CA2114223A1 - Polypeptides aptes a induire in vivo des anticorps eux-memes capables d'inhiber l'invasion de globules rouges par des merozoites de p. falciparum, produits apparentes et leur application a la production de compositions vaccinantes - Google Patents

Abstract

2114223 9303057 PCTABS00161 L'invention a pour objet un nouvel antigène issu de Plasmodium falciparum et son application à la production de composés vaccinants contre les parasites humains responsables du paludisme. Cet antigène est caractérisé par la séquence en acides aminés (I) ou par une partie de cette séquence.

Description

2 1 i s 2 2 3 PCI /FRg2/00763 POLYPEPTIDES APTES A INDUIRE IN VIVO DES
ANTICORPS ~UX--MEMES CAPABLES D'INHIBER L'INVASION
DE GLOBULES ROUGES PAR DES ~EROZOiTES DE
P. FALCIPARUM, PRODUITS APPARENTES ET LEUR
APPLICATION A LA PRODUCTION DE COMPOSITIONS
VACCINANTES

:
L'invention a pour objet de nouveaux antigènes de Plasmodium falciParum et leur application notamment en vue de la protection contre le paludisme.
Les parasites responsables du paludisme chez l'homme, dont notamment Plasmodium falciDarum ou Plasmodium vivax pour ne citer que les principaux d'entre eux, pr~esentent chez l'bôte humain des morphologies differentes et e~priment des antigènes différents, fonction du stade de leurs developppement et de leur localisation dans l'organisme de l'hôte infecte. Les differences morphologiques et antigéniques de ces parasites au cours de leur cycle de vie chez 1'homme, permettent de definir au moins ~uatre stades de developpement distincts.
Le tout premier stade de developpement du parasite chez l'homme correæpond à la forme sporozoïte introduite dans le sang de l'hôte, par piqures d'insectes porteurs du parasite. Le second stade correspond au passage du parasite dans le foie et à l'infection des cellules hepatiques dans leæquelles les parasites se developpent pour former les schizontes hepatiques qui, lorsqu'ils sont WOg3/03057 PCT/FR92/00763 2 l~4?.,~ 3 ` -matures (par exemple pour P.falciParum le 6è jour après penetration des sporozoïte~), libèrent par eclatement des merozoïtes hépatiques. Le troisième stade est caractérisé par l'infection des érythrocytes sanguins par le~ formes asexuées (merozoïtes) du parasite; ce stade érythrocytaire de développement correspond à la phase pathogène de la maladie. Le quatrième stade correspond a la formation des formes a potentiel sexue (ou gametocytes) qui deviendront des formes sexuees ou gamètes extra-cellulaires chez le moustigue.
Des études nombreuses ont éte consacrees au cours de ces dernieres annees à l'identification de molécules de parasites exposées à la surface de alobules rouges sanguins ou érythrocytes infectés avec le parasite humain pathogène, notamment du type Plasmodium falciParum. En effet, la virulence des parasites au stade sanguin a souvent éte associée à
l'existence de structures peptidigues ainsi exposees. Elles pourraient etre responsables de deux phenomènes souvent observés, à savoir 1'obstruction de capillaires vasculaires mettant en jeu une fixation de globules rouges parasites (PRBC, abreviation de l'expression "Parasitized Red Blood Cells) aux cellules endotheliales ou sequestration (~), et la fixation d'erythrocytes non infectes aux PRBCs avec formation de "rosettes^' (40). Ces phenomènes paraissent jouer un r~le mediateur important dans la physiopathologie des cas de paludisme sevère, notamment de ceux induits par Plasmodium falciParum.
Ces molecules de surface pourraient aussi ~ reprêsenter une cible pour les mecanismes de defense :~

W093/030s7 PCT/FR92/00763 2~1 ~2~3 immunitaire de l'hôte dont l'une des actions conduit à la phagocytose des PRBCs (10,11). Il y a quelque temps un gène, exprimé dans les stades tardifs du cycle intra-erythrocytique, à ete isolé (20). Le produit d'expression (antigène 332) s'est avere contenir une serie de séquences d'acides amines, repetitives degenerées. Il a et~e montre que des anticorps humains purifies par affinite au contact d'un polypeptide recombinant contenant la sequence de l'antigène 332, reagissait avec une famille de prot;eines du parasite qui consistaient en des produits d'expression de gènes differents (20).
Parmi les antigènes identifies au sein de cette famille, on mentionnera les antigènes 11.1 (Pfll-l) et (PflS5/RESA) qui contenaient eux-mêmes des d~terminants immunog~niques conduisant à des r~actions crois~es comme cela fut observe en utilisant un anticorps monoclonal humain (20). Plus recemment Udomsangtepch et al (36) decrivirent un anticorps monoclonal humain mAb 33G2 capable d'inhiber la cytoadherence de globules rouges parasites comportant ou non des protubérances avec des cellules de la lignee cellulaire de melanomes C32. Il a de plus éte constate que cet anticorps monoclonal inhibe, de façon efficace, l'invasion d'erythrocytes par les merozoïtes dans un test realise in vitro (38). Neanmoins, cet anticorps monoclonal initialement selectionne en raison de sa réactivite avec la molecule Pfl55/RESA (38), manque de specificite. Il reagit egalement avec d'autres antigènes apparaissant au stade sanguin de 1'infection par le parasite, notamment les antigènes Agll-l et Ag332 (20,37). L'antigène Ag 332 presente :;

W093/030s7 PCT~FR92/00763 2~ 4 sans aucun doute un intérêt potentiel important eu egard ~ ~a capacité ~ induire une immunité
protectrice. En effet, un polypeptide recombinant incluant le produit d'expression d'un fragment de 303 paires de bases issues de gènes Pf332 s'est avéré constituer un inhibiteur particulièrement efficace de 1'anticorps monoclonal mAb33G2, comme cela fut demontré dans un essai d'inhibition de l'invasion des globules rouges par les merozoïtes (37). Néanmoins, la caractérisation de Ag332 a jusqu'à ce jour été inhibée par les réactions croisées auxquelles les anticorps gui le reconnaissent donnent lieu, avec differents autres antigènes du parasite (20).
La présente invention r~sulte de l'identification et de la caractérisation d'une nouvelle sequence génique au sein du gène Pf332, de l'antigène code par cette sêquence g~nique et d'anticorps inductibles in vivo par cet antigène et specifique de 1'antigène. La sequence genique en question a éte localisèe dans la region subtelomerique du chromosome 11. L'antigène exprime par ce te sequence génique s'est avéré avoir un caractère monospécifique lui per~ettant de detecter spécifiquement une protéine megadaltonique du parasite ou des parasites asexués au stade sanguin par des réactions d'immuno-buvardage (immunoblot) et d'immunoprécipitation, contrairement aux anticorps induits par d'autres antigènes, soit issus de Ag332, soit apparentés à des séquences de celui-ci, tels que le dimère synthétique Y(SVTEEIAEEDK)2 (24) ou une proteine de fusion avec la beta-galactosidase (20). Ces anticorps réagissent également avec W093/030s7 PCT/FR92/0076~
2 1 i .? ~ 3 diverses autres molécules du parasite. Des anticorps formés contre l'antigene EB200 conduisent egalement à des reactions de surface avec des globules rouges infectés par Plasmodium falciParum avec une efficacite ayant le même ordre de grandeur que celle de 1'anticorps monoclonal mAb33G2.
La séquence peptidique de 1'antigène EB200, l'un des antigène conforme à la presente invention a une séquence peptidigue caractéristique correspondant à celle qui est encadrée dans la séquence du clone G9 (figure l(c) ), cette sequence ayant été déduite du clone G9 résultant de l'amplification de l'un des fragments du gène Pf332 dans les conditions qui seront rappelées plus loin.
L'antigène EB200 appartient de façon plus générale à la famîlle de polypeptides ayant un motif ou une sequence en acides aminés e~ commun contenant tout ou partie de la sequence polypeptidi~ue ci-dessous definie par sa sequence en acides ami~és :
S V T G N I L V E G
S V T E E V V G E E K
L V S E E I V T E E G
S V A Q E I V E E D A
P A T E E I D E I E
S V T E E V V E E E G
P V D E E I V Q E E G
T V T E E I I Q G E
S X V E E V V E E Q G
S E N E E I F V E E V
S A S Q E I V Q N E
S G T E E I L E K V
S A S Q E I V Q D G
S V T E Q I I E E L F

W093/030~7 PCT/FR92/00763 .,; . .~
c~ 6 P V T E E V V N E E E
Un peptide qui ne contient qu'une partie de cette séquence $ait partie de l'invention dès lors que ce peptide est apte, le cas echeant lorsqu'il est incorporee à une protéine de fusion, oligomerise ou conjugue à une proteine porteuse, à induire in vivo une reponse i~munitaire protectrice chez le singe ecureuil Saimiri sciureus.
La repartition des motifs successifs de la séquence en acides aminés d'un polypeptide preféré
conforme à l'invention, telle qu'elle a éte présentée ci-dessus, n'a d'autre objectif que celui de faire apparaitre l'existence de motifs répétitifs successifs, au sein de la proteine, cette répetitivite n'ètant cependant pas dépourvue de dégénerescences. Les blancs (en fait des liaisons directes) qui apparaissent ~ la fin de certaines des lignes ou au sein de certaine~ des lignes n'ont aucune signification parti~ulière. Leur seul bUt est la mise en ~vidence visuelle des homologues de sequences partielles de ces motifs repétitifs successifs. On peut remarquer lal frequence du motif VTEEV au sein de ces motifs partiellement repetitifs ou "dégéneres".
La même sequence en acides amines (utilisant la representation à trois lettres par acides amines, au lieu de la representation à une lettre dans la definition qui precede) est presentee dans la figure 2. Celle-ci fait egalement apparaître la sequence codante du clone recombinant, nomme PfEB2~0, contenant un insert de 411 paires~de bases isolees à partir du gène Pf332. Il est rappele que ce clone avait dejà ete isole à partir d'une banque W093/030s7 PCT/FR92/00763 2 1 , ! ` 2 2 3 de séquences d'expression construites dans un vecteur ~Amp3 avec un lot (pool3 de serums humains immuns (20). La presente invention découle de la mise en évidence de l'existence au sein de l'antigène Ag332 de ~equences en acides amines qui sont à la fois specifiques de cet antig~ne et exposes à la surface des mérozoïtes de P.falciparum et/ou des globules rouges infectés.
La ~anque genomique initiale de P.falci~parum dans le vecteur ~gtWES avait elle-même étè
construite par digestion à l'aide de DNaseI et addition d'adaptateurs (linkers) contenant des sites EcoRI comme antérieurement decrits dans (21).
Le criblage de la banque genomique initiale d'ADN de P.falciParum (souche Palo Alto à
prot~bérances positives) par digestion à 1'aide d'une nucléase et clonage dans un vecteur ~gtWES, et à l'aide d'une sonde d'hybridation issue du clone Pf332 a conduit les inventeurs à porter leur attention sur une sèrie de quatre clones Cl, Gl, G9 et G90 et à les sequencer partiellement. Les sèquences nucléotidiques de Gl, ~9 et G90, chevauchantes, avaient des tailles respectivement de 2,9 Kb; 4,8 Kb et 1,9 Kb. Le criblage d'une banque de cADNs da~ait conduire à un clone contenant un inserat de 466 paries de bases (clones Cl).
Les positions relatives des séquences de Cl, Gl, G9 et G90, vis-à-vis du clone initial dont elles sont issues sont schematiquement representes dans la figure l(a) :
Celle-ci pr~esente respectivement :
- une carte de restriction du gène Pf332, 2,3 " ;"

- les positions respectives des fragments retenus (Cl, G90, Gl et G9), - les sequences en acides amines déduites de parties des sequences de Cl, G90, Gl et G9 (dont la sequence s'étend approximativement dans la seconde moitié de la première colonne puis dans la premiere moitié de la seconde colonne des sequences représentées dans la figure 1~ qui ont plus particulièrement éte sequencées.
LRS parties séquencées sont représentees dans la figure 1 par des épaississement du trait. Les enzymes utilises pour la production de la carte de restriction etaient les suivants : BamHl(B), Clal(C), Dral(D), EcoRl~E) et Hind3(H).
Des parties de ces fragments et plus particuli~rement un sous-fragment de G9 (fragment BamHl, EcoRl de 441 paires de bases) a ete sous-clone dans un plasmide pGEX3(32). La sequence de (ci-apres dénommee EB200) prot~ine exprimee sous forme d'une proteine de fusion soluble PfEB200 avec une glutathione-S-transferase est l'objet d'un encadrement au sein de la partie de G9 qui avait ete seguencee. L'expression du polypeptide soluble a ete effectuée dans E.coli Dh5 ~ ~F end Al hsdr 17(rk-mk-) sup E44 thî-l, ~-, rec Al gyr A96 rel Al f80d lac Z~ M153. La purification de la proteine a ete faite par chromatographie d'affinite sur des billes d'agarose portant des groupes glutathion (32). LR
degre de purification de la prot~ine de fusion a ete analysee par electrophorèse sur gel de polyacrylamide contenant 10 % de SDS et par coloration au bleu de Coomassie.

W093/0~7 PCT/FR92/00763 2 ~

Toute technique classique peut être mise en oeuvre pour produire des anticorps specifiques de la proteina EB200 (sous forme de fusion ou non). Mais~
en l'occurrence, les anticorps testés dans les essais dont il est queætion plus loin ont ete produits dans les condition~ suivantes : des souris Balb/c ont éte immunis~es par injection sous-cutanee de la proteine recombinante EB200 (20 ~g) en présence de l'adjuvant complet de Freund. Deux injections de rappel, chaque fois de 15 ~g d'antigene, dans de l'adjuvant incomplet de Freund ont ete effectuees 3 semaines et 5 semaines respectivement après la première injection. Des æerums sanguins contenant les anticorps produits ont ete preleves æur les souris immunisees 7 jours après la derniere injection. Les titres en anticorps ont ete determines par immunofluorescence sur des globules rouges parasites etales en couches minces.
Ce sont les anticorps d'un tel serum qui se sont averes être monospecifigues. Teætes en immunoprecipitation et par Westerm Blot sur des extraits parasitaires, les anticorps anti-PfEB200 se sont avéres capables de rêagir avec une proteine de poids moleculaire apparent d'environ 1000 kDa appartenant au parasite Plasmodium falciParum.
La proteine EB200 et les anticorps correspondants ont encore donne lieu aux observations suivantes :
- les anticorps diriges contre la proteine recombinante exprime par le clone EB200 ont ete teætes selon leur capacite à inhiber, in vitro, la reinvasion des globules rouges par les merozoïtes, notamment dans le test decrit par R. Udomsangpetch 4~3 lo et al (37) qui lui même renvoie à une publication de Wahlin, B et al., intitulee "Human antibodies to a Mr 155,000 Plasmodium falciparum efficiently inhibit merozoïte invasion" (des anticorps humains contre une Mr 155.000 de Plasmodium falciparum inhibent efficacement une invasion aux merozoïtes) (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81 : 7912.Dans ce test, les parasites cultives en présence du serum anti-EB200 ont été inhibés à 84,4 % par rapport aux contrôles ou temoins cultivés en présence de sérum normal. L'anticorps monoclonal 33G2 dans le même test a inhibe 86,7 % de la parasitemie. Les activités de sérums anti-EB200 (anticorps polyclonal) et de l'anticorps monoclonal 33G2 étaient donc du même ordre de grandeur, - le sérum anti-EB200 réagi avec la surface des globules rouges de singe infectés par P.falciParum, - 1'antigène recombinant PfEB200 est capable d'inhiber la phagocytose des globules rouges parasités opsonisés (technique decrite dans (ii) par les monocytes des singes.
Ces résultats temoignent donc de l'exposition de la partie de l'antigène Pf332 qui contient une séquence peptidique correspondante à celle de la protéine EB200 à la surface des globules rouges infectés par le parasite ou à la surface des mérozoïtes.
La protéine EB200 ou des fractions de celle-ci présentent encore les caractéristiques suivantes :
- elles sont reconnues par des anticorps protecteurs contenus dans des sérums ou des fractions immunoglobuliniques provenant d'animaux, notamment de singes Saimiri sciureus, resistants aux W093/03057 2 ~ 3 PCT/FRg2/00763 parasites, lesdits sérums ou fractions etant susceptibles de rendre résistants des singes initialement sensibles à Plasmodium falciParum;
- elles sont inductrices notamment chez le singe, et plus particulierement chez le singe Saimiri sciureus, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de Plasmodium falci~arum.
Les conditions dans lesquelles de tels essais peuvent être realises ont éte decrites, par exemple par Dubois et al, 1984 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:
229-232; Perrin et al, 1984, J. of Exp. Med. 160:
440-451 et Siddiqui et al, 1987, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA ~4: 3014-3018.
Dans ce qui précede il a surtout eté fait reférence au pol~peptide EB200. Il va de soi que l'invention se rapporte également à toute partie de ce polypeptide qui est apte, le cas echéant apres incorporation à une proteine de fusion, oligomérisation ou conjugaison à une proteine porteuse, à induire in vivo une reponse immunitaire protectrice sur le singe-écureuil Saimiri sciureus.
De même l'invention s'~tend à tous les peptides équivalents resultant de 1'expression des sequences correspondantes d'ADNs issus de Plasmodiae infectieux pour l'homme, autres que P.falciparum, par exemple des souches 7G8 (Brésil), T9-96 tThaïlande), FcBR (Amerique du sud), 37D (derivee de NF54, Pays Bas) et Banjul (Gambie) lesquelles sont toutes reconnues dans des tests d'immunoprecipitation avec le sérum ~EB200. Il reconnaît de même des erythrocytes infectes par ces parasites. D'une façon generale tout peptide se WOg3/03057 PCT/FR92/00763 ,7,3 ~1 différenciant structurellement des precedents par substitutions, deletions ou additions d'un ou de plusieurs aminoacides fait partie de l'invention des lors qu'il est reconnu par des anticorps prealablement formes contre EB200 et, de preference, le cas écheant après oligomerisation, incorporation dans une proteine de fusion, conjugaison a une molecule porteuse, dès .lors qu'il induit chez le singe ecureuil Saimiri sciureus des anticorps actifs contre des parasites du paludisme humain, notamment P.falciparum.
On peut egalement avoir recours pour identifier les polypeptides ou peptides entrant dans le cadre de l'invention, au test de d'inhibition de l'invasion de globules rouges par des merozoïtes, notamment issus de P.falciparum. En particulier doit être considére comme faisant partie de 1'invention tout polypeptide ou fragment de polypeptide comportant en commun une partie de sequence en acides amines avec des EB200 et qui est apte à
induire in vivo des anticorps capables d'inhiber l'invasion des globules rouges dans une proportion au moins egale a 50 % par rapport à celles observables dans des preparations d'erythrocytes temoins places dans les mêmes conditions en presence des mêmes concentrations de merozoïtes, mais en l'absence des polypeptides ou partie de polypeptides du genre en question~
L'invention concerne naturellement tout polypeptide contenant une partie de s~quence s'etendant au delà des extremites de la sequence EB200, des lors que le polypeptide concerne presenterait des proprietes immunogènes protectrices 211~ 3 de la même nature. Par "Partie au del~ des extrémités de EB200" on entend par exemple les séquences en acides ~minés qui jouxtent la ~tructure en acides aminés de EB200 dans la sequence peptidique plus importante déduite de la s~guence nucléotidique du fragment G9, dont EB200 est issu (figure lC).
De la même façon, l'invention étend ses e~fets tous peptides dérivés des précédents, si ce n'est que certains residus aminoacyle de leurs séquences en acides amines seraient substitués par d'autres, voire délétés ou au contraire intercalés dans les sequences réprésentees, sans que les peptides modifiés obtenus perdent les propriétes biologiques caractéristiques du polypeptide EB200.
En :particulier l'invention concerne plus particuli~rement les sequences monomères correspondantes aux motifs repétitifs dégénérés présents dans EB200, notamment les peptides dont les séquences correspondent aux æéquences (a ~ o) qui suivent :
a) S V T G N I L V E G.
tb) S V T E E V V G E E K.
(c) L V S E E I V T E E G.
~d) S V A Q E I V E E D A.
(e) P A T E E I D E I E.
(f) S V T E E V V E E E G.
(g) P V D E E I V Q E E G.
(h) T V T E E I I Q G E.
(i) S K V E E V V E E Q G.

`

W093/030s7 PCT/FR92/00763 ~j) S E N E E I F V E E V.
(k) S A S Q E I V Q N E.
(1) S G T E E I L E K V.
(m) S A S Q E I V Q D G.
(n~ S V T E Q I I E E L F.
(o) P V T E E V V N E E E.
dès lors que incorporées à une protéine de fusion, oligomerises ou conjugués à une protéine porteuse, les peptides du genre en question sont aptes à
induire in vivo une réponse immunitaire protectrice chez le singe ecureuil Saimiri sciureus ou encore à
inhiber 1'invasion d'érythrocytes par les merozoïtes.
Au même titre fait encore partie de l'invention tout équivalent peptidique contenant des motifs representables par la formules :
(X)3 - EE - tX)2 ~ EE - (X)2-3 dans lequel c~acun des groupes X repriesente, selon 1'indice qui suit les signes de parenthèse qui entoure le groupe considere, un dipeptide ou tripeptide contenant chacun, au moins un résidu amino-acyle hydrophobe, cet équivalent peptidique étant susceptible d'induire une réponse i D unitaire protectrice chez le singe-écureuil Saimiri sciureus ou d'inhiber une invasion in vitro d'erythrocytes par P.falciparum.
Comme cela a déjà ete indique plus haut, l'in~ention concerne toute proteine de fusion, oligomère ou conjuguee faisant intervenir les peptides conformes à 1'invention.

W093~030~7 ~ PCT/FR92/0076 Ces peptides peuvent être produits par synthese chimique. Il peut encore en etre de même des oligomeres de ces peptides ou des peptides conjugues à des molecules porteuses. Des techniques permettant d'effectuer ces synthèses sont rappelees dans ce qui suit, bien entendu de façon non limitative.
Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène decrite par HOU~ENWEYL
dans l'ouvrage intitule "Methode der Organischen Chemie" (Méthodes de la Chimie Organique) editè par E. Wunsch, vol.l5-I et II., THIEME, Stuggart 1974.
Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement, dans 1'ordre requis, les aminoacides ou peptides prealablement formés avec d'autres aminoacides ou peptides prealablement formes cboisis de façon à permettre la production d'un polypeptide ayant la sequence finale choisie en aminoacides, etant entendu que l'on aura eu 80in, Si besoin, de proteger au prealable toutes les fonctions reacti~es portees par ces aminoacides ou peptides, à
l'exception de celles de leurs fonctions amine et carboxyle devant intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment apres activation desdites fonctions carboxyle. En variante, on pourra avoir recours à des reactions de couplage mettant en jeu des reactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la l-ethyl-3-(3-dimethyl-amino-propyl)-carbodiimide.
Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possede une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions sont protégees, par exemple par des groupes t-butylester.

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3 ~

Dans le cas de la synthèse progressive, a~ino-acide par amino-acide, la synthèse debute de preférence par la condensation de l'aminoacide C-terminal avec 1'aminoacide qui correspond à
1'aminoacyle voisin dans la séquence désiree et, de proche en proche, avec les autres acides aminés choisis de façon appropriée, la synthèse s'achevant avec la fixation de 1'acide aminé N-terminal.
Il est souvent avantageux d'avoir recours à la technique décrite par R.D~ MERRIFIELD dans 1'article intitule "Solid phase peptide synthesis" (J. Am.
Soc., 45: 2149-2154).
Le premier acide amine C-terminal de la chaîne à produire est fixé sur une resîne poreuse de polyme~re, jouant le role de su~port insoluble par 1'intermédiaire de son groupe carboxylique. La fonction amine de ce premier aminoacide aura normalement été protégée au préalable avec un groupe protecteur approprie, par ~xemple par un groupe t-butyloxycarbonyle.
L'oligomerisation des sequences monomères obtenues peut être conduite de toute façon en soit connue. Ces oligom~res contiennent, par exemple de 2 à 20 unites monomères. Il n'y a d'ailleurs pas de limite au nombre maxi~um d'unités monomères suceptibles d'être inclues dans l'oligomère, si ce n'est la capacite de l'oligomère finalement obtenu d'être hydrosoluble ou facilement solubilisable dan~
l'eau.
Une première methode d'oligomerisation ou de polymerisation du monomère consiste dans la reaction de celui-ci avec un agent de reticulation, tel que le glutaraldéhyde. On peut egalement avoir recours à

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2 2 t~, d'autres méthodes d'oligomérisation ou de couplage, par exemple à celle mettant en jeu des couplages successifs d'unit~s monomères, par l'intermediaire de leurs fonctions terminales carboxyle et amine, en présence d'agents de couplage homo- ou hetero-bifonctionnels, les autres groupes fonctionnels portes par ces unités monom~res ayant, le cas echeant, ete proteges au préalable.
Un autre procéd~ d'oligomerisation prefere fait appel aux techniques d~crites par Richman et Reese, RT. (1988) Proc. Nat. Acad. 85: 1662-1666 ou encore Posnett, DN. (1988) The Journal of Biological Chemistry Vol. 283, N4. Ces procedes mettent en jeu une petite "matrice centrale peptidique" (peptidyl core matrix) form~e à partir d'un nombre restreint d'acides amines trifonctionnels, en particulier des lysines, interconnectes entre eux de façon a comporter un nombre de fonctions libres important vis à vis du poids moleculaire de cette matrice centrale et formant autant de bras ou dendrites qui peuvent alors ~tre conjuguées à des aminoacides distincts ou aux extremités C-terminales. On se reportera plus particulierement a l'arti~le de Tam, J.P. publié en 1988 dans Proc. Nat. Acad. USA, Vol.
8~, 5409-5413, dans lequel les structures de telles matrices centrales produites à partir de lysine ont eté représentes. En particulier on peut avoir recours à de telles "matrices centrales" à base d'heptalysines comportant des sites pour la fixation de 9-16 chaines peptidiques. Une autre façon de combiner des residus lysine resulte du schema suivant ("matrice centrale" dite sous la forme d"'octopussy") W093/0~57 PCT/FR92/~763 ~ Cys - SS - C ~ Peptide K
/ Cys - SS - C - Peptide KCys - SS - C - Peptide ~ K
/ ~ Cys - SS - C - Peptide X

\ ~ Cys - SS - C - Peptide K
K ~ Cys - SS - C - Peptide \ Cys - SS - C - Peptide K

\Cys - SS - C - Peptide dans laquelle X represente la lysine et "Peptide" a la signification sus-indiquée; d'où il résulte un système d~nommé MAP (abrèviation partielle de 1'expression anglai~e "Multiple Antigen Peptide System" ou "Système d'Antig~ne Peptidique Multiple~).
Partant par exemple d'une "matriae centrale"
comportant huit fonctions amine susceptibles d'être mises en reaction avec les peptides qui doivent y ~tre rattachés, on proc~de au couplage des peptides à fi~rer, en particulier ceux conformes à
l'invention, à cette matrice centrale par 1'intermediaire des fonctions r~actives de celle-ci, et ce par la mise en oeuvre des techniques applicables à la synth~se peptidique. On peut se reporter aux articles precedemment identifies pour ce qui concerne les techniques pref~rees susceptibles d'être mises en oeuvre.

21i42~3 L'expression "oligom~re" inclut egalement les conjuguès obtenus par couplage covalent de plusieurs unites monomères ~ une molecule porteuse (naturelle ou synthetique), physiologiquement acceptable et non toxique, par 1'interm~diaire de groupements reactifs complementaires respectivement portes par la molecule porteuse et/ou les unites monomères. Des exemples de groupements appropriés sont illustres dans ce qui suit~
A titre d'exemple de molecules porteuses ou supports macromoleculaires entrant dans la constitution des conjugues selon l'invention, on mentionnera des proteines naturelles, telles que l'anatoxine tetanigue, l'ovalbumine, des sêrumalbumines, des hemocyanines, une proteine purifiee de la tuberculine (HPurified Protein Derivative~ = PPD) etc ...
: A titre de 8upports macromoleculaires synthétiques, on mentionnera par exemple des polylysines ou des poly(D-L-alanine)-poly(L-lysine) ou des proteines immunologiquement inertes.
La littèrature mentionne d'autres types de supports macromoleculaires susceptibles d'êtrè
utilis~s, lesquels presentent en géneral un poids moleculaire superieur à 20 000.
On peut avoir recours ~ tout procéde de couplage faisant intervenir, d'une part, une ou plusieurs fonctions reactives du peptide et, d'autre part, une ou plusieurs fonctions reactives de molecules supports. Avantageusement, il s'agit des fonctions carboxyle et amine, lesguelles peuvent donner lieu à une rèaction de couplage en presence d'un agent de couplage du genre de ceux utilises W093/0~s7 PCT/FR92/00763

4~ ~`` `;`?~

dans la synthèse des protéines, par exemple, le 1-~thyl-3-(3-dimethylaminopropyl~- carbodiimide, le N-hydroxybenzotriazole, etc... On peut encore avoir recours à la qlutarald~hyde, notamment lorsqu'il s'agit de relier entre eux des groupes aminés respectivement portés par le peptide et la molécule support.
L'invention concerne encore une variante de procéde de production des oligomères selon l'invention, cette variante consistant dans la transformation des cellules d'une culture de cellules compétentes par un vecteur contenant une sequence de nucléotides codant pour un polypeptide oligom~re contenant les ~usdites unit~s monomères sous le contrôle d'un promoteur reconnu par lesdites cellules comp~tentes, et ce dans des conditions autorisant l'expression dans ces cellules de ladite ~équence oligomerique de nucl~otides, et la r~cuperation du produit d'expression de ladite s~guence de nucleotides. Celle-ci fait également partie de l'invention. Il n'est point nécessaire d'insister sur les techniques susceptibles d'~tre utilisées, si ce n'est que, de préférence, les elements du vecteur sont de pr~f~rence tels que le produit d'expression soit transporté à 1'exterieur des cellules competentes, voire même excrete dans leur milieu de culture.

L'invention concerne naturellement les fragments d'acides correspondants, plus particulièrement de tout ou partie de ceux qui découlent de la figure l(c) ~ propos de la séquence G9. Ce fragment d'ADN peut ~tre, soit à l'etat W093/030S7 PCT/FR9~/00763 211~2;~

individualise, soit recombiné au ein d'un ADN
recombine de taille plus importante. Parmi ces ADNs de tailles plus importantes il est entendu que l'invention concerne :
- des ADNs codant pour des protéines de fusion faisant intervenir une séquence d'ADN codant pour un peptide conforme ~ 1'invention, avec des séquences d'ADN codant elles-mêmes pour des ~équences peptidiques hét~rologues n'interferant pas les propriétés d'induction par la séquence polypeptidique selon 1'invention d'une immunite protectrice contre P.falciParum ;
- tout vecteur contenant cette sequence polypeptidique placé sous le contrôle d'un promoteur autorisant son e~ression dans un hôte aellulaire compétent et dont les polymérases sont aptes à
reconnaitre ledit promoteur.
Il va également de soi que l'invention étend ses effets ~ux cultures cellulaires ainsi transform~es par de tels vecteurs ou ADN
recombinants qui permettent l'expression du polxpeptide ou du fragment de polypeptide selon l'invention.
De m~me font partie de l'invention les anticorps sp~cifiques des sequences contenues dans EB200 ou des peptides ou fragments de peptides présentant les mêmes propri~tes biologiques telles qu'elles ont ~té définies plus haut. Cette protection ~tend ses effets à tous anticorps monoclonaux specifiques des mêmes sequences polypeptidiques, ainsi qu'aux hybridomes sécréteurs de ces anticorps monoclonaux. Il sera compris que l'homme du metier est à même de produire ces W093/03057 ~s~ PCT/FR92/00763 anticorps monoclonaux et de les sélectionner dans des opérations de tri faisant intervenir la reconnaissance spécifique par les anticorps monoclonaux à selectionner, des sequences en acides aminés de peptides caractéristiques de 1'invention.
L'invention concerne de même toute composition pharmaceutique mettant en oeuvre ces polypeptides, le cas échéant associ~s ~ des vehicules pharmaceutiquement acceptables facilitant leur utilisation dans des operations de vaccination afin d'induire la production in vivo, notamment chez 1'homme, d'une reponse immunitaire protec:trice contre des parasites malariques infèctueux.
L'invention est egalement relative aux préparations d'anticorps, induits par EB200 ou les peptides equivalents de 1'invention, que ces anticorps soient polyrlonaux (serums les contenant - ou fraction immunoglobulinique purifiée à partir de ces serums) ou anticorps monoclonaux obtenus comme indiques ci-dessus. En particulier l'invention concerne des compositions pharmaceutiques contenant de tels anticorps aux fins d'entrer en compétition in vivo avec le parasite humain, notamment chez des individus infectés ou menacés d'infection par ce parasite, notamment du type P.falciparum, afin de les protéger contre les effets pathogènes dus à
cette infection.
Les anticorps selon 1'invention sont aussi plus particulièrement caracterises par le fait qu'ils ne donnent pas lieu à des réactions immunitaires croisées avec les~ produits d'expression du gène Pfll-l (27) et du gène Pfl55/RESA (38).

W093/03057 PCT/FR92/0076~
211~2~

Le clone contenant la séquence nucléotidique codant pour EB200, contenu dans Escherichia coli DH5 a ete deposé le 25 ~uillet sous le n-I-1128 à
la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris (CNCM). La bibliographie à laquelle il a éte fait reférence dans la présente description par des renvois à des numéros de publication compl~te la présente description.
L'invention concerne également les autres applications de ces anticorps, notamment leur utilisation pour le diagnostic in vitro, par exemple effectué sur un échantillon de sérum, d'une infection par des parasites paludéens, notamment au stade de 1'infection des ~rythrocytes sanguins, par exemple au moyen d'une reaction antigene-anticorps classique. A l'inverse, l'invention concarne enfin l'application des peptides eux-m~mes à la detection in vitro de la presence d'anticorps caracteristiques de l'infection par des parasites paludeens, notamment du type P.falci~arum ou analogue, et plus particulièrement encore au stade érythrocytaire de ces parasites, sous forme de mérozoïtes.
Au titre des donnees experimentales supplémentaires, on mentionne encore les faits suivants.
La solubilisation de Pf332, comme celle de Pf211, par différents detergents montre que 1'antigène est associé avec la membrane des globules rouges parasites sans être associe au cytosquelette.
Les anticorps anti-PfEB200 ont aussi eté
utilises pour localiser l'antigène Pf332 dans le parasite. L'immunofluorescence indirecte, sur des W093/030~7 ~ PCT/FR92/00763 parasites fixes à l'air et analysée par microscopie confocale, montre une image formee par des structures similaires à des vésicules d r environ 0.5-l~m. Ces vesicules ont ete localisées dans le cytoplasme du globule rouge parasité, dissociees du parasite, et transportees vers la membrane de l'érythrocyte. De plus, chez les formes evolutives tardives, l'antigene Pf332 semble être associe à la membrane des globules rouges. ~n effet, 1'immuno-electromicroscopie montre que l'antigene Pf332 est transporté vers la membrane de 1'erythrocyte en association avec les "Maurer's clefts". Plus important, par la techni~ue d'immunofluorescence en suspension, le sérum anti-PfEB200 réagit avec la surface des globules rouges parasités de singe. La présence d'épitopes de Pf332 à la surface des globules rouges confirme gue cet antigène peut être la cible de reactions i D unologiques de l'hôte et, donc, être d'intérêt pour le developpement d'un vaccin.
Des expériences préliminairPs montrent que les anticorps anti-PfEB200 (immunoglobulines totales purifiées ou immunoglobulines purifiées sur une colonne d'affinite couplee avec le recombinant PfEB200) sont capables d'inhiber le développement des parasites en 60-80%, par rapport aux controles.
Le polypeptide recombinant PfEB200 inhibe la phagocytose, par des monocytes, des erythrocytes infectes en presence de serum hyperimmun de singe.
L'invention concerne egalement des compositions mettant en oeuvre les peptides precedemment definis en association avec d'autres constituants peptidiques ayant des proprietes vaccinantes contre W093/03057 ~CT/FR92/00763 . 25 2~ 1~2~

le paludisme, notamment dû à Plasmodium falciparum, plus particulièrement la capacit~ d'induire in ViYo une reponse immunitaire protectrice, y compris la production d'anticorps immunoprotecteurs aptes à
detruire les parasites du stade sanguin, responsables de la maladie chez 1'homme, dans un modèle de primate repr~senté par le singe ecureuil SAIMIRI SCIUREUS.
Parmi les polypeptides avantageusement utilises en association avec les peptides EB200 ou analogues precedemment decrits, on mentionnera plus particulièrement, soit le "deuxième polypept:ide", soit le "troisième polypeptide" respectivement identifies ci-après :
Le "deuxième polypeptide" est constitué par un polypeptide dérive d'un antigène majeur de P falciParum, ayant un poids moleculaire de l'ordre de 72 kDA, d'où l'appellation "Antig~ne 72 kDA"
utilisee dans ce qui suit pour le designer, particulièrement d'un polypeptide issu de cet antigène 72 kDA ayant la capacite, comme celui-ci :
- d'être reconnu par des anticorps protecteurs contenus dans des serums ou des fractions immunoglobulines provenant d'animaux, notamment de singes SAIMIRI SCIUREUS, devenus resistants aux parasites après les infections repetees contrôlees par chimiothèrapie, lesdits serums ou fractions ètant susceptibles de rendre resistants des singes initialement sensibles ;
- d'être lui-même inducteur, notamment chez le singe, et plus particulièrement chez le singe SAIMIRI SCIUREUS, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement P

W093/030~7 PCT/FR92/0076 ~ 26 falciparum ou des parasites qui presentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles.
Ce "deuxième polypeptide" est lui-même souvent reconnu par des sérums de patients humains habitant des régions où le paludisme sévit de façon endémique.
La séquence nucléotidique codant pour la séquence peptidique antigène 72 kDA a ete identifiee par L.S. MATTEI et al European Journal of Immunology tl989) 19 : 1823 - 1828. Le "deuxième polypeptide"
est avantageusement constitué par un polypeptide ci-après désigné "i72" comprenant les 153 acides amines de la région C - terminale de 1'antigene 72 kDA. La séquence en acides amines, de même qu'une séquence d'acide nucleique codant pour le polypeptide i72, sont présentées ci-apres :

W O 93/03057 PC~r/FR92/00763 2.~ 2 2 3 1~1 31~1~
GAT C~T AS~ oT~ AAT GAS GCT GAA AAA TAC AAA GCA GAA oAT oAA GAA AAC AoA AAA AOA
~p rg ~t v l ~n ~p ~1~ glu ly~ tyr ly~ 91u ~ glu glu ~n ~rg ly~ ~rg ~1~21 91131 ASC OAA O~CA A~A AAC AOC.CST aAA AAT TAC T~C ~AT OOA ~1 AAA A~C lCA TTA OAA OAC
lu ~1~ r~ ~n ~r l-u ~lu ~ t~r cyt q r 91~ ~1 ly~ ~ r -r l~u ~lU ~rp 12~ 1 151/Sl CaA AAA ASS AAA GAA AAA ~SA CAA CC~ GCS GAA ATt GAA ACA TGT ATG AAA ACS AST AC~
~ln ly~ ly~ ~lu ly~ l-u ~ln pro ~ lu 11~ ~lu t~r ~y~ t 1~ t~r 1~- t~
~ 11/71 ACC ATA C~l GAA TGG T~A uAA AAA AAC CAA CIT GCr GGA AAA ~AT GAA TAt GAA o;c ~AA
t~s ~ alu trp l-u ~lu 1~ n ~n l-u ~ ly -p ~lu tyr ~lu 1- ly~
2~ 271/-~ ~
CAA AAA OAA G U GAA SCG ~ TGr oC~ C~A ATS ATG TC~ AAA ATC,TA~ CAA OA~ oCT oc~
~ln ly~ glu 1~ glu ~r v~l ~y~ pro i~ t ~ r ~y~ 11- tyJ glr~ al~
30~101 3~1111 OoT OCA OCC ~S GoT ASO CCA ~A oeT A~O CCC OoT 03A ASO CCA W S OOA ASO CCA W~
gly ~ gly gly o~t pro gly gly ~e pro ~ly gly ~t pro glr gly ~t pro ql~
~61~121 ~ 3~
GGr ASG CCA oa~r ot~ A~; ~AS STC CC~ Ol~ T aSG CCC ~;A GCA GGA aSG CCA OGA ~S
91~ ~t pro gly g~y ~t ~n F~ pro gly gly t pro 91~ 91~ ~t pr~ gly ~Jn Sl~151 OCC CCA OCT G&A A~ u^GA C;A ACA u-TS GAA ~AA G~T OAS TAA AC~ AAt AAA AAA AAA AAA1- pro ~1~ gly ~ r gly pro tnr v~l glu ~lu v~ p ~CH t~r -n ly~ ly~ ly~ ~y-T SAA Aa O~A CAA ASA SAA AAA TAT ASa taT TAT AAA AAS ATA SAT ASA TAT ATSb~OCN tn. gly gln 1~ ly~ tyr ~1~ tyr tys ly~ ~n 11- tgr 11- ty~ pb~
~ltl~ ~7 m m m T~A as m ~os ~A~ TSA AS~ ~CA A~S
p~ pn~ pn~ l-u ~1~ p~ cy~ ly- l-u 11- CPA ~1~
Ce "deuxième polypeptide" peut encore être constitue par un polypeptide recombinant contenant tout ou partie de la sequence de i72, par exemple une molecule de fusion avec la glutatione transferase de Schiætosoma japonicum, selon la technique decrite par D.B. Smith and K.S. Johnson (1988) Gene 67, 41-48, par transformation de E. Coli avec le plasmide pGEX prealablement modifie par la sequence nucleotidique d'insertion appropriee. Une culture de E. Coli (Escherichia coli DH5~) transforme par le susdit plasmide modifie par une se~quence nucleotidique codant pour le peptide i72, a ete d~eposee le 24 juillet 1991 auprès de la W093~03~7 PCT/FR92/0076 . 2~ .
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Inætitut Pasteur de Paris (CNCM) sous le numéro I - 1129.
Le "troisieme polypeptide" (peptide ou oligopeptide) ainsi qu'un fragment d'acide nucleique qui code pour ce troisieme polypeptide, sont caracterises en ce qu'ils contiennent les elements de sequence respectifs suivants :

WO 93/030~7 PCI'/FR92/00763 2 ~ 2 ~

GAG ~ ~GT CAA G~; GAA GTT TAT TTA TTT GTS ~AA AJ~G ATA CCT I~TA
Gl~ ~ Cys Gln Gly Glu Val Tyr Leu Phe V~ll Lys Lys Ile Pro Ile GAG C5~ 'G ATA AGA CAG TAC AAC TTG ATG MT GAT AAT GAT GGA GAA
Gl~ L ~sp Ile Arg Gln Tyr Asn L~u Met Asn .~sp A5n Asp- Gly Glu TA-- ~ ~A GAT G5G GAA AAT TTT AST ATG GAA GC~ GTA GCC TGC GCT
~L ~eu Asp Gly Glu Asn Phe Ile Y.et Glu Ala Val Ala Cys Ala TA~ T~ ~ GAG CAT TAT CCT GGA CTC ACA CCT ~AA TTG TAC AAG G~rA
L~ Ser Glu His Syr Pro Gly I,eu Thr Pro Lys Leu Tyr Lys Val TT~ T;~S GAG CCT GAl~ TGT GCT AAC TGS AAT GAA GAG GAT ~AG AAT ATG
Le~_ Tys Glu Pro Glu Cys Al~ ~n Cys Asn Glu Glu J~p Lys Asn Itet AG~ GA~ G~T MT ~CAT MG AAG GAT ~4GT ~ CAT MG GGG GAT AGT A/~T
Se- G~ sp Asn His Lys Lys J~sp Ser Lys His Lys Gly Asp Ser Asn AGT AAT CAC A~A AGT G~T AGT AAT CAC AAA AGT GAT
Hi~ L~s Ser Asp Ser Asn HiS Lys Ser Asp Ser Asn His Lys Ser Asp A~ A~ C:AT AAA AGT GAT ~.GT AJ~T CAT AAA AGT GGT AGT ~AT CAC AAA
Se_ A~ His Lys Ser Asp 'er Asn His Lys Ser Gly Ser Asn His Lys AG~ G~S TGT AA~ GAC AAG AGT GGT ~GT AAS C`AC AAG AGT GGT A~;T AAT
Ser A~p Cys Asn His Lys Ser Gly Ser Asn X~s Lys Ser Gly Ser Asn C~ J~ AG~ GAT ~T AAT CAT CJ~A AGT GAT SGT M~ ............
His L~s Ser Asp Ser Asn His Gln Ser Asp Cys Asn ..~ .........

~................................ G~T CAT MS C~C ~AA AGG GAT
........................... Asp His Asn ~is Ly~ Ser Asp C~ A~ CAC AAG AS;C GA~ T AAC CAC A~G ~GT GAT CAT ~AT CAC A~A
Hi~ Asn Hi~ Ly~ ~ _ ~GT G~T C~S AAA ~AA ~T AAT MC MT A~T AAG ~ M T M A AAT GAC
Ser Asp His Lys ~yo Asn Asn Asn Asn Asn Lys Asp Asn Lys Asn Asp _ GAT AA~ GA~ GAC AGT GAT G~A AGC G~ GCA GST GAT G~A G~T ATT GAG
Asp Asn Asp Asp Ser ~sp Ala Ser ~sp Ala V~l Aop Glu Asp Ile Glu ATA CTT GAG TCT TAT AGT GAT TTG AAT AAA m AAT GAG AT~ TTA ACA
lle Leu Glu Ser ~yr Ser A~p Leu Asn Lys Phe A3n GIu Met Leu T~r GAA CAA T~A AAT AAA M ~ AAG GAT GGA T~T GTT GTT ~SG GTT ACT GAA
Glu Gln Leu Asn Lyo A~n Lyo AJP Gly Sys V~l V~l Leu V~l T~r Glu Leu P~e Gly Glu Asp Leu Pbe Gln Tyr Ile Aon Ly~ Arg Asn Glu A~n ,~,~i~,? l 30 GM CAT ACG CGT GSA AGA GAT GAA CAT ~ ~A ATA ATT ATG m G~
Glu Asp Thr Arg Val Arg Asp Glu Asp Lys L.ys lle ~le ~e~ P~le Glu TTT TTA AAG TTA TTA ASA AAA TTA CAT MT GCA GGA TTG GTA CAT CTT
Phe L~u Lys Leu Leu Ile Lys L~u Nis Asn Ala Gly Leu Val His L u GAT ATA TCT C GAA AAT ATA $TG ATA GM AAT MT GGT GAG TTA CGC
Asp Ile Ser Pro Glu Asn Ile L u Il- Glu Asn Asn Gly Glu Leu ~rg TTA TGT GAT CTA GCT AAA TGS GCT CCA ATG TAT ACA CAC AAT TTA AGA
Leu Cys Asp Leu Ala Lys Cys Al~ Pro Met Tyr Thr His Asn Le~l Arg CAT ATT AAA GGA MT GGA AAC cas TTG SAT TCA STT CAA SCT TGT CAA
His Ile Lys Gly Asn Gly Asn A p Leu Syr Ser Pbe Gln Ser Cys Gln CCT SGT GTT GGA AAA ATC CCA Tt,S ATT CCA AAA GAG TGT TGG GAT .I~TT
Pro Cys Val Gly Lys Ile Pro Cy~ Ile Pro Lys Clu Cys Trp Asp Ile AST AGA GAA CAS ATA AAA TTA AAA ATA GAS AAT CCT TTT CAA CAT SSA
Sle Arg Glu His Ile Lys Leu Ly~ Ile Asp Asn Pro Phe Glu His Leu SCA ACT ATT ACT GAT CAA GAA GAA AGA AAA AAA TAT TAT STT GAT GTA
Ser Thr Ile Thr Asp Gln Glu Glu Arg Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp V~l CAT TGT GSA GAT AAA $AT A$G CTS GGS ATA TTT SAT ASA TGG ATA TGt;
~: His Cys Val A~p Lys Tyr Met L-u Gly Ile Pbe Tyr Ile Trp Ile Srp MT STA MT TAS ATA $GG AAA CGA GC$ GAC CCA CCA AAT GAT AGA ACA
Asn Leu Asn $yr Ile Trp Lys Arg ~ Asp Pro Pro Asn Asp ~rg Tbr m AAT MT TSC TSA AAA SA$ AAT T$A aAS ATA AAT GTA TTT CAG TTA
Pbe Asn Asn Phe Leu Lys Syr ~n L~u ~n Ile Asn Val Pbe Gln Leu GCC CAA CAA SGG CCA AAA GGS CTC AAA GAT ASA ATT AAC GTA AGA TAT
Ala Gln Gln Trp Pro Lys Gly ~u Lys Asp Ile ~le Asn Val A-~ Tyr ATA AGA AA1~ MA ~A AAA AAA MA AAA AT~ ATA ATA ATA ~TA ATG ATG
Ile Arq Lys Lys Lys Lys Lys Ly~ Lys Ile ~le Ile Ile Ile M.et Met TTT TAT ATA GT~ $GT GCA SAG TGA~S~TT5T TT5TSTAT~T TT~ATACAT
Phe ~yr Ile V~l Cy~ Al~
GAAATGAT~T A~TATAT~ AT~TA$A$AT ASA$TSSCIC 55TA$AGAAA
SSATTAAGCC TAGAAAGT~G AAIGW ~;UCA G~CTT~AA$G M TTAACSGA
ACATCCATG~ ~GGATTAATG AAGA$SAA$S SS~AT1115T ~AGTAT~T~
TGAATAT~TA TTA$SAGTAG ACTTTA$ATA TAACAA$AAA S~STGACACG
TGCAATATSA AiUUU4UUU~ ~AUULUUU~AA A/UUUU ~a~A A~AAAAAGG
AATGTSTTAT TGmAG&AC TATA$GGAAA AATAATAATA TATATATGTS
ICC~CATTAA AAA

ce "troisième polypeptide" a ete decrit dans la demande de brevet français n'90 10039 deposee le 6 ao~t 1990.

W093/03057 PCT/FR92/0076~
2 ~ 2 ~ 3 ce "troisième polypeptide" est reconnu par des anticorps contre P~ falciParum.
Une souche de E. Coli, transformée par un tel acide nucleique a éte deposee à la CNCM sous le nI-987 le 27 juillet 1990.
Un "troisieme peptide" prefere est le peptide recombinant contenant la séquence du peptide "R 23"
- de formule LysSerAspSerAsn~isLysSerAspHisAsnHisLysSerAspSerAsn HisMetSerAspHisAsnHisMetSerAspHisAsnHisLysSerAspHisAsnHisLys SerAspAsnAsnHisLysSer~spSerAsnHisLySSerAspSerAsnHisLysSerAsp SerAsnHisLysSerAspHisAsn Une souche d'E. Coli contenant la sequence d'ADN correspondante a ete déposee le 27 juillet annee 1990 sous le n I - 986 à la CN~M.
Le peptide R23 a pareillement eté produit sous forme d'une proteine recombinante du fusion avec la glutatione transferase de Schistosoma japonicum, selon la technique deja mentionnée de D.B. Smith et K.S. Johnson.
Il est entendu que dans les associations :
EB 200 et i72, EB 200 et R 23 respectivement, ces differents peptides peuvent être remplaces par des fragments ou proteines de fusion repondant aux conditions qui ont egalement ete definies plus haut.
L'invention concerne naturellement aussi les melanges d'anticorps specifiques qui peuvent être obtenus a partir des constituants respectifs des mélanges susdits de polypeptides. Ces melanges c~
~ ~ 32 d~ anticorps peuvent être administrés in vivo, notamment dans le but d'interférer avec une parasitemie due ~ une infection par un parasite humain, notamment du type P. falci~arum.
Enfin, l'invention étend de ~eme ses effets à
des melanges des æéquences nucléiques dans lesquelles les differentes s~guences nucléigues correspondantes auront eté recombinées entre elles, dans des conditions autorisant leur expression æous la forme d'une protéine de fusion comprenant des séquences peptidiques correspondant aux sequences des trois constituants (entiers ou partiels) prêcedemment pris en consideration.

WO 93tO3057 PCI /FR92tO076~
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Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Polypeptide contenant la séquence polypeptidique ci-dessous définie par sa séquence en acides aminés :
S V T G N I L V E G
S V T E E V V G E E K
L V S E E I V T E E G
S V A Q E I V E E D A
P A T E E I D E I E
S V T E E V V E E E G
P V D E E I V Q E E G
T V T E E I I Q G E
S K V E E V V E E Q G
S E N E E I F V E E V
S A S Q E I V Q N E
S G T E E I L E K V
S A S Q E I V Q D G
S V T E Q I I E E L F
P V T E E V V N E E E
ou une partie de cette séquence dès lors que celle-ci est apte, le cas échéant lorsqu'elle est incorporée à une protéine de fusion, oligomérisée ou conjuguée à une protéine porteuse, à induire in vivo une réponse immunitaire protectrice chez le singe écureuil Saimiri sciureus.

2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est capable d'induire in vivo des anticorps eux-mêmes capables d'inhiber l'invasion de globules rouges par des mérozoïtes.

3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit polypeptide ou ladite partie de séquence polypeptidique est apte à induire in vivo des anticorps capables d'inhiber l'invasion des globules rouges dans une proportion au moins égale à 50 % par rapport à celles observables dans des préparations d'érythrocytes témoins places dans les mêmes conditions en présence des mêmes concentrations de mérozoïtes, mais en l'absence des polypeptides ou partie de polypeptides du genre en question.

4. Partie de polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est constituée par l'une des séquences (a) à (o) suivantes :
(a) S V T G N I L V E G.
(b) S V T E E V V G E E K.
(c) L V S E E I V T E E G.
(d) S V A Q E I V E E D A.
(e) P A T E E I D E I E.
(f) S V T E E V V E E E G.
(g) P V D E E I V Q E E G.
(h) T V T E E I I Q G E.
(i) S X V E E V V E E Q G.
(j) S E N E E I F V E E V.
(k) S A S Q E I V Q N E.
(1) S G T E E I L E K V.
(m) S A S Q E I V Q D G.
(n) S V T E Q I I E E L F.
(o) P V T E E V V N E E E.

ou par un équivalent peptidique ayant un motif représentable par :
(X)3 - EE - (X)2 - EE - (X)2-3 dans lequel chacun des groupes X représente, selon l'indice qui suit les signes de parenthèse qui entoure le groupe considéré, un dipeptide ou tripeptide contenant chacun, au moins un résidu amino-acyle hydrophobe, cet équivalent peptidique étant susceptible d'induire une réponse immunitaire protectrice chez le singe-écureuil Saimiri sciureus.

5. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en qu'il est incorpore à une protéine de fusion, oligomérisé ou conjugué de façon covalente à une molécule, notamment protéine porteuse.

6. Composition capable d'induire in vivo des anticorps aptes à détruire les parasites responsables du paludisme chez l'homme, notamment à
leur stade sanguin, caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide ou partie de polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

7. Anticorps spécifiques du polypeptide ou de la partie de polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.

8. Fragment d'ADN, caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide ou partie de polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.

9. Fragment d'ADN selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il se trouve à l'état recombiné
au sein d'un ADN codant pour une protéine de fusion, dont les éléments d'ADN extérieurs au susdit fragment sont hétérologues vis-à-vis de celui-ci.

10. Vecteur modifié par le fragment d'ADN
selon la revendication 8 ou la revendication 9, dans lequel ledit fragment se trouve place sous le contrôle d'un promoteur autorisant son expression dans un hôte cellulaire dont les polymérases reconnaissent ledit promoteur.

11. Culture cellulaire transformée par le vecteur selon la revendication 10.

12. Application des polypeptides ou peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 au diagnostic in vitro de la présence d'anticorps anti-paludéens dans un échantillon biologique, notamment sérum sanguin, prélevé chez la personne soumise au diagnostic.

13. Application des anticorps selon la revendication 7 au diagnostic in vitro d'une infection par un parasite paludéen dans un échantillon biologique, notamment sérum sanguin chez la personne soumise au diagnostic.

14. Composition selon la revendication 6 qui contient un autre antigène vaccinant, de préférence, soit un antigène contenant la séquence en amino acides du polypeptide i72, soit un antigène contenant la séquence en amino-acides du polypeptide R 23.