JPS6229597A - ペプチド組成物 - Google Patents

ペプチド組成物

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JPS6229597A
JPS6229597A JP61172932A JP17293286A JPS6229597A JP S6229597 A JPS6229597 A JP S6229597A JP 61172932 A JP61172932 A JP 61172932A JP 17293286 A JP17293286 A JP 17293286A JP S6229597 A JPS6229597 A JP S6229597A
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56905—Protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
    • C08G69/08—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from amino-carboxylic acids
    • C08G69/10—Alpha-amino-carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 されるペプチド組成物に係る。
式（Ｉ） Ｈ−（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）　　−ＯＨ式
中　　Ａｓｎ　　：　　アスパラギンＡｌａ　　：　　
アラニン Ｐｒｏ　　：　　プロリン ｎ　　：　１０以上の数 ブラズモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）は、無を椎動
物宿主（この宿主内では、有性生殖を行う）及びを椎動
物宿主（この宿主内では、多数分裂により繁殖する）に
おいて互いに異なったライフサイクルを有する住血寄生
虫である。
ヒトの体内では、プラスモジウムは危険でかつ伝播力の
強いマラリアを起こす。
ヒトに体する病原体となりうるちのは次の４種である。
すなわち、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓ−ｍＯｄｉ式
日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　訴ａｒ−ｉ
ａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｉｏｄｉｕｍ　ｏ
ｖａｌｉｓ）及び熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄ
ｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である。
これらの中でも、熱帯熱マラリア原虫は、最も危険な病
気である。いわゆる悪性三日熱の病原体である。マラリ
ア寄生虫はアノフェレス蚊（無を膿 〜宿主である）によってヒト体内に移され、網状内皮性
及び肝系の細胞内で増殖する。このような第１段階につ
づいて、約１週間後には、寄生虫が血流中に侵入し、赤
血球を感染し、分裂を始める第２段階に達する。
上記寄生虫のうちいくつかのものは、多数分裂サイクル
を行なわず、生殖母体に変体する。
血流中にプラスモジウムを有するマラリア患者を刺すこ
とにより雌の蚊は、感染された血液と共に生殖母体を吸
入する。この生殖母体は　有性生殖によって、細くかつ
先細の形状のスポロゾイトを生成する。
かかるスポロゾイトは　蚊により、再びヒト体内に移さ
れ、これらは新たな多数分裂サイクルを開始する。
このようなマラリアを起こすプラスモジウムのライフサ
イクルの各段階に応じたワクチンが開発されている。
ヒトに対して有効である場合、病気の発症への進行及び
病気の伝染を防止できるようなスポロゾイトに対するワ
クチンの開発が特に注目を集めている。
マラリア性スポロゾイトに対してヒト及び動物を免疫し
、保護する可能性についてはＲ，１１，Ｎｕｓｓｅ−ｎ
ｚｗｅｔｇらにより照射済スポロゾイトを使用して研究
されている。（ｒＭｉｌ、ＭｅｄＪ　１（４，１３７６
（Ｉ９６９））。
さらに、このような保護は、スポロゾイトの表面上に存
在するタンパク質（いわゆるスポロゾイト周囲（ＣＳ）
タンパク質）に関する特殊な抗体の生産に相関すること
がわかっている。
最近、ＤａｌｌＩｅらは熱帯熱マラリア原虫のＣｓタン
パク質をコードづけする遺伝子をクローン化し、配列を
解明している（「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｊ　２
２５゜５９３−５９９（Ｉ９８４）　）。
かかるタンパク質（アミノ酸４１２個でなる）は、配列
Ａｓｎ　−Ａｌａ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏを有するテトラ
ペプチド３７個及び配列Ａｓｎ−八ｓｐ　−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏを有するテトラペプチド４個でなる中心繰返し領域
を有する。
ＣＳタンパク質に対して特異的なモノクロナール抗体を
使用して行なわれた研究では、この領域に特異なエピト
ープが存在することが明らかにされ、これにより、この
領域の免疫優性特性及びマラリアに対するワクチンの調
製の基礎として使用できることが確認された。最近、Ｌ
　Ｒｉｐｌｅｙ　　Ｂａ１ｌｏｕらは、熱帯熱マラリア
原虫のスポロゾイトのＣｓタンパク質領領域１ないし３
個のアミノ酸４分子体でなるペプチドを合成した（「サ
イエンスＪ２２８゜９９６−９９９（Ｉ，９８５）　）
。
著者らは、アミノ基末端システィン残基によりキャリヤ
ータンパク質に結合される際、これらペプチドは実験動
物に陽性の抗体応答を誘発しうろことを見出した。
さらに、生産された抗体は本来のスポロゾイト周囲タン
パク質を認識し、インビトロで、ヒト肝臓細胞のスポロ
ゾイト感染を阻害する。
しかしながら、この合成ペプチドを熱帯熱スポロゾイト
に対するワクチンの製造に使用するには、いくつかの制
限がある。
これら制限の理由は主として次の点にある。
（Ｉ）キャリヤータンパク質に結合できるベブ（３）エ
ピトープ−特異的抑制があること。
（４）熱帯熱マラリア原虫に対する免疫の期間が短かく
、繰返し接種することが必要であること。
Ｊ、　Ｆ、　Ｙｏｕｎｇらによれば、３２アミノ酸ペブ
チドセグメントに融合された熱帯熱マラリア原虫のＣＳ
タンパク質中に存在する領域の１６．３２又は４８繰返
しアミノ酸４分子体でなるタンパク質が、大腸菌（Ｅ、
　Ｃｏ１ｔ）内で発現される（［サイエンスＪ２２ｇ、
　９５８−９６２（Ｉ９８５）　）。
得られたタンパク質を実験動物でテストしたところ、か
かるタンパク質は高い抗体力を示し、誘発された抗体は
本来のタンパク質を認識し、インビトロ検定において、
腫瘍肝臓細胞のスポロゾイト侵入を防御する。
しかしながら、上記文献のＹｏｕｎｇらの方法に従って
操作する場合には、遺伝子操作を介して得られる生成物
をヒトの治療に使用することに関連する可能な限りの危
険を予め正確に評価しておくことが必要であり、又所望
のタンパク質を生産し、これを精製するために各種の困
難性があることはあきらかである。
必要である。
さらに、Ｅ、Ｃｏ１１合成生成物が細胞中に残留するた
め、抽出にあたっては、微生物の破壊又は分解が必要で
ある。抽出生成物はつづいて取出され、精製されなけれ
ばならない。
要するに、このような方法は、各種の工程が必要である
ため煩雑であり、収率も低く、工業的見地からこの方法
は必ずしも推奨されない。
発明者らは、マラリアの検地のための診断用キットの調
製と共に、マラリアワクチンの製造に使用されるペプチ
ド組成物（簡単かつ経済的な方法により、純粋な形で得
られる）を使用することにより、従来法の欠点を解消で
きることを新たに見出し、本発明に至った。
従って、本発明の目的は、マラリアワクチン及びマラリ
ア検地のための診断用キットの製造に使用されるペプチ
ド組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、かかるペプチド組成物のシリア診
断用キットの製造における前記ペプチド組成物の使用に
ある。
本発明の他の目的は下記の記載及び実験例から明らかに
なるであろう。
さらに詳述すれば、本発明によるペプチド組成物は、下
記の式（Ｉ）で表されるペプチド混合物でな ある。
式（Ｉ） ％式％ 式中　　Ａｓｎ　　：　　アスパラギンＡｌａ　　ニ　
アラニン Ｐｒｏ　　：　　プロリン ｎ　　；　１０以上の数 本発明によれば、上記ペプチド混合物は、下記の工程を
包含する方法により調製される。
ａ）一般式（ＩＩ） るＡｓｎ末端アミノ基保護テトラペプチドを合成線オろ
ｎａ。
ｂ）前記テトラペプチド（ＩＩ）をフェノールハロゲン
化誘導体との反応により活性化して、一般式（Ｉｎ） Ｘ−＾ｓｎ−Ａｌａ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−ＯＹ（式
中、Ｘは前記と同意義であり、Ｙはフェノールハロゲン
化誘導体の残基である）を有Ｃ）前記テトラペプチド（
ＩＩＩ）から酸分解によりアミノ保護基を除去して、一
般式（ＩＶ）ＨＣＬ−Ｈ−Ａｓｎ−Ａｌａ　−Ａｓｎ　
−Ｐｒｏ　−ＯＹを有するテトラペプチドを調製→マろ
工程。
ｄ）塩基性有機触媒の存在下で、前記テトラペプチド（
ＩＶ）を重縮合せしめる工程。
ｅ）ペプチド混合物（Ｉ） Ｈ−（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）　　−ＯＨ（
式中、ｎは１０以上）を分離、回収する工程。
本発明による方法の工程ａ）において、一般式％式％） で表されるＡｓｎの末端アミノ基部で保護されたテトラ
ペプチドの生成は、ペプチド合成における公知の方法に
従って、均一相での縮合により行なわれる。
一般に、アミノ又はカルボキシル官能基部で適宜保護さ
れたアミノ酸を、公知のものの中から選ばれる縮合剤の
存在下、不活性（非反応性）溶媒中に溶解せしめる。
好適な有機溶媒は、塩素化芳香族炭化水素、脂肪族ケト
ン、アルキルエーテルである。これら溶媒の中で特に好
ましいものは、Ｎ、Ｎ’　−ジメチルホルムアミド、ク
ロロホルム、酢酸エチル、テトラヒドロフランである。
アミノ保護基は、酸不安定性のもの（すなわち、酸加水
分解により除去されうるちの）の中から選ばれる。特に
、第３ブチルオキシカルボニル（Ｂｏａ）が好適である
。
縮合の反応温度は一般に一１０℃ないし＋４０℃であり
、これに対応する反応時間は、反応が完了され、又は実
質的に完了されるに必要なものでなければならない。
本発明による方法の工程ｂ）では、アミノ末端基で保護
されたテトラペプチド（ＩＩ）を、フェノールハロゲン
化誘導体との反応によって活性化して、Ｐｒｏの末端カ
ルボキシル基でエステル化された活性エステル（ＩＩ） Ｘ　−Ａｓｎ　−Ａｌａ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−ＯＹ
（式中、Ｘは前記と同意義であり、Ｙはフェノールハロ
ゲン化誘導体の残基である）を生成する。
本発明による方法で使用されるフェノールハロゲン化誘
導体はフッ素化又は塩素化誘導体である。
特に、ペンタクロロフェノール、■・リクロロフェノー
ル及びペンタフルオロフェノールが好適である。
Ｐｒｏカルボキシル基活性化反応は、Ｐｒｏカルボキシ
ル基から保護基を除去した後、テトラペプチド（ＩＩ）
をフェノールハロゲン化誘導体とモル比的１：１で接触
させることにより実施される。かかる反応は不活性有機
溶媒中、温度−１０℃ないし＋４０℃で行なわれる。さ
らに詳しくは、反応は室温又はこれに近い温度で行なわ
れる。
適切な有機溶媒の例としては、酢酸エチル又は塩素化脂
肪族炭化水素の如き非プロトン性のものがある。
得られた溶液を温度約０℃に冷却し、縮合剤を、縮合剤
／他の原料のモル比１／１以上で添加する。
さらに詳しくは、縮合剤としてノンクロヘキシルカルボ
ジイミドが使用される。
ついで、得られた混合物を温度−１Ｏ°Ｃないし＋４０
°Ｃに１５分ないし４時間維持する。実際には、温度約
ｏ’ｃでｔ時間、室！（２０−２５°Ｃ）又ハコれに近
い温度で約１時間操作することが好適である。
好適な条件下で操作することにより、融点１６０−１６
４℃及び〔α′３Ｄ”−７４，８°（ｃ＝０．７５、メ
タノール）を有するテトラペプチド（ＩＩＩ）が得られ
る。
工程Ｃ）では、アミノ保護基を酸加水分解によって活性
テトラペプチド（ＩＩＩ）から除去する。この酸加水分
解は、トリフルオロ酢酸又は濃塩酸を使用して、室温に
おいて約１時間で行なわれる。
本発明による方法の工程ｄ）では、保護基の除去後、上
記活性化テトラペプチド（ＩＶ）を、過剰量の塩基性有
機触媒の存在下、重縮合せしめる。好適な有機触媒はア
ルキル第３級アミン（アルキル基は炭素数１ないし４を
有する）である。特に好適なアミンはトリエチルアミン
である。
本発明によれば、反応は不活性有機溶媒中、液相で行な
われる。好適な有機溶媒はジメチルスルホキシド、ジメ
チロールアミド、ヘキサメチルホスホルアミドである。
反応温度は一１５°Ｃないし約＋４０℃であり、相応す
る反応時間（瓜２４時間ないし４日である。
させるに要する時間は概ね７２時間である。
反応終了後、ペプチド組成物が得られ、これから、ゲル
クロマトグラフィーにより、式（Ｉ）Ｈ−（Ａｓｎ　−
Ａｌａ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ）’　　−ＯＨ（式中、ｎ
は１０以上である）で表されるペプチド混合物を回収す
る。
マラリアワクチン又はマラリア診断用キットの製造に使
用される。
本発明の他の具体例によれば、上記混合物を分別するこ
とにより、狭い分子量（ＭＹ）分布を有する混合物が得
られる。
分別は、５ｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ５０を充填し
たカラム（２，５ｘ　８０ｃｍ）を使用し、温度２０−
２５℃、流量０．５ＸＬ’分の条件下、ゲルクロマトグ
ラフィーにより行なわれる。このように操作することに
より、ｎが３Ｌ−４１である分子量約１６．０００を有
するフラクション及びｎ２Ｏ−２３に相当する分子量約
ｇ、ｏｏｏを有するフラクションが分別、回収される。
特に好適なものはＭｉｌｌ約１６，０００及びｎ３７−
４１を有するペプチド混合物である。
全体の混合物及び単一フラクションのいずれも、マウス
において生物活性を示す。特に、ｎ３７−４１のペプチ
ド混合物が活性である。
従って、このような各種の混合物のいずれをも、マラリ
アワクチン及びマラリア診断用キットの製造に使用され
る。
下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、本
発明を限定するものではない。
実施例１ 攪拌機を具備する反応フラスコ（２５０３１１２）に、
ＨＣｌ２・Ｈ−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　１０９（４２，５ミリ
モル）及びＮ、Ｎ’　−ジメチルホルムアミド１５０Ｒ
Ｑを導入した。混合物を攪拌して、溶液を得た。
攪拌しながら、この溶液に、ジイソプロピルエチルアミ
ンＣＤＩＰＥＡ）？、１ｘＱ（４５ミリモル）及びＮ−
ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）８．４９　
（６２ミリモル）を添加し、溶液を０℃に冷却した。こ
の冷却した溶液に、ジシクロへキシルカルボジイミド（
＋）ＣＩ）９．３７９（４５ミリモル）を添加した。溶
液温度を０℃に維持して、縮合反応を９０分間行った。
その後、溶媒を反応混合物から留去し、残渣を酢酸エチ
ル（ＥｔＯＡｃ）２ＱＯｘＣテ溶解し、５　％（ｊｌ／
Ｖ）炭酸水素ナトリウム溶液３０峠、１０％（Ｗ／　Ｖ
）クエン酸溶液３０ｘＱ及び塩化ナトリウム飽和溶液３
０峠で順次洗浄した。
有機相を溶液から分離し、無水Ｍｇ５Ｏ，Ｌｏｇで乾燥
した。
ついで、溶液から溶媒を留去し、ＥｔＯＡｃ／ｎ−へ金 キサン（Ｉ／ｌ　、　Ｖ／Ｖ）１００ｍ１２から晶析に
より残渣を回収した。
融点１０５−１０６℃、〔α）Ｄ”−８３，６°（ｃ＝
１．２゜メタノール）を有する第３ブチロキシカルボニ
ル−アスパラギニル−プロリンのベンジルエステル１２
ｇが得られた。
ＯＢｚ　１１７ｇ（２８ミリモル）を、４Ｎ　ｈａ似金
含有るＢｔＯＡｃ溶液２００ｘ（！に添加した。
攪拌しながら、溶液を室温（２０−２５°Ｃ）に約１時
間維持した。
酸分解反応後、反応混合物から溶媒を留去し、残渣をジ
エチルエーテルと共に粉砕処理して、白色固状生成物を
得た。
Ｂｏａ　−Ａｌａ　−ＯＨ５，７ｇ（３０ミリモル）及
びＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）　３．０８ｘＣ（３
０ミリモル）と共に、前記白色固状物をＤＭＦ　１ｏｏ
ｚｆｆに添加した。溶液を０℃に冷却し、ついでこれに
ＤＣ９６，３９＜３０ミリモル）を添加した。反応を０
℃で９０分間行った。
この時間の経過後、反応混合物から溶媒を完全に留去し
た、残渣をＥｔ昨ｃ　２ＱＯ＊Ｑ中に溶解し、ついで前
記工程ｉ）と同様に、抽出、洗＃処理した。
その後、有機相を分離し、無水Ｍｇ５Ｏ，で乾燥した。
有機相から溶媒を分離し、残渣をｎ−ヘキサンと共に粉
砕することによって回収した。融点７１−７２℃及び　
〔α）、”−９４，７°（ｃ＝１．５．メタノール）を
有する第３ブチロキシカルボニル−アラニル−アスパラ
ギニル−プロリンのベンジルエステル１０ｇが得られた
（収率７３％）。
Ｐｒｏ　−０Ｂｚ）の合成 前記工程ｉ）と同様にしてＢｏｃ−Ａｌａ−＾５ｎ−Ｐ
ｒ。
−０Ｂｚ　９．９９（２０ミリモル）を使用して合成を
行った。
酸分解反応後、Ｂｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ５，１９（２２ミ
リモル）を含有するＤＭＰ　１ｏｏｓＱに残渣を溶解し
た。
溶液を温度θ℃に約２時間維持して縮合反応を行った。
ついで、工程ｉ）と同様に処理した。
融点１５３−１５４℃及び　〔α）、”　−９１，１°
（ｃ＝０．９．メタノール）を有する第３プチロキシカ
ルボニルーアスパラギニルーアラニルーアスパラギニル
ーブロリンのベンジルエステル　６ｇが得られた（収率
５０％）。
実施例２ と 攪拌機〜具備する反応容器（２００ｆｆ１２）に、Ｂｏ
ｃ　−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　１．
５９（２，５ミリモル）及びギ酸アンモニウム６０００
（９，５ミリモル）と共に、メタノール５０ｍＱを導入
した。
窒素雰囲気下で攪拌しながら、得られた溶液に、木炭に
担持した白金触媒（Ｉ０％）１９を添加した。
反応混合物を攪拌して、懸濁液を得た。
攪拌しながら、懸濁液を窒素雰囲気下、室温に維持し、
プロリンのカルボキシル基から保護ベンジル基を完全に
除去した。反応終了後、濾過により懸濁液から触媒を除
去し、減圧下で溶媒を留去して乾固した。この残渣を、
ペンタクロロフェノール６７０ｍ９（２，５ミリモル）
を含有するＥｔＯＡｃ　５０１１２に溶解した。溶液を
０℃に冷却し、これにＤｅ１２５２０Ｂ（２，５ミリモ
ル）を添加した。
攪拌しながら、溶液を０℃に１時間維持し、ついで室温
に約１時間維持した。
この時間の経過後、得られたジシクロヘキシル尿素を濾
過により回収し、溶媒を完全に留去した。
残渣を７０℃において、イソプロピルアルコール１００
ｉ（！で処理し、ついで、これにジエチルエーテルを添
加して晶析を開始させた。このようにして、所望の生成
物（融点１６０−１６４℃及び　〔α′４１２−７４．
８”　（ｃ＝０．７５．メタノール）を有する第３ブチ
ロキシカルボニル−アスパラギニル−アラニル−アスパ
ラギニル−プロリンのペンタクロロフェノールエステル
）１ｇが得られた。
実施例３ 実施例２で得られたＢｏｃ−Ａｓｎ　−Ａｌａ−＾５ｎ
−Ｐｒ。
−０ＰＣＰ　５００ｘ９（０，６５ミリモル）をトリフ
ルオロ酢酸２．０ｍ（ｌに溶解した。溶液を攪拌し、室
温に約１時間維持した。
反応終了後、減圧下で溶媒を留去し、油状残渣をジエチ
ルエーテルで処理して、白色固状物を得た。
生成物をジメチルスルホキシドＱｘＱ中に懸濁化し、混
合物を攪拌して溶液を得た。攪拌しながら、この溶液に
トリエチルアミン３００μＱを少量ずつ添加した。
□□！ｔｏ２４１よ６０、ｈｌＪｚｆｔＬ＝ア２．′１
００μＱの添加後、さらに４８時間維持した。
反応終了後、ゆっくりと攪拌した無水エタノール３５０
ｊＩＱに、得られた溶液を約５分間で滴加した。
濾過により沈殿を回収し、減圧下で乾燥した。
生成物を約３０Ｋｇのフラクションに分け、各フラクシ
ョンを０．ＩＮ酢酸ｌＲ１２に溶解し、クロマトグラフ
ィー分離処理した。
５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５　ＦＩＮＥ（Ｆａｒｍａｃｔ
ａ　　Ｕｐｓａｌａ）カラム（２，５ｘ　８０ｘｘ）を
・、温度２Ｇ−２５℃及び流量０．５ｘ１７／分の条件
下で使用した。
フラクションを１２分間の等しい範囲で集めた。
ま ２６から３９蚊でのフラクションを併わせ、凍結乾燥し
た。
Ｈ−（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）　　−ＯＨ（
ここでｎは１０以上である）で表される混合物でなるポ
リマー１１５１９が得られた（収率４０％）。
５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０を充填したカラムを使用し、
前記と同様にしてゲルクロマトグラフィーを行い、と共
に得られた。
ｎ＝３７−４１を有するフラクションの分子量を、内部
算定標準としてアルブミン（Ｍｌｌ　４５，０００）、
　ミオグロビン（Ｍｌ　１８．Ｇｏｏ）、　トリプシン
（Ｍｌ８，０００）及びトリプトファン（Ｉ４Ｗ　２０
０）を使用し、６Ｍ塩化グアム（Ｉ，ｓｘ　１ｏｏｃｊ
１）でのクロマトグラフィーにより確認した。
操作を室温で流量２　、５ｘＱ／時間で行い、１時間毎
にフラクションを集めた。
実施例４ リア原虫の抗スポロゾイトを検出するＥＬＩＳＡ検炙 ｉ）合成ペプチドでコーティングしたプレートの！！ ｎ＝３７−４１を有する合成ペプチドフラクションを蒸
留水に懸濁化し、ついで−７０℃に維持した懸濁液の一
定量をリン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）　（ｐＨ７，８
）で希釈して最終濃度Ｉμｙ／（ｌとした。
この溶液１００μρを、ＥＬＩＳＡ法で通常使用される
≧ 気クロ滴定プレートに移した。このミクロ滴定プレート
を、湿った室内で、室温（２０−２５℃）において−夜
培養した。
１吃 するＰＢＳ−Ｔ　２００μｍ２（ＰＢＳ−Ｔ−Ｍ）で飽
袷’６＝。プレートを室温に約１時間静置した。
飽和溶液を除去した後、ＰＢＳ−Ｔ−Ｍ　２．５％で適
当に希釈した検体の血清サンプル１００μＱを各ミクロ
滴定プレートのくぼみに滴加した。
プレートを室温で約１時間培養した。
ついで、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＩｇＧ。
ＩｇＭ又はヒト又は動物の全免疫グロブリンフラクショ
ンに対するベルオキシタ゛−ゼ結合抗血清（やぎから採
取したＩｇＧフラクション）１００μＱを添加した。抗
血清については２．５％ＰＢＳ−Ｔ−Ｍで適当に希釈し
た。
室温で１時間培養した後、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回
洗浄した。
ついで、０．１Ｍクエン酸塩曖衝液中にＨＩＯｌ　０．
０１％を含有するオルト−フェニレンジアミンの溶液（
０，４ｕ／ｉ＋４）ＬＯＯμＱを添加シタ。
２０分後、２．５Ｎ　　）Ｉ！Ｓｏ、を添加して酵素反
応を停止させた。
各プレートのくぼみにおける光学密度を、ミクロＥＬＩ
ＳＡ（ＭｕＬｔｉｓｋａｎ　　Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）を使
用して、４９２ｎｍにおける吸光度を測定することによ
り定量した。
た（添付図面参照）。
図において、横軸に検体の血清の希釈（比）を、縦軸に
４９２ｎｍにおける吸光度をプロットしている。
なお、各曲線は下記の如く採取された各検体の種類を示
す。
一一一一二スリナムからの患者から採取したもの α−−−リ：ザイールからの患者から採取したもの 酬−一一槌：コートシボアールに６年間居住するカフカ
ズ人から採取したもの ）−一−（：健康者から採取したもの（コントロール）
【図面の簡単な説明】
図面は本発明によるペプチド組成物を使用するマラリア
診断のためのＥＬＩＳＡ検定の結果を表わす（ばかｌる
）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １　マラリアワクチンの製造又はマラリア診断用キット
    の調製に使用される式（ I ） Ｈ−（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）＿ｎ−ＯＨ（
    式中、Ａｓｎはアスパラギンであり、Ａｌａはアラニン
    であり、Ｐｒｏはプロリンであり、ｎは１０以上の数で
    ある）で表わされるペプチド組成物。 ２　特許請求の範囲第１項のものにおいて、ｎが１０な
    いし１００である、ペプチド組成物。 ３　特許請求の範囲第１項のものにおいて、ペプチドの
    少なくとも６０重量％がｎ＝３７−４１を有するもので
    ある、ペプチド組成物。 ４　式（ I ） Ｈ−（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）＿ｎ−ＯＨ（
    式中、Ａｓｎはアスパラギンであり、Ａｌａはアラニン
    であり、Ｐｒｏはプロリンであり、ｎは１０以上の数で
    ある）で表されるペプチド組成物の製法において、 ａ）一般式（II） Ｘ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＨ（式中、Ｘ
    は酸不安定性保護基である）を有するＡｓｎ末端アミノ
    基保護テトラペプチドを合成し、 ｂ）前記テトラペプチド（II）をフェノールハロゲン化
    誘導体との反応により活性化して、 一般式（III） Ｘ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＹ（式中、Ｘ
    は前記と同意義であり、Ｙはフェノールハロゲン化誘導
    体の残基である）を有するＰｒｏ末端カルボキシ基部で
    エステル化されたテトラペプチドの活性エステルを調製
    し、ｃ）前記テトラペプチド（III）から酸分解により
    アミノ保護基を除去して、一般式（IV） ＨＣｌ−Ｈ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＹを
    有するテトラペプチドを調製し、 ｄ）塩基性有機触媒の存在下で、前記テトラペプチド（
    IV）を重縮合せしめ、 ｅ）前記式（ I ）で表されるペプチド混合物を分離、
    回収する、 ことを特徴とする、ペプチド組成物の製法。 ５　特許請求の範囲第４項記載の製法において、前記工
    程ａ）におけるアミノ保護基がＢｏｃである、ペプチド
    組成物の製法。 ６　特許請求の範囲第４項記載の製法において、前記工
    程ｂ）におけるフェノールハロゲン化誘導体が、フッ素
    化誘導体及び塩素化誘導体の中から選ばれる、ペプチド
    組成物の製法。 ７　特許請求の範囲第６項記載の製法において、前記フ
    ェノール誘導体が、ペンタクロロフェノール、トリクロ
    ロフェノール及びペンタフルオロフェノールである、ペ
    プチド組成物の製法。 ８　特許請求の範囲第４項記載の製法において、前記工
    程ｂ）におけるテトラペプチド（II）とフェノール誘導
    体との間のモル比が１／１又は１／１に近い値であり、
    不活性有機溶媒中、温度−１０℃ないし４０℃において
    液相で反応を行う、ペプチド組成物の製法。 ９　特許請求の範囲第８項記載の製法において、前記有
    機溶媒が酢酸エチルである、ペプチド組成物の製法。 １０　特許請求の範囲第８項記載の製法において、反応
    温度が０℃ないし２５℃である、ペプチド組成物の製法
    。 １１　特許請求の範囲第４項記載の製法において、前記
    工程ｃ）にあたり、前記アミノ保護基を、トリフルオ酢
    酸又は塩酸による酸分解によって除去する、ペプチド組
    成物の製法。 １２　特許請求の範囲第１１項記載の製法において、前
    記酸分解を、室温（２０−２５℃）、１時間又はほぼ１
    時間の条件下で行う、ペプチド組成物の製法。 １３　特許請求の範囲第４項記載の製法において、前記
    工程ｄ）における塩基性有機触媒が、アルキル第３級ア
    ミン（ここでアルキル基は炭素原子１ないし４個でなる
    ）の中から選ばれる、ペプチド組成物の製法。 １４　特許請求の範囲第１３項記載の製法において、前
    記アルキル第３級アミンがトリエチルアミンである、ペ
    プチド組成物の製法。 １５　特許請求の範囲第１４項記載の製法において、前
    記工程ｄ）にあたり、反応を室温（２０−２５℃）又は
    これに近い温度で行なう、ペプチド組成物の製法。 １６　特許請求の範囲第４項記載の製法において、前記
    工程ｅ）における分離をゲルクロマトグラフィーによっ
    て行う、ペプチド組成物の製法。 １７　式（ I ） Ｈ−（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）＿ｎ−ＯＨ（
    式中、Ａｓｎはアスパラギンであり、Ａｌａはアラニン
    であり、Ｐｒｏはプロリンであり、ｎは１０以上の数で
    ある）で表わされるペプチド組成物を使用することを特
    徴とする、マラリアワクチンの製法。 １８　式（ I ） Ｈ−（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）＿ｎ−ＯＨ（
    式中、Ａｓｎはアスパラギンであり、Ａｌａはアラニン
    であり、Ｐｒｏはプロリンであり、ｎは１０以上の数で
    ある）で表わされるペプチド組成物を使用することを特
    徴とする、マラリア診断用キットの調整法。 １９　基質として合成ペプチドを使用するＥＬＩＳＡ検
    定によって行うことを特徴とする、ヒト血液中のマラリ
    ア抗体の検出法。
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