGAACTAC TTGAATATGC GGAAGCTCTG TCCGGCATGT TCGCAGTTTT ACCAGCTAGA GCTTACATGA TGAGCATATT TTACATCGTC AAGAATTATT TGGATGATAC TATCATTGAT GCATATTGTT CCCTTGGATC CTTCTACGAT GAGGTTATGC CCAAGTGTAA GGTTTCCGCT CCTCTTCGAG CCAATGTTTA AGCTTTTGAA AAGGTGATGG GGGTGTATCT CCTGTTCAAA GCCTTGGCAT GCCACAAAGA AGCCCTGGAC CGTAAATCGT CGTTTGTGCG TGTATCTGAA AACCCTGTGG GCGAAGAATT GGAAATCACT GCGAGCTTGG AAACAGAACA TTCCACAGGA ATTCGCTCCC AACAACAAAT TGCGCAGGCT AAGAAGTTCG GCTCATTCAC TGCCTGGATC AAGAAACATT TTCACACATT GCriTTCACA CTGAGCTCCA ATTTTAACGT GTCAGTTTCA CATTTTCCGT TTGAATGCCA TAAGTACCTT TCATTCACAG TGATTACTGA GAACGTTATG ATCGGTGACT TTCAATTTAT GACTTGCATT TAAGACCCAC CATTTACCAG TCCGATCACC TCCACCGCTG ACAATGCCCA CTGTTTCGAT CGCCGGTTGT TTGTCAATTG

GGAGTGGCAG AAGCGTCGAA TCTTGGGCTT TGTATTAGCT GCTGCCGTTG GACTCTCCAT ATTCGATACC ACACAAAAAG AACAGAAGGA TCCTTCTGCA GAAGAACTAC TTCTTCCAAC CATCAAAACA TATCTACCGG GTTACGTGAA TGCCCATGTG GAGATTGCTA TGGTTGTGGT GAAGAAAATC ACTTTGGCAC AAGGAGGATG CATCGAAAGT GTAAAGATGC AGGAAAGACT GCTGCAAAAA GATCTGAAAA TCCTGCTCAA TCTCGGTGGG CTCTACCAGT CCATCTACAC TGTTTCACAA AATGAACCAT CAGACGCTCG GTACAAGGCA ACATGGACTG TCACCGTCGT CGGCATTGAA GCAAATGGAA AAGGGGAGCT AACTACCCCA CCGATGTCGT CCTATTTATT TGAAGGATTT ACAAAAACGG GTGTTCGGTT AATGACGGCA TACGCTTTGG ATGCTGGCAT TGACATAAAA TTCCCTCTGG AAAAACAAGA TGCCATGGAA AACTGGGGCC TTATCACTTA AATTTATGCA CCGATGAATA AACAGCGGGT TCAGTGGTTC GGCAATCTGG TCACACTGAA TTTTGCAACA TTTGTTGAGT ATCTTGGAAT GCAAGATTTC TTCTTGCTCG ATGGAATGGA GAGCCATCCG CTTTCGTTTA GGATTGACAA TATTTCATAC GCCAAGGGAG CGTCAGTTCT CAATTACAGG AATGCTGTTG TGCAATACCT AGCCGATCTG TGGAACGTCT TCAATGAAGT CGTCATGAAA ATCGACCAAT TTACCGATCA TAAAGTAGAA GAATTTAATG CGACCGCCCT TAAAGACGCC TTGGAACCAG AGAAATATCG TCCCCTATGG TATCAGGAAG GCAATAGCAA TGAACCGCTG TACTTGAACG TCAACAATCG ACATGGATTT TATCGACAAA ACTATGATGC CAAGAAAGAT CACAAGGTCT TCGGTCCAAG TGCTGCAGCT ACGATTGAGG CAATCGACTA CAAAAATGAA GAGGAATTCT TGCCTTGGAA AAAGTTCTTC GGTAATGAGC CGGAGACAAA AGAACCGATG TATAATAAGA GCAGCATTGA GTTATTCACA AAAATTAATA CTCAAAAGGA AAAGGACTGT ATAAAGCAAT ATAAGGATAT GGCCGGGGAA GCAGCAACCA AATGCGTTAA CTGTTATGGT GTACAGGAAG GTGGTGAAGA AGCAGAAGAT GTTCAACTGG AGAAGGGTAT TGTTACAGCT CTAAAAGAAC TTCTTTTGCG TCTTCAGGAT GTCCCTACCG CTTTCCGTGC CATGTTCAAT TTCCTAATGG AGAGATGGGA CAGAGCAGTT GATAAAGTGG TCGGCGCTTG AGATCAGCTG AAGAATCTAC AGAAGAACAA CCAGGAAATC GAAAAAGGAG AACATAAAAT ATCGGAATTC TTCAAGAGAG CAAGATCATA CTTCAAACTA GGAGACAGTT TTGCTGAAAA TCCATTCGAA TACAACCAAT AATACCATTT ATTTCGAATA TATCATGAAG CTTGTATCTT AGAGCTCACT CTCCATTTTG TAGCTGTGAT CCTAGAATCT TTCCCCAATA CATTCCAAAC GATTTGTTTT TTTGTCTGCT ATCCATCTAA CTTATCTGAT AAATATTGAC CTTGCTGT

120 180

0 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 114 0 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3356

1925

1930

1935

1940

1945

1950

1955

RO 117709 Β1

Informație pentru Sedv. io Nr.21

Caracteristici de secvență·

Lungime; 3369 baze perechi Tip: acid nucleic împletire; dublă Topologie; lineară

Descriere GGTTTAATTA CATTGCTGAA TCGGCCTCTC AGCCAGGGAA TACTCCTTCC CTGGTTATGT CAATGGTTGT TACCCCAAGA AGCACCCAAG AAATCTTGCT AGACCACTTA CCATAGATGC CCGTTACTGT GAGATGGAGA CATCCTACTT CGGGTGTTCG TGCAATCTGG TGAAGAAACA GCCTCATCAC ATAAACAGCG TGGTTACGAT AATTTATTGG TTGATGTACT TCAGAATCGA GAGCTTCTGT TATCGCAGTA TTTTTGATGA AGTTTGCAAG ACTCGACTAC AAGAGAAGTA AAGGCGATAA ATGTTAGTGA AAAATCATGA TTTACAGTCC ACGCAATTGA ATCTACCATT AGCCAGAGGC AAAGCAGTAT ACCTCCAAAA AATATAAAAA CCGAATGCGT AAGGCGGTGA TAGAAAAAGA GACTTCTCTT GTGCTTTCAA TTGAGAGATG TGATACCAGC TGCAGAAAAA CACAAAATAG AAGCCACCTT ATATGACAGG CAAAAATTTT AAACAAAGCT TCTTCCCTAT GTTGCTCAGA TCGTTTTACA AAAAAAAAA a secvent CCCAAGTTTG TCTAACTCCA TATTGGTCTC GGATGATACT AAGTAATATA GGACTTCCCA AATTGAGCCA ATGTGAACTG ACTGGAAAAG CAAGGTCGGC TACCACCCCG TCGTCGAATG CATTCATCCA GATCAGTGGT GTTGGCAGTT GTTCCGTATA TATCAAGTGC AGATATGATT TTACAGGGAA AATTGCTCGC GAAGTGGTGG AGCTGGTCAG TGAACGCGCT CAAAGCTGCA TCTTACTATG CCTCAAGAAG AGTTGTCACT TCAGTGGACG TTTGAAATTA CCGTCACCCG GAAGGAGATA TGCTGGCGCT CGCTAATGGT CCGGACAAGG GTATGAGACT AGAAATCGCA AAAGCCAGCT CGACTTCATT AGATGTCATT ACTTTTCGAT AAGAATCGCC TTATGCTTCC CTTCCTACGC GCGGGCTCTG CGATGTAGCA GCCAGATATC CTGCACTTCA TGGCATGAAC GGTGGATTGG GTAATTCGAA GAACTGACTG TATCGTTATA CAGTATTGGC ACCCTCTTCC ACACTTTCTC ATTGTATAGA ei; Secv. AGGGTCTCCA ATCCGTCTTA ACCTATTACT GGTGGCAAGG AAACCATTGT CCGGAGAAAA ACAAAGAGTA GTATCGGGCG GTTGAGTTTC TACATCGGTC GATGGCACCC GTACCATGCA AAAGGCACCA GATTGGATCA ATGGTTTCAG TGGTCACGCC ATAGAATTCT GGCCTTCCTG AACTCTT7GT ATTGTTGCTC GATAATTTGT ATAACTCAAG TTGAAAGCTG GAAG1 T GAAG CTGAGAGCCT TTCTCGTATA GACGTCGAAG ACTCAGATGG ACGCAAAGTC AAATACGGAT AAGCGAACAT CCCTTTGTGG TGGAAAAAGA AATGTCATCA GTATTTGAAC ATGTCCGGGA CAAACATACA GCCAATAACT GATATGTTCT GACGAAGTCA GCTCCTCTCC GACAAGGTGA CTAGCATTGG GACAGGAATT GCAAATCCTA ATTGAAAGTA GGAATCCGCT GCTCGTCAAT ATTAAAAAAC TTACATTGCC TCTGTTGGTC TTTGCCTTCC AACCGTAGAA TAACTGAATT CTCAATAGCT TTAGTTATCT

ID N.r.21

TCTAGATGAC TTGTCGCATT TTACTCGCAA ACAAAGACAA CTTACGACTT ACCTCACATT TCGTACTCAA ATAAAAAACT TTATCAAAAG TCATCAGCAA CTAAGATCGC TGGATGAACC AAGCCGTCTC CATCGAAGTT AATTTGAATA CAGAGGCAAA ACGAAGATTT ATTTCTCTGC TGTACGATGA ATGAGCTTGC GGTTGAATGA ATGACGCCAG ATTCGGTAGC AAGCCTTTGA TGATTGGAGA GCAATGCAGA GTCCAGACGG GCTTCCCAGT GATATGAGGC TTAAATGGGA GGTTGAGAAG TGAACGCAGA TAATCAAGCA TTAGCGATGC TTCTGAATTA TCTCTTCGAT TGATGAACAT ACAGAAATGA GCGCCCTCGG TGAACAAATG GATCAAGTGT TGGAGCTTTA GATGTCATAA CGTCGTTCGT TTGGCGAAGA TAGGAACGAA CACAACAGCA TCGGTGCATT ATTTCCAAAA AGTAATCCAG ACTGTTCCAC GTGAGGGGTC CAATATTACT CGGAAATTTG TCTTGTTTGT TATAAATATT

GTCGCAGGGG ATTTCTAGTA AGCGTTCGAT TTCTCCCTCT GACGATCAAA CGATGGGCGT TTCAAAGAAG CGAAATTGAA CCAACTGGAA CAGCTTTGGT TGCAGTTTCA GAAATACAAA GAATGGAATC CTTGACTACT CATCGAAGGT GAAGATGACA CTTTGATATC CGGTGCCATG CAGATTCTAT TCATCAGTGG AGGTTTTGCA AATGAGGAAC GTCAAGCCAT TGATATCACA AGAAAAACAT AGCGACTGAT CAAACCTATG TATTTCCGTA GAATAAAGAC TATTCCACTG AGATGAACCG CCGCTATGGA GCTCAAGGAT GTTTGCTGCG TGCCGAAAAA TTTGAAATAC ATTGAAACCG CAAGCTGTTT ATCGCAAGAC CAGGGATGGT TTATTGTTAT TACGGCCGAA AGATGTTACT ACGTATGCAG ATTCATTTTC GCACACATAT GATTGACCAG CGATAAAGCA ATTAGCGGCT ATCTTAAAGT TGAATGGAAG ATTGTTGTCA TTCGCTTCAT TTCATATTCG TTTTTTTTTG GATGGTTAAA

AGAACGCGGA GCTGCTGCAG ACCTCAGAAA GCGGCGGAAC ACATATCTAC GTGGAAATAT ATCTCTGTAA AGTGTAAAGG AAAGATCAAC GGAATCTACC CAAAATGAGC GCAAACTGGA GAAGTGAACG CCACGGATGT GAAACAAAGA CAATATGCTC AGATTCCCTC GAGAATTGGG GCACCGATGA TTCGGCGACT AGATTCACAG TACTTCCTGA CCACTTTCCT TACGCCAAAG AAGCATGCAG CTATGGGCAG AAAACCACAG GCAGAGTTTA GCTGTGGAGA TGGTATCAGG CTTTACTTGC TTTTATCGAC AATCATGAGG GCTGCAACTG GAAACGGAAT TTCCCTACCG ATGTATGAAA TTCCAAATCA TGCAGGAAGA CAAGCAGCAA GGTGTGAAGG ACACTCGCCC GCTTTGAAAC GATATCCCAA AATrTCCTTA GTTGAGAAAG CTGAAGAATC ATCGAACGAG TTCTTCAAGA TCATGAAGGA TTTTTACCTA CTTGAATAGT CAAATTGTTA TTTGTAGTCT ATTGTATTGA AAAAAAAAA/.

120 180 240 300 360 420 480 54 0 600 660

720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 294 0 3000 3060 3120 3180 324 0 3300 3360 3369

RO 117709 Β1

Informație pentru Secv. ID Nr. 22 Caracteristici de secvență· Lungime; 977 aminoacizi

Tip; peptidă

Descrierea secvenței; Secv. io ν.γ.22

2005

Mec Thi Ala Glu Glu Ser Gin Glu Gin Glu Thr Gin Gin :	Pro Arg
1 5			10				15
Lys Asn Thr Val Leu Arc :	Leu Thr Pro	Ile Lys Ser	Leu	Phe Ala
20			25				30
Leu Leu Val Val Ala Ala Ala '	Val Gly	Leu Ser Ile i	Gly	Leu '	Thl
35			40				45
Tyr Tyr Phe Thr Arg Lys .	Ala	Phe Asp '	Thr Thr Gly	Gly	Asn ·	Gly
50			55				60
Lys Gly Asp Gin Pro Ile	val	Asp Asp	Asn :	Ser Pro	Ser	Ala	Glu
65			70				75
Glu Leu Arg Leu Pro Thr	Thr	Ile Lys	Pro	Leu Thr	Tyr	Asp	Leu
80			85				90
Val Ile Lys Thr Tyr Leu	Pio	Asn Tyr	Val	Asn Tyi	Pio	Pio	Glu
95			100				105
Lys Asp Phe Ala Ile Asp	Gly	Thr Val	val	Ile Ala	Met	Glu	Val
110			115				120
Val Glu Pro Thr Lys Ser	Ile	Val Leu	Asn	Ser Lys	Asn	Ile	Pro
125			130				135
Val Ile Ala Asp Gin Cys	Glu	Leu Phe	Ser	Asn Asn	Gin	Lys	Leu
140			145				150
Asp Ile Glu Lys Val Val	Asp	Gin Pro	Arg	Leu Glu	Lys	Val	Glu
155			160				165
Phe Val Leu Lys Lys Lys	Leu	Glu Lys	Asn	Gin Lys	Ile	Thi	Leu
17 0			175				180
Lys Ile Val Tyr Ile Gly	Leu	Ile Asn	Asp	Mec Leu	Gly	Gly	Leu
185			190				195
Tyr Arg Thr Thr Tyr Thr	Asp	Lys Asp	Gly	Thl Thr	Lys	Ile	Ala
200			205				210
Ala Cys Thr His Met Glu	Pro	Thr Asp	Ala	Arg Leu	Mec	val	Pio
215			220				225
Cys Phe Asp Glu Pro Thr	Phe	Lys Ala	Asn	Trp Thr	Val	Thr	Val
230			235				24 0
Ile His Pro Lys Gly Thr	Ser	Ala Val	Ser	Asn Gly	Ile	Glu	Lys
245			250				255
Gly Glu Gly Glu Val Ser	Gly	Asp Trp	Val	Thr Thr	Arg	Phe	Asp
260			265				270
Pro Thr Pro Arg Mec Pro	Ser	Tyr Leu	Ile	Ala Leu	Val	Ile	Ser
27 5			280				285
Glu Phe Lys Tyr Ile Glu	Asn	Tyr Thi	Lys	Ser Gly	Val	Arg	Phe
290			295				300
Arg Ile Pro Ala Arg Pro	Glu	Ala Met	Lys	Met Thr	Glu	Tyr	Ala
305			310				315
Met Ile Ala Gly Ile Lys	Cys	Leu Asp	Tyr	Tyr Glu	Asp	Phe	Phe
320			325				330
Gly Ile Ly5 Phe Pro Leu	Pro	Lys Gin	Asp	Met Val	Ala	Leu	Pro
335			340				345
Asp Phe Ser Ser Gly Ala	Mec	Glu Asn	Tip	Gly Leu	Ile	Thl	Tyr
350			355				360
Arg Glu Gly Ser Val Leu	Tyr	Asp Glu	Asn	•Leu Tyr	Gly	Pro	Met
365			370				375
Asn Lys Glu Arg val Ala	Glu	val Ile	Ala	His Glu	Leu	Ala	His
380			385				390
Gin Trp Phe Gly Asn Leu	Val	Thr Mec	Lys	Trp Trp	> Asp	• Asn	Leu
39S			400				«05
Trp Leu Asn Glu Gly Phe	Ala	Ser Phe	Val	Glu Tyr	I le	Gly	Ala
4 10			4 15				420
Asp Phe ile Ser Asp Gly	Leu	i Trp Glu	Met	Lys Asp Phe	Phe	: Leu
425			430				435

2010

2015

2020

2025

2030

2035

2040

2045

RO 117709 Β1

Leu

Ala

Pro

Tyr

Thi 440

Ser Gly

lle Thr Ala Asp Ala 445

va 1

Ala

Sei 4 50

2050

Sei

His

Pio

Leu

Ser

Phe

Arg

I le

Asp Lys Ala

Ala

Asp

va 1

Sei

455

460

465

Glu

Ala

Phe

Asp

lle

Thi

Tyi

Arg Lys Gly

Ala

Sei

Va 1

Leu

470

475

480

Gin

Mec

Leu

Asn

Leu

Val

Gly

Asp Glu Asn

Phe

Lys

Gin

Ser

485

490

495

Va 1

Sei

Aig

Tyr

Leu

Lys

Phe

Ser Tyr Asp

Asn

Ala

500

505

510

2055

Glu

Asp

Leu

Tip

Ala

Phe

Asp

Glu Thr Val

Gin

Gly

I le

Thi

515

520

525

Gly

Pio

Asn

Gly

Pro

Leu

Lys

Met Set Glu

Phe

Ala

Pro

Gin

530

535

540

Tip

Thi

Gin

Met

Gly

Phe

Pro

Val Leu Thr

Va 1

Glu

Ser

Val

545

550

555

Asn

Ala

Thr

Thi

Leu

Lys

val

Thi

Gin Lys Arg

Tyr

Arg

Gin

Asn

2060

Lys

Asp

Ala

Lys

560 Glu

Pro

Glu

Lys

565 Tyi Aig His

Pio

Thr

Tyr

570 Gly

57 5

580

585

Phe

Lys

Tip

Asp

val

Pro

Leu

Trp

Tyi Gin Glu

Asp

Glu

Gin

590

595

600

Val

Lys

Aig

Thi

Trp

Leu

Lys

Aig

Glu Glu Pio

Leu

Tyr

Phe

His

605

610

615

Val

Sei

Asn

Sei

Asp

Ser

Sei

Val

Val Val Asn

Ala

Glu

Arg

2065

620

625

630

Ala

Phe

Cys

Aig

Ser

Asn

Tyr

Asp

Ala Asn Gly

Trp

Arg

Asn

lle

635

640

645

Met

Arg

Leu

Lys

Gin

Asn

His

Lys Val Tyr

Gly

Pro

Arg

Thr

650

655

660

Arg

Asn

Ala

Leu

lle

Ser

Asp

Ala

Phe Ala Ala

Ala

Val

Glu

665

670

675

2070

Glu

Met

Asn

Tyr

Glu

Thr

Val

Phe

Glu Met Leu

Lys

Tyi

Thr

Val

680

685

690

Lys

Glu

Asp

Tyr

Leu

Pio

Trp

Lys Glu Ala

lle

Ser

Gly

Phe

695

700

705

Asn

Thr

lle

Leu

Asp

Phe

Gly

Ser Glu Pio

Glu

Ser

Gin

Tip

710

715

720

Ala

Sei

Glu

Tyr

Mec

Arg

Lys

Leu

Mec Lys Pro

lle

Tyr

Asp

Lys

725

730

735

2075

Sei

lle

Lys

Phe

lle

Ala

Glu

Asn Tyr Lys

Lys

Asp

Sei

Leu

740

745

750.

Phe

Lys

Asn

Leu

Gin

lle

Ala Val lle

Asp

Thr

Tyr

Cys

755

760

765

Gly

Leu

Gly

Lys

Glu

cys

Leu

Glu Glu Met

Lys

Leu

Phe

770

775

780

Asp

Lys

Glu

Val

Met

Lys

Cys

Gin

Pro Gly Gin

Gin

Ala

Thr

Asp

2080

Cys

Val

Lys

Val

785 Thr

Ala

Pro

Leu

790 Aig Lys Thr

Val

Tyr

Cys

795 Tyr

800

805

810

Gly

Val

Gin

Glu

Gly

Asp

Glu

Ala Phe Asp

Lys

Val

Met

Glu

815

820

825

Leu

Tyr

Asn

Ala

Glu

Gin

Val

Gin

Leu Glu Lys

Asp

Ser

Leu

Aig

830

835

840

Glu

Ala

Leu

Gly

Cys

His

Lys

Asp

val Thr Ala

Leu

Lys

Gly

Leu

2085

845

850

855

Leu

Met

Leu

Ala

Leu

Asp

Arg

Asn

Ser Ser Phe

Val

Arg

Leu

Gin

860

865

87 0

Asp

Ala

His

Asp

Val

Phe

Asn

lle

Val Sei Arg

Asn

Pro

val

Gly

87 5

880

885

Asn

Glu

Leu

Phe

Asn

Phe

Leu

Thr Glu Arg

Trp

Glu

lle

890

895

900

2090

Leu

Glu

Sei

Leu

Ser

lle

Arg

His

Arg Ser val

Asp

Arg

Val

lle

905

910

915

Lys

Ala

Cys

Thr

Arg

Gly

Leu

Arg

Ser Arg Glu

Gin

va 1

Gin

920

925

930

Leu

Lv s

Asn

Leu

Tv r

Lvs

Asn

Asp

l.vs Arg Ala

Arg

Glu

Tvr

Gly

RO 117709 Β1

	935	940	945
Phe Gly	Gly Ala	Ile Clu Arg Sei Glu His Arg Val Lys	Trp
	950	955	960
Ile Glu Lys	His Phe	Arg Lys Leu Ala Ala Phe Phe Lys Lys	Ser
	965	970	975
Asn Sei

2095

Informație pentru Secv.ID Nr. 23 Caracteristici de secvență: Lungime: 972 aminoacizi

Tip; peptidă

Descrierea secvenței;Secv.ID Nr.23

2105

Mec 1

Thr

Ala

Glu Trp Gin Lys 5

Arg

Ile 10

Leu

Gly

Phe

Ser

Pro 15

Ile

Ser

Leu

Cys Tni Leu

Phe

Val

Leu

Ala

Val

Gly

20

25

30

Leu

Sei

I le

Giy

Leu Thr Tyi

Tyr

Phe

Thr

Arg

Lys

Ala

Phe

Asp

35

40

45

Thr

Gin

Lys

Glu Gir. Lys 50

Asp

Sei 55

Gly

Lys

Glu

Lys 60

2110

Asp

Asn

Ser

Pro

Ser Ala Glu

Glu

Leu

Pro

Thr

Asn

Ile

65

70

75

Lys

Pio

Val

Sei

Tyi Asp Leu

Asn

Ile

Lys

Thr

Tyr

Leu

Pro

Gly

00

85

90

Tyr

Val

Asn

Phe

Pro Pro Glu

Lys

Asn

Leu

Thi

Phe

Asp

Ala

His

95

100

105

Val

Glu

Ile

Ala

Met Vai Val

Val

Glu

Pro

Thr

Asn

Ser

Ile

Val

2115

110

115

120

Leu

Asn

Sei

Lys

Lys Ile Thi

Leu

Ala

Gin

Gly

Cys

Glu

Leu

125

130

135

Phe

Sei

Gly

Asn

Gin Lys Leu

Asp

Ile

Glu

Ser

val

Lys

Mec

Gin

140

145

150

Glu

Aig

Leu

Asp

Lys Leu Glu

Ile

Thr

Leu

Lys

Asn

Gin

Leu

Gin

155

160

165

2120

Lys

Asp

Leu

Lys

Ile Leu Leu

Lys

Ile

Thr

Tyr

Thr

Gly

Leu

Ile

170

175

180

Ser

Asp

Thr

Leu

Gly Gly Leu

Tyr

Gin

Ser

Ile

Tyr

Thr

Asp

Lys

185

19 0

195

Asp

Gly

Lys

Thi

Lys Ile Val

Ala

Val

Ser

Gin

Asn

Glu

Pro

Ser

200

205

210

Asp

Ala

Arg

Ile Ala Pro

cys

Phe

Asp

Glu

Pro

Lys

Tyr

Lys

215

220

225

2125

Ala

Thr

Tip

Thr

Val Thr val

val

His

Pro

Lys

Gly

Thr

Lys

Ala

230

235

240

Ala

Ser

Asn

Gly

Ile Glu Ala

Asn

ciy

Lys

Gly

Glu

Leu

Lys

Gly

245

250

255

Asp

Trp

Ile

Thr

Ser Lys Phe

Lys

Thr

Pro

Me C

Ser

260

265

27 0

Tyr

Leu

Ala

Ile Ile Val

Cys

Glu

Phe

Glu

Tyr

Ile

Glu

Gly

2130

27 5

280

28S

Phe

Thr

Lys

Thr

Gly val Arg

Phe

Arg

Ile

Trp

Sei

Arg

Pio

Glu

290

295

300

Ala

Lys

Aig

Mec

Thr Ala Tyi

Ala

Leu

Asp

•Ala

Gly

I le

Arg

cys

305

310

315

Leu

Glu

Phe

Tyi

Glu Lys Phe

Phe

Asp

Ile

Lys

Phe

Pro

Leu

Glu

320

325

330

Lys

Gin

Asp

Mec

Ile Ala Leu

Pro

Asp

Phe

Thr

Ala

Gly

Ala

Mec

2135

335

340

345

Glu

Asn

Trp

G1 v

Leu Ile Thr

Ty i

Arg

Glu

Asp

Ser

Leu

Ty r

350

355

360

Asp

Glu

Lv s

1 le

Tvr Ala Pro

Mec

Asn

Lvs

Gin

Arg

va 1

Ala

Leu

36 5

370

375

RO 117709 Β1

2140

Ala Asp Gly

His Thr Mec

Gin Trp Asp

Trp 385 Leu 400 Glu 4 15

Phe Asn Ile

Glv Glu Ser

Asn Gly His

Leu Phe Asn

Val 390 Ala 4 05 Asn 420

val Thr Thr

va 1 Leu Phe

Ala Lys Val

Iii s Trp Glu

Glu 380 Trp 395 Tyr 4 10

Leu Asp Leu

2145

Phe

Arg

Thr

Gin

Asp

Phe

Leu

Asp

Gly

Mec

ASp

Arg

Gly

425

430

435

Mec

Arg

Ala

Asp

Ser

Ala

Ser

His

Pro

Leu

Ser

Phe

Arg

440

445

450

Ile

Asp

Lys

Ala

Glu

Va 1

Ala

Glu

Ala

Phe

Asp

Ile

Ser

455

460

465

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ala

Ser

Val

Leu

Thr

Met

Leu

Arg

Ala

Leu

Ile

470

475

480

2150

Gly

Glu

Asp

Asn

Tyr

Arg

Asn

Ala

Val

Gin

Tyr

Leu

Lys

485

490

495

Phe

Ser

Tyr

Ser

Asn

Ala

Gin

Ala

Asp

Leu

Trp

Asn

val

Phe

500

505

510

Asn

Glu

Val

Lys

Gly

Val

Lys

Gly

Pro

Asp

Gly

Asn

Val

Mec

515

520

525

Lys

Ile

Asp

Gin

Phe

Thr

Asp

Gin

Trp

Thr

Tyr

Gin

Mec

Gly

Tyr

2155

Pro

Val

Lys

530 Val

Glu

Phe

Asn

535 Ala

Thr

Ala

Leu

Lys

540 Val

545

550

555

Thr

Gin

Sei

Arg

Tyr

Lys

ΤΠΙ

Asn

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Pro

Glu

560

565

570

Lys

Tyr

Arg

Asn

Pro

Lys

Tyr

Gly

Phe

Lys

Trp

Asp

Va 1

Pro

Leu

57 5

580

585

Trp

Tyr

Gin

Glu

Gly

Asn

Ser

Lys

Glu

Val

Lys

Arg

Thr

Trp

Leu

2160

590

595

600

Lys

Arg

Asp

Glu

Pro

Leu

Tyr

Leu

Asn

Val

Asn

Arg

Asp

Thr

605

610

615

Ser

Leu

Val

Asn

Ala

Asp

Arg

His

Gly

Phe

Tyr

Arg

Gin

Asn

620

625

630

Tyr

Asp

Ala

Asn

Gly

Trp

Lys

Ile

Lys

Gin

Leu

Lys

635

640

645

2165

Asp

His

Lys

val

Phe

Gly

Pro

Arg

Thr

Arg

Asn

Ala

Ile

Ser

650

655

660

Asp

Ala

Phe

Ala

Thr

Xle

Asp

Ala

Ile

Asp

Tyr

Glu

Thr

665

67 0

675

Val

Phe

Glu

Leu

Glu

Tyr

Ala

Lys

Asn

Glu

Phe

Leu

680

685

690

Pro

Trp

Lys

Glu

Ala

Leu

Ser

Gly

Mec

Phe

Ala

Va 1

Leu

Lys

Phe

695

700

7 05

2170

Phe

Gly

Asn

Glu

Pro

Glu

Thr

Lys

Pro

Ala

Arg

Ala

Tyi

Mec

710

715

720

Ser

Ile

Leu

Glu

Pro

Mec

Tyr

Asn

Lys

Ser

Sei

Ile

Asp

Tyr

Ile

725

730

735

Val

Lys

Asn

Tyr

Leu

Asp

Thr

Leu

Phe

Thr

Lys

Ile

Asn

Thr

740

745

7S0

Gin

Lys

Asp

Ile

Asp

Ala

Tyr

Cys

Ser

Leu

Gly

Ser

Lys

Asp

2175

cys

Ile

755

760

Val

765

Lys

Gin

Tyr

Lys

Asp

Ile

Phe

Tyr

Asp

Glu

Mec

Pro

770

775

780

Lys

cys

Lys

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Lys

cys

Val

Lys

Val

Ser

785

790

795

Ala

Pro

Leu

Arg

Ala

Asn

Va 1

Tyr

Cys

Tyr

Gly

val

Gin

Glu

Gly

800

805

810

2180

Gly

Glu

Aia

Phe

Glu

Lys

Val

Mec

Gly

Leu

Tyi

Leu

Ala

Glu

815

820

825

Asp

Va 1

Gin

Leu

Glu

Lys

ciy

Ile

Leu

Phe

Lys

Ala

Leu

Ala

Cys

830

835

840

His

Lys

Asp

Val

Thr

Ala

Leu

Lvs

Glu

Leu

Arg

Ala

Leu

845

850

855

Asp

Arg

Lys

Ser

Phe

va 1

Arg

Leu

Gin

Asp

Va 1

Pro

Thr

Ala

860

865

870

2185

Phe

Arg

Ala

val

Ser

Glu

Asn

Pi o

Va 1

Glv

Glu

Phe

Mec

Phe

RO 117709 Β1

875

880

S85

Asn

Phe

Leu

Mec

Glu

Arg

Trp

Glu

lle

Thr

Ala

Ser

Leu

Glu

890

895

900

Thr

Glu

His

Arg

Ala

val

Asp

Lys

Val

val

Gly

Ala

Cys

Thr

lle

905

910

915

2190

Gly

Arg

Ser

Gin

lle

Asp

Gin

Leu

Lys

Asn

Leu

Gin

920

925

930

Lys

Asn

Ala

Gin

Ala

Lys

Phe

Gly

Ser

Phe

Thr

Gin

Glu

935

940

945

lle

Glu

Lys

Gly

Glu

His

Lys

lle

Ala

Trp

lle

Lys

His

Phe

950

955

960

His

Arg

Leu

Ser

Glu

Phe

Lys

Arg

Ala

Arg

Ser

2195

965

970

Informație pentru Secv.ID Nr. 24 Caracteristici de secvență;

Lungime; 972 aminoacizi

Tip: peptidă

Descrierea secvenței;Secv.lO Nr. 24

2200

Mec 1

Thr

Ser

Gin

Gly 5

Arg

Thr

Arg

Thr

Leu 10

Leu

Asn

Leu

Thr

Pro 15

lle

Arg

Leu

lle

Val

Ala

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Val

Gly

20

25

30

Leu

Ser

lle

Gly

Leu

Thr

Tyr

Phe

Thr

Arg

Lys

Ala

Phe

Asp

35

40

45

Thr

Ser

Glu

Lys

Pro

Gly

Lys

Asp

Thr

Gly

Lys

Asp

Lys

50

55

60

Asp

Asn

Ser

Pro

Ser

Ala

Glu

Leu

Pro

Ser

Asn

lle

65

70

75

Lys

Pro

Leu

Ser

Tyr

Asp

Leu

Thr

lle

Lys

Thr

Tyr

Leu

Pro

Gly

80

85

90

Tyr

Val

Asp

Phe

Pro

Glu

Lys

Asn

Leu

Thr

Phe

Asp

Gly

Arg

95

100

105

Val

Glu

lle

Ser

Mec

Val

lle

Glu

Pro

Thr

Lys

Ser

lle

Val

110

115

120

Leu

Asn

Ser

Lys

lle

Ser

val

lle

Pro

Gin

Glu

Cys

Glu

Leu

125

130

135

Val

Ser

Gly

Asp

Lys

Leu

Glu

lle

Glu

Ser

Val

Lys

Glu

His

140

145

150

Pro

Arg

Leu

Glu

Lys

val

Glu

Phe

Leu

lle

Lys

Ser

Gin

Leu

Glu

155

160

165

Lys

Asp

Gin

lle

Leu

Lys

Val

Gly

Tyr

lle

Gly

Leu

lle

17 0

175

180

Ser

Asn

Ser

Phe

Gly

lle

Tyr

Gin

Thr

Tyi

Thr

Pro

185

190

195

Asp

Gly

Thr

Pro

Lys

lle

Ala

val

Sex

Gin

Asn

Glu

Pro

lle

200

205

210

Asp

Ala

Arg

Mec

Val

Pro

Cys

Mec

Asp

Glu

Pro

Lys

Tyr

Lys

215

220

225

Ala

Asn

Trp

Thr

Val

Thr

Val

lle

His

Pro

Lys

Gly

Thr

Lys

Ala

230

235

240

val

Ser

Asn

Gly

lle

Glu

val

Asn

Gly

Asp

Gly

Glu

lle

Ser

Gly

245

250

255

Asp

Trp

lle

Thr

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr

Pro

Arg

Mec

Ser

260

265

270

Tyr

Leu

Ala

Val

Met

Val

Ser

Glu

Phe

Glu

Tyr

lle

Glu

Gly

275

280

285

Glu

Thr

Lys

Thr

Gly

val

Arg

Phe

Arg

lle

Trp

Ser

Arg

Pro

Glu

290

295

300

A la

Lys

Ly s

Mec

Thr

Gin

Tyr

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

lle

Lys

Cys

305

310

315

lle

Glu

Phe

Tyr

Glu

Asp

Phe

Asp

1 le

Ar g

Phe

Pr o

Leu

Lys

2205

2210

2215

2220

2225

2230

RO 117709 Β1

Lys Gin Asp

Met

320 Ile Ala 33S

Leu Pro

Asp

325 Phe 340

Ser

Ala

Gly

330 Ala Met 345

2235

Glu

Asn

Trp

Gly

Leu Ile

Thr Tyr

Arg

Glu

Asn

Ser

Leu

Tyr

350

355

360

Asp

Arg

Phe

Tyr Ala

Pro Mec

Asn

Lys

Gin

Arg

I le

Ala

Arg

365

370

375

Ile

Val

Ala

His

Glu Leu

Ala His

Gin

Trp

Phe

Gly

Asp

Leu

Val

380

385

390

Thr

Met

Lys

Tip

Trp Asp

Asn Leu

Trp

Leu

Asn

Glu

Gly

Phe

Ala

2240

Aig

Phe

Thr

Glu

395 Phe Ile

Gly Ala

Gly

400 Gin

Ile

Thr

Gin

Asp

4GS Asp

410

415

420

Ala

Aig

Met

Arg

Asn Tyr

Phe Leu

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

Ala

425

430

435

Leu

Lys

Ala

Asp

Sex Val

Ala Ser

Sex

His

Pro

Leu

Ser

Phe

Arg

440

445

450

Ile

Asp

Lys

Ala

Ala Glu

Val Glu

Glu

Ala

Phe

Asp

Ile

Thr

2245

455

460

465

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ala Ser

Val Leu

Thr

Mec

Leu

Aig

Ala

Leu

Ile

470

475

460

Gly

Glu

Lys

His Lys

His Ala

Val

Ser

Gin

Ty i

Leu

Lys

485

490

495

Phe

Ser

Tyr

Ser

Asn Ala

Glu Ala

Thr

Asp

Leu

Tip

Ala

Val

Phe

500

505

510

2250

Asp

Glu

val

Val

Thr Asp

Vai Glu

Gly

Pro

Asp

Gly

Lys

Pro

Hec

515

520

525

Lys

Thr

Glu

Phe Ala

Ser Gin

Trp

Thi

Thr

Gin

Met

Gly

Phe

530

S35

54 0

Pro

Val

Ile

Ser

Val Ala

Giu Phe

Asn

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

545

550

555

Thr

Gin

Ser

Arg

Tyr Glu

Ala Asn

Lys

Asp

Ala

Val

Glu

Lys

Glu

560

565

57 0

2255

Lys

Tyr

Aig

His

Pio Lys

Tyr Gly

Phe

Lys

Trp

Asp

Ile

Pro

Leu

57 5

580

585

Tip

Tyr

Gin

Glu

Gly Asp

Lys Lys

Glu

Ile

Lys

Arg

Thl

Tip

Leu

590

595

60C

Aig

Arg

Asp

Glu

Pro Leu

Tyr Leu

His

Val

Ser

Asp

Ala

Gly

Ala

605

610

615

Pio

Phe

Val

Asn Ala

Asp Arg

Tyr

Gly

Phe

Tyr

Arg

Gin

Asn

2260

His

Asp

Ala

Asn

620 Gly Trp

Ly s Ly s

Ile

625 Ile

Lys

Gin

Leu

Lys

630 Asp

635

640

645

Asn

His

Glu

Val

Tyr Ser

Pro Arg

Thr

Arg

Asn

Val

Ile

Ser

650

655

660

Asp

Ala

Phe

Ala

Ala' Ala

Ala Thr

Asp

Ala

Ile

Glu

Tyr

Glu

Thr

665

67 0

675

Val

Phe

Glu

Leu

Leu Asn

Tyr Ala

Glu

Lys

Glu

Thr

Glu

Tyi

Leu

2265

680

.685

690

Pro

Leu

Glu

Ile

Ala Met

Ser Gly

Ile

Ser

Ile

Leu

Lys

Tyr

695

700

705

Phe

Pro

Thr

Glu

Pio Glu

Ala Lys

Pro

Ala

Gin

Thr

Tyr

Met

710

715

720

Asn

Ile

Leu

Lys

Pio Mec

Tyr Glu

Lys

Sex

Ser

Ile

Asp

Phe

Ile

725

730

735

2270

Ala

Asn

Tyr

Arg Asn

Asp Lys

Leu

Phe

Gin

Ile

Asn

Leu

740

745

750

Gin

Lys

Asp

val

Ile Asp

Met Phe

Cys

Ala

Leu

Gly

Ser

Gin

Asp

755

760

765

Cys

Arg

Lys

Tyr Lys

Lys Leu

Phe

Asp

Glu

Val

Met

Asn

770

775

780

Lys

Cys

Arg

Asp

Gly Gin

Ala Ala

Thr

Glu

Cys

Val

Arg

I le

Ala

2275

785

790

795

Ala

Pro

Leu

Arg

Ser Ser

Val Tyr

Cys

Tyr

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

800

805

810

Gly

Asp

Tvr

Ala

Ser Asp

Lys Val

Met

Glu

Leu

Tyr

Thr

Ala

Glu

815

820

825

RO 117709 Β1

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu 830

Lys

Asp

Phe

Leu

Arg 835

Leu

Ala

Leu

Cly

Cys 840

2280

His

Lys

Asp

Val

Thr

Ala

Leu

Lys

Gly

Leu

Arg

Ala

Leu

845

850

855

Asp

Arg

Asn

Ser

Phe

Val

Arg

Met

Gin

Asp

lle

Pro

Ser

Ala

860

865

87 0

Phe

Asn

Asp

Val

Ala

Asn

Pro

lle

Gly

Glu

Phe

lle

Phe

87 5

880

885

Asn

Phe

Leu

I Le

Glu

Arg

Trp

Pro

Asp

lle

Glu

Sei

1 le

Gly

890

895

900

2285

Thi

Lys

His

Thr

Tyr

Val

Glu

Lys

Val

lle

Pro

Ala

Cys

Thr

Ser

905

910

915

Gly

lle

Arg

Ser

Gin

lle

Asp

Gin

Leu

Lys

Asn

Leu

Gin

920

925

930

Lys

Asn

Gly

Mec

Asn

Ala

Aig

Gin

Phe

Gly

Ala

Phe

Asp

Lys

Ala

93S

940

945

lle

Glu

Aig

Ala

Gin

Asn

Arg

Val

Asp

Tip

lle

Lys

His

Phe

2290

950

955

960

Gin

Lys

Leu

Ala

Phe

Lys

Ala

Thr

Leu

965

970

Revendicări

Claims

Revendicări

2295

1. Polipeptide sintetice având activitate de enzimă aminopeptidazică sau o porțiune antigenică a acesteia, caracterizate prin aceea că acestea corespund, total sau parțial, secvențelor nucleotidice conform fig. 2, 3,4 sau 5 (Secv. ID Nr. 1 la 15 și respectiv 19 la 21), sau o variantă echivalentă funcțional a acestora, alta decât o polipeptidă sintetică corespunzătoare dubletului proteic H11OD sau o polipeptidă sintetică aleasă dintre:

a) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu Glu Phe

b) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser

c) Met Gly/Phe Asn Phe Lys lle Glu/Val Thr/Glu Ala Gly

d) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Lys Asp/Ala Thr/Lys Leu - lle Thr

e) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser-Phe Val

f) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gln/Ala Glu Asp Val

g) Met Gly Phe Pro Leu Val Thr Val Glu Ala Phe Tyr

h) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu Gin Ala Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro

i) Lys His/Tyr AsnA/al Ser Pro Ala Ala Glu Asn/Leu Leu Asn/Gly

j) Lys-Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn

k) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp - lle Lys Gly

l) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala Phe Asp Asp lle Thr? Tyr - - Gly Pro Ser

m) Lys - Glu Glu Thr Glu lle Phe Asn Met

n) Lys — Pro Phe Asn/Asp lle Glu Ala Leu

o) Asp Gin Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys

p) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu Glu Phe Ala Thr Ala Leu

q) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser - Tyr? - Thr

r) Met Glu/Phe Asn Phe Leu lle Glu/Val Thr/Glu Ala Gly -lle Thr

s) Met Gly Phe Leu Val Thr Val Glu Ala Phe Tyr - Thr Ser

t) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu Gin Ala Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro

u) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Leu Asp/Ala Thr/Lys Leu - lle Thr Gly

v) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser - Phe Val Gly?

w) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gln/Ala Glu Asp Val

x) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pro Ala Ala Glu Asn/Leu Leu Asn/Gly

y) Lys - Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn

z) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp - lle - - Lys Gly aa) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala Phe Asp Asp lle The? Tyr - - Gly Pro Ser

2300

2305

2310

2315

2320

2325

RO 117709 Β1 bb) Lys - Glu Gin Thr Glu Ile Phe Asn Met cc) Lys — Pro Phe Asn/Asp Ile Glu Ala Leu dd) Asp Gin Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys
2. Polipeptide sintetice conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că acestea cuprind o secvență de aminoacizi care constituie o enzimă aminopeptidazică sau o porțiune antigenică a acesteia, corespunzătoare în tot sau în parte secvențelor nucleotidice din fig. 2, 3, 4 sau 5 (Secv. ID Nr. 1 la 15 și 19 la 21), sau unei variante echivalente funcțional a acestora, substanțial lipsită de alte componente Haemonchus contortus.
3. Polipeptide sintetice conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt sub forma unei polipeptide de fuziune, care cuprinde o polipeptidă adițională, fuzionată la secvența de aminoacid ce constituie o enzimă aminopeptidazică sau o porțiune antigenică a acesteia, corespunzând în tot sau în parte secvențelor nucleotidice conform fig. 2. 3, 4 sau 5 (Secv ID Nr. 1 la 15 și 19 la 21), sau unei variante echivalente funcțional a acestora, substanțial liberă de alte componente Haemonchus contortus.
4. Polipeptidă sintetică conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se leagă prin glicozilare, o oligozaharidă pentru obținerea unui epitop ce este recunoscut în mecanismul de imunoreactivitate, oligozaharidă care are următoarea structură: