PT100757A - Polipeptidos aptos para induzir "in vivo"anticorpos capazes de inibir a invasao de globulos vermelhos por merozoitos de "p.falciparum", produtos aparentados e sua aplicacao na producao de composicoes de vacinacao - Google Patents

Description

"POLIPEPTIDOS APTOS PARA INDUZIR "IN VIVO" ANTICORPOS CAPAZES DE INIBIR A INVASÃO DE GLOBULOS VERMELHOS POR MEROZOITOS DE "P. FALCIPARUM". PRODUTOS APARENTADOS E SUA APLICAÇÃO NA PRODUÇÃO DE COMPOSIÇOES DE VACINAÇÃO" A presente invenção diz respeito a novos anti-gênios de "Plasmodium falciparum" e a sua aplicação especial-mente com vista á protecção contra o paludismo.

Os parasitas responsáveis pelo paludismo no homem, especialmente o "Plasmodium falciparum" ou o "Plas-modium vivax" para apenas citar os principais, apresentam no hospedeiro humano morfologias diferentes e exprimem anti-gênios diferentes, função do estádio do seu desenvolvimento e da sua localização no organismo do hospedeiro infectado.

As diferenças morfológicas e antigénicas destes parasitas durante o seu ciclo de vida no homem, permitem definir pelo menos quatro estádios de desenvolvimento distintos. O primeiro estádio de desenvolvimento do parasita no homem corresponde â forma esporozoito introduzido no sangue do hospedeiro, mediante picada de inseetos portadores do parasita. 0 segundo estádio corresponde è passagem do parasita pelo figado e â infecção das cãlulas hepáticas em que os parasitas se desenvolvem para formar os esquizontes hepáticos que, quando maduros se (por exemplo para o "P. falciparum" o 6s dia depois da penetração dos esporo-zoitos), libertam mediante rebentamento dos merazoitos hepá-

ticos· 0 terceiro estádio caracteriza-se pela infeeção dos eritrócitos sanguíneos pelas formas assexuadas (merazoitos) do parasita; este estádio eritrocitário do desenvolvimento corresponde â fase patogêniea da doença. 0 quarto estádio corresponde á formação das formas com potencial sexuado (ou gametôcitos) que se tomarão formas sexuadas ou gametas extras-celulares no mosquito.

Numerosos estudos foram consagrados durante estes últimos anos â identificação de moléculas de parasitas expostas â superfície de glóbulos vermelhos sanguíneos ou eritrócitos infectados com o parasita humano patogénico, especialmente do tipo "Plasmodium falclparum”. Com efeito, a virulência dos parasitas no estádio sanguíneo tem sido frequentemente associada â existência de estruturas peptidicas assim expostas. As quais poderão ser responsáveis por dois fenômenos frequentemente observados, seja a obstrução de capilares vasculares, realizando uma fjfeaçsbde glóbulos vermelhos parasitados (PRBC, abreviatura da expressão "Parasitized Red Blood Cells") nas células endoteliais ou sequestração (2), e a fixação de eritrócitos não infectados aos PRBGs com formação de "rosetas" (40). Estes fenómenos parecem desempenhar um papel mediador importante na fisiopatologia de casos de paludismo severo, especialmente os induzidos por "Plasmodium falciparum".

Estas moléculas da superfície poderão igualmente representar um alvo para os mecanismos de defesa imunitária do hospedeiro em que uma das acções leva à fagocitose dos PBBCs (10,11). Hâ algum tempo isolou-se um gêne, expresso nos estádios tardios do ciclo intra-eritrocitário (20). 0 pro duto da expressão (antigênio 332) demonstrou conter uma série de sequências de aminoácidos repetitivas degeneradas. Demonstrou-se que anticorpos humanos purificados por afinidade em contacto com um polipeptido recombinante contendo a sequência do antigênio 332, reagem com uma família de proteínas do parasita que consistem em produtos da expressão de gênes diferentes (20). Entre os antigênios identificados no seio desta família, menciona-se os antigênios 11.1 (Píll-1) e (PÍ155/ /RESA) que contêm determinantes imnnogênieas que levam a reacçoes cruzadas como a observada em que se utiliza um anticorpo monoclonal humano (20). Mais recentemente Udomsangtepch e colab. (36) descreveram um anticorpo monoclonal humano mAB 33&2 capaz de inibir a citoaderência de glóbulos vermelhos parasitados comportando ou não protuberâncias com células da linha celular de melanomas 032. Verificou-se, alêm disso, que este anticorpo monoclonal inibe, de modo eficaz, a invasão de eritrócitos pelos merazoitos em um ensaio realizado 11 in vitro" (38). Contudo, este anticorpo monoclonal inicialmente seleccionado em virtude da sua reactividade com a molécula PÍ155/RESA (38), carece de especificidade. Reage igualmente com outros antigênios que aparecem no estádio sanguíneo da infecção causada pelo parasita, especialmente os antigênios Agll-1 e Ag332 (20,37). 0 antigênio Ag332 apresenta sem dúvida alguma um interesse potencial importante em relação à sua capacidade para induzir uma imunidade protectora.

Com efeito, um polipeptido recombinante incluindo o produto de expressão de um fragmento de 303 pares de bases resultan- "Ç. tes de gênes Pf 332 provou ser um inibidor parcialmente eficaz do anticorpo monoclonal mAb33G2, como se demonstrou em um ensaio de inibição da invasão dos glóbulos vermelhos por merazoitos (37)· Contudo, a caracterização do Ag332 atê hoje foi inibida pelas reacções cruzadas a que os anticorpos que o reconhecem dão lugar, com diferentes outros antigénios do parasita (20). A presente invenção resulta da identificação e da caracterização de uma nova sequência gènica no seio do gêne Pf332, do antigênio codificado por esta sequência genica e dos anticorpos inductíveis "in vivo" por este antigênio e especifica do antigênio, A sequência gènica em questão foi localizada na região subtelomêrica do cromossoma 11. Veri-ficou-se que o antigênio expresso por esta sequência gènica tinha tua carácter monoespecifico que lhe permite detectar especificamente uma proteína megadaltônica do parasita ou dos parasitas assexuados no estádio sanguíneo mediante reacções de imuno-absorção (immunoblot) e de imunoprecipitação, contrariamente aos anticorpos induzidos por outros antigénios, quer provenientes do Ag332, quer aparentados âs sequências daquele, tais como o dímero sintético Y(SVTEEIAEEDK)2 (24) ou uma proteína de fusão com a beta-galactosidade (20). Estes anticorpos reagem igualmente com diversas outras moléculas do parasita. Anticorpos formados contra o antigênio EB200 levam igualmente a reacções de superfície com os glóbulos vermelhos infectados por "Plasmodium falciparum” com uma eficácia compreendida na mesma ordem de grandeza da do anticorpo monoclonal mAb33G2. - 5 -

A sequência peptídica do antigênlo EB200, um dos antigénios obtidos de acordo com a presente invenção, tem uma sequência peptídica caracteristiea correspondendo á enquadrada na sequência do clone G9 [ figura l(e)7, sendo esta sequência deduzida do clone G9 resultante da amplificação de um dos fragmentos do gêne PÍ332 nas condições que serão recordadas adiante. 0 antigénio EB200 pertence de modo mais geral â família de polipeptidos comportando um motivo ou uma sequência em aminoâcidos em comum contendo a totalidade ou parte da sequência polipeptídica definida a seguir pela sua sequência em aminoáeidos;

s V T G N I L ¥ E G s ¥ T E E V V G E E K L V s E E I V T E E G S V A Q E I V E E D A P A T E E I D S I E s ¥ I E E V V E E E G P V D E E I V Q E E G Φ V Φ E E I I Q G E s K V E Ξ V ¥ Ξ Ξ Q G s E Έ E E I P ¥ E Ξ ¥ s A S Q E I ¥ Q N Ξ s G T Ξ E I L E K ¥ s A s Q E I ¥ Q D G s V Φ E Q I I Ξ E L F PYf ΒΕΥΤΠΙΒΕΒ

Um peptido que apenas contenha uma parte desta sequência faz parte da presente invenção desde que este pêpti do seja apto, eventualmente quando incorporado numa proteína de fusão, oligomerizado ou conjugado com uma proteína portadora, para induzir "ln vivo1* uma resposta imunitária protec-tora no macaco-esquilo "Saimirl-sclureus". A repartição dos motivos sucessivos da sequência em aminoácidos de um polipeptido preferido de acordo com a presente invenção, tal como a apresentada anteriormente, apenas tem por objectivo fazer aparecer a existência de motivos repetitivos sucessivos, no seio da proteína, não sendo esta repetitividade contudo, desprovida de degenerescências. Os brancos (fazendo ligações directas) que aparecem no fim de algumas linhas ou no seió de certas linhas não têm qual-

I quer significado particular. 0 seu único objectivo ê a evidência visual dos homólogos de sequências parciais destes motivos repetitivos sucessivos. Pode-se observar a frequência do motivo VTEEV no seio destes motivos parcialmente repetitivos ou "degenerados". A mesma sequência em aminoácidos (utilizando a representação de três letras por aminoácido, em vez da representação com uma letra na definição anterior) está representada na figura 2. Esta faz igualmente aparecer a sequência que codifica para o clone recombinante, denominado PÍEB200, contendo um inserido de 411 pares de bases isoladas a partir do gêne Pf332. Recorda-se que este clone já foi isolado a partir de um banco de sequências de expressão construídas em um vector X Amp3 com um lote (pool) de soros humanos imunes (20). A presente invenção deriva de se ter evidenciado a existência no seio do antigênio Ag332 de sequências em aminoâcidos que são simultaneamente específicas deste antigênio e expostas à superfície dos merozoitos de WP. falci-parmn” e/ou dos glóbulos vermelhos infectados. 0 banco genômico inicial de wff. falolnarum" no vector gtWES foi, por sua vez, construído mediante digestão com DNase I e adição de adaptadores (linkers) contendo sítios EcoRI como anteriormente descrito em (21). A crivação do banco genômico inicial de ADN de UP. faloiparum" (estirpe Paio Alto com protuberâncias positivas) mediante digestão com- ajuda de uma nuclease e clonagem num vector gtWES e com ajuda de uma sonda de hi-bridação resultante do clone Pf332 levou os inventores a prestar atenção a uma série de quatro clones Cl, Gl, G9 e G90 e a fazer a sua sequenciação parcial. As sequências nucleotídicas de Gl, G9 e G90, acavaladas, têm tamanhos res-pectivamente de 2,9 Kb; 4,8 Kb e 1,9 Kb. A crivação de um banco de cADNs deverá conduzir a um clone contendo um inserido de 466 pares de bases (clones Cl).

As posições relativas das sequências de Cl,

Gl, G9 e G90, em relação ao clone inicial de onde elas provêm estão esquematicamente representadas na figura l(a):

Esta apresenta respectivamentes - um mapa de restrição do gêne Pf332, - as posições respectivas dos fragmentos retidos (Cl, G90, Gl e G9), - as sequências em aminoácidos deduzidas de partes das sequências de Cl, G90, G1 e G9 (cuja sequência se estende aproximadamente na segunda metade da primeira coluna depois na primeira metade da segunda coluna das sequências representadas na figura 1) que foram mais particularmente sequencia-das·

As partes sequenciadas estão representadas na figura 1 mediante espessidão da linha. As enzimas utilizadas para a produção do mapa de restrição são as seguintes:

BamHl(B), eial(G), Dral(D), EeoRl(E) e Hind3(H).

Partes destes fragmentos e mais particularmente um sub fragmento de G9 (fragmento BamHl, EcoRI de 441 pares de bases) foi(ram) sub-clonado(s) num plasmideo pGEX3(32). A sequência da proteína (adiante denominada BB200) expressa sob a forma de uma proteína de fusão soluvèl PfEB200 com tuna glutationo-S-transferase ê o objectivo de um enquadramento no seio da parte do G9 de que se fez a sequenciação. A expressão do polipeptido solúvel foi efectuada em ME. coli”

Dh5 ©( /¾1 end AI hsdr 17(rk-mk-) sup E44 thi-1, rec AI gyr A96 rei AI f80d lac Z 11^7. A purificação da proteína efectuou-se mediante cromatografia de afinidade sobre esferas de agarose comportando grupos glutatião (32). 0 grau de purificação da proteína de fusão ê analisado mediante electroforese em gel de poliacrilamida contendo 10% de SDS e mediante coloração com azul de Coomassie.

Qualquer técnica clássica pode ser utilizada para produzir anticorpos específicos da proteína EB200 (sob a forma de fusão ou não)· Mas, na ocasião, os anticorpos testados nos ensaios em discussão adiante foram produzidos nas seguintes condições: imunizou-se murganhos Balb/c median te injeeção subcutânea da proteína recombinante EB200 (20 jdg) na presença do adjuvante completo de Freund· Efec-tua-se duas injecções de reforço, cada vez de 15 jig de anti-gánio, em adjuvante incompleto de Freund, 3 semanas e 5 semanas respeetivamente depois da primeira injeeção· Colhe-se soros sanguíneos contendo os anticorpos produzidos pelos murganhos imunizados 7 dias depois da última injeeção· Os títulos em anticorpos foram determinados mediante imunofluorescência sobre os glóbulos vermelhos parasitados espalhados em camadas finas. Estes são os anticorpos ãe um tal soro que se verificou serem monoespecificos. Ensaiados em imunopre-cipitação e em Western Blot sobre extractos parasitários, os anticorpos anti-PfEB200 demonstraram ser capazes de reagir com uma proteína de peso molecular aparente de cerca de 1000 KDa pertencente ao parasita "Plasmodium falciparum”. A proteína EB200 e os anticorpos correspondentes deram ainda lugar âs seguintes observações: - os anticorpos dirigidos contra a proteína recombinante expressa pelo clone EB200 foram ensaiados segundo a sua capacidade para inibir "in vitroM, a reinvasio dos glóbulos vermelhos pelos merozoitos, especialmente no ensaio descrito por R. Udomsangpetch e colab. (37) que ele mesmo reenviou para uma publicação de Wahlin, B. e colab·, intitulada wHuman antibodies to a 155» 000 "Plasmodium falciparum” effieienthy inhibit merozoite invasion" (anticorpos humanos contra uma Mr 155,000 de "Plasmodium falclDa-rum” inibindo

eficazmente uma invasão por merozoitos) (1984) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 81 : 7912· Neste ensaio, os parasitas cultivados na presença do soro anti-EB200 são inibidos 84,4% em relação aos controlos ou testemunhos cultivados na presença de soro normal. 0 anticorpo monoelonal 3362 no mesmo ensaio inibiu 86,7% da parasitêmia. As actividades de soros anti--EB-200 (anticorpo polielonal) e do anticorpo monoelonal 3362 são por conseguinte da mesma ordem de grandeza, - o soro anti-EB200 reage com a superfície dos glóbulos vermelhos de macacos infectados por nP.falcioarum”. - o antigênio reeombinante ê capaz de inibir a fagoci-tose dos glóbulos vermelhos parasitados opsonizados (técnica descrita em (ii) pelos monócitos dos macacos.

Estes resultados provam portanto a exposição da parte do antigênio Pf332 que contêm uma sequência peptí-dica correspondente â da proteína EB200 â superfície dos glóbulos vermelhos infectados pelo parasita ou â superfície dos merozoitos. A proteina EB200 ou fraeções desta apresentam ainda as seguintes características: - são reconhecidas por anticorpos protectores contidos nos soros ou nas fraeções imunoglobulínicas provenientes de animais, especialmente de macacos "Saimiri sciureus" resistentes aos parasitas, sendo os referidos soros ou fraeções susceptiveis de tornar resistentes macacos inicialmente sensíveis ao "Plasmodium falciparum". - sao indutoras especialmente no macaco e mais particularmente no macaco "Saimiri sciureus", de anticorpos activos contra parasitas do paludismo, maia particularmente de "Plasmodium falciparum".

As condições em que tais ensaios se podem realizar foram descritas, por exemplo, por Dubois e colab., 1984, Proc. Hat. Acad. Sei. USA 81: 229-232; Perrin e colab., 1984, J. of Bxp. Med. 160: 440-451 e Siddiqui e colab., 1987, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84: 3014-3018.

Na descrição anterior fez-se sobretudo referencia ao polipeptido EB200. Ê evidente que a presente invenção diz igualmente respeito a qualquer parte deste polipeptido que seja apto, eventualmente depois da incorporação numa proteína de fusão, oligomerização ou conjugação com uma proteína portadora, para induzir "in vivo” uma resposta imunitária protectora no macaco-esquilo "Saimiri sciureus". A presente invenção diz igualmente respeito a todos os peptidos equivalentes resultantes da expressão das sequências correspondentes de ADffs provenientes de Plasmodio infeccioso para o homem, para além de "P.falciparum por exemplo estirpes 7G8 (Brasil), 19-96 (Tailandia), PeBr (América do Sul), 37D (derivado de NF54, Holanda) e Banjul (Gambia) que são todas reconhecidas nos ensaios de imunopre-cipitação com o soro ©< IB200. Reconhece igualmente eritrô-citos infectados por estes parasitas. De um modo geral qualquer péptido que se diferencie estruturalmente dos anteriores mediante substituições, deleções ou adições de um ou de vários aminoácidos faz parte da presente invenção desde que seja reconhecido pelos anticorpos previamente formados contra EB200 e, de preferencia, eventualmente apôs oligomerização, incorporação numa proteína de fusão, conjugação com uma molécula portadora, induzindo por consequência no macaco-eejuilo "Saimiri sciureus" anticorpos activos contra parasitas do paludismo humano, especialmente WP.falciparum”·

Pode-se igualmente recorrer, para identificar os polipeptidos ou pêptidos que entram no quadro da presente invenção, ao teste da inibição da invasão de glóbulos vermelhos por merozoitos, partieularmente provenientes de WP.falciparum". Em particular deve.considerar-se como fazendo parte da presente invenção qualquer polipeptido ou fragmento de polipeptido comportando em comum uma parte da sequência em aminoáeidos com EB200 e que ê capaz de induzir ”in vivo” anticorpos capazes de inibir a invasão dos glóbulos vermelhos em uma proporção pelo menos igual a 50% em relação às observáveis nas preparações de eritrócitos testemunhas colocados nas mesmas condições na presença das mesmas concentrações de merozoitos, mas sem polipeptidos ou parte de polipeptidos do gênero em questão· A presente invenção diz naturalmente respeito a qualquer polipeptido contendo uma parte de sequência que se estende alèm das extremidades da sequência EB200, desde que o polipeptido referido apresente propriedades imunogê-nicas protectoras da mesma natureza· Por "Parte além das extremidades de EB200” entende-se por exemplo as sequências em aminoáeidos que são contíguas â estrutura em aminoáeidos de EB200 na sequência peptldiea mais importante deduzida da

sequência nueleotídica do fragmento G9, de que ΞΒ200 ê proveniente (figura 1G)*

Do mesmo modo, a presente invenção estende os seus efeitos a todos os pèptidos derivados dos anteriores, a não ser que certos residuos aminoacilo das suas sequências em aminoácidos sejam substituídos por outros atê mesmo cortados ou pelo contrário intercalados nas sequências representadas, sem que os pèptidos modificados obtidos percam as propriedades biológicas earacteristicas do polipeptido EB200.

Em particular a presente invenção diz mais especialmente respeito a sequências monomeras correspondentes aos motivos repetitivos degenerados presentes em EB200, especialmente os pèptidos cujas sequências correspondem ás seguintes sequências (a a o); (a) SVTGUILVEG. (b) SVTEEVVGEEK. (c) LVSEEIVTEBG. (d) SVAQEIVEEDA. (e) PATBEIDEIE. (f) SVTEEVVEEEG. (g) PVDEEIVQEEG. (h) ! Y ! E E I I Q δ E, (i) SKVEEVVEEQG. (j) SEHEEIPVEEY. - 14 - - 14 -

(k) S A S Q E I V Q H S. (l) S δ ϊ E E I L B K V. (ffl) S A S Q B I V Q D G. (n) S T I E Q I I E E L Ϊ, (o) P Y f E E V y E E E E, desde que incorporadas numa proteína de fusão, oligomerizadas ou conjugadas com uma proteína portadora, os peptidos do gênero em questão são capazes de induzir Hin vivo” uma resposta imunitária protectora no macaco-esquilo "Saimiri sciureus" ou ainda capazes de inibir a invasão de eritrôcitos por mero-zoitos.

Do mesmo modo faz ainda parte da presente invenção qualquer equivalente peptídico contendo os motivos representáveis pela fórmula (X)3 - SE - (X^ - EB - (X)2_3 na qual cada um dos símbolos X representa de acordo com o índice que se segue aos sinais de parênteses que rodeiam o grupo considerado, um dipeptido ou tripeptido contendo, oada um, pelo menos um resíduo amino-acilo hidrôfobo, sendo este equivalente peptídico susceptível de induzir uma resposta imunitária protectora no macaco-esquilo "Saimiri sciureus" ou de inibir uma invasão "in vitro" de eritrôcitos por "P.falcjparum”.

Como já anteriormente se indicou, a presente invenção diz respeito a qualquer proteína de fusão,. oligomero ou conjugada em que intervenham os pêptidos de acordo com a presente invenção.

Estes pêptidos podem ser produzidos por síntese química, Podendo ainda mesmo ser oligomeros destes pêpti-dos ou pêptidos conjugados com moléculas portadoras, Recorda--se, a seguir, técnicas que permitem efectuar estas sínteses, evidentemente de modo não limitativo.

Por exemplo, pode-se recorrer à técnica de síntese em solução homogénea descrita por HOUBEHWEYL na obra intitulada "Methode der Organischen (Métodos da Química Orgânica) editado por E, Wunsch, vol. 15-1 e II, ΤΗΣΕΜΕ, Stuggart 1974.

Este método de síntese consiste em se condensar sucessivamente, na ordem pretendida, os aminoécidos ou pêptidos previamente formados com outros aminoécidos ou pép-tidos previamente formados escolhidos de modo a permitir a produção de um polipeptido comportando a sequencia final escolhida em aminoécidos, entendendo-se que se teré o cuidado, se necessário, de proteger previamente todas as funções reac-tivas transportadas por estes aminoécidos ou pêptidos, com excepção das de suas funções amina e carboxilo que devem intervir na formação das ligações peptídicas, espeeialmente apôs activação das ditas funções carboxilo. Como variante pode-se recorrer a reacções de ligação que utilizam reagentes de ligação clássica, do tipo carbodiimida, tais como por exemplo a l-etil-3-(3-dimetil-amino-propÍl)-carbodiimida.

Quando o aminoacilo utilizado possuir uma função ácido suplementar (especialmente no caso do ácido glutã- mico), protege-se estas funções, por exemplo com grupos t-butil-éster.

No caso da sintese progressiva, aminoácido por aminoêcido, a sintese inicia-se de preferencia pela condensação do aminoácido C-terminal com o aminoácido que corresponde ao aminoacilo vizinho na sequência pretendida e, gradualmente, com os outros aminoácidos escolhidos de modo apropriado, a sintese completa-se com a fixação do aminoácido N-terminal. 3S muitas vezes vantajoso recorrer â técnica descrita por R.D. MERRIFIELD no artigo intitulado "Solid phase peptide synthesis” (MJ. Am. Soc.M, 45 : 2149 - 2154). 0 primeiro aminoácido C-terminal da cadeia a produzir ê fixado sobre uma resina porosa do polimero, que desempenha o papel de suporte insolúvel por intermediário do seu grupo carboxllico. A função amina deste primeiro aminoácido terá normalmente que ser protegida prevlamente com um grupo protector apropriado, por exemplo com um grupo t-butiloxi-earbonilo· A oligomerização das sequências monomeras obtidas pode ser conduzida de qualquer modo conhecido. Estes oligomeros contêm, por exemplo 2 a 20 unidades monômeras.

Por outro lado não há limite para o número máximo de unidades monomeras susceptiveis de ser incluídas no oligomero, a não ser da capacidade do oligomero finalmente obtido de ser hidrossolúvel ou facilmente solubilizável em água.

Um primeiro método de oligomerização ou de polimerização do monomero consiste na reacção deste com um agente de reticulação tal como o glutaraldeldo. Pode-se igualmente recorrer a outros métodos de oligomerização ou de ligação por exemplo o que utiliza ligações sucessivas de unidades monomeras, por intermédio das suas funções terminais carboxilo e amina, na presença de agentes de ligação homo- ou hetero-bifuncionais, sendo os outros grupos funcionais transportados por estas unidades monomeras, eventualmente, protegidas previamente.

Um outro processo de oligomerização preferido utiliza as técnicas descritas por Richman e Reese, R(D, (1988) MProc. Hat. Acad,”! 85 t 1662 - 1666 ou ainda Posnett, DU. (1988) "lhe Journal of Biological Chemistry Yol. 283. H24, Estes processos utilizam uma pequena matriz central pèptídi-ca (peptidyl core matrix) formada a partir de um número restrito de aminoácidos trifuneionais, em particular lisinas, interligados entre eles de modo a comportar um número importante de funções livres em relação ao peso molecular desta matriz central e formando tantos braços ou dentrites que podem então ser conjugadas com aminoécidos distintos ou às extremidades C-terminais. Repetir-se-á mais particularmente 0 artigo de Iam, J.P. publicado em 1988 em Proc. Hat. Acad. USA, Yol. 85, 5409-5413, no qual as estruturas de tais matrizes centrais produzidas a partir da lisina estão representadas. Em particular, pode-se recorrer a tais ”matrizes centrais" â base de heptalisinas comportando sítios para a fixação de 9-16 cadeias peptidicas. Uma outra forma de combinar resíduos lisina resulta do seguinte esquema (ttmatriz central*’ dita sob a forma de "octopussy*') 18 Κ K K Κ Κ Ε Κ

Cys - SS - G Cys - SS - C Cys - SS - C Cys - SS - C Cys - SS - C Cys - SS - C Cys - SS - C Cys - SS - C

Peptiàe

Peptide Peptide Peptide Peptide Peptide Peptide

Peptide

no qual o símbolo K representa uma lisina e "Péptido” tem o significado anteriormente indicado; de onde resulta um sistema denominado MAP (abreviatura parcial da expressão inglesa "Multiple Antigen Peptide Systemw).

Partindo-se por exemplo de uma "matriz central” comportando oito funções amina susceptíveis de se fazer reagir com os péptidos que lhes devem ser ligados, pro-cede-se â ligação dos péptidos a fixar, em particular aos de acordo com a presente invenção, a esta matriz central por intermediário das funções reactivas desta e mediante a utilização das técnicas aplicáveis â síntese peptidica· Pode-se referir os artigos anteriormente identificados para o que - 19 - - 19 -

diz respeito ás técnicas preferidas susceptiveis de ser utilizadas· A expressão "oligomero" inclui igualmente os conjugados obtidos mediante ligação covalente de várias unidades de monomeros com uma molécula portadora (natural ou sintética), aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e não tóxica, por intermediário de grupos reagentes complementares respectivamente transportados pela molécula portadora e/ou as unidades de monomeros. Exemplos de grupos apropriados são ilustrados na descrição que se segue.

Como exemplo de moléculas portadoras ou suportes macromoleculares que entram na constituição dos conjugados de acordo com a presente invenção menciona-se as proteínas naturais, tais como a anatoxina tetânica, a oval-bumina, seroalbuminas, hemocianinas, uma proteína purificada da tuberculina ("purified Protein Derivativo" = PPD) etc...

Gomo suportes macromoleculares sintéticos menciona-se por exemplo polilisinas ou poli(D-L-alanina)--poli(L-lisina) ou proteínas imunologieamente inertes. A literatura menciona outros tipos de suportes macromoleculares susceptiveis de ser utilizados apresentando em geral um peso molecular superior a 20.000.

Pode-se recorrer a qualquer processo de ligação em que intervenha, por um lado, uma ou várias funções reactivas do peptido e, por outro lado, uma ou várias funções reactivas de moléculas suportes. Trata-se, com vantagem, de funções carboxilo e amina, as quais podem dar lugar a uma reacção de ligação na presença de um agente de ligação do género dos utilizados na síntese das proteínas, por exemplo, a l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida, o E-hidroxi--benzotriazol, etc·. Pode-se ainda recorrer ao glutaraldeído, especialmente quando se tratar de voltar a ligar entre eles grupos aminados respectivamente transportados pelo pêptido e pela molécula suporte· A presente invenção diz respeito a uma variante do processo para a produção de oligomeros de acordo com a presente invenção, consistindo esta variante na transformação das células de uma cultura de células competentes por um vector contendo uma sequência de nucleótidos que codifica para um polipeptido oligomero contendo as referidas unidades de monòmeros sob o controlo de um promotor reconhecido pelas ditas células competentes e nas condições que permitam a expressão nestas células da referida sequência de nucleôti-dos e a recuperação do produto de expressão da dita sequência de nucleótidos. Fazendo esta última, igualmente, parte da presente invenção· £ apenas necessário insistir sobre as técnicas susceptlveis de ser utilizadas, a não ser que, de preferência, os elementos do vector sejam de preferência tais que o produto de expressão seja transportado para o exterior das células competentes, até mesmo excretado para o meio de cultura· A presente invenção diz naturalmente respeito aos fragmentos de ácidos correspondentes, mais particularmente da totalidade ou de parte dos que derivam da figura l(e) a propósito da sequência G9. Este fragmento de ADN pode estar, quer no estado individualizado, quer recombinado no 21 - seio de um ADN recombinado de tamanho superior. Entre estes ADNs de tamanhos superiores entende-se que a presente invenção diz respeito: - ADNs que codificam para proteínas de fusão em que intervenha uma sequência de ADÍT que codifique para o pêptido de acordo com a presente invenção, com sequências de ADN que codifiquem por sua vez para sequências peptidicas heterolo-gas que não interferem nas propriedades de indução pela sequência polipeptidica de acordo com a presente invenção de uma imunidade protectora contra "P.falclparum": - qualquer vector que comporte esta sequência polipeptí-dica colocado sob o controlo de um promotor que autorize a sua expressão num hospedeiro celular competente e cujas poli merases são capazes de reeonhecer o dito promotor. t evidente que a presente invenção diz, igualmente, respeito âs culturas celulares assim transformadas por tais vectores ou ADN recombinantes que permitem a expressão do polipeptido ou do fragmento de polipeptido de acordo com a presente invenção. A presente invenção diz, do mesmo modo, respeito aos anticorpos específicos das sequências contidas nas EB200 ou nos pèptidos ou fragmentos de péptidos que apresentem as mesmas propriedades biológicas tais como as definidas anteriormente. Esta protecção estende os seus efeitos a todos os anticorpos monoclonais específicos das mesmas sequências polipeptidieas, assim como aos hibridomas secretores destes anticorpos monoclonais. Compreender-se-á - 22 - - 22 -

que o técnico terá da mesma forma, que produzir estes anticorpos monoclonais e que os seleccionar em operações de separação em que intervenha o reconhecimento específico para os anticorpos monoclonais a seleccionar, sequências em smi-noécidos de pèptidos caracterlsticos de acordo com a presente invenção. A presente invenção diz igualmente respeito a qualquer composição farmacêutica que utilize estes polipep-tidos, eventualmente associados a veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico que facilitam a sua utilização em operações de vacinação com o objectivo de induzir a produção W!ln vivo” especialmente no homem, de uma resposta imunitária protectora contra parasitas maláricos infeceiosos. A presente invenção diz igualmente respeito âs preparações de anticorpos, induzidos por EB200 ou pépti-dos equivalentes de acordo com a presente invenção, sendo estes anticorpos quer sejam policlonais (soros que os contêm ou fracção imunoglobulinica purificada a partir destes soros) ou anticorpos monoclonais, obtidos de acordo com a descrição indicada anteriormente. Em particular, a presente invenção diz respeito a composições farmacêuticas que contenham tais anticorpos com o objectivo de entrar em competi-ção "in vivo” com o parasita humano, especialmente nos indivíduos infectados ou ameaçados de infeeção por este parasita, especialmente do tipo "P.falciparum11. para os proteger contra os efeitos patogênicos devidos a esta infeeção.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção são também mais particularmente caracterizados pelo facto de não darem lugar a reacções Imunitárias cruzadas com os produtos de expressão do gêne Pfll-1 (27) e do gêne Pfl55/ /RSSA (38). 0 clone contendo a sequência nucleotídica que codifica para EB200, contido em "Escherichia coli" DH5^ foi depositado em 25 de Julho com o n2 1-1128 na Collection Hationale de Cultures de Microrganismos do Institut Pasteur de Paris (CNCM). A bibliografia a que se faz referencia na presente feserição apresentada com números de publicação completa a presente descrição. A presente invenção diz igualmente respeito a outras aplicações destes anticorpos, especialmente a sua utilização para o diagnóstico "in vitro". por exemplo efec-tuado sobre uma amostra de soro, de uma infecção por parasitas paludosos, especialmente no estádio da infecção dos eritrocitos sanguíneos, por exemplo, por meio de uma reacção antigénio-anticorpo clássica. Pelo contrário, a presente invenção diz finalmente respeito â aplicação destes pèptidos para a detecção nin vitro11 da presença de anticorpos carac-terlsticos da infecção pelos parasitas paludosos, especialmente do tipo "P.falciparum" ou análogo e mais particularmente ainda no estádio eritrocitário destes parasitas, sob a forma de merozoitos.

Como dados experimentais suplementares, menciona-se ainda os seguintes factos. A solubilização da Pf332, como a da PÍ211, por diferentes detergentes demonstra que o antigênio está associado com a membrana dos glóbulos vermelhos parasitados - 24

sem estar associado ao citoesqueleto

Os anticorpos anti-PfEB200 foram também utilizados para localizar o antigénio PÍ332 no parasita. A imuno-fluorescência indirecta, sobre parasitas fixados ao ar e analisada mediante microscopia confocal, mostra uma imagem formada por estruturas similares â das vesículas com cerca de 0,5 - 1jpm. Estas vesículas foram localizadas no citoplasma do glóbulo vermelho parasitado, dissociadas do parasita e transportadas em direcção da membrana do eritrocito. Além disso, nas formas evolutivas tardias, o antigénio Pf332 parece estar associado à membrana dos glóbulos vermelhos. Com efeito, a imunoelectromicroscopia mostra que o antigénio Pf332 ê transportado em direcção à membrana do eritrócito em associação com os "Maurer*s defts". Mais importante, para a técnica de imunofluorescência em suspensão, o soro anti--PfEB200 reage com a superfície dos glóbulos vermelhos parasitados de macaco. A presença de epitopes de Pf332 à superfície dos glóbulos vemelhos confirma que este antigénio pode ser o alvo de reacções imunológicas do hospedeiro e, por conseguinte, ser de interesse para o desenvolvimento de uma vacina.

Experiências preliminares demonstram que os anticorpos anti-PfEB2O0 (imunoglobulinas totais purificadas ou imunoglobulinas purificadas sobre uma coluna de afinidade emparilhada com o recombinante PÍEB2D0) são capazes de inibir o desenvolvimento dos parasitas em 60 a 80%, em relação aos controlos. 0 polipeptido recombinante PfEB200 inibe a fagoeitose, pelos monocitos, dos eritrocitos infectados na -25-

presença de soro hiperimune de macaco· A presente invenção diz igualmente respeito âs composições que utilizam os pêptidos anteriormente definidos em associação com outros constituintes peptídicos possuindo propriedades de vacinação contra o paludismo, especialmente devido ao "Plasmodium falcíparum" mais partieular-mente a capacidade de induzir "in vivo” uma resposta imunitária protectora e compreendendo a produção de anticorpos imunoprotectores aptos para destruir os parasitas do estádio sanguíneo, responsáveis pela doença no homem, em um modelo de primata representado pelo macaco-esquilo "SAIMIRI SCIUREUS".

Entre os polipeptidos utilizados, com vantagem em associação com os pêptidos EB200 ou análogos anteriormente descritos, menciona-se mais particularmente, quer o "segundo polipeptido" quer o "terceiro polipeptido” respectivamente identificados a seguir: 0 "segundo polipeptido" ê constituído por um polipeptido derivado de um antigênio maior de ”P·falciparum". tendo um peso molecular da ordem dos 72 KDa,de onde a designação "Antigênio 72 KDa" utilizada na descrição que se segue para o designar particularmente de um polipeptido resultante deste antigênio 72 KDa tendo a capacidade, como aquele: - de ser reconhecido por antieorpos protectores contidos em soros ou em fracções imunoglofculinas provenientes de animais, especialmente de macacos "SAIMIRI SCIUREUS", tomados resistentes aos parasitas apôs infecções repetidas controladas por quimioterapia, sendo os ditos soros ou fracções sus-ceptiveis de tomar resistentes macacos inicialmente sensí- - 26

veia; - de ser por sua vez indutor» especialmente no macaco e maia particularmente no macaco "SAIMIRI SCIUREOS", de anticorpos aetivos contra os parasitas do paludismo» maia particularmente "g.falciparam" ou parasitas que apresentem as mesmas caracteristicas biológicas essenciais. 0 "'segundo polipeptido"' ê por sua vez frequentemente reconhecido por soros de pacientes humanos que habitam regiões em que o paludismo castiga de modo endémico. A sequência nucleotldica que codifica para a sequência peptidica antigénio 72KDa foi identificada por Ii.S. ΜΑΪΤΕΙ e Colab. "European Journal of Immunology" (1989) 19 ! 1823 - 1828. 0 "segundo polipeptido" ê constituído, com vantagem, por um polipeptido designado adiante "i72" comportando os 193 aminoâcidos da região 0-terminal do antigénio 72 KDa. A sequência em aminoâcidos, assim como a sequência de ácido nucleico que codifica para o polipeptido i72, estão representadas a seguir: 27 - 1/1 31/11 GAT COT ATO OTT AAT OAT OCX GAA AAA TAC AAA OCA ΟΛΑ OAT OAA OAA AAC AOA AAA AOA *SÇ‘ irg wt vil *sn Asp aIa glu lys tyr lys *1« glu «*p glu glu Asn arg lys arg 61/21 91/01 ATC OAA OCA AOA AAC AOC CTT OAA AAT TAC TCC 7AT OOA OTT AAA AOC TCA TTA OAA OAC 11« glu ala arg asn ser leu glu asn tyr cys tyr gly vai lys ser ser leu glu asp 121/41 * 151/51 CAA λλλ ATT AAA OAA AAA TTA CAA CCA C5CT OAA ATT GAA ACA TGT ATO AAA ACT ATT ACA gin lys ile lys glu lya leu gin pro ala glu Ue glu thr cys ftet lys thr ile thr -191/61 ‘ * 211/71 >CC ATA CTT OAA TOO TTA OAA AAA AAC CAA CTT OCX OOA AAA OAT GAA TAT GAA GCC AAA thr lie leu glu trp leu elu lys asn gin leu ala gly lys asp glu tyr qlu ala lys 241/83 ’ 271/91 CAA AAA GAA OCA OAA TCO CTT TCT GCT CCA ATT ATO TCT AAA ATC TAT CAA OAT OCT GCT gin lys glu ale glu ser vai cys ala pro 11« aet ser lys lie tyr gin asp ala ala OOl/iOl 331/111 OOT OCA OCC OOT GOT ATO Ca OOA OOT ATO CCC OOT OOA ATO CCA OOT OOA ATO CCA OOT gly ala ala qiy gly set pro qly gly set pro gly gly set pro gly gly set pro gly 541/121 * ' 391/131 OOT ATO CCA OOT OOT ATO AAT TTC CCA OOA OCT ATO CCC GGA GCA OOA ATO CCA OOA AAT gly set pro gly gly set asn phe pro gly gly set pro gly ala 9ly set pro gly asn 421/U1 451/151 GCC CCA GCT GGA ACT GGA CCA ACA CTT OAA OAA CTT OAT TAA ACT AAT AAA AAA AAA AAA ala pro ala gly ser gly pro thr vai glu alu vai asp OQt thr asn lya lys lys lys 481/141 íll/171 CAT TAA ACA GGA CAA ATA TAA AAA TAT ATA TAT TAT AAA AAT ATA TAT ATA TAT ATT Τ7Γ hli OCH thr gly gin lie OCH lys tyr Ile tyr tyr lys un lie tyr lie tyr 11« ph* 541/181 571/191 TTT TTT TTT TTA CAT ΤΠ TGT AAA TTA ATA TGA ATT phe phe phe leu his phe cys lys leu lie OPA lie

Este "segundo polipeptido" pode ainda ser oons

I tituido por um polipeptido recombinante contendo a totalidade ou parte da sequência de 172, por exemplo uma molécula de fusão com a glútationa-transferase de "Schistosoma .japonicum". de acordo com a técnica descrita por D. B. Smith and K. S. Johnson (1988) Gene 67, 41-48, mediante transformação de "E. coli" com o plasmídeo pGEX previamente modificado por uma sequência nucleotídica de inserção apropriada. Uma cultura de "E. coli" (Escherichia coli DH5 , ) transformada 1 c\ pelo referido plasmídeo modificado por uma sequência nueleo- - 28 - tídica que codifique para o pêptido 172, foi depositada em 24 de Julho de 1991 na Collection ííationale de Cultures de Microorganismes do Institut Pasteur de Paris (CIC1) com o número 1-1129. 0 "terceiro polipeptido" (pêptido ou oligo-peptido) assim como um fragmento de ácido nucleico que codifica para este terceiro polipeptido, são caracterizados pelo facto de conterem os seguintes elementos de sequência res-pectivos: - 29

CT GAG GAA TCT CAA GGG GAA GTT TAT TTA TTT GTT AM MG ATA CCT ATA Glu Gltt- Cys Gin Gly Glu Vai Tyr Leu Phe val Lys Ly$ Ile Pro Ile GAG GTA TGG ATA AGA CAG TAC AAC TTG ATG MT GAT MT GAT GGA GM Glu Vai Trp Ile Arg Gin Tyr Asn Leu Met Asn Asp Asn Asp- Gly Glu TAT TTA TTA GAT GGG GAA AAT TTT ATT ATG GM GCA GTA GCC TGC GCT Tyr Leu. Leu Asp Gly Glu Asn Phe Ile Meu Glu Ala Val Ala Cys Ala TAT TTA AGC GAG CAT TAT CCT GGA CTC ACA CCT AM TTG TAC MG GTA Tyr leu. Ser Glu His Tyr Pro Gly Leu Thr Pro Lys Leu Tyr Lys Val TTA ΤΑΪ GAG CCT GAA TGT GCT MC TGT MT GM GAG GAT MG MT ATG Ler TyT Glu Pro Glu Cys Ala Asn Cys Asn Glu Glu Asp Lys Asn Met AGT GAA GAT MT CAT MG MG GAT AGT AM CAT MG GGG GAT AGT MT Ser GU Asp Asn His Lys Lys Asp Ser Lys HÍS Lys Gly Asp Ser Asn CAC AAA AQT GAT AGT MT CAC AM AGT GAT AGT AAT CAC AM AGT GAT His ϊτ* Ser Asp Ser Asn His Lys Ser Asp Ser Asn His Lys Ser Asp AGT AAT CAT AM AGT GAT AGT MT CAT AM AGT GGT AGT MT CAC AAA Ser A£« HÍ5 Lys Ser Asp Ser Asn His Lys Ser Gly Ser Asn His Lys AGT GAJ TGT MT CAC MG AGT GGT AGT MT CAC MG AGT GGT AGT MT Ser Asp Cys Asn His Lys Ser Gly Ser Asn His Lys Ser Gly Ser Asn CAC AAC- AGT GAT AGT MT CAT CM AGT GAT TGT MT His Ly* Ser Asp Ser Asn His Gin Ser Asp Cys Asn

...........................GAT CAT MT CAC AM AGC GAT ............ ... ............Asp His Asa His Lys Ser Asp

CAT AAC CAC MG AGC GAT MT MC CAC AAG AGT GA? GAT MT CAC AM

His Asn His Lys Ser Asp Asn Asn Hia Lys Ser Asp His Asn His Lys

AGT GAT CAT AM MA MT MT AAC MT MT MG GAT MT AAA MT GAC

Ser Asp His Lys|Lys Asn Asn Asn Asn Asn Lys Asp Asn Lys Asn Asp

GAT AAT GAT GAC AGT GAT GCA AGC GAT GCA GTT GAT GM*GAT ATT GAG

Asp Asn Asp Asp Ser Asp Ala Ser Asp Ala Vai Asp Glu Asp Ile Glu

ATA CTT GAG TCT TAT AGT GAT TTG MT AM TTT MT GAG ATG TTA ACA

Ile Leu Glu Ser Tyr Ser Asp Leu Asn Lys Phe Asn Glu Met Leu Thr

GM CAA TTA MT AAA MT MG GAT GGA TAT GTT GTT TTG GTT ACT GM

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Leu Phe Gly Glu Asp Leu Phe Gin Tyr Ile Asn Lys Arg Asn Glu Asn - 3Ρ - GAA GAT ACG CGT GTA AGA GAT GAA GAT AAA AAA ATA ATT ATG TTT GAA <í'‘ Glu Asp Thr Arg Vai Arg Asp Glu Aep Lys Lya lie lie Mev Phe Glu •'o TTT TTA AAG TTA TTA ATA AAA TTA CAT AAT GCA QGA TTG GTA CAT CTX Phe Leu Lys Leu Leu Ile Lys Leu His Aan Ala Gly Leu Vai Hia Leu GAT ATA TCT CCT GAA AAT ATA TTG ATA GAA AAT AAT GGT GAG’ TTA CGC Asp Jle Ser Pro Glu Asn Ile Leu Xle Glu Asn Asn Gly Glu Leu Arg TTA TGT GAT CTA GCT AAA TGT GCT CCA ATG TAT ACA CAC AAT TTA AGA Leu Cya Asp Leu Ala Lys Çys Ala PrO Met Tyr Thr Hia Asn Leu Arg CAT ATT AAA GGA AAT GGA AAC GAT TTG TAT TCA TTT CAA TCT TGT CAA Hia Xle Lys Gly Asn Gly Asn Asp Leu Tyr Ser Phe Gin Ser Cys Gin CCT TGT GTT GGA AAA ATC CCA TGT ATT CCA AAA GAG TGT TGG GAT ATT Pro Cys Vai Gly Lys Ile Pro Cys Ile Pro Lys Glu Cys Trp Asp Xle ATT AGA GAA CAT ATA AAA TTA AAA ATA CAT AAT CCT TTT GAA CAT TTA Xle Arg Glu Hi3 Ile LyS Leu Lys Xle Asp Asn Pro Phe Glu His Leu TCA ACT ATT ACT GAT CAA GAA GAA AGA AAA AAA TAT TAT TTT GAT GTA Ser Thr Xle Thr Asp Gin Glu Glu Arg Lys Lys Tyr Tyr Phe Aàp Vul CAT TGT GTA GAT AAA TAT ATG CTT GGT ATA TTT TAT ATA TGG ATA TGG His Cys Vai Asp Lys Tyr Met Leu Gly Ile Phe Tyr Ile Trp Ile Trp AAT TTA AAT TAT ATA TGG AAA CGA GCT GAC CCA CCA AAT GAT AGA ACA - Asn Leu Asn Tyr Ile Trp Lys Arg %J.a Asp Pro Pro Asn Asp Arg Thr TTT AAT AAT >TTC TTA AAA TAT AAT TTA AAT ATA AAT GTA TTT CAG TTA Phe Asn Asn phe Leu Lys Tyr Asn Leu Asn Ile Asn Vai Phe Gin Leu GCC CM CM TGG CCA AAA GGT CTC AM GAT ATA ATT AAC GTA AGA TAT Ala Gin Gin Trp Pro Lys Gly Leu Lys Asp Ile Ile Asn Vai Arg Tyr ATA AGA AAA AM AAA AAA AAA AAA AM ATA ATA ATA ATA ATA ATG ATG Ile Arg Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Ile Ile Ile Ile Ket Ker TTT TAT ATA GTA TGT GCA TA6 TGAATGTTTT TTTTTTATAT TTTMTACAT Phe Tyr Ile Vai Cys Ala ***

GMATGATAT ΛΤΑΤΑΤΑΤΑΤ ATATATATAT ATATTTTCTC TTTATAGAAA TTATTMGCC TAGAAAGTAG AATGAAGACA GAÇTTAAATG AATTAACTGA ACÀTCCATGG TGGATTAATG AAGATTMTT TTAATTTTTT AAGTATTATA TGAATATTTA TTATTAGTAG ACTTTATATA TAACAATAAA TATTGACACG TGCAATATTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGA ATTAAAAAGG aatgttttat tgtttaggac tatatggaaa mtmtmta tatatatgtt

TCCACATTM AAA

Bste "terceiro polipeptido" foi descrito no pedido de patente de invenção francesa nâ 90 10039 depositada em 6 de Agosto de 1990.

Este "terceiro polipeptido" ê reconhecido pelos anticorpos contra "P.falciparum".

Uma estirpe de >,E#eoliw. transformada por um tal ácido nucleieo foi depositada na CUCM com o ns 1-987 em 27 de Julho de 1990.

Um "terceiro pêptido" preferido ê o pêptido reeombinante que contenha a sequência do pêptido "R23" de fórmula

LysSerAspSerAsnHisLysSerAspHisAsnHisLysSerAspSerAsn

HisMetSerAspHisAsnHisMetSerAspHisAsnHisLysSerAspHisAsnHisLys

SerAspAsnAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAsp

SerAsnHisLysSerAspHisAsn

Uma estirpe de "Ξ. colí" contendo a sequência de ADR correspondente foi depositada em 27 de Julho de 1990 com o ns 1-986 na CECM. 0 pêptido R23 foi igualmente produzido sob a forma de uma proteína reeombinante de fusão com a glutationa--transferase de "Sohistosona ,iaponicum" de acordo com a técnica descrita por D. B. Smith e K. S. Johnson.

Entendendo-se que nestas associações; BB200 e Í72 EB200 e R23 respectivamente, estes diferentes pêptidos podem ser substituídos por fragmentos ou proteínas de fusão respondendo âs condições que foram igualmente definidas anteriormente. A presente invenção diz, naturalmente também respeito ás misturas de anticorpos específicos que podem ser obtidos a partir dos constituintes respectivos das misturas dos referidos polipeptidos. Estas misturas de anticorpos podem ser administradas "in vivo”. especialmente com o objec-tivo de interferir com uma parasitêmia causada por uma infec-ção por um parasita humano, especialmente do tipo “P.falci-parum".

Finalmente, a presente invenção diz igualmente respeito â mistura de sequências nucleieas em que as diferentes sequências nucleieas correspondentes foram recombinadas entre elas, nas condições que permitam a sua expressão sob a forma de uma proteína de fusão comportando as sequências pep-tídicas correspondentes âs sequências dos três constituintes (inteiras ou parciais) anteriormente tomadas em consideração. 1. Ahlborg, N., K. Berzins, and P. Perlmann. 1991. Definition of the epitope recognized by the Plasmodium falcipanm-Ttacúve human monoclonal antíbody 33G2. Mol. Biochem. Parasitol. 46:89-96. 2. Berendt, A. R., D. J. P. Ferguson, and C. I. Newbold. 1990. Sequestratíon in Plasmodium falciparum malaria: Stícky cells and sticky problems. ParasitoL Today. 6:247-254. 3. Chen, E. J., and P. H. Seeburg. 1985. Supercoil sequencing: a fast and simple method for sequencing plasmid DNA. DNA. 4:165-170. 4. Chomczynski, P., and N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolatíon by acid * guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:156-161. 5. Chu, G., D. Vollrath, and R. J. Davis. 1986. Separation of large DNA molecules by contour-clamped homogeneous electric fields. Science. 234:1582-1585. 6. Coppel, R. L., J. G. Culvenor, A. E. Bianco, P. E. Crewther, H. D. Stahl, G. V. Brown, R. F. Anders, and D. J. Kemp. 1986. Variable antigen associated with the surface of erythrocytes of Plasmodium falciparum. Mol. Biochem. Parasitol. 20:265-277. 7. Corcoran, L. M., J. K. Thompson, D. Walliker, and D. J. Kemp. 1988. Homologous recombination within subtelomeric repeat sequences generates chromosome size - 34 - - 34 -

polymorphisms in Plasmodium. falciparum. CelL 53:807-813 8. Gassner, D., Z. Shraideh, and K. Wohlfarth-Bottermann. 1985. A giant titin-like protein in Physarum potycephalum: evidence for its candidacy as a major component of an elastic cytoskeletal superthin filament lattice. Eur. J. Cell BioL 37:44-62. 9. Goding, J. W., and E. Handman. 1984. Electrophoretíc analysis of protein antigens. In: Genes and antigens of parasites. 383-415. 10. Groux, H., and J. Gysin. 1990. Opsonization as an effector mechanism in human protecúon against asexual blood stages of Plasmodium falciparum: functional role of IgG subclasses. Res. Immunol. 141:529-542. 11. Groux, H., R. Perraut, O. Garraud, J. P. Poingt, and J. Gysin. 1990. Functional characterization of the antibody-mediated protecdon against blood stages of Plasmodium falciparum in the monkey Saimiri sciureus. Eur. J. Immunol. 20:2317-2323. 12. Kemp, D.J., L.M. Corcoran, R.L. Coppel, H.D. Stahl, A.E. Bianco, G.V. Brown, and R.F. Anders. 1985. Size variation in chromosomes from independent cultured isolates of Plasmodium falciparum. Nature (London). 315:347-350. 13. Koenen, Μ, A. Scherf, O. Mercereau, G. Langsley, L. Sibilli, P. Dubois, L. Pereira da Silva, and B. Miiller-Hill. 1984. Human antisera detect a Plasmodium falciparum genomic clone encoding a nonapeptide repeaL Nature (London). 311:382-384 14. Labeit, S., D. P. Barlow, M. Gautel, T. Gibson, J. Holt, C L. Hsieh, U. Frankc, K. Leonard, J. Wardale, A. Whiting, and J. Trinick. 1990. A regular pattern of two types of 100-residues motif in the sequence of titin. Nature (London). 231:507:509 15. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of stractural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London). 227:680-685. 16. Langsley, G., J. E. Hyde, M. Goman, and J. G. Scaife. 1983. Cloníng and characterisadon of the rRNA genes from the human parasite Plasmodiumfalciparum. Nucl. Acids Res. 24:8703-8717. φ 17. Leech, J. H., J. W. Barnwell, L. H. Miller, and R. J. Howard. 1984. Identification of a strain-specific malarial antigen exposed on the suiface of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J. Exp. Med. 159:1567-1575. 18. Maniatis, T.f E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1982. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 19. Maruyama, K. 1986. Connectin, an elastic Filamentous protein of striated muscle. InL Rev. Cytol. 104:81-114. 20. Mattei, D., K. Berzins, M. Wahlgren, R. Udomsangpetch, P. Perlman, H. W. Griesser, A. %

Scherf, B. Miiller-Hill, S. Bonnefoy, M. Guillotte, G. Langsley, L. Pereira da Silva, and O. Mercereau-Puijalon. 1989. Cross-rcactive antigenic deícrminants present on different Plasmodium falciparum blood-stage antigens. Parasite ImmunoL 11:15-30. 21. Mattei, D., G. Langsley, C. Braun-Breton, M. Guillotte, J. F. Dubremetz, and O. Mercereau-Puijalon. 1988. The S-antigen of Plasmodium falciparum Paio Alto represents a new S-antigen serotype. Mol. Biochem. Parasitol. 27:171-180. 22. Mattei, D., A. Scherf, O. Bensaude, and L. Pereira da Silva. 1989. A heat shock-like protein ffom the human malaría parasite Plasmodium falciparum induces autoantibodies. Hur J Immunol 19:1823-1828. 23. McCutchan, T.F., Jf.L.Hansen, J.B. Dame, and J.A. Mullins, 1984. Mung bean nuclease cleaves Plasmodium genomic DNA at sites before and after genes. Science 225:625-628. 24. Mercereau-Puijalon, O., G. Langsley, D. Mattei, M. Guillotte, T. Blisnick, K. Berzins, H. W. Griesser, A. Scherf, B. Miiller-Hill, and L. Pereira da Silva. 1987. Presence of cross-reacting determinants on several blood-stage antigens of Plasmodium falciparum. UCLA Symp. 42:343-354. 25. Pasvol, G., R. J. M. Wilson, Μ. E. Smalley, and J. Brown. 1978. Separation of viable schizont-infected red blood cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. - 37 - - 37 -

Trop. Med. Parasitol. 72:87-88. 26. Patarapotikul, J., and G. Langsley. 1988. Chromosomc size polymorphism in Plasmodium falciparum can involve deletions of the subtelomeric pPFrep20 scquence. NucL Acids

Res. 16:4331-4340. . 27. Petersen, C., R. Nelson, J. Leech, J. Jensen, W. Wollish, and A. Scherf. 1990. The gene product of the Plasmodium falciparum 11.1 locus is a protein larger than one megadalton. Mol. Biochem. Parasitol. 42:189-196. 28 . Pologe, L.G., and J.V. Ravetch. 1988. Large deletions result from breakage and healing ol P. falciparum chromosomes. CelL 55: 869-874. 29. Ponzi, Μ., T. Pace, E. Dore, and C. Frontali. 1985. Identification of a telomeric DNA sequence in Plasmodium. berghei. EMBO J. 4:2991-2995. 30. Pudles, J., M. Moudjou, S. Hisanaga, K. Maruyama, and H. Sakai. 1990. Isolation, characterisation and immunochemical properties of a giant protein from sea urchin egg cytomatrix. Exp. Cell Res. 189:253-260. 31. Schwartz, D. C., and C. R. Cantor. 1984. Separation of yeast chromosome-sized DNAs b> pulse field gradient electrophoresis. Cell. 37:67-75. 32. Smith, D. B., and K. S. Johnson. 1988. Single-step purification of polypeptides - 38 - - 38 -

expressed in Escherichia coli as fusion porteins with glutathione S-transferase.

Gene. 29:31-40. 33. Smith, G.H. and, M.D.Summers. 1980. The bidirectíonal transfcr of DNA and RNA to nitrocellulose or diazobenzylomethyl-paper. Anal. Biochem. 109,123-129. 34. Taylor, D.W., M. Parra, G.B. Chapman, M.E. Stearns, J. Rener, M. Aikawa, S. Uni, S.B. Aley, LJ. Panton, and RJ. Howard. 1987. Localization of Plasmodiumfalciparum histidini rich protein I in the erythrocyte skeleton under knobs. MoL Biochem. Parasitol. 25:165-174. 35. Trager, W. T. and J. B. Jensen. 1976. Human malaria parasite in continuous culture. Science. 193:673-675. 36. Udomsangpetch, R., M. Aikawa, K. Berzins, M. Wahlgren, and P. Perlmann. 1989. Cytoadherence of knobless Plasmodium falciparum-Mccteâ erythrocytes and its inhibition by human monoclonal antibody. Nature (London). 338:763-765. 37. Udomsangpetch, R., J. Carlsson, B. Wahlin, G. Holmquist, L. S. Ozaki, A. Scherf, D. Mattei, Ό. Mercereau-Puijalon, S. Uni, M. Aikawa, K. Berzins, and P. Perlmann. 1989. Reactivity of the human monoclonal antibody 33G2 with repeated sequences of three distinct Plasmodium falciparum antigens. J. Immunol. 142:3620-3626. 38. Udomsangpetch, R., K. Lundgren, K. Berzins, B. Wahlin, H. Perlmann, M. Troye- - 39 -

Blomberg, J. Carlsson, M. Wahlgren, P. Perlmann, and A. Bjõrkman. 1986. Human monoclonal antíbodies to Pfl55, a major antígen of malaria parasite Plasmodium faldparum. Science. 231:57-59. 39. Vemick, K. D., D. Walliker, and T. F. McCutchan. 1988. Genetic hypervariability of telomere-related sequences is associated with meiosis in Plasmodium falciparum.

Nucl. Acid. Res. 16:6973-6985. 40. Wahlgren, M. 1986. Antigens and antíbodies involved in humoral ixnmunity to Plasmodiur falciparum. Thesis, Stockholm, Sweden, Karolinska Institutet 41. Walliker, D., I. A. Quakyi, T. E. Wellems, T. F. McCutchan, A. Szarfman, W. T. Londo L. M. Corcoran, T. R. Burkot, and R. Cárter. 1987. Genetic analysis of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 236:1661-1666. 42. Wang, K., and A. McClure. 1979. Tu:Titin : Major myoFibrillar components of striated muscle. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 76:3698-3702. 43. Welléms, T. E., D. Walliker, C. L. Smith, V. E. Rosário, W. L. Maloy, R. J. Howard, R. Cárter, and T. F. McCutchan. 1987. A histidine-rich prtotein gene marks a linkage group favored strongly in a genetic cross of Plasmodium falciparum. Cell. 49:633-642.

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES 1.- Polipeptido, caracterizado pelo facto de conter a sequência polipeptidica definida a seguir pela sua sequência em aminoácidos: s V T G N T L V E G s V T E E V V G Ξ E K L V s E V I V T S E G s V A <2 E I V E E D A P A ? E E I D •p •w I E s V T E E V V E V S G P V D E E I V Q Ξ E G T V φ E E I T Q G E s K V E r V V E V <M Q G s s N E E I F V E E V s A S Q E I V Q N E s G T E E I L E K V s A s Q E I V Q D G s V T E Q I I E E L F P V T E Ξ V V N E E •jj» *4 -41- ou uma parte desta sequência desde que esta seja apta, quando eventualmente incorporada numa proteína de fusão, oligomerizada ou conjugada com uma proteína portadora, para induzir "in vivo" uma resposta imunitária protectora no macaco-esquilo "Saimiri sciurcus".
2. 2. - Polipeptido de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo facto de ser capaz de induzir "in vivo" anticorpos por sua vez capazes de inibir a invasão de glóbulos vermelhos pelos merazoitos.
3. 3. - Polipeptido de acordo com a reivindicação 2, caracte-rizado pelo facto de o referido polipeptido ou a referida parte da sequência polipeptídica ser(em) capaz(es) de induzir "in vivo anticorpos capazes de inibir a invasão dos glóbulos vermelhos em uma proporção pelo menos igual a 50% em relação às observáveis nas preparações de eritrócitos testemunhas colocados nas mesmas condições na presença das mesmas concentrações de merazoitos, mas sem polipeptidos ou parte de polipeptidos do gênero em questão.
4. 4. - Parte de polipeptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de ser constituída por uma das seguintes sequências (a) a (o): -42-

   (a) s V T G λΝ T L V Σ G, (ϊ>) s V T Ξ E V V G Jmí E K* (c) L V s £ £ I V T E E G. (d) s V A Q Σ mm V E E D A* (a) P m A T E E I D E 1 E, (í) s V T E E V V E Σ Σ G. (g) T5 -V V D £ E I. V Q E E G. (h) T V T E E I I Q G E. (í) s K V E E V V E Σ Q G. (j) s E N Ξ E T F V T E V, (*) s A S Q E I V Q N E, (1) s G T E E T L V J-i K V, (m) s A s Q E 7 V Q D G. (n) s V T E Q I I E E L F. (o) p V T Ξ E V V N -w E ΤΓ •i-/ « ou por equivalente peptídico comportando um motivo representável por: (X)3-EE-(X)2-EE-(X)2_3 na qual cada um dos símbolos X representa, de acordo com o índice que se segue aos sinais de parênteses que rodeiam o grupo con siderado, um dipeptido ou tripeptido contendo, cada um, pelo menos um resíduo amino-acilo hidrõfobo, sendo este equivalente peptídico susceptível de induzir uma resposta imunitária protec-tora no macaco-esquilo "Saimiri-sciurcus".
5. 5. - Polipeptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de estar incorporado numa proteína de fusão, oligomerizado ou conjugado de modo covalente com uma molécula, especialmente uma proteína portadora.
6. 6. - Composição capaz de induzir "in vivo" anticorpos aptos a destruir os parasitas responsáveis pelo paludismo no homem, especialmente no seu estádio sanguíneo, caracterizada pelo facto de conter um polipeptido ou parte de polipeptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, em associação com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
7. 7. - Anticorpos, caracterizados pelo facto de serem específicos do polipeptido ou da parte do polipeptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4. -44-
8. 8. - Fragmento de ADN, caracterizado pelo facto de codificar para o polipeptido ou parte de polipeptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4.
9. 9. - Fragmento de ADN de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se encontrar no estado recombinado no seio de um ADN que codifica para uma proteína de fusão, em que os elementos de ADN exteriores ao referido fragmento são heterólogos em relação a este.
10. 10. - Vector modificado pelo fragmento de ADN de acordo com a reivindicação 8 ou a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o referido fragmento se encontrar colocado sob o controlo de um promotor que autoriza a sua expressão em um hospedeiro celular cujas polimerases reconhecem o dito promotor.
11. 11. - Cultura celular, caracterizada pelo facto de ser transformada pelo vector de acordo com a reivindicação 10.
12. 12. - Aplicação dos polipeptidos ou péptidos de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5 ao diagnóstico "In vitro11 da presença de anticorpos anti-paludosos em uma amostra biológica, especialmente soro sanguíneo, colhido na pessoa submetida ao diagnóstico.
13. 13.- Aplicaçao dos anticorpos de acordo com a reivindicação -45- ç 7 ao diagnóstico "in vitro" de uma infecção causada por um parasita paludoso em uma amostra biológica, especialmente soro sanguíneo da pessoa submetida ao diagnóstico.·
14. 14. - Composição de acordo com a reivindicação 6, caracte-rizada pelo facto de conter um outro antigénio de. vacináçao, de preferência, òu uni. ántigénio ‘que* contém -á. sequência lide" aminoácidos do polipeptido 172, ou um antigénia quê contém a sequência de aminoácidos do polipeptido R23.
15. 15. - Processo para a preparação de um polipeptido que contém a sequência polipeptídi-ca definida a seguir pela sua sequência em aminoácidos: s V T G N T L V E G 5 V Φ E E V V G V «J E K L V s E S I V T E E G S V A Q Ξ I V E S D A P A T E E I D 2 I E s V T B S V V E E Ξ G p V D E Σ 1 V Q Ξ - Ξ G T V T E E I I Q G E s K V E Σ V V E E Q G s * «tf N 2 Σ I F V E E V s A S Q E I V Q N 2 s G T E E I L E K V s A s Q E I V Q D G s V T E Q I I E 2 L P p V T Σ E V V N 7 «4 E Ξ

    ou uma parte desta sequência desde que esta seja apta, quando eventualmente incorporada numa proteína de fusão, oligomeri-zada ou conjugada com uma proteína portadora, para induzir "in vivo" uma resposta imunitária protectora no macaco-esquilo "Saimiri sciurcus", caracterizado pelo facto de: quer se condensar sucessivamente, na ordem pretendida, os aminoácidos ou péptidos previamente formados com outros amino-ácidos ou péptidos previamente formados escolhidos de modo a permitir a produção do polipeptido contendo a referida sequência ou parte de sequência em aminoácidos, entendendo-se que se terá o cuidado, se necessário, de proteger previamente todas as funções reactivas transportadas por estes aminoácidos ou pêpti-dos, com excepção das suas funções amina e carboxilo que devem intervir na formação das ligações peptídicas, nomeadamente após a activação das referidas funções carboxilo, e de se recuperar o composto final assim obtido; quer se efectuar a transformação das células de uma cultura de células competentes com um vector contendo uma sequência de nucleotidos que codifique para o referido polipeptido sob o controlo de um promotor que reconhece as polimerases das referidas células competentes, e nas condições que permitam a expressão nestas células da dita sequência de nucleotidos, e de se recuperar o produto de expressão da referida sequência de nucleotidos.
16. 16.- Processo de acordo com a reivindicação 15, caracte-

    rizado pelo facto de se produzir um polipeptido capaz de indu-zir "in vivo1' anticorpos por sua vez capazes de inibir a invasão de glóbulos vermelhos pelos merazoitos.
17. 17. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracteri-zado pelo facto de se produzir um polipeptido ou parte da sequência polipeptídica capaz de induzir nin vivo” anticorpos capazes de inibir a invasão dos glóbulos vermelhos em uma proporção pelo menos igual a 50% em relação â observável nas preparações de eritrócitos testemunhas colocados nas mesmas condições na presença das mesmas concentrações de merazoitos, mas sem polipeptido ou parte de polipeptido. N
18. 18. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo facto de o polipeptido produzido possuir uma das seguintes sequências (a) a (o) -48- (a) s V T G N I L V E G. Ο) s V T 7 E V V c- >T E K. ( = ) L V s E I V T Ξ £ G. (<S) S V À Q Σ X V Tf £ S D A * (a) r A rr· ? E T D £ T •A * (i) s V Φ .te E E V V Tt £ E a G. (g) Ό V D E E I V Q E S G« (¾) T V φ E E T T Q G Ξ * (i) s X V £ E V V E E G G* (j) s E N E E I F V E E V* (*) s A S Q E I -V Q •N E » d) s G T E E I L S K V f (a) s A s G E I V Q D G » (a) s V T £ Q T -É* I E E X y, (o) TD 4ê V Φ tm s E V V N E E E. -49-

    ou um equivalente peptídico comportando um motivo representável por: (X)3-EE-(X)2~EE-(X)2_3 na qual cada um dos símbolos X representa, de acordo com o índice que se segue aos sinais de parênteses que rodeiam o grupo considerado, um dipeptido ou tripeptido contendo, cada um, pelo menos um resíduo amino-acilo hidrõfobo, sendo este equivalente peptídico susceptível de induzir uma resposta imunitária protec-tora no macaco-esquilo "Saimiri-sciurcus".
19. 19. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 15 a 18, caracterizado por incluir uma etapa suplementar de incorporação do polipeptido obtido numa proteína de fusão, sua oligomerização ou sua conjugação de modo covalente com uma molécula, especialmente uma proteína portadora, mediante reacção com agentes de ligação apropriados para esse efeito.
20. 20. - Processo para a produção de uma composição capaz de induzir "in vivo1* anticorpos aptos a destruir os parasitas responsáveis pelo paludismo no homem, especialmente no seu estádio sanguíneo, caracterizado pelo facto de se misturar um polipeptido ou parte de polipeptido obtido pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 15 a 17 ou o composto obtido pelo processo de acordo com a reivindicação 18, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 21.-
21. 21. - Processo para a produção de anticorpos específicos do polipeptido ou da parte do polipeptido obtida pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 15 a 17, caracte-rizado pelo facto de se imunizar um animal com o referido polipeptido ou parte de polipeptido e de se recuperar os anticorpos assim produzidos.
22. 22. - Processo para a produção de um fragmento de ADN que codifica para o polipeptido ou partedepolipeptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo facto de a sua clonagem e a sua replicação se efectuarem num hospedeiro celular apropriado.
23. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de se recombinar previamente o referido fragmento de ADN no seio de um ADN recombinante que codifique para uma proteína de fusão.
24. 24. - Processo para o diagnóstico "in vibro" da presença de anticorpos anti-paludosos em uma amostra biológica, especial^ mente soro sanguíneo, colhido na pessoa submetida ao diagnotico, caracterizado pelo facto de se fazer contactar esta amostra bio lógica com um polipeptido ou péptido obtido pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 15 a 19 ou com o ν -51-

    composto obtido pela realização da etapa do processo suplementar da reivindicação 19.
25. 25. - Processo para o diagnóstico "in vitro" de uma infecção causada por um parasita paludoso em uma amostra biológica, especialmente soro sanguíneo da pessoa submetida ao diagnóstico, ca- , racterizado pelo facto de se fazer contactar este meio biológico com os anticorpos obtidos pelo processo de acordo com a reivindicação 21.
26. 26. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracteri-zado pelo facto de a incorporação suplementar na referida composição ser quer de uma proteína imunogênica resultante de um antigénio 72 KDA, quer de uma proteína imunogênica contendo o piptido R23. Lisboa, 31 de Julho de 1992 O Agente Oficial *da Propriedade Industriai jt»

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