JPS61181387A - マラリアワクチン用ポリペプチドのイー・コリにおけるクローニングおよび発現 - Google Patents

マラリアワクチン用ポリペプチドのイー・コリにおけるクローニングおよび発現

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JPS61181387A
JPS61181387A JP61025660A JP2566086A JPS61181387A JP S61181387 A JPS61181387 A JP S61181387A JP 61025660 A JP61025660 A JP 61025660A JP 2566086 A JP2566086 A JP 2566086A JP S61181387 A JPS61181387 A JP S61181387A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、哺乳動物をマラリアから防御するワクチンに
関する。
発明の背景 マラリアは、長年鋭意研究が重ねられてきたにもかかわ
らず、ワクチンが開発されていない、重く、かつ広範囲
にわたる病気である。例えば、サイエンス(Scien
ce)、第226巻、679頁(1984年11月9日
)参照。実験的に、ヒトを含めた哺乳類は、照射したス
ポロゾイトを接種することにより、マラリアの病原体、
プラスモジウム(P Iasmodium)による感染
に対して防御される。
クライトら、アメリカン・ジャーナル・オプ・トロピカ
ル・メジシン・アンド・ハイジーン(C1ydeeL 
al、 、Am、 J 、 Trop、 Meds H
yg、 )、第24巻、397頁(1975)およびリ
ークマンら、ブリティン、ダブリュー・エイチ・オー(
Rieckmanet al、 、Bull、 WHO
)、第57巻(補遺l)、261頁(1979)参照。
ヨシダら、サイエンス(Yoshida  et  a
l、 、5cience)、第207巻、71頁(19
80)は、かかる防御は、少なくとも、スポロゾイトの
表面上のタンパク質、サーカムスボロゾイト(CS)タ
ンパク質に対する抗体により部分的に媒介され、CSタ
ンパク質に対して生じたモノクローナル抗体は、in 
 vitr。
で感染を中和し、in  vivoで動物を防御する。
CSタンパク質は、棟内で高度に進化的に保存されるが
、種間ではかなり異なる。
プラスモジウムの4つの種は、ヒトを感染させることが
公知である。これらは、熱帯熱マラリア原虫(P 、 
falciparum)、三日熱マラリア原虫(P。
vivax)、卵形マラリア原虫(P 、 ovale
)および四日熱原虫(P 、 malariae)であ
って、後の2つは頻度が少ない。科学的に興味深い他の
種は、1歯類住血胞子虫(P 、berghei)およ
び猿マラリア原虫(P。
knowlesi)であり、これらの種の宿主は、各々
、唱歯傾動物およびサルである。
猿マラリア原虫のCSタンパク質は、12のアミノ酸配
列の12のタンデム重複からなる。ザバラら、ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン(Zaval
a  et  al、 、J、 Exp、 Med、 
)、第157巻、1947頁(1983)は、該重複単
位に対するモノクローナル抗体が、抗スポロゾイト抗血
清の可溶化スポロゾイトタンパク質に対する接触をブロ
ックするという実験に基づいて、該重複単位が、猿マラ
リア原虫CSタンパク質の主な免疫原であることを報告
している。ジシンら、ジャーナル・オブ・エクスベリメ
ンタル・メジシン(Gysin  et  al、  
、J、 Exp、 Med、 )、 第160巻、93
5頁(1984)は、猿マラリア原虫CSタンパク質の
タンデム重複単位を表す合成の24のペプチド残基は、
サルにおける病原性スポロゾイトの感染性を中和するこ
とを報告している。
コルマンら(Colman  et  at) 、国際
特許公開WO34−2922−A号(1984年8月2
日公開)は、猿マラリア原虫CSタンパク質重複単位の
コーディング領域のタンパク質のクローニング、および
イー・コリ(E、 coli)におけるそのβ−ラクタ
マーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ融合株の発現を報告
している。ヌッセンッバイクラ(Nussenzwei
g  et  al、 )、米国特許第4466917
号は、P44タンパク質と称するスポロゾイトタンパク
質、およびイー・コリにおけるそのクローニングおよび
発現を開示している。
エネアら、ブロンーディングズ・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・才ブ・サイエンシズ・ニー・ニス伊エイ(E
nea et al、 、Proc、 Natl、 A
cad。
Sci、USA)、第81巻、7520頁(1984)
は、シノモルギマラリア原虫(P 、 cynomol
ogi)のCSタンパク質質重類貝した重複単位構造を
報告している。
ケンブら(Kemp  et  al) 、国際特許公
開WO34−02917−A号は、イー・コリにおける
熱帯熱マラリア原虫cDNAのクローニングおよび発現
を開示している。
ゲノムら、サイエンス(D ame et al、、 
S cience)、第225巻、593頁(+984
’)は、イー・コリにおける熱帯熱マラリア原虫のCS
タンパク質のクローニングおよび発現を報告している。
該タンパク質は、分子量約44000の約412のアミ
ノ酸からなると記載されている。これは、テトラペプチ
ドの41タンデム重複からなる。モノクローナル抗体に
結合した重複領域由来の合成の7−111−および15
−ペプチド残基は、CSタンパク質に対して発生する。
発明の概要 一態様において、本発明は、熱帯熱マラリア原虫(P 
lasiodium  falciparuIIl) 
OSタンパク質の重複単位の全部または一部に対するコ
ーディング配列を有するイー・コリ(E、 coli)
発現ベクターである。
他の態様において、本発明は、本発明のイー・コリ発現
ベクターで形質転換されたイー・コリ、および増殖イー
・コリ培養株から本発明の熱帯熱マラリア原虫CSタン
パク質の4以上のタンデム重複単位を有するポリペプチ
ドを精製する方法からなる。
【図面の簡単な説明】
第1a図は、CSタンパク質のコーディング配列を担う
熱帯熱マラリア原虫(P 、 falciparum)
ゲノムDNAの領域の部分的制限エンドヌクレアーゼ開
裂地図である。 第tb図は、pAslの部分的制限エンドヌクレアーゼ
の開裂地図である。 聚吸堅県反 本発明のポリペプチドは、イー・コリ(E、 coli
)において産生される4つ以上のタンデムCSタンパク
質重複単位からなる。該ポリペプチドは、CSタンパク
質ではないが、重複単位以外のCSタンパク質の部分を
含んでもよい。熱帯熱マラリア原虫(P、 falci
parum)重複単位は、次に示す配列を有するテトラ
ペプチドである: アスパラギン(asn)−アラニン(ala)−asn
−プロリン(pro)−本発明のポリペプチド内で、種
々のテトラペプチドが存在し、かかるペプチドは、熱帯
熱マラリア原虫CSタンパク質に関して、その抗体の反
応性に著しく悪い影響を及ぼさない。 例えば、ゲノムら、サイエンス(D ame  et 
 al、 。 S cience)、第225巻、593頁(1984
)に開示されている如く、天然に存在する熱帯熱マラリ
ア原虫における41テトラペプチド重複の37はasn
 −ala −asn −proであり、4はasn−
バリン(val)−アスパラギン酸(asp)  pr
oである。好ましくは、本発明のポリペプチドにおける
テトラペプチド重複単位の半分以上は、いわゆる共通塩
基配列、asn −a Ia −asn −proであ
る。 好ましくは、本発明のポリペプチドは、約8重複(即ち
32アミノ酸)〜約148重複からなる。 さらに好ましくは、ポリペプチドは、約16〜約112
の重複からなる。 本発明のポリペプチドは、ハイブリッド、即ち、非CS
タンパク質重複単位配列を有する融合ポリペプチドであ
ってもよい。かかる非CSタンパク質重萬配列は、免疫
原性を高めるか、または組換微生物におけるクローニン
グおよび発現を促進する担体分子として機能し得る。あ
るいは、かかる追加的配列は、他のスポロゾイト免疫原
、他のプラスモジウム免疫原および/または他の非プラ
スモジウム免疫原に対する1以上のエピトープを担うこ
とができる。特に、イー・コリにおいて実施可能な量で
安定に発現されず、熱帯熱マラリア原虫に対する免疫化
に関して必要でないことが判明しているCSタンパク質
は、本発明から除外され本明細書において例示する本発
明のポリペプチドの種類の具体例は、次のとおりである
:重複のC末端と融合したpBR322におけるテトラ
サイクリン耐性(Let R)遺伝子由来の約32のN
−末端アミノ酸を有する少なくとも4つの重複からなる
Rtet+tポリペプチド;重複のC末端と融合したt
etR遺伝子を有する少なくとも4つの重複からなるR
tetseポリペプチド; 重複のC末端と融合したNSIの227のアミノ酸を有
する少なくとも4つの重複からなるRNS1ポリペプチ
ド; 重複のN末端と融合したNS1の81のN末端アミノ酸
を有する少なくとも4つの重複からなるN5IRポリペ
プチド; 重複のC末端で一グリシン残基が続いている少なくとも
4つの重複からなるRGポリペプチド;重複のC末端で
一ロイシンーアルギニン残基につながっている少なくと
も・4つの重複からなるRLAポリペブヂド:および 重複のC末端で−asn−thr−val−ser−s
erにつながっている少なくとも4つの重複からなるR
Nポリペプチド。 CSタンパク質重複単位に関する遺伝子コーディング配
列は、公知の技術により得ることができる。 該技術には、合成、好ましくは、例えば、エリスら、ネ
イチャー(Ellis  et  al、 、Natu
re)、第302巻、536頁(1983)に開示され
ている様なメツセンジャーRNAの逆転写により、熱帯
熱マラリア原虫から得られるものによるか、または、前
記ゲノムら(D ame  et  al)により開示
されている様な、熱帯熱マラリア原虫ゲノムDNAから
得られる完全な遺伝子の直接的クローニングによるもの
が挙げられる。図面に、csタンパク質ココ−ディング
領域示す。熱帯熱マラリア原虫およびそのスポロゾイト
は、感染したヒトおよび蚊より得ることができる。 CSタンパク質の全部または一部に対するコーディング
配列をクローンし、重複単位の全部または一部をコード
するそのサブフラグメントを、公知の技術により調製す
ることができる。第1a図に、CSタンパク質遺伝子内
の選択された有用な制限サイトを示す。好ましいサイト
はXholIサイトである。Xho■で切断すると、次
に示す16重複のコーディング配列が得られる: N −asp−pro  ((asn−ala−asn
−pro)+5(asn−val−asp−pro)+
〕nC 〔式中、nはlである〕 適当な配列の多重タンデムXhoIIフラグメントを用
いることにより、さらに長い重複、即ち、nが1以上で
ある重複が得られる。 合成技術は公知であり、かつ、商業的に入手可能なりN
A合成装置を用いて達成することができる。実質的に同
じアミノ酸に関するコドンを有し、同じXho■末端ま
たは末端に異なる開裂サイトを有する合成オリゴヌクレ
オチドを合成することができる。かかる合成オリゴヌク
レオチドは、天然の64コドンと異なってもよく、同じ
アミノ酸、または少数の、好ましくは約8未満の異なる
アミノ酸をコードし得る。ただし、これらはポリペプチ
ドの免疫防御性に著しく悪影響を及ぼさないものとする
。典型的な合成コーディング配列は、完全に、共通塩基
配列、(asn−ala−asn−pro)n(式中、
nは少なくとも4である)をコードする。 ポリペプチドのコーディング配列は、いかなるイー・コ
リ発現ベクターにも挿入することができ、その多くは公
知であり、かつ入手可能である。イー・コリにおける本
発明のポリペプチドの高レベルの発現は、生成物の異常
なアミノ酸組成(アスパラギン(asn)約50%、ア
ラニン(ala)25%、プロリン(pro) 25%
)の観点から、驚異的である。さらに以下に記載する様
に、プラスミドpASlに含まれる様な、λ−PL−ロ
モーターおよびλ−clI  リポソーム結合サイトか
らなる調節エレメントを用いて、コーディング配列がよ
く発現されることが判明している〔ローゼンベルクら、
メソッズ・オプ・エンザイモロジー(Rosenber
get  al、 、Meth、 Enzym、 )、
第101巻、123頁(1983)およびシャツラマン
ら、エクスペリメンタル・マニピュレイション・才ブ・
ジーン・エクスプレッション、エム・イノウニ編、アカ
デミツクプレス、ニューヨーク(Shatzman  
et al、。 in  E xperimental  Manipu
lation  of  geneExpressio
n、 edit、 by  M、 T nouye、 
AcaremicPress、New  York)(
1982)参照)。MSIは、pBR322複製開始点
、アンピシリン耐性マーカーおよびPL、N抗停止機能
認識サイト(NutLおよびN u t R)、ρ−依
依存性転写停止ダグナルtRl)およびG残基が直接B
amHI開裂サイトにつながっているall翻訳開始サ
イトを含むclIリポソーム結合サイトを含むλ由来の
一連のフラグメントを担う。pAslは、pKC30c
IIから、pKc30cI[のcIr−pBR322結
合のBamHIサイトおよびclIATG間のヌクレオ
チドを切除し、該分子を再結紮して、ATGのすぐ下流
にBamHIサイトを再生することにより得ることがで
きる。pKc30cUは、pKC30のHpal  サ
イトに、c■遺伝子を担うλ由来の1゜3kb  Ha
emフラグメントを挿入することにより組立てることが
できる(前記シャツラマンら(Shatzman et
 al、)および前記ローゼンベルクら(Rosenb
erg et al、)参照)。pKc30は、シミタ
ケら、ネイチ−?−(Shimitake  et  
aL、 、Nature)、第292巻、128頁(1
981)により記載されている。これは、pBR322
のtet R遺伝子のHindIIIおよびBamHI
サイト間に挿入されたλの2゜4 kb  )Tind
I[I−BamHrフラグメントを有するpBR322
誘導体である。pAst  に類似した構造は、コート
ニーら、ネイチャー(Courtney etal 、
 、 Nature)、第313巻、149頁(198
5)に記載されている。1)ASIは、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション(A merican
Type  Cu1tureCo1tection、R
ockville、Maryland)に、ブダペスト
条約に従って寄託されている。コーディング配列は、有
効に、即ち、適当な配列で、適当な解読フレーム中で、
イー・コリ発現ベクターの調節エレメントに、標準的技
術により結合され、本発明の発現ベクターを形成する。 この様に発現されたポリペプチドを、公知の標準的タン
パク質単離技術により、増殖培養株から単離精製する。 典型的な、有用な一連の精製反応は、l)細胞の破壊、
2)細胞片の清澄化、3)本発明のポリペプチドの、清
澄化細胞抽出物中に存在する他のポリペプチドからの分
離、4)残存ポリペプチド、炭水化物、核酸および/ま
たはりポポリサッカライドを含む残存する汚染物質を除
去するための最終精製からなる。 第1工程は、例えば、リソシームまたは他の溶解または
浸透化剤を添加するか、あるいは機械的または超音波破
壊により達成することができる。 抽出物を清澄化するための遠心操作または濾過の前に、
界面活性剤を添加して、本発明のポリペプチドを溶液状
態に保つ。 本発明の一態様としては、本発明のある種のポリペプチ
ドは、清澄化した抽出物を、タンパク質の溶解性を維持
するために界面活性剤を添加した後、約80℃に加熱す
ることにより、他のポリペプチドから非常に効率よく分
離できることが判明した。少なくとも約4分間80℃に
加熱することにより、実質的に重複または他の非熱変性
配列と融合した重複からなるポリペプチドを変性させる
ことなく殆んど全ての細菌性ポリペプチドを沈殿させら
れることが判明した。変性した細菌性ポリペプチドは、
遠心操作によりペレット化し、除去することができる。 この操作は、Rtet3t、RGlRLAおよびRte
teaポリペプチドを精製するのに用いられる。特に、
この操作は、以下の実施例に記載の如く、RI 6 t
et3.、R32Let3t、R48tet32、R6
4tetH1R48G、R32LAおよびRI 6 t
etaeをうまく精製するのに用いられるが、R16N
SIおよびR32NS1を加熱すると、これらのポリペ
プチドは沈殿する。 例えば、選択的沈殿剤を添加し、次いでイオン交換クロ
マトグラフィーまたは逆相HP L C等の仕上クロマ
トグラフィ一工程により、本発明のポリペプチドをさら
に精製することができる。 本発明のワクチンにおいて、好ましくは生理的pHに緩
衝された本発明のポリペプチドの水性溶液を直接用いる
ことができる。あるいは、通常の凍結乾燥を施したかま
たはしていないポリペプチドを、いかなる各種公知のア
ジュバントと混合あるいは吸着させることができる。か
かるアジュバントとしては、とりわけ水酸化アルミニウ
ム、ムラミルジペプチドおよびQuil A等のサポニ
ンが挙げられる。別の変法例として、ポリペプチドをリ
ポソーム等の微粒子中に封入することができる。 さらに別法例として、死菌百日咳(B ordetel
 Ia)または破傷風トキソイド等の免疫刺激性高分子
に接合することができる。 ワクチンの調製は、一般的に、「ワクチンにおける新傾
向および発展」ポーラ−ら編、ユニバシティー・パーク
・プレス(New  Trends  andDeve
lopements  in  Vaccines、 
 edited  byVoller  et  al
、 、University  Park  Pres
s。 Baltimore、Maryland、U、 S 、
 A)、(1978)に記載されている。リポソーム中
への封入は、例えば、フユジートン(F ullert
on)、米国特許第4235877号に記載されている
。タンパク質の高分子への接合は、例えぼりクハイト(
L 1khite)、米国特許第4372945号およ
びアーモーら(armor  et  at、 )、米
国特許第4474757号により開示されている。Qu
il Aの使用は、例えばプレスガードら、アクタ・ベ
テリナリア・スカンジナビ力(Dalsgaard  
et  al、 、Acta、 Vet。 5cand、 )、第18巻、349頁、(1977)
に開示されている。 各ワクヂン投与量中に存在するポリペプチドの量は、典
型的なワクチンにおける著しく有害な副作用なしに免疫
防御応答を惹起する量として選択される。かかる量は、
どのポリペプチドを用いるか、およびワクチンにアジュ
バントが添加されているか否かによって異なる。一般に
、各投与量はポリペプチドを1−1000μ9、好まし
くは、10〜200μ2含有する。特定のワクチンに対
する最適量は、抗体力価および患者における他の応答の
観察を含めた標準的考察により確かめることができる。 第1同棲種の後、患者は好ましくは約4週間後に追加抗
原投与を受け、その後、感染の危険性が存在するかぎり
、6力月毎に追加抗原投与を繰返し受ける。 以下の実施例で本発明を説明するが、これに限定される
ものではない。CSタンパク質コーディング配列は、ジ
ェームズ・ウェーバ−、ウォルター・リード・アーミー
・インスティチュート・フォア・リサーチ(J ame
s  Weber、Walter  ReedArmy
  r n5titute  for  Re5ear
ch)により、pUC8(標準的なイー・コリクローニ
ングベクター(例えば、ベゼスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ・インコーホレイテッド(B ethesda 
ResearchLaboratories、 I n
c、 、Gaithersburg、 MD)より入手
可能)のEcoRIサイトにおけるλmPF1(前記ゲ
ノムら(Dame  et  al、 )参照)の23
37bp  EcoRIフラグメント(第1a図参照)
として得た。得られたpUC8誘導体は、pUC8クロ
ーンlと称する。 寒監匹 実施例1 CSタンパク質誘導体 精製したpUC8クローンlプラスミドDNA40μ9
を培地緩衝液(50mMトリス、pH7,550mM 
 NaCQ、1mMジチオトレイトール(DTT)、1
0mM  MgCl22) 400 uQ中制限エンド
ヌクレアーゼ5tuIおよびRsal  (各酵素、そ
れぞれ100単位)で37℃にて1.5時間消化する。 CSタンパク質のはじめの18アミノ酸以外をコードす
る得られた1216塩基対フラグメントを、5%ポリア
クリルアミドゲル(PAGE)上での電気泳動により単
離する。発現ベクター1)ASI  10μ9を、培地
緩衝液200μρ中制限エンドヌクレアーゼBamHI
 25単位で、37℃にて1.5時間消化する。切断さ
れたプラスミドを、次いでDNAポリメラージーフラグ
メントで処理しくフレノウ5単位;20mM)リス−H
CQSl)H7,5,7mM  MgCh、60mM 
 Nac(1,6mM2−メルカプトエタノールおよび
各0.25mMの4種のデオキシヌクレオチドトリホス
フェート:25℃、15分)、BamHIサイトの末端
をうめる。O9遺伝子フラグメントIμ9を次いで30
μQリガーゼバッフy−(50mMトリス、pH7,5
,1mM  DTTl 10mM  MgCQt、10
0μM  rATP)中、1単位のT4−DNAリガー
ゼで4℃にて16時間、このベクター100r+9に結
紮する。該結紮混合物をイー・コリMM294CI+株
に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを得、C8遺
伝子フラグメントのpAsl  中への挿入に関してス
クリーンする。適正な構造を有するプラスミド(pCS
P)を同定し、イー・コリN5151株(crts85
7)に形質転換し、完全なCSタンパク質の発現に関し
てテストする。 (タンパク質のアミノ末端での18アミノ酸の欠失は、
真正CSタンパク質の開裂シグナルペプチドに対応する
。)細胞を、ルリア・ベルタニ・ブロス(LB)中で3
2℃にて650nmでの吸収(A。 、。)が0.6となる様に増殖させ、2時間428Cで
発現プラスミドのPLプロモーターの転写およびその結
果CSタンパク質誘導体の翻訳が起こる。 細胞の1112をサンプルにとり、ペレット化し、溶解
緩衝液(10mM)リス−HCe、pH7,8,25%
(V/V)グリセロール、2%2−メルカプトエタノー
ル、2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.1%
ブロモフェニルブルー)中に再懸濁し、105℃加熱ブ
ロック中で5分間インキュベートする。タンパク質を5
DS−PAGE(13%アクリルアミド30:0.8 
 アクリルアミド:ビスアクリルアミド比)により分離
する。タンパク質をニトロセルロースに移し、イー・コ
リにおいて産生されたCSタンパク質を、熱帯熱マラリ
ア原虫CSタンパク質のテトラペプチド重複領域と反応
性の5つのモノクローナル抗体のプールを用いて、ウェ
スタンプロット分析により検出する(前記ゲノムら(D
ame  et  al、 )参照)。 実施例2 Rl 6 Letea 精製したpucsクローンlプラスミド100μ9を培
地緩衝液400μσ中制限工ンドヌクレアーゼXho■
40単位で37℃にて、16時間消化する。CSタンパ
ク質の16テトラベプチド重複をコードづける192塩
基対フラグメントを次いでPAGEにより単離する。発
現ベクターpAs1を実施例1に記載したのと同様にし
て制限エンドヌクレアーゼBamHIで開裂させる。実
施例1に記載したのと同様にして、192塩基対のX 
ho IIフラグメントlμ2をpAsl  100n
9のBamH■サイトに結紮する。結紮ミックスをイー
・コリMM294CI十株に形質転換する。クローンは
、該プラスミドのBamHI −HlndII  フラ
グメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により
1)ASIのBamHIサイトで適正な配列である19
2塩基対のXholIフラグメントを含有し、Hind
■サイトがtetR遺伝子の下流であり、BamHIサ
イトがcllATG および適正な配列のプラスミドの
挿入部の結合点にあるものと同定される。このプラスミ
ドl)RI 6 Leteaは、次の様に表されるpB
R322PL   重複  tetRS  pBR32
2BHBB (図中、BHはBamHIサイトを意味し、BはBan
■サイト、Sは終止コドンを意味する)。pR16Le
tssは、イー・コリN5151株(c I ts85
7)を形質転換するのに用いられ、ウェスタン・プロッ
ト分析によりCSタンパク質のテトラペプチド重複の産
生に関して調べる。この様にして産生されたタンパク質
は、次の様な配列を有する:N−net−asp−pr
o(asn−ala−asn−pro)+5(asn−
valasp−pro)、T 86−C (式中、TBGはpASl上に存在するテトラサイクリ
ン耐性遺伝子由来の86アミノ酸である)。 N−末端メチオニン(met)残基も、ベクター、より
詳しくは、c[Iタンパク質開始コドン由来である。 実施例2A R32tetaaおよびR48tetaa精製したpR
I 6 teLaeプラスミドDNA10t19を培地
緩衝液200μc中BamHI 25単位で37℃にて
2時間、消化する。このDNA100n!?を次いで前
記と同様にして、+92塩基対のXhoffフラグメン
トIμ9と結紮する。次のポリペプチドをコードするプ
ラスミド発現ベクター、pR32tetagおよびpR
48tetseを調製し、イー・コリにおいて発現させ
る: N −met −asp−pro C(asn−ala
−asn−pro) + 5−(asn−val−as
p−pro)+ ) n−T 86−C(式中、nは2
 (R32tetsa)またはnは3(R48tete
s)である。)nが2または3であるpAs1クローン
は、前記と同様にして、各々nが2または3以外である
クローンから選択される。調べた全てのクローンは、適
正な配列の挿入部を有していた。R32tetseおよ
びR48teteeは両方とも、イムノプロッティング
により評価される如く、R16teLeとほぼ同じレベ
ルで発現される。 数種のRtetseタンパク質のイムノプロット分析に
より、クーマシー・ブリリアント・ブルーR−250染
色により見られない不均一な生成物があることが示され
る。これらのタンパク質は、以下に記載の如(RteL
atポリペプチドのおよそ半量まで蓄積されると考えら
れる。最小の分解生成物の大きさは、クローン中のテト
ラペプチド重複の数に比例する。これらのタンパク質の
不安定性は、不均質C0OH末端の低下による。 実施例3 Rl 6 teLeを 精製したpRI6Letse DNAl0.CZ9を培
地緩衝液200μρ中制限エンドヌクレアーゼBanI
[25単位で、37℃にて2時間で切断する。切断した
DDNAloonを次いで結紮する。この操作により!
4塩基対のBanUフラグメントが欠失し、残存するB
anI[サイトのすぐ下流に終止コドンが生じる。得ら
れたプラスミドpRl 6 tet3tを用いてイー・
コリN5151株においてRI 6 tetstを発現
させ、RI 6 tetstをこれから精製する。 RI 6 Let、tを含有するイー・コリ30g(湿
潤重量)を緩衝液A(50mM)リスHCl2、p)(
8,0,2mMエチレンジアミン四酢酸酢酸DTA)、
0.1mMジチオトレイトール、5%(V/V)グリセ
ロール)200i(中に再懸濁させる。リソザイムを添
加して最終濃度を0.2txg/*Qにし、該混合物を
氷上で30分間インキュベートし、細胞を溶解させる。 該混合物を次いでワーリングブレングー中、最高値にセ
ットして3分間処理し、次いでプランラン350超音波
装置で1分間超音波処理することにより、微生物性DN
Aを除去する。デオキシコール酸ナトリウムを添加して
最終濃度を0.1%(W/V)にし、この混合物を4℃
にて30分間撹拌する。該懸濁液を次いで12000X
9で30分間遠心操作に付し、細胞片を除去する。上清
をフラスコ中に集め、沸騰水浴中で10分間インキュベ
ートし、12000xyで30分間遠心分離する。殆ど
全てのイー・コリタンパク質が、加熱工程中に沈殿し、
遠心操作中にペレット化され、一方、R16tetth
tタンパク質は溶解性で、上清中に含まれる。上清を集
め、次いで硫酸アルミニウムをゆっくり添加して、最終
濃度を飽和状態の20%とする。これにより、R16t
etBタンパク質が選択的に沈殿し、これを遠心操作(
12000×2で30分間)により集める。この時点で
、R16tets*は、他の汚染バクテリアタンパク質
に関して約95%純粋である。 最終クロマトグラフィ一工程(例えば、イオン交換、逆
相高速液体クロマトグラフィー、フエニルセファロース
クロマトグラフイー、サイズ・セパレーション等)を行
い、タンパク質、炭水化物、核酸またはりボボリサッカ
ライド等の他の物質による残存する汚染物質を除去する
。RI 6 Leastを発現させ、イー・コリタンパ
ク質全体の5%にほぼ等しいレベル、即ち、フーマシー
ブルー染色により示される様な、約30〜60mg/L
で精製する。 R16tetatは次に示す配列を有する・N −me
t−asp−pro C(asn−ala−asn−p
ro)+5(asn−vaトasp−pro)+ ) 
nT 32−C(式中、nは1、Ta2はテトラサイク
リン耐性遺伝子由来の32アミノ酸である。)さらに詳
しくは、Ta2は、次の様に配列ニ ー 1eu−arg−arg−thr−his−arg
−gly−arg−h is−his−arg−arg
−h is−arg−ays−gly−cys−trp
−arg−1eu−tyr−arg−arg−his−
his−arg−trp−gly−arg−ser−g
ly−set−Cを有し、残存するBanI[サイトは
、30および3!残基の間にある。 実施例3A R32tet+t、R48tet3を 前記実施例3と実質的に同様にして、R32tet3t
およびR48tettt(各々、RL 6 tejHに
おいてnが2および3である)をイー・コリにおいて発
現させ、R16tetff2と同じレベルおよび程度の
純度に単離する。出発ベクターは、各々、pR32te
tsaおよびpR48tetsaである。 実施例3B R64tetj2、R80tent 精製したpR48tet3zプラスミドDNAl0μ9
を培地緩衝液200μρ中BamHI 25単位で、3
7℃にて2時間消化する。このDNA100n!?を次
いで前記と同様にして、192塩基対のXh。 ■フラグメントlu9と結紮する。次に示すポリペプチ
ドをコードするプラスミド発現ベクターを調製し、イー
・コリにおいて発現させる。 N −met−asp−pr□ C(asn−ala−
asn−pro)+5(asn−val−asp−pr
o)+) n−T 32−C(式中、nは4 (R64
tet3t)またはnは5([Otet3g)である)
。nが4または5であるpAs1クローンを、前記と同
様にして、各々、n#(4または5以外であるクローン
から選択する。 R64teL、、およびR80Lea
stは両方ともR48tet、tとほぼ同じレベルで発
現する。R64Leastを、前記R16Least、
R32tetatおよびR48tetstと実質的に同
じ方法で精製する。 実施例3C R96tet+tおよびRl 12 tetH前記実施
例3Bに記載したのと実質的に同様にして、R96te
tatおよびR112Let+2(各々、nは6および
7である)をR48LetHとほぼ同じレベルでイー・
コリにおいて発現させる。出発ベクターはpR80te
tstである。 イムノプロット分、折により、精製したRtet3gポ
リペプチドにおいて、いくぶん不均一性がみられるが、
バンドに対応する主要な反応性種がタンパク質染色によ
り見られる。5DS−PAGEによって得られる分子量
は、予想値の約2倍であるが、各タンパク質の移動は、
各構造中のテトラペプチドの数に比例する。数種のRt
eLatポリペプチドに関するアミノ酸組成決定は、予
想通りの値を示す。 実施例4 16G p’I’ermは、配列; 5°−GATCCCGGGTGACTGACTGA  
 −3’3°−GGCCCACTGACTGACTCT
AG−5゜を有する合成リンカ−を、pAslのBam
HI  サイトに挿入することにより調製される。pA
s110u9を25単位のBamHIで消化する。10
0n9のBamHI切断pA切断音As19の合成リン
カ−と結紮し、プラスミドpT ermをpΔSlのB
amHlサイトに挿入されたリンカ−で同定する。この
ベクターはBamHIサイトを有し、全ての3種の解読
フレーム中にcII タンパク質のATG開始コドンの
下流にTGA終止コドンが挿入される。 pR16Gは、ptrcsクローンl由来の192塩基
対のXhoIIフラグメントをpT ermのBamH
Iサイトに挿入することにより調製し、適正な配列の1
つのXho■挿入部を有するクローンを、実質pR16
Gは、pucsクローンl由来の192塩基対のXho
lIフラグメントをpTermのBamHIサイトに挿
入することにより調製し、適正な配列の1つのXhoU
挿入部を有するクローンを、実質的に前記と同様にして
選択する。 実質的に前記と同様にして、pR16Gをクローン化し
、イー・コリN5151株において発現させる。 RI6Gは、次に示す配列を有する: N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro) + a−(asn−valasp−
pro)I)n−gly−C (式中、nはlである)。 このタンパク質は芳香族残基を含有していないので、発
現レベルを定量化するクーマシーブリリアントブルーR
−250染色法によって視覚化することができない。c
sタンパク質に関して特異的な5種のモノクローナル抗
体を用いたイムノプロット分析(前記ゲノムら(Dam
e  et  al、)参照)により、クーマシーブリ
リアントブルーR−250染色が可能なRI 6 te
t、と比較して評価したレベルは、全細胞タンパク質の
約1%である。 実施例4A R32G、R48G1R64GSR80GおよびR11
2G 前記実施例4と同様にして、R32GSR48G、R6
4G、R80GおよびR112G(R16Gにおいて各
々、nが2.3.4.5または7である)をイー・コリ
N5151株において発現させる。これらのポリペプチ
ドは、R16Gとほぼ同じレベルで発現される。実質的
に実施例3に記載したのと同様にして、R48Gを精製
する。 実施例5 R16LAおよびR32LA 実質的に実施例4に記載したのと同様にして、配列: 5°−GATCCGCTGCGTT   −3’3″−
GCGACGCAACTAG−5゜を有する合成リンカ
−をpAslのBamHI  サイトに挿入することに
よりpT erm 2を調製する。 pT erm 2はBamHIサイトを有する。pUC
8りローンl由来の192塩基対のXhoIIフラグメ
ントを前記と同様にして挿入する。各々、適正な配列の
1種または2種のXhoII挿入部を有するクローンで
あるpR16,LAおよびpR32LAを、実質的に前
記と同様にして選択する。実質的に実施例3に記載した
のと同様にして、R32LAを精製する。 実質的に前記と同様にして、pR16LAおよびpr(
32LAをクローン化し、イー・コリN5151株にお
いて発現させる。 RI6LAおよびr(32L’Aはつぎの配列を有する
: N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro) + 5(asn−val−asp−
pro)+) n−1en−1eu−ar式中、nは、
各々、■および2である)。C末端のロイシンおよびア
ルギニンは、pT erm 2の合成リンカ−由来のも
のである。R16LAは全イー・コリタンパク質の約1
%で発現され、一方、R32LAは、全細胞タンパク質
の約5%で発現される。 実施例6 R1’6NS! pAs1デルタEHは、PASI  起源のT)BR3
22の必須でないE coRI −H1ndII[領域
の切除により調製される。実質的に前記と同様にして、
10 μ9(7)PA S lを、培地緩衝液200u
Q中EcoR■およびHindI[I(各々、2G単位
)で切断し、DNAポリメラーゼ(フレノウ)で処理し
、結紮し、イー・コリ中に形質転換する。29塩基対の
EcoRr −H1ndllr フラグメントが欠失し
たクローンを同定する。861塩基対のビールス原およ
び375塩基対のpBR322原生にインフルエンザビ
ールス(A/PR/8/34)NS 1コーデイング領
域を含有するpAPR801の1236塩基対のBam
HIフラグメント(ヤングら、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニ
ー・ニス・エイ(Young  et  al、 、P
roc、 Natl、 Acad、 Sci、 U。 S 、A)、第80巻、6105頁(1983)参照)
を、pASlデルタEHのBamHIサイトに挿入する
。得られたプラスミド、pAs1デルタEH/801は
真正のN5I(230アミノ酸)を発現する。このプラ
スミドは、cII翻訳開始サイトおよびNSIコーディ
ング配列間にBamH[サイトを有する。 実質的に前記と同様にして、1)AS+デルタEH/8
01  10μ9を、ハイ・バッファー(50mMトリ
ス−HCl2、pH7,5、ImM  DTT。 10mM  MgCσ7、I OOmM  NaCl2
) 200μQ中EcoRI 20単位および5a11
20単位で、37℃にて2時間で切断し、DNAポリメ
ラージーフラグメント(フレノウ)で処理し、結紮する
。 650塩基対のEcoRI −Sal I領域が欠失し
たクローンを単離する。このプラスミド、pNs1デル
タESは真正のNSIを発現する。 pucsクローン1由来の192塩基対のXh。 ■フラグメントをpNSlデルタES中のBamHIサ
イト中に挿入することによりpR16NsIを調製し、
実質的に前記と同様にして、適正な配列の1つのXho
ll挿入部を有するクローンを選択す4っ 煮沸工程を除いて、実質的に前記と同様にして、pR1
6Ns1をクローンし、イー・コリにおいて発現し、R
16NS+を精製する。 RI6NSIは、次の配列を有する。 N −met−asp−pro ((asn−aha−
asn−pro) +5(asn−val−asp−p
ro)+ ) n−N 227(式中、nはl、N22
7は、NSI起源の227アミノ酸である)。 R16N91調製におけるRI6NSIは、煮沸または
イオン交換工程なしで、タンパク質の80%以上と評価
された。特に著しく高い比率を示すR16NS1は、総
細胞タンパク質の約25%である。 実施例6A R32NS l5R48NS1およびR64NSL煮沸
工程を除いて、実質的に実施例3に記載したのと同様に
して、R32NS1  (R16NS+においてnが2
である)をイー・コリにおいて発現し、イー・コリから
精製する。R32NS 1はR16NSIとほぼ同じレ
ベルで発現され、同じ程度まで精製する。 実質的に前記と同様にして、R48NSl(R1、6N
、S lにおいてnが3である)およびR64NS’1
(R16NS 1においてnが4である)をイー・コリ
において発現させる。R48NS IおよびR64NS
1は、各々、総イー・コリタンパク質の約lO%および
約5%で発現する。 実施例7 5IR48 実質的に前記と同様にして、pR48teteaをBa
mHIで開裂させ、DNAポリメラーゼ(フレノウ)で
末端をうめる。プラスミドを次いで前記の如<BanI
Iで開裂させ、3つのXhoffフラグメントを担う6
72塩基対のフラグメントおよびテトラサイクリン耐性
遺伝子由来の96塩基対を得る。 実質的に前記と同様にして、10μ9のI)ASIデル
タEH/801をハイバッファ−200μa中Nco1
20単位で37℃にて2時間で切断し、DNAポリメラ
ージーフラグメント(フレノウ)で末端をうめる。Nc
olサイトは、NSI中の81残基に関するコドン中に
ある。プラスミドを次いで前記の如<BanIr切断し
て残存するNSIコドンおよびテトラサイクリン耐性遺
伝子の一部を切除し、pAslデルタEH/801−1
を得る。 672塩基対のBamHI(末端をうめたもの)−Ba
nIIフラグメントをpAsIデルタEH/801−1
に挿入して1)N5IR48を調製する。このプラスミ
ドを実質的に前記と同様にして、イー・コリにおいて発
現させる。N5IR48は、次の配列を有する: N −81N −asp−pro C(asn−ala
−asn−pro)+5(asn−val−asp−p
ro)+ ) n−T 32−C(式中、81NはNS
Iの81N末端アミノ酸、nは3、Ta2は前記のとお
りである)。 N5IR48は総細胞タンパク質の約5
%で発現される。 実施例8 32N 実質的に前記と同様にして、10μ9のl)R32NS
Iを培地V新液200μf2中HindI[25単位で
37°Cにて2時間で切断し、pR32NS 1−1を
得る。HindIII サイトはNSIコーディング領
域中の残基5に関するコドン中にある。pR32NSI
−110Or+9を次いで実質的に前記と同様にして結
紮する。得られたプラスミド、pR32Nは、NSIコ
ーディング配列において、5番目のコドンの後にTAA
終止コドンを含有する。 pR32N は、実質的に前記と同様にしてイー・コリ
においてR32Nを発現するのに用いる。 R32Nは、次の配列を有する: N −met−asp−pro  C(asn−ala
−asn−pro) + 5−(asn−vaiasp
−pro)+ ) n−N 5−C(式中、nは2、N
5はNSI  遺伝子由来の5つのアミノ酸である)。 さらに詳しくは、N5は、次の配列を何するニ ーasn−thr−val−ser−ser−CR32
Nは総イー・コリタンパク質の約5%で発現される。 実施例9 抗体応答−EL I SA 組換タンパク質R16tetst、R32tetstお
よびR48teLtを実質的に前記と同様にして精製し
、0.01Mリン酸緩衝生理食塩水pH7、0(PBS
)に対して透析し、アリコートをとり、−80℃にて貯
蔵する。構築物を、PBS、水酸化アルミニウム(明パ
ン)または完全フロインドアジュバント(CF A)の
いずれかと混合して、50μ9のタンパク質を含有する
0 、 5 RQの投与量を得る。 PBS中CFA(GIBCOlGrand l5lan
d、 New Y ork)十抗原をl:lの比で、機
械的撹拌機で30分間撹拌することにより乳濁化させる
。明パンをPBS中に希釈した水酸化アルミニウムゲル
(USP)から調製する。 4℃にて12時間回転式混合機で、抗原は明パンに吸着
される。該懸濁液をさらに12時間静置し、上清を廃棄
して、l投与量につきA120.80所お上び組換タン
パク質50μ9を得る。6〜8週令のC57B1/6マ
ウスを総量50μ9のタンパク質を皮下投与および腹腔
内投与により免疫化する(1群につき5匹)。被験動物
に、第一回注射と同じ方法に従って、初期免疫化の4週
間後に追加抗原投与をする。ただし、CFA中免疫原を
受けた群には、不完全フロインドアジュバント(■FA
)中孔濁化したタンパク質で追加抗原投与を行う。1週
間後、尾から採取した血を全部ため、−夜4℃にて凝固
させ、遠心操作に付して血清を分離する。この血清を必
要になるまで一80℃にて保存する。 固相酵素免疫測定法(ELISA)を用いて、熱帯熱マ
ラリア原虫CSタンパク質(asn−aQa−asn−
pro)aの4つの重複からなるI6アミノ酸合成ペプ
チドとの反応性に関して、全ての血清をテストする(ゲ
ノムら、サイエンス(Dame  et  al、。 S cience)、第225巻、593頁(1984
)参照)。合成ペプチド抗原を牛血清アルブミン(BS
A)と結合させ、これをマイクロタイタープレートの孔
に塗布する。0.01M リン酸緩衝生理食塩水pH7
,4(PBS)で希釈したスクリーニング抗原50μ1
2(0,1μg)をポリスチレンマイクロタイタープレ
ート(イムンロン2 ダイナチク・ラボラトリーズ(I
 mmunlon 2  D ynatech  L 
abo−ratories、Alexandria、 
 VA)のくぼみにピペットで添加し、−夜室温(約2
2℃XRT)に保つ。 孔内容物を次いで、吸引し、ブロッキングバッファー(
BB=PBS中1.0%BSA、0.5%カゼイン、0
.005%チメルソールおよびo、oo。 5%フェノールレッド)を充填し、1時間室温に保つ。 マウスの血清を連続してBB中に希釈し、50μeを番
孔に添加する。室温にて2時間インキュベートした後、
孔を吸引し、PBS−0,05%ツイーン20(PBS
−TW20)で3回洗浄し、■O%PBS中熱不活化ヒ
ト血清で11500に希釈したヤギ抗マウスIgG(H
+L)(バイオラドラボラトリーズ(Bio−Rad 
 Laboratories。 Richmond、 CA)と接合したホースラディツ
シュパーオキシダーゼ50μaを番孔に添加する。1時
間後、孔内容物を吸引し、PBS−TW20で3回洗浄
し、次いで基質(13!92.2°−アジノージ−(3
−エチルベンズチアゾリンスルホン酸−6 ) / O
、I Mクエン酸リン酸緩衝液、pH4、OwQ。 使用直前に0.005%過酸化水素を添加)を路孔に添
加する。414nmにおける吸収を1時間後にELrS
Aプレートリーダー(ティターチク・マルチスキャン、
フロー・ラボラトリーズ・インコーホレイテッド(T 
1tertek  Multiskan、  F lo
wlaboratories 、 I nc、 、 M
e L ean、 V A ))で測定する。 R16tet32、R32tet、およびR48tet
3を構築物は、全てEL I SAにおいて反応する抗
体を産生する。R16tet*tは、単独で投与した場
合、R32tet*zおよびR48tetatに比べて
免疫原性が劣る。明パンおよびCFAは両方とも3種の
タンパク質全部の免疫原性を高め、抗体は、少なくとも
l領域で滴定により+02000検出される。 実施例IO 抗体応答−rFA 実施例9で得た抗血清は、間接免疫蛍光抗体分VFr(
IFA)でテストし、真正熱帯熱マラリア原虫CSタン
パク質と強く反応することが示された。 猿マラリア原虫、シノモルギマラリア原虫(P。 cynomolgi)、三日熱マラリア原虫(P、 v
iva)、およびガリナケウムマラリア原虫(P 、g
allinaceum)に対する反応性は検出されなか
った。R32tet32に対する抗血清の反応性は、若
干、嘔歯類住血胞子虫(P 、berghei)に関し
てみられた。この結果は、ホックマイヤーら、プロシー
デングズ・サード・インターナショナル・シンポジウム
・オブ・イムノバイオロジー、プロテインズペプタイズ
、アタソン、エム・ゼット編、プレナム(Hockme
yer  etal、、  in  Proc、  3
d  Int’1. Symp、  Immuno−b
iol、 Proteins  Peptides、 
 ed、 by Atassi。 M、 Z、、  P lenum  New  Yor
k(inpress)による、熱帯熱マラリア原虫に対
するある種のMabは、IFAにより、1歯類住血胞子
虫スポロゾイトと反応することを示すデータと一致する
。 実質的にボスワース、ジャーナル・オブ・バラントロシ
イ(Bosworth、 J 、Parasitol、
)、第61巻、769頁(1975)に記載されている
のと同様にして、スポロゾイトを感染した蚊の唾液腺か
ら摘出し、食塩水または0.5%BSAを含有するMe
dium I 99 (G I B CO)中に希釈し
、血球計算盤で計測し、2000〜5000スポロゾイ
ト/IOμeに希釈する。10μeのアリコートを、マ
ルチウェルプリンテッドIFAスライドの路孔に入れ、
室温で乾燥し、−80’Cにて保存する。 rFAi;t、まず、BBでl/+007.:希釈した
血清20μρ容を、乾燥したスポロゾイトを入れたIF
Aスライドの孔に入れることにより開始する。湿潤室内
で室温にて20分間インキュベートした後、該血清溶液
を吸引し、スポットを2滴のPBSで洗浄する。BBで
1:40に希釈したフルオレセインイソチオシアネート
(キルヶガード・アンド・ベリー(Kirkegord
  and  Pery。 G aithersburg、  M D )と接合し
たヤギ抗マウス抗体20μQを次いで各スポットに添加
する。再び室温にて20分間インキュベートした後、該
スポットを再び2滴のPBSで洗浄し、グリセロールに
添加し、500倍のUV光の下で蛍光に関して調べる。 実施例11 csp反応 Rl 6 tetst、R32tet、およびR48t
etstで免疫化したマウス由来の血清は、強いcsp
li性反応を示す(第1表参照)。アジュバントなしで
投与した場合、RI 6 tet+tだけが、陽性のC
S2反応を示す抗体を産生せず、一方、CFAまたは明
パンとともに投与した場合、3つの構築物は全て強いC
12反応を示す抗体を産生じた。 第  1  表 RI 6 tetHlR32tet3tおよびR48t
etstに対する血清のC2F反応性 抗血清 アジュバント R16Let3fR32Let32R4
8tet3tなし     O/25(−) 17/2
5(2+) 21/25(4+)CFA  23/25
(4+) 21/25(4+) 21/25(4+)明
パン   25/25(4+) 25/25/(4+)
  16/27(2+−4+) C12反応は、基本的にファンデルベルクら、(Van
derberg et al、 Mil、 Med、)
、第134巻(補遺I)、1183頁(1969)によ
り記載されているのと同様にして行う。Medium 
I 99 中に再懸尚させた熱帯熱マラリア原虫500
〜1000を含有する蚊唾液腺スポロゾイトを、顕微鏡
スライド上で血清5μQと混合し、カバーガラスをかけ
、ペトロリウムゼリーをふちにつけて密封し、37℃に
て1時間インキュベートする。位相差顕微鏡で400倍
で反応を評価する。25のランダムスポロゾイトを、各
血清サンプルに関して調べ、C9P陽性生体の数を表に
示す。面記ファンデルベルクら(V anderber
g  et  al、)により記載されているC2F反
応度を書き加えである。 (−)は、CSP反応性が検出されないことを示す+(
2+)は、スポロゾイトの表面上に粒状の沈殿が見られ
ることを示す;(4+)は、スポロゾイトの一端に、長
い糸状フィラメントが見られることを示す。正常マウス
血清、およびCFAのみで免疫化したマウスから得た血
清は、同様の分析で検出可能なC8P活性を示さなかっ
た。 実施例12 肝臓細胞ブロッキング 前記実施例9で得た血清を、in  vitroでの侵
入阻害分析で調べた(第2表)。これらのデータにより
、R32tetHおよびR48Let3.タンパク質は
アジュバントの非存在下でも抗体に強いブロッキング活
性を惹起することがわかる。Rl 6 tetstは、
適用され明パンに吸収される場合は、強いブロッキング
抗体の惹起にあまり有効でない。これは、Rl 6 t
etszタンパク質に生じる抗血清について見られる弱
いCSP反応性および低いELiSA滴定値と一致する
。 第2表 in  vitroの熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト
侵入HepG 2−A I 6ヘパトーム細胞の阻害な
  し            46      95
      92CPA       76   92
   94明パン     100  100   9
6培養細胞のスポロゾイト侵入の阻害は、ホリングデイ
ルら、ジャーナル・オブ・イムノロシイ(Hollin
gdale  et  al、、  J、Immuno
l、)第32巻、909頁(1984)により記載され
ているのと実質的に同様にして行なわれる。R16te
t、、、R32Let:+tおよびR48tetat構
築物で免疫化されたマウスから得た血清を、熱帯熱マラ
リア原虫スポロゾイトによる培養細胞の侵入の阻害性に
関してテストした。血清を培養液中に希釈し、HepG
2−AI6細胞培養物に添加しで、最終希釈度をl :
20(v/v)にする。次いで12000〜40000
の蚊唾液腺熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトを適用した
培養物を、37℃にて5%COを雰囲気下で3時間イン
キュベートし、D ulbecc。 のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、メタノー
ル中で凝固させて、PBSで2回洗浄する。 細胞中にはいったスポロゾイトは、免疫パーオキシダー
ゼ分析(IPA)により視覚化できる(前記ホリングデ
イルら(Hollingdale  et  al、参
照)。IPAは、まず、固定化培養物を熱帯熱マラリア
原虫に対するMab(2F 1 、 l 、前記ゲノム
ら(Dame  et  al、参照)で処理し、次い
で、ホースラディツシュパーオキシダーゼと接合したウ
サギ抗マウスイムノグロブリンとともにインキュベート
し、3.3−ジアミノベンジジンで染色することにより
行う。培養細胞中に侵入したスポロゾイトの数を、ライ
フ(Leitz)の顕微鏡で、250倍で、暗青色フィ
ルターを用いて、全調製物中に存在する細胞内寄生体の
計測により測定する。 実験は、2回または3回ずつ行い、同一の実験において
は、各細胞培養物に同数のスポロゾイトを添加する。阻
害は、正常マウス血清対照例と比較した杭構築免疫血清
によるスポロゾイト侵入の減少率(%)であり、CS反
応性Mab2F  1.1により、希釈度l/20で1
00%のスポロゾイト侵入阻害が得られた。 実質的に前記と同様にして調製した組換タンパク質、R
LA、R16NS !およびR32NS 1を、同様に
EL I SAおよびIFA分析でテストし、同様に、
16合成ペプチド残基と反応する抗体を惹起し、陽性の
CSP反応を示すことが判明した。R32tet=tお
よびR32LAは、その反応の均一性、発現レベルおよ
び調製の容易性のために好ましい。 合成的に製造したワクチンの第一の問題は、合成免疫原
性に対して産生された抗体が真正分子を認識するかどう
か、および該抗体が防御を付与するのに十分な生物学的
性質を有するかどうかである。免疫蛍光分析およびC8
P反応の両方を示す実施例により、イー・コリ構築物に
対して産生された抗体は、スポロゾイトの表面と反応し
、従って、真正CSタンパク質を認識することがわかる
。 C9P抗体は動物およびヒトにおいて存在し、防御免疫
と重要な関連があることが判明している。 抗構築抗体がin  vitroでヒトへブトーマのス
ポロゾイト侵入を阻害することは明らかである。前記ホ
リングデイルら(Hollingdale  et  
al、)は、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア
原虫に対するMabは両方とも、これらのマラリア種に
対するヒト免疫由来のポリクローナル血清と同様に、ス
ポロゾイト侵入をブロックすることを示している。in
  vitroでのスポロゾイト侵入のブロッキングは
、従って防御抗体に関する評価として考慮される。従っ
て、該データは全体として、侵入のワクチンは、熱帯熱
マラリア原虫スポロゾイトによる感染からヒトを防御す
るのに用いることができることがわかる。 ELISA滴定により評価されるこれらの組換タンパク
質、表面反応性(IFAおよびC8Pにより示される)
およびスポロゾイト侵入のブロッキングに対する免疫応
答は、完全フロインドアジュバントまたは明パンのいず
れかを用いることにより高められる。完全フロインドア
ジュバントは、発熱させ、肉芽腫を生じさせ、その結果
、ツベルクリン過感作となるので、ヒトにおいて用いる
ことができない。明パンは、現在、ジフテリアおよび破
傷風トキソイド等の確立されたワクチン、ならびに最新
ワクチンの一種、B型肝炎において、アジュバントとし
て用いられている。これは、有効で、ヒトにおいて長期
間安全に使用できることが実証されている。 実施例13 ワクチン調製物 一例として、ワクチンを以下の様にして調製する。3%
水酸化アルミニウムの緩衝水性溶液(10mMリン酸ナ
トリウム、150 mMNac12. pH6。 8;濾過により滅菌化)に、同様のII街液液中本発明
ポリペプチド溶液を撹拌しながら添加し、ポリペプチド
の最終濃度を100μ9/村、アルミニウム(AQ”+
)の最終濃度を1.0肩9/酎にする。I)Hを6.6
 に保つ。該混合物を約0℃にて一夜静置する。チメル
ソールを添加し、最終農度を0.005%にする。p)
(をチェックし、要すれば、6゜8に調節する。 以上の様に本発明およびその好ましい具体例を記載した
が、本発明は、記載した具体例に限定されるわけではな
く、むしろ特許請求の範囲に含まれるあらゆる修飾が含
まれる。 4、図面の簡単な説明 第1a図は、CSタンパク質のコーディング配列を担う
熱帯熱マラリア原虫(P lasmoduimfalc
iparum)ゲノムDNAの領域の部分的制限エンド
ヌクレアーゼ開裂地図である。 第1b図は、pAslの部分的制限エンドヌクレアーゼ
の開裂地図である。 特許出願人 スミスクライン・ベックマン・コーポレイ
ション 代 理 人 弁理士前 山  葆ほか2名

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)調節エレメントと有効に結合した熱帯熱マラリア
    原虫(Plasmodium falciparum)
    のCSタンパク質の重複単位の全部または一部に対する
    コーディング配列を有するイー・コリ(E.coli)
    発現ベクター。
  2. (2)CSタンパク質コーディング配列またはそのタン
    デム重複のXhoII−XhoII領域を含む前記第(1)
    項のベクター。
  3. (3)コーディング配列が少なくとも4タンデム重複を
    コードする前記第(1)項のベクター。
  4. (4)コーディング配列が少なくとも約16〜148重
    複単位をコードする前記第(3)項のベクター。
  5. (5)コーディング配列が、Rtet_3_2ポリペプ
    チド、Rtet_8_8ポリペプチド、RNS1ポリペ
    プチド、NS1Rポリペプチド、RGポリペプチド、R
    LAポリペプチドおよびRNポリペプチドからなる群よ
    り選ばれるポリペプチドをコードする前記第(4)項の
    ベクター。
  6. (6)コーディング配列が、 R16tet_8_8 R32G R32tet_8_6 R48G R48tet_8_8 R64G R16tet_3_2 R80G R32tet_3_2 R112G R48tet_3_2 R16LA R64tet_3_2 R32LA R80tet_3_2 R16NS1 R96tet_3_2 R32NS1 R112tet_3_2 R48NS1 R16G R64NS1 NS1R48 R32N からなる群より選ばれるポリペプチドをコードする前記
    第(4)項のベクター。
  7. (7)ポリペプチドがR32tet_3_2またはR3
    2LAである前記第(4)項のベクター。
  8. (8)調節エレメントが、PLプロモーター、およびc
    II翻訳開始サイトを含めたcIIリボソーム結合サイトを
    含む前記第(1)項のベクター。
  9. (9)pAS1調節エレメントを有する前記第(8)項
    のベクター。
  10. (10)前記第(1)項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
  11. (11)前記第(2)項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
  12. (12)前記第(3)項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
  13. (13)前記第(4)項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
  14. (14)前記第(5)項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
  15. (15)前記第(6)項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
  16. (16)前記第(7)項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
  17. (17)前記第(8)項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
  18. (18)前記第(9)項のベクターで形質転換されたイ
    ー・コリ。
  19. (19)細胞抽出物に界面活性剤を添加し、次いで該抽
    出物を加熱して細菌性タンパク質を沈殿させ、さらにポ
    リペプチドを上清から精製することを特徴とする、増殖
    イー・コリの清澄化細胞抽出物から熱帯熱マラリア原虫
    CSタンパク質の4以上のタンデム重複を有するポリペ
    プチドを精製する方法。
  20. (20)前記第(10)項のイー・コリを培養してポリ
    ペプチドを産生し、これより該ポリペプチドを精製する
    ことを特徴とする熱帯熱マラリア原虫CSタンパク質の
    4以上のタンデム重複を有するポリペプチドの調製方法
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