ES2338832T3

ES2338832T3 - Proteina recombinante que contiene un fragmento c-terminal de msp-1 de plasmodium.

Info

Publication number: ES2338832T3
Application number: ES97905212T
Authority: ES
Inventors: Shirley Longacre-Andre; Charles C/O Agnes Rimond Roth; Faridabano Nato; John W. Barnwell; Kamini Mendis
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; New York University NYU
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; New York University NYU
Priority date: 1996-02-14
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2017-02-14
Also published as: JP2000516083A; DK0880588T3; EP0880588B1; DE69739749D1; US20070036818A1; US20100291133A1; EP2194132A1; ATE456658T1; KR20000065266A; US20060018932A1; US6958235B1; US7696308B2; PT880588E; FR2744724B1; WO1997030158A3; EP0880588A2; WO1997030158A9; CN101230104A; US20020076403A1; WO1997030158A2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA PROTEINA RECOMBINANTE, PRODUCIDA EN UN SISTEMA DE BACULOVIRUS, CUYA SECUENCIA POLIPEPTIDICA CONSTITUTIVA ESENCIAL ES LA DE UN FRAGMENTO C - TERMINAL DE 19 KILODALTONES (P19) DE LA PROTEINA 1 DE SUPERFICIE (PROTEINA MSP 1) DE LA FORMA MEROZOITA DE UN PARASITO DE TIPO PLASMODIUM, EN PARTICULAR PLASMODIUM FALCIPARUM, INFECCIOSO PARA EL HOMBRE. DICHO FRAGMENTO C - TERMINAL PERMANECE NORMALMENTE ANCLADO A LA SUPERFICIE DEL PARASITO AL TERMINO DE SU FASE DE PENETRACION EN ERITROCITOS HUMANOS CON OCASION DE UN CICLO INFECCIOSO. ESTA PROTEINA RECOMBINANTE ES APLICABLE A LA PRODUCCION DE VACUNAS CONTRA LA MALARIA.

Description

Proteína recombinante que contiene un fragmento C-terminal de MSP-1 de Plasmodium.

La presente invención se refiere a nuevos principios activos de vacunas derivados de la proteína mayor de superficie de formas merozoitas de un Plasmodium infeccioso unos mamíferos, especialmente el ser humano, conocida más generalmente con la designación MSP-1.

Esta proteína ya ha sido objeto de numerosos estudios. Se sintetiza en la fase esquizonte de los parásitos de tipo Plasmodium, en particular Plasmodium falciparum, y se expresa en forma de uno de los constituyentes principales de la superficie de los merozoitos tanto durante el estado hepático como durante el estado eritrocitario del paludismo (1, 2, 3, 4). Debido al carácter predominante y a la conservación en todas las especies de Plasmodium conocidas de esta proteína, se ha sugerido que podría representar un candidato para la constitución de vacunas anti-palúdicas (5, 6).

También ocurre lo mismo para unos fragmentos de esta proteína, en particular unos productos naturales de escisión de los cuales se observa la formación, por ejemplo durante la invasión por el parásito de los eritrocitos del hospedante infectado. Entre estos productos de escisión, se destacará el fragmento C-terminal que tiene un peso molecular de 42 kDa (7, 8) que, a su vez, se escinde nuevamente en un fragmento N-terminal que tiene un peso molecular aparente convencional de 33 kDa y en un fragmento C-terminal que tiene un peso molecular aparente convencional de 19 kDa (9) que permanece fijado normalmente a la membrana del parásito al final de las modificaciones de las cuales es objeto, por medio de grupos del tipo glicosilfosfatidilinositol (GPI) (10, 11).

Se le vuelve a encontrar en el estado de anillo precoz del ciclo de desarrollo intraeritrocitario (15, 16), por lo cual se han realizado las observaciones de que este fragmento de 19 kDa podría desempeñar una función todavía no conocida, pero sin duda esencial en los procesos re-invasivos. De ello se desprenden las hipótesis ya formuladas en el pasado de que esta proteína podría constituir una diana particularmente eficaz para eventuales vacunas.

Se entenderá que las referencias realizadas frecuentemente en la continuación de la descripción a unas proteínas p42 y p19 procedentes de un cierto tipo de Plasmodium se extienden como refiriéndose a los productos de escisión C-terminales correspondientes de la proteína MSP-1 de este Plasmodium, o, por extensión, a unos productos que contienen sustancialmente las mismas secuencias en aminoácidos, obtenidos por recombinación genética o por síntesis química según las técnicas habituales, por ejemplo por síntesis de tipo "Applied System" o por sintetizador en fase sólida de tipo "Merrifield". Para más facilidad del lenguaje, las referencias a unas "p42 recombinantes" y a unas "p19 recombinantes" hacen referencia a unas "p42" y "p19" obtenidas mediante unas técnicas que comprenden por lo menos una etapa de ingeniería genética.

Frente a la dificultad de obtener cantidades importantes de parásitos para P. falciparum y la imposibilidad de cultivar P. vivax in vivo, ha resultado evidente que el único medio para producir una vacuna antipalúdica necesita recurrir a las técnicas que permiten la utilización de los péptidos o de las proteínas recombinantes. Pero, la MSP-1 es muy difícil de producir entera debido a su gran tamaño, de aproximadamente 200 kDa, un hecho que ha conducido a los investigadores a interesarse en la parte C-terminal cuya función, todavía desconocida, es probablemente la más importante.

A título de las proteínas recombinantes que se refieren a la parte C-terminal de MSP-1 de P. falciparum, que han sido producidas y ensayadas en el mono (12, 40, 41) se mencionarán:

\bullet: una p19 fusionada con una glutatión-S-transferasa producida en E. coli (40),

\bullet: una p42 fusionada con una glutatión-S-transferasa producida en E. coli (12),

\bullet: una p19 fusionada con un polipéptido procedente de una anatoxina tetánica y portador de epítopos de células T auxiliares producidas en S. cerevisiae (12),

\bullet: una p42 producida en un sistema baculovirus (41).

Una composición que contiene la proteína de fusión p19 con una glutatión-S-transferasa producida en E. coli en asociación con alumbre o liposomas no ejerció ningún efecto protector sobre ninguno de los seis monos Aotus nancymai vacunados (40).

Una composición que contiene la proteína de fusión p42 con una glutatión-S-transferasa producida en E. coli en asociación con un adyuvante completo de Freund no ejerció ningún efecto protector en los dos tipos de monos Aotus (A. nancymai y A. vociferans) a los que fue administrada. La proteína p19 producida en S. cerevisiae ejerció un efecto protector en dos monos Aotus de tipo A. nancymai (12). Por el contrario, no ejerció ningún efecto protector en dos monos Aotus de tipo A. vociferans.

Algunos investigadores (Chang et al.) han referido asimismo unos ensayos de inmunización realizados en el conejo con una proteína recombinante p42 producida en un sistema baculovirus y que contiene una secuencia de aminoácidos en común con P. falciparum (18). De esta manera, estos autores indican que esta p42 recombinante se comporta en el conejo de forma sustancialmente igual que la proteína MSP-1 recombinante entera (gp 195). Esta proteína p42 en asociación con un adyuvante completo de Freund fue objeto de un ensayo de vacunación en un primate no humano susceptible a la infección por P. falciparum, Aotus, Lemurinus grisemembra (40). Los resultados muestran que 2 de 3 animales estaban completamente protegidos y el tercero, a pesar de mostrar una parasitemia parecida a los controles, tenía un periodo latente más largo. Sin embargo, es arriesgado concluir en el carácter protector en el ser humano de los anticuerpos así inducidos en contra de los parásitos en sí. Se recuerda en efecto, que no existe actualmente ningún modelo experimental muy satisfactorio en el primate para P. vivax y P. falciparum. El modelo Saimiri, que fue desarrollado para P. falciparum y P. vivax, y el modelo Aotus para P. falciparum, son unos sistemas artificiales que necesitan la adaptación de cepas de parásito y frecuentemente la esplenectomía de los animales para obtener unas parasitemias significativas. En consecuencia, los resultados de vacunación que proceden de estos modelos sólo pueden tener un valor predictivo limitado para el ser humano.

De todas formas se puede preguntar sobre lo que sería un porcentaje real de vacunación susceptible de ser obtenido eventualmente con dichas proteínas recombinantes, debido a la constatación -referida más adelante- que se realizó de la presencia en las p42 procedentes de los Plasmodium de la misma especie, y más particularmente en las p33 correspondientes, de regiones hipervariables que harían aleatoria en numerosos casos la eficacia inmunoprotectora de los anticuerpos inducidos en unas personas vacunadas por una p42 procedente de una cepa de Plasmodium en contra de una infección por otras cepas de la misma especie (13).

Se puede suponer asimismo que el polimorfismo importante de la parte N-terminal de la p42 desempeña una función significativa en la evasión inmunitaria, frecuentemente observada para este tipo de parásitos.

La presente invención tiene por objeto la producción de proteínas recombinantes que evitan estas dificultades, cuyo efecto protector se puede verificar en los modelos experimentales realmente significativos, o incluso directamente en el ser humano.

La presente invención se refiere más particularmente a las composiciones vacunantes contra un parásito del tipo Plasmodium infeccioso para el ser humano, que contiene a título de principio activo una proteína recombinante gicosilada o no, cuya secuencia polipeptídica constitutiva esencial es:

\bullet: o bien la de un fragmento C-terminal de 19 kilodaltons (p19) de la proteína 1 de superficie (proteína MSP-1) de la forma merozoita de un parásito del tipo Plasmodium, infeccioso para el ser humano, permaneciendo este fragmento C-terminal normalmente anclado en la superficie del parásito al final de su fase de penetración en unos eritrocitos humanos, durante un ciclo infeccioso;

\bullet: o bien la de una parte de este fragmento por cuanto que es apropiada asimismo para inducir una respuesta inmune capaz de inhibir una parasitemia in vivo debida al parásito correspondiente;

\bullet: o bien la de un péptido inmunológicamente equivalente a este fragmento p19 o a dicha parte de este fragmento, y

comprendiendo esta proteína recombinante además unos epítopos conformacionales inestables en medio reductor y que constituyen, preferentemente, la mayoría de los epítopos reconocidos por unos antisueros humanos formados contra el Plasmodium correspondiente.

La presencia de estos epítopos conformacionales podría desempeñar una función importante en la eficacia protectora del principio activo de vacunas. Se encuentran muy particularmente en los principios activos que presentan, por otra parte, las demás características definidas anteriormente, cuando éstos han sido producidos en un sistema vector baculovirus. Si es necesario, se menciona a continuación que mediante la expresión "sistema de vector baculovirus" se entiende el conjunto que constituye el vector de tipo baculovirus en sí y las líneas celulares, en particular células de insectos transfectables por un baculovirus modificado por una secuencia a transferir a estas líneas celulares con el resultado de la expresión de esta secuencia transferida. Unos ejemplos preferidos de estos dos asociados del sistema baculovirus han sido descritos en el artículo de Longacre et al. (19). Es el mismo sistema que se ha utilizado en los ejemplos siguientes. Evidentemente, unas variantes, tanto del baculovirus como de las células que pueden ser infectadas por este baculovirus, se pueden utilizar en lugar del que se ha elegido.

En particular, dicha proteína recombinante es reconocida por unos antisueros humanos formados contra el Plasmodium correspondiente o contra un Plasmodium homólogo cuando ésta se encuentra en el estado no reducido o en un estado reducido no irreversible, pero no reconocida o poco reconocida por estos mismos antisueros, cuando está irreversiblemente reducida.

El carácter inestable en medio reductor de estos epítopos conformacionales se puede demostrar, en particular mediante el ensayo descrito más adelante en los ejemplos, en particular en presencia de \beta-mercaptoetanol. Asimismo, se indican en los ejemplos siguientes unas condiciones experimentales aplicables a la obtención de una reducción irreversible de las proteínas de acuerdo con la invención.

Desde este punto de vista, la proteína recombinante producida por S. Longacre et al. (14) se puede realizar en dichas composiciones. Se recuerda que S. Longacre et al. han podido producir una p19 recombinante procedente de la MSP-1 de P. vivax en un sistema vector de baculovirus que contiene una secuencia nucleotídica que codifica para la p19 de Plasmodium vivax, en particular mediante la transfección de cultivos de células de insectos [línea de Spodoptera frugiperda (sf9)] con unos baculovirus vectores que contienen, bajo el control del promotor de la polihedrina, una secuencia que codifica para los fragmentos peptídicos definidos anteriormente, cuyas secuencias estaban dispuestas en el orden siguiente en el vector baculovirus utilizado:

\bullet: fragmento 5'-terminal de 35 pares de bases de la secuencia señal de la polihedrina, de la cual se había mutado (en ATT) el codón metionina de iniciación de la expresión de esta proteína;

\bullet: un fragmento 5'-terminal nucleotídico que codifica para un péptido de 32 aminoácidos que corresponde a la parte N-terminal de MSP-1, incluyendo el péptido señal de MSP-1;

\bullet: o bien una secuencia nucleotídica que codifica para la p19, o bien una secuencia que codifica para la p42 de la proteína MSP-1 de Plasmodium vivax, estando estas secuencias, según el caso, o bien provistas (formas "ancladas"), o bien desprovistas (formas solubles) de las regiones de extremo 3' de estas secuencias de nucleótidos cuyos productos de expresión C-terminales extremos son conocidos por desempeñar una función esencial en el anclaje de la proteína final p19 sobre la membrana del parásito;

\bullet: 2 codones de terminación TAA.

Para la p42, las secuencias derivadas de la región C-terminal de MSP-1 se extendían por consiguiente desde el aminoácido Asp 1325 hasta el aminoácido Leu 1726 (forma anclada) o hasta el aminoácido Ser 1705 (forma soluble), y para la p19, las secuencias se extendían desde al aminoácido Ile 1602 hasta el aminoácido Leu 1726 (forma anclada) o hasta el aminoácido Ser 1705 (forma soluble), entendiéndose que las secuencias de aminoácidos completas de p42 y p19 cuyos aminoácidos iniciales y terminales han sido indicados anteriormente resultan del gen del aislado Belem de P. vivax que ha sido secuenciado (20).

Se han obtenido unos resultados parecidos utilizando en los mismos sistemas de vectores unas secuencias nucleotídicas que codifican para la p42 y la p19 de Plasmodium cynomolgi. P. cynomolgi presenta un doble interés: es una especie parasitaria muy parecida a P. vivax que es infecciosa para el macaco. Asimismo, puede infectar al ser humano. Se accede asimismo a unos hospedantes naturales de P. cynomolgi, los monos rhesus y los monos de gorro, para ensayar la eficacia de protección de la MPS-1 de P. cynomolgi en unos sistemas naturales. El mono rhesus es considerado como una de las especies más representativas de las reacciones inmunitarias en el ser humano.

En particular, se han obtenido excelentes resultados en unos ensayos de vacunación realizados en el mono de gorro con dos polipéptidos recombinantes: la p42 y, sobretodo, la p19 solubles, derivadas de P. cynomolgi, respectivamente producidas en un sistema baculovirus y purificadas sobre columna de afinidad con unos anticuerpos monoclonales que reconocen las regiones correspondientes de la proteína MSP-1 nativa. Se han hecho las siguientes observaciones: los seis monos inmunizados sólo con p19 (tres monos) y la p19 y p42 juntas (3 monos) han demostrado todos una inmunidad prácticamente estéril después de la infección de prueba. Los resultados obtenidos en los tres monos inmunizados con la p42 han sido menos significativos. Dos de ellos se comportaron como los anteriores, pero si el tercero ha manifestado una parasitemia menos importante que unos controles inmunizados con un tampón PBS en presencia del adyuvante de Freund (3 monos) o no inmunizados (3 monos), no era menos patente.

Una segunda infección de prueba ha demostrado que los monos que han recibido la p19 sola estaban protegidos por lo menos durante seis meses. Un segundo ensayo de vacunación con la p19 en asociación con alumbre en este sistema (P. cynomolgilmono de gorro) ha demostrado una protección significativa para 2 de los 3 monos. Es la primera vez que la MSP-1 u otro antígeno recombinante ha demostrado un efecto protector en presencia de alumbre (42).

Los resultados de los ensayos particularmente eficaces realizados en el macaco con unos polipéptidos recombinantes producidos en un sistema baculovirus que utilizan una p19 recombinante de P. cynomolgi establecen que unos polipéptidos recombinantes que contienen respectivamente unas p19 recombinantes procedentes de otros Plasmodium deben comportarse de la misma manera. Son "más expresivos" para el paludismo en el ser humano que los resultados de ensayos realizados con P. vivax o P. falciparum en sus "hospedantes artificiales".

Las proteínas recombinantes de baculovirus, derivadas de una parte C-terminal de MSP-1 (p19) tienen un efecto protector antipalúdico muy significativo en un sistema natural, que constituye el modelo de evaluación del efecto protector de MSP-1 más representativo para el ser humano.

El efecto protector obtenido podría ser aún mejor cuando la forma p19 está desprovista de la región hipervariable de la parte N-terminal de la p42, cuyo efecto puede ser deletéreo en unas situaciones naturales en las que el sujeto vacunado está confrontado a un polimorfismo importante. Por lo tanto, la p19 parece poseer unos epítopos específicos que no están presentes en la p42.

El fragmento C-terminal de 19 kDa, cuya secuencia está presente en el principio activo de la vacuna, puede estar limitado a la secuencia de la p19 en sí, en ausencia de cualquier secuencia polipeptídica normalmente corriente arriba de la secuencia de p19 en la proteína MSP-1 correspondiente. Sin embargo, resulta evidente que la secuencia polipeptídica constitutiva esencial del principio activo puede comprender asimismo una secuencia polipeptídica del lado C-terminal que pertenece al fragmento N-terminal de 33 kDa (p33) también asociada a la p19 en la p42 correspondiente, antes de la escisión natural de esta última, cada vez que la presencia de este fragmento no es de naturaleza que modifique las propiedades inmunológicas del principio activo de la vacuna. Tal como se expondrá más adelante, en particular en lo referente a la descripción de los ejemplos, las secuencias C-terminales de la p33 de cepas diversas de una misma especie de Plasmodium (véase la parte C-terminal de las secuencias peptídicas de la "región III" de la figura 4), presentan asimismo un grado de homología o de conservación sustancial de la secuencia, por ejemplo del orden de 80% por lo menos, en diferentes variedades de Plasmodium infecciosas para el ser humano, de manera que no son de naturaleza que modifiquen fundamentalmente las propiedades vacunantes del principio activo (cuya secuencia corresponde a la región IV) de la figura 4, en particular en la hipótesis que se desprende de esta figura el presunto sitio de escisión entre la p19 y la región III de la p33 se sitúa entre los restos leucina y asparagina en una región particularmente bien conservada (LNVQTQ).

Normalmente, la secuencia polipeptídica C-terminal de la p33, cuando está presente, comprende menos de 50 restos de aminoácidos, incluso menos de 35, o incluso menos de 10 restos de aminoácidos.

A la inversa, la secuencia polipeptídica constitutiva esencial del principio activo de vacuna puede no comprender la totalidad de la secuencia que codifica para la p19, naturalmente con la condición de que esta última conserve la capacidad de inducir unos anticuerpos protectores contra el parásito. En particular, dicha "parte de fragmento" tiene un peso molecular de 10 a 25 kDa, en particular de 10 a 15 kDa. Preferentemente, esta parte de fragmento polipeptídico contiene por lo menos una de las dos regiones EGF (abreviatura de la expresión inglesa "Epidermal Growth Factor").

Resulta evidente que el experto en la materia tiene la capacidad para diferenciar entre los fragmentos activos y los que dejarían de serlo, en particular de manera experimental produciendo unos vectores modificados que contienen unos insertos procedentes de la p19 de longitudes diferentes, respectivamente aislados a partir de fragmentos obtenidos a partir de la secuencia que codifica para la p19, mediante la reacción con unas enzimas de restricción apropiadas, o también mediante unas enzimas exonucleolíticas que habrían sido mantenidas en contacto con el fragmento que codifica para la p19 durante unos tiempos variables; pudiéndose ensayar entonces la capacidad de los productos de expresión de estos insertos para ejercer un efecto protector en unas células eucariotas correspondientes, en particular unas células de insectos, transformadas por los vectores modificados correspondientes, en particular en las condiciones experimentales que se describirán más adelante, en lo referente a los ejemplos. En particular, los productos de expresión de estos insertos deben ser apropiados para inhibir una parasitemia inducida in vivo por el parásito correspondiente entero.

Asimismo, la presente invención incluye todas las composiciones vacunantes en las que la secuencia polipeptídica constitutiva esencial del principio activo estaría constituida por un péptido capaz de inducir una respuesta inmunológica de tipo celular y/o humoral equivalente a la producida por la p19 o al fragmento tal como se acaba de definir, ya que la adición, la deleción o la sustitución en su secuencia de ciertos aminoácidos por otros no provocarían una modificación importante de la capacidad del péptido así modificado -denominado a continuación "péptido inmunológicamente equivalente"- para inhibir asimismo dicha parasitemia.

El fragmento de la p19 puede ser asociado asimismo naturalmente ya sea por el lado N-terminal o por el lado C-terminal o por medio de un enlace peptídico a otro fragmento de proteína plasmodial que tiene un potencial vacunante tal como por ejemplo una proteína ("Duffy Binding Protein" de P. vivax (29) o EBA-175 de P. falciparum (30) y (31) de las cuales una región es específicamente rica en cisteína), con la condición de que no sea alterada, al contrario amplificada, su capacidad para inhibir una parasitemia introducida normalmente in vivo por el parásito correspondiente.

El fragmento que codifica para la p19 o una parte de ésta puede contener asimismo, corriente arriba del extremo N-terminal de p19, una secuencia peptídica también diferente, por ejemplo a un fragmento C-terminal del péptido señal utilizado, tal como el de la proteína MSP-1. Esta secuencia comprende preferentemente menos de 50 aminoácidos, por ejemplo de 10 a 40 aminoácidos.

Estas observaciones se extienden de la misma manera a unas p19 procedentes de otros plasmodium, en particular P. falciparum, la especie dominante de los parásitos, responsable de una de las formas más graves de paludismo.

Pero las técnicas recordadas anteriormente para la producción en un sistema de baculovirus de una p19 recombinante procedente de P. vivax o P. cynomolgi se pueden extrapolar difícilmente tal cual a la producción de una p19 recombinante de P. falciparum con un rendimiento satisfactorio, aunque sea para obtener unas cantidades apreciables que permiten la realización de ensayos de inmunoprotección.

La presente invención proporciona asimismo un procedimiento que evita en gran parte esta dificultad. Resulta posible asimismo obtener unos rendimientos mucho más importantes en p19 de P. falciparum -y de otros Plasmodium cuando se encuentran unas dificultades parecidas- utilizando una secuencia nucleotídica sintética de sustitución a la secuencia nucleotídica natural que codifica para la p19 de Plasmodium falciparum en un vector de expresión de un sistema baculovirus, codificando esta secuencia nucleotídica sintética para la misma p19, pero estando caracterizada por una proporción de nucleótidos G y C más elevada que en la secuencia nucleotídica natural.

En otras palabras, la invención es el resultado del descubrimiento de que la expresión en un sistema baculovirus de una secuencia nucleotídica que codifica para una p19 estaba aparentemente relacionada con una compatibilidad mejorada de los codones sucesivos de la secuencia nucleotídica a expresar con la "maquinaria celular" de las células hospedantes transformables por unos baculovirus, a la manera de lo que se observa para las secuencias nucleotídicas naturales contenidas normalmente en estos baculovirus y expresadas en las células hospedantes infectadas; de lo cual resulta la mala expresión, incluso a veces la ausencia total de expresión de una secuencia nucleotídica nativa de P. falciparum; de lo cual resulta asimismo una explicación posible a la expresión más eficaz observada de la p19 de P. vivax en un sistema baculovirus por Longacre et al. (14) y, tal como los inventores lo han constatado asimismo, de la secuencia de P. cynomolgi a partir de las secuencias nucleotídicas p19 nativas correspondientes, debido a sus contenidos relativos en nucleótidos G y C mucho más elevados que los de las secuencias nucleotídicas nativas que codifican para las p19 de P. falciparum.

Por lo tanto, la presente invención se refiere asimismo, más generalmente, a un vector modificado de tipo baculovirus recombinante que contiene, bajo el control de un promotor contenido en este vector y susceptible de ser reconocido por unas células transfectables por este vector, una primera secuencia nucleotídica que codifica para un péptido señal explotable por un sistema baculovirus, caracterizado porque presenta una segunda secuencia nucleotídica corriente abajo de la primera, asimismo bajo el control de este promotor y codifica para la secuencia peptídica:

\bullet: o bien de un fragmento peptídico C-terminal de 19 kilodaltons (p19) de la proteína 1 de superficie (proteína MSP-1) de la forma merozoita de un parásito del tipo Plasmodium distinto que el Plasmodium vivax e infeccioso para el ser humano, permaneciendo este fragmento C-terminal normalmente anclado a la superficie del parásito al final de su penetración en unos eritrocitos humanos, durante un ciclo infeccioso;

\bullet: o bien de una parte de este fragmento peptídico ya que el producto de expresión de la segunda secuencia en un sistema baculovirus es apropiado asimismo para inducir una respuesta inmune capaz de inhibir una parasitemia in vivo debida al parásito correspondiente;

\bullet: o bien de un péptido inmunológicamente equivalente derivado de dicho fragmento peptídico C-terminal (p19) o de dicha parte de fragmento peptídico por adición, deleción o sustitución de aminoácidos que no provocan una modificación importante de la capacidad de este péptido inmunológicamente equivalente para inducir una respuesta inmunológica de tipo celular y/o humoral parecida a la producida por este fragmento peptídico p19 o a dicha parte de este fragmento, y

presentando dicha secuencia nucleotídica, llegado el caso, un contenido en nucleótidos G y C comprendido entre 40 y 60%, preferentemente de por lo menos 50% de la totalidad de los nucleótidos de los cuales está constituida. Esta secuencia se puede obtener mediante la construcción de un gen sintético en el que los codones naturales han sido cambiados por unos codones ricos en G/C sin que se modifique su traducción (mantenimiento de la secuencia peptídica).

En este caso, dicha secuencia nucleotídica, suministrada por un ADN sintético, puede presentar por lo menos 10% de codones modificados con relación a la secuencia del gen o del ADNc natural conservando al mismo tiempo las características de la secuencia natural traducida, es decir, el mantenimiento de la secuencia en aminoácidos.

Ahora bien, no se excluye que este contenido en nucleótidos G y C pudiera aumentar más, a partir de que las modificaciones que resultaran en cuanto a la secuencia en aminoácidos del péptido recombinante -o péptido inmunológicamente equivalente- producido no provocarían una pérdida de las propiedades inmunológicas, incluso protectoras, de las proteínas recombinantes formadas, en particular en los ensayos que se ilustrarán a continuación.

Estas observaciones se aplican naturalmente a otros Plasmodium infecciosos para el ser humano, en particular ya que unas secuencias nucleotídicas nativas que codifican para las p19 correspondientes tendrían unos contenidos en nucleótidos T y A difícilmente compatibles con una expresión eficaz en un sistema baculovirus.

La secuencia que codifica para la señal utilizada puede ser la asociada normalmente a la secuencia nativa del Plasmodium en cuestión. Pero puede proceder asimismo de otro Plasmodium, por ejemplo, P. vivax o P. cynomolgi, o de otro organismo si es susceptible de ser reconocido como señal en un sistema baculovirus.

La secuencia que codifica para la p19 o un fragmento de ésta en el seno del vector considerado está, llegado el caso, desprovista de la secuencia de anclaje de la proteína nativa al parásito del cual procede, caso en el que la proteína expresada está en general excretada en el medio de cultivo (forma soluble). De hecho, se puede observar a este respecto que en las condiciones de la presente invención, las formas solubles y ancladas de proteínas recombinantes producidas, en particular cuando proceden de P. falciparum o de P. cynomolgi o P. vivax, tienden a formar unos oligómeros, pudiendo ser esta propiedad el origen de las inmunogenicidades aumentadas de las proteínas recombinantes formadas.

La presente invención se refiere asimismo a los vectores en los que la secuencia codificante contiene la secuencia de extremo 3' terminal que codifica para la secuencia de extremo C'-terminal hidrófoba de la p19 y que está implicada normalmente en la inducción del anclaje de la proteína nativa a la membrana celular del hospedante en el que está expresada. Esta región de extremo 3'-terminal puede por otro lado ser heteróloga frente a la secuencia que codifica para la parte soluble de p19, por ejemplo corresponder a la secuencia 3'-terminal procedente de P. vivax o de otro organismo puesto que codifica para una secuencia de anclaje del conjunto de la proteína recombinante producida a la membrana del hospedante celular del sistema baculovirus utilizado. A título de ejemplo de dichas secuencias de anclaje se citan la GPI del antígeno CD59 expresable en unas células de insectos del tipo Spodoptera frugiperda (32) o la GPI de una proteína humana CD14 (33).

La presente invención se refiere naturalmente asimismo a las proteínas recombinantes, comprendiendo estas proteínas unos epítopos conformacionales reconocidos por unos sueros humanos formados contra el Plasmodium correspondiente.

De una manera general, la presente invención se refiere asimismo a cualquier proteína recombinante del tipo indicado anteriormente, puesto que comprende unos epítopos conformacionales tales como los producidos en el sistema baculovirus, en particular los que resultan ser inestables en un medio reductor.

La presente invención se refiere naturalmente a dichas proteínas recombinantes, ya estén en la forma denominada soluble o en la forma provista de una región de anclaje, en particular a los hospedantes celulares utilizados en el sistema baculovirus.

Están comprendidos asimismo en el ámbito de la presente invención, los oligómeros producidos espontáneamente en los sistemas baculovirus utilizados o producidos a posteriori, recurriendo a unas técnicas habituales de oligomerización de proteínas. La técnica utilizada habitualmente utiliza el glutaraldehído. Pero se podrá asimismo utilizar cualquier sistema habitual de puente entre unas funciones respectivamente amina y carboxilo, tales como se encuentran en las proteínas. A título de ejemplos, se puede utilizar cualquiera de las técnicas descritas en la solicitud de patente europea 0602079.

Por el término "oligómero" se entiende una molécula que contiene de 2 a 50 unidades monoméricas, conteniendo cada una de estas unidades monoméricas la p19 o un fragmento de ésta, tal como se ha definido anteriormente, capaz de formar un agregado. La presente invención se refiere asimismo a cualquier producto de conjugación entre, por un lado, una p19 o un fragmento de p19 tal como se ha definido anteriormente y, por otro lado, una molécula portadora -por ejemplo una polilisina-alanina- que se puede utilizar para la producción de vacunas, por medio de enlaces covalentes o no. Las composiciones vacunantes que las utilizan forman parte asimismo de la presente invención.

La presente invención se refiere asimismo a las composiciones de vacunas que utilizan estas proteínas recombinantes oligoméricas o conjugadas, incluidas de hecho las proteínas procedentes de Plasmodium vivax, extendiéndose estas observaciones asimismo a los oligómeros de estas proteínas recombinantes.

Forman parte asimismo de la presente invención las composiciones en las que las proteínas recombinantes mencionadas anteriormente están asociadas a un adyuvante, por ejemplo un alumbre. Las proteínas recombinantes que comprenden el extremo de región C-terminal que permite su anclaje a la membrana de las células en las que están producidas se utilizan ventajosamente en combinación con unos lípidos apropiados para formar unos liposomas y apropiados para la producción de vacunas. Sin limitarse a los mismos, se puede recurrir a los lípidos descritos a este fin, por ejemplo, en la obra titulada "Les liposomes aspects technologique, biologique et pharmacologique" de J. Delattre et al., edición INSERM, 1993.

La presencia de la región de anclaje en la proteína recombinante, ya se trate de una región de anclaje homóloga o heteróloga frente a la parte vacunante propiamente dicha, es de naturaleza que favorece la producción de anticuerpos citófilos, en particular del tipo IgG_{2a} e IgG_{2b} en el ratón que podrían tener una actividad protectora particularmente elevada, hasta el punto que se podría evitar asociar los principios activos de vacunas así constituidos con unos adyuvantes distintos de los lípidos utilizados para la constitución de las formas liposómicas. Se trataría en este caso de una ventaja importante, puesto que los liposomas pueden ser liofilizados en unas condiciones que permiten su almacenamiento y su transporte, sin que sean entonces indispensables unas cadenas de frío.

Otras características de la invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la descripción siguiente de ejemplos de proteínas recombinantes y de las condiciones en las que se pueden producir, sin que estos ejemplos sean de naturaleza limitativa del alcance de la invención.

Descripción de la construcción PfMSP1_{p19}S (soluble) (p19 soluble procedente de P. falciparum)

La construcción recombinante PfMSP1_{p19}S contiene ADN que corresponde a los 8 pares de bases de la secuencia líder y a los 32 primeros aminoácidos de MSP1 de Plasmodium vivax de Met_{1} a Asp_{32} (aislado Belem; Del Portillo et al., 1991. P.N.A.S. 88, 4030) seguidos por un GluPhe, debido al sitio EcoRI que realiza la unión de los dos fragmentos. El conjunto está seguido por el gen sintético, descrito en la figura 1, que codifica el Plasmodium falciparum MSP1_{p19} de Asn_{1613} a Ser_{1705} (aislado Uganda-Palo Alto; Chang et al., 1988. Exp. Parasitol. 67,1). La construcción se termina por dos codones de terminación de TAA. Esta construcción da lugar a una proteína recombinante que es segregada en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas.

De la misma manera y con fines comparativos, se ha producido una construcción recombinante en unas condiciones parecidas a las utilizadas para la producción de la p19 anterior, pero trabajando con una secuencia codificante que consiste en una copia directa del ADN correspondiente de la cepa P. falciparum (FUP) descrita por Chang et al., Exp. Parasit. 67,1; 1989. La copia de este gen natural (que se extiende desde la asparagina 1613 hasta la serina 1705) ha sido formada mediante PCR a partir del gen nativo.

Se ha representado en la figura 1A las secuencias al mismo tiempo del gen sintético (Bac19) y del "gen nativo" (PF19).

Se observa que 57 codones de los 93 codones de la secuencia codificante nativa para la p19 procedente de P. falciparum han sido modificados (por lo que corresponde al tercer nucleótido en 55 de ellos y del primer y tercer nucleótidos en los dos codones restantes). Se han añadido dos codones nuevos en el extremo 5' para introducir el péptido señal en las condiciones que se han indicado anteriormente y para introducir un sitio EcoRI para la clonación, por un lado, y asimismo se han añadido dos codones de terminación no presentes en la p19 de P. falciparum con el fin de obtener unas señales de terminación de la expresión. Las letras individualizadas dispuestas respectivamente encima de los codones sucesivos corresponden a los aminoácidos respectivos sucesivos. Los asteriscos (*) se refieren a los codones de terminación. Las líneas verticales subrayan los nucleótidos que son los mismos en las dos secuencias.

Descripción de la construcción PfMSP1_{p19}A (anclada GPI) (p19 anclada de P. falciparum)

La construcción PfMSP1_{p19}A tiene unas características de la anterior salvo que la secuencia sintética (figura 1B) codifica para la MPS_{p19} de Plasmodium falciparum (aislado Uganda-Palo Alto) de Asn_{1613} a Ile_{1726}, seguida por dos codones de terminación de TAA. Esta construcción da lugar a una proteína recombinante que está anclada en la membrana plasmídica de las células infectadas por una estructura del tipo glicosil-fosfatidil-inositol (GPI).

La figura 1C es representativa de la secuencia de la proteína recombinante PfMSP1_{p19}S antes del corte de la secuencia señal.

La figura 1D es representativa de la secuencia de la proteína recombinante PfMSP1_{p19}S después del corte de la secuencia señal.

Los aminoácidos subrayados en las figuras 1C y 1D proceden del sitio EcoRI utilizado para unir las secuencias nucleotídicas derivadas de la parte N-terminal de MSP1 de P. vivax (con secuencia señal) y de MSP1_{p19} de P. falciparum.

Figura 2 - El antígeno recombinante PfMSP1_{p19} soluble purificado mediante inmunoafinidad ha sido analizado mediante inmunotransferencia después de SDS-PAGE en presencia (reducido) o en ausencia (no reducido) de B-mercaptoetanol. Las muestras se cargan sobre gel después de un calentamiento a 95ºC en presencia de 2% de SDS. En estas condiciones sólo unos enlaces de tipo covalente (puentes disulfuro) pueden resistir a la disgregación. La transferencia de la izquierda se ha revelado con un anticuerpo monoclonal que reacciona con un epítopo lineal de la p19 natural. La transferencia de la derecha se ha revelado con una mezcla de 13 antisueros humanos que proceden de los sujetos con una inmunidad adquirida al paludismo debido a Plasmodium falciparum. Estos resultados muestran que la molécula recombinante de baculovirus reproduce los epítopos conformacionales en forma de polímero que son reconocidos en su mayoría por el antisuero humano.

Figura 2B - Análisis mediante inmunotransferencia con antisuero humano de MSP-1 p19 purificado de P. vivax y de P. cynomolgi recombinante en unas condiciones no reducidas (NR), reducidas sólo en el medio de carga (R) y reducidas irreversiblemente (IR).

Este trabajo se basa en la idea de que el sistema de expresión baculovirus reproduce correctamente y en grandes proporciones los epítopos conformacionales presentes in vivo en la parte C-terminal de MSP-1. El mejor medio para medir esta propiedad (y puede ser el único medio posible en ausencia de las proteínas nativas purificadas que corresponden a p19) es estudiar la reactividad de las proteínas recombinantes con el antisuero de los individuos expuestos al paludismo, siendo esto un reflejo de las proteínas nativas tales como son "vistas" por el sistema inmunitario humano.

Por lo tanto, los antígenos recombinantes PvMSP-1 p19 y PcMSP-1 p19 solubles purificados mediante inmunoafinidad han sido analizados mediante inmunotransferencia tras SDS-PAGE (15%) en presencia (reducido) o en ausencia (no reducido) de DTT. Las muestras se cargan sobre gel después de un calentamiento a 95ºC en presencia de 2% de SDS. La reducción irreversible se realizó como sigue: la proteína se resuspende en 0,2 M de Tris-HCl, pH 8,4, 100 mM de DTT, 1,0% de SDS y se calienta durante 30 minutos a 70ºC. Después de la dilución con agua, se añade acrilamida a una concentración final de 2 M y la mezcla se incuba bajo nitrógeno sin luz durante 1 hora a 37ºC. La inmunotransferencia ha sido revelada con una mezcla de 25 antisueros humanos que proceden de los sujetos con una inmunidad adquirida al paludismo debido a Plasmodium vivax. V y C designan respectivamente las proteínas derivadas de MSP-1 de P. vivax y de P. cynomolgi. Es notable que las proteínas recombinantes reducidas de manera irreversible no muestran ninguna reactividad con el antisuero humano mientras que las proteínas reducidas de manera no irreversible o no reducidas muestran una buena reactividad. (La PvMSP-1 p19 no reducida es un poco débil porque en su estado glicosilado no se une muy bien al papel de nitrocelulosa). Estos resultados muestran que el reconocimiento de las moléculas MSP-1 p19 de baculovirus por el antisuero humano es en gran parte, sino totalmente, dependiente de los epítopos conformacionales sensibles a la reducción que son producidos en este sistema.

Figura 3 - El antígeno recombinante PvMSP1_{p42} soluble (Longacre et al., 1994, op. cit.) ha sido incubado durante 5 horas a 37ºC en presencia de las fracciones de proteínas derivadas de los merozoitos de P. falciparum y separadas mediante isoelectroenfoque. A continuación, las muestras han sido analizadas mediante inmunotransferencia en presencia (reducida) o en ausencia (no reducida) de B-mercaptoetanol. Se han analizado las fracciones 5 a 12 de isoelectroenfoque, así como dos extractos totales de merozoitos realizados en presencia (Tex) o en ausencia (T) de detergente. La inmunotransferencia ha sido revelada con unos anticuerpos monoclonales específicos para MSP1_{P42} y _{P19} de P. vivax. Los resultados sugieren que existe una actividad proteolítica en los merozoitos de P. falciparum que se puede extraer en detergente. La digestión de la p42 en ciertas fracciones parece provocar una polimerización de los productos e digestión (p19); esta polimerización está relacionada probablemente con la formación de puentes disulfuro puesto que en presencia de B-mercaptoetanol, las formas de alto peso molecular desaparecen a favor de una molécula de aproximadamente 19 kDa (Tex-R). La polimerización de p19 observada en estos experimentos podría por lo tanto ser una propiedad intrínseca de esta molécula in vivo.

Figura 3B: la contribución diferencial de los antígenos p42 y p19 a la respuesta humana anti-MSP-1 de P. vivax.

El reconocimiento de los antígenos MSP-1 p42 y p19 de P. vivax por el antisuero de los individuos que tienen una inmunidad adquirida a P. vivax ha sido comparado mediante la técnica de inhibición de ELISA como sigue: una mezcla de 25 antisueros humanos que proceden de los sujetos con una inmunidad adquirida al paludismo debido a P. vivax ha sido diluida a 1:5.000 e incubada durante 4 horas a temperatura ambiente o bien sola, o bien en presencia de una disolución de 1 mM de p42 o p19 recombinante purificado de P. vivax. Esta mezcla ha sido transferida a un pocillo de microtitulación previamente revestido durante 18 horas a 4ºC por 500 ng ml^{-1} de p42 o de p19 recombinante purificada absorbida, e incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS que contiene 0,1% de Tween 20, se ha añadido un anti-ratón IgG de cabra conjugado con peroxidasa, y la mezcla se incubó durante 1 hora a 37ºC, y la actividad enzimática se reveló mediante la lectura de la densidad óptica a 492 nm. El porcentaje de inhibición ha sido calculado basándose en valores de 100% de reactividad de antisuero con el antígeno revestido en placa de microtitulación en ausencia de un antígeno competidor. Los datos estadísticos han sido calculados utilizando el programa Statview. Cada barra representa la inhibición media en porcentaje de un par de antígenos competidor/absorbido basada en 4 a 12 determinaciones, y las líneas verticales corresponden a un intervalo de 95% de confianza. Las estrellas (*) designan unos antígenos producidos en presencia de tunicamicina, por lo tanto sin N-glicosilación. Los parámetros importantes de estas mediciones son la dilución de antisuero a 1:5.000 que se encuentra en la región sensible de las curvas de ELISA y las concentraciones de antígenos competidores a 1 mM que incluyen la competición por los epítopos de baja afinidad. Por lo tanto, los datos reflejan la similitud máxima entre los dos antígenos comparados. Los resultados muestran que la mayoría, si no son todos, de los epítopos de p42 reconocidos por el antisuero humano están presentes en p19 puesto que en presencia de esta última, la reactividad del antisuero humano contra p42 está inhibida tanto como por el antígeno p42 en sí. Pero, al contrario, aproximadamente 20% de los epítopos de p19 reconocidos por el antisuero humano no lo son o no son accesibles en p42, puesto que la reactividad del antisuero humano contra p19 está bastante menos inhibida por p42 que por p19 en sí. Dichos epítopos específicos de p19 pueden estar constituidos o ser revelados sólo después del corte de p42 en p19 y p33. Estos resultados no están afectados por la glicosilación que muestra que el efecto se debe realmente a una diferencia entre los componentes peptídicos de p19 y de p42 y no a una diferencia de glicosilación. Estos resultados subrayan el hecho de que p19 tiene una identidad inmunológica distinta de p42.

Descripción de la construcción PcMSP1_{p19}S (soluble) (p19 soluble de P. cynomolgi)

El ADN utilizado para dicha construcción ha sido obtenido a partir de un clon de la cepa de Plasmodium cynomolgi ceylonesis (22-23). Esta cepa se mantuvo mediante pasos sucesivos en su hospedante natural (Macaya sinica) y unas transmisiones cíclicas por medio de mosquitos (27).

Se han obtenido unos parásitos sanguíneos a partir de los monos infectados en la fase esquizonte madura cuando las parasitemias han alcanzado un nivel de 5%. Se han purificado entonces según los métodos descritos en (25). El ADN se ha extraído a continuación tal como se ha descrito en (26).

Un fragmento de 1.200 pares de bases se ha producido después recurriendo a la reacción PCR que utiliza los oligonucleótidos subrayados en la figura 4 y procedentes de P. vivax. El oligonucleótido 5' comprendía un sitio de restricción EcoRI y el oligonucleótido 3' dos codones sintéticos de terminación TAA seguidos por un sitio de restricción BgIII. Este fragmento ha sido introducido mediante ligación y por medio de estos sitios EcoRI y BgIII en el plásmido pVLSV_{200} que contiene ya la secuencia señal de la proteína MSP-1 de P. vivax (19). El nuevo plásmido (pVLSV_{200}C_{42}) ha sido utilizado para el análisis de secuencias de ADN.

Se han alineado las secuencias de P. cynomolgi y unas secuencias correspondientes de P. vivax. Las flechas negras designan los presuntos sitios de escisión primaria y secundaria. Se han determinado mediante analogía con los sitios conocidos en P. falciparum (27, 28). Unas líneas verticales y unas flechas horizontales localizan los límites de las cuatro regiones que han sido estudiadas. La región 4 corresponde a la secuencia que codifica para la p19 de P. cynomolgi. Unos sitios de glicosilación están enmarcados y las cisteínas conservadas están subrayadas. En la parte inferior de la figura 4 están indicados los porcentajes de identidad entre los dos aislados de P. vivax y P. cynomolgi.

La construcción recombinante PcMSP1_{p19}S contiene ADN que corresponde a los 8 pares de bases de la secuencia "líder" y los 32 primeros aminoácidos de MSP1 de Plasmodium vivax de Met_{1} a Asp_{32} (aislado Belem; Del Portillo et al., 1991. P.N.A.S. 88, 4030) seguidos por un GluPhe, debido al sitio EcoRI que realiza la unión de los dos fragmentos. El conjunto está seguido por la secuencia que codifica para la MSP1_{p19} de Plasmodium cynomolgi (cepa Ceylon) de Lys_{276} a Ser_{380}. La construcción se termina por dos codones de terminación de TAA. Esta construcción da lugar a una proteína recombinante que está segregada en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas.

Purificación de la proteína recombinante PfMSP1p19 mediante cromatografía de inmunoafinidad con un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la p19 de Plasmodium falciparum

La resina de cromatografía se ha preparado mezclando 70 mg de un anticuerpo monoclonal (obtenido a partir de un hibridoma G17.12 depositado en la CNCM (Paris, Francia) el 14 de febrero de 1997 con el nº I-1846; este hibridoma G17.12 ha sido construido a partir del mieloma X63 Ag8 653 que produce unas IgG 2a/k que reconocen la p19 de P. falciparum) con 3 g de CNBr-sefarosa 4B activado (Pharmacia) mediante unos métodos estándares detallados en el modo de utilización suministrado por Pharmacia. Los sobrenadantes de cultivo que contienen PfMSP1p19 soluble han sido incubados en "lotes" con la resina de cromatografía durante 16 horas a 4ºC. La columna se lavó una vez con 20 volúmenes de 0,05% de NP40, 0,5 M de NaCl, PBS; una vez con 5 volúmenes de PBS y una vez con 2 volúmenes de 10 mM de fosfato de sodio, pH 6,8. La elución se efectuó con 30 ml de 0,2 M de glicina, pH 2,2. El eluato se ha neutralizado con 1 M de fosfato de sodio, pH 7,7 y después se ha concentrado mediante ultrafiltración y se ha dializado contra PBS. Para la purificación del PfMSP1p19 anclada, todas las disoluciones de lavado y de elución contenían como suplemento 0,1% de sulfonato de 3-(dimetil-dodecilamonio)-propano (Fluka).

Ensayo de vacunación de MSP1 recombinante de Plasmodium vivax (p42 y p19) en el mono ardilla Saimiri sciureus

Este ensayo de vacunación se realizó en unos Saimiri sciureus boliviensis machos de 2 a 3 años, no esplenectomizados. Tres monos han sido inyectados 3 veces por vía intramuscular con 3 semanas de intervalo con una mezcla de aproximadamente 50 a 100 \mug cada uno, de PvMSP1_{p42} y _{p19} soluble recombinante (19), purificada mediante inmunoafinidad. El adyuvante de Freund completo e incompleto se usó como sigue: 1ª inyección: 1:1 FCA/FIA; 2ª inyección: 1:4 FCA/FIA; 3ª inyección: FIA. Estas composiciones de adyuvante se mezclaron a continuación 1:1 con el antígeno en PBS. Los cinco monos de control recibían el antígeno glutatión-S-transferasa (GST) producido en E. coli según el mismo protocolo. La infección de prueba se efectuó inyectando 2.10^{6} hematíes infectados con una cepa adaptada de Plasmodium vivax (Belem) 2,5 semanas después de la última inyección. La protección se evaluó determinando las parasitemias diarias en todos los animales mediante un examen de los frotis coloreados con giemsa.

Las curvas de la figura 5 son representativas de la variación de la parasitemia medida en número de hematíes parasitados por microlitro de sangre (en el eje de las ordenadas en la escala logarítmica) en función del tiempo transcurrido después de la infección (en días). La curva A corresponde a los valores medios observados en los tres monos vacunados, la curva B a los valores medios en cinco monos de control.

A partir del examen de la figura, se desprende una reducción muy fuerte de la parasitemia bajo el efecto de la vacunación.

Ensayo de vacunación de MSP1 recombinante de Plasmodium cynomolgi (p42 y p19) en el mono de gorro, Macaca sinica

Se han utilizado quince monos capturados como sigue: (1) 3 animales inyectados con 100 \mug de PcMSP1_{p42} soluble; (2) 3 animales inyectados con 35 \mug (1ª inyección) o 50 \mug (2ª y 3ª inyecciones) de PcMSP1_{p19} soluble; (3) 3 animales inyectados con una mezcla de PcMSP1_{p42} y _{p19}; (4) 3 animales inyectados con el adyuvante más PBS; (5) 3 animales no inyectados. El adyuvante de Freund completo e incompleto se utilizó según el protocolo descrito anteriormente. Las inyecciones se realizaron por vía intramuscular con 4 semanas de intervalo. La infección de prueba se realizó inyectando 2.10^{5} hematíes infectados con Plasmodium cynomolgi 4 semanas después de la última inyección. La protección se evaluó determinando las parasitemias diarias en todos los animales examinando las parasitemias con giemsa. Las parasitemias han sido clasificadas como negativas únicamente después del recuento de 400 campos de frotis. Las parasitemias están expresadas en porcentaje de hematíes parasitados.

Las figuras 6A-6G son ilustrativas de los resultados obtenidos. En cada una de ellas aparecen las parasitemias (expresadas en porcentaje de hematíes parasitados sobre el eje de las ordenadas en la escala logarítmica) observadas en los animales de prueba en función de los tiempos después de la infección (en días sobre los ejes de las abscisas).

Los resultados se refieren:

\bullet: en la figura 6A: a unos animales de control no vacunados;

\bullet: la figura 6B se refiere a unos animales que habían recibido una disolución salina que contiene además el adyuvante de Freund;

\bullet: la figura 6C es una superposición de las figuras 6A y 6B, con el objetivo de hacer aparecer los resultados relativos que resultan de la administración del adyuvante de Freund a los animales (evidentemente las variaciones no son significativas);

\bullet: la figura 6D proporciona los resultados obtenidos al final de una vacunación con p42;

\bullet: la figura 6E se refiere a unos animales vacunados sólo con p19;

\bullet: por último, la figura 6F se refiere a los animales vacunados con una mezcla de p19 y de p42.

La p42 induce ciertos niveles de protección. Pero como lo atestiguan las figuras 6E y 6F, la protección conferida por p19 recombinante según la invención está considerablemente mejorada.

Se puede formular la hipótesis de que la mejora de la protección resulta de una escisión secundaria de la p42 que se acompaña de la revelación de cisteína libre que forma, a continuación, unos puentes disulfuro intermoleculares que dan lugar a unos multímeros de p19 muy característicos de esta forma en las proteínas recombinantes de las tres especies ensayadas.

Las cifras utilizadas para elaborar los gráficos (6A-6F) se precisan en la figura 6G.

Ensayo de vacunación P. cynomolgi/mono de gorro; segunda infección de prueba sobre monos vacunados con p19 sola y controles (figuras 8)

Seis meses más tarde, sin ninguna otra inmunización, los 3 monos que han recibido la MSP-1 p19 solo con FCA/FIA (figura 6E) y los 3 monos que han recibido una disolución salina que contenía el adyuvante de Freund (figura 6B) así como 2 nuevos monos no sometidos a ninguna vacuna previa han sufrido una nueva infección de prueba mediante inyección de 1-10^{6} hematíes infectados con Plasmodium cynomolgi. La protección se ha evaluado determinando las parasitemias diarias en todos los animales examinando los frotis con giemsa. Las parasitemias han sido clasificadas como negativas únicamente después del recuento de 400 campos de frotis. Las parasitemias están expresadas en porcentaje de hematíes parasitados (las cifras utilizadas para elaborar los gráficos 8A-C se precisan en la figura 8D). Los seis animales inmunizados que habían sufrido una infección de prueba seis meses antes no tenían ninguna parasitemia detectable salvo para 1 animal en cada grupo que presentó una parasitemia de 0,008% durante 1 día (Figura 8A y 8B). Los dos controles que no había sido tratados antes muestran una parasitemia habitual con un máximo de 0,8% y durante 21 días (figura 8C). Por lo tanto, los 3 animales vacunados con MSP-1 p19 estaban tan protegidos seis meses más tarde como los 3 controles que presentaban una infección completa habitual después de la primera infección de prueba, a pesar de una ausencia o de una parasitemia muy baja después de la primera infección de prueba. Estos resultados sugieren que la duración de la protección de p19 es por lo menos de seis meses.

Ensayo de vacunación con p19 en asociación con alumbre en el sistema P. cynomolgi/mono de gorro (figuras 9)

Los resultados positivos de protección anteriores han sido obtenidos utilizando el adyuvante completo (FCA) o incompleto (FIA) de Freund. Sin embargo, el único adyuvante admitido actualmente en el ser humano es el alumbre. Por esta razón, se ha realizado un ensayo de vacunación con MSP-1 p19 de P. cynomolgi en el mono de gorro en presencia de alumbre como adyuvante. Seis monos capturados han sido utilizados como sigue: (1) 3 animales inyectados con 4 dosis de 50 mg de MSP-1 p19 recombinante de P. cynomolgi con 20 mg de alumbre, (2) 3 animales inyectados 4 veces con agua fisiológica y 10 mg de alumbre. Las inyecciones han sido realizadas por vía intramuscular con 4 semanas de intervalo. La infección de prueba se realizó inyectando 2.10^{5} hematíes infectados con P. cynomolgi 4 semanas después de la última inyección. La protección ha sido evaluada determinando las parasitemias diarias en todos los animales examinando los frotis con giemsa. Las parasitemias han sido clasificadas como negativas únicamente después del recuento de 400 campos de frotis. Las parasitemias están expresadas en porcentaje de hematíes parasitados. Los resultados de este experimento son los siguientes: 2 de 3 monos inmunizados con p19 recombinante en alumbre tenían aproximadamente 30 veces menos de parasitemia total durante la infección (figuras 9A y 9B) que los 3 monos de control inmunizados con agua fisiológica y alumbre (figura 9D) después de la infección de prueba. El tercer mono inmunizado con p19 (figura 9C) no era muy diferente de los de control. Para el ensayo de vacunación de Plasmodium cynomolgi p19 en el mono de gorro, Macaca sinica, descrito en la figura 9, se precisan (figura 9E) las cifras utilizadas para elaborar los gráficos (9A-9D). A pesar de que estos resultados son un poco menos espectaculares que los anteriores
(figuras 6, 8), es la primera vez que se observa una protección significativa para MSP-1 recombinante en alumbre.

Figura 10: Ensayo de vacunación con p19 recombinante de Plasmodium falciparum en el mono ardilla.

Veinte monos Saïmiri sciureus guyanensis (mono ardilla) de aproximadamente 3 años de edad criados en cautividad han sido utilizados como sigue: (1) 4 animales inyectados con 50 mg de PfMSP-1 p19 soluble en presencia de adyuvante de Freund como sigue: 1ª inyección: 1:1 FCA/FIA; 2ª inyección: 1:4 FCA/FIA; 3ª inyección: FIA. Estas composiciones de adyuvante han sido mezcladas a continuación con el antígeno en PBS 1:1. (2) 2 animales de control recibían el adyuvante de Freund tal como se ha descrito para (1) únicamente con PBS; (3) 4 animales inyectados con 50 mg de PfMSP-1 p19 soluble en presencia de 10 mg de alumbre (Alu-Gel-S, Serva); (4) 2 animales de control recibían 10 mg de alumbre únicamente con PBS; (5) 4 animales inyectados con aproximadamente 50-100 mg de PfMSP-1 p19 anclada GPI reconstituidos en liposomas como sigue: 300 mmoles de colesterol y 300 mmoles de fosfatidilcolina se secaron al vacío y se resuspendieron en 330 mM de N-octilglucósido en PBS con 1,4 mg de PfMSP-1 p19, GPI. Esta disolución había sido dializada contra PBS con unos "Bio-Beads SM-2" absorbentes (BioRad) y los liposomas así formados se concentraron mediante centrifugación y se resuspendieron en PBS. La 1ª inyección se realizó con los liposomas frescos mantenidos a 4ºC y las 2ª y 3ª inyecciones se realizaron con los liposomas que habían sido congelados para su conservación; (6) 2 animales inyectados con unos liposomas de control de la misma manera en ausencia del antígeno p19, GPI, tal como se ha descrito para (5); (7) 2 animales inyectados con agua fisiológica. Tres inyecciones han sido realizadas por vía intramuscular con 4 semanas de intervalo. La infección de prueba se realizó inyectando 1.10^{6} hematíes infectados con Plasmodium falciparum. La protección se evaluó determinando las parasitemias diarias en todos los animales examinando los frotis con giemsa. Las parasitemias están expresadas en porcentaje de hematíes parasitados. Los resultados de este ensayo se exponen en las figuras 10, A-G.

Los grupos inmunizados con p19 en adyuvante de Freund o en liposoma han demostrado unas parasitemias parecidas a los grupos de control después de una infección de prueba (un animal (numero 29) vacunado con p19 en adyuvante de Freund murió algunos días después de la infección de prueba por razones independientes a la vacunación (paro cardiaco)). Unas irregularidades en la administración del antígeno en estos 2 grupos (mala emulsión de Freund, liposomas congelados) no permiten evaluar de manera completa el significado de estos resultados. En el grupo alumbre 2 animales han mostrado unas parasitemias totales durante la infección aproximadamente 4 veces menos importantes que los de control, 1 animal aproximadamente 3 veces menos importante y 1 animal era parecido a los de control. Este experimento es un poco difícil de interpretar a causa de la variabilidad en los controles, probablemente debido a la cepa de parásito utilizada para la infección de prueba que habría estado lo bastante adaptada al modelo Saimiri no esplenectomizado realizado sólo recientemente en Cayenne. Sin embargo, el efecto real, aunque imperfecto, con el alumbre es prometedor en la medida en la que los presentes antígenos parecen ser las únicas versiones recombi-
nantes MSP-1 de P. falciparum que, de momento, han demostrado una cierta eficacia en asociación con el alumbre.

Ensayo de vacunación con una p19 recombinante de Plasmodium falciparum en el mono ardilla (mismo ensayo que en las figuras 10)

Unos monos criados en cautividad han sido inyectados con 1 ml de inóculo por vía intramuscular 2 veces con 4 semanas de intervalo como sigue: (1) 4 animales inyectados con 50 \mug de PfMSP1p19 soluble en presencia de adyuvante de Freund como sigue: 1ª inyección: 1:1 FCA/FIA; 2ª inyección: 1:4 FCA/FIA; y mezclados a continuación 1:1 con el antígeno en PBS; (2) 4 animales inyectados con 50 \mug de PfMSP1p19 soluble en presencia de 10 mg de alumbre; (3) 4 animales inyectados con aproximadamente 50 \mug de PfMSP1p19 anclada GPI reconstituidos en liposomas compuestos 1:1 en molaridad de colesterol y fosfatidilcolina. Los animales han sido sacrificados 17 días después de la segunda inyección.

Los glóbulos rojos que proceden de un mono ardilla con 30% de parasitemia debida a P. falciparum (con unas formas maduras en su mayoría) han sido lavados en PBS, y el residuo se diluyó 8 veces en presencia de 2% de SDS y 2% de ditiotreitol, y se calentó a 95ºC antes de ser cargado sobre un gel de poliacrilamida de 7,5% (gel de separación) y 4% (gel de stacking) (parte alta del gel). Después de la transferencia en nitrocelulosa, el análisis mediante inmunotransferencia (inmunohuella) se llevó a cabo con unos antisueros como sigue: (1) pool de antisueros de los 4 monos vacunados con PfMSP1p19 soluble en adyuvante de Freund diluido a la vigésima parte; (2) pool de antisueros de los 4 monos vacunados con PfMSP1p19 soluble en adyuvante de alumbre diluido a la vigésima; (3) pool de antisuero de los 4 monos vacunados con PfMSP1p19 anclada en liposomas diluido a la vigésima; (4) el anticuerpo monoclonal, que reacciona con un epítopo lineal de PfMSP1p19, a 50 \mug/ml; (5) pool de antisueros SHI90 que procede de una veintena de monos infectados repetidamente por P. falciparum y refractarios a cualquier infección ulterior de P. falciparum, diluido a la quingentésima; (6) pool de antisueros de los monos no tratados antes (que no han sido jamás expuestos a P. falciparum) diluido a la vigésima.

Los resultados muestran que los 3 pools de antisueros de los monos vacunados con PfMSP1p19 reaccionan de manera importante y específica con unos complejos de peso molecular muy alto (que se encuentran de manera difusa en el gel de "stacking") y presentes en unos extractos de parásito que contienen más formas maduras. Estos resultados confirman la hipótesis de la presencia de una agregación específica de MSP1 p19 in vivo que comprende unos epítopos que son reproducidos en las moléculas recombinantes PfMSP1p19 sintetizadas en el sistema baculovirus, en particular aquéllas en forma de oligómero.

La figura 7 ilustra asimismo estos resultados. Se refiere a las inmunohuellas producidas en el gel. Las tres primeras columnas del gel ilustran la respuesta in vivo de monos a unas inyecciones de p19 [(1) con el adyuvante de Freund, (2) con alumbre, (3) en forma de liposoma] y en particular la existencia de complejos de alto peso molecular que confirman la hipótesis de la agregación in vivo de p19 en forma de oligómero, específica de la etapa de maduración (cuando p42 está cortada en p19 y p33).

Este ensayo de vacunación comprende asimismo una tercera inyección idéntica a las anteriores. La inyección con el adyuvante de Freund comprende únicamente FIA.

Existen dos animales de control para cada grupo, a saber: 2 animales de control inyectados con PBS y el adyuvante de Freund; 2 animales de control inyectados con PBS y alumbre; 2 animales de control inyectados con liposomas sin proteína; y dos animales inyectados con PBS sin adyuvante. La protección se evalúa tal como se ha descrito anteriormente.

Figura 7B: Los datos para esta figura se derivan del ensayo de vacunación de P. falciparum/mono ardilla (figura 10 a continuación). Las cifras corresponden a los monos individuales indicados en la figura 10. Las técnicas y los métodos para esta figura son los mismos que para la figura 7, salvo que el antisuero individual de cada mono indicado ha sido ensayado después de tres inyecciones el día de la infección de prueba, y el antisuero SHI ha sido diluido 1:250. Los resultados muestran que el antisuero de los 4 monos vacunados con p19 y alumbre reaccionan de manera importante y específica con unos complejos de peso molecular muy alto, mientras que los monos de los demás grupos vacunados con p19 y el adyuvante de Freund o unos liposomas muestran sólo una baja reactividad con estos complejos. Puesto que los monos vacunados con p19 y alumbre han sido asimismo los mejor protegidos, esta reactividad con los complejos de alto peso molecular parece indicar un efecto protector, a pesar de que un mono del grupo alumbre no estaba protegido con relación a los de control y que otro lo era sólo parcialmente.

La invención se refiere naturalmente a otras aplicaciones, por ejemplo las expuestas a continuación en relación con algunos de los ejemplos, las cuales no presentan ningún carácter limitativo.

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Terapéutica

La molécula recombinante PfMSP1p19 se puede utilizar para producir unos anticuerpos específicos que se pueden utilizar eventualmente mediante transferencia pasiva con fines de terapia adaptada al paludismo severo debido a P. falciparum con riesgo de mortalidad.

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Diagnóstico

Las moléculas recombinantes PvMSP1 p42 y PvMSP1p19 y PfMSP1p19 derivadas de baculovirus pueden ser y son utilizadas para producir unos anticuerpos monoclonales específicos murinos. Estos anticuerpos, en combinación con unos antisueros policlonales anti MSP1p19 que proceden de otra especie tal como el conejo o la cabra, pueden ser la base de un ensayo de diagnóstico semi-cuantitativo para el paludismo, y capaz de distinguir entre un paludismo debido a P. falciparum, que puede ser mortal, y un paludismo debido a P. vivax, que generalmente no es mortal. El principio de este ensayo sería escoger y cuantificar cualquier molécula de MSP1 que contiene la parte p19 en la sangre.

En este ámbito, las ventajas de la molécula MSP1p19 son las siguientes:

(i): se conserva extremadamente bien en el seno de una misma especie y al mismo tiempo es suficientemente divergente entre unas especies diferentes para permitir producir fácilmente unos reactivos específicos de especie. No se ha observado ninguna reacción cruzada entre los anticuerpos derivados de PfMSP1p19 y PvMSP1p19;

(ii): la función de MSP1p19, aunque no conocida con precisión, parece ser suficientemente importante para que esta molécula no varíe de manera significativa o sea delecionada sin efecto letal para el parásito;

(iii): es un antígeno principal que se encuentra en todos los merozoitos y, por lo tanto, debe de ser en principio detectable incluso con baja parasitemia y proporcionalmente a la parasitemia;

(iv): puesto que las moléculas recombinantes de MSP1p19 derivadas de baculovirus parecen reproducir más la estructura nativa de MSP1p19, los anticuerpos producidos contra estas proteínas estarían bien adaptados para una utilización de diagnóstico.

Los microorganismos identificados a continuación han sido depositados según la normativa 6.1 del Tratado de Budapest en fecha de 01 de febrero de 1996, con los números siguientes:

1

La presente invención se refiere asimismo a la utilización de estos anticuerpos, preferentemente fijados previamente en un soporte sólido (por ejemplo para cromatografía de afinidad), para la purificación de péptidos de tipo p19 contenidos inicialmente en una mezcla.

La purificación hace intervenir entonces una puesta en contacto de esta mezcla con el anticuerpo, la disociación del complejo antígeno-anticuerpo y la recuperación del péptido de tipo p19 purificado.

La presente invención se refiere asimismo a unas composiciones de vacuna, que comprenden asimismo unas mezclas de proteínas o de fragmentos, en particular unas mezclas de tipo:

-: p19 de P. falciparum y p19 de P. vivax,

-: p19 de P. falciparum y p42 de P. falciparum, estando ésta, llegado el caso, desprovista de sus regiones más hipervariables,

-: p19 de P. vivax y p42 de P. vivax, estando ésta, llegado el caso, desprovista de sus regiones más hipervariables,

-: p19 de P. vivax y p42 de P. falciparum, estando ésta, llegado el caso, desprovista de sus regiones más hipervariables, y p19 de P. vivax y p42 de P. vivax, estando ésta, llegado el caso, desprovista de sus regiones más hipervariables.

En el presente caso, se entiende definir las regiones más hipervariables como la región II o la región II y la región III en parte o en su totalidad, siendo la parte de la región III preferentemente delecionada la que está yuxtapuesta a la región II (situándose la parte conservada por el lado C-terminal de la p33, cercana de la p19). Las regiones II y III están ilustradas en la figura 4.

La presente invención no está limitada a la producción de vacunas humanas. Se aplica asimismo a la producción de composiciones de vacuna veterinaria que utilizan las proteínas o los antígenos correspondientes derivados de parásitos infecciosos para unos mamíferos y producidos en las mismas condiciones. En efecto, se sabe que unas infecciones del mismo tipo, la babesiosis, aparecen tanto en los bovinos como en los caninos y en los equinos. Uno de los antígenos de las especies Babesia presenta una fuerte homología conformacional (en particular los dos dominios "EGF-like" y riqueza en cisteína) y funcional con una parte proteica de MSP-1 [(36), (37) y (38)].

Se han descrito (39) unos ejemplos de vacunas veterinarias que utilizan un antígeno soluble contra dichos parásitos.

Evidentemente, las p19 utilizadas en estas mezclas pueden asimismo dar lugar a cualquier modificación que se han expuesto en la descripción anterior, cuando se consideraba de manera aislada.

Referencias

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(39) T. P. M. Schetters et al. (1995) "Vaccines against Babesiosis using Soluble Parasite Antigens", Parasitology Today, vol. 11, nº 12.

(40) P. A. Burghaus et al. (1996) "Immunization of Aotus nancymai with Recombinant C Terminus of Plasmodium falciparum Merozoite Surface Protein 1 in Liposomes and Alun Adjuvant Does Not Induce Protection against a Challenge Infection", Infection and Immunity, 64: 3614-3619.

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(42) L. H. Miller et al. (1997) "The Need for Assays Predictive of Protection in Development of Malaria Bloodstage Vaccines", Parasitology Today, vol. 13, nº 2: 46-47.

La presente invención se refiere asimismo a los hibridomas segregantes de anticuerpos específicos que reconocen selectivamente la p19 de una proteína MSP-1 de la forma merozoita de un parásito de tipo Plasmodium infeccioso para el ser humano distinto de Plasmodium vivax y que no reconoce Plasmodium vivax.

En particular, estos hibridomas segregan unos anticuerpos monoclonales que no reconocen la p19 de Plasmodium vivax y que reconocen específicamente la p19 de Plasmodium falciparum.

La invención se refiere asimismo a un hibridoma, caracterizado porque produce un anticuerpo específico que reconoce específicamente la p19 de P. vivax y la p19 de P. cynomolgi. Un hibridoma F10-3 ha sido construido a partir del mieloma X63 Ag8 653 que produce unas IgG 2b/k que reconocen la glicoproteína p42 de Plasmodium vivax.

Claims

1. ADN que codifica un fragmento polipeptídico o una parte de fragmento polipeptídico,

siendo dicho fragmento o parte de fragmento apropiado para inducir una respuesta inmune capaz de inhibir una parasitemia debida a un parásito Plasmodium falciparum, caracterizado porque dicho ADN comprende una secuencia nucleotídica sintética que codifica:

-: un fragmento C-terminal de 19 kilodaltons (p19) de la proteína 1 de superficie (MSP-1) de la forma merozoita de un Plasmodium falciparum, permaneciendo este fragmento C-terminal normalmente anclado a la superficie del parásito al final de su penetración en unos eritrocitos humanos, durante un ciclo infeccioso, o

-: una parte del fragmento p19 que contiene por lo menos una de las dos regiones EGF contenidas en el fragmento p19 salvaje de la MSP-1 de la forma merozoita de un Plasmodium falciparum,

presentando además dicha secuencia nucleotídica sintética un contenido en G y C comprendido entre 40 y 60% de la totalidad de los nucleótidos de los que está constituida.

2. ADN según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica sintética está desprovista de la secuencia que corresponde a la secuencia de anclaje de la proteína nativa.

3. ADN según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica sintética codifica para una forma soluble del fragmento p19 o parte de fragmento p19.

4. ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica sintética tiene un contenido en G y C de por lo menos 50% de la totalidad de los nucleótidos de los que está constituida.

5. ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende además, corriente arriba de dicha secuencia nucleotídica sintética, una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia polipeptídica que comprende menos de 50 restos de la parte C-terminal del fragmento de 33 kilodaltons (p33) de MSP-1.

6. ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende además una secuencia nucleotídica que codifica un péptido señal, corriente arriba del extremo 5'-terminal de dicha secuencia nucleotídica sintética, siendo este péptido señal susceptible de ser reconocido como señal en un sistema baculovirus.

7. ADN según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho péptido señal es un péptido señal de MSP-1 de Plasmodium.

8. ADN según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho péptido señal es un péptido señal de MSP-1 de Plasmodium falciparum.

9. ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 6, 7, caracterizado porque:

\quad: dicha secuencia nucleotídica sintética codifica un fragmento C-terminal de 19 kilodaltons (p19) de la proteína 1 de superficie (MSP-1) de la forma merozoita de un Plasmodium falciparum desde Asn 1613 hasta Ser 1705,

\quad: porque corriente arriba del extremo 5'-terminal de esta secuencia nucleotídica sintética, el ADN comprende:

-: los 8 pares de bases de la secuencia líder de la proteína 1 de superficie de Plasmodium vivax, y

-: una secuencia que codifica los treinta y dos aminoácidos de la proteína 1 de superficie de Plasmodium vivax desde Met 1 hasta Asp 32,

\quad: y porque corriente abajo del extremo 3'-terminal de esta secuencia nucleotídica sintética, el ADN comprende dos codones de terminación TAA.

10. ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 7, caracterizado porque:

\quad: dicha secuencia nucleotídica sintética codifica un fragmento C-terminal de 19 kilodaltons (p19) de la proteína 1 de superficie (MSP-1) de la forma merozoita de un Plasmodium falciparum desde Asn 1613 hasta Ile 1726,

11. Vector baculovirus recombinante que contiene, bajo el control de un promotor contenido en este vector y susceptible de ser reconocido por unas células transfectables por este vector:

-: un ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y una secuencia nucleotídica que codifica un péptido señal, corriente arriba del extremo 5'-terminal de este ADN, siendo este péptido señal susceptible de ser reconocido como señal en un sistema baculovirus, o

-: un ADN según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.

12. Vector baculovirus según la reivindicación 11, caracterizado porque se selecciona de entre el virus depositado en la CNCM con el número I-1661, y el virus depositado en la CNCMC con el número I-1662.

13. Célula de insecto transfectada por un vector baculovirus según la reivindicación 11 ó 12.

14. Fragmento polipeptídico, o parte de fragmento polipeptídico, siendo dicho fragmento o parte de fragmento apropiado para inducir una respuesta inmune capaz de inhibir una parasitemia debida a un parásito Plasmodium falciparum, caracterizado porque dicho fragmento o parte de fragmento es susceptible de ser:

-: expresado por un vector baculovirus según la reivindicación 11 ó 12, o

-: producido por una célula según la reivindicación 13,

: y porque dicho fragmento o parte de fragmento

-: comprende unos epítopos conformacionales inestables en medio reductor y que constituyen la mayoría de los epítopos reconocidos por unos antisueros humanos formados contra Plasmodium falciparum, y

-: es reconocido por unos antisueros humanos formados contra Plasmodium falciparum cuando se encuentra en el estado no reducido o en un estado reducido no irreversible, pero no reconocido o poco reconocido por estos mismos antisueros cuando está irreversiblemente reducido.

15. Oligómero de fragmentos polipeptídicos o de partes de fragmentos polipeptídicos según la reivindicación 14.

16. Proteína que comprende un fragmento polipeptídico o parte de fragmento polipeptídico según la reivindicación 14.

17. Composición adaptada para la vacunación contra un parásito Plasmodium falciparum, caracterizada porque comprende:

-: un fragmento polipeptídico o parte de fragmento polipeptídico según la reivindicación 14, o un oligómero según la reivindicación 15, o una proteína según la reivindicación 16.

18. Procedimiento para la producción de un fragmento polipeptídico o de una parte de fragmento polipeptídico, siendo dicho fragmento o parte de fragmento apropiado para inducir una respuesta inmune capaz de inhibir una parasitemia debida a un parásito Plasmodium falciparum, caracterizado porque comprende:

: insertar un ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en un vector baculovirus, de manera que este vector pueda expresar el fragmento polipeptídico codificado por este ADN,

: transfectar una célula de insecto por este vector,

: recoger el fragmento polipeptídico o parte de fragmento polipeptídicio producido por esta célula.